CN102869384A - 使用带有c-端元件的肽和蛋白质的方法和组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于将分子靶向和内化进入目标细胞以及用于目标组织的分子穿入的组合物和方法。所述组合物和方法基于选择性地被细胞内化、穿入组织或者被细胞内化和穿入组织的肽序列。所述公开的内化和组织穿入可用于递送治疗剂和可检测剂进入目标细胞和组织。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2009年6月22日提交的美国临时申请No.61/219,086和2009年10月6日提交的美国临时申请No.61/249,140的权益。2009年6月22日提交的申请No.61/219,086和2009年10月6日提交的申请No.61/249,140全文以引用的方式纳入本文。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明在政府的支持下,在国立卫生研究院(NIH)的国立癌症研究所(NCI)的资助CA104898、CA119414、CA119335、CA124427、CA115410和30199以及国防部(DoD)的资助BC 076050下作出。政府在本发明中享有一定权利。
技术领域
本发明大体上涉及分子药物领域,更具体而言涉及细胞和组织穿入肽。
背景技术
被细胞内化的肽一般被称为细胞穿入肽(cell-penetring peptide)。有两种主要类型的此类肽:疏水型和阳离子型(Zorko and Langel,2005)。一般用于将核酸、蛋白质引入细胞的所述阳离子型肽包括原型细胞穿入肽(CPP)、Tat和穿膜肽(penetratin)(Derossi et al.,1998;Meade andDowdy,2007)。疱疹病毒蛋白VP22既能够进出细胞还能够随其携带负载(Elliott and O′Hare,1997;Brewis et al.,2003)。这些肽作为递送载体的主要限制是它们不是选择性的;它们可进入所有细胞。可以使用对于一种细胞类型或组织更特异的可活化递送系统。
组织穿入是向细胞递送组合物的严重限制。对荧光素标记的肽和相同肽包被的氧化铁颗粒的分布进行比较显示,所述颗粒保持在肿瘤血管附近,而荧光肽到达所述肿瘤的所有区域。频繁引用的肿瘤脉管的“泄露”似乎没有大幅地减轻这一问题。此外,引起肿瘤脉管系统“正常化”的抗血管生成治疗(Jain,2005),需要靶向脉管系统不泄露的肿瘤。因此,寻找改善将各种组合物递送至血管外空间的途径的新方法很重要。已知很多蛋白质可转移通过血管内皮,包括血脑屏障。一个主要的实例是运铁蛋白,其由运铁蛋白受体运载穿过血脑屏障。该系统已被用于携带其他负载进入脑中(Li et al.,2002;Fenart and Cecchelli,2003)。可以使用用于能够介导组合物从循环系统转移进入组织的内皮胞吞转运的肽信号。
因此,需要用于选择性地靶向多种细胞类型的新治疗性方法,以及用于将蛋白质和肽内化进入这些细胞且使蛋白质和肽穿入组织的新治疗性方法。还有增加将化合物和组合物递送至并且进入细胞和组织的需要。本发明通过提供可选择性地靶向且可以被多种类型的细胞选择性地内化并且/或者能够穿入组织的肽而满足这些需求。还提供了相关优点。
发明内容
公开了增强共组合物(co-composition)内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,其中,在暴露所述细胞、组织或者细胞和组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。
还公开了增强共组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化进入所述细胞,其中,在暴露所述细胞之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。
公开了增强共组合物穿入进入并通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物穿入进入并通过所述组织,其中,在暴露所述组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。
还公开了包含CendR元件和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含CendR元件和辅助肽(accessory peptide),其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和辅助肽,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。还公开了包含CendR元件、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合,其中所述CendR元件和所述辅助分子相互共价连接或者非共价缔合。在这些组合物中,所述辅助肽可以与所述CendR元件重叠,或者与所述CendR元件分开。
可用的辅助分子的实例包括归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入分子、内体逃逸分子(endosomal escape molecule)、亚细胞靶向分子、核靶向分子。不同的辅助分子可以相互具有相似或不同的功能。具有相似功能、不同功能或者两者都有的辅助分子可与CendR元件、CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质和/或CendR肽相缔合。
还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质和肽包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。还公开了包含CendR元件、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合,其中所述CendR元件和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。在这些组合物中,所述归巢肽可与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。
还公开了增强货物(cargo)组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。
还公开了增强货物组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化进入所述细胞,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。
公开了增强货物组合物穿入进入并通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物穿入进入并通过组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。
还公开了包含CendR元件和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含CendR元件和辅助肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和辅助肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。还公开了包含CendR元件、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合,其中所述CendR元件和所述辅助分子相互之间共价连接或者非共价缔合。在这些组合物中,所述辅助肽可以与所述CendR元件重叠,或者与所述CendR元件分开。
还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质和肽包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合。还公开了包含CendR元件、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合,其中所述CendR元件和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。在这些组合物中,所述归巢肽可与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。
在一些形式中,所述CendR元件是1型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件是2型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件不是1型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件不是2型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件是1型CendR元件而不是2型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件是2型CendR元件而不是1型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件是1型CendR元件或2型CendR元件。
所述CendR元件能够穿透所述细胞、组织或者细胞和组织。所述细胞、组织或者细胞和组织可以是在受试者中。可以通过将所述CendR元件和所述共组合物给予所述受试者来将所述细胞、组织或细胞和组织暴露于所述CendR元件和所述共组合物。可以将所述CendR元件和所述共组合物同时给予所述受试者。可将所述CendR元件和所述共组合物以包含所述CendR元件和所述共组合物的单一组合物给予所述受试者。可将所述CendR元件和所述共组合物以不同的组合物给予所述受试者。可在不同的时间将所述CendR元件和所述共组合物给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可以不同的组合物给予所述受试者。可通过不同的途径将所述CendR元件和所述共组合物给予所述受试者。在一些形式中,所述CendR元件和所述共组合物没有相互结合。可通过将所述CendR元件和所述货物组合物给予所述受试者来使细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述CendR元件和所述货物组合物。可将所述CendR元件和所述货物组合物同时给予所述受试者。可将所述CendR元件和所述货物组合物以包含所述CendR元件和所述货物组合物的单一组合物给予所述受试者。
多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物可一起使用。类似地,多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物可一起使用。当这些多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物一起使用时,它们可与单一类型的共组合物、单一类型的货物组合物、多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物一起使用。类似地,当多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物可以一起使用时,它们可与单一类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物或CendR组合物一起使用,或与多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物组合物一起使用。
例如,iRGD(在单一肽中结合CendR元件和RGD元件)可与一种或多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物、一种或多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物、或者它们的任意结合物一起使用。在这样的结合物中,所述iRGD本身可在相同的缀合物或组合物中与一种或多种货物组合物、一种或多种辅助分子、一种或多种归巢分子等结合。
可通过将不同CendR组分和不同共组合物给予所述受试者来将细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述CendR组分的结合物和所述共组合物的结合物。可将一种或多种所述CendR元件和一种或多种所述共组合物同时给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可在包含所述CendR组分和所述共组合物的一种或多种单一组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可在不同时间给予所述受试者。所述CendR组分和所述共组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可通过一种或多种不同的途径给予所述受试者。在一些形式中,所述CendR元件和所述共组合物没有相互结合。
可通过将不同CendR组分和不同货物组合物给予所述受试者来将细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述CendR组分的结合物和所述货物组合物的结合物。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可同时给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可在包含所述CendR组分和所述货物组合物的一种或多种单一组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可在不同时间给予所述受试者。所述CendR元件和所述货物组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可通过一种或多种不同的途径给予所述受试者。
可通过将iRGD和所述共组合物给予所述受试者来使细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述iRGD和所述共组合物。可将所述iRGD和所述共组合物同时给予所述受试者。可将所述iRGD和所述共组合物在包含所述iRGD和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。可将所述iRGD和所述共组合物在不同的组合物中给予所述受试者。可在不同时间将所述iRGD和所述共组合物给予所述受试者。所述iRGD和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。可通过不同的途径将所述iRGD和所述共组合物给予所述受试者。在一些形式中,所述iRGD和所述共组合物没有相互结合。可通过将所述iRGD和所述货物组合物给予所述受试者使细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述iRGD和所述货物组合物。可同时给予所述受试者所述iRGD和所述货物组合物。所述iRGD和所述货物组合物可在包含所iRGD和所述货物组合物的单一组合物中给予所述受试者。
所述CendR元件可被包含在蛋白质或肽中的氨基酸序列中。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,而所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不内化进入细胞、不穿入组织或者不内化进入细胞并且不穿入组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽时,所述蛋白质或肽不穿入组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽时,所述蛋白质或肽不内化进入细胞并且不穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列不与所述共组合物缔合即可内化进入细胞、穿入组织或者可内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列不与所述共组合物缔合即可穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列不与所述共组合物缔合即可内化进入细胞和穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列是所述蛋白质或肽中的唯一功能性内化元件。
在一些形式中,当细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述CendR元件时,所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织被增强,而当细胞、组织或者细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织不被增强。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR元件时,所述共组合物穿入进入或通过所述组织被增强,而当组织不暴露于所述CendR元件时,所述共组合物穿入进入或通过所述组织不被增强。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR元件时,所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织被增强,而当细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织不被增强。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织不被增强。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物穿入进入或通过组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物穿入进入或通过组织不被增强。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织不被增强。
在一些形式中,当细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述CendR元件时,所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织被增强,而当细胞、组织或者细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织不被增强。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR元件时,所述货物组合物穿入进入或通过所述组织被增强,而当组织不暴露于所述CendR元件时,所述货物组合物穿入进入或通过所述组织不被增强。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR元件时,所述货物组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织被增强,而当细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,所述货物组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织不被增强。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织不被增强。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述货物组合物穿入进入或通过组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述货物组合物穿入进入或通过组织不被增强。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织不被增强。
所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可活化CendR元件可以是可蛋白酶活化CendR元件。所述蛋白质或肽可以是环化的。所述蛋白质或肽可以是线性的。所述CendR元件可以在所述蛋白质或肽的C端末端。所述共组合物和/或货物组合物可包含治疗剂。所述共组合物和/或货物组合物可包含检测剂。所述共组合物和/或货物组合物可包含载体、运载体(vehicle)或者载体和运载体。所述共组合物和/或货物组合物可包含治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、抗血管生成剂、促血管生成剂(pro-angiogenic agent)、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒子、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂或结合物。
所述CendR元件可与一个或多个辅助分子连接。例如,辅助分子可以是包含所述CendR元件的氨基酸、蛋白质或者肽的一部分。作为另一实例,所述辅助分子可以与所述CendR元件或者包含所述CendR元件的氨基酸序列、蛋白质或肽共价结合或非共价缔合。所述辅助分子可与所述CendR元件分开或者重叠。例如,一些辅助分子是氨基酸序列。这可使得由所述CendR元件组成的氨基酸序列与由所述辅助氨基酸序列组成的氨基酸序列重叠。例如,iRGD、LyP-1、iNGR和RGR肽各自包含在肽中相互重叠的辅助序列和CendR序列。或者,所述辅助肽可以是不与所述CendR元件重叠的分开实体。例如,非CendR元件的HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽或RGD肽可由不与CendR元件重叠的氨基酸序列组成。在一些形式中,所述辅助分子可包含例如CendR肽中与不同于所述CendR元件的受体的特定受体结合的序列。
所述氨基酸序列可包含一种或多种辅助肽。例如,所述氨基酸序列可包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或者结合物。所述蛋白质或肽可包含一种或多种辅助肽。例如,所述氨基酸序列可包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。
在一些形式中,所述共组合物不包含辅助分子。所述共组合物可以包含一种或多种辅助分子。在一些形式中,所述共组合物不包含辅助肽。所述共组合物可以包含一种或多种辅助肽。所述共组合物可以选择性地归巢于肿瘤。在一些形式中,所述共组合物不选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述共组合物可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。在一些形式中,所述货物组合物不包含辅助分子。所述货物组合物可以包含一种或多种辅助分子。在一些形式中,所述货物组合物不包含辅助肽。所述货物组合物可以包含一种或多种辅助肽。所述货物组合物可以选择性地归巢于肿瘤。在一些形式中,所述货物组合物不选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述货物组合物可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。
所述CendR元件可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述CendR元件的氨基酸序列、蛋白质或肽的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述CendR元件或者包含所述CendR元件的氨基酸、蛋白质或肽共价结合或非共价缔合。所述归巢分子可以与所述CendR元件分开或者重叠。例如,一些归巢分子是氨基酸序列。这可使得由所述CendR元件组成的氨基酸序列与由所述归巢氨基酸序列组成的氨基酸序列重叠。例如,iRGD、LyP-1、iNGR和RGR肽各自包含在肽中相互重叠的归巢序列和CendR序列。或者,所述归巢肽可以是不与所述CendR序列重叠的分开实体。例如,非CendR元件的HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽或RGD肽可由不与CendR元件重叠的氨基酸序列组成。在一些形式中,所述归巢分子可包含例如CendR肽中与不同于所述CendR元件的受体的具体受体结合的序列。
很多归巢分子和归巢肽可归巢于靶组织的脉管系统。然而,为方便起见,在本文一些地方,归巢是指归巢于与脉管系统相关的组织,所述脉管系统是所述归巢分子或归巢肽实际可以归巢的脉管系统。因此,例如,归巢于肿瘤脉管系统的归巢肽在本文中可称为归巢于肿瘤组织或肿瘤细胞。通过将归巢分子或归巢肽纳入或缔合于例如蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件,所述蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件可被靶向或者可以归巢至所述归巢分子或归巢肽的靶标。这样,所述蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件可称为归巢于所述归巢分子或归巢肽的靶标。为了方便并且除非另有说明,否则提及蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物、CendR元件等的归巢意欲指所述蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物、CendR元件等包含合适的归巢分子或归巢肽或者与合适的归巢分子或归巢肽相缔合。
所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肿瘤。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于一种或多种具体类型肿瘤。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于一种或多种具体类型肿瘤的脉管系统。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肿瘤或癌的一个或多个具体阶段。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肿瘤或癌的一个或多个具体阶段的脉管系统。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于一种或多种具体类型肿瘤的一个或多个具体阶段。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于一种或多种具体类型肿瘤的一个或多个不同阶段的脉管系统。
所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肺组织。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肺脉管系统。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于心脏组织。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于心脏脉管系统。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于脑细胞、脑的干细胞、脑组织和/或脑脉管系统、肾细胞、肾干细胞、肾组织和/或肾脉管系统、皮肤细胞、皮肤干细胞、皮肤组织和/或皮肤脉管系统、肺细胞、肺组织和/或肺脉管系统、胰腺细胞、胰腺组织和/或胰腺脉管系统、肠细胞、肠组织和/或肠脉管系统、肾上腺细胞、肾上腺组织和/或肾上腺脉管系统、视网膜细胞、视网膜组织和/或视网膜脉管系统、肝细胞、肝组织和/或肝脉管系统、前列腺细胞、前列腺组织和/或前列腺脉管系统、子宫内膜异位细胞、子宫内膜异位组织和/或子宫内膜异位脉管系统、卵巢细胞、卵巢组织和/或卵巢脉管系统、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管和/或肿瘤脉管系统、骨细胞、骨组织和/或骨脉管系统、骨髓细胞、骨髓组织和/或骨髓脉管系统、软骨细胞、软骨组织和/或软骨脉管系统、干细胞、胚胎细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、嗅成体干细胞、神经嵴干细胞、癌干细胞、血细胞、红细胞、血小板、白细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴样细胞、淋巴细胞、单核细胞、创伤脉管系统、损伤组织的脉管系统、发炎组织的脉管系统、动脉粥样硬化斑块或它们的结合。
可以选择所述氨基酸序列用于内化进入细胞。可以选择所述氨基酸序列用于组织穿入。可以选择所述氨基酸序列用于内化进入细胞和组织穿入。所述氨基酸序列可包含一个或多个归巢肽。例如,所述氨基酸序列可包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述氨基酸序列可包含CREKA肽。
所述蛋白质或肽可包含一个或多个归巢肽。例如,所述氨基酸序列可包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述蛋白质或肽可包含iRGD。所述蛋白质或肽可包含LyP-1肽。所述蛋白质或肽可包含iNGR。所述蛋白质或肽可包含RGR肽。所述蛋白质或肽可包含CREKA肽。
在一些形式中,所述CendR元件和所述共组合物相互没有共价结合或非共价缔合。在一些形式中,所述共结合物不包含功能性内化元件。所述共组合物可包含功能性内化元件。在一些形式中,所述共组合物不包含归巢分子。所述共组合物可以包含一种或多种归巢分子。在一些形式中,所述共组合物不包含归巢肽。所述共组合物可以包含一种或多种归巢肽。所述共组合物可以选择性地归巢于肿瘤。在一些形式中,所述共组合物不选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述共组合物可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。
在一些形式中,所述CendR元件和所述货物组合物没有相互共价结合或非共价缔合。在一些形式中,所述货物组合物不包含功能性内化元件。所述货物组合物可以包含功能性内化元件。在一些形式中,所述货物组合物不包含归巢分子。所述货物组合物可以包含一种或多种归巢分子。在一些形式中,所述货物组合物不包含归巢肽。所述货物组合物可以包含一种或多种归巢肽。所述货物组合物可以选择性地归巢于肿瘤。在一些形式中,所述货物组合物不选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述货物组合物可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。
所述氨基酸序列可以选择性地归巢于肿瘤。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于一种或多种具体类型肿瘤的脉管系统。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于肿瘤或癌症的一个或多个具体阶段。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于肿瘤或癌症的一个或多个具体阶段的脉管系统。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤的一个或多个具体阶段。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于一种或多种具体类型肿瘤的一个或多个不同阶段的脉管系统。
所述氨基酸序列可以选择性地归巢于肺组织。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于肺脉管系统。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于心脏组织。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于心脏脉管系统。所述氨基酸序列可以选择性地归巢于脑细胞、脑的干细胞、脑组织和/或脑脉管系统、肾细胞、肾干细胞、肾组织和/或肾脉管系统、皮肤细胞、皮肤干细胞、皮肤组织和/或皮肤脉管系统、肺细胞、肺组织和/或肺脉管系统、胰腺细胞、胰腺组织和/或胰腺脉管系统、肠细胞、肠组织和/或肠脉管系统、肾上腺细胞、肾上腺组织和/或肾上腺脉管系统、视网膜细胞、视网膜组织和/或视网膜脉管系统、肝细胞、肝组织和/或肝脉管系统、前列腺细胞、前列腺组织和/或前列腺脉管系统、子宫内膜异位细胞、子宫内膜异位组织和/或子宫内膜异位脉管系统、卵巢细胞、卵巢组织和/或卵巢脉管系统、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管和/或肿瘤脉管系统、骨细胞、骨组织和/或骨脉管系统、骨髓细胞、骨髓组织和/或骨髓脉管系统、软骨细胞、软骨组织和/或软骨脉管系统、干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、嗅成体干细胞、神经嵴干细胞、癌干细胞、血细胞、红细胞、血小板、白细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴样细胞、淋巴细胞、单核细胞、创伤脉管系统、损伤组织的脉管系统、发炎组织的脉管系统、动脉粥样硬化斑块或结合。
所述CendR元件当与归巢分子结合或缔合时,可以选择性地归巢于肿瘤。这样的CendR元件可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤的脉管系统。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于肿瘤或癌症的一个或多个具体阶段。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于肿瘤或癌症的一个或多个具体阶段的脉管系统。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤的一个或多个具体阶段。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤的一个或多个不同阶段的脉管系统。
与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于肺组织。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于肺脉管系统。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于心脏组织。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于心脏脉管系统。与归巢分子结合或缔合的CendR元件可以选择性地归巢于脑细胞、脑的干细胞、脑组织和/或脑脉管系统、肾细胞、肾干细胞、肾组织和/或肾脉管系统、皮肤细胞、皮肤干细胞、皮肤组织和/或皮肤脉管系统、肺细胞、肺组织和/或肺脉管系统、胰腺细胞、胰腺组织和/或胰腺脉管系统、肠细胞、肠组织和/或肠脉管系统、肾上腺细胞、肾上腺组织和/或肾上腺脉管系统、视网膜细胞、视网膜组织和/或视网膜脉管系统、肝细胞、肝组织和/或肝脉管系统、前列腺细胞、前列腺组织和/或前列腺脉管系统、子宫内膜异位细胞、子宫内膜异位组织和/或子宫内膜异位脉管系统、卵巢细胞、卵巢组织和/或卵巢脉管系统、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管和/或肿瘤脉管系统、骨细胞、骨组织和/或骨脉管系统、骨髓细胞、骨髓组织和/或骨髓脉管系统、软骨细胞、软骨组织和/或软骨脉管系统、干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、嗅成体干细胞、神经嵴干细胞、癌干细胞、血细胞、红细胞、血小板、白细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴样细胞、淋巴细胞、单核细胞、创伤脉管系统、损伤组织的脉管系统、发炎组织的脉管系统、动脉粥样硬化斑块或结合。
所述CendR元件可以是所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等中唯一的功能性内化元件,所述CendR元件可以是所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等中唯一的功能性组织穿入元件,或者所述CendR元件可以是所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等中唯一的功能性内化元件和功能性组织穿入元件。所选的氨基酸序列可以是所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等中唯一的功能性内化元件,所选的氨基酸序列可以是所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等中唯一的功能性组织穿入元件,或者所选的氨基酸序列可以是所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等中唯一的功能性内化元件和功能性组织穿入元件。
所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述CendR元件可以是可蛋白酶活化的CendR元件。所述蛋白质或肽可以是环化的(环型)或者可以包含环。所述CendR元件可以在所述蛋白质或肽的C端末端。所述CendR元件可以包含末端羧基基团。保护基团可被连接至所述末端羧基基团。连接所述保护基团和所述末端羧基基团的键可被选择为可被存在于目标细胞附近的蛋白酶、酶、切割剂和/或切割条件所切割。所述保护基团可被连接于所述CendR元件的C端氨基酸。所述保护基团可被连接于所述CendR元件的氨基酸,所述氨基酸不是所述CendR元件的C端氨基酸。
还公开了产生可活化CendR元件的方法,所述CendR元件可在目标细胞附近被活化,所述方法包括形成可活化CendR元件,其中保护基团通过可切割键连接于CendR元件,其中所述可切割键可被目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件所切割。所述细胞可以在受试者中。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可被识别。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可在形成所述可活化CendR元件之前被识别。所述可切割键可基于存在于目标细胞附近的酶而选择。所述可切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割剂而选择。所述可切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割条件而选择。所述可切割键可在形成所述可活化CendR元件之前选择。所述CendR元件可以包含末端羧基基团,其中所述保护基团连接于所述末端羧基基团。还公开了产生可活化CendR元件的方法,所述方法包括形成可活化CendR元件,其中保护基团通过可切割键连接于CendR元件。所述可切割键可以任意合适方法切割。例如,所述可切割键可通过酶或非酶方式切割。对于酶切割,所述切割酶可被提供或存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点。例如,所述酶可以存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的细胞附近。对于非酶切割,所述CendR元件可与切割剂接触,可被置于切割条件下,或者与切割剂接触并且置于切割条件下。切割剂是能够介导或诱导所述可切割键切割的任意物质。切割条件可以是能够介导或诱发所述可切割键切割的任意溶液或环境条件。
还公开了形成可活化CendR元件的方法,所述方法包括使得保护基团共价连接至CendR元件,其中连接所述保护基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了形成可活化CendR元件的方法,所述方法包括使得保护基团共价连接至氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件,其中连接所述保护基团和所述CendR元件的键是可切割的。还公开了形成可活化CendR元件的方法,所述方法包括(a)选择氨基酸序列用于内化进入细胞和/或穿入组织,其中所述氨基酸序列包含CendR元件,和(b)使得保护基团共价连接于所述CendR元件,其中连接所述保护基团和所述CendR元件的键是可切割的。与所述CendR元件共价连接的所述保护基团减少或者防止内化进入细胞和/或穿入组织。与没有保护基团的相同CendR元件相比,共价连接于所述CendR元件的保护基团能够减少或防止内化进入细胞和/或穿入组织。所述可活化CendR元件可包含所选的氨基酸序列和所述保护基团。所述细胞可以在受试者中。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可被识别。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可在形成所述可活化CendR元件之前被识别。所述可切割键可基于存在于目标细胞附近的酶而选择。所述切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割剂而选择。所述可切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割条件而选择。所述可切割键可在形成所述可活化CendR元件之前选择。所述CendR元件可包含末端羧基基团,其中所述保护基团连接至所述末端羧基基团。
本文公开了形成归巢CendR组合物的方法,所述方法包括选择用于内化进入细胞的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含C端元件,并且使得归巢分子与所选择的氨基酸序列共价连接或者非共价缔合,其中所述CendR组合物包含所选的氨基酸序列和连接或缔合的归巢分子。
公开了制造归巢CendR组合物的方法,包括:(a)选择用于内化进入细胞的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含C端元件,(b)使得归巢分子共价连接或非共价缔合所选的氨基酸序列,其中所述CendR组合物包含所选的氨基酸序列和连接或缔合的归巢分子。
还公开了将共组合物递送进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR组合物和所述共组合物,其中所述CendR组合物随后可以进入所述细胞,从而将述共组合物递送进入所述细胞。
还公开了使得共组合物穿入组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR组合物和所述共组合物,其中所述CendR组合物随后可以进出所述组织的细胞,从而使得所述共组合物穿入所述组织。
另外公开了将共组合物递送进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于所述共组合物和包含可活化CendR元件的CendR组合物,切割剂随即活化所述CendR组合物的可活化CendR元件,其中所述CendR组合物随后可以进入所述细胞,从而将所述共组合物递送进入所述细胞。
另外公开了使得共组合物穿入组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于所述共组合物和包含可活化CendR元件的CendR组合物,切割剂随即活化所述CendR组合物的所述可活化CendR元件,其中所述CendR组合物随后可以进入并穿过组织的细胞,从而使得所述共组合物穿入所述组织。
还公开了递送货物组合物进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR组合物和所述货物组合物,其中所述CendR组合物随后能够进入细胞,从而递送所述货物组合物进入所述细胞。
还公开了使得货物组合物穿入组织的方法,其中所述方法包括:将所述组织暴露于CendR组合物和所述货物组合物,其中所述CendR组合物随后能够进出所述组织的细胞,从而使得所述货物组合物穿入所述组织。
另外公开了递送货物组合物进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于所述货物组合物和包含可活化CendR元件的CendR组合物,切割剂随即活化所述CendR组合物的可活化CendR元件,其中所述CendR组合物随后能够进入所述细胞,从而递送所述货物组合物进入所述细胞。
还公开了使得货物组合物穿入组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于所述货物组合物和包含可活化CendR元件的CendR组合物,切割剂随即活化所述CendR组合物的可活化CendR元件,其中所述CendR组合物随后能够进入并且穿过所述组织的细胞,从而使得所述货物组合物穿入所述组织。
还公开了递送货物组合物进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR组合物和所述货物组合物,其中所述CendR组合物包含所述货物组合物,其中所述CendR组合物随后能够进入所述细胞,从而递送所述货物组合物进入所述细胞。
还公开了使得货物组合物穿入组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR组合物和所述货物组合物,其中所述CendR组合物包含所述货物组合物,其中所述CendR组合物随后能够进出所述组织的细胞,从而使得所述货物组合物穿入所述组织。
还公开了递送货物组合物进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于所述货物组合物和包含可活化CendR元件的CendR组合物,切割剂随即活化所述CendR组合物的可活化CendR元件,其中所述CendR组合物随后能够进入所述细胞,从而递送所述货物组合物进入所述细胞,其中所述CendR组合物包含所述货物组合物。
另外公开了使得货物组合物穿入组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于所述货物组合物和包含可活化CendR元件的CendR组合物,切割剂随即活化所述CendR组合物的可活化CendR元件,其中所述CendR组合物随后能够进入并且穿过所述组织的细胞,从而使得所述货物组合物穿入所述组织,其中所述CendR组合物包含所述货物组合物。
能够内化CendR元件的细胞可通过如下方式鉴别:(a)将细胞暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否被内化。例如,所述细胞可以是在试验中。所述CendR元件可连接至归巢分子,从而形成CendR组合物。可内化可活化CendR元件的细胞可通过如下方式鉴别:(a)将细胞暴露于可活化CendR元件;(b)确定所述活化CendR元件是否被内化。所述可活化CendR元件可在暴露于所述细胞之前去保护,但不需要去保护。例如,这可用于测试所述保护剂(blocker)的保护能力。所述可活化CendR元件还可以是可蛋白酶活化的CendR元件。
癌细胞或者带有癌细胞的受试者可通过如下方式被鉴别为用于基于CendR的疗法的候选者:(a)将所述癌细胞暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化,其中内化的CendR元件鉴定所述癌细胞或所述受试者是用于基于CendR的疗法的候选者。例如,所述细胞可以在试验中,或者在受试者中。所述CendR元件可被连接至归巢分子,从而形成CendR组合物。
肿瘤或者带有肿瘤的受试者可通过如下方式被鉴别为用于基于CendR的疗法的候选者:(a)将来自所述肿瘤的组织暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否穿过所述组织或者被所述组织的细胞内化,其中穿过或内化的CendR元件鉴定所述肿瘤或所述受试者是基于CendR的疗法的候选者。
可在目标细胞附近被活化的可活化CendR元件可通过如下方式制备:形成可活化CendR元件,其中保护基团通过可切割键连接至CendR元件,其中所述可切割键可通过存在于目标细胞附近的酶切割。这还可以包括:在形成所述可活化CendR元件之前,鉴别存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件。这还可以包括:在形成所述可活化CendR元件之前,基于存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件选择所述可切割键。
可通过如下方式形成可活化CendR元件:(a)选择用于内化进入细胞的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含C端元件,其中所述C端元件包含末端羧基基团,并且(b)使得保护基团共价连接于所选氨基酸序列的末端羧基基团,其中连接所述保护基团和所述末端羧基的键是可切割的,其中所述可活化CendR元件包含所选的氨基酸序列和所述保护基团。这还可以包括:在步骤(b)之前,选择连接所述保护基团和所述末端羧基的键,使其能够被存在于目标细胞附近的蛋白酶、酶、切割剂和/或切割条件切割。
可活化CendR元件可通过如下方法制备,所述方法包括:(a)选择用于内化进入细胞的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含C端元件,其中所述C端元件包含末端羧基基团,并且(b)使得保护基团共价连接于所选氨基酸序列的末端羧基基团,其中连接所述保护基团和所述末端羧基基团的键是可切割的,其中所述可活化CendR元件包含所选的氨基酸序列和所述保护基团。所述方法还可以包括:在步骤(b)之前,选择连接所述保护基团和所述末端羧基的键,使得可被存在于目标细胞附近的蛋白酶、酶、切割剂和/或切割条件切割。
所公开的方法和组合物的更多优点部分地在说明书下文列出,部分地可从说明书理解,或者可通过实施所公开的方法和组合物领会。所公开的方法和组合物的优点可通过所附权利要求书中具体指出的要素和组合实现和达到。应理解,在前的发明内容和之后的具体实施方式仅是示例性和说明性的,不是对所要求的发明进行限制。
附图说明
附图被纳入本说明书并且是本说明书的一部分,其以图说明所公开的方法和组合物的一些实施方案,并且与描述一起用于解释所公开的方法和组合物的原理。
图1显示了组织靶向/组织穿入CendR系统的示意图。
图2显示了,在注射肽RPARPAR(SEQ ID NO:2)之后,多种组织中的噬菌体滴度的图。全身低聚物RPARPAR增加了非靶向的循环追踪噬菌体的血管泄露。对小鼠静脉内注射150μl含有以下成分的PBS:1010pfu对照噬菌体和使用neutravidin支架低聚化的8μM RPARPAR(或对照)肽。30分钟的循环后,灌注小鼠,确定停留在组织中的噬菌体的数目。Y轴的值代表RPARPAR/对照比例。使用Student’s t检验进行统计学分析,n=4;误差棒表示标准误差;双星号,p<0.01,三星号,p<0.001。比例尺:20μm(B,C)和50μm(F)。
图3显示的图解为iRGD的多步结合和穿入机制的实例。序列是SEQID NO:1和SEQ ID NO:37。
图4A-4C显示了iRGD肽的体内肿瘤归巢。a,荧光素标记的(FAM)iRGD或对照肽(200μg溶于PBS)静脉内注射进入患有原位胰腺导管腺癌(PDAC)的LSL-Kras、p53-fl/+、p48-Cre小鼠。使所述肽循环2小时,收集器官并在UV光下观察。箭头指向肿瘤。点线显示所述器官放置的位置。b,来自注射了所指出的肽、噬菌体和微团的小鼠的常位22Rv-1人前列腺癌异种移植物的共聚焦图像。比较发现iRGD具有相似的整联蛋白结合,而非穿入肽CRDGC(SEQ ID NO:36)没有。对于循环时间,所述游离肽是2小时,所述展示肽的噬菌体是15分钟,而所述肽结合的微团是3小时。箭头指向血管壁内或紧邻血管壁外面的FAM-CRGDC肽或CRGDC噬菌体,表明它归巢于肿瘤脉管系统。显示了来自三个肿瘤每个的多张切片的代表性区域。比例尺=50μm。c,iRGD和CRGDC肽的肿瘤归巢区域的定量。用抗FITC抗体对来自注射了FAM-iRGD或FAM-CRGDC肽的小鼠的22Rv-1常位肿瘤的冷冻切片进行免疫组织化学染色。将所述样本用Scanscope CM-1扫描器进行图像分析,用于量化FAM阳性区域。用Student’s t检验进行统计学分析,n=3;误差棒,标准误差;三星号,p<0.001。
图5A和5B显示了在iRGD注射的小鼠中Evans Blue(白蛋白)肿瘤特异性地进入血管外肿瘤组织。iRGD是SEQ ID NO:3。iRGDD是SEQID NO:4。对携带常位移植的胰腺或乳腺癌异种移植物的小鼠注射1μg的Evans Blue,5分钟后注射溶于PBS的100μg iRGD肽、仅PBS或对照肽。30分钟后收集肿瘤和组织并检查染料含量。图5A显示了iRGD注射的小鼠的肿瘤比对照肿瘤含有更多的蓝色。图5B显示了来自有胰腺肿瘤的小鼠和同一小鼠的非肿瘤组织的结果量化。在所述iRGD处理的肿瘤中积累了约4倍于对照肿瘤的染料。所述对照肽包含非CendRRGD肽。
图6A和6B显示了离体(ex vivo)肿瘤穿入测定。PPC1人前列腺癌皮下异种移植物被切下,并保持在含有1010个噬菌体颗粒/ml的短期培养物中,图6A中为iRGD,图6B中为具有CG7C插入物的对照噬菌体。90分钟后,在37℃下,将所述肿瘤清洗、固定并切片。使用针对噬菌体外壳蛋白的抗体检测噬菌体。注意所述iRGD噬菌体已经深深穿入进入了所述肿瘤。比例尺200μm。
图7是注射不同组合物后肿瘤体积(mm3)对时间(天数)的曲线图,显示了在用赫赛汀(Herceptin)和iRGD肽的结合物处理的小鼠中抗肿瘤效果增强。如图中所示,以3mg/kg(在肿瘤细胞接种后21天首次注射=图中第0天)或1.5mg/kg(后续注射)每周注射赫赛汀并结合每天注射4mg/kg iRGD或PBS来处理携带人乳腺癌(HER2表达提高)异种移植物(BT474)的小鼠。
图8的图解显示了CendR增强非连接共组合物的靶向、内化和组织穿入。列出了3个归巢肽实例,但是CendR元件可以在不进行靶向或归巢时使用,并且可与任意其他靶向或归巢分子、试剂、肽或序列一起使用。
图9A-9D显示了在iRGD注射小鼠中Evans Blue肿瘤特异性地进入血管外肿瘤组织。iRGD是SEQ ID NO:3。iRGDD是SEQ ID NO:4。对携带常位MIA PaCa-2人胰腺癌异种移植物的小鼠静脉内注射1μg白蛋白结合染料Evans Blue,5分钟后注射溶于PBS的100nmol iRGD肽或对照肽或仅PBS。30分钟后收集组织。(A)Evans Blue在注射了iRGD(主图)的小鼠组织和在注射了PBS的对照小鼠的肿瘤(插图)中积累。注意所述iRGD注射的小鼠的原发肿瘤和侵入左肾(箭头)的肿瘤中的深蓝色。T,肿瘤;P,胰腺;S,脾。(B至D)Evans Blue在所述胰腺肿瘤和组织中的量化。在(B)中,注射了不同量的iRGD。在(C)中,比较了iRGD的效果与缺乏RXXK/R CendR序列的对照RGD肽(SEQ ID NO:6)的效果。在(D)中,在注射iRGD之前,注射50μg抗-神经毡蛋白-1的封闭抗体或对照IgG。在(B)和(D)中用ANOVA进行统计学分析,在(C)中用Student’s t检验进行统计学分析。n=3;误差棒,标准误差;双星号,p<0.01;三星号,p<0.001。
图10A-10C显示了在多个肿瘤模型中Evans Blue肿瘤特异性地进入血管外肿瘤组织。序列是SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:40。对肿瘤小鼠注射1μg白蛋白结合染料Evans Blue,5分钟后注射100nmol溶于PBS的iRGD肽或对照肽或者仅PBS。30分钟后收集组织。(A)显示了组织和随后的肿瘤的宏观外表;BT474人乳腺和22Rv1人前列腺癌以及从头遗传工程改造小鼠胰腺导管腺癌(PDAC)的常位异种移植物。(B)显示了由心内注射肿瘤细胞产生的GFP-PC-3弥散性肿瘤和正常组织的宏观外表。注意来自同时接受了所述染料和iRGD的小鼠的肿瘤中的蓝色,包括所述GFP-PC-3弥散性肿瘤模型中的很多小结节(左上图,箭头)。所述GFP-PC-3弥散性肿瘤的右图中的绿色荧光信号(着白色)显示了所述肿瘤结节的位置。(C)在所述GFP-PC-3弥散性肿瘤模型的颌肿瘤中的Evans Blue的定量。注意当iRGD与所述染料一起注射时所述染料的肿瘤特异性积累,但是当iRGD与缺乏RXXK/R CendR基序的对照RGD肽(SEQ ID NO:6)一起或仅PBS注射时不会如此。用Student’st检验进行统计学分析;误差棒,标准误差;双星号,p<0.01;n=3。
图11显示了iRGD的CendR元件(CRGDK;SEQ ID NO:34)在皮肤中诱导局部血管穿透。进行了改良的Miles分析(Miles and Miles,1952,Murohara et al.,1998,Teesalu et al.,2009)。用含有0.5%Evans Blue、13μg Quantilum重组萤光素酶和109pfu非靶向噬菌体颗粒的混合物的150μl PBS静脉内注射小鼠。10分钟后,所述小鼠接受皮内注射含有指定浓度的VEGF-165、RPARPAR肽(SEQ ID NO:2)、RPAR肽、CRGDK肽(SEQ ID NO:34)的30μl PBS或仅PBS。30分钟后,用4mm打孔器收集所述皮肤样本。测量萤光光素酶活性和噬菌体滴度来对所述试剂在皮肤的血管外组织的停留进行定量。将所述值相对于注射了PBS的皮肤样本标准化。用ANOVA进行统计分析;n=3;误差棒,标准误差;单星号,p<0.05;双星号,p<0.01;三星号,p<0.001。RPAR是SEQID NO:5。
图12显示了所述iRGD-混合物(iRGD-combo)递送系统。序列是SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:37。静脉内注射的iRGD肽分三步穿入肿瘤组织(右图,更多细节参见Sugahara et al.,2009);(1)iRGD用RGD基序识别肿瘤血管上皮细胞上的αv整联蛋白,(2)然后它被蛋白酶解以暴露C端隐藏的CendR元件,RGD K/R(SEQ ID NO:31)(右图中细小的箭头),并且二硫键断裂(右图中的窄线),(3)所述CendR元件介导结合至神经毡蛋白-1,以诱导所述CendR诱导的跨内皮&组织(CendIT)作用,导致细胞和组织的穿入。在常规结合的递送方法中,货物(例如,药物、诊断物)以化学方式连接于N端半胱氨酸(窄线下的“C”代表二硫键断裂,右图)。使用所述混合物递送方法,所述货物与所述肽分开共给予。iRGD诱导的CendIT作用使所述共给予的货物穿入进入所述血管外肿瘤组织。
