CN113880811A - Fapi二聚体化合物、基于fapi二聚体的肿瘤诊断pet显像剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Fapi二聚体化合物、基于fapi二聚体的肿瘤诊断pet显像剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及FAPI二聚体化合物、基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂及其制备方法和应用。本发明提供的具有式I所示结构的FAPI二聚体化合物中两亲性聚乙二醇链和FAPI的二聚体化结构能够改善化合物的体内动力学特性，延长其在肿瘤内的滞留时间，进而提高其在肿瘤内的摄取和显像效果。通过在FAPI二聚体化合物中标记诊断性核素(68Ga)能够实现精准肿瘤诊断，在PET显像进行诊断以及未来标记治疗性核素(177Lu、90Y)进行治疗FAP‑α表达的肿瘤的药物中具有良好的应用前景。

Description

FAPI二聚体化合物、基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及FAPI二聚体化合物、基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂及其制备方法和应用。
背景技术
进行肿瘤的早诊断、早治疗和个体化综合治疗是降低肿瘤死亡率最有效的措施。精准的影像学诊断技术，尤其是肿瘤分子影像，是实现肿瘤早诊、早治和个体化治疗的关键环节之一。在各种分子影像诊断技术当中，以核医学分子影像技术中的单光子发射计算机断层扫描(SPECT)和正电子发射计算机断层扫描(PET)为代表已在临床上广泛应用。通过放射性核素示踪技术，PET和SPECT能够灵敏、清晰地显示患者体内深部组织的分子影像学特征，为癌症患者的早诊断、早治疗和个体化综合治疗带来了希望。
随着对肿瘤形成机制的不断探索，肿瘤的发生、发展和转移与肿瘤微环境有着十分密切的关系，肿瘤被认为是肿瘤细胞及其周围支持组织或肿瘤基质中不同细胞类型之间不断相互作用的产物。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)是肿瘤微环境中的重要组成部分，其几乎存在于所有实体瘤中的成纤维细胞中，在某些肿瘤间质组织中的比例高达90％，临床研究表明CAFs是乳腺癌、胃癌和肝癌等肿瘤的重要的预后因素。
FAP蛋白是CAFs的关键蛋白，其是一种97-kDa的细胞表面糖蛋白，具有明胶酶和二肽基肽酶活性。整个实体瘤组织中，FAP阳性的CAFs多位于组织的边缘或浸润在肿瘤组织中，在肿瘤免疫调控方面具有重要作用。正常的成纤维细胞不表达或低表达FAP，只是在愈合伤口的组织中短暂出现或在慢性炎症性疾病如肝硬化中表达，使得FAP成为研究肿瘤基质细胞生物学和潜在肿瘤治疗靶标的有吸引力的目标。近年来靶向FAP成像的68Ga-FAPI-46PET/CT在临床肿瘤诊断中的研究进展迅速。虽然68Ga-FAPI-46能迅速进入肿瘤，但是其滞留时间相对较短，导致其在FAP表达不高肿瘤内的摄取以及显像效果不理想。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供FAPI二聚体化合物、基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂及其制备方法和应用，本发明提供的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂在肿瘤内滞留时间长、显像效果好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种FAPI二聚体化合物，具有式I所示的结构：
Figure BDA0003286028150000021
本发明提供了上述技术方案所述的FAPI二聚体化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将化合物1、化合物2、第一缩合试剂和第一有机碱混合，进行第一缩合反应，将得到的缩合产物进行第一脱Boc保护基反应，得到化合物3；
(2)将所述化合物3、化合物4、第二缩合试剂和第二有机碱混合，进行第二缩合反应，将得到的缩合产物进行第二脱Boc保护基反应，得到化合物5；
(3)将所述化合物5、化合物6、第三缩合试剂和第三有机碱混合，进行第三缩合反应，将得到的缩合产物进行脱Fmoc保护基反应，得到化合物7；
(4)将化合物7、化合物8、第四缩合试剂和第四有机碱混合，进行第四缩合反应，将得到的缩合产物进行脱羧酸保护基反应，得到具有式I所示结构的FAPI二聚体化合物；
Figure BDA0003286028150000031
优选的，步骤(1)中，所述化合物2、化合物1、第一缩合试剂和第一有机碱的摩尔比为1：1～5：1～5：2～6；
所述第一缩合反应的温度为25～100℃，时间为4～16h；
所述第一脱Boc保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～5h。
优选的，步骤(2)中，所述化合物3、化合物4、第二缩合试剂和第二有机碱的摩尔比为1：1～5：1～5：2～6；
所述第二缩合反应的温度为25～100℃，时间为4～16h；
所述第二脱Boc保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～3h。
优选的，步骤(3)中，所述化合物5、化合物6、第三缩合试剂和第三有机碱的摩尔比为1：1～3：2～6：5～10；
所述第三缩合反应的温度为25～100℃，时间为4～16h；
所述脱Fmoc保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～3h。
优选的，步骤(4)中，所述化合物7、化合物8、第四缩合试剂和第四有机碱的摩尔比为1：1～5：2～6：5～10；
所述第四缩合反应的温度为25～100℃，时间为1～10h；
所述脱羧酸保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～5h。
优选的，所述第一缩合试剂、第二缩合试剂、第三缩合试剂和第四缩合试剂独立地包括2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或几种；
所述第一有机碱、第二有机碱、第三有机碱和第四有机碱独立地包括有机胺和/或4-二甲氨基吡啶。
本发明提供了一种基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂，包括FAPI二聚体化合物和诊断性核素；
所述诊断性核素包括68Ga；
所述FAPI二聚体化合物为上述技术方案所述的FAPI二聚体化合物或上述技术方案所述制备方法得到的FAPI二聚体化合物。
本发明提供了上述技术方案所述基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂的制备方法，包括以下步骤：
将FAPI二聚体化合物和含诊断性核素溶液混合，将得到混合液的pH值调节至3.3～3.6后进行放射性标记，得到基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂。
本发明还提供了上述技术方案所述的FAPI二聚体化合物、上述技术方案所述制备方法得到的FAPI二聚体化合物、上述技术方案所述的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂或上述技术方案所述制备方法得到的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂在PET显像或制备诊断FAP-α表达的肿瘤的药物中的应用。
