KR20210080606A - Ｐｒｒｓ 바이러스 변이체, 유럽형 ｐｒｒｓ 바이러스 ｃｄｎａ 클론, 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 동물 건강 분야에 속하고, 돼지에게 영향을 미치는 바이러스성 질환인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 연구하기 위한 수단, 및 PRRS의 예방, 치료 및 진단을 위한 백신, 치료제 및 진단법의 개발을 위한 수단을 제공한다. 제1 고려사항에서, 본 발명은 신규한 PRRS 바이러스 변이체에 관한 것이고, 제2 고려사항에서는 감염성 유전자형 I (EU) PRRS 바이러스 클론의 게놈을 포함하는 핵산 서열에 관한 것이다. 이에 기초하여, 향상된 특성을 갖는 신규한 PRRS 백신 후보물이 제공된다.

Description

ＰＲＲＳ 바이러스 변이체, 유럽형 ＰＲＲＳ 바이러스 ＣＤＮＡ 클론, 및 이들의 용도{PRRS VIRUS VARIANT, EUROPEAN PRRS VIRUS CDNA CLONE, AND USES THEREOF}
본 발명은 동물 건강 분야에 속한다.
제1 고려사항에서, 본 발명은 신규한 PRRS 바이러스 변이체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 돼지에게 영향을 미치는 바이러스성 질환인 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)를 연구하기 위한 이러한 PRRS 바이러스의 용도에 관한 것이고, PRRS의 예방, 치료 및 진단을 위한 백신, 치료제 및 진단법의 개발에 있어서의 이러한 PRRS 바이러스의 용도에 관한 것이다.
제2 고려사항에서, 본 발명은 감염성 유전자형 I(EU) PRRS 바이러스 클론의 게놈을 포함하는 핵산 서열에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 돼지에서 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 예방하거나 치료하는데 유용한 약독화된 생 바이러스를 생산하기 위한 감염성 유전자형 I PRRS 바이러스 클론의 핵산 서열의 용도에 관한 것이고, PRRS의 예방, 치료 및 진단을 위한 백신, 치료제 및 진단법의 개발에 있어서의 감염성 유전자형 I PRRS 바이러스 클론의 핵산 서열의 용도에 관한 것이다.
상기 2개의 고려사항을 종합하면, 개선된 특성을 지닌 추가의 신규한 PRRS 바이러스가 본 발명의 제3 고려사항 하에 제공된다.
돼지 생식기 및 호흡기 증후구 바이러스(PRRSV)는 바이러스 패밀리 아테리비리데(Arteriviridae)의 구성원이고, 코로나비리데(Coronaviridae)와 함께 바이러스 오더(virus order) 니도비랄레스(Nidovirales)에 속한다. PRRSV는 9개의 개방 판독 프레임(ORF), 즉, ORF1a, ORF1ab, ORF2a, ORF2ab, 및 ORF3 내지 ORF7을 포함하는 약 15킬로베이스(kilobase)의 단일-가닥의 포지티브-센스(positive-sense) RNA 게놈을 갖는 외피 바이러스이다. ORF 1a 및 1ab는 바이러스성 프로테아제 nsp1, nsp2 및 nsp4의 자가-(auto-) 및 트랜스개열(transcleavage)에 의해 바이러스성 비구조적 단백질(nsp)에 프로세싱되는 거대 폴리단백질을 암호화한다(Snijder and Meulenberg, 1998). ORF4는, 바이러스 외피에서 발견되는 주요 당단백질(GP5) 및 2개의 다른 미소한 당단백질(GP2a 및 GP3)에 이어지는 미소한 당단백질(GP4)을 암호화하고, 여기서, 상기 당단백질 모두는 감염성 바이러스 생산에 중요하다.