图13A-13C显示了分子和纳米颗粒在iRGD-注射的小鼠的血管外肿瘤组织中的积累。带有常位22Rv1人前列腺肿瘤的小鼠被注射200nmol荧光素标记的CRGDC肽(FAM-CRGDC,SEQ ID NO:36)、0.2mg德克斯红标记的3-kDa或10-kDa葡聚糖、5mg铁/kg荧光素标记的氧化铁纳米蠕虫(nanoworm)或109空斑形成单位(pfu)的非靶向噬菌体,5分钟之后注射100nmol iRGD肽的PBS溶液或仅PBS。对于葡聚糖和噬菌体,30分钟之后收集组织,对于FAM-CRGDC和纳米蠕虫,2小时后收集组织。(A)肿瘤的免疫荧光测定。对于FAM-CRGDC,还显示了在UV光下拍摄的图像(最左图)。虚线显示所述组织放置的位置。用T7噬菌体抗体检测噬菌体。在各幅图中描述了颜色。浅色圈(spec)代表FAM-CRGDC阳性染色;浅灰区域代表葡聚糖阳性染色;浅色圈代表氧化铁纳米蠕虫或噬菌体染色。比例尺=100μm。(B)对肿瘤切片中的FAM-CRGDC和葡聚糖的阳性区域进行定量。用抗FITC抗体(FAM-CRGDC)或抗葡聚糖抗体(葡聚糖)免疫组织化学染色冷冻切片,并且用Scanscope扫描用于分析。(C)基于噬菌体滴度对在所述组织中积累的噬菌体进行定量。
图14A-14D显示了与iRGD共注射的多柔比星(DOX)-脂质体的抗肿瘤作用增强。(A和B)用DOX-脂质体((3mg DOX/kg)、5分钟之后用100nmol iRGD或PBS静脉内注射带有常位22Rv1人前列腺肿瘤的裸鼠。3小时后收集肿瘤和组织。在(A)中,将所述肿瘤切片并且用抗-CD31抗体染色。左图中,多柔比星由看似4个光环的浅色圈表示。比例尺=200μm,n=3。在(B)中,对组织中的DOX进行了定量。(C)带有2周的常位22Rv1肿瘤的裸鼠每日接受DOX-脂质体(1或3mgDOX/kg)或PBS连同2μmol/kg iRGD、环(-RGDfK-)(SEQ ID NO:40)或PBS静脉内注射。处理17天后收集并称重所述肿瘤。每组中的小鼠的数量为5。显示了给出类似结果的3个实验中的一个。(D)对来自所述处理研究的肿瘤和心脏样本的组织切片以免疫组织化学的方式进行TUNEL染色,并且对阳性进行定量。在(B)中用Student’s t检验进行统计分析,在(C)和(D)中用ANOVA进行统计分析;误差棒,标准误差;n.s.,不显著;单星号,p<0.05;双星号,p<0.01;三星号,p<0.001。
图15显示了iRGD和3mg DOX/kg的DOX脂质体的结合物的抗肿瘤作用增强。对带有2周的常位22Rv1肿瘤的裸鼠每天静脉内注射DOX-脂质体(3mg DOX/kg)或PBS、连同2μmol/kg iRGD或PBS。处理17天后收集并称重所述肿瘤。每组中动物的数目为13。使用Student’s t检验进行统计分析;误差棒,标准误差;单星号,p<0.05;双星号,p<0.01。
图16显示了在用iRGD和DOX-脂质体的结合物处理后在心脏的组织切片上进行的TUNEL染色。将图14显示的处理研究之后收集的心脏样本切片用TUNEL分析试剂盒和DAPI(蓝)进行免疫荧光染色,并用共聚焦显微镜观察。模糊的红点(箭头指向实例)代表TUNEL信号。比例尺=200μm。
图17显示了用iRGD和DOX-脂质体的结合物处理的肿瘤小鼠的体重变化。图14显示的处理研究的小鼠在所述处理研究期间每4天称一次重。显示了体重变化百分比。用ANOVA进行了统计分析;误差棒,标准误差;n.s.,不显著;三星号,p<0.001。
图18A-18C显示了与iRGD共注射的赫赛汀的抗癌作用增强(A和B)。对带有常位BT474人乳腺肿瘤的小鼠静脉内注射赫赛汀(3mg/kg),5分钟之后静脉内注射100nmol iRGD或PBS。3小时后收集组织。在(A)中,用抗人IgG抗体对肿瘤切片进行针对赫赛汀的免疫组织化学染色,并且对阳性区域(较深阴影)进行定量,n=3。在(B)中,用竞争性ELISA对组织中的赫赛汀进行定量。n=3。(C)共给予赫赛汀和iRGD的肿瘤治疗研究。对BT474肿瘤小鼠每4天静脉内注射赫赛汀或PBS,共24天,处理第1天的赫赛汀浓度为3或9mg/kg(图中的0天),随后注射的赫赛汀浓度为1.5或4.5mg/kg。所述处理与在赫赛汀注射日每天注射4μmol/kg iRGD或PBS并在其他日注射2μmol/kg iRGD或PBS相结合。每组中小鼠的数目是10。显示了给出相似结果的4个实验中的一个实验。在(A)和(B)中用Student’s t检验、在(C)中用ANOVA进行统计学分析;误差棒,标准误差;n.s.,不显著;单星号,p<0.05;双星号,p<0.01;三星号,p<0.001。
图19显示了表达iRGD的T7噬菌体的离体肿瘤穿入。将PPC1人前列腺癌皮下肿瘤切下,在包含109pfu/ml噬菌体和抑制剂的以下结合物的短期培养物中保持:(左上),表达iRGD肽的噬菌体(iRGD噬菌体),无抑制剂;(右上),表达对照G7肽的非靶向噬菌体(CG7C噬菌体),无抑制剂;(中左),iRGD噬菌体和10mM叠氮化钠;(中右),iRGD噬菌体,无抑制剂,但在4℃下孵育;(左下),iRGD噬菌体和功能阻断性抗-神经毡蛋白-1抗体;(右下),iRGD噬菌体和对照山羊IgG。首先,在4℃下将所述肿瘤与所述抑制剂孵育20分钟。然后将标明的噬菌体加入到所述溶液中,将所述肿瘤在37℃(在D图中为4℃)下再孵育90分钟。孵育之后,对肿瘤进行冲洗、固定并切片。用抗-T7噬菌体抗体(浅染)、抗-CD31抗体(中度染色——在A中看不到,在B中存在很少量)和DAPI(灰色染色)对所述切片进行染色,并以共聚焦显微镜进行观察。注意iRGD噬菌体已经深深穿入进入所述肿瘤,并且所述过程被叠氮化钠、低温或抗-神经毡蛋白-1抗体抑制。比例尺=200μm。
图20显示了用iRGD-混合物方案处理后DOX-脂质体在肿瘤组织中的扩散。将图14C显示的处理研究之后收集的肿瘤固定并切片。(A)用抗-CD31抗体免疫荧光染色来自图14C的肿瘤的切片。在左图中可见的灰色圈代表Dox染色。注意用iRGD-混合物方案处理2-3周后DOX的广泛分布。显示了5个肿瘤各自的代表性图像。比例尺=200μm。
具体实施方式
参考以下具体实施方案和其中包括的实施例的详细说明以及附图和它们的前文和下文的描述可以更容易地理解所公开的方法和组合物。
在对本发明的化合物、组合物、产品、装置和/或方法公开和描述之前,除非另有说明,否则应理解它们并不限于特定的合成方法或特定的重组生物学技术,或者除非另有说明,否则它们并不限于具体的试剂,因为它们当然是可变的。还应理解,本文使用的术语仅仅是用于描述具体的实施方案,并不意欲进行限制。
A.定义
除非上下文另有明确说明,说明书和所附权利要求书所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数形式。因此,例如,提及“a pharmaceuticalcarrier”包括两种或多种此类载体的混合物,如此类推。
本文表达的范围可以是从“约”一个具体数值和/或至“约”另一个具体数值。当表达这样的范围时,另一个实施方案包括从该一个具体数值和/或至该另一个具体数值。类似地,当数值通过使用先行词“约”被表达为近似值时,应理解,所述具体值形成另一个实施方案。还应理解每个范围的端点在与另一个端点有关和无关时均是有意义的。还应理解,本文公开了很多数值,除了所述数值本身之外,每个数值在本文中还被公开为“约”所述具体数值。例如,如果公开了数值“10”,那么也公开了“约10”。还应理解,当公开了某个数值时,也就公开了“小于或等于”所述数值,“大于或等于所述数值”和数值之间的可能范围,这是本领域技术人员可以理解的。例如,如果公开了数值“10”,也就公开了“小于多等于10”以及“大于或等于10”。还应理解在整个申请中,数据以多种形式提供,该数据代表终点和起点,以及所述数据点的任何组合的范围。例如,如果公开了具体的数据点“10”和具体的数据点“15”,应理解大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10至15也被认为是公开的。还应理解还公开了两个具体单位之间的每个单位。例如,如果公开了10和15,那么也公开了11、12、13和14。
在本说明书和其后的权利要求书中,会涉及很多术语,其应被定义为具有以下含义:
“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件或情况可能发生或者可能不发生,并且所述描述包括所述事件或情况发生的实例和所述事件或情况不发生的实例。
在整个说明书中,提及了多种出版物。这些出版物的公开内容全文在此以引用的方式被纳入本申请,目的是充分描述其所属领域的现有技术。所公开的参考物还对于它们包含的内容(引用其的句子对其进行了论述)单独并且具体地以引用的方式纳入本文。
还应理解,除非另有说明,所公开的方法和组合物不限于特定的合成方法、特定的分析技术或具体的试剂,因此是可变的。还应理解本文使用的术语仅仅是用于描述具体的实施方案,并不意欲进行限制。
B.概述
本文公开的是新技术平台,其能够实现组合物的细胞内递送、离开和组织穿入。所述递送可以是通用的,也可以靶向目标细胞或组织,例如肿瘤。组合物(包括纳米颗粒、药物、可检测标记物和其他化合物)和它们的负载内化进入靶细胞并且穿入进入靶组织能够增加靶向的有效性。如果负载不与细胞或组织特异性穿入肽共价连接或非共价缔合,所述负载细胞类型特异性内化和组织类型特异性穿入在以前是不能实现的。
细胞穿入递送载体从多方面来看是重要的。首先,细胞穿入靶向元件能够将负载带入细胞质,这在例如送基于核酸的治疗剂中是关键的。第二,内化能够改善靶向,因为将肽和它的负载内化进入细胞使得归巢更加有效(Christian et al.,2003;Jiang et al.,2004;Laakkonen et al.,2004;Weissleder at al.,2005)。第三,如本文所述,细胞穿入特性和组织穿入特性的结合增强外渗和组织扩散。Tat、穿膜肽和其他原型细胞穿入肽还未被认为具有组织穿入特性。
所公开的CendR肽与原型细胞穿入肽(CPP)的差别在于CendR肽的细胞穿入特性依赖于与特异的细胞表面受体的立体特异性结合,而L-氨基酸和D-氨基酸CPP都是有活性的(Langel,2007;Meade andDowdy,2007)。此外,所述CendR肽对具体的病理损伤(例如肿瘤)或单个组织可以是特异的。
组合物穿过进入血管外空间的能力是限制组合物在体内的靶向有效性的主要因素。已鉴定出以C-端元件为定义性特性的简单肽基序,该基序发出高效内化噬菌体和游离肽进入细胞的信号。该内化现象被称为“C-端规则”或“CendR”。露出C-端元件的蛋白酶解可作为引发内化信号的开关。通过该机制可内化多种组合物。例如,用暴露C-端元件的通用或细胞类型特异性蛋白酶解,在靶位点可出现归巢肽介导的积累,所述C-端元件使得高度特异的归巢系统能够实现靶引发的内化。所述CendR途径还可用于目标组合物离开脉管系统并且扩散进入组织。所述C-端元件能够引起组合物从脉管系统扩散(从而可以例如从静脉内注射扩散进入肿瘤组织)。CendR元件还可用于介导目标组合物通过其他CendR容许(CendR-capable)膜,例如粘膜和血脑屏障。本文使用的术语“组织穿入”和“组织的穿入”是指穿过进入或通过组织那边,或通过外层或第一层细胞,或者通过组织膜。此种穿过或穿入通过组织(还可被称为外渗和组织穿入)可以随例如组织中的细胞内化和细胞间的穿过变化。在该申请全文中,当使用术语“组织穿入”时,应理解这样的穿入还可以扩展至见于整个身体的其他屏障和CendR容许膜,例如血脑屏障。
不同于已知的细胞穿入肽,所公开的内化元件是位置依赖的——当其存在于所述肽的非C-端位置时是无活性的。另一个区别特点是所述CendR元件是立体特异性的,也就是说,完全由D-氨基酸组成的CendR元件是无活性的。潜在的CendR肽可通过由例如合适的蛋白酶解酶来切割以暴露例如C-端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸来活化。在所述申请全文中,当使用术语“CendR元件”或“C-端元件”时,是用于描述C-端精氨酸、C-端赖氨酸或C-端赖氨酸-甘氨酸对,其中甘氨酸位于C-端的最远位置。换言之,在赖氨酸位于C-端末端的情况下,所述CendR元件在甘氨酸位于赖氨酸的C端侧的情况下可以保持功能。但是,没有必要使甘氨酸处于所述末端以使赖氨酸残基作为C-端元件具有功能,因此赖氨酸可以在没有甘氨酸的情况下存在,并且仍具有功能。但是,反之则不可以,因为甘氨酸在不邻接赖氨酸的情况下不能作为C-端元件起作用。精氨酸不需要赖氨酸或甘氨酸就能作为C-端元件其作用,条件是它保持在C-端的最远位置。这样的CendR元件可称为1型CendR元件。
术语“CendR元件”或“C-端元件”还可用于描述C-端组氨酸和具有序列X1X2X3X4的氨基酸序列,其中X1可以是R、K或H,其中X4可以是R、K、H或KG,其中X2和X3各自可以独立地是任意氨基酸。这样的CendR元件可以被称为2型CendR元件。可针对具体目的选择X2和X3氨基酸。例如,可以选择X2、X3或者X2和X3形成蛋白酶识别序列的全部或部分。这可以用于,例如,规定具有CendR元件(潜在或隐藏的CendR元件形式,其通过在X4氨基酸后切割而被活化)的肽切割或者使得能够进行所述肽切割。表1和2中显示了此类氨基酸选择的实例。还可选择X1、X2和X3,例如,以将其他蛋白质募集至细胞表面的NRP-1分子。这可以用于,例如,调节CendR元件(和包含CendR元件的组合物、缀合物、蛋白质和肽)的选择性以及内化和/或组织穿入能力。还可以选择X2和X3氨基酸以防止X1-X4基序中的蛋白酶解切割。例如,X2和/或X3可以是脯氨酸,其减少或消除例如通过羧肽酶在所述脯氨酸和下一下游氨基酸之间的蛋白酶解切割。另一个实例是,X1、X2、X3和/或X4之间的一个或多个键可被修饰以减少或消除这些键处的蛋白酶解切割。任选地,还可将一些氨基酸排除用于X2、X3或者X2和X3。例如,如果需要,可分别将G和D排除同时用作X2和X3。一些2型CendR元件还可描述为R/K/HXXR/K/H(SEQ ID NO:20)、R/KXXR/K(SEQ IDNO:23)和R/K/HXXKG(SEQ ID NO:21)。
CendR元件的实例包括XXR/K/H,XXR/K,XXR/H,XXK/H,XXR,XXK,XXH,XXKG,RXXR/K/H,RXXR/K,RXXR/H,RXXK/H,RXXR,RXXK,RXXH,RXXKG,KXXR/K/H,KXXR/K,KXXR/H,KXXK/H,KXXR,KXXK,KXXH,KXXKG,HXXR/K/H,HXXR/K,HXXR/H,HXXK/H,HXXR,HXXK,HXXH,HXXKG,R/K/HXXR,R/KXXR,R/HXXR,K/HXXR,RXXR,KXXR,HXXR,R/K/HXXK,R/KXXK,R/HXXK,K/HXXK,RXXK,KXXK,HXXK,R/K/HXXH,R/KXXH,R/HXXH,K/HXXH,RXXH,KXXH,HXXH,R/K/HXXKG,R/KXXKG,R/HXXKG,K/HXXKG,RXXKG,KXXKG,和HXXKG.
为方便起见,如果精氨酸、赖氨酸、赖氨酸-甘氨酸对或组氨酸位于C-端,并且计划或者打算将要暴露在所述C-端的精氨酸、赖氨酸、赖氨酸-甘氨酸对或组氨酸,则氨基酸基序即可以构成CendR元件,其可被称为CendR元件或潜在的CendR元件。
该蛋白酶可控内化系统可用于改造组合物,使得其具有例如细胞类型特异性和/或组织特异性摄取的功能以及使所述组合物具有在组织中扩散的能力。此外,该规则可与很多生物过程(包括病毒感染和吞噬作用)有关。由于病毒天然能够使用所述CendR途径用于感染细胞,所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质和/或元件可用于干扰病毒感染过程。
所述公开的组织/细胞穿入系统使得可能得到不仅归巢于特定的靶组织并且还能穿入进入该组织的肽。这些肽包含两种活性序列基序:特异性受体的结合位点以及与组织穿入受体结合的序列基序。所述两种序列基序可以相互重叠。CendR肽激活携带与CendR肽一起存在的材料的转运系统。多种归巢CendR肽可用于将药物和其他化合物和组合物靶向不同的靶细胞和组织。例如,一种类型的CendR肽的受体优先在肿瘤的含氧量低的区域表达,因此有一组这些肽可以比单一肽更彻底地覆盖肿瘤组织。各种尺寸的共组合物和货物可以与所述CendR肽一起使用。在药物中纳入肿瘤穿入CendR肽(或两个的结合)可使所述药物在肿瘤中浓度更高,而不影响它在非肿瘤组织中的浓度。所公开的方法和组合物还能够使得所述药物在肿瘤中分布更广。结果是可以增强抗肿瘤活性。CendR元件可与多种其他元件结合,例如辅助分子和归巢基序,以及待递送和内化的组分,例如共组合物和货物组合物。
穿入进入肿瘤组织是所有抗癌药物的问题,因为肿瘤内液体高压压迫组织液流出所述肿瘤,这反作用于药物扩散进入脉管外肿瘤组织(Jainet al.,2007)。推测的原因是肿瘤中血管易于渗漏,而淋巴管功能低下。如果药物是完全肿瘤特异性的并且对正常组织无害(并且如果费用不是问题),就能够给予多至能够穿入任何障碍的所述药物以将足量剂量递送至所述肿瘤的全部区域。对于抗癌试剂显然并非如此;药物毒性限制了剂量,肿瘤穿入是主要的障碍。所公开的方法和组合物可对有穿入问题或者在常规治疗剂量下有效但是毒性很高的药物有最大的影响。基本上所有的抗癌药物都有这两种问题或其一。
发现了一些肽基序特异性地增加药物穿入进入肿瘤并且进入其他细胞和组织。公开的是特异性增加药物穿入进入肿瘤的肿瘤归巢肽。这些肽包含肿瘤特异性归巢序列以及被称为CendR的组织穿入和内化基序。所述CendR元件在这些肽中是隐藏的并且在靶肿瘤处由蛋白酶解切割激活。附着这些肽的药物、荧光团和纳米颗粒负载在肿瘤中积累并且穿入深入所述脉管外肿瘤组织。但是,还发现所述负载不一定需要与所述CendR肽连接或缔合。游离的CendR肽在肿瘤中特异地诱导组织穿透性(被称作CendIT作用——CendR诱导的跨上皮&组织效应),使得同时注射的药物或纳米颗粒外渗并穿入进入肿瘤组织。这种相同的效应可由带有CendR受体的任何细胞和组织完成。同时注射的化合物在肿瘤中的浓度增加约4倍。
可将肿瘤穿入CendR肽用于,例如,增强肿瘤成像和用抗肿瘤药物治疗肿瘤。FDA批准的显像剂,例如氧化铁纳米颗粒MRI造影剂可被注射进入具有肿瘤归巢CendR肽或者具有肽结合物的肿瘤携带小鼠,之后进行成像。任何已知的或以后的药物都可与CendR肽一起使用以影响并抑制肿瘤生长。例如,所述共组合物可以是任何临床使用的抗肿瘤药物。可使用已知的技术来测定所述肿瘤组织中的药物积累和分布以及抗肿瘤效力。
所公开的内化和组织穿入增强有广泛的应用。使用所公开的CendR元件和肽可以扩大和增强任何药物、化合物或组合物的有效靶向、递送和穿入。靶向和归巢CendR肽的作用有一些重大的影响。首先,药物以及其他化合物和组合物可被以比常规疗法可能的浓度更高的浓度递送至目标细胞和组织。这是由所述CendR肽介导的内化和组织穿入增强引起的。这一点特别重要,因为可给予的药物的量通常受限于副作用。因此,不增加给予的药物的量而增加靶处的药物浓度可以延长并且增强任何已知的和以后的药物和疗法的有效性。当使用靶向和归巢CendR肽时,药物浓度的增加只出现在被靶向的细胞和组织而不出现在非靶向的组织。在这样的情况下,治疗的效力增加,而副作用保持相同。第二,药物或其他化合物或组合物的剂量或量可降低而不会降低所述治疗的效力。尽管给予的药物的量减少,但是所述CendR肽会使得在所述靶细胞或组织处有相同的药物浓度。第三,由于所述辅助性CendR肽和所述药物、显像剂或其他化合物或组合物不必相互结合,可将确证并且批准的CendR肽用于增强任意药物、显影剂或其他化合物或组合物。
所公开的方法和化合物大体地解决了治疗和体内诊断并且具体而言癌症治疗和体内诊断中的重要问题:药物和其他化合物和组合物穿入组织较差。已经发现了有效并且特异地穿入肿瘤组织的肿瘤归巢肽,其能够携带附着的负载,例如荧光团、药物或纳米颗粒显像剂,深入到脉管外肿瘤组织。现还发现所述负载不必连接或结合至所述肿瘤穿入肽;所述肽在所述肿瘤中特异性地诱导组织穿透性,使得共注射的化合物可以外渗并穿入进入肿瘤组织。
所述肿瘤穿入肽概念有极大的功用:(1)它递送至肿瘤的药物(或诊断探针或其他化合物或组合物)比常规方案达到所述肿瘤的更多。这意味着更好的效力和更少的副作用。(2)所述方法能够帮助解决所述肿瘤穿入问题。药物从血管穿透的距离一般不会超过3-5个细胞直径,使得位置更远的肿瘤细胞没有任何药物,或者使得肿瘤细胞暴露于可能促使抗性出现的低药物浓度(Hambley and Hait,2009)。所公开的方法和组合物使得药物可能在肿瘤中更均衡地分布。(3)所述药物不必与所述肽连接的事实意味着一旦肿瘤穿入肽在临床上被批准,它即可被用于提高任意成像剂或抗癌药物的效力。
在另一个实例中,所述CendR肽可被用在纳米医药中。纳米医药的一个主要目标是设计通过在诊断、监测和治疗疾病中实现多种功能来超过简单药物的装置。可以使用新技术来解决多功能纳米颗粒医药用途中的一些主要问题,例如难以穿入进入血管外组织。
公开的是CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽和CendR元件。CendR元件和CendR化合物是CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR蛋白质、CendR肽等的基础特征。CendR组合物是包含CendR元件或CendR化合物的任意组合物、聚集物、缀合物、分子、蛋白质、肽等。CendR缀合物是CendR元件或CendR化合物和一种或多种其他元件、肽、蛋白质、化合物、分子、试剂和化合物等的共价或和非共价的联合物(association)。例如,CendR缀合物可包含CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR分子等。CendR分子是包含CendR元件或CendR化合物的分子。例如,CendR分子可以包含CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽等。总的来说,CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR分子和CendR缀合物是CendR组合物的所有形式。CendR化合物、CendR肽和CendR蛋白质可以是CendR分子的形式。除非上下文另有说明,提及CendR组合物即意欲指CendR组合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质和CendR元件等。CendR组分是包含CendR元件的任何分子、肽、蛋白质、化合物、缀合物、组合物等。CendR组分的实例包括,例如,CendR组合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽和CendR元件。
CendR组分可以包含一个或多个CendR元件。当CendR元件包含两个或多个CendR元件时,将所述CendR组分设计为使得一些或全部所述CendR元件被暴露于或者可暴露于蛋白质或肽的C端是有用的。这可以通过多种方式实现,例如缀合物和组合物。这也可以通过例如使肽和蛋白质分支实现。
公开了增强共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,其中在暴露所述细胞、组织或者细胞和组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强共组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化进入所述细胞,其中,在暴露所述细胞之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强共组合物穿入进入和通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物穿入进入和通过所述组织,其中,在暴露所述组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR肽和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,其中在暴露所述细胞、组织或者细胞和组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强共组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR肽和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化进入所述细胞,其中,在暴露所述细胞之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。公开了增强共组合物穿入进入并且通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR肽和所述共组合物,从而增强所述共组合物穿入进入并且通过所述组织,其中,在暴露所述组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于CendR组合物和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,其中,在暴露所述细胞、组织或者组织和细胞之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强共组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR组合物和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化进入所述细胞,其中在暴露所述细胞之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强共组合物穿入进入并且通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR组合物和所述共组合物,从而增强所述共组合物穿入进入并且通过所述组织,其中,在暴露所述组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者组织和细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于CendR缀合物和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者组织和细胞,其中,在暴露所述细胞、组织或者组织和细胞之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强共组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR缀合物和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化进入所述细胞,其中,在暴露所述细胞之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强共组合物穿入进入并且通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR缀合物和所述共组合物,从而增强所述共组合物穿入进入并且通过所述组织,其中,在暴露所述组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
在任意所公开的方法中,例如,使用共组合物的所公开的方法中,所述方法中使用的CendR元件或其他CendR组分可以是包含货物组合物的CendR元件。类似地,在任意所公开的方法中,例如,使用货物组合物的所公开的方法中,所述方法中还可以使用一种或多种组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强货物组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化进入所述细胞,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强货物组合物穿入进入并且通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物穿入进入并且通过所述组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于CendR肽和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强货物组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR肽和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化进入所述细胞,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。公开了增强货物组合物穿入进入并且通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR肽和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物穿入进入并且通过所述组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于CendR组合物和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强货物组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR组合物和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化进入所述细胞,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强货物组合物穿入进入并且通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR组合物和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物穿入进入并且通过所述组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:将所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于CendR缀合物和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
还公开了增强货物组合物内化进入细胞的方法,所述方法包括:将所述细胞暴露于CendR缀合物和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化进入所述细胞,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了增强货物组合物穿入进入并且通过组织的方法,所述方法包括:将所述组织暴露于CendR缀合物和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物穿入进入并且通过所述组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
所述CendR元件可以穿透所述细胞、组织或者组织和细胞。所述细胞、组织或者组织和细胞可以在受试者中。可通过将所述CendR元件和所述共组合物给予受试者使所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件和所述共组合物。所述CendR元件和所述共组合物可被同时给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在包含所述CendR元件和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可通过不同的途径给予所述受试者。在一些形式中,所述CendR元件和所述共组合物相互没有结合。可通过将所述CendR元件和所述货物组合物给予所述受试者使所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件和所述货物组合物。所述CendR元件和所述货物组合物可同时给予所述受试者。所述CendR元件和所述货物组合物可在包含所述CendR元件和所述货物组合物的单一组合物中给予所述受试者。这样的组合物可单独给予或者与任意其他组分(例如本文公开的那些)结合给予。例如,所述CendR/货物组合物可与一种或多种其他CendR组分、一种或多种货物组合物、一种或多种共组合物或者它们的任意结合物一起给予或使用。所述CendR元件可以在包含所述CendR元件和任意其他组分(例如本文公开的那些)的组合物中。例如,所述CendR组合物还能够包含一种或多种其他CendR组分、一种或多种货物组合物或者它们的任意结合物。
多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物能够一起使用。类似地,多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物可以一起使用。当这些多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物一起使用时,它们可以与单一类型的共组合物、单一类型的货物组合物、多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物一起使用。类似地,当多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物可以一起使用时,它们可以与单一类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物或CendR组合物一起使用,或者与多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物一起使用。一起使用是指在同一组合物中、在相同时间、在同一处理中、在同一处理方案中、在同一处理过程中等一起使用。
例如,CendR元件可与一种或多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物、一种或多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或结合物、或者它们的任意结合物一起使用。在这样的结合物中,所述CendR元件本身可在同一缀合物或组合物中与一种或多种货物组合物、一种或多种辅助分子、一种或多种归巢分子等结合。
作为另一实例,iRGD(在单一肽中与CendR元件和RGD元件结合)可以与一种或多种不同的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR化合物、CendR缀合物、CendR组合物或结合物、一种或多种不同的共组合物、多种不同的货物组合物或者结合物、或者它们的任意结合物一起使用。在这样的结合物中,所述iRGD本身可在同一缀合物或组合物中与一种或多种货物组合物、一种或多种辅助分子、一种或多种归巢分子等结合。
所述细胞、组织或者组织和细胞可以通过将所述CendR组分和所述共组合物给予所述受试者而暴露于不同CendR组分的结合物和不同共组合物的结合物。一种或多种所述CendR元件和一种或多种所述共组合物可同时给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可在一种或多种包含所述CendR组分和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述共组合物可通过一种或多种不同的途径给予所述受试者。在一些形式中,所述CendR元件和所述共组合物没有相互结合。
通过将所述CendR组分和所述货物组合物给予所述受试者而使所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于不同CendR组分的结合物和不同货物组分的结合物。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可同时给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可在一种或多种包含一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物的单一组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR元件和所述货物组合物可在一种或多种不同的组合物中给予所述受试者。一种或多种所述CendR组分和一种或多种所述货物组合物可通过一种或多种不同的途径给予所述受试者。本文所公开的多种形式中任一种的多种CendR组分、以及任选的多种共组合物中任一种可一起或者分别地以不同的时间、方式、形式、方案、剂量等给予。
可以通过将iRGD和共组合物给予所述受试者而使所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述iRGD和所述共组合物。所述iRGD和所述共组合物可同时给予所述受试者。所述iRGD和所述共组合物可在包含所述iRGD和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。所述iRGD和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述iRGD和所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述iRGD和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述iRGD和所述共组合物可通过不同的途径给予所述受试者。在一些形式中,所述iRGD和所述共组合物没有相互结合。可通过将所述iRGD和所述货物组合物给予所述受试者而使所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述iRGD和所述货物组合物。所述iRGD和所述货物组合物可同时给予所述受试者。所述iRGD和所述货物组合物可在包含所述iRGD和所述货物组合物的单一组合物中给予所述受试者。这样的组合物可被单独地或者与任意其他组分(例如本文公开的那些组分)一起给予。例如,所述iRGD/货物组合物可与一种或多种其他CendR组分、一种或多种其他货物组合物、一种或多种共组合物或者它们的结合物一起给予或使用。所述iRGD可以在包含所述iRGD和任意其他组分(例如本文公开的那些组分)的组合物中。例如,所述iRGD组合物还可以包含一种或多种其他CendR组分,一种或多种货物组合物或者它们的结合物。
所述CendR肽可以穿透所述细胞、组织或者组织和细胞。所述细胞、组织或者组织和细胞可以在受试者中。可通过将所述CendR肽和所述共组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR肽和所述共组合物。所述CendR肽和所述共组合物可同时给予所述受试者。所述CendR肽和所述共组合物可在包含所述CendR肽和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。所述CendR肽和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR肽和所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR肽和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR肽和所述共组合物可通过不同的途径给予所述受试者。在一些形式中,所述CendR肽和所述共组合物没有相互结合。可通过将所述CendR肽和所述货物组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR肽和所述货物组合物。所述CendR肽和所述货物组合物可同时给予所述受试者。所述CendR肽和所述货物组合物可在包含所述CendR肽和所述货物组合物的单一组合物中给予所述受试者。
所述CendR组合物可以穿透所述细胞、组织或者组织和细胞。所述细胞、组织或者组织和细胞可以在受试者中。可通过将所述CendR组合物和所述共组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR组合物和所述共组合物。所述CendR组合物和所述共组合物可同时给予所述受试者。所述CendR组合物和所述共组合物可在包含所述CendR组合物和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。所述CendR组合物和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR组合物和所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR组合物和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR组合物和所述共组合物可通过不同的途径给予所述受试者。在一些形式中,所述CendR组合物和所述共组合物没有相互结合。可通过将所述CendR组合物和所述货物组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR组合物和所述货物组合物。所述CendR组合物和所述货物组合物可同时给予所述受试者。所述CendR组合物和所述货物组合物可在包含所述CendR组合物和所述货物组合物的单一组合物中给予所述受试者。更通常地,CendR组分可以包含CendR元件和货物组合物。例如,CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物和CendR组合物可以包含CendR元件和货物组合物。
所述CendR缀合物可以穿透所述细胞、组织或者组织和细胞。所述细胞、组织或者组织和细胞可以在受试者中。可以通过将所述CendR缀合物和所述共组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR缀合物和所述共组合物。所述CendR缀合物和所述共组合物可同时给予所述受试者。所述CendR缀合物和所述共组合物可在包含所述CendR缀合物和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。所述CendR缀合物和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR缀合物和所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR缀合物和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR缀合物和所述共组合物可通过不同的途径给予所述受试者。在一些形式中,所述CendR缀合物和所述共组合物没有相互结合。可以通过将所述CendR缀合物和所述货物组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR缀合物和所述货物组合物。所述CendR缀合物和所述货物组合物可同时给予所述受试者。所述CendR缀合物和所述货物组合物可在包含所述CendR缀合物和所述货物组合物的单一组合物中给予所述受试者。
所述CendR元件可以是氨基酸序列的全部或部分。所述氨基酸序列可以是蛋白质或肽的全部或部分。所述CendR肽可以是包含氨基酸序列的蛋白质或肽的全部或部分。所述CendR缀合物可以包含含有氨基酸序列的蛋白质和肽。所述CendR组合物可以包含含有氨基酸序列的蛋白质或肽。所述氨基酸序列可以包含CendR元件。所述氨基酸序列还可以包含一个或多个辅助分子。所述氨基酸序列还可以包含一个或多个归巢分子。所述蛋白质或肽还可以包含一个或多个辅助分子。所述蛋白质或肽还可以包含一个或多个归巢分子。所述CendR缀合物可以包含一种或多种货物组合物。所述CendR组合物可以包含一种或多种货物组合物。
在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽时,所述蛋白质或肽不能内化进入细胞、穿入组织或者不能内化进入细胞并且不能穿入组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能穿入组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能内化进入细胞且也不能穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述共组合物缔合而穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列是所述蛋白质或肽中唯一的功能性内化元件。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物穿入进入或通过组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽时,不增强所述共组合物穿入进入或通过组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述货物组合物穿入进入或通过组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽,不增强所述货物组合物穿入进入或通过组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过细胞和组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过细胞和组织。
在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能内化进入细胞、穿入组织或者不能内化进入细胞并且不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能内化进入细胞且也不能穿入组织。在一些形式中,所述CendR元件可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR元件可以不与所述共组合物缔合而穿入组织。在一些形式中,所述CendR元件可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR元件是所述蛋白质或肽中唯一的功能性元件。在一些形式中,当所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过细胞、组织或者细胞或组织,但是当所述细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过细胞、组织或者细胞或组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织,但是当所述组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当所述细胞和组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织,但是当所述细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织。在一些形式中,当所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件时,增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,但是当所述细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR元件时,不增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当所述组织暴露于所述CendR元件时,增强所述货物组合物穿入进入或通过组织,但是当所述组织不暴露于所述CendR元件时,不增强述货物组合物穿入进入或通过组织。在一些形式中,当所述细胞和组织暴露于所述CendR元件时,增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过细胞和组织,但是当所述细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过细胞和组织。
在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR肽时,所述CendR肽可以内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR肽时,所述CendR肽不能内化进入细胞、穿入组织或者不能内化进入细胞并且不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR肽中时,所述CendR肽可以穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR肽中时,所述CendR肽不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR肽中时,所述CendR肽可以内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR肽中时,所述CendR肽不能内化进入细胞且也不能穿入组织。在一些形式中,所述CendR肽可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR肽可以不与所述共组合物缔合而穿入组织。在一些形式中,所述CendR肽可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR元件是所述CendR肽中唯一的功能性内化元件。在一些形式中,当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR肽中时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR肽时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR肽时,增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR肽时,不增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR肽时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR肽时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织。在一些形式中,当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR肽时,增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR肽时,不增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR肽时,增强所述货物组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR肽时,不增强所述货物组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR肽时,增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR肽时,不增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过所述细胞和组织。
在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR缀合物中时,所述CendR缀合物可以内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR缀合物中时,所述CendR缀合物不能内化进入细胞、穿入组织或者不能内化进入细胞并且不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR缀合物中时,所述CendR缀合物可以穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR缀合物中时,所述CendR缀合物不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR缀合物中时,所述CendR缀合物可以内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR缀合物中时,所述CendR缀合物不能内化进入细胞且也不能穿入组织。在一些形式中,所述CendR缀合物可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR缀合物可以不与所述共组合物缔合而穿入组织。在一些形式中,所述CendR缀合物可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR元件是所述CendR缀合物中唯一的功能性内化元件。在一些形式中,当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR缀合物时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR缀合物时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR缀合物时,增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR缀合物时,不增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR缀合物时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR缀合物时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织。在一些形式中,当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR缀合物时,增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR缀合物时,不增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR缀合物时,增强所述货物组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR缀合物时,不增强所述货物组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR缀合物时,增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过所述细胞和组织,但是当细胞和不暴露于所述CendR缀合物时,不增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过所述细胞和组织。
在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物可以内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物不能内化进入细胞、穿入组织或者不能内化进入细胞并且不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物可以穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物不能穿入组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物可以内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述CendR元件不存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物不能内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR组合物可以不与所述共组合物结合而内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR组合物可以不与所述共组合物缔合而穿入组织。在一些形式中,所述CendR组合物可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述CendR元件是所述CendR组合物中唯一的功能性内化元件。在一些形式中,当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR组合物时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR组合物时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR组合物时,增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR组合物时,不增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR组合物时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR组合物时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织。在一些形式中,当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR组合物时,增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR组合物时,不增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR组合物时,增强所述货物组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR组合物时,不增强所述货物组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR组合物时,增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR组合物时,不增强所述货物组合物内化和穿入进入或者通过所述细胞和组织。
所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可活化CendR元件可以是可蛋白酶活化CendR元件。所述CendR肽可以是可活化CendR肽。所述可活化CendR肽可以是可蛋白酶活化CendR肽。所述CendR肽可以在所述蛋白质或肽的C末端。所述CendR缀合物可以是可活化CendR缀合物。所述可活化CendR缀合物可以是可蛋白酶活化CendR缀合物。所述CendR缀合物可以在所述蛋白质或肽的C末端。所述CendR组合物可以是可活化CendR组合物。所述可活化CendR组合物可以是可蛋白酶活化CendR组合物。所述CendR组合物可以在所述蛋白质或肽的C末端。