本发明提供了一种FAPI二聚体化合物，具有式I所示的结构。本发明提供的FAPI二聚体化合物分子中两亲性聚乙二醇链和FAPI的二聚体化结构能够改善化合物的体内动力学特性，延长其在肿瘤内的滞留时间，在本发明提供的FAPI二聚体化合物上标记诊断性核素后形成PET显像剂，能够提高PET显像剂在肿瘤内的摄取和显像效果，在PET显像诊断FAP-α表达的肿瘤方面具有很好的应用前景。
本发明提供了上述技术方案所述FAPI二聚体化合物的制备方法，本发明提供的制备方法反应路线短，操作简单，制备原料廉价易得，生产成本低，适宜工业化生产。
本发明提供了一种基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂，包括FAPI二聚体化合物和诊断性核素；所述诊断性核素包括68Ga；所述FAPI二聚体化合物为上述技术方案所述的FAPI二聚体化合物或上述技术方案所述制备方法得到的FAPI二聚体化合物。本发明提供的PET显像剂以FAPI二聚体化合物作为载体，该FAPI二聚体化合物在肿瘤内滞留时间长且稳定性性好，使得PET显像剂在肿瘤内的摄取和显像效果优异；通过在FAPI二聚体化合物中标记诊断性核素，从而能够实现肿瘤的精准诊断，在PET显像、制备诊断FAP-α表达的肿瘤的药物以及未来标记治疗性核素(177Lu、90Y)治疗FAP-α表达的肿瘤的药物中具有良好的应用前景。如实施例结果所示，本发明提供的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂与PBS或胎牛血清(FBS)共孵育4h后68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer未见明显分解，放射化学纯度大于90％，说明，本发明制备得68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer稳定性优异。本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer与FAP的结合是特异性的，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer中2PEG(3)-FAPI-dimer对受体结合亲和力高且能够被未标记的FAPI-46阻断，说明本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer结合FAP蛋白的特异性良好。此外，68Ga-FAPI-46在FAP呈低表达的肿瘤病灶低摄取(SUVmax 2.7)，而68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在相应病灶的摄取更高(SUVmax 9.8)，较周围肝组织高，具有良好的靶本底比，说明本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer即使在低表达的肿瘤中也较68Ga-FAPI-46具有更好的肿瘤摄取效果。
本发明提供了上述技术方案所述基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂的制备方法。本发明提供的制备方法操作简单，生产成本低，适宜工业化生产。
附图说明
图1为2PEG(3)-FAPI-dimer的合成路线图；
图2为含2PEG(3)-FAPI-dimer反应液的HPLC分析结果图；
图3为为2PEG(3)-FAPI-dimer的LC-MS谱图；
图4为测试例1中HPLC分析放射化学纯度结果；
图5为测试例2中放射性配体结合研究包括细胞摄取、细胞摄取的阻断和FAP结合测定结果，其中，A为肝细胞肝癌(HCC)细胞系Huh7细胞和肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中的成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达结果，B为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46在CAFs中的细胞摄取和阻断实验结果，C为未标记的FAPI-46抑制68Ga-FAPI-46与CAFs上的FAP结合结果，D为未标记的FAPI-46抑制68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer与CAFs上的FAP结合结果；
图6为测试例3中人源肿瘤组织来源移植瘤(PDXs)模型的鉴定结果，其中，A为免疫组织化学染色，B为蛋白免疫印迹图；
图7为测试例4中HCC-PDXs模型中的PET成像研究结果，其中，A为HCC-PDX-1中68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46在注射0.5h、1h、2和4h后的代表性静态PET成像，B为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在心脏、肾脏、肝脏、肌肉和肿瘤组织的动态时间-活动曲线；
图8为测试例4中HCC-PDXs模型中的PET成像研究结果，A为HCC-PDX-2中68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46在注射0.5h、1h、2和4h后的代表性静态PET成像，B为在HCC-PDX-1和HCC-PDX-2中给予竞争性阻断剂和未给予阻断剂再注射68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer1h后具有代表性的静态PET成像；
图9为测试例5中68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在HCC-PDX1模型中的生物分布研究结果，其中，A为注射1h和4h后HCC-PDX-1中68Ga-FAPI-46的体外生物分布，B为注射1h和4h后HCC-PDX-1中有和没有共同注射未标记的FAPI-46作为阻断剂后68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的体外生物分布；
图10为测试例7中甲状腺癌患者对68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer摄取的病灶比较结果，其中，A为68Ga-FAPI-46注射1h后的PET显像结果，B为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer注射1h后的PET显像结果，C为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer注射4h后的PET显像结果，D为对转移淋巴结进行穿刺的苏木精和伊红(H&E)染色和FAP免疫组织化学染色结果；
图11为测试例7中肝细胞肝癌患者对68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer摄取的病灶比较结果，其中，A列为增强MRI图像，B列为CT图像、注射1h后的68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的PET/CT图像，C列为手术组织、苏木精和伊红(H&E)染色以及FAP免疫组织化学染色结果。
具体实施方式
本发明提供了一种FAPI二聚体化合物，具有式I所示的结构：
Figure BDA0003286028150000071
本发明提供了上述技术方案所述的FAPI二聚体化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将化合物1、化合物2、缩合试剂和有机碱混合，进行第一缩合反应，将得到的缩合产物进行第一脱Boc保护基反应，得到化合物3；
(2)将所述化合物3、化合物4、缩合试剂和有机碱混合，进行第二缩合反应，将得到的缩合产物进行第二脱Boc保护基反应，得到化合物5；