PRRSV는, 암퇘지에서의 후기 생식 부전 및 성장하는 돼지에서의 호흡기 질환을 야기하는 돼지에서의 경제적으로 가장 중요한 감염성 제제들 중 하나로 여겨진다. 종종, PRRS 감염은, 바이러스의 면역억제 특성에 기여하는 2차 세균 감염에 연루된다. 또한, PRRSV 바이러스혈증은 수주 동안 지속되고, 이어서, 바이러스는 림프 기관에서 여전히 수개월 동안 검출될 수 있고, 이는 숙주의 면역 반응이 바이러스를 제거하는 것이 어렵거나 제거하는 것에 실패하였음을 입증한다(Allende et al., 2000).
뉴클레오타이드 서열 수준에서 약 40%만큼 나뉘는 유사한 임상학적 징후를 야기하는 2개의 별개의 바이러스성 PRRSV 유전자형, 유전자형 I(EU) 및 유전자형 II(US)이 존재한다. 북 아메리카(US) 원형(prototype) 스트레인은 VR-2332이고, 한편, 유럽(EU) 원형 스트레인은 렐리스타드 바이러스이다.
그러나, 제1 고려사항에서, PRRS 바이러스 스트레인은 높은 생물 다양성(biological diversity)을 갖고 개인 농장으로 신속하게 전개되고(Badaoui et al. BMC Veterinary Research 2013, 9:58), 신규한 PRRSV 단리물은, PRRS를 보다 잘 이해하기 위해, 상기 질환을 이의 상이한 형태로 재생성시키기 위해, 비교 시험을 위해, 그리고 PRRS의 예방, 치료 및 진단을 위한 신규한 백신, 의약 및 진단법의 개발을 위한 플랫폼으로서 요구된다.
제2 고려사항에서, PRRS 바이러스의 감염성 cDNA 클론의 증가하는 숫자는 과학계에 입수가능해지고 있고, 이의 대부분은 US형의 바이러스에 기초한다. 그러나, EU형의 경우, 소수의 클론들만이 입수가능하다. 따라서, PRRS를 보다 잘 이해하기 위해, 비교 시험을 위해, 그리고 PRRS의 예방, 치료 및 진단을 위한 신규한 백신, 의약 및 진단법의 개발을 위한 플랫폼으로서 유럽형(유전자형 I) PRRS 바이러스의 신규한 감염성 cDNA 클론에 대한 강력한 필요성이 존재하고, 여기서, cDNA 클론의 사용은 높은 수율의 바이러스 생산을 초래한다. 따라서, PRRS 백신 연구에서 실험적 편리성을 위해, 유전자형 I PRRS 바이러스를 고량으로 생산되게 하는 감염성 cDNA 클론이 필요할 수 있다.
상기 기술적 문제에 대한 해소는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 청구범위에 특성확인된 실시형태들에 의해 달성된다.
따라서, 본 발명은 상이한 양상들 및 실시형태들에서 청구범위에 따라 실행된다.
1. 본 발명의 제1 고려사항
본 섹션에서 상세하게 설명되는 제1 고려사항에 따르면, 본 발명은 놀랍게도 수퇘지에서 중증의 임상 징후를 유도할 수 있는 신규한 PRRS 바이러스의 단리에 기초한다. 이러한 PRRS 바이러스 변이체의 더 근접한 분석은 상기 바이러스의 ORF4 유전자 내의 유의한 결실을 밝혔다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명은 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스로서, 상기 바이러스는 하기 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, PRRS 바이러스에 관한 것이고:
(a) 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질을 포함하는 PRRS 바이러스;
(b) 야생형 유전자형 I PRRS 바이러스의 ORF4 단백질과 비교하여 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이에 위치한 영역에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, PRRS 바이러스, 바람직하게는 유전자형 I PRRS 바이러스;
(c) 야생형 유전자형 II PRRS 바이러스와 비교하여 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스;
(d) 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, PRRS 바이러스, 바람직하게는 유전자형 I PRRS 바이러스(여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드(Lelystad) 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다);
(e) 아미노산 위치 50 내지 67 사이에 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스(여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 PRRS 바이러스 VR2332의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다);
(f) (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 임의의 조합;
추가의 양상에서, 본 발명은 각각 하기 A), B), C), D), E) 및 F)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스에 관한 것이다:
A) PRRS 바이러스의 게놈이, 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, PRRS 바이러스;
B) PRRS 바이러스의 게놈이, 야생형 유전자형 I PRRS 바이러스의 ORF4 단백질과 비교하여, 상기 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이에 위치하는 영역에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, PRRS 바이러스, 바람직하게는 유전자형 I PRRS 바이러스;
C) 유전자형 II PRRS 바이러스의 게놈이, 야생형 유전자형 II PRRS 바이러스와 비교하여, 상기 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스;
D) PRRS 바이러스의 게놈이, 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, PRRS 바이러스, 바람직하게는 유전자형 I PRRS 바이러스(여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다);
E) 유전자형 II PRRS 바이러스의 게놈이, 아미노산 위치 50 내지 67 사이에 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스(여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 PRRS 바이러스 VR2332의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다);
F) A), B), C), D) 및 E)의 임의의 조합.