所述蛋白质或肽可以是环化的。所述蛋白质或肽可以是线性的。所述CendR元件可以在所述蛋白质或肽的C末端。所述共组合物可以包含治疗剂。所述共组合物可以包含检测剂。所述共组合物可以包含载体、运载体或者载体和运载体。所述共组合物可以包含,例如,治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒子、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂或结合物。
所述货物组合物可以包含治疗剂。所述货物组合物可以包含检测剂。所述货物组合物可以包含载体、运载体或者载体和运载体。所述货物组合物可以包含,例如,治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒子、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂或结合物。
在一些形式中,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。在一些形式中,所述CendR肽和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。在一些形式中,所述CendR缀合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。在一些形式中,所述CendR组合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。在一些形式中,所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。在一些形式中,所述CendR肽和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。在一些形式中,所述CendR缀合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。在一些形式中,所述CendR组合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了包含CendR元件和共组合物的组合物。还公开了包含CendR肽和共组合物的组合物。还公开了包含CendR缀合物和共组合物的组合物。还公开了包含CendR组合物和共组合物的组合物。公开了包含包含CendR元件和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽和共组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物和共组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物和共组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了包含CendR元件和一种或多种共组合物的组合物。还公开了包含CendR肽和一种或多种共组合物的组合物。还公开了包含CendR缀合物和一种或多种共组合物的组合物。还公开了包含CendR组合物和一种或多种共组合物的组合物。公开了包含CendR元件和一种或多种共组合物的组合物,其中所述CendR元件和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽和一种或多种共组合物的组合物,其中所述CendR肽和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物和一种或多种共组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物和一种或多种共组合物的组合物,其中所述CendR组合物和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
公开了包含CendR元件和货物组合物的组合物。还公开了包含CendR肽和货物组合物的组合物。还公开了包含CendR缀合物和货物组合物的组合物。还公开了包含CendR组合物和货物组合物的组合物。公开了包含CendR元件和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽和货物组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物和货物组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物和货物组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
公开了包含CendR元件和一种或多种货物组合物的组合物。还公开了包含CendR肽和一种或多种货物组合物的组合物。还公开了包含CendR缀合物和一种或多种货物组合物的组合物。还公开了包含CendR组合物和一种或多种货物组合物的组合物。公开了包含CendR元件和一种或多种货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和至少一种所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽和一种或多种货物组合物的组合物,其中所述CendR肽和至少一种所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物和一种或多种货物组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和至少一种所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物和一种或多种货物组合物的组合物,其中所述CendR组合物和至少一种所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含CendR元件、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽包含所述辅助分子。还公开了包含CendR缀合物、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物包含所述辅助分子。还公开了包含CendR组合物、辅助分子和共组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物包含所述辅助分子。在这些组合物中,所述辅助分子可以是或者可以包含辅助肽。所述辅助肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种共组合物和/或一种或多种辅助分子,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含CendR元件、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽包含所述归巢分子。还公开了包含CendR缀合物、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物包含所述归巢分子。还公开了包含CendR组合物、归巢分子和共组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物包含所述归巢分子。在这些组合物中,所述归巢分子可以是或者可以包含归巢肽。所述归巢肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种共组合物和/或一种或多种归巢分子,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含CendR元件、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物和所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽包含所述辅助分子。还公开了包含CendR缀合物、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物包含所述辅助分子。还公开了包含CendR组合物、辅助分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物包含所述辅助分子。在这些组合物中,所述辅助分子可以是或者可以包含辅助肽。所述辅助肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种货物组合物和/或一种或多种辅助分子,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述辅助分子相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含CendR元件、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR缀合物、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR组合物、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物和所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR肽、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR肽和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR肽包含所述归巢分子。还公开了包含CendR缀合物、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR缀合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR缀合物包含所述归巢分子。还公开了包含CendR组合物、归巢分子和货物组合物的组合物,其中所述CendR组合物和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR组合物包含所述归巢分子。在这些组合物中,所述归巢分子可以是或者可以包含归巢肽。所述归巢肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种货物组合物和/或一种或多种归巢分子,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述货物组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物或CendR组合物和至少一种所述归巢分子相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含CendR元件和辅助肽,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和辅助肽,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。在这些组合物中,所述辅助肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种共组合物和/或一种或多种辅助肽,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述辅助肽相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和共组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。在这些组合物中,所述归巢肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种共组合物和/或一种或多种归巢肽,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述归巢肽相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含CendR元件和辅助肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和辅助肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。在这些组合物中,所述辅助肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种货物组合物和/或一种或多种辅助肽,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述辅助肽相互共价连接或非共价缔合。
还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含蛋白质或肽和货物组合物的组合物,其中所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件和归巢肽,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合。在这些组合物中,所述归巢肽可以与所述CendR元件重叠或者与所述CendR元件分开。在这些组合物中,所述组合物可以包含一种或多种货物组合物和/或一种或多种归巢肽,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述货物组合物没有相互共价连接或非共价缔合,其中所述蛋白质或肽和至少一种所述归巢肽相互共价连接或非共价缔合。
如本文所使用,提及组分(例如CendR元件和共组合物)为“没有共价连接”是指所述组分没有通过共价键连接(例如,所述CendR元件和所述共组合物没有通过共价键连接)。也就是说,在例如所述CendR元件和所述共组合物之间没有共价键的连续链。相反地,提及组分(例如CendR元件和货物组合物)为“共价连接”是指所述组分通过共价键连接(例如,所述CendR元件和所述货物组合物通过共价键连接)。也就是说,在例如所述CendR元件和所述货物组合物之间有共价键的连续链。组分可以直接或者间接地共价连接。直接共价连接是指每个所述组分的原子之间存在共价键。间接共价连接是指每个所述组分的原子之间不存在共价键。也就是说,一些不属于相互连接的两个组分的其他一个或多个原子介入到所述组分的原子之间。直接和间接共价连接都涉及共价键的连续链。
非共价缔合(non-covalent association)是指组分通过非共价键和相互作用缔合。非共价缔合可以是直接的或间接的。直接非共价缔合是指涉及通过共价键链各自分别与所述组分连接的原子的非共价键。因此,在直接非共价缔合中,没有其他分子介入所缔合的组分之间。间接非共价缔合是指连接所述组分的分子和键的任意链,其中所述组分没有共价连接(也就是说,有至少一个非所述组分的不同分子通过非共价键介入所述组分之间)。
提及组分(例如CendR元件和共组合物)没有“非共价缔合”是指在所述组分之间没有直接或间接非共价缔合。也就是说,例如,没有共价连接于CendR元件的原子参与到与共价连接于共组合物的原子的非共价键。在该含义中,CendR元件和共组合物可以一起在组合物中,在其中它们通过多个中间非共价键间接缔合,而不是如本文定义的所述术语那样非共价缔合。例如,CendR元件和共组合物可在载体中混合在一起,在其中它们没有直接非共价缔合。被提及为没有间接非共价缔合的CendR元件和共组合物不能在连续组合物中混合在一起。提及组分(例如CendR元件和共组合物)没有“直接非共价缔合”是指在所述组分之间没有直接的非共价缔合(可能存在间接非共价缔合)。提及组分(例如CendR元件和共组合物)没有“间接非共价缔合”是指所述组分之间没有直接或间接非共价缔合。
应理解,组分可以通过包括直接和间接非共价缔合的多条链和途径非共价缔合。对于这些定义,单个直接非共价缔合的存在使得所述缔合为直接非共价缔合,即使还有间接非共价缔合存在。类似地,组分之间存在共价连接意味着所述组分是共价连接的,即使还有非共价缔合存在。还应理解,相互之间碰巧缺乏任何非共价缔合的共价连接组分不被认为落入没有非共价缔合的组分的定义中。
在一些形式中,所述共组合物不包含功能性内化元件。所述共组合物可以包含功能性内化元件。在一些形式中,所述共组合物不包含归巢分子。所述共组合物可以包含归巢分子。在一些形式中,所述共组合物不包含归巢肽。所述共组合物可以包含归巢肽。所述共组合物可以选择性地归巢于肿瘤。在一些形式中,所述共组合物不选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述共组合物可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。在一些形式中,所述共组合物不包含辅助分子。所述共组合物可以包含辅助分子。在一些形式中,所述共组合物不包含辅助肽。所述共组合物可以包含辅助肽。所述共组合物可以选择性地归巢于肿瘤。
所述CendR元件可与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述CendR元件的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述CendR元件或包含所述CendR元件的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。辅助分子可以是具有有用功能并且可与CendR元件、CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质和/或CendR肽组合使用的任何分子、化合物、组分等。可用辅助分子的实例包括归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入分子、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子。不同的辅助分子可以相互具有相似或不同的功能。具有相似功能、不同功能或者两者都有的辅助分子可与CendR元件、CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质和/或CendR肽相缔合。
所述辅助分子可以与所述CendR元件分开或者与所述CendR元件重叠。例如,一些辅助分子是氨基酸序列。这可以使得由所述CendR元件组成的所述氨基酸序列与由所述辅助氨基酸序列组成的氨基酸序列重叠。例如,iRGD、LyP-1、iNGR和RGR肽各自包含在所述肽中相互重叠的辅助序列和CendR序列。或者,所述辅助分子可以是不与所述CendR元件重叠的分开实体。例如,非CendR元件的HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR或RGD肽可由不与CendR元件重叠的氨基酸序列组成。在一些形式中,所述辅助分子可包含例如CendR肽中与不同于所述CendR元件的受体的特定受体结合的氨基酸序列。
所述CendR肽可与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述CendR肽的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述CendR肽或者包含所述CendR肽的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。所述CendR缀合物可以与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述CendR缀合物的缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述CendR缀合物或包含所述CendR缀合物的缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。所述CendR组合物可以与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述CendR组合物的组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述CendR组合物或包含所述CendR组合物的组合物共价结合或非共价缔合。
所述氨基酸序列可以与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述氨基酸序列的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述氨基酸序列或包含所述氨基酸序列的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述氨基酸序列可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述氨基酸序列可以包含CREKA肽。所述蛋白质或肽可以与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述肽的蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述肽或包含所述肽的蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,辅助分子可以是包含所述蛋白质的蛋白质、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述蛋白质或包含所述蛋白质的蛋白质、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述蛋白质或肽可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述缀合物可以与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述缀合物的缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述缀合物或包含所述缀合物的缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述缀合物可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述组合物可以与一个或多个辅助分子缔合。例如,辅助分子可以是包含所述组合物的组合物的一部分。作为另一个实例,所述辅助分子可以与所述组合物或包含所述组合物的组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述组合物可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。
所述CendR元件可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述CendR元件的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述CendR元件或包含所述CendR元件的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。所述归巢分子可以与所述CendR元件分开或者与所述CendR元件重叠。例如,一些归巢分子是氨基酸序列。这可以使得由所述CendR元件组成的所述氨基酸序列与由所述归巢氨基酸组成的所述氨基酸序列重叠。例如,iRGD、LyP-1、iNGR和RGR肽各自包含在所述肽中相互重叠的归巢序列和CendR序列。或者,所述归巢分子可以是不与所述CendR元件重叠的分开实体。例如,非CendR元件的HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR或RGD肽可以由不与CendR元件重叠的氨基酸序列组成。在一些形式中,所述归巢分子可包含例如CendR肽中与不同于所述CendR元件的受体的特定受体结合的序列。
所述CendR肽可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述CendR肽的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述CendR肽或包含所述CendR肽的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。所述CendR缀合物可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述CendR缀合物的缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述CendR缀合物或包含所述CendR缀合物的缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。所述CendR组合物可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述CendR组合物的组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述CendR组合物或包含所述CendR组合物的组合物共价连接或非共价缔合。
所述氨基酸序列可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述氨基酸序列的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述氨基酸序列或包含所述氨基酸序列的氨基酸序列、蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述氨基酸序列可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述氨基酸序列可以包含CREKA肽。所述蛋白质或肽可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述肽的蛋白质、肽、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述肽或包含所述肽的蛋白质、肽、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,归巢分子可以是包含所述蛋白质的蛋白质、缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述蛋白质或包含所述蛋白质的蛋白质、缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述蛋白质或肽可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述蛋白质或肽可以包含iRGD。所述蛋白质或肽可以包含LyP-1肽。所述蛋白质或肽可以包含iNGR。所述蛋白质或肽可以包含RGR肽。所述蛋白质或肽可以包含CREKA肽。所述缀合物可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述缀合物的缀合物或组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述缀合物或包含所述缀合物的缀合物或组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述缀合物可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或者结合物。所述缀合物可以包含iRGD。所述缀合物可以包含LyP-1肽。所述缀合物可以包含iNGR。所述缀合物可以包含RGR肽。所述缀合物可以包含CREKA肽。所述组合物可以与一个或多个归巢分子缔合。例如,归巢分子可以是包含所述组合物的组合物的一部分。作为另一个实例,所述归巢分子可以与所述组合物或包含所述组合物的组合物共价连接或非共价缔合。例如,所述组合物可以包含非CendR元件的iRGD肽、LyP-1肽、RGR肽、HER2结合肽、CREKA肽、NGR肽、iNGR、RGD肽或结合物。所述组合物可以包含iRGD。所述组合物可以包含LyP-1肽。所述组合物可以包含iNGR。所述组合物可以包含RGR肽。所述组合物可以包含CREKA肽。
所述氨基酸序列可被选择用于内化进入细胞。所述氨基酸序列可被选择用于组织穿入。所述氨基酸序列可被选择用于内化进入细胞和组织穿入。所述蛋白质或肽可被选择用于内化进入细胞。所述蛋白质或肽可被选择用于组织穿入。所述蛋白质或肽可被选择用于内化进入细胞和组织穿入。所述缀合物可被选择用于内化进入细胞。所述缀合物可被选择用于组织穿入。所述缀合物可被选择用于内化进入细胞和组织穿入。所述组合物可被选择用于内化进入细胞。所述组合物可被选择用于组织穿入。所述组合物可被选择用于内化进入细胞和组织穿入。
所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于肿瘤。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤的脉管系统。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于肿瘤或癌症的一个或多个具体阶段。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于一个或多个具体阶段的肿瘤或癌症的脉管系统。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于一种或多种具体类型的肿瘤的一个或多个具体阶段。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于一个或多个具体阶段的一种或多种具体类型的肿瘤的脉管系统。
所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于肺组织。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于肺脉管系统。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于心脏组织。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于心脏脉管系统。所述CendR元件、CendR肽、CendR缀合物、CendR组合物、氨基酸序列、蛋白质或肽、缀合物、组合物、共组合物、货物组合物或结合物可以选择性地归巢于脑细胞、脑的干细胞、脑组织和/或脑脉管系统、肾细胞、肾干细胞、肾组织和/或肾脉管系统、皮肤细胞、皮肤干细胞、皮肤组织和/或皮肤脉管系统、肺细胞、肺组织和/或肺脉管系统、胰腺细胞、胰腺组织和/或胰腺脉管系统、肠细胞、肠组织和/或肠脉管系统、肾上腺细胞、肾上腺组织和/或肾上腺脉管系统、视网膜细胞、视网膜组织和/或视网膜脉管系统、肝细胞、肝组织和/或肝脉管系统、前列腺细胞、前列腺组织和/或前列腺脉管系统、子宫内膜异位细胞、子宫内膜异位组织和/或子宫内膜异位脉管系统、卵巢细胞、卵巢组织和/或卵巢脉管系统、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管和/或肿瘤脉管系统、骨细胞、骨组织和/或骨脉管系统、骨髓细胞、骨髓组织和/或骨髓脉管系统、软骨细胞、软骨组织和/或软骨脉管系统、干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、成体干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、嗅成体干细胞、神经嵴干细胞、癌干细胞、血细胞、红细胞、血小板、白细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴样细胞、淋巴细胞、单核细胞、创伤脉管系统、损伤组织的脉管系统、发炎组织的脉管系统、动脉粥样硬化斑块或结合。
可以以任意合适的方式设计并产生CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽和CendR元件。例如,可通过选择用于内化进入细胞和/或穿入组织的氨基酸序列来设计或者产生所公开的CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质和CendR肽中的CendR元件,其中所述氨基酸序列包含C端元件,其中蛋白质或肽包含所选择的氨基酸序列,其中所选择的氨基酸序列在所述蛋白质或肽的C末端。
公开了包含CendR元件和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。还公开了包含CendR元件和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件是2型CendR元件。
还公开了增强共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,在暴露所述细胞、组织或者细胞和组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。
还公开了增强货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织。所述CendR元件和所述货物组合物可以相互共价连接或非共价缔合。所述CendR元件可以是2型CendR元件。所述方法还可以包括,在将所述细胞、组织或者组织和细胞之前暴露于所述CendR元件之前,将所述CendR元件连接至所述货物组合物。
所述CendR元件可以穿透所述细胞、组织或者组织和细胞。所述细胞、组织或者组织和细胞可以在受试者中。可以通过将所述CendR元件和所述共组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件和所述共组合物。可以通过将所述CendR元件和所述货物组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件。
所述CendR元件可以与一个或多个辅助分子缔合。所述CendR元件可以与多个辅助分子缔合。在一些形式中,至少一个所述辅助分子与所述CendR元件重叠。在一些形式中,至少一个所述辅助分子不与所述CendR元件重叠。在一些形式中,至少一个所述辅助分子可以包含RGD肽、iRGD、LyP-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或结合物。一个或多个所述辅助分子可以独立地是归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入肽、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子或结合物。一个或多个所述辅助分子可以是归巢分子。一个或多个所述辅助分子可以是辅助肽。一个或多个所述辅助分子可以包含iRGD。一个或多个所述辅助分子可以包含LyP-1肽。一个或多个所述辅助分子可以包含iNGR。一个或多个所述辅助分子可以包含RGR肽。
所述CendR元件可以选择性地归巢于脑细胞、组织或者脑细胞和组织、肾细胞、组织或者肾细胞和组织、皮肤和腱细胞、组织或者皮肤和键细胞与组织、肺细胞、组织或者肺细胞和组织、胰腺细胞、组织或者胰腺细胞和组织、肠细胞、组织或者肠细胞和组织、肾上腺细胞、组织或者肾上腺细胞和组织、视网膜细胞、组织或者视网膜细胞和组织、肝细胞、组织或者肝细胞和组织、前列腺细胞、组织或者前列腺细胞和组织、子宫内膜异位细胞、组织或者子宫内膜异位细胞和组织、卵巢细胞、组织或者卵巢细胞和组织、心脏细胞、组织或者心脏细胞和组织、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管或结合。所述CendR元件可以选择性地归巢于肿瘤。所述CendR元件可以选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述CendR元件可以选择性地归巢于肺组织。所述CendR元件可以选择性地归巢于心脏组织。
所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可活化CendR元件可以是可蛋白酶活化CendR元件。所述可蛋白酶活化CendR元件可以被丝氨酸蛋白酶、血纤蛋白溶酶、血纤蛋白溶酶原激活剂、尿激酶、前蛋白转化酶(proprotein convertase)、弗林蛋白酶、羧肽酶、羧肽酶A、谷氨酸特异性羧肽酶、脯氨酸特异性羧肽酶、PSMA或结合物活化。
所述CendR元件和所述共组合物可同时给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在包含所述CendR元件和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可通过不同的途径给予所述受试者。
在一些形式中,所述CendR元件和所述共组合物没有相互结合。所述共组合物或货物组合物可以包含治疗剂。所述共组合物或货物组合物可以包含检测剂。所述共组合物或货物组合物可以包含载体、运载体或者载体和运载体。所述共组合物或货物组合物可以包含治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性试剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒子、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂、或抗血管生成剂、促血管生成剂或结合物。
所述CendR元件可包括在氨基酸序列中。所述氨基酸序列可包括在蛋白质或肽中。所述CendR元件可包括在蛋白质或肽中。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能内化进入细胞、穿入组织或者不能内化进入细胞并且不能穿入组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能穿入组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽可以内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能内化进入细胞并且穿入组织。
在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述货物组合物缔合而内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述共组合物缔合而穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述货物组合物缔合而穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述共组合物缔合而内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以不与所述货物组合物缔合而内化进入细胞并且穿入组织。在一些形式中,所述氨基酸序列可以是所述蛋白质或肽中唯一的功能性内化元件。
所述蛋白质或肽可以是环化的。所述CendR元件可以在所述蛋白质或肽的C末端。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织。在一些形式中,当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织。在一些形式中,当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织。
所述氨基酸序列可与一个或多个辅助分子缔合。所述蛋白质或肽可与一个或多个辅助分子缔合。一个或多个所述辅助分子可独立地是归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入肽、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子或结合物。一个或多个所述辅助分子可以是归巢分子。一个或多个所述归巢分子可以独立地是RGD肽、iRGD、LyP-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或结合物。
所述蛋白质或肽可以包含一个或多个辅助肽。所述氨基酸序列可以包含一个或多个辅助肽。一个或多个所述辅助肽可以独立地是归巢肽、靶向分子、亲和配体、细胞穿入肽、内体逃逸肽、亚细胞靶向肽、核靶向肽或结合物。一个或多个所述归巢肽可以独立地是RGD肽、iRGD、LyP-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或结合物。所述蛋白质或肽可以包含iRGD。所述蛋白质或肽可以包含LyP-1肽。所述蛋白质或肽可以包含iNGR。所述蛋白质或肽可以包含RGR肽。
所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于脑细胞、组织或者脑细胞和组织、肾细胞、组织或者肾细胞和组织、皮肤和腱细胞、组织或者皮肤和腱细胞以及组织、肺细胞、组织或者肺细胞和组织、胰腺细胞、组织或者胰腺细胞和组织、肠细胞、组织或者肠细胞和组织、肾上腺细胞、组织或者肾上腺细胞和组织、视网膜细胞、组织或者视网膜细胞和组织、肝细胞、组织或者肝细胞和组织、前列腺细胞、组织或者前列腺细胞和组织、子宫内膜异位细胞、组织或者子宫内膜异位细胞和组织、卵巢细胞、组织或者卵巢细胞和组织、心脏细胞、组织或者心脏细胞和组织、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管或结合。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肿瘤。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肿瘤脉管系统。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于肺组织。所述蛋白质或肽能够选择性地归巢于心脏组织。
所述氨基酸序列可被选择用于内化进入细胞。所述氨基酸序列可被选择用于组织穿入。所述氨基酸序列可被选择用于内化进入细胞和组织穿入。
在一些形式中,当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞或组织。在一些形式中,当组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织。在一些形式中,当细胞和组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织。
所述CendR元件可包括在CendR组合物中。所述CendR组合物可以包含一种或多种辅助分子。所述CendR组合物可以包含一种或多种货物组合物。所述CendR组合物可以包含一种或多种归巢分子。所述CendR元件可包括在CendR缀合物中。所述CendR缀合物可以包含一种或多种辅助分子。所述CendR缀合物可以包含一种或多种货物组合物。所述CendR缀合物可以包含一种或多种归巢分子。
所述细胞、组织或者组织和细胞可以暴露于多种辅助分子。所述细胞、组织或者组织和细胞可以暴露于多种归巢分子。所述细胞、组织或者组织和细胞可以暴露于多种货物组合物。所述细胞、组织或者组织和细胞可以暴露于多种CendR元件。所述细胞、组织或者组织和细胞可以暴露于多种共组合物。
如本文所定义,C端元件(CendR元件)可以是精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸(对于1型CendR元件),或者是组氨酸或具有序列X1X2X3X4的氨基酸序列,其中X1可以是R、K或H,其中X4可以是R、K、H或KG,并且其中X2和X3各自可以独立地是任意氨基酸(对于2型CendR元件)。
如本文所使用,“选择氨基酸序列用于内化进入细胞”是指选择、鉴别、设计或者分类氨基酸序列,具体目的是使得包含所述氨基酸序列的蛋白质和肽进入细胞。因此,例如,选择氨基酸序列用于一些目的或能力,而不是使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞,并且没有使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞的目的,则不构成“选择氨基酸序列用于内化进入细胞”。选择氨基酸序列用于一些目的或能力以及用于使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞确实构成“选择氨基酸序列用于内化进入细胞”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞为具体目的选择氨基酸序列构成“选择氨基酸序列用于内化进入细胞”。
如本文所使用,“选择氨基酸序列用于穿入组织”是指选择、鉴别、设计或者分类氨基酸序列,具体目的是使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入组织(也就是组织穿入)。因此,例如,选择氨基酸序列用于一些目的或能力,而不是使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入组织,并且没有使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入组织的目的,则不构成“选择氨基酸序列用于组织穿入”。选择氨基酸序列用于一些目的或能力以及用于使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入组织确实构成“选择氨基酸序列用于组织穿入”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入组织为具体目的选择氨基酸序列构成“选择氨基酸序列用于穿入组织”。
如本文所使用,“选择氨基酸序列用于内化进入细胞和/或穿入组织”是指选择、鉴别、设计或者分类氨基酸序列,具体目的是使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织。因此,例如,选择氨基酸序列用于一些目的或能力,而不是使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞、组织或者进入细胞和组织,并且没有使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞、组织或者进入细胞和组织的目的,则不构成“选择氨基酸序列用于内化进入细胞和/或穿入组织”。选择氨基酸序列用于一些目的或能力以及用于使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织确实构成“选择氨基酸序列用于内化进入细胞和/或穿入组织”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得包含所述氨基酸序列的蛋白质或肽进入细胞、组织或者进入细胞和组织为具体目的选择氨基酸序列构成“选择氨基酸序列用于内化进入细胞和/或穿入组织”。
如本文所使用,除非上下文另有说明,“选择共组合物用于内化进入细胞”是指选择、鉴别、设计或者分类共组合物和CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件,具体目的是使得所述共组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞。因此,例如,选择共组合物用于一些目的或能力,而不是使得随着选出的CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件的进入一起进入细胞,并且没有使得所述共组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞的目的,则不构成“选择共组合物用于内化进入细胞”。选择共组合物用于一些目的或能力以及用于使得所述共组合物进入细胞确实构成“选择共组合物用于内化进入细胞”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得共组合物进入细胞为具体目的选择共组合物构成“选择共组合物用于内化进入细胞”。
如本文所使用,除非上下文另有说明,“选择共组合物用于穿入组织”是指选择、鉴别、设计或者分类共组合物和CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件,具体目的是使得所述共组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入组织(即组织穿入)。因此,例如,选择共组合物用于一些目的或能力,而不是使得随着选出的CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件的进入一起进入组织,并且没有使得所述共组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入组织的目的,则不构成“选择共组合物用于穿入组织”。选择共组合物用于一些目的或能力以及用于使得所述共组合物进入组织确实构成“选择共组合物用于穿入组织”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得共组合物进入组织为具体目的选择共组合物构成“选择共组合物用于穿入组织”。
如本文所使用,除非上下文另有说明,“选择共组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”是指选择、鉴别、设计或者分类共组合物和CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件,具体目的是使得所述共组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织。因此,例如,选择共组合物用于一些目的或能力,而不是使得随着选出的CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件的进入一起进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织,并且没有使得所述共组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织的目的,则不构成“选择共组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”。选择共组合物用于一些目的或能力以及用于使得所述共组合物进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织确实构成“选择共组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得共组合物进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织为具体目的选择共组合物构成“选择共组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”。
如本文所使用,除非上下文另有说明,“选择货物组合物用于内化进入细胞”是指选择、鉴别、设计或者分类货物组合物和CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件,具体目的是使得所述货物组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞。因此,例如,选择货物组合物用于一些目的或能力,而不是使得随着选出的CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件的进入一起进入细胞,并且没有使得所述货物组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞的目的,则不构成“选择货物组合物用于内化进入细胞”。选择货物组合物用于一些目的或能力以及用于使得所述货物组合物进入细胞确实构成“选择货物组合物用于内化进入细胞”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得货物组合物进入细胞为具体目的选择货物组合物构成“选择货物组合物用于内化进入细胞”。
如本文所使用,除非上下文另有说明,“选择货物组合物用于穿入组织”是指选择、鉴别、设计或者分类货物组合物和CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件,具体目的是使得所述货物组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入组织(即组织穿入)。因此,例如,选择货物组合物用于一些目的或能力,而不是使得随着选出的CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件的进入一起进入组织,并且没有使得所述货物组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入组织的目的,则不构成“选择货物组合物用于穿入组织”。选择货物组合物用于一些目的或能力以及用于使得所述货物组合物进入组织确实构成“选择货物组合物用于穿入组织”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得货物组合物进入组织为具体目的选择货物组合物构成“选择货物组合物用于穿入组织”。
如本文所使用,除非上下文另有说明,“选择货物组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”是指选择、鉴别、设计或者分类货物组合物和CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件,具体目的是使得所述货物组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织。因此,例如,选择货物组合物用于一些目的或能力,而不是使得随着选出的CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件的进入一起进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织,并且没有使得所述货物组合物和所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织的目的,则不构成“选择货物组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”。选择货物组合物用于一些目的或能力以及用于使得所述货物组合物进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织确实构成“选择货物组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”。因此,存在其他目标或目的并不改变至少以使得货物组合物进入细胞和组织之一或者进入细胞和组织为具体目的选择货物组合物构成“选择货物组合物用于内化进入细胞和/或穿入组织”。
如本文所使用,“致使化合物或组合物共价连接或非共价缔合”于其他物质是指致使没有与所述其他物质共价连接或非共价缔合的化合物或组合物变成或者呈现与所述其他物质共价连接或非共价缔合的状态的任意作用。例如,将归巢分子共价连接至CendR元件构成“致使归巢分子共价连接或非共价缔合”于所述CendR元件。作为另一个实例,开始并不存在、然后作为组合物(包含所述CendR肽待与其连接或缔合的物质)的一部分被合成的CendR肽构成“致使CendR肽共价连接或非共价缔合”于所述物质。例如,合成包含目标氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的肽构成了致使所述目标氨基酸序列共价连接或非共价缔合于所述含C端元件的氨基酸序列。但是,一般来说,合成天然包含目标氨基酸序列和含C端元件的氨基酸序列的蛋白质或肽被排除在“致使目标氨基酸序列共价连接或非共价缔合”于含C端元件的氨基酸序列的过程之外。
如本文所使用,“致使共组合物共价连接或非共价缔合”于其他物质是指致使没有与所述其他物质共价连接或非共价缔合的共组合物变成或者呈现与所述其他物质共价连接或非共价缔合的状态的任意作用。更明确地,“致使共组合物共价连接或非共价缔合”于其他物质是指致使共组合物和所述其他物质变成或者呈现共价连接或非共价缔合的状态的任意作用。作为一个实例,将共组合物共价连接至另一共组合物构成“致使共组合物共价连接或非共价缔合”于另一共组合物。作为另一个实例,开始不存在、然后作为组合物(包含所述共组合物待与其连接或缔合的物质)的一部分被合成的共组合物构成“致使共组合物共价连接或非共价缔合”于所述物质。
如本文所使用,“致使货物组合物共价连接或非共价缔合”于其他物质是指致使没有与所述其他物质共价连接或非共价缔合的货物组合物变成或呈现与所述其他物质共价连接或非共价缔合的状态的任意作用。更明确地,“致使货物组合物共价连接或非共价缔合”于其他物质是指致使货物组合物和所述其他物质变成或呈现共价连接或非共价缔合的状态的任意作用。作为一个实例,将货物组合物共价连接至另一货物组合物构成“致使货物组合物共价连接或非共价缔合”于另一货物组合物。作为另一个实例,开始不存在、然后作为组合物(包含所述货物组合物待与其连接或缔合的物质)的一部分被合成的货物组合物构成“致使货物组合物共价连接或非共价缔合”于所述物质。
如本文所使用,“CendR元件”是指具有C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸序列的氨基酸序列(对于1型CendR元件),或者具有C端组氨酸或具有序列X1X2X3X4的C端氨基酸序列的氨基酸序列,其中X1可以是R、K或H,其中X4可以是R、K、H或KG,并且其中X2和X3各自可以独立地是任意氨基酸(对于2型CendR元件)。一些2型CendR元件还可被描述为R/K/HXXR/K/H(SEQ ID NO:20)、R/KXXR/K(SEQ ID NO:23)和R/K/HXXKG(SEQ ID NO:21)。所述X1、X2和X3氨基酸还可被选择以将另外的蛋白质募集至所述细胞表面的NRP-1分子,例如通过纳入重叠的辅助肽或归巢肽。这可应用于,例如,调节CendR元件(和包含CendR元件的组合物、缀合物、蛋白质和肽)的选择性以及内化和/或组织穿入能力。CendR元件可以,例如,包含含有具有C端元件的氨基酸序列的蛋白质或者肽;包含由具有C端元件的氨基酸序列组成的蛋白质或肽;或者由具有C端元件的氨基酸序列组成。任选地,一些氨基酸被排除用于X1X2X3X4形式的CendR元件中的X2、X3或者X2和X3。例如,如果需要,可将G和D分别排除同时用作X2和X3。
CendR元件的实例包括XXR/K/H,XXR/K,XXR/H,XXK/H,XXR,XXK,XXH,XXKG,RXXR/K/H,RXXR/K,RXXR/H,RXXK/H,RXXR,RXXK,RXXH,RXXKG,KXXR/K/H,KXXR/K,KXXR/H,KXXK/H,KXXR,KXXK,KXXH,KXXKG,HXXR/K/H,HXXR/K,HXXR/H,HXXK/H,HXXR,HXXK,HXXH,HXXKG,R/K/HXXR,R/KXXR,R/HXXR,K/HXXR,RXXR,KXXR,HXXR,R/K/HXXK,R/KXXK,R/HXXK,K/HXXK,RXXK,KXXK,HXXK,R/K/HXXH,R/KXXH,R/HXXH,K/HXXH,RXXH,KXXH,HXXH,R/K/HXXKG,R/KXXKG,R/HXXKG,K/HXXKG,RXXKG,KXXKG,和HXXKG.