(3)将所述化合物5、化合物6、缩合试剂和有机碱混合，进行第三缩合反应，将得到的缩合产物进行脱Fmoc保护基反应，得到化合物7；
(4)将化合物7、化合物8、第四缩合试剂和第四有机碱混合，进行第四缩合反应，将得到的缩合产物进行脱羧酸保护基反应，得到具有式I所示结构的FAPI二聚体化合物；
Figure BDA0003286028150000081
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
本发明将化合物1、化合物2、缩合试剂和有机碱混合，进行第一缩合反应，将得到的缩合产物进行第一脱Boc保护基反应，得到化合物3。
在本发明中，所述第一缩合试剂优选包括2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲(TSTU)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)中的一种或几种；当所述第一缩合试剂为上述物质中的多种时，本发明对各缩合试剂的配比没有特殊要求，任意配比均可。在本发明中，所述第一有机碱优选包括有机胺和/或4-二甲氨基吡啶(DMAP)；所述有机胺优选包括N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和/或三乙胺；当所述有机碱为上述物质中的多种时，本发明对各有机碱的配比没有特殊要求，任意配比均可。在本发明中，所述化合物2、化合物1、第一缩合试剂和第一有机碱的摩尔比优选为1：1～5：1～5：2～6，更优选为1：2～4：2～4：3～5，进一步优选为1：3：3：4。
在本发明中，所述第一缩合反应用有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和二甲基亚砜(DMSO)中的一种或几种；本发明对于所述有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证第一缩合反应顺利进行即可；在本发明的实施例中，所述化合物2的物质的量和有机溶剂的体积比优选为1mmol：3～10mL，更优选为1mmol：5～8mL。
在本发明中，所述第一缩合反应的温度优选为25～100℃，更优选为50～80℃，所述第一缩合反应的时间优选为4～16h，更优选为5～15h。在本发明中，所述第一脱Boc保护基反应优选在酸性条件下进行，具体的，在冰水浴条件下，将酸加入到所述所述缩合产物中进行第一脱Boc保护基反应；所述酸优选包括三氟乙酸(TFA)和/或盐酸溶液，所述盐酸溶液中的溶剂优选为醇，所述醇优选包括甲醇和/或乙醇；所述盐酸溶液的浓度优选为0.5～2mol/L；所述酸的加入方式优选为滴加，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，逐滴加入即可；所述化合物2和酸的摩尔比优选为1：10～20，更优选为1：15～18；所述第一脱Boc保护基反应的温度优选为0～50℃，更优选为10～20℃；所述第一脱Boc保护基反应的时间优选为0.5～5h，更优选为1～2h。在本发明中，所述第一缩合反应和第一脱Boc保护基反应过程中发生的具体反应如图1所示。
所述第一脱Boc保护基反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述第一脱Boc保护基反应得到的反应液的pH值调节至4.5～6.5后进行高效液相色谱(HPLC)纯化，得到化合物3。在本发明中，所述pH值调节采用的碱优选包括氢氧化钠或氢氧化钾；所述碱优选以碱固体或碱溶液形式使用，本发明对于所述碱溶液的浓度没有特殊限定，能够将pH值调节至4.5～6.5即可，所述pH值进一步优选为5～5.5。在本发明中，所述高效液相色谱优选为制备型高效液相色谱；所述高效液相色谱纯化的条件优选包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。
得到化合物3后，本发明将所述化合物3、化合物4、第二缩合试剂和第二有机碱混合，进行第二缩合反应，将得到的缩合产物进行第二脱Boc保护基反应，得到化合物5。
在本发明中，所述第二缩合试剂和第二有机碱的可选种类优选与前述第一缩合试剂和第一有机碱的可选种类相同，在此不再赘述。在本发明中，所述化合物3、化合物4、第二缩合试剂和第二有机碱的摩尔比优选为1：1～5：1～5：2～6，更优选为1：2～4：2～4：3～5，进一步优选为1：3：3：4。
在本发明中，所述第二缩合反应用有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和二甲基亚砜(DMSO)中的一种或几种；本发明对于所述有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证第二缩合反应顺利进行即可；在本发明的实施例中，所述化合物3的物质的量和有机溶剂的体积比优选为1mmol：3～10mL，更优选为1mmol：5～8mL。
在本发明中，所述第二缩合反应的温度优选为25～100℃，更优选为50～80℃，所述第二缩合反应的时间优选为4～16h，更优选为5～15h。在本发明中，所述第二脱Boc保护基反应优选在酸性条件下进行，具体的，在冰水浴条件下，将酸加入到所述所述缩合产物中进行第二脱Boc保护基反应；所述酸优选包括三氟乙酸(TFA)和/或盐酸溶液，所述盐酸溶液中的溶剂优选为醇，所述醇优选包括甲醇和/或乙醇；所述盐酸溶液的浓度优选为0.5～2mol/L；所述酸的加入方式优选为滴加，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，逐滴加入即可；所述化合物3和酸的摩尔比优选为1：10～20，更优选为1：15～18；所述第二脱Boc保护基反应的温度优选为0～50℃，更优选为10～20℃；所述第二脱Boc保护基反应的时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h。在本发明中，所述第二缩合反应和第二脱Boc保护基反应过程中发生的具体反应如图1所示。
所述第二脱Boc保护基反应反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述第二脱Boc保护基反应得到的反应液的pH值调节至4.5～6.5后进行高效液相色谱(HPLC)纯化，得到化合物5。在本发明中，所述pH值调节采用的碱优选包括氢氧化钠或氢氧化钾；所述碱优选以碱固体或碱溶液形式使用，本发明对于所述碱溶液的浓度没有特殊限定，能够将pH值调节至4.5～6.5即可，所述pH值进一步优选为5～5.5。在本发明中，所述高效液相色谱优选为制备型高效液相色谱；所述高效液相色谱纯化的条件优选包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。
得到化合物5后，本发明将将所述化合物5、化合物6、第三缩合试剂和第三有机碱混合，进行第三缩合反应，将得到的缩合产物进行脱Fmoc保护基反应，得到化合物7。
在本发明中，所述第三缩合试剂和第三有机碱的可选种类优选与前述第一缩合试剂和第一有机碱的可选种类相同，在此不再赘述。在本发明中，所述化合物5、化合物6、第三缩合试剂和第三有机碱的摩尔比优选为1：1～3：2～6：5～10，更优选为1：3～5：6～9：6～9，进一步优选为1：2：4：8。
在本发明中，所述第三缩合反应用有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和二甲基亚砜(DMSO)中的一种或几种；本发明对于所述有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证第三缩合反应顺利进行即可；在本发明的实施例中，所述化合物5的物质的量和有机溶剂的体积比优选为1mmol：3～5mL，更优选为1mmol：4mL。
在本发明中，所述第三缩合反应的温度优选为25～100℃，更优选为50～80℃，所述第三缩合反应的时间优选为4～16h，更优选为5～10h。所述第三缩合反应后，本发明优选还包括将所述第三缩合反应得到的反应液浓缩后再进行脱Fmoc保护基反应；本发明对于所述浓缩的方式没有特殊限定，能够将所述反应液中的有机溶剂去除即可。
在本发明中，所述脱Fmoc保护基反应优选在二乙醇胺-三氟乙酸混合试剂(DEA-THF)条件下进行，具体的，在冰水浴条件下，将二乙醇胺-三氟乙酸混合试剂加入到所述所述缩合产物中进行脱Fmoc保护基反应；所述二乙醇胺-三氟乙酸混合试剂中二乙醇胺的浓度优选为10～30wt％，更优选为20～25wt％；所述化合物5的物质的量和二乙醇胺-三氟乙酸混合试剂的体积比优选为1mmol：0.5～3mL，更优选为1mmol：1～2mL；所述二乙醇胺-三氟乙酸混合试剂的加入方式优选为滴加，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，逐滴加入即可；所述脱Fmoc保护基反应的温度优选为0～50℃，更优选为10～20℃；所述脱Fmoc保护基反应的时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h。。在本发明中，所述第三缩合反应和脱Fmoc保护基反应过程中发生的具体反应如图1所示。
所述脱Fmoc保护基反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述脱Fmoc保护基反应得到的反应液的pH值调节至4.5～6.5后进行高效液相色谱(HPLC)纯化，得到化合物7。在本发明中，所述pH值调节采用的碱优选包括氢氧化钠或氢氧化钾；所述碱优选以碱固体或碱溶液形式使用，本发明对于所述碱溶液的浓度没有特殊限定，能够将pH值调节至4.5～6.5即可，所述pH值进一步优选为5～5.5。在本发明中，所述高效液相色谱优选为制备型高效液相色谱；所述高效液相色谱纯化的条件优选包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。
得到化合物7后，本发明将化合物7、化合物8、缩合试剂和有机碱混合，进行第四缩合反应，将得到的缩合产物进行脱羧酸保护基反应，得到具有式I所示结构的FAPI二聚体化合物。
在本发明中，所述第四缩合试剂和第四有机碱的可选种类优选与前述第一缩合试剂和第一有机碱的可选种类相同，在此不再赘述。在本发明中，所述化合物5、化合物6、第三缩合试剂和第三有机碱的摩尔比优选为1：1～3：2～6：5～10，更优选为1：3～5：6～9：6～9，进一步优选为1：2：4：8。
在本发明中，所述第四缩合反应用有机溶剂优选包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)和二甲基亚砜(DMSO)中的一种或几种；本发明对于所述有机溶剂的用量没有特殊限定，能够保证第四缩合反应顺利进行即可；在本发明的实施例中，所述化合物5的物质的量和有机溶剂的体积比优选为1mmol：3～5mL，更优选为1mmol：4mL。
在本发明中，所述第四缩合反应的温度优选为25～100℃，更优选为50～80℃，所述第四缩合反应的时间优选为1～10h，更优选为5～8h。在本发明中，所述脱羧酸保护基反应优选在酸性条件下进行，具体的，在冰水浴条件下，将酸加入到所述所述缩合产物中进行脱羧酸保护基反应；所述酸优选包括三氟乙酸(TFA)和/或盐酸溶液，所述盐酸溶液中的溶剂优选为醇，所述醇优选包括甲醇和/或乙醇；所述盐酸溶液的浓度优选为0.5～2mol/L；所述酸的加入方式优选为滴加，本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，逐滴加入即可；所述化合物2和酸的摩尔比优选为1：10～20，更优选为1：15～18；所述脱羧酸保护基反应的温度优选为0～50℃，更优选为10～20℃；所述脱羧酸保护基反应的时间优选为0.5～5h，更优选为1～2h。在本发明中，所述第四缩合反应和脱羧酸保护基反应过程中发生的具体反应如图1所示。
所述脱羧酸保护基反应后，本发明优选还包括后处理，所述后处理包括：将所述脱羧酸保护基反应得到的反应液的pH值调节至5.5后进行高效液相色谱(HPLC)纯化，得到得到具有式I所示结构的FAPI二聚体化合物。在本发明中，所述pH值调节至5.5采用的碱优选包括氢氧化钠或氢氧化钾；所述碱优选以碱固体或碱溶液形式使用，本发明对于所述碱溶液的浓度没有特殊限定，能够将pH值调节至5.5即可。在本发明中，所述高效液相色谱优选为制备型高效液相色谱；所述高效液相色谱纯化的条件优选包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。
本发明提供了一种基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂，包括FAPI二聚体化合物和诊断性核素；所述诊断性核素包括68Ga；
所述FAPI二聚体化合物为上述技术方案所述的FAPI二聚体化合物或上述技术方案所述制备方法得到的FAPI二聚体化合物。
在本发明中，所述基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂中诊断性核素的注射剂量优选为1.5～3.7MBq/kg，更优选为1.85～2.96MBq/kg。
本发明提供了上述技术方案所述基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂的制备方法，包括以下步骤：
将FAPI二聚体化合物和含诊断性核素溶液混合，将得到混合液的pH值调节至3.3～3.6后进行放射性标记，得到基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂。
在本发明中，所述含诊断性核素溶液包括诊断性核素和盐酸水溶液，所述诊断性核素的浓度优选为296～333MBq/mL；所述盐酸水溶液溶液的浓度优选为0.1～1mol/L，更优选为0.5～0.6mol/L
在本发明中，所述FAPI二聚体化合物和含诊断性核素溶液中诊断性核素的比活度优选为10～40GBq/μmol，更优选为15～37GBq/μmol。
在本发明中，所述混合pH值调节采用的pH值调节剂优选包括乙酸钠和/或盐酸；所述pH值调节剂优选以pH值调节剂水溶液形式使用，所述pH值调节剂水溶液的浓度优选为1～3mol/L，更优选为2～2.5mol/L。本发明对于所述pH值调节剂的用量没有特殊限定，能够将pH值调节至3.3～3.6即可，所述pH值优选为3.4～3.5。
在本发明中，所述放射性标记的温度优选为50～150℃，更优选为85～100℃；所述放射性标记的时间优选为5～30min，更优选为10～15min。在本发明中，以68Ga为例，所述放射性标记过程中发生的反应如下：
Figure BDA0003286028150000141
所述放射性标记后，本发明优选还包括将所述放射性标记得到的体系进行高效液相色谱分离，得到基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂。在本发明中，所述高效液相色谱分离采用的色谱柱优选为C18 Sep-Pak柱(WAT020515，Waters，USA)，所述高效液相色谱分离采用的洗脱剂优选为醇类溶剂，所述醇类溶剂优选为乙醇。
本发明提供了上述技术方案所述的FAPI二聚体化合物、上述技术方案所述制备方法得到的FAPI二聚体化合物、上述技术方案所述的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂或上述技术方案所述制备方法得到的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂在PET显像或制备诊断FAP-α表达的肿瘤的药物中的应用。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