为方便起见,如果精氨酸、赖氨酸、赖氨酸-甘氨酸对或组氨酸位于C端,并且如果计划或者打算将要暴露在所述C端的精氨酸、赖氨酸、赖氨酸-甘氨酸对或组氨酸,则氨基酸基序即可以构成CendR元件,其可被称为CendR元件或潜在的CendR元件。
CendR元件可以由例如氨基酸、氨基酸类似物、肽类似物、氨基酸模拟物、肽模拟物等构成。尽管为了方便本文从氨基酸和由氨基酸组成的肽方面描述了CendR元件和CendR肽的结构、设计等,但是应理解氨基酸和肽的相似类似物、模拟物、修饰形式等也可以被用作CendR元件和CendR肽,并且使用类似的原理来设计。
如本文所公开,一些组分可以与CendR元件重叠。一般地,与CendR元件重叠的组分会是包含氨基酸序列的组分,并且所述组分的全部或者部分氨基酸序列会与所述CendR元件的氨基酸重叠。一般地,这样的重叠的特征是为所述组分的一部分、在所述组分内或规定所述组分的氨基酸为构成所述CendR元件的氨基酸所共有或者在其范围之内。对于1型CendR元件,如果所述C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸序列是为某组分的一部分、在所述组分内或规定所述组分的氨基酸,则所述组分与所述CendR元件重叠。例如,归巢肽NGRAHA(SEQ ID NO:24)可以与包含赖氨酸的CendR元件重叠。在该实例中,在所述归巢肽中的精氨酸残基是所述CendR元件。
对于2型CendR元件,如果所述氨基酸X1、X2、X3和/或X4的一个或多个或者如果所述C端组氨酸是为某组分的一部分、在所述组分内或者规定所述组分,则所述组分与所述CendR元件重叠。例如,归巢肽CREKA(SEQ ID NO:7)可与包含RGCR(SEQ ID NO:19)的CendR元件重叠以形成RGCREKA(SEQ ID NO:18)(CendR元件有下划线)。在该实例中,所述CendR元件的最后两个氨基酸(CR)也作为所述归巢肽的前两个氨基酸。作为另一个实例,归巢肽NGRAHA(SEQ IDNO:24)可以通过加上精氨酸(或赖氨酸或组氨酸)并且使用内部精氨酸与2型CendR元件重叠,形成重叠的归巢肽和CendR元件RNGRAHA(SEQ ID NO:25)(所述CendR元件有下划线)。作为另一个实例,归巢肽CREKA(SEQ ID NO:7)可以与包含RREK(SEQ ID NO:26)的CendR元件重叠以形成RREKA(SEQ ID NO:27)(所述CendR元件有下划线)。CREKA肽中的半胱氨酸对于其归巢功能不是关键性的。作为另一个实例,归巢肽NGR可以与所述CendR元件重叠,可加上可切割基序GPDC(SEQ ID NO:28)以使其可活化,并且可使用末端半胱氨酸环化所述肽以形成CRNGRGPDC(SEQ ID NO:41)(所述CendR元件有下划线)。作为另一个实例,可通过将CendR元件(下划线)、可尿激酶(urokinse)切割序列(粗体)和归巢于生血管整联蛋白的序列(双下划线)结合来制备与生血管性血管亲和的可尿激酶活化CendR肽(用于肿瘤靶向):AGGSVA(SEQ ID NO:43)。作为另一个实例,可通过将CendR元件(下划线)、可弗林蛋白酶切割序列和CD13归巢序列(双下划线)结合来制备与生血管性血管亲和的可弗林蛋白酶活化CendR肽(用于肿瘤靶向): (SEQ IDNO:42)。作为另一个实例,可通过将CendR元件(下划线)、可弗林蛋白酶切割序列和脑微脉管系统归巢序列(双下划线)结合来制备与脑血管亲和的可弗林蛋白酶活化CendR肽(用于CNS靶向):(SEQ ID NO:44)。
具有一些规定氨基酸序列和例如不具有规定的氨基酸序列的规定间隔区的组分也能够被称为与CendR元件重叠,条件是所述组分的间隔区的全部或部分共用组成所述CendR元件的氨基酸或者在组成所述CendR元件的氨基酸序列范围内。例如,如果组分由氨基酸序列TGLTAXXXXW(SEQ ID NO:45)限定,那么所述组分与CendR元件重叠,即为所述CendR元件位于所述组分的XXXX区域中。与CendR元件重叠的组分可以并且经常会在一端或两端延伸超出所述CendR元件(也就是说超出所述CendR元件的N端、超出所述CendR元件的C端或者超出所述CendR元件的N端和C端)。
使用这些原理、可以设计和使用如本文所公开的CendR元件的结构规格和待与所述CendR元件重叠的组分的结构规格、多个重叠的CendR元件。当所述CendR元件的结构规格和所述组分的结构规格相容时,多个不同的组分可以与单一CendR组分重叠。例如,归巢肽和蛋白酶切割位点都可以与同一CendR元件重叠。
组分还可以与CendR元件毗连。如本文所使用,与CendR元件毗连的组分不与CendR元件重叠。与CendR元件毗连的组分可以与所述CendR元件的任一端毗连。如果组分的氨基酸(或其他分子)共价连接于CendR元件的末端氨基酸,则所述组分与CendR元件毗连。既不与CendR元件重叠也不与CendR元件毗连、但是共价连接于所述CendR元件的组分可以在所述CendR元件的上游(N端)、下游(C端)或者上游和下游(环状分子中)。
任意组分,如本文公开的组分,可以与CendR元件重叠、毗连和/或在所述CendR元件上游、下游或者上游和下游。此类组分的实例包括辅助分子、归巢分子、蛋白酶切割位点等。将一些组分与CendR元件连接或缔合在所述CendR元件的下游(C端)是有用的。例如,在CendR元件下游具有辅助蛋白质或归巢肽的可活化CendR元件(因此切割位点的下游用于活化)当其被活化时与所述CendR元件分开。作为另一个实例,在CendR元件下游具有辅助分子或归巢分子的可活化CendR元件(因此切割位点的下游用于活化)当其被活化时与所述CendR元件分开。这具有一些益处,例如,使得所述CendR元件的功能更有效或者减少被除去组分的无关效应发生。
本文公开的任何CendR元件在任何场合、组合或使用中均可以是一般的CendR元件、1型CendR元件、2型CendR元件、具体CendR元件或结合。在一些形式中,所述CendR元件是1型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件是2型CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件不是1型CendR元件。非1型CendR元件的CendR元件的实例是具有C端组氨酸的CendR元件。在一些形式中,所述CendR元件不是2型CendR元件。非2型CendR元件的CendR元件的实例是具有C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸对的CendR元件,其中在所述精氨酸或赖氨酸的上游3个氨基酸的氨基酸不是精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在一些形式中,所述CendR元件是1型CendR元件而不是2型CendR元件。是1型CendR元件而不是2型CendR元件的CendR元件的实例是具有C端精氨酸、赖氨酸或赖氨酸-甘氨酸对的CendR元件,其中所述精氨酸或赖氨酸的上游3个氨基酸的氨基酸不是精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在一些形式中,所述CendR元件是2型CendR元件而不是1型CendR元件。是2型CendR元件而不是1型CendR元件的CendR元件的实例是具有C端组氨酸的CendR元件。是2型CendR元件而不是1型CendR元件的CendR元件的另一个实例是具有C端精氨酸、赖氨酸、组氨酸或赖氨酸-甘氨酸对的CendR元件,其中所述精氨酸、赖氨酸或组氨酸的上游3个氨基酸的氨基酸是精氨酸、赖氨酸或组氨酸。在一些形式中,所述CendR元件是1型CendR元件或者是2型CendR元件。任何类型CendR元件、CendR元件组和/或具体的CendR元件都可明确地纳入任何场合、组合或使用,或者从任何场合、组合或使用中排除。例如,在美国专利申请公开物No.20090226372中描述的任何CendR元件可被明确地纳入或排除在外。美国专利申请No.20090226372在此以引用的方式全文纳入本文,特别是对其对CendR元件的描述。
可被内化进入细胞的CendR元件可称作内化CendR元件。可以穿入组织的CendR元件可称作穿入CendR元件。可被内化进入细胞和可以穿入组织的CendR元件可称作内化和穿入CendR元件。除非上下文明确地另有说明,提及“CendR元件”是指单独的、全部的或任意组合的上述CendR元件。
如本文所使用,“CendR组合物”是指包含CendR元件的组合物。所述CendR元件可以是,例如,有活性的、可活化的或被保护的。例如,所述CendR组合物可以包含这样的蛋白质或肽,所述蛋白质或肽包含氨基酸序列,所述氨基酸序列包含CendR元件,其中所述氨基酸序列位于所述蛋白质或肽的C末端。
如本文所使用,“可活化CendR元件”是指这样的CendR元件,即其具有共价连接至所述CendR元件(例如连接至所述C端元件的末端羧基基团)的分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物,其中所述分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物可以阻止所述CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等的内化和/或组织穿入,并且其中所述分子、部分、纳米颗粒、化合物或其他组合物可被除去(例如以暴露所述末端羧基基团)。例如,所述可活化CendR元件可以在所述肽的C末端,并且可以防止所述CendR元件内化和/或穿入组织。共价连接至所述CendR元件的分子、纳米颗粒、部分、化合物或其他组合物可称作“保护基团”。例如,所述保护基团可以连接至所述CendR元件的C端精氨酸或赖氨酸或其他C端氨基酸的末端羧基基团,连接至所述CendR元件的C端氨基酸,或者连接至所述CendR元件的非C端氨基酸的氨基酸。只要所述保护基团能够防止所述CendR元件被内化和/或穿入组织,所述保护基团就还可以与不是CendR元件的CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽等的一部分连接或缔合。包含可活化CendR元件的CendR组合物可称作可活化CendR组合物。包含可活化CendR元件的CendR分子可称作可活化CendR分子。包含可活化CendR元件的CendR缀合物可称为可活化CendR缀合物。包含可活化CendR元件的CendR蛋白质可称作可活化CendR蛋白质。包含可活化CendR元件的CendR肽可称作可活化CendR肽。
可活化CendR元件可被阻断内化进入细胞、组织穿入或者内化进入细胞和组织穿入。一般地,可活化CendR元件会被阻断内化进入细胞和组织穿入。这样的可活化CendR元件可称作可活化内化和穿入CendR元件。但是,一些可活化CendR元件仅能被阻断组织穿入或仅被阻断内化进入细胞。这样的可活化CendR元件可称作可活化内化CendR元件(对于仅被阻断内化进入细胞的CendR元件)或称作可活化内化和穿入CendR元件(对于仅被阻断组织穿入的CendR元件)。一般地,可活化的内化CendR元件会是可活化内化CendR元件。类似地,可活化的穿入CendR元件一般会是可活化穿入CendR元件。可活化的内化和穿入CendR元件会是可活化内化和穿入CendR元件。除去所述保护基团会使得所述CendR元件内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织。
所述可活化CendR元件的可切割键可以任意合适方法切割。例如,所述可切割键可通过酶或非酶方式切割。对于酶切割,所述切割酶可被提供或存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点。例如,所述酶可以存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的细胞附近。对于非酶切割,所述CendR元件可与切割剂接触,可被置于切割条件下,或者与切割剂接触并且置于切割条件下。切割剂是能够介导或诱导所述可切割键的切割的任意物质。非酶切割剂是除酶之外的任意切割剂。切割条件可以是能够介导或诱发所述可切割键切割的任意溶液或环境条件。例如,一些不稳定键可在酸性条件、碱性条件、反应性基团存在的条件下被切割。非酶切割条件是除存在酶之外的任意切割条件。非试剂切割条件是除存在切割剂之外的任意切割条件。
可活化CendR元件可在广义或狭义条件下活化。一般地,可活化CendR元件相对于可以活化所述CendR元件的具体试剂或试剂组是可活化的。因此,例如,具体的可活化CendR元件可以仅被某些蛋白酶活化。这样的CendR元件可称作可活化CendR元件,但是也可以称为可由所述具体蛋白酶活化。
“可蛋白酶活化CendR元件”(或者“蛋白酶活化的CendR元件”)是指这样的可活化CendR元件,即其中保护基团通过肽键连接于所述CendR元件,并且其中所述肽键可被蛋白酶切割。在可蛋白酶活化CendR元件中切割该肽键使得所述CendR元件能够内化进入细胞和/或组织穿入。在一个实例中,所述保护基团可通过可切割或不稳定键连接于所述CendR元件。所述可切割键可被例如酶或化合物切割。可活化CendR元件中切割或“不稳定化”所述键使得所述CendR元件能够内化进入细胞和/或组织穿入。这样的切割或“不稳定化”可称为所述CendR元件的活化。可蛋白酶活化CendR元件是一种可活化CendR元件形式。X1X2X3X4形式的CendR元件的X2和X3氨基酸可被选择用于特定目的。例如,X2、X3或者X2和X3可被选择以形成蛋白酶识别序列的全部或部分。这可以用于,例如,规定具有CendR元件(潜在的或隐藏的CendR元件形式,其通过在X4氨基酸后切割而被活化)的肽切割或者使得能够进行所述肽切割。这样的氨基酸的选择实例在表1和2中显示。蛋白酶切割位点可基于本领域技术人员发现和已知的知识预测。例如,可在网站cbs.dtu.dk/services/ProP/对切割预测进行评估。一类有用的CendR元件可由去保护CendR元件和可活化CendR元件组成,该类CendR元件排除不可活化的被保护的CendR元件。
有用的蛋白酶包括在碱性残基(CendR元件的C端残基可以是碱性残基)的C端侧切割的酶和识别其切割位点的C端侧的序列的酶(从而使得可以自由选择所述切割产物的C端序列)。有用蛋白酶的实例包括,例如,丝氨酸蛋白酶(包括,例如,血纤蛋白溶酶和血纤蛋白溶酶原激活剂)、尿激酶、前蛋白转化酶(参见,例如,Duckert et al.,Prediction ofproprotein convertase cleavage sites Protein engineering Design andSelection 17(1):107-112(2004))、弗林蛋白酶和羧肽酶,例如羧肽酶A(带有芳香族或支链烃侧链的氨基酸)、谷氨酸特异性羧肽酶、脯氨酸特异性羧肽酶和PSMA。丝氨酸蛋白酶尤其可用于靶向癌细胞或肿瘤的CendR元件和CendR组合物。在碱性残基C端侧切割的酶的实例包括Arg-C蛋白酶(其在精氨酸残基的C端侧切割;Keil,Specificity ofProteolysis(Springer-Verlag,Berlin-Heidelberg-New York(1992))、梭菌蛋白酶(其在精氨酸残基的C端侧切割;Keil,1992)、肠激酶(其在序列-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-后切割;SEQ ID NO:22)、因子Xa(其在序列-Gly-Arg后切割;Fujikawa et al.,Activation of bovine factor X(Stuartfactor):conversion of factor Xa alpha to factor Xa beta,Proc.Natl.Acad.Sci.72:3359-3363(1975))、Lys-C(其在赖氨酸残基的C端侧切割;Keil,1992)、凝血酶(其在精氨酸残基的C端侧切割;Keil,1992)、胰蛋白酶(其在精氨酸和赖氨酸残基的C端侧切割;Keil,1992)、丝氨酸蛋白酶、前蛋白转化酶(例如PC1、PC2、PC3、PC4、PC5、PC6、PC7、PC8、弗林蛋白酶、Pace、PACE4、位点1蛋白酶、S1P、SKI、NARC-1、PCSK1、PCSK2、PCSK3、PCSK4、PCSK5、PCSK6、PCSK7、PCSK8和PCSK9)、纤溶酶和血纤维蛋白溶酶原激活剂。识别其切割位点C端侧的序列的酶的实例包括Asp-N内肽酶(其在天冬氨酸的N端侧切割;Keil,1992)和羧肽酶,例如羧肽酶A(其切割除脯氨酸、赖氨酸和精氨酸之外的C端残基)。
蛋白酶的实例还在以下材料中描述:Hook,Proteolytic and cellularmechanisms in prohormone and proprotein processing,RG LandesCompany,Austin,Texas,USA(1998);Hooper et al.,Biochem.J.321:265-279(1997);Werb,Cell 91:439-442(1997);Wolfsberg et al.,J.CellBiol.131:275-278(1995);Murakami and Etlinger,Biochem.Biophys.Res.Comm.146:1249-1259(1987);Berg et al.,Biochem.J.307:313-326(1995);Smyth and Trapani,Immunology Today 16:202-206(1995);Talanian et al.,J.Biol.Chem.272:9677-9682(1997);和Thornberry et al.,J.Biol.Chem.272:17907-17911(1997)。
表1.用于体外和体内靶向研究的可蛋白酶切割和对照噬菌体。底物噬菌体的切割位点用箭头指示。通过蛋白酶解方式暴露的C端残基以粗体显示。
表2.切割规则
底物 切割
↓
----P4-P3-P2-P1-P1’-P2’-P3’-P4’-----
下列酶可以在各自的切割位点组成被发现时进行切割。
例外规则:对于以下切割位点组成,上述切割规则不适用,即没有出现切割:
外肽酶,例如羧肽酶,可被用于活化CendR元件。例如,羧肽酶是用于活化CendR元件的有用蛋白酶。羧肽酶从蛋白质或肽除去C端氨基酸。羧肽酶可在它们底物优先性界限内从蛋白质或肽中连续除去氨基酸。因此,例如,羧肽酶可以彻底地或者几乎彻底地水解蛋白质或肽。因为各个羧肽酶有一些底物优先性或局限性,并且因为羧肽酶一般仅切割肽键,因此存在一些氨基酸、修饰和/或非肽键可以控制羧肽酶对蛋白质或肽的切割。
在CendR元件的情况下,可以选择包含CendR元件的蛋白质、肽或氨基酸序列的结构和/或对其的修饰以获得在所述CendR元件的C端氨基酸结束的羧肽酶切割。这可以通过例如在CendR元件中纳入作为倒数第二位氨基酸的氨基酸实现,所述氨基酸不支持羧肽酶,或者会阻断羧肽酶切割其与C端氨基酸的键。脯氨酸是这样的氨基酸的一个实例(对于许多羧肽酶而言)。作为另一个实例,所述CendR元件中C端氨基酸和所述倒数第二位氨基酸之间的键可受到保护不被蛋白酶切割。例如,所述键可以是非肽键或者可以包含修饰,例如甲基化。作为另一个实例,D-氨基酸可被用作CendR元件中的C端氨基酸、倒数第二位氨基酸或者C端氨基酸和倒数第二位氨基酸。作为另一个实例,D-氨基酸可被用作CendR元件中的C端氨基酸。有限使用D氨基酸的CendR元件保持内化和穿入活性。作为另一个实例,作为羧肽酶底物的氨基酸可以位于所述CendR元件的C端氨基酸的C端。例如,对于谷氨酸特异性羧肽酶,例如PSMA,谷氨酸氨基酸可位于邻接所述CendR元件的C端氨基酸的C端和位于包含所述CendR元件的蛋白质或肽的C末端。可以类似的方式使用其他氨基酸特异性(或优选的)羧肽酶。在这些情况中,所述CendR元件的C端氨基酸不应是用于所述羧肽酶的底物(或者说应是非支持底物)。
可以减少或消除蛋白酶的键切割的键和修饰是已知的,并且可用于所公开的CendR元件中。例如,多种化学修饰技术和部分在例如以下材料中描述:美国专利No.5,554,728、6,869,932、6,828,401、6,673,580、6,552,170、6,420,339,美国专利公布2006/0210526和国际专利申请WO2006/136586。这样的修饰的一些实例包括肽键代替物,例如在Cudic andStawikowski,Peptidomimetics:Fmoc Solid-Phase PseudopeptideSynthesis,in Methods in Molecular Biology,vol.294,223-246(2008)中描述的那些,和化学修饰,例如马来酰亚胺帽化、聚乙二醇(PEG)附着、马来酰亚胺化(maleidification)、酰化、烷化、酯化和酰胺化,以产生所述肽的结构类似物。这些和其他修饰还在本文别处描述。
一些有用形式的可活化CendR元件可以是环化蛋白质或肽,或者可以在环化蛋白质或肽中。所述CendR元件在这样的化合结构中是潜在的,因为所述CendR元件不会在游离C末端。环化蛋白质和肽可由本领域已知的多种方式形成,例如通过半胱氨酸键,通过共价键,通过活性基团的反应和通过连接物。半胱氨酸键是一种有用的环化蛋白质和肽的工具。应理解,所述环化连接不必在所述CendR元件的C末端。通过将环化连接置于远离所述CendR元件的C末端,环化键的选择和所述潜在CendR元件的可切割键的选择各自可以是独立的。例如,所述环化连接可以是半胱氨酸键而所述潜在CendR元件的可切割键可以是肽键(其中所述肽键可以,例如,在蛋白酶靶标的切割位点处)。
在公开的蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR组合物中的CendR元件一般应在游离C末端或者可活化CendR元件的可切割位点的N端侧。
在一些形式中,不在肽或蛋白质的游离C末端的CendR元件可以介导细胞内化和/或组织穿入。当存在时,该效应一般比使用去保护CendR元件的内化和组织穿入效力低。不在肽或蛋白质的游离C末端、但是能够介导细胞内化和/或组织穿入的CendR元件可称作内部CendR元件。内部CendR元件不同于被保护的CendR元件,因为被保护的CendR元件不介导细胞内化和/或组织穿入(除非去保护)。内部CendR元件可用在线性、环化或支链肽和蛋白质中。内部CendR元件通过切割以暴露蛋白质或肽C末端的CendR元件也是可活化的。内部CendR元件的该类活化会增加所述内化和/或组织穿入活性。
在一些形式中,当所选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于肽或蛋白质中时,所述CendR组合物的肽或蛋白质可以内化进入细胞,但是当所选择的氨基酸不存在于所述肽或蛋白质中时,所述CendR组合物的肽或蛋白质不能内化进入细胞。这可用于,例如,检测蛋白质或肽是否包含CendR元件。例如,所述CendR元件可以不与除其本身序列之外的任何物质缔合而内化进入细胞。所述CendR元件可以是所述蛋白质或肽或所述CendR组合物中唯一的功能性内化元件,或者可以有一个或多个其他功能性内化元件。在一些形式中,当所选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物可以被内化进入细胞,但是当所选择的氨基酸序列不存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物不能被内化进入细胞。
类似地,在一些形式中,当所选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述蛋白质或肽中时,所述CendR组合物的肽或蛋白质可以穿入组织,但是当所选择的氨基酸不存在于所述蛋白质或肽中时,所述CendR组合物的肽或蛋白质不能穿入组织。这可用于,例如,检测蛋白质或肽是否包含CendR元件。例如,所述CendR元件可以不与除其本身之外的任何物质缔合而穿入组织。所述CendR元件可以是所述蛋白质或肽或所述CendR组合物中唯一的功能性组织穿入元件,或者可以有一个或多个其他功能性组织穿入元件。在一些形式中,当所选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物可以穿入组织,但是当所选择的氨基酸不存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物不能穿入组织。
类似地,在一些形式中,当所选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述蛋白质或肽中时,所述CendR组合物的肽或蛋白质可以被内化进入细胞并且穿入组织,但是当所选择的氨基酸不存在于所述蛋白质或肽中时,所述CendR组合物的肽或蛋白质不能被内化进入细胞并且不能穿入组织。这可用于,例如,检测蛋白质或肽是否包含CendR元件。例如,所述CendR元件可以不与除其本身之外的任何物质缔合而内化进入细胞并且穿入组织。所述CendR元件可以是所述蛋白质或肽或所述CendR组合物中唯一的功能性内化和组织穿入元件,或者可以有一个或多个其他功能性内化和/或组织穿入元件。在一些形式中,当所选择的氨基酸序列(CendR元件)存在于所述CendR组合物中时,所述CendR组合物可以被内化进入细胞并且穿入组织,但是当所选择的氨基酸不存在于所述CendR元件时,所述CendR组合物不能被内化进入细胞并且穿入组织。
“内化”是指通过质膜或其他生物屏障。“穿入”是指进入并且通过细胞、组织或其他生物屏障。穿入一般涉及并且包括内化。所公开的CendR元件一般促进并且允许内化(例如内化进入细胞)和穿入(例如组织穿入)。提及内化或穿入应理解为是指内化并且穿入,除非上下文另有说明(例如分别对内化进入细胞和组织穿入分开进行讨论和描述或进行不同讨论和描述——本段即是这样的一例)。
“内化进入细胞”是指所述CendR元件能够穿入质膜,从而被内化进入细胞。对于给定的CendR元件和给定的细胞,该内化可以以例如10、20、30、40、50、60、70、80、90或100%的效力出现。CendR元件一般能够促进、介导、引发、增强(等)内化;穿入;内化进入和/或通过细胞、组织或者细胞和组织;穿入进入和/或通过细胞、组织或细胞和组织;穿透细胞和/或组织;或者它们的结合。“穿透”是指促进、介导、引发、增强(等)细胞和/或组织允许所述细胞和/或组织附近的组合物、缀合物、分子等进入和/或通过所述细胞和/或组织的能力和/或条件。因此,所公开的CendR元件、蛋白质、肽、缀合物、组合物等可被称为穿透所述细胞和/或组织。“可穿透”是指细胞和/或组织允许所述细胞和/或组织附近的组合物、缀合物、分子等进入和/或通过所述细胞和/或组织的能力和/或条件。
能够内化CendR元件的细胞可通过例如以下方法鉴别:(a)将细胞暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否被内化。所述细胞例如可以是在测定中。所述CendR元件可被连接至,例如归巢分子,从而形成CendR组合物。可内化可活化CendR元件的细胞可通过例如以下方法鉴别:(a)将细胞暴露于可活化CendR元件;(b)确定所述活化CendR元件是否被内化。所述可活化CendR元件可在暴露于所述细胞之前去保护,但不必去保护。这可用于,例如测试所述保护剂的保护能力。所述可活化CendR元件还可以是蛋白酶活化的CendR元件。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
癌细胞或者带有癌细胞的受试者可通过例如以下方法被鉴别为用于基于CendR的疗法的候选者:(a)将所述癌细胞暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化,其中内化的CendR元件将所述癌细胞或所述受试者鉴定为是用于基于CendR的疗法的候选者。所述细胞例如可以在测定中,或者在受试者中。所述CendR元件可被连接至例如归巢分子,从而形成CendR组合物。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
肿瘤或者带有肿瘤的受试者可通过例如以下方法被鉴别为用于基于CendR的疗法的候选者:(a)将来自所述肿瘤的组织暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否穿过所述组织或者被所述组织中的细胞内化,其中穿过或内化的CendR元件将所述肿瘤或所述受试者鉴定为是基于CendR的疗法的候选者。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
可在目标细胞附近被活化的可活化CendR元件可通过例如以下方法制备:形成可活化CendR元件,其中保护基团通过可切割键连接于CendR元件,其中所述可切割键可被存在于所述目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件切割。这还可以包括,在形成所述可活化CendR元件之前,鉴别存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件。这还可以包括,在形成所述可活化CendR元件之前,基于存在于目标酶附近的酶、切割剂和/或切割条件选择所述可切割键。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
可活化CendR元件可通过例如以下方法形成:(a)选择用于内化进入细胞的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含C端元件,其中所述C端元件包含末端羧基基团,并且(b)使得保护基团共价连接于所选择的氨基酸序列的末端羧基基团,其中连接所述保护基团和所述末端羧基的键是可切割的,其中所述可活化CendR元件包含所选择的氨基酸序列和所述保护基团。这还可以包括,在步骤(b)之前,选择连接所述保护基团和所述末端羧基基团的键,使其能够被存在于目标细胞附近的蛋白酶、酶、切割剂和/或切割条件切割。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
可活化CendR元件可通过以下方法制备,所述方法包括(a)选择用于内化进入细胞的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含C端元件,其中所述C端元件包含末端羧基基团,并且(b)使得保护基团共价连接至所选择的氨基酸序列的末端羧基基团,其中连接所述保护基团和所述末端羧基基团的键是可切割的,其中所述可活化CendR元件包含所选择的氨基酸序列和所述保护基团。这还可以包括,在步骤(b)之前,选择连接所述保护基团和所述末端羧基基团的键,使其能够被存在于目标细胞附近的蛋白酶、酶、切割剂和/或切割条件切割。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述CendR元件可以是可蛋白酶活化CendR元件。所述蛋白质或肽可以是环化的或者可以包含环。所述CendR元件可以在所述蛋白质或肽的C末端。所述CendR元件可以包含末端羧基基团。保护基团可被连接至所述末端羧基基团。连接所述保护基团和所述末端羧基基团的键可被选择为使其能够被存在于目标细胞附近的蛋白酶、酶、切割剂和/或切割条件切割。所述保护基团可被连接至所述CendR元件的C端氨基酸。所述保护基团可被连接至非所述CendR元件的C端氨基酸的所述CendR元件的氨基酸。
所述共组合物可以是,例如,有治疗性或诊断性应用的纳米颗粒或者分子或分子复合物。可与CendR元件一起靶向的治疗性共组合物包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、细胞毒性剂、促细胞存活剂、细胞分化剂、神经保护剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗关节炎剂、抗病毒剂或它们的结合物。可与CendR元件一起靶向的治疗性共组合物包括但不限制于治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、可调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂或结合物。可与CendR元件一起靶向的诊断性共组合物可以包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、MRI成像剂、放射成像剂、光学成像剂、分子标签(例如生物素)、荧光团、表位标签(其可以通过例如使用特定的分子测定来检测)或它们的结合物。
所述货物组合物可以是,例如,具有治疗性或诊断性应用的纳米颗粒或者分子或分子复合物。可以与CendR元件一起靶向的治疗性货物组合物包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、细胞毒性剂、促细胞存活剂、细胞分化剂、神经保护剂、免疫调节剂、抗炎剂、抗关节炎剂、抗病毒剂或它们的结合物。可以与CendR元件一起靶向的治疗性货物组合物包括但不限于治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、抗血管生成剂、促血管生成剂、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、可调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂或结合物。可以与CendR元件一起靶向的诊断性货物组合物包括但不限于纳米颗粒、分子、分子复合物、MRI成像剂、放射成像剂、光学成像剂、分子标签(例如生物素)、荧光团、表位标签(其可以通过例如使用特定的分子测定来检测)或它们的结合物。
可以内化CendR元件的细胞可通过例如以下方法鉴别:(a)将细胞暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否被内化。还公开了将癌细胞鉴定为基于CendR的疗法的候选者的方法,所述方法包括(a)将所述癌细胞暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否被所述癌细胞内化,其中内化的CendR元件将所述癌细胞鉴定为是用于基于CendR的疗法的候选者。所述细胞可以在测定中。所述CendR元件可被连接至蛋白质或肽。所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可活化CendR元件可以在暴露于所述细胞之前被活化。所述可活化CendR元件可以是可蛋白酶活化CendR元件。所述蛋白质或肽可以是环化的。所述蛋白质或肽可以是线性的。所述CendR元件可以在所述蛋白质或肽的C末端。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
可被CendR元件穿入的组织可通过例如以下方法鉴别:(a)将组织暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否穿入所述组织。还公开了将肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选者的方法,所述方法包括(a)将来自所述肿瘤的细胞暴露于CendR元件;并且(b)确定所述CendR元件是否被所述细胞内化,其中内化的CendR元件将所述肿瘤鉴定为是用于基于CendR的疗法的候选者。通过例如以下方法可将肿瘤鉴定为基于CendR的疗法的候选者:(a)将所述肿瘤暴露于CendR元件,并且(b)确定所述CendR元件是否穿入所述组织,其中穿入的CendR元件将所述肿瘤鉴定为是用于基于CendR的疗法的候选者。所述肿瘤可以在测定中。所述CendR元件可被连接至蛋白质或肽。所述CendR元件可以是可活化CendR元件。所述可活化CendR元件可以在暴露于所述肿瘤之前被活化。所述可活化CendR元件可以是可蛋白酶活化CendR元件。所述蛋白质或肽可以是环化的。所述蛋白质或肽可以是线性的。所述CendR元件可以在所述蛋白质或肽的C末端。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
可在目标细胞附近被活化的可活化CendR元件可通过例如以下方法产生:形成可活化CendR元件,其中保护基团通过可切割键连接于CendR元件,其中所述可切割键可被存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件切割。所述细胞可以在受试者中。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可被鉴别。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可在形成所述可活化CendR元件之前被鉴别。所述可切割键可基于存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件而选择。所述可切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割剂而选择。所述可切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割条件而选择。所述可切割键可在形成所述可活化CendR元件之前选择。所述CendR元件可以包含末端羧基基团,其中所述保护基团连接于所述末端羧基基团。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
可活化CendR元件可通过例如以下方法形成:使得保护基团共价连接于CendR元件,其中连接所述保护基团和所述CendR元件的键是可切割的。可活化CendR元件可通过例如以下方法形成:使得保护基团共价连接于氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件,并且其中连接所述保护基团和所述CendR元件的键是可切割的。可活化CendR元件可通过例如以下方法形成:(a)选择用于内化进入细胞和/或穿入组织的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含CendR元件,并且(b)使得保护基团共价连接于所述CendR元件,其中连接所述保护基团和所述CendR元件的键是可切割的。与所述CendR元件共价连接的保护基团减少或者防止内化进入细胞和/或穿入组织。与没有保护基团的相同CendR元件相比,共价连接于所述CendR元件的保护基团能够减少或防止内化进入细胞和/或穿入组织。所述可活化CendR元件可包含所选的氨基酸序列和所述保护基团。所述细胞可以在受试者中。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可被鉴别。存在于目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件可在形成所述可活化CendR元件之前被鉴别。所述可切割键可基于存在于所述目标细胞附近的酶、切割剂和/或切割条件而选择。所述切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割剂而选择。所述可切割键可基于存在于所述CendR元件被递送、归巢、移动或积累的位点例如目标细胞的切割条件而选择。所述可切割键可在形成所述可活化CendR元件之前选择。所述CendR元件可包含末端羧基基团,其中所述保护基团连接至所述末端羧基基团。任意形式或类型的CendR元件、CendR肽、CendR蛋白质、CendR缀合物或CendR组合物均可用在这些方法中。
所述CendR元件的长度最长可有10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基。在具体实施方案中,CendR元件的长度至少为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基。在另外的实施方案中,CendR元件的长度为2至200个残基、2至100个残基、2至90个残基、2至80个残基、2至70个残基、2至60个残基、2至50个残基、2至40个残基、2至30个残基、2至20个残基、2至15个残基、2至10个残基、3至200个残基、3至100个残基、3至90个残基、3至80个残基、3至70个残基、3至60个残基、3至50个残基、3至40个残基、3至30个残基、3至20个残基、3至15个残基、3至10个残基、4至200个残基、4至100个残基、4至90个残基、4至80个残基、4至70个残基、4至60个残基、4至50个残基、4至40个残基、4至30个残基、4至20个残基、4至15个残基、4至10个残基、5至200个残基、5至100个残基、5至90个残基、5至80个残基、5至70个残基、5至60个残基、5至50个残基、5至40个残基、5至30个残基、5至20个残基、5至15个残基、5至10个残基、10至200个残基、10至100个残基、10至90个残基、10至80个残基、10至70个残基、10至60个残基、10至50个残基、10至40个残基、10至30个残基、10至20个残基、20至200个残基、20至100个残基、20至90个残基、20至80个残基、20至70个残基、20至60个残基、20至50个残基、20至40个残基或20至30个残基。如本文所使用,术语“残基”是指氨基酸或氨基酸类似物。
包含CendR元件的蛋白质或肽的长度最长可有50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基。在具体的实施方案中,CendR组合物的蛋白质或肽部分的长度可以至少是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基。在另外的实施方案中,包含CendR元件的蛋白质或肽的长度可以是2至200个残基、2至100个残基、2至90个残基、2至80个残基、2至70个残基、2至60个残基、2至50个残基、2至40个残基、2至30个残基、2至20个残基、2至15个残基、2至10个残基、3至200个残基、3至100个残基、3至90个残基、3至80个残基、3至70个残基、3至60个残基、3至50个残基、3至40个残基、3至30个残基、3至20个残基、3至15个残基、3至10个残基、4至200个残基、4至100个残基、4至90个残基、4至80个残基、4至70个残基、4至60个残基、4至50个残基、4至40个残基、4至30个残基、4至20个残基、4至15个残基、4至10个残基、5至200个残基、5至100个残基、5至90个残基、5至80个残基、5至70个残基、5至60个残基、5至50个残基、5至40个残基、5至30个残基、5至20个残基、5至15个残基、5至10个残基、10至200个残基、10至100个残基、10至90个残基、10至80个残基、10至70个残基、10至60个残基、10至50个残基、10至40个残基、10至30个残基、10至20个残基、20至200个残基、20至100个残基、20至90个残基、20至80个残基、20至70个残基、20至60个残基、20至50个残基、20至40个残基或20至30个残基。
所述CendR缀合物的长度最长可有50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基。在具体的实施方案中,CendR缀合物的长度可以至少是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基。在另外的实施方案中,CendR缀合物的长度可以是5至200个残基、5至100个残基、5至90个残基、5至80个残基、5至70个残基、5至60个残基、5至50个残基、5至40个残基、5至30个残基、5至20个残基、5至15个残基、5至10个残基、10至200个残基、10至100个残基、10至90个残基、10至80个残基、10至70个残基、10至60个残基、10至50个残基、10至40个残基、10至30个残基、10至20个残基、20至200个残基、20至100个残基、20至90个残基、20至80个残基、20至70个残基、20至60个残基、20至50个残基、20至40个残基或20至30个残基。
CendR组合物的蛋白质或肽部分的长度最长可有50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基。在具体的实施方案中,CendR组合物的蛋白质或肽部分的长度可以至少是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基。在另外的实施方案中,CendR组合物的蛋白质或肽部分的长度可以是2至200个残基、2至100个残基、2至90个残基、2至80个残基、2至70个残基、2至60个残基、2至50个残基、2至40个残基、2至30个残基、2至20个残基、2至15个残基、2至10个残基、3至200个残基、3至100个残基、3至90个残基、3至80个残基、3至70个残基、3至60个残基、3至50个残基、3至40个残基、3至30个残基、3至20个残基、3至15个残基、3至10个残基、4至200个残基、4至100个残基、4至90个残基、4至80个残基、4至70个残基、4至60个残基、4至50个残基、4至40个残基、4至30个残基、4至20个残基、4至15个残基、4至10个残基、5至200个残基、5至100个残基、5至90个残基、5至80个残基、5至70个残基、5至60个残基、5至50个残基、5至40个残基、5至30个残基、5至20个残基、5至15个残基、5至10个残基、10至200个残基、10至100个残基、10至90个残基、10至80个残基、10至70个残基、10至60个残基、10至50个残基、10至40个残基、10至30个残基、10至20个残基、20至200个残基、20至100个残基、20至90个残基、20至80个残基、20至70个残基、20至60个残基、20至50个残基、20至40个残基或20至30个残基。
所述CendR组合物的长度最长可有50、100、150、200、250、300、400、500、1000或2000个残基。在具体的实施方案中,CendR组合物的长度可以是至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个残基。在另外的实施方案中,CendR组合物的长度可以是5至200个残基、5至100个残基、5至90个残基、5至80个残基、5至70个残基、5至60个残基、5至50个残基、5至40个残基、5至30个残基、5至20个残基、5至15个残基、5至10个残基、10至200个残基、10至100个残基、10至90个残基、10至80个残基、10至70个残基、10至60个残基、10至50个残基、10至40个残基、10至30个残基、10至20个残基、20至200个残基、20至100个残基、20至90个残基、20至80个残基、20至70个残基、20至60个残基、20至50个残基、20至40个残基或20至30个残基。
可稳定CendR(和其他)肽以对抗蛋白酶解。例如,可通过用N-甲基化或C-甲基化保护一些肽键而保护肽例如肿瘤归巢肽CREKA(Simberg et al.,2007)的稳定性和活性。为了增强活性保护的最重要的键是R-G键,因为它会防止这样的切割,即其会灭活整联蛋白结合和CendR活性。例如,肽C(CMe)RGDKGPDC(SEQ ID NO:92)和CR(NMe)GDKGPDC(SEQ ID NO:93)化合物对于不想要的蛋白酶解是稳定的。辅助肽和归巢肽也可以或者类似地被稳定对抗蛋白酶解。