(1)化合物3的合成
将化合物2(500mg，1mmol)和化合物1(Boc-PEG3-OH，338mg，1.1mmol)溶解于3mLDMF中，加入HATU(570mg，1.5mmol)和DIPEA(710mg，5.5mmol)混合，在80℃、搅拌条件下第一缩合反应16h，转移到冰浴中，滴加TFA(1.15mL，15mmol)后在室温、搅拌条件下第一脱Boc保护基反应3h，利用NaOH溶液(浓度为1mol/L)调节至pH值至5.5，通过制备型HPLC纯化，得到化合物3(200mg，纯度为95％)；其中，制备型HPLC纯化的条件包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。化合物2的LC-MS(ESI+)：m/z 689.6[M+H]+,345.4[M+2H]+/2。
(2)化合物5的合成
将化合物3(68.9mg，0.1mmol)和化合物4(56mg，1.1mmol)溶解于1mL DMF中，加入HATU(57mg，0.15mmol)和DIPEA(71mg，0.55mmol)混合，在80℃、搅拌条件下第二缩合反应8h，转移到冰浴中，滴加TFA(0.2mL，1.8mmol)后在室温、搅拌条件下第二脱Boc保护基反应1h后，利用浓度为1M的NaOH溶液调节至pH值至5.5，通过制备型HPLC纯化，得到化合物5(50mg，纯度为95％)；其中，制备型HPLC纯化的条件包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。化合物5的LC-MS(ESI+)：m/z 1039.9[M+H]+，520.5[M+2H]+/2。
(3)化合物7的合成
将化合物5(30mg，0.028mmol)和化合物6(20mg，0.035mmol)溶解于1.5mL DMF，加入HATU(16mg，0.042mmol)和DIPEA(20mg，0.154mmol)混合，在室温、搅拌条件下第三缩合反应6h，减压蒸馏除去DMF，滴加1mL DEA浓度为25wt％DEA-THF混合溶液，在室温、搅拌条件下脱Fmoc保护基反应1h，通过制备型HPLC纯化，得到化合物7(10mg，纯度为95％)；其中，制备型HPLC纯化的条件包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。化合物7的LC-MS(ESI+)：m/z 686.8[M+2H]+/2。
(4)FAPI二聚体化合物2PEG(3)-FAPI-dimer的合成
将化合物7(16mg，0.01mmol)和化合物8(9.5mg，0.011mmol)溶解于1mLDMF中，加入用HATU(5.7mg，0.015mmol)和DIPEA(7.1mg，0.055mmol)混合，在80℃、搅拌条件下第四缩合反应4h，转移到冰浴中，滴加TFA(0.02mL，0.18mmol)后在室温、搅拌条件下脱羧酸保护基反应1h后，利用浓度为5mol/L的NaOH溶液调节至pH值至5.5，将得到的含2PEG(3)-FAPI-dimer反应液进行制备型HPLC纯化，得到FAPI二聚体化合物(简写为2PEG(3)-FAPI-dimer，50mg，纯度为95％)；其中，制备型HPLC纯化的条件包括：流动相A为0.1％TFA-乙腈，流动相B为0.1％TFA-水；洗脱方式为梯度洗脱；所述梯度洗脱的条件为：0～25min，所述流动相A的体积分数由10％增加至90％；所述流动相A和流动相B的流速均为5mL/min。2PEG(3)-FAPI-dimer的LC-MS(ESI+)：m/z 659.3[M+3H]+/3。
(5)基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂(68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer)的合成
将2PEG(3)-FAPI-dimer(50μg，25.3nmol)和4mL68Ga溶液(1.3GBq溶解于0.6mol/L盐酸水溶液中)混合，加入1mL浓度为2.5mol/L的乙酸钠水溶液将pH值调节至3.3～3.6，在100℃放射性标记15min，然后进行HPLC分离，得到基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂(简写为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer)；其中，HPLC分离采用C18 Sep-Pak色谱柱(WAT020515，Waters，USA)，0.5mL乙醇为洗脱剂。
步骤(4)中含2PEG(3)-FAPI-dimer反应液的HPLC分析结果如图2和表1所示：
表1含2PEG(3)-FAPI-dimer反应液的HPLC分析结果
保留时间/min 峰面积 峰高/％ 峰宽(s) 峰面积/％
7.664 16974 0.36 22.000 0.48
8.031 3271 0.10 12.000 0.09
8.290 3545868 99.54 35.000 99.43
由表1和图2可知，目标产物(2PEG(3)-FAPI-dimer)的化学纯度大于99％。
图3为2PEG(3)-FAPI-dimer的LC-MS谱图，由图3可知，产物2PEG(3)-FAPI-dimer的分子量为659.3[M+3H]+/3，即1974.19，为目标产物。
对比例1
按照实施例1步骤(5)的方法制备，与实施例1的区别在于将2PEG(3)-FAPI-dimer替换为FAPI-46，得到68Ga-FAPI-46，其中，FAPI-46购买于希施生物科技(上海)有限公司。
测试例1
稳定性测试
移取20μL实施例1制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer(3.7MBq活度/20μL)的溶液(溶剂为生理盐水)加入到含有100μLFBS的离心管中，在37℃条件下共孵育1h、2h和4h，得到FBS共孵育溶液；取20μLFBS共孵育溶液加入40uL乙腈使蛋白析出，过0.22μm针式滤膜，采用HPLC分析放射化学纯度，测试结果如图4所示。
移取20μL实施例1制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer(3.7MBq活度/20μL)的溶液(溶剂为生理盐水)加入到含有100μLPBS缓冲溶液(pH＝7.4)的离心管中，在37℃条件下共孵育1h、2h和4h，得到PBS共孵育溶液；取20μLPBS共孵育溶液，过0.22μm针式滤膜，采用HPLC分析放射化学纯度，测试结果如图4所示。
其中，HPLC分析条件：C18柱(250×4.6mm，5μm，Thermo)；流动相A为水+0.1％TFA，流动相B为乙腈+0.1％TFA；梯度洗脱条件：0～25min，流动相B体积分数为5～95％，25～30min，流动相B体积分数为95％；30～40min，流动相B体积分数为5％，流动相A和流动相B的流速均为1mL/min。
由图4可知，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在PBS和FBS中孵育后，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer保持完整，未见明显分解，放射化学纯度均大于90％，说明本发明制备得68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer稳定性优异。
测试例2
放射性配体结合研究包括细胞摄取、细胞摄取的阻断和FAP结合测定
人肝细胞肝癌细胞系Huh7购自中国国家实验细胞资源共享平台。肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)由HCC患者手术标本提取。
验证CAFs是高表达FAP的细胞后再进行下一步实验。使用WesternBlot进行测定FAP表达，具体步骤如下：用裂解缓冲液提取细胞蛋白质，每个样品含20μg总蛋白质，通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜(Millipore)上，将PVDF膜与TBST缓冲液(含5％脱脂牛奶)预孵育1h，然后与人FAP抗体(ab207178；Abcam)孵育。用TBST洗涤PVDF膜3次，并用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，使用增强型化学发光检测系统(C280，Azure)进行检测。验证CAFs是高表达FAP的细胞后进行放射性配体结合研究。其中，裂解缓冲液组成：50mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝8)、150mmol/L的NaCl、乙1mmol/L的二胺四乙酸(EDTA)和1％(体积分数)的TritonX-100。
将表达FAP的CAFs接种在24孔板中，使用含有10％(体积分数)FBS的1640培养基，在实验前培养48h至约80～90％的密度。培养基更换为不含FBS的1640培养基。分别将68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer、68Ga-FAPI-46或68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer+11.3nmol FAPI-46(用于封闭实验)添加到24孔板中并孵育，预定间隔时间为10min、30min、60min、90min和120min。FAP结合测定通过放射性标记的化合物与相应未标记的FAPI衍生物(68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer中加入1.27×10-4～10-13mol/L 2PEG(3)-FAPI-dimer，68Ga-FAPI-46中加入2.83×10-4～1×10-13mol/LFAPI-46)共孵育60min后进行测定。半抑制浓度(IC50s)是通过使用GraphPadPrism通过非线性回归拟合数据计算得到。在实验的每个步骤中，细胞用1mLPBS洗涤两次。最后，用0.5mL的1mol/LNaOH水溶液裂解CAFs以进行放射性计数，并在γ计数器中进行检查。每个实验平行重复3次。
放射性配体结合研究包括细胞摄取、细胞摄取的阻断和FAP结合测定测试结果如图5所示。
图5中A为肝癌细胞系Huh7细胞和肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中的成纤维细胞活化蛋白(FAP)表达，使用Western Blot测定；由图5中A可知，CAFs细胞能高度表达FAP，能作为后续实验用细胞。
图5中B为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46在CAFs中的细胞摄取和阻断实验(每组平行实验3次)。由图5中B可知，68Ga-FAPI-46的吸收在孵育10min后达到约1.5％，并在120min前略有增加；68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的吸收模式与68Ga-FAPI-46相似，但吸收值大约是68Ga-FAPI-46单体的两倍。关于细胞摄取阻断实验，FAPI-46前体可以显着阻断68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和FAP之间的结合，表明本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer与FAP的结合是特异性的。
图5中C为未标记的FAPI-46抑制68Ga-FAPI-46与CAFs上的FAP结合结果，由图5中C可知，68Ga-FAPI-46的IC50值为1.60nmol/L。
图5中D为未标记的2PEG(3)-FAPI-dimer抑制68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer与CAFs上的FAP结合结果，由图5中D可知，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的IC50值为3.57nmol/L。
2PEG(3)-FAPI-dimer和FAPI-46的IC50值相仿，表明2PEG(3)-FAPI-dimer对受体结合亲和力的影响很小。
测试例3
人源肿瘤组织来源移植瘤(PDX)模型的鉴定
HCC-PDX1和HCC-PDX2模型进行小鼠的PET成像和生物分布研究，首先进行组织学验证，包括FAP和Ki67的免疫组织化学染色、苏木精和伊红(H&E)染色以及消化肿瘤组织提取蛋白通过WesternBlot检测FAP蛋白表达情况，验证结果如图6所示，其中，A为免疫组织化学染色图，B为蛋白免疫印迹(Western Blot)图。由图6可知，HCC-PDX-1和HCC-PDX-2与原肿瘤FAP、Ki67免疫组化及H&E高度一致，且免疫组化示FAP蛋白阳性表达；WesternBlot结果示HCC-PDX-1和HCC-PDX-2肿瘤组织FAP高度表达。说明，FAP阳性表达，可用于进一步小鼠实验。
测试例4
HCC-PDXs模型中的PET成像研究
将68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46的产物稀释到74MBq/mL的浓度。将7.4MBq的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer或7.4MBq的68Ga-FAPI-46通过尾静脉注射到HCC-PDX模型中(每组平行实验3次)。所有PET扫描均使用Inveon小动物PET扫描仪(SiemensPreclinical Solution，美国)进行。对于动态PET成像，扫描持续时间为60min，重建帧为10×30s、10×60s、10×120s和9×160s。对于10min静态PET成像，采集时间为注射后0.5h、1h、2和4h。对于封闭实验，在注射前将30nmol未标记的FAPI-46添加到68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer溶液(溶剂为生理盐水)中。使用3D OPMAP 256.pPetRcn(Siemens)迭代重建图像，并转换为％ID/g图像。在PET图像上计算肿瘤、肝脏、心脏、肾脏和肌肉中的感兴趣区域(ROI)，以量化放射性信号。测试结果如图7～8所示。
图7中A为HCC-PDX-1中68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46在注射0.5h、1h、2和4h后的代表性静态PET成像，图7中B为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在心脏、肾脏、肝脏、肌肉和肿瘤组织的动态时间-活动曲线。由图7可知，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer较68Ga-FAPI-46在HCC-PDX-1模型中肿瘤组织的摄取更高、滞留更好，两者均在正常器官的摄取低、下降迅速。
图8中A为HCC-PDX-2中68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46在注射0.5h、1h、2和4h后的代表性静态PET成像，图8中B为在HCC-PDX-1和HCC-PDX-2中给予竞争性阻断剂和未给予阻断剂再注射68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer 1h后具有代表性的静态PET成像。由图8可知，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer较68Ga-FAPI-46在HCC-PDX-2模型中肿瘤组织的摄取更高、滞留更好，两者均在正常器官的摄取低、下降迅速。。