LyP-1肽和任何其他CendR肽的活性可使用用于iRGD的相同Evans Blue测定(图5)来测试。MDA-MB-435人癌可用于测试LyP-1肽的活性,因为该肿瘤显示出最高表达的细胞表面p32——LyP-1的初级受体(Fogal et al.,2008)。RGR在噬菌体文库筛查中用RIP-Tag胰岛细胞癌(可用于测试RGR肽的活性)鉴别(Joyce et al.,2003)。LyP-1的主要靶标是低氧/低营养区域的肿瘤淋巴、肿瘤巨噬细胞和肿瘤细胞,而不是血管(Laakkonen et al.,2004;Fogal et al.,2008)。因此,可预期与LyP-1一同注射的化合物能够优先积累于所述肽偏好的区域。
iRGD可以增加多种大小的共组合物的积累:1.3-kDa FAM-CRGDC肽(其没有CendR基序,靠其自身仅最小程度地穿入肿瘤组织)、白蛋白结合染料(Evans Blue)、抗体和两类纳米颗粒:T7噬菌体(直径65nm)和氧化铁纳米蠕虫(长80nm,厚30nm)。任何共组合物均可使用例如iRGD和非CendR RGD肽(其作为用于肿瘤积累的对照,所述肿瘤积累涉及归巢至肿瘤联合的整联蛋白,但不是所述CendR机制)测试。该RGD肽的惰性D至E变体可以用作不与整联蛋白结合的对照肽。可以对所述CendR肽的剂量滴定以找出最有效的范围。由CendR肽介导的共组合物的内化和组织穿入还可通过例如用标记形式的共组合物对经灌注的、iRGD处理的肿瘤染色来测试。
所公开的CendR肽(和其他CendR形式)和共组合物可以以下方式给予:一起或分开;相同的形式和方式或者不同的形式和/或方式;在相同的时间或不同的时间;所述CendR肽(或其他CendR形式)在先或在后。给药可以是,例如,共同给药(同时并且通过相同或不同的途径/方式/形式)、分开给药(通过相同或不同的途径/方式/形式平行给药)、顺序给药(在不同的时间通过相同或不同的途径/方式/形式)等。当所述共组合物和CendR肽(或其他CendR形式)在不同时间给药时,在所述给药之间可以使用多种不同的延迟。例如,可在给予共组合物之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、20、30、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120分钟或更长时间给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、54、60、66或72小时或更长时间给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之前1、2、3、4、5、6或7天或更长时间给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、20、30、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120分钟或更长时间给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、54、60、66或72小时或更长时间给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之后1、2、3、4、5、6或7天或更长时间给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。
可在给予共组合物之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、20、30、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120分钟之内给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之前1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、54、60、66或72小时之内给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之前1、2、3、4、5、6或7天之内给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、20、30、40、45、50、60、70、80、90、100、110或120分钟之内给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、54、60、66或72小时之内给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。可在给予共组合物之后1、2、3、4、5、6或7天之内给予所述CendR肽(或其他CendR形式)。在同一天或同一小时内给药尤其有用。
所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件和所述共组合物可被同时给予所述受试者。同时是指在重叠或者连续的时间段内。所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件和所述共组合物可在包含所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件和所述共组合物的单一组合物中给予受试者。所述CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽或CendR元件和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的时间给予所述受试者。所述CendR元件和所述共组合物可在不同的组合物中给予所述受试者。不同的组合物是指相互没有混合或接触的组合物(可能在给药后出现的除外)。所述CendR元件和所述共组合物可通过不同的途径给予所述受试者。不同的途径是指在不同的位点,通过不同的方式或模式。
CendR肽可被制备为稳定化肽的形式并且/或者配制为长的环化形式。例如,可以使用聚乙二醇缀合物。还可在一段时间内给予CendR肽和/或共组合物。例如,可用渗透泵递送CendR肽和/或共组合物。这可以扩大靶细胞和组织的穿透性。可使用修饰形式的CendR肽。例如,CendR肽可被甲基化(其可以稳定所述肽对抗蛋白酶解)。需要对抗切割的稳定性,待切割以活化CendR元件的键除外。对CendR元件的修饰通常应使得它们在活化后仍具有功能或者能够发挥功能。
应理解,有很多可被纳入所述公开的CendR组合物、缀合物、分子、蛋白质、肽和元件的氨基酸和肽类似物。例如,有很多可以使用的D氨基酸或其他非天然氨基酸。公开了天然存在的肽的相对立体异构体,以及肽类似物的立体异构体。通过化学合成或者通过用选择的氨基酸装载tRNA分子和工程改造遗传构建体(其使用例如琥珀密码予以位点特异性方式将所述氨基酸类似物插入肽链中)可将这些氨基酸容易地纳入多肽链中(Thorson et al.,Methods in Molec.Biol.77:43-73(1991),Zoller,Current Opinion in Biotechnology,3:348-354(1992);Ibba,Biotechnology& Genetic Engineering Reviews 13:197-216(1995),Cahill et al.,TIBS,14(10):400-403(1989);Benner,TIB Tech,12:158-163(1994);Ibba andHennecke,Bio/technology,12:678-682(1994),所有这些至少对于与氨基酸类似物相关的材料都以引用的方式纳入本文)。
可以产生类似于肽但是不经天然肽键连接的分子。例如,用于氨基酸或氨基酸类似物的连接可以包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2--CH2--、--CH=CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CHH2SO--(这些和其他可见于Spatola,A.F.in Chemistry and Biochemistry ofAmino Acids,Peptides,and Proteins,B.Weinstein,eds.,Marcel Dekker,New York,p.267(1983);Spatola,A.F.,Vega Data(March 1983),Vol.1,Issue 3,Peptide Backbone Modifications(general review);Morley,TrendsPharm Sci(1980)pp.463-468;Hudson,D.et al.,Int J Pept Prot Res14:177-185(1979)(--CH2NH--,CH2CH2--);Spatola et al.Life Sci38:1243-1249(1986)(--CH H2--S);Hann J.Chem.Soc Perkin Trans.I307-314(1982)(--CH--CH--,顺式和反式);Almquist et al.J.Med.Chem.23:1392-1398(1980)(--COCH2--);Jennings-Wbite et al.Tetrahedron Lett23:2533(1982)(--COCH2--);Szelke et al.European Appln,EP 45665CA(1982):97:39405(1982)(--CH(OH)CH2--);Holladay et al.Tetrahedron.Lett 24:4401-4404(1983)(--C(OH)CH2--);和Hruby Life Sci 31:189-199(1982)(--CH2--S--);这些各自都以引用的方式纳入本文)。一个特别有优选的非肽连接是--CH2NH--。应理解,肽类似物可以在所述键原子之间有超过一个原子,例如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。
氨基酸类似物和肽类似物经常具有增强的或需要的特性,例如,生产更经济、化学稳定性更高、药物学性质(半衰期、吸收、效能、有效性等)增强、特异性改变(例如,宽谱的生物活性)、抗原性降低以及其他。
可以使用D-氨基酸来产生更稳定的肽,因为D氨基酸不被肽酶等识别。只要能够保留活性,就可用同类型D-氨基酸系统地代替共有序列的一个或多个氨基酸(例如,用D-赖氨酸代替L-赖氨酸),以生成更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于使两个或多个肽环化或连接在一起。这可用于将肽限制于具体的构象(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992),以引用的方式纳入本文)。
公开了这样的多功能CendR组合物,其除了所述CendR元件之外,还包含例如辅助肽、与所述CendR元件融合的辅助肽、共价连接或非共价缔合于所述CendR元件或CendR肽的辅助分子、与所述CendR元件融合的归巢肽、共价连接或非共价缔合于所述CendR元件或CendR肽的归巢分子、与所述CendR元件融合的货物组合物和/或共价连接或非共价缔合于所述CendR元件或CendR肽的货物组合物。具有不同功能的其他化合物可被加至所述组合物。这样的多功能缀合物具有至少两个由所述组合物的不同部分赋予的功能,并且除了选择性归巢活性外,还能够例如展示抗血管生成活性或促细胞凋亡活性。
本文使用的术语“肽”被广泛地用于指肽、蛋白质、蛋白质的片段等。本文使用的术语“肽模拟物”是指具有作为其结构基础的肽的活性的肽样分子。这样的肽模拟物包括化学修饰肽、包含非天然存在氨基酸的肽样分子和类肽(peptoid),并且具有例如所述肽模拟物从中衍生的活性(参见,例如Goodman and Ro,Peptidomimetics for Drug Design,in″Burger′s Medicinal Chemistry and Drug Discovery″Vol.1(ed.M.E.Wolff;John Wiley & Sons 1995),803-861页)。
CendR元件与存在于细胞表面的神经毡蛋白-1(NRP-1)结合。CendR元件与NRP-1的结合介导所述CendR元件、附着于所述CendR元件的任意物质和共组合物的内化。非肽化合物也可以用于结合NRP-1并且介导内化和组织穿入。这样的非肽化合物在本文中被称为CendR化合物。CendR化合物可以以本文描述的使用CendR元件的所有形式使用,并且可被用在所有组合物中(其中使用CendR元件)(唯一的例外是具体用途或组合物需要所述CendR组分是肽时)。
已经开发了用于归巢肽的设计原理,其结合三种功能:组织特异性归巢、在靶组织中扩散和内化进入所述组织中的细胞。这些肽包含组织特异性归巢序列以及包含在CendR元件中的组织穿入和内化基序。可活化CendR元件可通过例如所述靶组织处的蛋白酶解而被活化。该实例通过靶向选择的组织为该平台技术提供了原理的证据。
1.使用所公开的原理和实例,结合特异性归巢于正常或患病组织、组织穿入和细胞内化的肽可被筛选和合成。还公开了结合组织特异性归巢、组织穿入和细胞内化的肽。所述肽可以使用归巢和组织穿入元件的多种结合,并且将靶向心脏、肺或前列腺。
2.所公开的肽可用于组织特异性归巢、在所述靶组织中扩散和内化进入所述组织中的细胞,该用途可通过进行体外细胞结合和内化,以及在体内归巢测定中确定和证实。
所公开的化合物是引导材料进入靶组织的有用工具。它们可以使得诊断性和治疗性化合物疾病特异性或者细胞类型和组织特异性地靶向,以增加有效性且减少副作用。本文公开的原理可应用于任何可获得特异性归巢肽并且表达CendR受体的细胞或组织(大部分细胞都这样)。
最近的研究已经发现在不同正常组织的脉管系统中有大量的分子异质性。此外,病理性损伤,例如肿瘤,对所述脉管系统施以它们自有的改变。该分子标记系统可被称作“脉管代码(vascular zip code)”(Ruoslahti,2004)。所述代码使得基于停靠的(“synaphic”)靶向可以选择性地递送诊断性和治疗性物质进入特定组织。该方法可以产生更大的有效性并且减少副作用。已经建立了所述靶向递送原理,尤其是在癌症中:用抗体将放射性同位素靶向白细胞是已建立的疗法,旨在诊断和治疗实体瘤的一些产品在临床试验中;它们中的很多使用早期产生的肿瘤归巢肽或它们的衍生物。但是,在使得所述synaphic递送更广泛地使用中的一个问题是有效性倾向于较低。已经认识到将递送物靶向血管可能更有效,因为它们的内皮衬里容易接触循环的探针,而穿入肿瘤实质在过去是个问题(Jain,1990)。因此,尽管很容易证明被靶向的材料与靶脉管的结合,但是不一定可以获得在所述靶组织中有大幅更高浓度的所述材料(例如,Liu et al.,2007)。
已经发现了一类新的归巢肽,其在递送负载至靶标方面比目前存在的肽更有效并且更具特异性。如本文所描述,这些肽的一个重要特征(和它们较高性能的基础)是达到所述靶组织时,它们活跃地渗入并且穿入所述组织和其中的细胞。该活性的原理和分子机制已经用肿瘤归巢肽确证。但是,所述原理的使用和应用可以用任何细胞和组织,并且使用任何细胞或组织靶向或归巢化合物。
超出现有可能的将更高浓度或量的材料递送到达并且进入身体中的特定靶标的能力在医学上有极大的意义。所公开的技术可以有益于所有体内诊断化合物、肠胃外给予的药物、纳米医学化合物、基因和细胞治疗物等。它可以通过浓缩待递送至所述靶标的材料而提高效能,并且减少接受相对较少所述材料的其他组织中的副作用。选择性穿入所述靶组织更进一步增加有效性。最后,所公开的组织穿入肽可被修饰并且配制为药物样化学物质,这使得所述技术也可以用于口服给药疗法。
最近发现了一种组织/细胞穿入系统,其使得能够产生不仅归巢于特定靶组织并且还穿入所述组织的肽。所述组织穿入基序必需在肽(或蛋白质)的C端暴露以变得有活性。因此,对于C末端规则,它被称为CendR。图1描述了所述CendR系统的原理。CendR归巢肽包含组织特异性归巢序列和CendR序列(如图1所描绘,其可以是潜在的或可活化的CendR序列)。所述归巢序列将所述肽携带至靶组织中的脉管内皮,如果该肽有潜在CendR序列,则所述肽会在此由内源性蛋白酶以蛋白酶解方式处理,使得CendR基序变成C端并且有活性。然后所述活化的CendR基序结合至受体(神经毡-1),其介导所述CendR肽和附着于所述CendR肽的任何负载的外渗、组织穿入和细胞进入(Teesalu et al.,2009;美国专利申请公布No.20090226372)。
所述多步骤归巢、处理和组织穿入过程使得CendR比仅依赖受体结合的肽和其他探针更具特异性。所述组织和细胞穿入促进递送至所述靶组织中的所有部分和细胞类型。
首次注意到,在细胞结合和组织归巢肽的T7噬菌体文库筛选中,不成比例数目的肽具有精氨酸(或者有时是赖氨酸或组氨酸)作为C端残基。(在所述T7系统中,所述肽插入物被展示在所述噬菌体外壳蛋白的C端)。C端精氨酸一般出现在RXXR序列中(R,精氨酸;X,任意氨基酸)。认识到该序列基序能够引发噬菌体颗粒内化进入细胞,导致富集。已经产生了大量数据证明该系统及其机制。首先,将展示R(K)XXR基序的噬菌体从已经在37℃下培养的细胞(PPC1前列腺癌细胞)中回收,并用酸性缓冲液(pH 2.5)清洗。由于T7噬菌体在pH 2.5下不稳定,因此该结果指示了噬菌体的内化。使用来自选择的库中的个体噬菌体的结合研究表明,尽管仅存在C端精氨酸(如在G6R中)就足以用于噬菌体与PPC1细胞的微弱结合,但是强结合和内化需要C端RXXR基序的存在,如在,例如RPARPAR(SEQ ID NO:2)中,其是所述选择的噬菌体库中的最经常性的代表序列。
所述RPARPAR肽的丙氨酸扫描显示,C端精氨酸(或赖氨酸)对于噬菌体结合是关键的,并且另外两个碱性氨基酸可以以剂量和位置依赖的方式增加所述相互作用。所述与细胞的相互作用并不涉及其他噬菌体元件,因为RPARPAR-功能化的量子点(qdots)以难于区分于所述噬菌体颗粒的方式结合并且被内化。所述量子点内化可见于活的、未固定的细胞,处理假象所致的细胞内积累除外。值得注意的是,包含D-氨基酸的肽(D-rparpar;SEQ ID NO:2)引发摄入量子点的能力大幅下降,表明涉及手性结合位点。用另外的C端氨基酸隐藏所述C端RXXR元件(如在RPARPARA中;SEQ ID NO:94)或者将所述C端羧基基团酰胺化消除了细胞结合和内化。用胰蛋白酶处理所述RPARPARA噬菌体(其在碱性残基后切割并且推定暴露C端精氨酸)恢复了PPC-1细胞结合。这些发现表明,细胞结合和内化需要存在带有游离羧基基团的末端碱性氨基酸。一组肿瘤和正常细胞系中的每个细胞系和源自正常小鼠器官的原代细胞也结合了RPARPAR噬菌体。
静脉内注射的RPARPAR噬菌体强烈地积累于首先遇到的血管床——肺,并以较低的程度积累于心脏。所述RPARPAR噬菌体扩散于整个肺组织,而对照噬菌体在肺中检测不到。该结果表明所述CendR噬菌体能够穿入进入组织实质。因此,RPARPAR肽是能够进入多种类型的细胞并且还能够促进组织穿入的细胞穿入肽。多个细胞内化途径的可用抑制剂中没有一种抑制了由RPARPAR CendR肽介导的内化,表明有新的途径。
神经毡蛋白-1是CendR肽的细胞受体。为了鉴别RPARPAR结合蛋白,通过亲和层析在固定于琼脂糖珠的RPARPAR肽上对PPC-1肿瘤提取物进行了分级分离。用包含游离RPARPAR肽的缓冲液洗脱释放了130-kDa的蛋白质,其由MALDI-TOF质谱鉴定为NRP-1。通过免疫印迹确证了所述鉴定。
一系列证据支持NRP-1作为CendR受体的作用:M21黑色素瘤细胞既不结合也不内化RPARPAR肽,也不表达NRP-1。NRP-1在这些细胞中的强制表达使得能够结合和内化RPARPAR噬菌体,而用NRP-1结合袋突变体转染的细胞没有赋予RPARPAR结合。最后,免疫荧光共染色(immunofluorescent co-staining)显示RPARPAR噬菌体和量子点与NRP-1共同位于细胞表面和细胞内部。
血管内皮生长因子的一种可变形式——VEGF-165使用其由外显子8编码的C端CendR样序列(CRCDKPRR;SEQ ID NO:95;Jia et al.,2006)结合NRP-1。一些肽,例如A7R(ATWLPPR;SEQ ID NO:96;Starzec et al.,2006)、免疫调节肽促吞噬肽(tuftsin)(TKPR;SEQ ID NO:97)和其变体增强的促吞噬肽(TKPPR;SEQ ID NO:98;von Wronski etal.,2006)也结合NRP-1上的相同位点(Geretti et al.,2008)。同样结合该位点的脑信号蛋白3A可增强脉管穿透性(Acevedo et al.,2008)。展示VEGF-165的7个C端氨基酸、增强的促吞噬肽或A7R的T7噬菌体与PPC-1细胞结合或者被其摄入,这两种活性在未标记的RPARPAR肽被包括在所述结合缓冲液中或者丙氨酸残基被加至VEGF-C7的C端时都被降低。这些实验显示CendR肽通过涉及NRP-1(作为关键组分)的途径被内化。
已知同源域转录因子,例如Antennapedia、单纯疱疹病毒-1蛋白VP22和人免疫缺陷病毒-1反式活化剂TAT蛋白质可以被内化进入细胞。来自这些蛋白质的短阳离子细胞穿入肽(CPP)可保持其内化能力。但是,这些肽不同于CendR肽,因为它们不受所述肽中氨基酸的手性影响,需要细胞表面的硫酸乙酰肝素用于活性,并且没有组织穿入活性(Langel,2007)。
来自噬菌体筛选的肿瘤归巢肽中的潜在CendR序列。通过胰蛋白酶活化C端保护的RPARPARA肽表明内部CendR基序可被蛋白酶活化,引发内化和组织穿入。确实,对来自肿瘤归巢筛选的所述细胞穿入肽进行检查显示了一些可能的CendR肽。这些肽包括LyP-1(CGNKRTRGC;SEQ ID NO:99),其包含KRTR序列(SEQ ID NO:100;Laakkonen et al.,2002,2004;PCT公布No.WO 2007/090194;美国专利申请公布No.2008/0014143);CRGRRST(SEQ ID NO:101);RGRR(SEQ ID NO:102;Joyce et al.,2003);和一种新发现的RGD肽,其具有优越的细胞和组织穿入活性——iRGD(Sugahara et al.,2009;美国专利申请No.12/355,672,2009年1月19日提交)。
上文所列的每种肿瘤归巢肽都含有CendR基序——R/KXXK/R,但是该基序不是C端。据推测,蛋白酶解过程能够活化这些肽中的CendR基序。确实,用胰蛋白酶处理iRGD噬菌体或LyP-1噬菌体增强了所述噬菌体与PPC1细胞的结合。胰蛋白酶对非内化肽CRGDC(SEQ IDNO:36)或RGD-4C没有作用。4℃时所述胰蛋白酶处理的iRGD噬菌体(而不是完整iRGD噬菌体)的结合被表达原型CendR肽——RPARPAR的非感染性噬菌体阻断,而不被展示以下所述肽(RPARPARA;SEQ IDNO:2)的噬菌体阻断,所述肽中的CendR基序由在C端加入丙氨酸残基而被隐藏。还从用iRGD肽处理的细胞中分离了细胞内产物,并且质谱显示预计的CendR活性片段——CRGDK(SEQ ID NO:34)可从所述细胞中回收(Sugahara et al.,2009;美国专利申请No.12/355,672,2009年1月19日提交)。
所述iRGD肽独特地对促进外渗和组织穿入有效;iRGD肽和iRGD噬菌体在肿瘤组织中扩散,而缺乏潜在CendR基序的常规RGD肽仅到达所述肿瘤血管(参见图4)。所述iRGD肽未被检测出归巢于任何正常组织。用所述iRGD肽包被的纳米颗粒很明显地扩散进入组织,可使进行光学成像、MRI并且增强abraxane(包含紫杉醇和白蛋白的纳米颗粒药物)的活性。iRGD引起的归巢增加平均是非靶向对照的12倍(Sugahara et al.2009;2009年1月19日提交的美国专利申请No.12/355,672)。所述LyP-1肽也携带纳米颗粒和其他共组合物深入血管外肿瘤组织(Laakkonen et al.,2004;Karmali et al.,2009;PCT公布No.WO2007/090194;美国专利申请公布No.2008/0014143)。这些结果证明所述CendR元件介导组织穿入和细胞内化,以及包含潜在CendR元件的肿瘤归巢肽可以独特地对于将负载特异地递送至肿瘤有效。如本文所公开,CendR元件和CendR归巢肽的用途可被扩展用于非肿瘤的组织。
器官特异性CendR归巢肽。大部分,可能全部正常组织在它们的脉管系统上有组织特异性分子标志,其由特定分子标记物确定(在Ruoslahti,2004中综述)。对于肿瘤,这些差异可用来自噬菌体展示筛查的肽进行探测,并且可被开发为递送化合物和组合物(例如CendR元件和CendR肽)的靶。
目前已通过体内噬菌体展示分析的所有正常组织都显示表达组织特异性内皮标记物。这些组织包括较大器官,例如脑、肺、心脏和肾脏;以及小器官,例如前列腺(Ruoslahti and Rajotte,2000;Arap et al.,2002;Zhang et al.,2005)。早期的工作是用丝状噬菌体文库进行的,其中所述插入物作为噬菌体表面蛋白质上的N端延伸部分表达。这些文库并不支持CendR肽,因此,从这些筛查中回收的组织特异性归巢肽并不包含CendR基序。
最近的研究中用T7检查器官特异性归巢肽已经发现了很多具有潜在CendR序列的肽。一群心脏归巢肽(Zhang et al.,2005;美国专利申请公布no 2006/0160743和2009/0092548)包含3个这样的肽;它们其中的2个效能最强的肽是CGRKSKTVC(SEQ ID NO:103)(被认为是受体,富含半胱氨酸的蛋白2)和CPKTRRVPC(SEQ ID NO:104)(受体,膀胱癌相关蛋白bc10)。最近,进行了使用正常前列腺组织的基于T7的筛查,不同于早前的丝状噬菌体筛查(Arap et al.,2002),T7筛查也发现了大量的CendR肽。来自由3轮对从小鼠前列腺分离的细胞的离体(ex vivo)筛查和1轮体内前列腺归巢筛查组成的筛查中的21种肽中,有9种包含潜在的CendR基序。值得注意的是,这九种中有八种相互之间非常相似,因为它们都符合CRXTRXXRC共有序列(SEQ ID NO:105)。一种带有表观CendR(apparent CendR)基序的狂犬病毒衍生的肽被用于递送siRNA通过血脑屏障至脑(Kumar et al.,2007)。这些结果表明具有CendR特性的器官特异性肽可被生产和使用。
如本文所公开,可筛选和合成结合组织特异性归巢、组织穿入和细胞内化的肽。所述肽可使用脉管归巢和组织穿入元件的多种结合,并且可以靶向例如心脏、肺或前列腺。
正常器官可被用作靶,因为可预计脉管系统和实质的组织特异性特性即使在患病组织中也被保留,尤其是在疾病过程早期,此时干预可能是最有益的。例如,可以靶向心脏、肺和前列腺。用于这些组织的脉管系统的常规CendR肽和候选CendR肽都是可以得到的。对于可以使用特异性靶向和组织穿入的治疗(囊性纤维化是这类疾病的一个实例),心脏和肺是非常值得关注的靶。此外,心脏和肺的右侧是首先遇到静脉内注射的肽的组织。预活化的CendR肽(具有暴露的R/KXXR/K序列的肽;SEQ ID NO:2)确实选择性地被这些组织保留。因此,它们在一定程度上被像RPARPAR(SEQ ID NO:2)和CRPPR(SEQ ID NO:106;Zhang et al.,2005)的肽选择性地靶向。先前已经使用转基因前列腺癌小鼠用于显示在所述肿瘤出现之前靶向破坏前列腺组织显著地推迟这些小鼠中肿瘤的出现(Arap et al.,2002)。所公开的肽将更有效地改善所述过程。此外,前列腺代表了小器官和其中首过效应不是一个因素的器官。神经毡蛋白-1在内皮细胞和多种实质细胞中遍在表达,在前列腺筛查中得到了大量表观CendR肽,因此所述CendR方法也可被用于前列腺。
例如,3种方法可被用于所述选择的器官的组织穿入肽:(1)对心脏和前列腺测试已有的CendR基序肽;(2)构建包含之前鉴定的归巢序列和通用CendR基序的嵌合肽;和(3)对新肽进行噬菌体筛查。
现有CendR基序归巢肽。已有归巢于肺(Rajotte and Ruoslahti,1999;Brown and Ruoslahti,2004)、心脏(Zhang et al.,2005,和未公开结果)和前列腺(Arap et al.,2002;未发表)的肽。这些肽中的一些有CendR基序。可以数种方式证实肽的归巢。一个实例是使用被称为“play offscreening”的筛查方法。以相等比例结合所述候选噬菌体,将该库注射至小鼠,将靶器官或组织连同一些其他器官或组织收集,并通过定量PCR确定是否任何噬菌体展示肽均优先地归巢于靶。所述肺(和心脏)可在一定程度上被活化的CendR肽(例如,RPARPAR;SEQ ID NO:2)靶向。所述归巢基于首过效应,并且包括心脏(尤其是右侧)。在其他器官中还有这些肽的大量的积累;结果是,如果需要严格靶向,它们是最好的。
嵌合肽。之前(和以后)鉴定的非CendR归巢肽可与活化的或可活化CendR元件结合。例如,用于肺(Rajotte and Ruoslahti,1999;Brownand Ruoslahti,2004)和前列腺(Arap et al.,2002)的归巢肽可与RPARPAR(SEQ ID NO:2)(或RPAR;SEQ ID NO:5)结合,使得所述归巢肽成为RPARPAR(SEQ ID NO:2)的C端(以阻断所述CendR活性);并且被为CendR活化提供蛋白酶切割位点的序列分开。这些肽中潜在的CendR元件可被弗林蛋白酶活化,因为这些酶优选地在RXXR中的C端精氨酸后切割,特别是当所述X中的一个是碱性氨基酸时。但是,正如通过以胰蛋白酶活化RPARPARA(SEQ ID NO:2)和iRGD所证明的,在碱性氨基酸后切割的任何酶均有可能活化潜在CendR序列。所述酶相对于CendR归巢肽的初级受体的定位可能影响所述活化。已知的切割位点可通过重复来自已有可活化CendR肽的序列来制造。所述构建体可使用噬菌体滴定作为读出信息被测试为噬菌体展示的肽。如果需要,可通过用结构RPARPXRXXXX-归巢肽(SEQ ID NO:107)制备噬菌体文库,并且就结合以及内化进入从所述靶组织分离的细胞对其进行筛查,来优化所述蛋白酶切割位点。
对于肺归巢,例如序列CGFELETC(SEQ ID NO:108;Rajotte andRuoslahti,1999;靶分子:膜二肽基肽酶)可被用于构建嵌合肽文库。
作为心脏归巢的另一个策略,非CendR肽心脏归巢肽集合(Zhanget al.,2005)可被用于构建嵌合肽和文库。作为另一个策略,可以使用显示偏好心脏(Zhang et al.,2005)的活化的CendR肽CRPPR(SEQ ID NO:106)。通过测试例如CRPPRA序列(SEQ ID NO:109)的活化和/或内化(C端氨基酸需要被切掉以活化所述CendR元件——也可以使用其他氨基酸),或者通过用例如结构CRPPRXXXX(SEQ ID NO:110)筛查噬菌体文库,可以产生其他心脏归巢CendR基序肽。
对于前列腺,前列腺归巢肽(SMSIARL;靶分子未知;Arap et al.,2002)例如可被用作构建嵌合肽文库的起始点。前列腺特异性膜抗原(PSMA)为在前列腺中被活化的CendR肽提供另一个值得注意的来源。PSMA是谷氨酰基偏好的羧肽酶(例如,Liu et al.,2002)。用C端谷氨酸保护RPARPAR肽(RPARPARE;SEQ ID NO:111)能够给出在前列腺中选择性被活化的CendR肽。所述羧肽酶的表达在癌细胞中被上调,使得它尤其可用于癌症治疗中的活化。为了增加所述肽在前列腺中的浓度,在构建体中将例如前列腺归巢SMSIARL序列(SEQ ID NO:112)加至(在该情况下)例如RPARE序列(SEQ ID NO:111的氨基酸4-8)的N端一侧(SMSIARLARPARE;SEQ ID NO:113)。将一个氨基酸(例如丙氨酸)插入所述两个肽之间形成类似于RPARPAR(SEQ ID NO:2)中的双CendR基序。
所公开的肽可通过例如测试体外细胞结合和内化以及体内归巢来证实。合成肽可被用于证明,与所选择的噬菌体相关的活性由所述噬菌体展示的所述肽重现。关于上述内容的技术是已知的(例如,Zhang et al.,2005;Simberg et al.,2007;Karmali et al.,2008)。所述肽一般可用荧光团标记以在组织中检测,并且可以检测所述游离肽和纳米颗粒上的多聚体缀合物(其更接近地模拟在噬菌体上的多价展示)。
公开了与CendR元件连接以将所述CendR元件选择性地递送至给定细胞从而形成归巢CendR组合物的归巢分子。多种归巢分子可被用在所公开的组合物、缀合物和方法中。这样的归巢分子包括但不限于本文公开的肽。所公开的化合物、组合物、缀合物和方法可以包括或使用多种形式的所公开的归巢分子,包括如所公开的肽和肽模拟物。为了便于表达,在本文的很多地方陈述了使用或包括肽。应理解,在这样的情况下,考虑多种形式的归巢分子也可以相似或类似的方式使用或被包括,正如从肽方面描述的方式,并且这样的使用和包括被具体考虑并由此被公开。归巢CendR肽、分子等是指与一个或多个归巢肽或分子结合的CendR元件。
本文使用的术语“归巢分子”是指在体内选择性地归巢于特定细胞或特定组织而非正常组织的任意分子。类似地,术语“归巢肽”或“归巢肽模拟物”是指在体内选择性地归巢于特定细胞或特定组织而非正常组织的肽。应理解,在体内选择性地归巢于特定细胞或特定组织的归巢分子可以表现出优先归巢于特定细胞或特定组织。
术语“选择性地归巢”是指在体内相对于非靶所述归巢分子优先地结合靶。例如,与非肿瘤相比,所述归巢分子可以优先地结合于肿瘤。选择性地归巢于例如肿瘤细胞的特征一般是,其在肿瘤细胞内的定位是在一些组织类型的非肿瘤细胞内的至少两倍。归巢分子的特征可以是,至肿瘤细胞的定位是至大多数或者全部非肿瘤细胞的5倍、10倍、20倍或者更多倍。因此,应理解,在一些情况下,除了归巢于靶细胞和组织外,归巢分子部分地归巢至一种或多种正常细胞、组织和器官。选择性归巢也可以称为靶向。
归巢分子识别和/或结合至它的靶中的结合可以指共价和非共价结合,例如,其中归巢分子可以通过共价和/或非共价连接方式结合、附着或者以其他方式连接至它的靶。结合可以是高亲和性或低亲和性的,优选高亲和性。可以使用的结合力的实例包括但不限于共价键、偶极相互作用、静电力、氢键、疏水相互作用、离子键和/或范德华力。除了与CendR元件一起出现的结合之外,该结合也可以出现。
很多归巢分子和归巢肽归巢于所述靶组织的脉管系统。但是,为方便起见,本文的一些地方,归巢被称为归巢于与归巢分子或者归巢肽实际可以归巢于的脉管系统相关的组织。因此,例如,归巢于肿瘤脉管系统的归巢肽在本文中可被称为归巢于肿瘤组织或肿瘤细胞。通过将归巢分子或归巢肽包括或缔合于例如蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件,所述蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件可被靶向或者可以归巢于所述归巢分子或归巢肽的靶。这样,所述蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件可被称为归巢于所述归巢分子或归巢肽的靶。为方便起见并且除非另有说明,提及蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件等的归巢则意欲是指所述蛋白质、肽、氨基酸序列、共组合物、货物组合物或CendR元件等包括或与合适的归巢分子或归巢肽缔合。
所公开的氨基酸序列、共组合物、蛋白质或肽(以及与归巢分子连接或缔合的CendR元件)可以例如归巢于脑细胞、脑的干细胞、脑组织和/或脑脉管系统、肾细胞、肾干细胞、肾组织和/或肾脉管系统、皮肤细胞、皮肤干细胞、皮肤组织和/或皮肤脉管系统、肺细胞、肺组织和/或肺脉管系统、胰腺细胞、胰腺组织和/或胰腺脉管系统、肠细胞、肠组织和/或肠脉管系统、肾上腺细胞、肾上腺组织和/或肾上腺脉管系统、视网膜细胞、视网膜组织和/或视网膜脉管系统、肝细胞、肝组织和/或肝脉管系统、前列腺细胞、前列腺组织和/或前列腺脉管系统、子宫内膜异位细胞、子宫内膜异位组织和/或子宫内膜异位脉管系统、卵巢细胞、卵巢组织和/或卵巢脉管系统、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管和/或肿瘤脉管系统、骨细胞、骨组织和/或骨脉管系统、骨髓细胞、骨髓组织和/或骨髓脉管系统、软骨细胞、软骨组织和/或软骨脉管系统、干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞、成体干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、乳腺干细胞、内皮干细胞、嗅成体干细胞、神经嵴干细胞、癌干细胞、血细胞、红细胞、血小板、白细胞、粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴样细胞、淋巴细胞、单核细胞、创伤脉管系统、损伤组织的脉管系统、发炎组织的脉管系统、动脉粥样硬化斑块或它们的结合。
归巢分子和归巢肽的实例是已知的。实例包括:
脑归巢肽,例如:CNSRLHLRC(SEQ ID NO:114),CENWWGDVC(SEQ ID NO:115),WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL(SEQ IDNO:116),CLSSRLDAC(SEQ ID NO:117),CVLRGGRC(SEQ ID NO:118),CNSRLQLRC(SEQ ID NO:119),CGVRLGC(SEQ ID NO:120),CKDWGRIC(SEQ IDNO:121),CLDWGRIC(SEQ ID NO:122),CTRITESC(SEQ ID NO:123),CETLPAC(SEQ ID NO:124),CRTGTLFC(SEQ ID NO:125),CGRSLDAC(SEQ ID NO:126),CRHWFDVVC(SEQ ID NO:127),CANAQSHC(SEQ ID NO:128),CGNPSYRC(SEQID NO:129),YPCGGEAVAGVSSVRTMCSE(SEQ ID NO:130),LNCDYQGTNPATSVSVPCTV(SEQ ID NO:131);肾归巢肽,例如:CLPVASC(SEQ ID NO:132),CGAREMC(SEQ ID NO:133),CKGRSSAC(SEQ IDNO:134),CWARAQGC(SEQ ID NO:135),CLGRSSVC(SEQ ID NO:136),CTSPGGSC(SEQ ID NO:137),CMGRWRLC(SEQ ID NO:138),CVGECGGC(SEQ ID NO:139),CVAWLNC(SEQ ID NO:140),CRRFQDC(SEQ ID NO:141),CLMGVHC(SEQ IDNO:142),CKLLSGVC(SEQ ID NO:143),CFVGHDLC(SEQ ID NO:144),CRCLNVC(SEQ ID NO:145),CKLMGEC(SEQ ID NO:146);皮肤归巢肽,例如:CARSKNKDC(SEQ ID NO:147),CRKDKC(SEQ ID NO:148),CVALCREACGEGC(SEQ ID NO:149),CSSGCSKNCLEMC(SEQ ID NO:150),CIGEVEVC(SEQ IDNO:151),CKWSRLHSC(SEQ ID NO:152),CWRGDRKIC(SEQ ID NO:153),CERVVGSSC(SEQ ID NO:154),CLAKENVVC(SEQ ID NO:155);肺归巢肽,例如:CGFECVRQCPERC(SEQ ID NO:156),CGFELETC(SEQ IDNO:157),CTLRDRNC(SEQ ID NO:158),CIGEVEVC(SEQ ID NO:159),CTLRDRNC(SEQ ID NO:160),CGKRYRNC(SEQ ID NO:161),CLRPYLNC(SEQ ID NO:162),CTVNEAYKTRMC(SEQ ID NO:163),CRLRSYGTLSLC(SEQ ID NO:164),CRPWHNQAHTEC(SEQ ID NO:165);胰腺归巢肽,例如:SWCEPGWCR(SEQ ID NO:166),CKAAKNK(SEQ ID NO:167),CKGAKAR(SEQ IDNO:168),VGVGEWSV(SEQ ID NO:169);小肠归巢肽,例如:YSGKWGW(SEQ ID NO:170);子宫归巢肽,例如:GLSGGRS(SEQ IDNO:171);肾上腺归巢肽,例如:LMLPRAD(SEQ ID NO:172),LPRYLLS(SEQ ID NO:173);视网膜归巢肽,例如:CSCFRDVCC(SEQ IDNO:174),CRDVVSVIC(SEQ ID NO:175);消化道归巢肽,例如:YSGKWGK(SEQ ID NO:176),GISALVLS(SEQ ID NO:177),SRRQPLS(SEQ ID NO:178),MSPQLAT(SEQ ID NO:179),MRRDEQR(SEQ ID NO:180),QVRRVPE(SEQ IDNO:181),VRRGSPQ(SEQ ID NO:182),GGRGSWE(SEQ ID NO:183),FRVRGSP(SEQ ID NO:184),RVRGPER(SEQ ID NO:185);肝归巢肽,例如:VKSVCRT(SEQ ID NO:186),WRQNMPL(SEQ ID NO:187),SRRFVGG(SEQ IDNO:188),ALERRSL(SEQ ID NO:189),ARRGWTL(SEQ ID NO:190);前列腺归巢肽,例如:SMSIARL(SEQ ID NO:191),VSFLEYR(SEQ ID NO:192),RGRWLAL(SEQ ID NO:193);卵巢归巢肽,例如:EVRSRLS(SEQ IDNO:194),VRARLMS(SEQ ID NO:195),RVGLVAR(SEQ ID NO:196),RVRLVNL(SEQ ID NO:197);凝块结合归巢肽,例如:CREKA(SEQ ID NO:7),CLOT1,and CLOT2;心脏归巢肽,例如:CRPPR(SEQ ID NO:198),CGRKSKTVC(SEQ ID NO:199),CARPAR(SEQ ID NO:200),CPKRPR(SEQ IDNO:201),CKRAVR(SEQ ID NO:202),CRNSWKPNC(SEQ ID NO:203),RGSSS(SEQID NO:204),CRSTRANPC(SEQ ID NO:205),CPKTRRVPC(SEQ ID NO:206),CSGMARTKC(SEQ ID NO:207),GGGVFWQ(SEQ ID NO:208),HGRVRPH(SEQ IDNO:209),VVLVTSS(SEQ ID NO:210),CLHRGNSC(SEQ ID NO:211),CRSWNKADNRSC(SEQ ID NO:212),CGRKSKTVC(SEQ ID NO:213),CKRAVR(SEQ ID NO:214),CRNSWKPNC(SEQ ID NO:215),CPKTRRVPC(SEQ ID NO:216),CSGMARTKC(SEQ ID NO:217),CARPAR(SEQ ID NO:218),CPKRPR(SEQ IDNO:219);肿瘤血管归巢肽,例如:CNGRC(SEQ ID NO:220)和其他具有NGR基序的肽(美国专利No.6,177,542和6,576,239;美国专利申请公布No.20090257951);RGD肽,和RGR肽.
其他归巢肽包括CSRPRRSEC(SEQ ID NO:221),CSRPRRSVC(SEQ IDNO:222)和CSRPRRSWC(SEQ ID NO:223)(Hoffman et al.,Cancer Cell,vol.4(2003)),F3(KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKK;(SEQ ID NO:224)),PQRRSARLSA(SEQ ID NO:225),PKRRSARLSA(SEQ ID NO:226)(美国专利No.7,544,767),和CGRECPRLCQSSC(SEQ ID NO:62),其归巢于肿瘤.
应理解,尽管很多归巢和靶向基序和序列显示在一端或两端具有半胱氨酸残基,但这样的半胱氨酸一般不是归巢功能需要的。一般地,这样的半胱氨酸的存在归因于鉴定所述归巢和靶向序列的方法。这样的末端半胱氨酸可被用于例如环化肽,例如本文公开的那些肽。因为这些原因,还应理解半胱氨酸残基可被加至所公开的任意肽的末端。
可用的NGR肽,包括例如以下的肽X2CNGRCX2(SEQ ID NO:89),CX2(C/X)NGR(C/X)X2C(SEQ ID NO:90),和CNGRCX6(SEQ ID NO:91)(其中″X″是任意氨基酸),其可以是线性的或环化的.NGR肽的实例包括CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO:63),NGRAHA(SEQ ID NO:24),CVLNGRMEC(SEQ ID NO:67),CNGRC(SEQ ID NO:68),ALNGREESP(SEQ ID NO:66),CVLNGRME(SEQ ID NO:87),CKVCNGRCCG(SEQ ID NO:88),CEMCNGRCMG(SEQ ID NO:69),CPLCNGRCAL(SEQ ID NO:70),CPTCNGRCVR(SEQ ID NO:71),CGVCNGRCGL(SEQ ID NO:72),CEQCNGRCGQ(SEQ ID NO:73),CRNCNGRCEG(SEQ ID NO:74),CVLCNGRCWS(SEQ ID NO:75),CVTCNGRCRV(SEQ ID NO:76),CTECNGRCQL(SEQ ID NO:77),CRTCNGRCLE(SEQ ID NO:78),CETCNGRCVG(SEQ ID NO:79),CAVCNGRCGF(SEQ ID NO:80),CRDLNGRKVM(SEQ ID NO:81),CSCCNGRCGD(SEQ ID NO:82),CWGCNGRCRM(SEQ ID NO:83),CPLCNGRCAR(SEQ ID NO:84),CKSCNGRCLA(SEQ ID NO:85),CVPCNGRCHE(SEQ ID NO:86),CQSCNGRCVR(SEQ ID NO:47),CRTCNGRCQV(SEQ ID NO:48),CVQCNGRCAL(SEQ ID NO:49),CRCCNGRCSP(SEQ ID NO:50),CASNNGRVVL(SEQ ID NO:51),CGRCNGRCLL(SEQ ID NO:52),CWLCNGRCGR(SEQ ID NO:53),CSKCNGRCGH(SEQ ID NO:54),CVWCNGRCGL(SEQ ID NO:55),CIRCNGRCSV(SEQ ID NO:56),CGECNGRCVE(SEQ ID NO:57),CEGVNGRRLR(SEQ ID NO:58),CLSCNGRCPS(SEQ ID NO:59),CEVCNGRCAL(SEQ ID NO:60).