由图7～8可知，本发明在两种肝癌的PDX模型中进行显像摄取和阻断实验，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46的对比结果均显示，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer较68Ga-FAPI-46在肿瘤组织的摄取更高、滞留更好，并且能够被未标记的FAPI-46阻断，说明本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer结合FAP蛋白的特异性良好，且更优于68Ga-FAPI-46的肿瘤摄取和滞留。
测试例5
68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在HCC-PDX1模型中的生物分布研究
在生物分布研究中，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer溶液和68Ga-FAPI-46溶液的浓度均为14.8MBq/mL，溶剂为生理盐水。HCC-PDX-1小鼠注射1.48MBq的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer，分别在注射后1h和4h(每个时间点平行实验3次)后分离、称重和分析主要器官和肿瘤。68Ga-FAPI-46组(1.48MBq)和封闭组(1.48MBq68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer+30nmol未标记的FAPI-46)的生物分布也进行了比较。用γ-计数器测定放射性(每min计数，cpm)，测试结果如图9所示。
图9中A为注射1h和4h后HCC-PDX-1中68Ga-FAPI-46的体外生物分布。由图9中A可知，在注射1h后68Ga-FAPI-46主要在肿瘤(4.60±1.12％ID/g)和肾脏(4.42±0.97％ID/g)以及肿瘤到肾脏(T/K)中积累比率为1.05±0.18。注射4h后，血液、心脏、肝脏、肺和脾脏中的68Ga-FAPI-46急剧下降，而肿瘤摄取稳定(3.81±0.18％ID/g)。
图9中B为注射1h和4h后HCC-PDX-1中有和没有共同注射未标记的FAPI-46作为阻断剂后68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的体外生物分布。由图9中B可知，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在HCC-PDX-1小鼠模型肿瘤摄取的1h和4h均高于目前已广泛应用的68Ga-FAPI-46探针。与PET显像发现一致，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46在注射1h后肿瘤摄取量分别为8.97±0.32％ID/g和4.60±1.12％ID/g(P＝0.003)，注射4h后肿瘤摄取量分别为7.61±0.64％ID/g和3.81±0.18％ID/g(P＝0.001)，说明，本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer显示出比68Ga-FAPI-46更高的肿瘤摄取。关于阻断组，在大多数器官中检测到放射性显着降低，并且肿瘤摄取降低最显着(注射1h后从对照组的8.97±0.32降低到阻断组的1.07±0.19％ID/g；注射4h后从对照组的7.61±0.64降低到阻断组的1.14±0.15％ID/g)。
测试例6
68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在健康志愿者体内分布的研究
本实验经厦门大学第一附属医院临床研究伦理委员会批准，所有受试者均签署书面知情同意书。根据受试者体重计算静脉注射68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的剂量(1.8～2.2MBq[0.05～0.06mCi]/kg)。在静脉注射10min、30min、60min和180min后，使用混合PET/CT扫描仪(Discovery MI，GE Healthcare，Milwaukee，WI，USA)获取数据。使用在经轴图像上绘制的感兴趣区域(ROI)自动计算最大标准摄取值(SUVmax)。在注射68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer之前和之后4h收集安全数据，其中包括生命体征(血压、脉搏、呼吸频率和体温)和不良事件。结果显示患者注射68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer后无任何不适症状。使用OLINDA/EXMv.1.1进行时间-活动曲线拟合和随后的剂量计算。三名健康志愿者的剂量学报告和代表性数据如表2所示。
表2健康志愿者剂量学报告和代表性数据
Figure BDA0003286028150000211
Figure BDA0003286028150000221
由表2可知，使用OLINDA计算68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的有效剂量为1.19E-02mSv/MBq(即1.19×10-2mSv/MBq)。有效剂量最高的器官是甲状腺(3.11E-03mSv/MBq)，其次是肝脏(1.65E-03mSv/MBq)和肺(1.36E-03mSv/MBq)。说明，本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的有效剂量与68Ga-FAPI-02(1.80E-02mSv/MBq)和68Ga-FAPI-04(1.64E-02mSv/MBq)相当，但高于68Ga-FAPI-46(7.80E-03mSv/MBq)。
测试例7
68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在肿瘤患者的研究
本实验经厦门大学第一附属医院临床研究伦理委员会批准，所有受试者均签署书面知情同意书。根据患者体重计算静脉注射68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的剂量(1.8～2.2MBq[0.05～0.06mCi]/kg)。癌症患者执行68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer和68Ga-FAPI-46的时间间隔为3天。使用混合PET/CT扫描仪(DiscoveryMI，GE Healthcare，Milwaukee，WI，USA)获取数据。在静脉注射60min后获取PET/CT图像(一名甲状腺癌患者在注射60min和240min后扫描两次)。使用在经轴图像上绘制的感兴趣区域(ROI)自动计算最大标准摄取值(SUVmax)。68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer PET/CT扫描在三名患者静脉给药60min后进行，包括一名鼻咽癌患者(非角化未分化癌，放化疗后广泛扩散的骨转移后进行免疫治疗)、一名甲状腺癌患者(甲状腺乳头状癌、甲状腺全切及淋巴结清扫术后行多个周期的放射性碘治疗)和一名肝细胞肝癌患者(初诊未治疗)。三名癌症患者逐个病灶比较68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的摄取如表3所示。
表3三名癌症患者逐个病灶比较68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的摄取的结果
Figure BDA0003286028150000231
Figure BDA0003286028150000241
由表3可知，在单个病变对比分析中，68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer摄取显着高于68Ga-FAPI-46。
甲状腺癌患者对68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer摄取的病灶比较结果如图10所示，其中，A为68Ga-FAPI-46注射1h后的结果，B为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer注射1h后的结果，C为68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer注射4h后的结果，D为对转移淋巴结进行穿刺的结果。由图10可知，甲状腺癌患者体内68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer主要积累在肿瘤、胰腺、下颌下腺和血池中。由于良好的肿瘤与背景比，可以清楚地显示所有肿瘤病变。注射1h时病变中68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的摄取范围为8.1～39.0，而68Ga-FAPI-46摄取的范围为1.7～24.0。此外，肿瘤中68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的摄取从1h到4h仅略有下降(1h的最大标准化摄取值[SUVmax]：8.1～39.0；4h的SUVmax：6.6～35.0)。对转移淋巴结进行穿刺，H&E染色显示肿瘤组织中CAFs丰富，FAP免疫组化显示FAP强烈表达。
肝细胞肝癌患者对68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer摄取的病灶比较结果如图11所示，其中，A列为增强MRI图像，B列为CT图像、注射1h后的68Ga-FAPI-46和68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer的PET/CT图像，C列为手术组织、苏木精和伊红(H&E)染色以及FAP图像的免疫组织化学染色结果。由图11可知，68Ga-FAPI-46在病灶低摄取(SUVmax 2.7)，而68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer在病灶摄取更高(SUVmax 9.8)，较周围肝组织高，具有良好的靶本底比；手术组织、苏木精和伊红(H&E)染色以及FAP图像的免疫组织化学染色结果表明，FAP在肿瘤基质中呈低表达。说明，本发明制备的68Ga-2PEG(3)-FAPI-dimer即使在低表达的肿瘤中也较68Ga-FAPI-46具有较更好的肿瘤摄取。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种FAPI二聚体化合物，其特征在于，具有式I所示的结构：
Figure FDA0003286028140000011
2.权利要求1所述的FAPI二聚体化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将化合物1、化合物2、第一缩合试剂和第一有机碱混合，进行第一缩合反应，将得到的缩合产物进行第一脱Boc保护基反应，得到化合物3；
(2)将所述化合物3、化合物4、第二缩合试剂和第二有机碱混合，进行第二缩合反应，将得到的缩合产物进行第二脱Boc保护基反应，得到化合物5；
(3)将所述化合物5、化合物6、第三缩合试剂和第三有机碱混合，进行第三缩合反应，将得到的缩合产物进行脱Fmoc保护基反应，得到化合物7；
(4)将化合物7、化合物8、第四缩合试剂和第四有机碱混合，进行第四缩合反应，将得到的缩合产物进行脱羧酸保护基反应，得到具有式I所示结构的FAPI二聚体化合物；
Figure FDA0003286028140000021
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物2、化合物1、第一缩合试剂和第一有机碱的摩尔比为1：1～5：1～5：2～6；
所述第一缩合反应的温度为25～100℃，时间为4～16h；
所述第一脱Boc保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～5h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述化合物3、化合物4、第二缩合试剂和第二有机碱的摩尔比为1：1～5：1～5：2～6；
所述第二缩合反应的温度为25～100℃，时间为4～16h；
所述第二脱Boc保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～3h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述化合物5、化合物6、第三缩合试剂和第三有机碱的摩尔比为1：1～3：2～6：5～10；
所述第三缩合反应的温度为25～100℃，时间为4～16h；
所述脱Fmoc保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～3h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述化合物7、化合物8、第四缩合试剂和第四有机碱的摩尔比为1：1～5：2～6：5～10；
所述第四缩合反应的温度为25～100℃，时间为1～10h；
所述脱羧酸保护基反应的温度为0～50℃，时间为0.5～5h。
7.根据权利要求2～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一缩合试剂、第二缩合试剂、第三缩合试剂和第四缩合试剂独立地包括2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基四氟硼酸脲和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯中的一种或几种；
所述第一有机碱、第二有机碱、第三有机碱和第四有机碱独立地包括有机胺和/或4-二甲氨基吡啶。
8.一种基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂，包括FAPI二聚体化合物和诊断性核素；
所述诊断性核素包括68Ga；
所述FAPI二聚体化合物为权利要求1所述的FAPI二聚体化合物或权利要求2～7任一项所述制备方法得到的FAPI二聚体化合物。
9.权利要求8所述基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂的制备方法，包括以下步骤：
将FAPI二聚体化合物和含诊断性核素溶液混合，将得到混合液的pH值调节至3.3～3.6后进行放射性标记，得到基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂。
10.权利要求1所述的FAPI二聚体化合物、权利要求2～7任一项所述制备方法得到的FAPI二聚体化合物、权利要求8所述的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂或权利要求9所述制备方法得到的基于FAPI二聚体的肿瘤诊断PET显像剂在PET显像或制备诊断FAP-α表达的肿瘤的药物中的应用。
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