可用于肿瘤靶向的肽包括例如iRGD、LyP-1、iNGR和RGR肽。原型肿瘤归巢CendR肽——iRGD——被用于产生本文描述结果。LyP-1是一个包含推定的CendR元件并且具有肿瘤穿入特性的肽。该肽在肿瘤中具有独特的靶;它优先地积累于肿瘤的低氧/低营养区域(Laakkonen etal.,2002;2004;Karmali et al.,2009)。CRGRRST(RGR;Joyce et al.,2003)是一个成功地被用于将细胞因子抗体结合物靶向肿瘤内的肽(Hamzah et al.,2008)。该肽是线性的,这简化了合成。NGR肽归巢于生血管脉管系统,包括与肿瘤相关的生血管脉管系统,和αv整联蛋白和α5β1整联蛋白(美国专利No.6,576,239和6,177,542以及美国专利申请公布No.20090257951)。像LyP-1一样,RGR至少在一定程度上是肿瘤类型特异的(Joyce et al.,2003),但是由所述两种肽识别的肿瘤类型看起来是部分地不同的,这可能有益于测试与pan-肿瘤iRGD的结合物。表3显示肿瘤归巢CendR肽的实例。
表3.具有CendR元件的肿瘤归巢肽实例。
RGD肽是包含RGD(Arg-Gly-Asp)基序并且归巢于生血管和肿瘤脉管系统的肽。NGR肽是包含NGR(Asn-Gly-Arg)基序并且归巢于生血管和肿瘤脉管系统的肽。NGR肽的实例包括CNGRCVSGCAGRC(SEQ ID NO:63)、NGRAHA(SEQ ID NO:24)、CVLNGRMEC(SEQID NO:67)和CNGRC(SEQ ID NO:68)。GSL肽是包含GSL(Gly-Ser-Leu)基序并且归巢于肿瘤脉管系统的肽。GSL肽的实例包括CGSLVRC(SEQ ID NO:65)和CLSGSLSC(SEQ ID NO:64)。
内化RGD(iRGD)是指结合RGD基序和CendR元件的肽。例如,具有序列CRGDK/RGPD/EC(SEQ ID NO:71)的环化RGD在策划连接的负载在肿瘤组织中的外渗和扩散以及随后内化进入肿瘤细胞方面特别有效。所述iRGD肽包含两个功能元件:赋予肿瘤特异性的RGD基序(Pierschbacher and Ruoslahti,E.Cell attachment activity of fibronectincan be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.Nature309,30-33(1984);Ruoslahti(2003);Eliceiri and Cheresh(2001);Ruoslahti(2002);Arap et al.(1998);Curnis et al.(2004);Sipkins et al.(1998);Murphy et al.(2008))和介导穿入的CendR基序。iRGD可以容易地附着于表达αv整联蛋白的培养细胞,并且比其他RGD肽远远更有效地被内化。内化依赖于神经毡蛋白-1的表达,神经毡蛋白-1是CendR基序的受体。在多种肿瘤模型中,连接于荧光素、噬菌体或人工纳米颗粒负载的iRGD在体内积累于肿瘤脉管周围,扩散通过整个肿瘤间质组织,并且内化进入肿瘤细胞。全身给予用近红外染料标记的iRGD微团在小鼠的全身成像中产生强烈而特异的肿瘤信号。iRGD中的CendR元件是可活化CendR元件,所述可活化CendR元件可能被在Lys/Arg之后的切割而活化,从而使得所述肽介导内化。
内化NGR(iNGR)是指结合NGR基序和CendR元件的肽。例如,具有序列K/RNGR(SEQ ID NO:46)的NGR肽可以有效地策划所连接的负载在肿瘤组织中的外渗和扩散以及随后的内化进入肿瘤细胞。iNGR肽包括两个功能性元件:提供肿瘤特异性的NGR基序,和介导穿入的CendR基序。iNGR肽的另一个实例是NGRAHA(SEQ ID NO:24)。iNGR肽NGRAHA(SEQ ID NO:24)中的CendR元件是可活化CendR元件,所述可活化CendR元件可能被在Lys/Arg之后的切割而活化,从而使得所述肽介导内化。
辅助分子可以是具有有用功能并且可用于与CendR元件、CendR组合物、CendR缀合物、CendR分子、CendR化合物、CendR蛋白质、CendR肽、组合物、共组合物和/或货物组合物一起使用的任意分子、化合物、组分等。有用辅助分子的实例包括归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入分子、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子。不同的辅助分子可以相互具有相似或不同的功能。
靶向或归巢于一些分子、结构、细胞、组织等或者对一些分子、结构、细胞、组织等具有亲和性的分子尤其可用作辅助分子。除了本文他出描述的归巢肽,已知有很多分子和化合物对具体的靶分子、结构、细胞、组织等有亲和性,并且可以帮助积累并且/或者引导所公开的组分和组合物到达所述需靶。为方便起见,这样的亲和作用可被称为归巢。本文他处对归巢和归巢作用的描述可适用于这些分子。
亲和配体是与具体分子、部分、细胞组织等特异性地相互作用的分子。与亲和配体特异性地相互作用的分子、部分、细胞组织等在本文中被称为靶或靶分子、部分、细胞组织等。应理解,术语靶分子是指与亲和配体特异性地相互作用的单独的分子和这样的分子的部分,例如,蛋白质的表位。抗体、受体/配体对的任一成员、合成聚酰胺(Dervan andBurli,Sequence-specific DNA recognition by polyamides.Curr Opin ChemBiol,3(6):688-93(1999);Wemmer and Dervan,Targeting the minor grooveof DNA.Curr Opin Struct Biol,7(3):355-61(1997))和具有特异性结合亲和性的其他分子是亲和配体的实例。
与具体靶分子特异性地相互作用的亲和配体被称为对所述靶分子特异。例如,当所述亲和配体是与具体抗原结合的抗体时,所述亲和配体被称为对所述抗原特异。所述抗原是所述靶分子。所述亲和配体还可被称为对具体靶分子是特异的。有用亲和配体的实例是抗体、配体、结合蛋白质、受体蛋白质、半抗原、适体、碳水化合物、凝集素、叶酸、合成聚酰胺和寡核苷酸。有用的结合蛋白质包括DNA结合蛋白。有用的DNA结合蛋白包括锌指基序、亮氨酸拉链基序和螺旋-转角-螺旋基序。这些基序可结合在同一亲和配体中。
抗体可用作亲和配体。可市购或者使用已建立的方法获得抗体。例如,Johnstone和Thorpe,Immunochemistry In Practice(BlackwellScientific Publications,Oxford,England,1987)在30-85页描述了可用于产生单克隆抗体和多克隆抗体的一般方法。整本书描述了很多可用于在测定系统中使用抗体的很多一般技术和原理。已知与具体蛋白质、碳水化合物、糖蛋白、分子、细胞、组织等结合的很多抗体和其他亲和配体。这样的抗体可被用在所公开的组分和组合物中。
细胞穿入肽的实例在例如以下材料中描述:美国专利申请公布No.20100061942、20100061932、20100048487、20100022466、20100016215、20090280058、20090186802、20080234183、20060014712、20050260756和20030077289,它们在此被以引用的方式全文纳入本文,尤其是对于它们对细胞穿入肽和基序的描述。内体逃逸分子的实例在例如以下材料中描述:美国专利申请公布No.20090325866,20090317802,20080305119,20070292920,20060147997,20050038239,20040219169,20030148263,20030082143,20020132990,和20020068272,它们在此被以引用的方式全文纳入本文,尤其是对于它们对内体逃逸分子和基序的描述。亚细胞靶向分子的实例在例如以下材料中描述:美国专利申请公布No.2009031733,20090258926,20090176660,20080311136,20070287680,20070157328,20070111270,20070111251,20060257942,20060154340,20060014712,20050281805,20050233356,20040005309,20030082176,和20010021500,它们在此被以引用的方式全文纳入本文,尤其是对于它们对亚细胞靶向分子和基序的描述。核靶向分子的实例在例如以下材料中描述:
美国专利申请公布No.10100143454,20100099627,20090305329,20090176710,20090087899,20070231862,20070212332,20060242725,20060233807,20060147922,20060070133,20060051315,20050147993,20050071088,20030166601,20030125283,20030083261,20030003100,20020068272,和20020055174,它们在此被以引用的方式全文纳入本文,尤其是对于它们对核靶向分子和基序的描述。
如本文所公开,术语“共组合物”是指可与所述CendR元件一起使用的物质的任意组合物。类似地,术语“货物组合物”是指可与所述CendR元件一起使用的物质的任何组合物。一般地,例如,共组合物或货物组合物可以是待被内化并且/或者穿入细胞和/或组织的任意组合物。例如,共组合物或货物组合物可以是分子、缀合物、分子的结合、组合物、混合物。共组合物和货物组合物的实例包括但不限于癌症化疗剂、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、多肽、核酸分子、小分子、纳米颗粒、微粒、荧光团、荧光素、罗丹明、放射性核素、镥-177(177Lu)、铼-188(188Re)、镓-68(68Ga)、钇-90(90Y)、锝-99m(99mTc)、钬-166(166Ho)、碘-131(131I)、铟-111(111In)、氟-18(18F)、碳-11(11C)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、溴-75(75Br)、溴-76(76Br)、碘-124(124I)、铊-201(201Tl)、锝-99(99Tc)、碘-123(123I)、抗血管生成剂、促血管生成剂或它们的组合物。
所公开的CendR组分可与任何治疗剂一起使用,因为它们代表用于辅助将治疗剂递送至细胞和组织的一般模式和平台。因此,任何治疗剂都可被用在所公开的组合物中,或者与所公开的组合物一起使用。在很多地方可见治疗剂和药物的综合列表,例如Orange Book和美国食品和药物管理局维持的其他列表(信息可见于网站fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ucml29662.htm和fda.gov/Drugs/InformationOnDrugs/ApprovedDrugs/default.htm)和其他国家维持的类似列表,以及clinicaltrials.gov/(用于正在进行临床试验的药物和治疗剂)。
共组合物和货物组合物可以是部分。如本文所使用,术语“部分”广义上是指一般地赋予连接的共组合物或连接的货物组合物有用生物学功能的物理材料、化学材料或生物材料。部分可以任何天然和非天然材料,包括但不限于生物材料,例如细胞、噬菌体或其他病毒;有机化学物质,例如小分子;纳米颗粒、放射性核素;核酸分子或寡核苷酸;多肽;或肽。例如,影响所述靶的部分,例如具有治疗作用的部分,或者方便靶的检测、可视化或成像的部分,例如荧光团或放射性核素。
所述公开的共组合物和货物组合物的组分可以以任意合适的方式结合、连接和/或连结。例如,部分和其他分子可直接地或者间接地共价或非共价联结,有或无连接部分。
在一些实施方案中,共组合物或货物组合物可以包含癌症化疗剂。如本文所使用,“癌症化疗剂”是抑制癌细胞的增殖、生长、寿命或转移活性的化学试剂。这样的癌症化疗剂可以是但不限于紫杉烷,例如多西他赛(docetaxel);蒽环类抗生素,例如多柔比星;烷基化剂;长春花生物碱;抗代谢物;铂试剂,例如顺铂或卡铂;类固醇,例如氨甲喋呤;抗生素,例如阿霉素;isofamide;或者选择性雌激素受体调节剂;抗体,例如曲妥单抗(trastuzumab);紫杉醇,例如凯素(Abraxane);Doxil。
共组合物或货物组合物可以包含治疗剂。有用的治疗性试剂可以是例如细胞毒性剂,其如本文所使用的可以是直接或间接地促进细胞死亡的任何分子。可用的细胞毒性剂包括但不限于小分子、多肽、肽、肽模拟物、核酸分子、细胞和病毒。作为非限制性实例,可用的细胞毒性剂包括细胞毒性小分子,例如多柔比星、多西他赛或曲妥单抗;抗微生物肽,例如下文描述的那些;促细胞凋亡多肽,例如胱天蛋白酶和毒素,例如,胱天蛋白酶-8;白喉毒素A链,假单胞菌外毒素A,霍乱毒素,配体融合毒素,例如DAB389EGF、蓖麻毒素(蓖麻毒蛋白);和细胞毒性细胞,例如细胞毒性T细胞。参见,例如,Martin et al.,Cancer Res.60:3218-3224(2000);Kreitman and Pastan,Blood 90:252-259(1997);Allam et al.,Cancer Res.57:2615-2618(1997);and Osborne andCoronado-Heinsohn,Cancer J.Sci.Am.2:175(1996)。本领域技术人员理解,本文描述的或本领域已知的这些和其他细胞毒性剂可用于所公开的组合物和方法。
在一些形式中,治疗剂可以是治疗性多肽。如本文所使用,治疗性多肽可以是具有有用生物学功能的任何多肽。有用的治疗性多肽包括但不限于细胞因子、抗体、细胞毒性多肽;促细胞凋亡多肽;和抗血管生成多肽。作为非限制性实例,可用的治疗性多肽可以是细胞因子,例如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、肿瘤坏死因子-β(TNF-β)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-α(IFN-α);干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-1(IL-I)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-12(IL-12)、淋巴细胞趋化蛋白(lymphotactin,LTN)或树突细胞趋化因子1(DC-CK1);抗-HER2抗体或其片段;细胞毒性多肽,包括毒素或胱天蛋白酶,例如白喉毒素A链、假单胞菌外毒素A、霍乱毒素、配体融合毒素例如DAB389EGF或蓖麻毒蛋白;或者抗血管生成多肽,例如血管生成抑制素、内皮抑制素、血小板反应蛋白、血小板因子4;anastellin;或本文另外描述的或本领域已知的那些的一种。应理解,具有生物活性的这些或其他多肽可以是“治疗性多肽”。
可用在所公开的共组合物和或组合物中的治疗剂可以是抗血管生成试剂。如本文所使用,术语“抗血管生成试剂”是指减少或防止血管生成的分子,所述血管生成是血管的生长和发生。所述共组合物和货物组合物可被用于治疗或诊断与血管生成有关的任何疾病、病症或失调。例如,可以诊断和/或治疗黄斑变性和糖尿病性脉管并发症。多种抗血管生成剂可以通过常规方法制备。这样的抗血管生成剂包括但不限于小分子;蛋白质,例如显性失活形式的血管生成因子、转录因子和抗体;肽;和核酸分子,包括核酶、反义寡核苷酸和编码例如显性失活形式的血管生成因子和受体、转录因子以及抗体和它们的抗原结合片段的核酸分子。参加,例如Hagedorn and Bikfalvi,Crit.Rev.Oncol.Hematol.34:89-110(2000),and Kirsch et al.,J.Neurooncol.50:149-163(2000)。
有用的治疗剂的一些其他实例包括氮芥、亚硝基脲、环乙亚胺、烷基磺酸盐、四嗪、铂化合物、嘧啶类似物、嘌呤类似物、抗代谢物、叶酸类似物、蒽环类、紫杉烷、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂和激素试剂。示例性化疗药物有放线菌素-D、爱克兰、Ara-C、阿那曲唑(Anastrozole)、天冬酰胺酶、BiCNU、比卡鲁胺(Bicalutamide)、博来霉素(Bleomycin)、白消安(Busulfan)、卡培他滨(Capecitabine)、卡铂(carboplatin)、Carboplatinum、卡莫司汀(Carmustine)、CCNU、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、Chlomaphazine、Cholophosphamide、顺铂、克拉屈滨(Cladribine)、CPT-11、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、环磷酰胺(Cytoxan)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、放线霉素D、柔红霉素(Daunorubicin)、右雷佐生(Dexrazoxane)、多西他赛(Docetaxel)、多柔比星(Doxorubicin)、DTIC、表柔比星(Epirubicin)、雌莫司汀(Estramustine)、环乙亚胺、依托泊苷(Etoposide)、氟尿苷(Floxuridine)、氟达拉滨(Fludarabine)、氟尿嘧啶、氟他胺(Flutamide)、福莫司汀(Fotemustine)、吉西他滨(Gemcitabine)、赫赛汀(Herceptin)、六甲铵(Hexamethylamine)、羟基脲(Hydroxyurea)、伊达比星(Idarubicin)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊立替康(Irinotecan)、洛莫司汀(Lomustine)、氮芥(Mechlorethamine)、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(Melphalan)、巯基嘌呤(Mercaptopurine)、氨甲喋呤、丝裂霉素(Mitomycin)、米托坦(Mitotane)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、新氮芥(Novembiehin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Paclitaxel)、氨羟二磷酸二钠(Pamidronate)、喷司他丁(Pentostatin)、苯芥胆甾醇(Phenesterine)、普卡霉素(Plicamycin)、泼尼莫司汀(Prednimustine)、丙卡巴肼(Procarbazine)、利妥昔单抗(Rituximab)、甾体、链佐星(Streptozocin)、STI-571、链佐星、他莫昔芬(Tamoxifen)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊苷(Teniposide)、四嗪、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、塞替派(Thiotepa)、雷替曲塞(Tomudex)、拓扑替康(Topotecan)、苏消安(Treosulphan)、三甲曲沙(Trimetrexate)、曲磷胺(Trofosfamide)、长春碱、长春新碱、长春碱酰胺、长春瑞滨(vinorelbine)、VP-16和卡培他滨(Xeloda)。烷基化剂例如塞替派(thiotepa)和;烷基磺酸盐例如白消安、英丙舒凡(Improsulfan)和哌泊舒凡(Piposulfan);吖丙啶(aziridine),例如Benzodopa、卡波醌(Carboquone)、Meturedopa和Uredopa;环乙亚胺(ethylenimine)和曲他胺(methylamelamine),包括六甲密胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、噻替派(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲密胺(trimethylolomelamine);硝基脲,例如Cannustine、氯脲菌素(Chlorozotocin)、福莫司汀(Fotemustine)、洛莫司汀(Lomustine)、尼莫司汀(Nimustine)和雷莫司汀(Ranimustine);抗生素,例如阿克拉霉素(Aclacinomysin)、放线菌素(Actinomycin)、Authramycin、偶氮丝氨酸(Azaserine)、博来霉素、放线菌素C(Cactinomycin)、Calicheamicin、Carabicin、Caminomycin、嗜癌霉素(Carzinophilin)、Chromoinycins、放线菌素D(Dactinomycin)、柔红霉素、地托比星(Detorubicin)、6-重氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星(Esorubicin)、Idambicin、马西罗霉素(Marcellomycin)、丝裂霉素、麦考酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(Nogalamycin)、橄榄霉素(Olivomycins)、培洛霉素(Peplomycin)、Potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素(Quelamycin)、罗多比星(Rodorubicin)、链黑霉素(Streptonigrin)、链佐星(Streptozocin)、杀结核菌素(Tubercidin)、乌苯美司(Ubenimex)、净司他丁(Zinostatin)和佐柔比星(Zorubicin);抗代谢物,例如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);叶酸类似物,例如二甲叶酸(Denopterin)、氨甲喋呤、蝶罗呤(Pteropterin)和三甲曲沙(Trimetrexate);嘌呤类似物,例如氟达拉滨(Fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(Thiamiprine)和硫鸟嘌呤(Thioguanine);嘧啶类似物,例如安西他滨(Ancitabine)、阿扎胞苷(Azacitidine)、6-氮杂尿嘧啶(6-azauridine)、卡莫氟(Carmofur)、阿糖胞苷、二脱氧尿苷(Dideoxyuridine)、去氧氟尿啶(Doxifluridine)、依诺他滨(Enocitabine)、氟尿苷(Floxuridine)和5-FU;雄激素类,例如卡鲁睾酮(Calusterone)、丙酸甲雄烷酮(Dromostanolone Propionate)、环硫雄醇(Epitiostanol)、Rnepitiostane和睾内酪(Testolactone);抗肾上腺物质,例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦和曲洛司坦(Trilostane);叶酸补充物,例如亚乙酸(frolinic acid);醋葡醛内酯(aceglatone);醛基磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside);氨基乙酰丙酸;安吖啶(Amsacrine);Bestrabucil;比生群(Bisantrene);依达曲沙(Edatraxate);地磷酰胺(Defofamine);秋水仙胺(Demecolcine);地吖醌(Diaziquone);Elfornithine;依利醋铵(elliptinium acetate);依托格鲁(Etoglucid);硝酸镓;羟基脲;香菇多糖(Lentinan);氯尼达明(Lonidamine);米托胍腙(Mitoguazone);米托蒽醌(Mitoxantrone);莫哌达醇(Mopidamol);尼曲吖啶(Nitracrine);喷斯他丁(Pentostatin);蛋氨氮芥(Phenamet);吡柔比星(Pirarubicin);鬼臼酸(podophyllinicacid);2-乙基酰肼(2-ethylhydrazide);丙卡巴肼(Procarbazine);雷佐生(Razoxane);Sizofrran;锗螺胺(Spirogermanium);细格孢氮杂酸(tenuazonic acid);三亚胺醌(triaziquone);2,2′,2″-三氯三乙胺;乌拉坦(Urethan);长春碱酰胺;达卡巴嗪(Dacarbazine);甘露莫司汀(Mannomustine);二溴甘露醇(Mitobronitol);二溴卫矛醇(Mitolactol);哌泊溴烷(Pipobroman);Gacytosine;阿糖胞苷(Arabinoside,″Ara-C″);环磷酰胺;塞替派(thiotEPa);紫杉类(taxoid),例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,NJ.)和多西他赛(Doxetaxel,Rhone-PoulencRorer,Antony,France);吉西他滨(Gemcitabine);6-硫鸟嘌呤;巯嘌呤;氨甲喋呤;铂类似物,例如顺铂和卡铂;长春花碱;铂;依托泊甙(etoposide)(VP-16);异环磷酰胺;丝裂霉素C;米托蒽醌;长春新碱;长春瑞滨(Vinorelbine);诺维本(Navelbine);诺消灵(Novantrone);.替尼泊苷(Teniposide);道诺霉素(Daunomycin);氨喋呤(Aminopterin);适罗达(Xeloda);伊班膦酸盐(Ibandronate);CPT-11;拓扑异构酶抑制剂RFS 2000;二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸;Esperamicins;卡培他滨(Capecitabine);和上述任意物质的可药用盐,酸或衍生物。还包括调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂,例如抗雌激素类,包括例如他莫昔芬(Tamoxifen)、雷洛昔芬(Raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(Trioxifene)、那洛西芬(Keoxifene)、奥纳斯酮(Onapristone)和托瑞米芬(Toremifene)(Fareston);和抗雄激素类,例如氟他胺(Flutamide)、尼鲁米特(Nilutamide)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、亮丙立德(Leuprolide)和戈舍瑞林(Goserelin);和上述任意物质的可药用盐、酸或衍生物。可用的共组合物和货物组合物包括例如多柔比星、赫赛汀(Herceptin)和脂质体多柔比星。
所述共组合物或货物组合物还可以包含含硼的化合物。由于有机合成技术已经扩展到包括硼原子,过去几年中含硼的化合物作为治疗剂受到了越来越多的关注(Boron Therapeutics on the horizon,Groziak,M.P.;American Journal of Therapeutics(2001)8,321-328)。最值得注意的含硼治疗剂是硼酸bortezomib,其最近被应用于治疗多发性骨髓瘤。该突破证明了使用含硼化合物作为药剂的可行性。已经证明含硼化合物具有多种生物活性,包括除草(Organic boron compounds as herbicides.Barnsley,G.E.;Eaton,J.K.;Airs,R.S.;(1957),DE 1016978 1957 1003)、硼中子捕获疗法(Molecular Design and Synthesis of B-10Carriers for NeutronCapture Therapy.Yamamoto,Y.;Pure Appl.Chem.,(1991)63,423-426)、丝氨酸蛋白酶抑制(Borinic acid inhibitors as probes of the factorsinvolved in binding at the active sites of subtilisin Carlsberg and.alpha,-chymotrypsin.Simpelkamp,J.;Jones,J.B.;Bioorganic & MedicinalChemistry Letters,(1992),2(11),1391-4;Design,Synthesis and BiologicalEvaluation of Selective Boron-containing Thrombin Inhibitors.Weinand,A.;Ehrhardt,C;Metternich,R.;Tapparelli,C;Bioorganic and MedicinalChemistry,(1999),7,1295-1307)、乙酰胆碱酯酶抑制(New,specific andreversible bifunctional alkylborinic acid inhibitor of acetylcholinesterase.Koehler,K.A.;Hess,G.P.;Biochemistry(1974),13,5345-50)和作为抗菌试剂(Boron-Containing Antibacterial Agents:Effects on Growth andMorphology of Bacteria Under Various Culture Conditions.Bailey,P.J.;Cousins,G.;Snow,G.A.;and White,A.J.;Antimicrobial Agents andChemotherapy,(1980),17,549-553)。具有抗菌活性的含硼化合物还可被进一步分为两大类,从20世纪60年代以来即已知的diazaborinine类,和二噻吩基硼酸复合物。二噻吩基硼酸复合物已经被扩展至包含很多不同的具有潜在抗菌活性的二芳基硼酸复合物(Preparation ofdiarylborinic acid esters as DNA methyl transferase inhibitors.Benkovic,S.J.;Shapiro,L.;Baker,S.J.;Wahnon,D.C;Wall,M.;Shier,V.K.;Scott,C.P.;Baboval,J.;PCT Int.Appl.(2002),WO 2002044184)。
所述共组合物或货物组合物还可以有一个或多个同位素。这样的同位素可被用作例如治疗剂、作为检测剂或作为治疗剂和检测剂。可用同位素的实例包括镥-177(177Lu)、铼-188(188Re)、镓-68(68Ga)、钇-90(90Y)、锝-99m(99mTc)、钬-166(166Ho)、碘-131(131I)、铟-111(111In)、氟-18(18F)、碳-11(11C)、氮-13(13N)、氧-15(15O)、溴-75(75Br),、溴-76(76Br)、碘-124(124I)、铊-201(201Tl)、锝-99(99Tc)和碘-123(123I)。
所述共组合物或货物组合物还可包含可检测剂。多种可检测剂可用于所公开的方法。如本文所使用,术语“可检测剂”是指可被检测的任意分子。可用的可检测剂包含能被给予体内并且随后被检测的部分。可用于所公开的组合物和成像方法中的可检测剂也不限于放射性标签和荧光分子。所述可检测剂可以是例如可方便直接或者间接地检测的任意部分,优选地通过非侵入性和/或体内可视技术。例如,可检测剂可以通过任意已知成像技术(包括例如放射性技术)而被检测。可检测剂可以包括例如显影剂。所述显影剂可以是例如Feridex。在一些实施方案中,例如,所述可检测剂包含钽化合物。在一些实施方案中,所述可检测剂包含碘,例如放射性碘。在一些实施方案中,例如,所述可检测剂包含有机碘酸,例如,碘羧酸、三碘苯酚、三碘甲烷和/或四碘乙烯。在一些实施方案中,所述可检测剂包含非放射性可检测试剂,例如,非放射性同位素。例如,氧化铁和Gd在一些实施方案中可被用作非放射性可检测剂。可检测剂还可包括放射性同位素、酶、荧光团和量子点例如,所述可检测部分可以是酶、生物素、金属或表位标签。其他已知的或新发现的可检测标记物可被考虑用于所提供的组合物。在一些实施方案中,例如,所述可检测剂包含钡化合物,例如硫酸钡。
所述可检测剂可以是(或者所述共组合物或货物组合物可以包含)一种或多种成像剂。成像剂的实例包括放射性显影剂,例如泛影酸(diatrizoic acid)钠盐二水合物、碘和硫酸钡;荧光成像剂,例如丽丝胺罗明丹PE;荧光或非荧光染色剂或染料,例如,可以赋予可见颜色或者在可见或其他波长(例如红外或紫外波长)下反应特征性电磁辐射谱的染色剂或染料,例如罗明丹;放射性同位素,正电子发射同位素,例如18F或124I(尽管正电子发射同位素的短半衰期可能带来一些限制);金属;铁磁化合物;顺磁性化合物,例如钆;超顺磁性化合物,例如氧化铁;和反磁性化合物,例如硫酸钡。可以选择成像剂以优化由选择的成像技术产生的图像的有用性。例如,可以选择所述成像剂以增强关注特征(例如胃肠息肉)和正常胃肠组织之间的反差。成像可通过例如以下的任意合适成像技术实现,例如X光、计算机化断层显像(CT)、MRI、正电子发射断层显像(PET)或SPECT。在一些形式中,所述共组合物或货物组合物可被连接至核医学成像剂,例如铟-III或锝-99,连接至PET成像剂,或者连接至MRI成像剂,例如纳米颗粒。
成像技术的实例包括磁共振成像(MRI)、计算机化断层显像(CT)、单光子发射计算机化断层显像(SPECT)和正电子发射断层显像。成像剂一般以其用途被分为诊断性或治疗性成像剂。由于放射性对组织的破坏作用,对放射性药剂的生物分布定靶越准确越好。PET可以使用由例如正电子发射剂例如18F、11C、13N和15O、75Br、76Br和124I标记的成像剂。SPECT可以使用由例如单光子发射剂例如201Tl、99Tc、123I和131I标记的成像剂。
基于葡萄糖和基于氨基酸的化合物可被用作成像剂。基于氨基酸的化合物在分析肿瘤细胞中更有用,因为它们能够更快地被摄取并被纳入蛋白质合成中。在基于氨基酸的化合物中,含11C化合物和含18F化合物已经被成功使用。适于成像的含11C化合物包括,例如L-[1-11C]亮氨酸(Keen et al.J.Cereb.Blood Flow Metab.1989(9):429-45)、L-[1-11C]酪氨酸(Wiesel et al.J.Nucl.Med.1991(32):2041-49)、L-[甲基-11C]甲硫氨酸(Comar et al.Eur.J.Nucl.Med.1976(1):11-14)和L-[1-11C]甲硫氨酸(Bolster et al.Appl.Radiat.Isot.1986(37):1069-70)。
PET涉及使用相应的方法检测来自短暂正电子发射放射性同位素的湮没电子形式的γ射线,所述同位素包括但不限于,半衰期大约为110分钟的18F、半衰期大约为20分钟的11C、半衰期大约为10分钟的13N和半衰期大约为2分钟的15O。对于PET成像研究,可以使用例如[11C]间-羟基麻黄碱(hydroxyephedrine,HED)和2-[18F]氟-2-脱氧-D-葡萄糖(FDG)。SPECT可以使用较长期的同位素,包括但不限于半衰期大约为6小时的99mTc和半衰期大约为74小时的201Tl。放射性碘标记的间碘苄基胍(MIBG)是可被用于核医学成像研究中的放射性追踪试剂。
所公开的CendR组合物和共组合物和货物组合物可在可药用载体中给予体内。术语“可药用”是指无生物学或其他方面不适的材料,即,所述材料可与核酸或载体一起给予受试者,而不会引起任何不需要的生物学效应或者与包含它的药物组合物中的任何其他组分以有害的方式相互作用。自然地,所述载体被选择以使活性成分在所述受试者体内的降解最小化并且以使在所述受试者中的任何不利副作用最小化,这是本领域技术人员已知的。所述材料可以在溶液、悬浮液中(例如,被纳入微粒、脂质体或细胞中)。
所述CendR组合物和共组合物和货物组合物可与可药用载体结合用于治疗。合适的载体和它们的制剂在Remington:The Science andPractice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro,Mack PublishingCompany,Easton,PA 1995中描述。一般地,在所述制剂中使用合适量的可药用盐使得所述制剂等渗。可药用载体的实例包括但不限于盐水、林格溶液和右旋糖溶液。所述溶液的pH优选为约5至约8,更优选为约7至约7.5。其他载体包括持续释放制品,例如包含抗体的固态疏水聚合物的半透基质,所述基质是成型产品的形式,例如膜、脂质体或微粒。本领域技术人员知晓一些载体基于例如给药途径和给药组合物的浓度是更优选的。
所述制品可以本身形式或者在药物组合物(所述制品在其中与合适的载体或赋形剂混合)中被给予受试者或生物体。
本文使用的“药物组合物”是指本文描述的一种或多种活性成分和例如生理适用载体和赋形剂的其他化学组分的制剂。药物组合物的目的是便于将化合物给予受试者或生物体。
在本文中术语“活性组分”是指负责生物作用的制剂。
本文使用的可以替换使用的短语“生理可接受载体”和“可药用载体”是指不对受试者或生物体引起显著刺激并且不会消除所给予的化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。佐剂被包括在这些短语之内。
在本文中“赋形剂”是指加至药物组合物中以进一步方便活性成分的给药的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、多种糖和各类淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
配制和给予药物的技术可见于Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,latest edition,其以引用的方式纳入本文。
任意合适的给药途径可被用于所公开的组合物。合适的给药途径可以包括例如外部(topical)、肠、局部(local)、全身或肠胃外给药。例如,给药可以是表皮(epicutaneous)、吸入、灌肠、结膜、滴眼剂、滴耳剂、肺泡、鼻、鼻内、阴道、阴道内、经阴道、肠内(enteral)、口服、口内、经口、肠(intestinal)、直肠、直肠内、经直肠、注射、输注、静脉内、动脉内、肌内、大脑内、心室内、脑室内、心脏内、皮下、骨内、皮内、鞘内、腹膜内、膀胱内、阴茎内、骨髓内、眼内、颅内、经皮肤、经粘膜、经鼻、吸入、脑池内、硬膜外(epidural)、硬膜周(peridural)、玻璃体内给药等。所公开的组合物可用在其他的方法中,或者与其他方法一起使用。例如,所公开的组合物可作为HIPEC疗法的一部分被给予。在HIPEC中,包含目标组合物的加热无菌溶液在整个腹膜腔中连续地循环。
可通过本领域熟知的方法制备药物组合物,例如通过常规的混合、溶解、粒化、包糖衣、磨细、乳化、包封、包入(entrapping)或冻干步骤来制备。
用于所公开的方法的药物组合物可以常规方式使用一种或多种生理可接受载体配制,所述载体包括赋形剂和辅助剂,其便于将活性成分加工进入可药用的制剂中。合适的制剂依赖于所选的给药途径。
对于注射,所述活性成分可在水性溶液中配制,优选在生理相容性缓冲液中,例如Hank′s液、林格溶液或生理盐缓冲液中配制。对于经粘膜给药,在制剂中使用适于待穿透的屏障的穿透剂。这样的穿透剂是本领域公知的。
对于口服给药,所述化合物可通过将所述活性化合物与本领域熟知的可药用载体结合来容易地配制。这样的载体使得所述化合物可被配制为片剂、丸剂、糖衣丸剂、胶囊剂、液体剂、凝胶剂、糖浆剂、膏剂、悬液剂等,用于患者口服。用于口服的药物制剂可使用固体赋形剂制备,任选地研磨得到的混合物,在(如需要)加入合适的辅助剂之后加工所述颗粒组合物,以获得片剂或糖衣丸剂核心。合适的赋形剂特别是填充剂,例如糖,包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇;纤维素制品,例如玉米淀粉、小麦淀粉、稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠;和/或生理可接受聚合物,例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要,可加入崩解剂,例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或者其盐,例如藻酸钠。
为糖衣丸核心提供合适的包衣。为此目的,可以使用浓缩的糖溶液,其可以任选地包含阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶(carbopol gel)、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可被加至所述片剂或糖衣丸包衣中用于鉴别或表征活性化合物剂量的不同结合物。
可以口服使用的药用组合物包括由明胶制成的推入契合胶囊以及由明胶和塑化剂(例如甘油或山梨糖醇)制成的软密封胶囊。所述推入契合胶囊可以包含与填充剂(例如乳糖)、粘合剂(例如淀粉)、润滑剂(例如滑石或硬脂酸镁)和任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中,所述活性成分可以溶解或者悬浮在合适的液体中,例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。此外,可以加入稳定剂。用于口服给药的所有制剂应该有适于所选给药途径的剂量。
对于口腔含化给药,所述组合物的形式可以是以常规方法配制的片剂或锭剂形式。
对于鼻吸入给药,用在所公开的方法中的活性成分可以以存在于加压罐或喷雾器中的气雾喷雾剂的形式使用合适的喷射剂以常规方法递送,其中所述喷射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或二氧化碳。在加压气雾剂的情况下,可通过提供阀确定给药单位以递送计量的量。用在分配器中的例如明胶胶囊和弹药型制剂可被配制为包含所述化合物和合适粉末基质(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文描述的制剂可被配制用于肠胃外给药,例如通过快速浓注或连续输注。用于注射的制剂可以单位剂型存在,例如在任选添加了防腐剂的安剖瓶中或在多剂量容器中。所述组合物可以是油性或水性运载体中的悬液剂、溶液剂或乳剂,并且可以包含配制剂,例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物组合物包括水溶性形式的所述活性制剂的水性溶液。此外,所述活性成分的悬液剂可被配制为合适的油性或水基注射悬液剂。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油,例如芝麻油,或者合成脂肪酸酯,例如油酸乙酯,甘油三酸酯或脂质体。水性注射悬液剂可以包含增加所述悬液剂的粘度的物质,例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地,所述悬液剂还可以包含合适的稳定剂或者增加所述活性成分的溶解性以使得可制备高度浓缩的溶液的试剂。
或者,所述活性成分可以是粉末形式,其可用于在使用前以合适的运载体,例如无菌的无热原水基溶液复原。
所述制剂还可以使用例如常规的栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)配制在直肠组合物中,例如栓剂或停留性灌肠剂。
所公开的组合物可以任意合适制剂的形式提供。例如,固体、液体、溶液、凝胶、膏药、缓释剂、定时释放剂等。
用于所公开的方法的药用组合物包括其中包含有效地实现所需目的的量的活性成分的组合物。更具体地,治疗有效量是指能够有效地防止、减轻或者改善疾病的症状或者延长被治疗受试者的存活的活性成分的量。
确定治疗有效量在本领域技术人员的能力范围内,尤其是依照本文提供的详细公开内容。
对于所公开的方法中使用的任意制剂,可最初根据体外和细胞培养测定估计治疗有效量或剂量。例如,可在动物模型中确定实现所需要的循环抗体浓度或滴度的剂量。这样的信息可用于更准确地确定人中的可用剂量。
本文描述的活性成分的毒性和治疗有效性可在体外、细胞培养物中或实验动物中通过标准药学步骤确定。从这些体外和细胞培养测定以及动物研究中得到的数据可用于确定人用剂量范围。所述剂量可以随着使用的剂型和使用的给药途径而不同。可由个体医生考虑患者的病症选择准确的制剂、给药途径和剂量(参见,例如Fingl et al in ThePharmacological Basis of Therapeutics,Ch.1p.1.(1975))。
给药量和间隔可被个别地调整以提供足以防止或减少病毒进入的抗体血浆(最小有效浓度,MEC)。MEC对于每个制剂不同,但是可从体外数据中估计。实现所述MEC所必须的剂量依赖于个体特征和给药途径。可以使用结合测定来确定血浆浓度。
给药间隔还可以使用所述MEC值确定。应该使用这样的方案来给予制剂,即所述方案可在10-90%、优选在30-90%之间、最优选为50-90%的时间里保持血浆水平在MEC之上。
依赖于待治疗的病症的严重程度和反应性,给药可以是单次或多次给药,疗程持续数天至数周,或者直到治疗起作用或者实现疾病状态减小。
待给予的组合物的量当然会依赖于被治疗的受试者、疾病的严重程度、给药方式、处方医师的判断等。
可缀合至所公开的CendR组合物和共组合物和货物组合物的脂肪酸(即脂质)包括可使所述肽被有效纳入脂质体的那些脂肪酸。一般地,所述脂肪酸是极性脂质。因此,所述脂肪酸可以是磷脂。所提供的组合物可以包含天然或合成磷脂。所述磷脂可选自包含饱和或不饱和单或双取代脂肪酸及其结合物的磷脂。这些磷脂可以是例如二油酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰丝氨酸、二油酰磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、棕榈酰油酰磷脂酰丝氨酸、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺、棕榈酰油酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酸、反棕榈油酰油酰磷脂酰胆碱(palmitelaidoyloleoylphosphatidylcholine)、反棕榈油酰油酰磷脂酰丝氨酸(palmitelaidoyloleoylphosphatidylserine)、反棕榈油酰油酰磷脂酰乙醇胺(palmitelaidoyloleoylphosphatidylethanolamine)、反棕榈油酰油酰磷脂酰甘油(palmitelaidoyloleoylphosphatidylglycerol)、反棕榈油酰油酰磷脂酸(palmitelaidoyloleoylphosphatidic acid)、肉豆蔻烯酰油酰磷脂酰胆碱(myristoleoyloleoylphosphatidylcholine)、肉豆蔻烯酰油酰磷脂酰丝氨酸(myristoleoyloleoylphosphatidylserine)、肉豆蔻烯酰油酰磷脂酰乙醇胺(myristoleoyloleoylphosphatidylethanoamine)、肉豆蔻烯酰油酰磷脂酰甘油(myristoleoyloleoyl phosphatidylglycerol)、肉豆蔻烯酰油酰磷脂酰磷脂酸(myristoleoyloleoylphosphatidic acid)、二亚油酰磷脂酰胆碱(dilinoleoylphosphatidylcholine)、二亚油酰磷脂酰丝氨酸(dilinoleoylphosphatidylserine)、二亚油酰磷脂酰乙醇胺(dilinoleoylphosphatidylethanolamine)、二亚油酰磷脂酰甘油(dilinoleoylphosphatidylglycerol)、二亚油酰磷脂酸(dilinoleoylphosphatidic acid)、棕榈亚油酰磷脂酰胆碱(palmiticlinoleoylphosphatidylcholine)、棕榈亚油酰磷脂酰丝氨酸(palmiticlinoleoylphatidylserine)、棕榈亚油酰磷脂酰乙醇胺(palmiticlinoleoylphosphatidylethanolamine)、棕榈亚油酰磷脂酰甘油(palmiticlinoleoylphosphatidylglycerol)、棕榈亚油酰磷脂酸(palmiticlinoleoylphosphatidic acid)。这些磷脂还可以是磷脂酰胆碱(溶血磷脂酰胆碱)、磷脂酰丝氨酸(溶血磷脂酰丝氨酸)、磷脂酰乙醇胺(溶血磷脂酰乙醇胺)、磷脂酰甘油(溶血磷脂酰甘油)和磷脂酸(溶血磷脂酸)的单酰化衍生物。这些溶血磷脂酰衍生物中的单酰基链可以是棕榈酰基(palimtoyl)、油酰基、棕榈油酰基(palmitoleoyl)、亚油酰基(linoleoyl)肉豆蔻酰基或肉豆蔻油酰基(myristoleoyl)。这些磷脂还可以是合成的。合成磷脂可以从多种来源容易地市购,例如AVANTIPolar Lipids(Albaster,Ala.);Sigma Chemical Company(St.Louis,Mo.)。这些合成的化合物可以不同,并且它们的脂肪酸侧链可以有自然存在的磷脂中所没有的变异。这些脂肪酸可以在PS或PC之一或者PS和PC中有C14、C16、C18或C20链长的不饱和脂肪酸侧链。合成磷脂可以有二油酰(18:1)-PS;棕榈酰(16:0)-油酰(18:1)-PS、二豆蔻酰(14:0)-PS;二棕榈油酰(16:1)-PC、二棕榈酰(16:0)-PC、二油酰(18:1)-PC、棕榈酰(16:0)-油酰(18:1)-PC和肉豆蔻酰(14:0)-油酰(18:1)-PC作为组分。因此,举例来说,所提供的组合物可以包含棕榈酰16:0。
所述共组合物或货物组合物可以是微粒或纳米颗粒,例如纳米球、纳米壳、纳米蠕虫、加热生成的纳米壳等。本文所使用“纳米壳”是具有由一层或多层传导壳层围绕的离散绝缘或半传导性核心部分的纳米颗粒。美国专利No.6,530,944因其制备和使用金属纳米壳的方法教导而在此以引用的方式全文纳入本文。例如,纳米壳可以用例如高度传导性金属的材料包被的绝缘或惰性材料(例如硅)核心形成,所述包被材料可使用例如近红外光(约800至1300nm)激发。被激发后,所述纳米壳发热。所致过热可以杀死周围的细胞或组织。所述纳米壳的壳和核心的总体直径为几十至几百纳米。近红外光对于其穿入组织的能力是有利的。也可以使用其他类型的辐射,取决于所述纳米颗粒涂层和所靶向细胞的选择。实例包括X光、磁场和超声。所述颗粒还可以被用于增强成像,尤其是使用红外扩散光子成像方法。靶向分子可以是抗体或其片段、特定受体的配体或者与待靶向细胞表面特异性结合的其他蛋白质。
其他分子、元件、部分等可以被共价连接或或者非共价缔合于例如所公开的共组合物、货物组合物、CendR组合物、蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件。这样的分子、元件、部分等可被连接至例如所公开的蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件的氨基端;连接至所公开的蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件的内部氨基酸;连接至所公开蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件的羧基端;连接至所述CendR元件的N端侧的蛋白质、肽、氨基酸序列;通过连接物连接至所公开的蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件;或者其结合。所公开的CendR组合物还可包含连接物,其连接这样的分子、元件、部分(等)和公开的CendR组合物、蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件。所公开的CendR组合物、蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件还可被缀合至包被分子,例如牛血清白蛋白(BSA;参见Tkachenko et al.,(2003)J Am Chem Soc,125,4700-4701),其可用于与所述蛋白质、肽、氨基酸序列或CendR元件一起包被纳米颗粒、纳米蠕虫、纳米壳等。
1.可用于将其他分子、元件、部分(等)交联至所公开的共组合物、货物组合物、CendR组合物、蛋白质、肽、氨基酸序列等的蛋白质交联剂是本领域已知的并且基于用途和结构而定义,其包括DSS(二琥珀酰亚胺辛二酸酯;Disuccinimidylsuberate)、DSP(二硫代双(琥珀酰亚胺丙酸酯;Dithiobis(succinimidylpropionate))、DTSSP(3,3′-二硫代双(磺基琥珀酰亚胺丙酸酯);3,3′-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate))、SULFO BSOCOES(双[2-(磺基琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基]砜;Bis[2-(sulfosuccinimdooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone)、BSOCOES(双[2-(琥珀酰亚胺氧羰基氧)乙基]砜;Bis[2-(succinimdooxycarbonyloxy)ethyl]sulfone)、SULFO DST(二磺基琥珀酰亚胺酒石酸酯;Disulfosuccinimdyl tartrate)、DST(二琥珀酰亚胺酒石酸酯;Disuccinimdyltartrate)、SULFO EGS(乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯);Ethyleneglycolbis(succinimidylsuccinate))、EGS(乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺琥珀酸酯);Ethylene glycolbis(sulfosuccinimidylsuccinate))、DPDPB(1,2-二[3′-(2′-吡啶二硫)丙酰胺基]丁烷);
1,2-Di[3′-(2′-pyridyldithio)propionamido]butane)、BSSS(双(磺基琥珀酰亚胺)辛二酸酯;Bis(sulfosuccinimdyl)suberate)、SMPB(琥珀酰亚胺基-4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯;Succinimdyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate)、SULFO SMPB(磺基琥珀酰亚胺-4-(对-马来酰亚胺苯基)丁酸酯;
Sulfosuccinimdyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrate)、MBS(3-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯;
3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、SULFO MBS(3-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯;
3-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysulfosuccinimide ester)、SIAB(N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯;
N-Succinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate)、SULFO SIAB(N-磺基琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯;
N-Sulfosuccinimidyl(4-iodoacetyl)aminobenzoate)、SMCC(琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-碳酸酯;
Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)、SULFO SMCC(磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-碳酸酯;
Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)、NHS LC SPDP(琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺基)己酸酯;Succinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoate)、SULFO NHS LC SPDP(磺基琥珀酰亚胺基-6-[3-(2-吡啶基二硫)丙酰胺基)己酸酯;
Sulfosuccinimidyl-6-[3-(2-pyridyldithio)propionamido)hexanoate)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯;
N-Succinimdyl-3-(2-pyridyldithio)propionate)、NHSBROMOACETATE(N-羟基琥珀酰亚胺溴乙酸酯;
N-Hydroxysuccinimidylbromoacetate)、NHS IODOACETATE(N-羟基琥珀酰亚胺碘乙酸酯;N-Hydroxysuccinimidyliodoacetate)、MPBH(盐酸4-(N-马来酰亚胺苯基)丁酸酰肼;4-(N-Maleimidophenyl)butyric acid hydrazide hydrochloride)、MCCH(盐酸4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酰肼;4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylic acid hydrazide hydrochloride)、MBH(盐酸间马来酰亚胺苯甲酸酰肼;m-Maleimidobenzoic acidhydrazidehydrochloride)、SULFO EMCS(N-(ε-马来酰亚胺己酰氧)磺基琥珀酰亚胺;N-(epsilon-Maleimidocaproyloxy)sulfosuccinimide)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺己酰氧)琥珀酰亚胺N-(epsilon-Maleimidocaproyloxy)succinimide)、PMPI(N-(对-马来酰亚胺苯基)异氰酸酯;N-(p-Maleimidophenyl)isocyanate)、KMUH(N-(κ-马来酰亚胺十一烷酸)酰肼;
N-(kappa-Maleimidoundecanoic acid)hydrazide)、LC SMCC(琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基(6-氨基己酸酯);Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxy(6-amidocaproate))、SULFO GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁氧基)磺基琥珀酰亚胺酯;N-(gamma-Maleimidobutryloxy)sulfosuccinimide ester)、SMPH(琥珀酰亚胺-6-(β-马来酰亚胺丙酰胺基己酸酯);
Succinimidyl-6-(beta-maleimidopropionamidohexanoate))、SULFOKMUS(N-(κ-马来酰亚胺十一酰氧)磺基琥珀酰亚胺酯;
N-(kappa-Maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide ester)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁氧基)琥珀酰亚胺;
N-(gamma-Maleimidobutyrloxy)succinimide)、DMP(二甲基庚二亚胺盐酸盐;Dimethylpimelimidatehydrochloride)、DMS(二甲基辛二亚氨酸酯盐酸盐;Dimethylsuberimidate hydrochloride)、MHBH(Wood′s Reagent;甲基对羟基苯甲亚胺酸盐酸盐;
Methyl-p-hydroxybenzimidate hydrochloride,98%)、DMA(二甲基己二亚氨盐酸盐,Dimethyladipimidate hydrochloride)。
共组合物或货物组合物的组分还可以通过使用例如马来酰亚胺连接来连接。举例来说,组分可通过以下方式被连接至脂质:通过使用所述组分上的游离半胱氨酸巯基基团连接至例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)2000;DSPE-PEG2000-马来酰亚胺](Avanti Polar Lipids)。所述反应可在例如室温下在水性溶液中进行4小时。该连接化学法可被用于连接共组合物和货物组合物的组分。
还可以使用例如氨基基团官能化葡聚糖化学法来连接所公开的化合物、组分和组合物。颗粒,例如纳米颗粒、纳米蠕虫和微团可被用氨基基团官能化的葡聚糖包被。将PEG连接至胺化颗粒增加循环时间,据推测是通过减少参与调理作用的血浆蛋白质的结合实现的(Moghimi et al.,2001)。所述颗粒可具有表面修饰,例如,用于网状内皮系统避开(PEG)和归巢(归巢分子)、内体逃逸(pH敏感肽,例如Pirello et al.,2007)、可检测试剂、治疗化合物或它们的组合。为了在一个颗粒中集中所有这些功能,可进行优化研究以确定这些元件的任一种可以占据所述颗粒表面的哪些可用连接位点以给出靶向和负载递送的最佳结合。这样的共组合物和货物组合物的细胞内化和/或组织穿入可由所公开的CendR元件、氨基酸序列、肽、蛋白质、分子、缀合物和组合物介导。
可以使用已知的技术或本文描述的技术将所述CendR元件、氨基酸序列、肽、蛋白质、分子、缀合物和组合物本身连接至本文描述的其他组分(但是(如本文他处所描述)一般不连接至所公开的共组合物)。所公开的CendR元件可用在环肽中。为使这样的环肽连接至其他组分,可以使用选择性侧基保护以用额外的半胱氨酸合成环肽,所述半胱氨酸带有游离巯基基团。这些肽是稳定的,没有可检测的二硫键干扰。马来酰亚胺官能团也可被用作连接基团。这些化学法可被用于将CendR元件、氨基酸序列、肽、蛋白质、分子、缀合物和组合物相互连接或连接至其他组分。
CendR元件、氨基酸序列、肽和蛋白质还可使用例如马来酰亚胺连接而连接至其他组分。举例来说,CendR元件、氨基酸序列、肽和蛋白质可通过以下方式被连接至脂质:通过使用所述CendR元件、氨基酸序列、肽和蛋白质上的游离半胱氨酸巯基基团连接至例如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-[马来酰亚胺(聚乙二醇)2000;DSPE-PEG2000-马来酰亚胺](Avanti Polar Lipids)。所述反应可在例如室温下在水性溶液中进行4小时。该连接化学法可被用于将所公开的CendR元件、氨基酸序列、肽和蛋白质连接至很多其他组分、分子和组合物。
术语“治疗”是指对患者进行医疗处理,目的是治愈、减轻、稳定或防止疾病、病理病症或失调。该术语包括主动治疗,即明确地指向改善疾病、病理病症或失调的治疗;还包括病因治疗,即指向消除相关的疾病、病理病症或失调的病因的治疗。此外,该术语包括姑息治疗,即治疗旨在减轻症状而非治愈所述疾病、病理病症或失调;预防性治疗,即指向最小化或者部分或完全地抑制所述相关疾病、病理病症或失调的发展的治疗;和支持性治疗,即用于补充另一种具体疗法(其指向改善所述相关的疾病、病理病症或失调)的治疗。
如本文所使用,“受试者”包括但不限于动物、植物、细菌、病毒、寄生物和具有核酸的任意其他生物体或实体。所述受试者可以是脊椎动物,更尤其是哺乳动物(例如,人、马、猪、兔、狗、绵羊、山羊、非人灵长类、牛、猫、豚鼠或啮齿目动物)、鱼、鸟或爬行动物或者两栖动物。宠物和家畜尤其可以是受试者。所述受试者可以是无脊椎动物,例如蠕虫或节肢动物(例如,昆虫和甲壳纲动物)。该术语并不指示具体的年龄或性别。因此,意欲包括雄性或雌性的成体和新生受试者以及胎儿。患者是指患有疾病或失调的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。在子宫内膜异位和子宫内膜异位细胞的情况下,应理解受试者是具有或者可具有子宫内膜异位和/或子宫内膜异位细胞的受试者。
肿瘤穿入CendR肽可被用于增强肿瘤成像和用抗肿瘤药物的肿瘤治疗。可以测试CendR肽对成像的作用。例如,使用例如近红外荧光团使用Kodak IN VIVO Fx成像仪和Li-Cor Odyssey成像仪(例如Simberget al.,2007;Sugahara et al.,2009)的光学成像和MRI成像可被使用。对于MRI成像,所述共组合物或货物组合物可以是MRI显影剂,例如Feridex氧化铁纳米颗粒和钆化合物。这些化合物可在有或无肿瘤归巢CendR肽或肽组合物的情况下被注射进入携带肿瘤的小鼠,之后进行成像。所述结果可被用于确定治疗的效果并且用于评估使用CendR肽的不同治疗方案,其中以治疗剂作为所述共组合物或货物组合物。
不同CendR肽与不同共组合物和/或货物组合物的结合物可被通过例如改变所述药物的剂量并且使用给出最大作用的肽剂量来测试所述共组合物或货物组合物在所述靶细胞和组织中的最佳积累和分布。所公开的结果显示CendR-药物结合物能够减少需要的药量,从而减少副作用,同时能产生相同的抗肿瘤作用。CendR肽还可以产生单独使用所述共组合物或货物组合物所不能达到的效果。例如,使用CendR肽可使得所述共组合物或货物组合物在细胞和组织中的浓度更高,这原本是不可能的。在这样的情况下,所述共组合物或货物组合物的效力可以超过常规疗法获得的效力。
2009年1月19日提交的美国专利申请No.12/355,672,和2009年2月20日提交的12/390,061在此以引用的方式全文以及特别是它们对iRGD肽和CendR元件、肽和缀合物的公开内容纳入本文。
实施例
描述以下实施例以为本领域普通技术人员提供本文要求保护的化合物、组合物、产品、装置和/或方法是如何制备以及评估的完整公开和描述,并且目的只是示例性的,不意欲限制所述公开内容。已经努力确保数值(例如,量、温度等)的准确性,但是应说明会有一些误差和偏差。除非另有说明,部分是重量部分,温度是以℃计或者是环境温度,压力是处于或接近大气压。
A.实施例1:由CendR肽介导的共组合物的细胞内化和组织穿入
为了证明全身给予的CendR肽引起脉管渗漏(从而增强共组合物的细胞内化和组织穿入)的能力,静脉内注射低聚RPARPAR-neutravidin复合物(SEQ ID NO:2)并且确定共注射的追踪噬菌体的组织分布。在该测定中,通过灌注除去血液,外渗的血液组分(包括所述追踪噬菌体)保留在组织中。低聚RPARPAR(SEQ ID NO:2)而非低聚对照肽引起了所述噬菌体在肺和其他器官中更多地停留,这与所述噬菌体颗粒外渗增加一致(图2)。这些数据显示RPARPAR肽能够促进附着的负载的组织穿入并且能够穿透组织以允许大分子例如给予或存在的共组合物进入。
B.实施例2:使用归巢CendR肽的肿瘤穿入和穿透性
图3描述了CendR系统在用于肿瘤归巢RGD肽时——被称为iRGD(序列:CRGDK/RGPD/EC;SEQ ID NO:61)的原理。iRGD中的两个基序是RGD基序(Ruoslahti,2002),其介导所述肽结合至肿瘤内皮的αv整联蛋白;和潜在CendR序列RGDK(或RGDR;SEQ ID NO:229)。所述RGD归巢肽引导所述肽至肿瘤内皮(表达αv整联蛋白的生血管性脉管系统),在此所述肽由内源性蛋白酶进行蛋白酶解处理,使得所述CendR基序成为C端并且有了活性。然后,所述活化的CendR基序与不同受体(神经毡蛋白-1,Teesalu et al.,2009;2009年1月19日提交的美国专利No.12/355,672)结合,所述受体介导所述C端截短肽(和附着在其上的任意负载)的外渗、肿瘤穿入和细胞进入。这些步骤中的每一步都已被生物化学实验证实,其包括从细胞内部分离所预计的iRGD的N端片段(Sugahara et al.,2009;美国专利申请No.12/390,061,2009年2月20日提交)。所述多步骤归巢和组织穿入过程使得CendR比仅依赖于受体结合的肽和其他探针更具特异性。神经毡蛋白-1在多种类型的细胞中广泛表达,但是肿瘤经常比正常组织表达更高水平的该蛋白。
iRGD显著的肿瘤穿入特性在图4中描述,图4将iRGD与两种RGD肽进行了比较,所述RGD肽以与iRGD的亲和性类似的亲和性与αv整联蛋白结合(Sugahara et al.,2009),但是缺少CendR基序。
所述CendR基序存在于一些蛋白质的C端。血管内皮生长因子的一种可变形式——VEGF-165——使用它的由外显子8编码的C端CendR样序列(CRCDKPRR;SEQ ID NO:95)结合至NRP-1。一些肽,例如A7R(ATWLPPR;SEQ ID NO:96)、免疫调节肽促吞噬肽(TKPR;SEQID NO:97)及其变体增强的促吞噬肽(TKPPR;SEQ ID NO:98)也结合于NRP-1上的相同位点(Geretti et al.,2008)。脑信号蛋白3A(它也包含C端CendR基序并且结合于该位点)增强脉管穿透性(Acevedo et al.,2008)。一些肿瘤穿入肽再现这些化合物的脉管穿透性。所述作用可以是肿瘤特异的,因为它需要在靶细胞表面积累和蛋白酶解活化。
已知同源域转录因子,例如Antennapedia、单纯疱疹病毒-1蛋白VP22和人免疫缺陷病毒-1反式活化剂TAT蛋白质可以被内化进入细胞。来自这些蛋白质的短阳离子细胞穿入肽保持其内化能力。但是,这些肽不同于所公开的CendR肽,因为它们不受所述肽中氨基酸的手性影响,需要细胞表面的硫酸乙酰肝素用于活性(而发明人的肽不需要),并且没有组织穿入活性(Langel,2007)。
来自噬菌体筛选的肿瘤归巢肽中的潜在CendR序列。除iRGD之外,很多其他归巢肽包含CendR元件。这些肽包括包含KRTR序列(SEQ IDNO:100;Laakkonen et al.,2002,2004)的LyP-1(CGNKRTRGC;SEQID NO:99)和包含RGRR的CRGRRST(SEQ ID NO:102和101;Joyceet al.,2003)。像在iRGD中一样,这些肽中的CendR基序不是C端。已发现需要蛋白酶解处理来活化所述CendR基序。确实,用胰蛋白酶处理iRGD噬菌体或LyP-1噬菌体增强了所述噬菌体与PPC1细胞上的神经毡蛋白-1的结合。胰岛素对非CendR肽CRGDC(SEQ ID NO:36)和RGD-4C没有作用。Lyp-1归巢于肿瘤中远离血管的低氧/低营养区域并且将纳米颗粒大小的负载递送至这些区域(Laakkonen et al.,2002;2004;Karmali et al.,2009)。因此,LyP-1是肿瘤穿入CendR肽。
iRGD增强肿瘤中的脉管穿透性。已经发现,iRGD的肿瘤穿入特性包括增加肿瘤中的脉管穿透性的能力。肿瘤携带小鼠被注射Evans Blue(常用于脉管穿透性研究中的白蛋白结合染料),之后注射iRGD肽。如图5所示,与对照肽相比,iRGD引起染料更多地渗入所述肿瘤,所述渗透是对肿瘤组织特异的,并且它不会由不含CendR基序的RGD肽引发。在多个实验中测试了4种肿瘤类型,包括肿瘤转移,结果一致。所述CendR系统参与脉管渗出已被实验证明,所述实验中RGD对脉管穿透性的作用被针对NRP-1的抑制性抗体的使用所阻断。
iRGD增强氧化铁纳米颗粒进入肿瘤。通过对肿瘤小鼠注射临床使用的MRI显影剂Feridex来测试纳米颗粒进入肿瘤,Feridex是顺磁性葡聚糖包被的氧化铁纳米颗粒,直径为约150nm。与单独使用Feridex相比,将Feridex与iRGD结合致使所述肿瘤中有更强的MRI对比。
iRGD诱导组织穿入。iRGD和LyP-1迅速穿入远离血管的肿瘤组织(Laakkonen et al.,2004;Sugahara et al.,2009),表明iRGD除了促进外渗外,还能增强运输通过实质肿瘤组织。为了证明这一点,通过在含有噬菌体的培养基中培养新切肿瘤来消除循环的影响。所述iRGD噬菌体快速穿入肿瘤组织,在90分钟内移动约4mm,而对照噬菌体仅以痕量见于所述肿瘤表面(图6)。因此,CendR肽诱导组织穿入,并且所述穿入依赖于主动运输过程。该过程可被称为CendR诱导的跨内皮&组织(CendIT)作用。
iRGD增加赫赛汀的肿瘤积累和抗癌活性。还已经证明,iRGD增强肿瘤中的药物递送。赫赛汀被用作所述共组合物药物。赫赛汀是针对HER2受体的抗体,其广泛用于临床,用作抗癌试剂。与单独等剂量赫赛汀相比,给予iRGD和赫赛汀在抑制肿瘤生长方面显著更有效(图7)。
这些结果证实了新概念的肿瘤治疗方法:肿瘤特异地增强药物穿入肿瘤组织。肿瘤血管易于渗漏,这使得材料可以外渗进入肿瘤血管周围的组织(所谓增强的穿透和保留——EPR——作用)。可被称为CendIT的CendR肽的作用明显比所述EPR作用有效很多(例如,参见图4)。同样,由于CendIT是主动过程,而不是渗漏,并且因为它是受体(NRP-1)依赖的,因此其导致较深的肿瘤穿入,这是在没有循环存在下的被动扩散和对流所不能实现的(图6)。
1.讨论
所述研究揭示了一种之前没有认识到的细胞内化途径,其被称为CendR。CendR的显著特征为:(i)R/KXXR/K(SEQ ID NO:23)识别基序,(ii)所述基序的C端暴露用于结合和内化活性,(iii)NRP-1参与所述结合和内化,和(iv)潜在CendR基序通过蛋白酶解处理转变为活性基序。
一组心脏归巢肽包含暴露的CendR基序(Zhang,L.et al.2005),但是所述CendR基序也可以是潜在的。一些具有细胞穿透特性的肿瘤归巢肽包含潜在的CendR基序(Laakkonen,P.,et al.2002b;Porkka,K.et al.,2002;Jarvinen,T.A.et al.2007;Zhang,L.et al.2006)。除所述CendR基序之外,这些肽还具有可与特定受体结合的序列。在Sugahara et al.,2009和2009年2月20日提交的美国专利申请No.12/390,061中描述了整联蛋白结合iRGD肽,提供了这样的肽如何工作的说明;所述特定归巢元件将所述肽集中于靶(肿瘤),蛋白酶暴露所述CendR基序,之后NRP-1结合致使所述肽(如果有的话还有它的负载)被细胞摄取。
很多阳离子CPP包含活性或潜在CendR元件(Langel,2007)。具有CendR基序的HIV-1TAT蛋白的基本结构域抑制VEGFA-165结合至NRP-1(Jia,H.et al.2001),但是阳离子CPP的结合和摄入的机制仍不清楚。阳离子CPP和CendR肽之间最重大的差异是包含D氨基酸的CPP是有活性的(Polyakov,V.et al.2000,Gammon,S.T.et al.2003),而本文的结果显示CendR的摄入仅依赖于L-肽的特异性识别。同样,很多CPP能够内化C端锚定的货物,这与所述核心CendR概念明显相反。可能CendR是能够参与阳离子CPP摄入的数条平行途径之一。
所述CendR介导的内化系统的生理学意义仍不完全明确,但是CendR元件存在于整个蛋白质组中,并且很多丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶能够活化它们(Barrett,Alan et al.1998)。前蛋白转化酶和膜蛋白酶(例如matriptase)尤其有关,因为这些酶的切割暴露多种内源蛋白质(肽激素、生长因子、粘附分子、蛋白酶;Thomas,G.,2002,Uhland,K.2006)C端的RXXR序列。能够实现NRP-1辅助受体(co-receptor)功能、受体活化和活性蛋白质摄入细胞是所述生理学CendR序列的可能功能。
病毒和其他微生物看来将所述CendR机制移用于促进感染。同时伴随着CendR元件的暴露的病毒外壳蛋白的蛋白酶切看来是很多病毒病原体感染性中重复出现的事件(表4)。
表4.具有表面CendR元件的人致病性病毒实例
通过遍在表达的蛋白酶——弗林蛋白酶——切割病毒表面蛋白质对于一些病毒的全身扩散是重要的促进性因子,而对具有受限表达模式的蛋白酶敏感的病毒感染性可以限制感染至表达合适蛋白酶的组织。该概念的实例有流感病毒(Steinhauer,D.A.et al.1999)。局部感染的哺乳动物和无毒力的禽流感病毒的血球凝集素在单个精氨酸残基处被切割;这样的切割限于有限的细胞类型,例如呼吸道和食道的细胞。相反,引起全身感染的有毒力禽流感病毒由弗林蛋白酶活化以暴露多碱价CendR元件。本文指出,抑制CendR介导的病原体及其产物的内化和组织穿入可以提供对抗传染性疾病的新方法。
所述CendR技术可以有很多生物技术应用,例如改善细胞类型特异性纳米颗粒的递送。用预先暴露的CendR肽包被的纳米颗粒可以被所述颗粒遇到的首个血管床(心脏和肺,在静脉内注射RPARPAR(SEQ IDNO:2)噬菌体之后)摄取。如Sugahara et al.2008所示,潜在CendR序列可用于递送货物至外周组织。血浆含有高浓度的通用(例如,α-2-巨球蛋白)和酶特异性(例如,α-2-抗血纤蛋白溶酶、抗凝血酶)蛋白酶抑制剂。这可能在血液中提供对抗过早CendR活化的保护。活性蛋白酶一般局限在紧邻细胞周围区域。这些蛋白酶可活化纳米颗粒上的潜在CendR肽,所述纳米颗粒通过被动积累或者通过归巢肽介导的递送已经达到了靶组织。能够暴露潜在CendR序列的组织特异性蛋白酶能够进一步增强体内靶的选择性。由所述活化的CendR元件介导的细胞摄取为处理的肽及其货物在所述靶组织或细胞处的积累提供了机制。所述研究的另一个重要结论是,CendR元件能够促进纳米颗粒在组织中的扩散,以及选择性CendR介导的内化和组织穿入可以通过将基于停靠的和蛋白酶敏感的CendR靶向元件结合来实现。所述iRGD肽(Sugahara et al.,2009),可能还有具有上文讨论的潜在CendR元件的其他内化脉管归巢肽,例证了该范例。还应指出,与所研究的噬菌体和其他纳米颗粒类似,多种感染剂可以使用所述CendR系统来促进它们扩散至整个组织中。
2.方法
动物步骤。使用BALB/c裸鼠(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,IN)根据University of California,Santa Barbara的AnimalResearch Committee批准的步骤进行所有的动物实验。
噬菌体展示。对于体内噬菌体展示,对小鼠静脉内注射1010菌斑形成单位(pfu)的T7噬菌体,之后灌注循环系统并通过滴定确定靶器官中的结合噬菌体。对于对培养细胞(体外展示)和源自器官的细胞悬浮液(离体展示)的细胞结合研究,将所述细胞用109pfu的噬菌体在4℃孵育、清洗、裂解并且通过滴定来定量。将在37℃下孵育、之后低pH下清洗(甘氨酸-HCl,pH 2.5)用来评估内化的噬菌体的量。
量子点的标记。根据制造商的说明使用生物素化肽来官能化605ITK链霉亲和素量子点(nvitrogen,Carlsbad,CA)。
免疫荧光。用4%缓冲的多聚甲醛或冷(-20℃)甲醇固定培养细胞和组织切片,之后用合适的第一抗体和Alexa标记的第二抗体孵育,用DAPI或Hoechst 342DNA染料进行核染色。
亲和层析。在含有200mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷的PBS中裂解所述PPC-1肿瘤,之后用RPARPAR(SEQ ID NO:2)包被的Sulfolink-bead(Pierce,Rockford,IL)孵育,并且在含有2mM游离RPARPAR(SEQ ID NO:2)肽的裂解缓冲液中洗脱。在Burnham Institutefor Medical Research Proteomics Resource将从洗脱级分的银染凝胶中分离的凝胶片段进行MALDI-TOF质谱。
小鼠和组织。所有的动物实验根据University of California,SantaBarbara的Animal Research Committee批准的步骤进行。对于肿瘤注射和在处死之前,腹膜内注射甲苯噻嗪(xylazine,10mg/kg)和氯胺酮(50mg/kg)麻醉小鼠。BALB/c无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,IN)被用于肿瘤异种移植和体内和离体噬菌体展示实验。通过将106PPC-1细胞(Zhang,L.et al.2006)注射入前列腺的腹瓣来产生常位前列腺肿瘤异种移植物。对于组织学分析,将组织在4%多聚甲醛中固定,在含30%蔗糖的磷酸盐缓冲的盐水溶液中冷冻保护并且以10μm切片。
细胞系。在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养PPC-1、PC-3、Du-145、4T1、MIA PaCa-2、PDAC1.3、B16F10、M21和MDA-MB-435细胞系。根据制造商的说明培养人脐带静脉内皮细胞。
噬菌体展示。T7-选择性噬菌体展示系统根据制造商的说明(EMDBiosciences,Gibbstown,NJ)被用于噬菌体文库构建(文库多样性-108)和单个噬菌体克隆。通过用PEG-8000(Sigma,St.Louis,MO)沉淀,之后用CsCl2梯度超速离心和透析来纯化噬菌体。展示的肽的序列根据编码T7主要外壳蛋白gp10的C端处包含插入物的区域的DNA确定。
对于生物淘选(biopanning)和噬菌体结合研究(Hoffman,J.A.et al.,2004),使培养细胞生长至汇合,用胰蛋白酶收集细胞,使用Medimachine(BD Biosciences,San Jose,CA)解离小鼠器官。为了测量噬菌体结合,在4℃用109pfu/ml的T7噬菌体孵育结合缓冲液(含1%BSA的DMEM)中的106个细胞1小时。用所述结合缓冲液清洗所述细胞4次,在包含1%NP-40的LB细菌生长培养基中裂解,并且滴定。噬菌体内化测定使用相同的步骤,但是在37℃下将细胞与噬菌体孵育,并且在第二次清洗时使用酸性缓冲液(500m氯化钠,0.1M甘氨酸,1%BSA,pH 2.5),而不是使用结合缓冲液。
在时间进程实验中,使用在硅油垫(1.03g/ml)上离心将未结合噬菌体从细胞中分离。在与噬菌体孵育前20分钟将噬菌体结合和内化抑制剂(肝素、软骨素、糖萼去除酶、内吞抑制剂、游离肽、量子点和UV-灭活噬菌体)加至所述细胞。本研究中使用如下的内吞抑制剂:制霉菌素(50μg/ml)、染料木黄酮(100μg/ml)、氯丙嗪(5μg/ml)、5-(N-乙基-N-异丙基)氨氯吡嗪脒(100μM)、渥曼青霉素(10μM)。
小鼠体内噬菌体归巢研究是通过如下方式进行的:将1010pfu的T7噬菌体注射进入尾静脉,10分钟至1小时后,用DMEM通过心脏左心室灌注小鼠。收集目标器官,在1%NP40中均化,通过滴定定量所述噬菌体。
肽合成和量子点标记。在微波辅助自动化肽合称仪(Liberty,CEMCorporation)上使用Fmoc/t-Bu化学法合成所述肽。通过HPLC使用溶于乙腈-水混合物的0.1%TFA纯化肽达到90%-95%的纯度,通过Q-TOF质谱分析确证。
通过与100倍摩尔超量的肽孵育,之后通过透析除去游离肽,用生物素化肽官能化链霉亲和素ITK-605量子点(Invitrogen,Carlsbad,CA)。
亲和层析。在含有400mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、1mMMgSO4、1mM MnCl2、1mM CaCl2和1片/5ml的无EDTA蛋白酶抑制剂混合物(Sigma,St.Louis,MO)的PBS中匀浆常位PPC-1肿瘤。在4℃下在旋转平台上提取6小时后,通过离心(在冷冻微量离心机中在14000rpm下离心20分钟)澄清裂解物并且将其加至亲和柱上,所述亲和柱是根据制造商(Pierce,Rockford,IL)的说明书通过将半胱氨酸标记的RPARPAR(SEQ ID NO:2)肽连接至Sulfolink连接凝胶制备的。过夜结合之后,用含有200mM正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、但其他方面与所述裂解缓冲液相同的柱清洗缓冲液清洗所述柱,之后用相同缓冲液中的2mM游离RPARPAR(SEQ ID NO:2)肽进行洗脱。
将所述清洗和洗脱级分的样本使用Novex 4-20%Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen,Carlsbad,CA)分离,使用Silver Snap试剂盒(Pierce,Rockford,IL)银染,并且在Burnham Institute for MedicalResearch Proteomics Facility对其进行MALDI-TOF质谱。对亲和层析样本用抗体进行免疫印迹和探测,之后对结合进行化学发光检测。
免疫荧光染色。在37℃和5%CO2下在6孔组织培养板中在胶原蛋白-1包被的盖玻片上(BD Biosciences,San Jose,CA)将培养的细胞(2×105个细胞)培养过夜,并用108pfu的T7噬菌体孵育。将所述细胞在4%多聚甲醛或冷(-20℃)甲醇中固定,并用抗体染色。用DAPI或Hoechst 542对核染色。如先前所述(Laakkonen,P.et al.2002b)自己产生多克隆兔抗-T7抗体,但是包括使用CsCl2离心的另一噬菌体纯化步骤。使用的其他第一抗体是大鼠抗-小鼠CD31单克隆抗体(BDBiosciences)、兔抗-NRP-1、小鼠抗-人Lamp-1、小鼠抗-人窖蛋白(Millipore,Temecula,CA)、小鼠抗-NRP-1(Miltenyi Biotec Inc.,Auburn,CA)、小鼠抗-人EEA-I(BD Biosciences,San Jose,CA)。第二抗体——针对小鼠、大鼠和兔免疫球蛋白的Alexa594山羊抗体和Alexa488驴抗-兔抗体来自Invitrogen(Carlsbad,CA)。通过共聚焦显微镜(Fluoview500,Olympus America Inc.,Center Valley,PA)来检测细胞和组织切片。
DNA构建体和转染。在pcDNA3.1(+)中的野生型NRP-1cDNA表达构建体由Michael Klagsbrun博士馈赠。使用定点诱变通过用GCTAAAGCTGCT(SEQ ID NO:30;编码AKAA)替换TCAAAAGAAACC(SEQ ID NO:29;编码氨基酸SKET)来产生在NRP-1的b1结构域的VEGF-165结合位点的三重突变(S346A-E348A-349A)。
使用lipofectamine根据制造商的说明(Invitrogen,Carlsbad,CA)用这些构建体短暂转染M21黑素瘤细胞。
噬菌体和量子点的蛋白酶处理。用50iu的uPA、25μg的结晶胰蛋白酶、50iu的凝血酶或25μg的I型胶原酶(都来自Sigma,St.Louis,Mo)处理109个噬菌体颗粒或50μl的肽包被量子点噬菌体。
C.实施例3:通过诱导肿瘤选择性脉管穿透性来靶向肿瘤
癌症治疗的一个主要问题是抗癌剂没有充分地穿入肿瘤组织。本文介绍了一种新概念的方法来克服该局限。公开了肿瘤穿入肽——iRGD(CRGDK/RGPD/EC;SEQ ID NO:61),其选择性地增加共给予的多种大小的化合物的脉管逃逸和肿瘤穿入。该活性依赖于iRGD中的两个序列基序——针对αv整联蛋白的RGD结合基序(其在肿瘤脉管中(并且经常在肿瘤细胞上)表达)和RXXR/K C-末端规则基序(其与组织穿入受体——神经毡蛋白-1——结合)。与iRGD共给予增加了两种药物(多柔比星脂质体和赫赛汀)的抗肿瘤活性。iRGD能够被作为癌症诊断剂和治疗剂的通用辅助剂使用。
现有的抗癌剂有两个主要问题:很难穿入肿瘤组织以及对正常组织毒性高。在实体瘤中,抗癌剂仅能从血管穿过3-5个细胞直径,使得一些肿瘤区域没有药物或者药物浓度低(Hambley et al.,2009;Minchintonet al.,2006)。肿瘤具有较高的间隙压力,可能是由于肿瘤中的血管容易渗漏而淋巴管功能较差,这反作用于药物穿入肿瘤组织(Jain,1990;Heldin et al.,2004)。这些情况可降低所述治疗的有效性并且可促进药物抗性的出现。
目前鉴定了一种肿瘤穿入肽——iRGD(CRGDK/RGPD/EC;SEQ IDNO:61;由半胱氨酸之间的二硫键环化),其可以特异性地结合肿瘤血管,穿入肿瘤组织,并且能够携带附着的负载,例如荧光团、药物或纳米颗粒显影剂深入进入脉管外肿瘤组织(Sugahara,2009)。不一定要将负载连接至所述肿瘤穿入肽;所述肽特异性地在肿瘤中增加脉管穿透性,使得共注射的化合物外渗并且穿入肿瘤组织(Sugahara et al.,2010)。该方法使得能够增加在肿瘤内起作用的药物的有效性,而不需要修饰所述药物用于靶向,而且不会增加所述药物的副作用。
所述iRGD肽选择性地归巢于肿瘤,因为它与αv整联蛋白结合,所述αv整联蛋白特异性地在肿瘤脉管系统中表达并且经常在肿瘤细胞上表达(Ruoslahti et al.,2002;Eliceiri et al.,2001;Sugahara et al.,2009)。RGD肽和它们的模拟物现在被用于多种医学应用,例如肿瘤诊断和治疗,并且在临床试验中被评估(Tucker et al.,2003)。所述iRGD肽不同于目前使用的RGD肽,因为尽管它最初结合至生血管肿瘤内皮上的αv整联蛋白,但是之后蛋白酶解切割会暴露C端RGDK/R序列(SEQ IDNO:31;CendR序列;Sugahara et al.,2009;Teesalu et al.,2009)。截短的肽不再与整联蛋白结合,而获得对神经毡蛋白-1的亲和性,所述神经毡蛋白-1介导所述外渗和组织穿入活性(Sugahara et al.,2009;Teesalu etal.,2009)。这样的特性赋予iRGD高度有效、肿瘤选择性的组织穿入,其在将所述肽注射进入血流后的数分钟内出现(Sugahara,2009)。
具有C-端R/KXXR/K(SEQ ID NO:23)的肽和蛋白质通过结合至神经毡蛋白-1增加脉管穿透性(Acevedo et al.,2008;Jia et al.,2006;Soker et al.,1998;Teesalu et al.,2009)。iRGD在所述肿瘤中的迅速外渗和组织穿入可由肿瘤特异的iRGD的CendR序列诱导的脉管穿透性增加引起。肿瘤携带小鼠被注射Evans Blue(常用于脉管穿透性研究中的白蛋白结合染料)(Miles et al.,1952;Murohara et al.,1998)。当化学合成的iRGD肽与所述染料共注射时,引起了所述染料在常位MIA PaCa-2人胰腺癌异种移植物处(图9A)和由该肿瘤侵入的继发性位点(图9A,箭头)处的特异性积累。所述诱导的穿透性也可见于其他肿瘤类型,其中显示iRGD有效归巢于(Sugahara et al.,2010)BT474人乳腺和22Rv1人前列腺肿瘤的常位异种移植物、模拟转移的弥散性人GFP-PC-3前列腺肿瘤和基因工程改造的从头开始胰腺导管腺癌模型(Hezel et al.,2006;图9A和图10,A和B1)。对所述组织中所述染料的定量证实了所述穿透性是对所述肿瘤特异的并且依赖于给予的iRGD的剂量。所述肿瘤积累中的增加是约4倍(图9B)。
为了测试所述CendR元件在iRGD诱导的脉管穿透性中的关联性,对两种常用的不携带CendR基序的RGD肽——RGD-4C(CDCRGDCFC;SEQ ID NO:32;Koivunen et al.,1995)和环(-RGDfK-)(SEQ ID NO:40;Murphy et al.,2008)——检测穿透作用,发现其没有活性(图9C和图10C)。此外,携带RGD但不携带CendR基序的打乱的iRGD变体(CRGDGPC;SEQ ID NO:33)也不能增强在肿瘤中的穿透性(图9C和图10C)。将功能性地阻断神经毡蛋白-1(CendR肽的受体)的抗体预先注射进入肿瘤小鼠中抑制了iRGD诱导的穿透性增加(图9D)。当iRGD靶向肿瘤时,它被蛋白酶解切割成为CRGDK(SEQID NO:34),其作为神经毡蛋白-1结合CendR肽起作用(Sugahara et al.,2009)。化学合成的CRGDK(SEQ ID NO:34)肽以类似于VEGF-165和原型CendR肽、RPARPAR(SEQ ID NO:2)和RPAR(SEQ ID NO:5;Teesalu et al.,2009;图11)的剂量依赖方式增强皮肤中的局部脉管穿透性。总的来说,这些结果显示由iRGD增强的肿瘤中的穿透性是CendR依赖的。
由iRGD介导的组织进入的肿瘤特异性增加导致了提高将药物和成像剂递送至肿瘤实质的新方法(表示在图12中)。很多化合物与iRGD一起注射。1.3-kDa的肽——荧光素标记的CRGDC(FAM-CRGDC,SEQID NO:36)——不含CendR基序,本身仅能以最小程度穿入肿瘤组织(Koivunen et al.,1993;Sugahara et al.,2009),当其与iRGD共注射时显示出广泛的脉管外分布(图13A)。类似的结果可以用3-kDa和10-kDa葡聚糖、超顺磁性氧化铁纳米蠕虫(长约80nm,厚30nm(Park et al.,2009))和T7噬菌体(直径约65nm(Sokoloff et al.,2000))获得。对在组织切片中的扩散区域的定量显示了FAM-CRGDC(SEQ ID NO:36)和所述葡聚糖在肿瘤中的扩散在存在iRGD的情况下是在不存在iRGDS的情况下的3-5倍(图13B)。与iRGD共注射时,T7噬菌体在肿瘤中的积累是对照的3倍,其由噬菌体滴定所证实(图13C)。这些结果显示,所述iRGD混合物系统可以增加大小和化学性质极大不同的化合物(可以是1-kDa肽至大小约70nm的纳米颗粒)在肿瘤中的积累。由共给予例如iRGD的CendR肽诱导的此种组织特异的分子穿入已被称为CendR诱导的跨内皮&组织作用(CendIT——发音类似于“send it”——作用)。
为了研究所述iRGD混合物方案对肿瘤治疗的应用,用iRGD和多柔比星(DOX)-脂质体(直径为约120nm)的结合物处理常位22Rv1肿瘤。与iRGD结合时比不与iRGD结合时所述脂质体在肿瘤组织中扩散更广泛并且积累更多(图14A和B)。肿瘤治疗研究显示了所述iRGD-混合物方案(1mg DOX/kg+iRGD)与单独给予3倍剂量的DOX-脂质体的效力相当(图14C)。不含CendR基序的环RGD肽不能增强所述药物的作用。一些RGD肽已显示抑制肿瘤生长(Brooks et al.,1994;Tuckeret al.,2003)。仅iRGD的对照(剂量为用于所述混合物方案的剂量)显示出对肿瘤生长没有作用,支持了如下观点,即所述混合物方案比仅药物更有效,因为iRGD使得药物更多地接近肿瘤细胞。每天以3mgDOX/kg给予所述脂质体,持续17天,达到药物在小鼠中累积的最大耐受剂量(Parr et al.,1997)。将iRGD与该剂量结合(3mg DOX/kg+iRGD)进一步提高所述药物的有效性(图15)。
所述混合物方案显著增加药物的有效性,但是它并不增加副作用。DOX的主要副作用,心脏毒性,已经在分子水平为心肌细胞凋亡所证实(Arola et al.,2000)。在3mg DOX/kg组观察到了由TUNEL染色检测到的大量心肌细胞凋亡,而它最低程度地出现在所述混合物组中(1mgDOX/kg+iRGD),其出现的水平类似于1mg DOX/kg组的水平(图14D和图16)。相反,来自于所述混合物组(1mg DOX/kg+iRGD)的肿瘤显示出与3mg DOX/kg组相当水平的强TUNEL染色,支持了处理数据(图14D)。此外,3mg DOX/kg组大幅地体重减轻,而所述混合物组(1mg DOX/kg+iRGD)显示出与1mg DOX/kg组相当的体重轻微减轻(图17)。这些结果表明,所述混合物方案提供与仅使用较高剂量药物等同的抗肿瘤作用,而不增加副作用。
然后,在另一由BT474细胞产生的常位肿瘤模型中测试所述iRGD-混合物方案。所述BT474细胞高度表达HER2,其是148-kDa的抗HER2抗体赫赛汀的靶(Spiridon et al.,2002)。当赫赛汀与iRGD一起注射时,在所述肿瘤组织中的扩散比对照注射更有效(图18A)。ELISA定量显示,iRGD将赫赛汀在所述肿瘤中的积累显著地提高了40倍,可能是因为它对HER2表达肿瘤细胞的亲和性(图18B)。因此,结合iRGD和赫赛汀处理常位BT747肿瘤大幅地增加了所述药物的效力(图18C)。以在所述混合物方案中使用的剂量单独使用所述iRGD肽不会影响肿瘤生长。所述混合物方案比单独用同样的或3倍剂量的赫赛汀处理显著更有效。将iRGD与3倍剂量的赫赛汀结合甚至更提高了所述药物的效力。用该结合物处理致使全部肿瘤根除(图18C)。所述肿瘤在它们消失后2周的观察中在无任何治疗的情况下没有复发。
作为新的肿瘤靶向方法学的基础的CendIT作用不同于所谓增强的穿透和保留(EPR)作用。EPR是由于肿瘤脉管的渗漏,其可使材料外渗进入肿瘤脉管周围组织(Maeda et al.,2003)。CendIT作用明显比EPR有效很多(例如,参见图13)。CendIT作用可能是一个主动过程而不是被动的脉管渗透现象,因为(i)CendIT是受体(神经毡蛋白-1)介导的,而EPR不是,(ii)CendIT在数分钟内引起外渗,而EPR显示出较慢的开始,在6-8小时内逐渐达到峰值(Maeda et al.,2003),(iii)CendIT对小分子有效,而EPR延长大于45-kDa的分子在肿瘤内的停留(Maeda etal.,2003),并且(iv)表达iRGD的噬菌体即使在没有循环的情况下仍然能穿入肿瘤组织,且这一过程是神经毡蛋白-1和能量依赖的(图19)。但是,在EPR(和一般的脉管穿透)中可以有CendIT组分,因为参与这些过程的VEGF-165在C端具有活性CendR基序(Maeda et al.,2003;Jiaet al.,2006;Soker et al.,1998;Teesalu et al.,2009)。
所述基于CendIT的iRGD-混合物系统是一种新概念的肿瘤治疗新方法;将肽与游离药物共给予增强药物接近肿瘤。常规的药物递送系统经常需要大量的化学法来将所述靶向元件(例如肽和抗体)附着至药物。所公开的系统与这样的系统相比提供了显著的优点,即药物活性可不经任何修饰而被增强(参见图12)。此外,常规系统依赖于抗原-受体停留在靶处(synaphic靶向),因此会受制于由于肿瘤脉管系统上有限的受体数量而饱和。相反,所述混合物系统是不会饱和的。一旦激发了穿入信号(CendIT作用),任何给定浓度的分子都可能外渗并且停留在肿瘤组织内,其由本研究中的不同剂量的药物所证实。
所述iRGD-混合物系统是高度肿瘤选择性的。所述肿瘤特异性源自于iRGD的3-步肿瘤靶向机制(Sugahara et al.,2009and 2010;图12);iRGD肽(i)用它的RGD靶向肿瘤脉管,(ii)然后被切割成为CendR(CRGDK/R片段;SEQ ID NO:37),(iii)并且结合于神经毡蛋白-1以引发CendIT作用。除非iRGD被切断,否则它不会显示CendR特性或者具有对肿瘤穿入受体神经毡蛋白-1的亲和性,从而在正常组织中给出最小背景(Sugahara et al.,2009)。对于VEGF做了类似的尝试以增加脉管穿透性,从而实现分子和纳米颗粒更深地穿入肿瘤组织(Monsky et al.,1999)。当VEGF局部浇注到肿瘤上时,成功地增强了白蛋白和纳米颗粒在所述肿瘤中的渗透,最高达4倍。但是,类似的效应可见于局部注射VEGF的皮肤(Monsky et al.,1999;Murohara et al.,1998;Teesalu etal.,2009)和全身注射非靶向CendR肽的肺中(Teesalu et al.,2009),证明了成功的肿瘤选择性CendIT作用需要靶向元件。
分子在肿瘤中而不是其他任何地方的4倍分子积累可通过极少的优化工作来实现;可通过例如使用纳米颗粒上的多聚体iRGD、结构稳定化的iRGD、其他肿瘤归巢CendR肽(Hoffman et al.,2003;Joyce et al.,2003;Laakkonen et al.,2002;Porkka et al.,2002),或肽的结合物,或者通过优化剂量和给药方案而可能提高该比例。值得注意的是,与用相同或更高剂量的药物单独处理的肿瘤相比,在用所述混合物方案处理后收集的肿瘤(图14B)显示出药物在肿瘤中的显著广泛分布(图20)。与用相同或更高剂量的药物单独处理的肿瘤相比,从赫赛汀混合物方案中收集的肿瘤(图18C)显示赫赛汀在肿瘤中广泛的分布。因此,多次注射的混合物方案或者较长的循环时间可以帮助增加化合物在肿瘤中的积累。此外,如用赫赛汀所证明的,使用具有对肿瘤组织有亲和性的抗癌剂可以帮助改善该系统。
分子在肿瘤中的积累使得可能达到更大的抗肿瘤活性。该观点已经在关于组织穿入主题的使用不同药物的2个肿瘤模型中得到证实(Yuanet al.,1994;Thurber et al.,2008)。由于发明人测试的8种差异巨大的化合物(从1-kDa的分子至最大到直径为约120nm的纳米颗粒)的每一种的肿瘤递送都能被增强,可能任何药物的活性都可能用该系统来提高。或者,降低剂量使得可能减少副作用,同时达到与常规治疗相同水平的抗肿瘤活性。因此,甚至还可能重新使用由于毒性不被使用的药物。肿瘤治疗(和诊断)可以显著提高。
1.方法
细胞和肿瘤模型。在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养MIA PaCa-2人胰腺导管癌、22Rv1、GFP-PC-3和PPC1人前列腺癌细胞系。在添加10%胎牛血清和青霉素/链霉素的SFM4MAB培养基中培养BT474人乳腺癌细胞系。通过对BALB/c无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley,Inc.,Indianapolis,IN)常位注射106个人癌细胞来产生异种移植物。对于BT474异种移植物,在常位接种悬浮在基质胶(matrigel,BD Biosciences,San Jose,CA)中的5×106个肿瘤细胞之前1天,将17β-雌二醇颗粒(Innovative Research ofAmerica,Sarasota,FL)皮下植入小鼠的背部。通过将2×106个GFP-PC-3细胞注射进入心脏的左心室来产生弥散性前列腺肿瘤。用IllumatoolBright Light System LT-9900(Lightools Research,Encinitas,CA)在UV光下检查所述弥散性肿瘤结节。从头开始胰腺导管腺癌的转基因小鼠由University of California,San Francisco,CA的Douglas Hanahan博士馈赠。根据University of California,Santa Barbara的Animal ResearchCommittee批准的步骤进行所有的动物实验。
化合物的制备。如所描述制备了合成肽(Teesalu et al.,2009)、表达G7(SEQ ID NO:38)或CG7C(SEQ ID NO:39)肽的非靶向T7噬菌体和iRGD噬菌体(Teesalu et al.,2009)、以及荧光素标记的非靶向氧化铁纳米蠕虫(Park et al.,2009)。DOX-脂质体包含摩尔比例为2∶1.5∶1.25∶0.25的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、胆固醇、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-S-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]。将脂质(来自Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL)溶解于三氯甲烷,并将所述溶剂用不含水分的氮气蒸发,形成薄膜。用300mM磷酸铵(pH 7.4)将所述干燥的脂质膜在60℃下水合1小时。将安瓶短暂涡旋并且间或在浸浴超声发生器中超声处理。由此形成的多层小泡用Ti探测超声发生器进一步超声处理2-3分钟,直到获得小的单层小泡的半透明溶液。然后使用Avanti mini压出机(Avanti Polar Lipids)将所述小的单层小泡连续地挤压通过孔径为200nm和100nm的聚碳酸酯膜滤器11次。然后,使用NAP-10或NAP-25柱(GE Healthcare,Milwaukee,WI)通过凝胶过滤将所述缓冲液与Hepes缓冲盐水(20mM Hepes、150mM NaCl、pH 7.4)交换。通过如先前所述的跨膜磷酸梯度(Murphy etal.,2008)将DOX(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)装入这些脂质体中。所述DOX-脂质体的直径为119.8±7.6nm(±标示标准偏差),其由在Malvern Zetasizer Nano(Malvern,UK)上的动态激光散射(折射率,1.59;粘度,0.89)测量。
体内全身穿透测定(iRGD-混合物系统)。肿瘤小鼠被静脉内注射100μl PBS,其包含1μg的Evans Blue、200nmol荧光素标记的CRGDC肽(FAM-CRGDC,SEQ ID NO:36)、200μg可固定葡聚糖(MolecularProbes,Eugene,OR)、109菌斑形成单位(pfu)G7-表达噬菌体、5mg铁/kg荧光素标记的非靶向氧化铁纳米蠕虫、1mg DOX/kg的DOX-脂质体或者3mg/kg的赫赛汀(Genentech,South San Francisco,CA)。5分钟后,所述小鼠接受静脉内注射100μl的PBS,所述PBS含有不同浓度的iRGD或对照肽,或者不含iRGD或者对照肽。在标示的循环时间后,用包含1%BSA的20ml PBS灌注所述小鼠,并收集组织。对于EvansBlue定量,在37℃下使用N,N-二甲基甲酰胺将所述染料从组织中提取24小时,通过使用分光光度计在600nm下测量吸光率来对染料含量定量。来自接受FAM-CRGDC(SEQ ID NO:36)的小鼠的组织在进行免疫荧光和免疫组织化学处理之前,在UV光下使用Illumatool BrightLight System LT-9900成像。有葡聚糖、纳米蠕虫、DOX-脂质体或赫赛汀的组织被处理,用于免疫荧光或免疫组织化学或者免疫荧光和免疫组织化学。在该说明书的其他地方描述了免疫组织化学染色切片阳性区域的定量和组织中抗体的总量的定量。
体内皮肤穿透测定(改良的Miles测定)。麻醉裸鼠被静脉内注射由150μl的PBS中的0.5%Evans Blue(MP Biomedicals,Irvine,CA)、13μg的Quantilum重组萤光素酶(Promega,Madison,Wi)和109pfu的表达G7(SEQ ID NO:38)的噬菌体颗组成的3-示踪混合物。10分钟后,所述小鼠在腹侧以两列皮内注射30μl含15ng VEGF-165(Calbiochem,SanDiego,CA)或各种浓度肽的PBS。30分钟之后,所述小鼠被心脏灌注,经检测具有Evans Blue的包含注射位点的皮肤被取下并且充分清洗。从所述注射位点打孔取下皮肤样本(直径4mm),在具有1%NP40的溶源性培养基中均质化,并且对其进行萤光素酶活性和噬菌体滴度测定。
免疫荧光。如所描述进行组织制备和冷冻切片染色(Sugahara et al.,2009)。第一抗体是大鼠抗-小鼠CD31单克隆抗体(BD Biosciences)和兔抗-T7噬菌体多克隆抗体(Teesalu et al.,2009)。第二抗体——AlexaFluor 594山羊抗兔、647山羊抗大鼠和488驴抗兔抗体来自MolecularProbes。在一些实验中,组织切片被用TUNEL分析试剂盒(In Situ CellDeath Detection Kit,TMR red;Roche Applied Science,Indianapolis,IN)染色。所述组织切片被用Fluoview 500共聚焦显微镜(Olympus America,Center Valley,PA)检查。
免疫组织化学。冷冻切片被免疫组织化学染色,并用Scanscope CM-I扫描器扫描,用ImageScope软件(Aperio Technologies,Vista,CA;Sugahara et al.,2009)对阳性染色区域定量。使用的第一抗体是生物素化兔抗-FITC/Oregon green多克隆抗体(Molecular Probes)、小鼠抗-葡聚糖单克隆抗体(Stemcell Technologies,Vancouver,BC,Canada)和生物素化大鼠抗小鼠CD31单克隆抗体(BD Biosciences)。第二抗体是生物素化山羊抗兔(Pierce Biotechnology,Rockford,IL)、山羊抗小鼠(Vector laboratories,Burlingame,CA)和兔抗人(Pierce Biotechnology)多克隆抗体。在一些实验中,组织切片被用TUNEL测定试剂盒(In SituCell Death Detection Kit,POD;Roche Applied Science)染色。
肿瘤和正常组织中DOX的定量。如他处所描述进行所述定量(Mayeret al.,1997)。简要地,携带22Rv1常位肿瘤的小鼠被静脉内注射DOX-脂质体(5mg DOX/kg)(与或不与iRGD(4μmol/kg)),或者空脂质体。3小时后,所述小鼠被心脏灌注,收集目标肿瘤和器官。将所述组织在溶于水的1%十二烷基硫酸钠和1mM H2SO4中机械均质化。之后,通过加入2ml三氯甲烷/异丙醇(1∶1,v/v)、之后通过涡旋和冷冻/解冻循环来提取DOX。所述样本在14000×g下离心15分钟,用分光光度计在OD 490nm下对有机相(最低的相)测量DOX。
用DOX-脂质体处理22Rv1异种移植物。带有2周大22Rv1常位异种移植物(肿瘤体积一般为约250mm3)的裸鼠接受每天静脉内注射DOX-脂质体(1或3mg DOX/kg)或PBS,联合每天静脉内注射2μmol/kgiRGD、环化(-RGDfK-,SEQ ID NO:40)或PBS。在所述处理期间每4天对所述小鼠称一次重。17天处理之后,所述小鼠被心脏灌注,并且收集组织。对所述肿瘤称重,如本研究他处所描述对心脏样本进行组织学处理。
对赫赛汀定量的竞争性ELISA。所述ELISA基于赫赛汀和生物素化人IgG之间的竞争性结合原理。当进行测量时每次都产生标准曲线。对于标准曲线,用多种浓度的赫赛汀(范围为0.01至10μg/ml)和终浓度为1μg/ml的生物素化人IgG(Rockland Immunochemicals,Gilbertsville,PA)的混合物孵育5μg/ml兔抗人IgG(SouthernBiotech)包被的微量滴定孔。在室温下孵育2小时后,用含有0.01%Tween 20的PBS清洗所述孔,加入链霉亲和素缀合的辣根过氧化物酶,在室温下孵育30分钟。捕获在所述微量滴定孔上的生物素化人IgG的量用2,2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2-azino-bis(3-etylbenzthiazoline-6-sulfonic acid))作为底物定量,并且测量405nm下的吸光度。通过相对于赫赛汀浓度对吸光度作图绘制标准曲线,并将其用于计算组织提取物中赫赛汀的浓度。在相同的竞争性ELISA系统中通过用组织提取物替换所述标准赫赛汀样本来测量进入所述BT474异种移植物和组织的赫赛汀的量。如下制备所述组织提取物。接受赫赛汀注射的BT474肿瘤小鼠的组织在1ml的0.1M甘氨酸pH2和1%Tween-20以及蛋白酶抑制剂(Complete MiniEDTA-free;RocheApplied Science)中均质化,之后进行离心(4℃,10min,14000rpm)。收集600微升上清液,加入150μl的1M Tris pH8和50μl的5M NaCl。
用赫赛汀处理BT474异种移植物。对携带BT474常位异种移植物(肿瘤体积为约100mm3)的裸鼠每4天用赫赛汀静脉内注射,肿瘤细胞接种后第21天(=图中的第0天)首次注射的赫赛汀浓度为3mg/kg,之后的注射浓度为1.5mg/kg。所述赫赛汀处理与每天注射iRGD或PBS,在赫赛汀注射日注射的iRGD的浓度是4μmol/kg,其他时间是2μmol/kg。在一些组中,使用3倍于所述iRGD-混合物方案中使用剂量的赫赛汀。24天处理之后,所述小鼠被心脏灌注,并且收集组织。使用以下公式计算肿瘤体积:体积(mm3)=(d2×D)/2,其中d是最小肿瘤直径,而D是最大肿瘤直径(Karmali et al.,2009)。
离体肿瘤穿入测定(肿瘤浸渍测定)。PPC1人前列腺皮下肿瘤(直径约1cm)被切下并且保持在含有表达iRGD或G7(SEQ ID NO:38)肽的109pfu/ml T7噬菌体和各抑制剂的DMEM中。在4℃下首先用所述抑制剂孵育所述肿瘤20分钟。将所述噬菌体加至所述溶液中,将所述肿瘤在37℃或4℃下继续孵育90分钟。在孵育之后,用含有1%BSA的冷DMEM清洗肿瘤,将其固定、切片、免疫荧光染色并且用共聚焦显微镜观察。
统计学分析。通过双尾Student’s t检验或者单因素方差分析(ANOVA),之后用合适的事后检验来分析数据。结果总结在表5中。
在整个该说明书中,提及多种出版物。这些出版物的公开内容全文在此以引用的方式纳入本申请中,目的是更充分地描述本发明所属技术领域的现有技术。
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必须注意,除非上下文另有明确说明,否则如本文和所附的权利要求所使用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物。因此,例如,提及“a peptide”包括多种这样的肽,提及“the peptide”是指一种或多种肽和本领域技术人员已知的等价物,如此类推。
“任选的”或“任选地”是指其后描述的事件、情况或材料可能发生或存在,也可能不发生或存在,所述描述包括所述事件、情况或材料发生或者存在的情况,也包括所述事件、情况或材料不发生或者不存在的情况。
范围在本文中被表达为从“约”一个具体值并且/或者至“约”另一个具体值。当表达这样的范围时,除非上下文另有明确说明,否则还明确地考虑并认为公开了从所述一个具体值并且/或者至所述另一个具体值的范围。类似地,当数值通过使用先行词“约”被表达为近似值时,应理解,除非上下文另有明确说明,否则所述具体值形成了另一个明确考虑的实施方案,应当认为公开了所述实施方案。还应理解,除非上下文另有明确说明,否则每个所述范围的端点在与另一个端点有关和无关时均是有意义的。最后,应理解,除非上下文另有明确说明,包含在明确公开的范围内的所有单个值和值的子范围也被明确地考虑,并且应认为被公开。不管在具体情况下一些或全部这些实施方案是否被明确公开上述均适用。
除非另有定义,本文使用的所有技术术语和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属技术领域的技术人员所一般理解的相同的含义。尽管与本文公开的方法和材料类似或等同的任何方法和材料均可被用于实施和测试本发明的方法和组合物,仍然描述了具体可用的方法、装置和材料。本文引用的出版物和其之所以被引用的材料在此以引用方式明确纳入本文。本文中没有任何内容被解释为承认本发明发明不早于现有发明的这些公开内容。没有承认任何参考文献构成现有技术。对参考文献的讨论陈述它们的作者的观点,申请人保留对所引用的文件的准确性和相关性提出质疑的权利。应该明确地理解,尽管本文引用了很多出版物,这样的引用并不构成承认任何这些文件形成本领域的公知常识的一部分。
在整个该申请的说明书和权利要求书中,单词“包括”以及该词的变体,例如“含有”和“包含”是指“包括但不限于”,并且不意欲排除例如其他添加物、组分、整数或步骤。
应理解,所公开的方法和组合物不限于所描述的具体方法学、方案和试剂,因为它们可以变化。还应理解,本文使用的术语仅是用于描述具体的实施方案,不意欲限制仅由所附权利要求限定的本发明的范围。
本领域技术人员会认识到,或者能够仅使用常规实验查明,本文描述的方法和组合物的具体实施方案有很多等同方案。以下的权利要求书意欲包括这样的等同方案。
Claims (183)
1.一种增强共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:
将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR元件和所述共组合物,从而增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,其中,在暴露所述细胞、组织或者细胞和组织之前,所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或者非共价缔合。
2.一种增强货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织的方法,所述方法包括:
将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于CendR元件和所述货物组合物,从而增强所述货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者细胞和组织,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互之间共价连接或者非共价缔合,其中所述CendR元件是2型CendR元件。
3.权利要求2的方法,还包括:在将所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于所述CendR元件之前,将所述CendR元件连接至所述货物组合物。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中所述CendR元件穿透所述细胞、组织或者细胞和组织。
5.权利要求1-4任一项的方法,其中所述细胞、组织或者细胞和组织在受试者中。
6.权利要求5的方法,其中通过将所述CendR元件和所述共组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件和所述共组合物。
7.权利要求5的方法,其中通过将所述CendR元件和所述货物组合物给予所述受试者使得所述细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件和所述货物组合物。
8.权利要求1-7任一项的方法,其中所述CendR元件与一个或多个辅助分子缔合。
9.权利要求8的方法,其中所述CendR元件与多个辅助分子缔合。
10.权利要求8或9的方法,其中至少一个所述辅助分子与所述CendR元件重叠。
11.权利要求8-10任一项的方法,其中至少一个所述辅助分子不与所述CendR元件重叠。
12.权利要求8-11任一项的方法,其中至少一个所述辅助分子包含RGD肽、iRGD、Lyp-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或它们的结合物。
13.权利要求8-12任一项的方法,其中一个或多个所述辅助分子独立地是归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入肽、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子或它们的结合物。
14.权利要求13的方法,其中一个或多个所述辅助分子是归巢分子。
15.权利要求13的方法,其中一个或多个所述辅助分子是辅助肽。
16.权利要求8-15任一项的方法,其中所述CendR元件选择性地归巢于脑细胞、组织或者脑细胞和组织、肾细胞、组织或者肾细胞和组织、皮肤和腱细胞、组织或者皮肤和腱细胞与组织、肺细胞、组织或者肺细胞和组织、胰腺细胞、组织或者胰腺细胞和组织、肠细胞、组织或者肠细胞和组织、肾上腺细胞、组织或者肾上腺细胞和组织、视网膜细胞、组织或者视网膜细胞和组织、肝细胞、组织或者肝细胞和组织、前列腺细胞、组织或者前列腺细胞和组织、子宫内膜异位细胞、组织或者子宫内膜异位细胞和组织、卵巢细胞、组织或者卵巢细胞和组织、心脏细胞、组织或者心脏细胞和组织、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管或它们的结合。
17.权利要求8-15任一项的方法,其中一个或多个所述辅助分子包含iRGD。
18.权利要求8-17任一项的方法,其中一个或多个所述辅助分子包含Lyp-1肽。
19.权利要求8-18任一项的方法,其中一个或多个所述辅助分子包含iNGR。
20.权利要求8-19任一项的方法,其中一个或多个所述辅助分子包含RGR肽。
21.权利要求8-20任一项的方法,其中所述CendR元件选择性地归巢于肿瘤。
22.权利要求21的方法,其中所述CendR元件选择性地归巢于肿瘤脉管系统。
23.权利要求8-15任一项的方法,其中所述CendR元件选择性地归巢于肺组织。
24.权利要求8-15任一项的方法,其中所述CendR元件选择性地归巢于心脏组织。
25.权利要求1-24任一项的方法,其中所述CendR元件是可活化CendR元件。
26.权利要求25的方法,其中所述可活化CendR元件是可蛋白酶活化CendR元件。
27.权利要求26的方法,其中所述可蛋白酶活化CendR元件可以被丝氨酸蛋白酶、血纤蛋白溶酶、血纤蛋白溶酶原激活剂、尿激酶、前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、羧肽酶、羧肽酶A、谷氨酸特异性羧肽酶、脯氨酸特异性羧肽酶、PSMA或结合物活化。
28.权利要求6或8-27任一项的方法,其中所述CendR元件和所述共组合物被同时给予所述受试者。
29.权利要求28的方法,其中所述CendR元件和所述共组合物在包含所述CendR元件和所述共组合物的单一组合物中给予所述受试者。
30.权利要求6或8-28任一项的方法,其中所述CendR元件和所述共组合物在不同的组合物中给予所述受试者。
31.权利要求6或8-27任一项的方法,其中所述CendR元件和所述共组合物在不同的时间给予所述受试者。
32.权利要求31的方法,其中所述CendR元件和所述共组合物在不同的组合物中给予所述受试者。
33.权利要求30-32任一项的方法,其中所述CendR元件和所述共组合物通过不同的途径给予所述受试者。
34.权利要求1-33任一项的方法,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互结合。
35.权利要求1-34任一项的方法,其中所述共组合物或货物组合物包含治疗剂。
36.权利要求1-35任一项的方法,其中所述共组合物或货物组合物包含检测剂。
37.权利要求1-36任一项的方法,其中所述共组合物或货物组合物包含载体、运载体或者载体和运载体。
38.权利要求1-37任一项的方法,其中所述共组合物或货物组合物包含治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂、或抗血管生成剂、促血管生成剂或它们的结合物。
39.权利要求1-38任一项的方法,其中所述CendR元件被包含在氨基酸序列中。
40.权利要求39的方法,其中所述氨基酸序列被包含在蛋白质或肽中。
41.权利要求1-39任一项的方法,其中所述CendR元件被包含在蛋白质或肽中。
42.权利要求40的方法,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽能被内化进入细胞、穿入组织或者内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能内化进入细胞、穿入组织或者不能被内化进入细胞并且不能穿入组织。
43.权利要求40的方法,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽能穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能穿入组织。
44.权利要求40的方法,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽能被内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能被内化进入细胞并且穿入组织。
45.权利要求39-44任一项的方法,其中所述氨基酸序列能不与所述共组合物缔合而被内化进入细胞、穿入组织或者被内化进入细胞并且穿入组织。
46.权利要求39-44任一项的方法,其中所述氨基酸序列能不与所述货物组合物缔合而被内化进入细胞、穿入组织或者被内化进入细胞并且穿入组织。
47.权利要求39-44任一项的方法,其中所述氨基酸序列能不与所述共组合物缔合而穿入组织。
48.权利要求39-44任一项的方法,其中所述氨基酸序列能不与所述货物组合物缔合而穿入组织。
49.权利要求39-44任一项的方法,其中所述氨基酸序列能不与所述共组合物缔合而被内化进入细胞并且穿入组织。
50.权利要求39-44任一项的方法,其中所述氨基酸序列能不与所述货物组合物缔合而被内化进入细胞并且穿入组织。
51.权利要求39-50任一项的方法,其中所述氨基酸序列是所述蛋白质或肽中唯一的功能性内化元件。
52.权利要求40-51任一项的方法,其中所述蛋白质或肽是环化的。
53.权利要求40-51任一项的方法,其中所述CendR元件在所述蛋白质或肽的C末端。
54.权利要求40-53任一项的方法,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织不被增强。
55.权利要求40-53任一项的方法,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织不被增强。
56.权利要求40-53任一项的方法,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织不被增强。
57.权利要求40-53任一项的方法,其中当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织
58.权利要求40-53任一项的方法,其中当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织。
59.权利要求40-53任一项的方法,其中当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织。
60.权利要求39-59任一项的方法,其中所述氨基酸序列与一个或多个辅助分子缔合。
61.权利要求40-60任一项的方法,其中所述蛋白质或肽与一个或多个辅助分子缔合。
62.权利要求60或61的方法,其中一个或多个所述辅助分子独立地是归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入肽、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子或它们的结合物。
63.权利要求62的方法,其中一个或多个所述辅助分子是归巢分子。
64.权利要求63的方法,其中一个或多个所述归巢分子独立地是RGD肽、iRGD、Lyp-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或结合物。
65.权利要求40-64任一项的方法,其中所述蛋白质或肽包含一种或多种辅助分子。
66.权利要求39-64任一项的方法,其中所述氨基酸序列包含一种或多种辅助肽。
67.权利要求65或66的方法,其中一个或多个所述辅助肽独立地是归巢肽、靶向分子、亲和配体、细胞穿入肽、内体逃逸肽、亚细胞靶向肽、核靶向肽或结合物。
68.权利要求67的方法,其中一个或多个所述辅助分子是归巢分子。
69.权利要求68的方法,其中一个或多个所述归巢分子独立地是RGD肽、iRGD、Lyp-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或它们的结合物。
70.权利要求61-69任一项的方法,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于脑细胞、组织或者脑细胞和组织、肾细胞、组织或者肾细胞和组织、皮肤和腱细胞、组织或者皮肤和腱细胞与组织、肺细胞、组织或者肺细胞和组织、胰腺细胞、组织或者胰腺细胞和组织、肠细胞、组织或者肠细胞和组织、肾上腺细胞、组织或者肾上腺细胞和组织、视网膜细胞、组织或者视网膜细胞和组织、肝细胞、组织或者肝细胞和组织、前列腺细胞、组织或者前列腺细胞和组织、子宫内膜异位细胞、组织或者子宫内膜异位细胞和组织、卵巢细胞、组织或者卵巢细胞和组织、心脏细胞、组织或者心脏细胞和组织、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管或它们的结合。
71.权利要求40-70任一项的方法,其中所述蛋白质或肽包含iRGD。
72.权利要求40-71任一项的方法,其中所述蛋白质或肽包含Lyp-1肽。
73.权利要求40-72任一项的方法,其中所述蛋白质或肽包含iNGR。
74.权利要求40-73任一项的方法,其中所述蛋白质或肽包含RGR肽。
75.权利要求61-74任一项的方法,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于肿瘤。
76.权利要求75的方法,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于肿瘤脉管系统。
77.权利要求61-70任一项的方法,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于肺组织。
78.权利要求61-70任一项的方法,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于心脏组织。
79.权利要求39-78任一项的方法,其中所述氨基酸序列被选择用于内化进入细胞。
80.权利要求39-79任一项的方法,其中所述氨基酸序列被选择用于组织穿入。
81.权利要求39-80任一项的方法,其中所述氨基酸序列被选择用于内化进入细胞和组织穿入。
82.权利要求1-81任一项的方法,其中当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞和组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞和组织。
83.权利要求1-81任一项的方法,其中当组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织。
84.权利要求1-81任一项的方法,其中当细胞和组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织。
85.权利要求1-84任一项的方法,其中所述CendR元件被包含在CendR组合物中。
86.权利要求85的方法,其中所述CendR组合物包含一种或多种辅助分子。
87.权利要求85或86的方法,其中所述CendR组合物包含一种或多种货物组合物。
88.权利要求85-87任一项的方法,其中所述CendR组合物包含一种或多种归巢分子。
89.权利要求1-84任一项的方法,其中所述CendR元件被包含在CendR缀合物中。
90.权利要求89的方法,其中所述CendR缀合物包含一种或多种辅助分子。
91.权利要求89或90的方法,其中所述CendR缀合物包含一种或多种货物组合物。
92.权利要求1-91任一项的方法,其中所述CendR缀合物包含一种或多种归巢分子。
93.权利要求1-92任一项的方法,其中所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于多个辅助分子。
94.权利要求1-93任一项的方法,其中所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于多个归巢分子。
95.权利要求1-94任一项的方法,其中所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于多个货物组合物。
96.权利要求1-95任一项的方法,其中所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于多个CendR元件。
97.权利要求1-96任一项的方法,其中所述细胞、组织或者细胞和组织暴露于多个共组合物。
98.一种包含CendR元件和共组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物没有相互共价连接或非共价缔合。
99.一种包含CendR元件和货物组合物的组合物,其中所述CendR元件和所述货物组合物相互共价连接或非共价缔合,其中所述CendR元件是2型CendR元件。
100.权利要求98或99的组合物,其中所述CendR元件与一个或多个辅助分子缔合。
101.权利要求100的组合物,其中所述CendR元件与多个辅助分子缔合。
102.权利要求100或101的组合物,其中至少一个所述辅助分子与所述CendR元件重叠。
103.权利要求100-102任一项的组合物,其中至少一个所述辅助分子不与所述CendR元件重叠。
104.权利要求100-103任一项的组合物,其中至少一个所述辅助分子包含RGD肽、iRGD、Lyp-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或它们的结合物。
105.权利要求100-104任一项的组合物,其中一个或多个所述辅助分子独立地是归巢分子、靶向分子、亲和配体、细胞穿入分子、内体逃逸分子、亚细胞靶向分子、核靶向分子或它们的结合物。
106.权利要求105的组合物,其中一个或多个所述辅助分子是归巢分子。
107.权利要求105的组合物,其中所述一个或多个所述辅助分子是辅助肽。
108.权利要求100-107任一项的组合物,其中所述CendR元件选择性地归巢于脑细胞、组织或者脑细胞和组织、肾细胞、组织或者肾细胞和组织、皮肤和腱细胞、组织或者皮肤和腱细胞与组织、肺细胞、组织或者肺细胞和组织、胰腺细胞、组织或者胰腺细胞和组织、肠细胞、组织或者肠细胞和组织、肾上腺细胞、组织或者肾上腺细胞和组织、视网膜细胞、组织或者视网膜细胞和组织、肝细胞、组织或者肝细胞和组织、前列腺细胞、组织或者前列腺细胞和组织、子宫内膜异位细胞、组织或者子宫内膜异位细胞和组织、卵巢细胞、组织或者卵巢细胞和组织、心脏细胞、组织或者心脏细胞和组织、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管或它们的结合。
109.权利要求100-107任一项的组合物,其中一个或多个所述辅助分子包含iRGD。
110.权利要求100-109任一项的组合物,其中一个或多个所述辅助分子包含Lyp-1肽。
111.权利要求100-110任一项的组合物,其中其中一个或多个所述辅助分子包含iNGR。
112.权利要求100-111任一项的组合物,其中一个或多个所述辅助分子包含RGR肽。
113.权利要求100-112任一项的组合物,其中所述CendR元件选择性地归巢于肿瘤。
114.权利要求113的组合物,其中所述CendR元件选择性地归巢于肿瘤脉管系统。
115.权利要求100-107任一项的组合物,其中所述CendR元件选择性地归巢于肺组织。
116.权利要求100-107任一项的组合物,其中所述CendR元件选择性地归巢于心脏组织。
117.权利要求98-116任一项的组合物,其中所述CendR元件是可活化CendR元件。
118.权利要求117的组合物,其中所述可活化CendR元件是可蛋白酶活化CendR元件。
119.权利要求118的组合物,其中所述可蛋白酶活化CendR元件可以被丝氨酸蛋白酶、血纤蛋白溶酶、血纤蛋白溶酶原激活剂、尿激酶、前蛋白转化酶、弗林蛋白酶、羧肽酶、羧肽酶A、谷氨酸特异性羧肽酶、脯氨酸特异性羧肽酶、PSMA或结合物活化。
120.权利要求98-119任一项的组合物,其中所述CendR元件和所述共组合物相互没有结合。
121.权利要求98-120任一项的组合物,其中所述共组合物或货物组合物包含治疗剂。
122.权利要求98-121任一项的组合物,其中所述共组合物或货物组合物包含检测剂。
123.权利要求98-122任一项的组合物,其中所述共组合物或货物组合物包含载体、运载体或者载体和运载体。
124.权利要求98-123任一项的组合物,其中所述共组合物或货物组合物包含治疗性蛋白质、治疗性化合物、治疗性组合物、癌症化疗剂、毒素、细胞毒性剂、抗炎剂、抗关节炎剂、生长因子、细胞因子、趋化因子、调节一个或多个信号通路的化合物、抗体、核酸、核酸类似物、细胞、病毒、噬菌体、病毒颗粒、噬菌体颗粒、病毒衣壳、噬菌体衣壳、病毒样颗粒、脂质体、微团、珠、纳米颗粒、微粒、化疗剂、显影剂、成像剂、标签、标记试剂、或抗血管生成剂、促血管生成剂或它们的结合物。
125.权利要求98-124任一项的组合物,其中所述CendR元件被包含在氨基酸序列中。
126.权利要求125的组合物,其中所述氨基酸序列被包含在蛋白质或肽中。
127.权利要求98-125任一项的组合物,其中所述CendR元件被包含在蛋白质或肽中。
128.权利要求126的组合物,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽能被内化进入细胞、穿入组织或者被内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能被内化进入细胞、穿入组织或者不能被内化进入细胞并且不能穿入组织。
129.权利要求126的组合物,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽能穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能穿入组织。
130.权利要求126的组合物,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽能被内化进入细胞并且穿入组织,但是当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述蛋白质或肽不能被内化进入细胞并且穿入组织。
131.权利要求125-130任一项的组合物,其中所述氨基酸序列能不与所述共组合物缔合而被内化进入细胞、穿入组织或者被内化进入细胞并且穿入组织。
132.权利要求125-130任一项的组合物,其中所述氨基酸序列能不与所述货物组合物缔合而被内化进入细胞、穿入组织或者被内化进入细胞并且穿入组织。
133.权利要求125-130任一项的组合物,其中所述氨基酸序列能不与所述共组合物缔合而穿入组织。
134.权利要求125-130任一项的组合物,其中所述氨基酸序列能不与所述货物组合物缔合而穿入组织。
135.权利要求125-130任一项的组合物,其中所述氨基酸序列能不与所述共组合物缔合而被内化进入细胞并且穿入组织。
136.权利要求125-130任一项的组合物,其中所述氨基酸序列能不与所述货物组合物缔合而被内化进入细胞并且穿入组织。
137.权利要求125-136任一项的组合物,其中所述氨基酸序列是所述蛋白质或肽中唯一的功能性内化元件。
138.权利要求126-137任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽是环化的。
139.权利要求126-137任一项的组合物,其中所述CendR元件位于所述蛋白质或肽的C端末端。
140.权利要求126-139任一项的组合物,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过所述细胞、组织或者所述细胞和组织不被增强。
141.权利要求126-139任一项的组合物,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织不被增强。
142.权利要求126-139任一项的组合物,其中当所述氨基酸序列存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织被增强,而当所述氨基酸序列不存在于所述蛋白质或肽中时,所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织不被增强。
143.权利要求126-139任一项的组合物,其中当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或通过细胞、组织或者细胞和组织。
144.权利要求126-139任一项的组合物,其中当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物穿入进入或通过组织。
145.权利要求126-139任一项的组合物,其中当所述CendR元件存在于所述蛋白质或肽中时,增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织,但是当所述CendR元件不存在于所述蛋白质或肽中时,不增强所述共组合物或货物组合物内化和穿入进入或通过细胞和组织。
146.权利要求125-145任一项的组合物,其中所述氨基酸序列与一个或多个辅助分子缔合。
147.权利要求126-146任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽与一个或多个辅助分子缔合。
148.权利要求146或147的组合物,其中一个或多个所述辅助分子独立地是归巢肽、靶向分子、亲和配体、细胞穿透肽、内体逃逸肽、亚细胞靶向肽、核靶向肽或结合物。
149.权利要求148的组合物,其中一个或多个所述辅助分子是归巢分子。
150.权利要求149的组合物,其中一个或多个归巢分子独立地是RGD肽、iRGD、Lyp-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或它们的结合物。
151.权利要求126-150任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽包含一种或多种辅助肽。
152.权利要求125-150任一项的组合物,其中所述氨基酸序列包含一种或多种辅助肽。
153.权利要求151或152的组合物,其中一种或多种所述辅助肽独立地是归巢肽、靶向分子、亲和配体、细胞穿透肽、内体逃逸肽、亚细胞靶向肽、核靶向肽或结合物。
154.权利要求153的组合物,其中一种或多种所述辅助肽是归巢肽。
155.权利要求154的组合物,其中一种或多种所述归巢肽独立地是RGD肽、iRGD、Lyp-1肽、NGR肽、iNGR、RGR肽、HER2结合肽或它们的结合物。
156.权利要求147-155任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于脑细胞、组织或者脑细胞和组织、肾细胞、组织或者肾细胞和组织、皮肤和腱细胞、组织或者皮肤和腱细胞与组织、肺细胞、组织或者肺细胞和组织、胰腺细胞、组织或者胰腺细胞和组织、肠细胞、组织或者肠细胞和组织、肾上腺细胞、组织或者肾上腺细胞和组织、视网膜细胞、组织或者视网膜细胞和组织、肝细胞、组织或者肝细胞和组织、前列腺细胞、组织或者前列腺细胞和组织、子宫内膜异位细胞、组织或者子宫内膜异位细胞和组织、卵巢细胞、组织或者卵巢细胞和组织、心脏细胞、组织或者心脏细胞和组织、肿瘤细胞、肿瘤、肿瘤血管或它们的结合。
157.权利要求126-156任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽包含iRGD。
158.权利要求126-157任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽包含Lyp-1肽。
159.权利要求126-158任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽包含iNGR。
160.权利要求126-159任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽包含RGR肽。
161.权利要求147-160任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于肿瘤。
162.权利要求161的组合物,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于肿瘤脉管系统。
163.权利要求147-156任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于肺组织。
164.权利要求147-156任一项的组合物,其中所述蛋白质或肽选择性地归巢于心脏组织。
165.权利要求125-164任一项的组合物,其中所述氨基酸序列被选择用于内化进入细胞。
166.权利要求125-165任一项的组合物,其中所述氨基酸序列被选择用于组织穿入。
167.权利要求125-166任一项的组合物,其中所述氨基酸序列被选择用于内化进入细胞和组织穿入。
168.权利要求98-166任一项的组合物,其中当细胞、组织或者组织和细胞暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞和组织,但是当细胞、组织或者组织和细胞不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化、穿入或者内化和穿入进入或者通过所述细胞、组织或者细胞和组织。
169.权利要求98-166任一项的组合物,其中当组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织,但是当组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物穿入进入或通过所述组织。
170.权利要求98-166任一项的组合物,其中当细胞和组织暴露于所述CendR元件时,增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织,但是当细胞和组织不暴露于所述CendR元件时,不增强所述共组合物内化和穿入进入或通过所述细胞和组织。
171.权利要求98-170任一项的组合物,其中所述CendR元件被包括在CendR组合物中。
172.权利要求175的组合物,其中所述CendR组合物包含一种或多种辅助分子。
173.权利要求175或172的组合物,其中所述CendR组合物包含一种或多种货物组合物。
174.权利要求175-173任一项的组合物,其中所述CendR组合物包含一种或多种归巢分子。
175.权利要求98-170任一项的组合物,其中所述CendR元件被包括在CendR缀合物中。
176.权利要求175的组合物,其中所述CendR缀合物包含一种或多种辅助分子。
177.权利要求175或176的组合物,其中所述CendR缀合物包含一种或多种货物组合物。
178.权利要求98-177任一项的组合物,其中所述CendR缀合物包含一种或多种归巢分子。
179.权利要求98-178任一项的组合物,其中所述细胞、组织或者细胞和组织被暴露于多个辅助分子。
180.权利要求98-179任一项的组合物,其中所述细胞、组织或者细胞和组织被暴露于多个归巢分子。
181.权利要求98-180任一项的组合物,其中所述细胞、组织或者细胞和组织被暴露于多个货物组合物。
182.权利要求98-181任一项的组合物,其中所述细胞、组织或者细胞和组织被暴露于多个CendR元件。
183.权利要求98-182任一项的组合物,其中所述细胞、组织或者细胞和组织被暴露于多个共组合物。
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