바람직하게는, 이하에 "본 발명의 PRRS 바이러스"로서도 칭하는 상기 PRRS 바이러스는 단리된 PRRS 바이러스이다.
본 발명의 맥락 내에서, 특히 어구 "영역에 아미노산 잔기들"은 어구 "영역에 위치하는 아미노산 잔기들"과 동등함이 이해되고, 각각, 특히 용어 "아미노산 위치들 사이의 아미노산 잔기들"은 용어 "아미노산 위치들 사이의 영역에 위치하는 아미노산 잔기들"과 상호교환될 수 있음이 이해된다.
추가로 용어 "유전자형 I" 및 "유전자형 II"는 PRRSV의 맥락에서 문헌에 빈번하게 사용되는 용어 "유전자형 1" 및 "유전자형 2"와 또는 "1형" 및 "2형"과 동등함이 이해된다.
따라서, 제1 양상 ((a))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질을 포함하는 PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 ORF4 단백질은 바람직하게는 서열번호 13 내지 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 ORF4 단백질은 예시의 비-제한적 실시형태에서 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
각각, 제1 양상 ((A))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, PRRS 바이러스의 게놈이, 서열번호 1 내지 서열번호 12로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 ORF4 단백질은 바람직하게는 서열번호 13 내지 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 ORF4 단백질은 예시의 비-제한적 실시형태에서 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함한다.
제2 양상 ((b))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, 야생형 유전자형 I PRRS 바이러스의 ORF4 단백질과 비교하여, 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, PRRS 바이러스, 특히, 유전자형 I PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들은 바람직하게는 서열번호 25 및 서열번호 26에 제시된 2개의 아미노산 서열이거나, 바람직하게는 서열번호 29 및 서열번호 30에 제시된 2개의 아미노산 서열이고, 예시의 비-제한적 실시형태에서 상기 ORF4 단백질은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함한다.
각각, 제2 양상 ((B))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, PRRS 바이러스의 게놈이, 야생형 유전자형 I PRRS 바이러스의 ORF4 단백질과 비교하여, 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, PRRS 바이러스, 특히, 유전자형 I PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들은 바람직하게는 서열번호 25 및 서열번호 26에 제시된 2개의 아미노산 서열이거나, 바람직하게는 서열번호 29 및 서열번호 30에 제시된 2개의 아미노산 서열이고, 예시의 비-제한적 실시형태에서 상기 ORF4 단백질은 서열번호 32의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술되는 바와 같이, 비교의 목적을 위해, 야생형 유전자형 I PRRS 바이러스는 원형 유전자형 I 렐리스타드 바이러스인 것이 바람직하다. 렐리스타드 바이러스의 게놈은 서열번호 41의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
제3 양상 ((c))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, 야생형 유전자형 II PRRS 바이러스와 비교하여, 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들은 바람직하게는 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 2개의 아미노산 서열이고, 상기 ORF4 단백질은 예시의 비-제한적 실시형태에서 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다.
각각, 제3 양상 ((C))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, PRRS 바이러스의 게놈이, 야생형 유전자형 II PRRS 바이러스와 비교하여, 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들은 바람직하게는 서열번호 27 및 서열번호 28에 제시된 2개의 아미노산 서열이고, 상기 ORF4 단백질은 예시의 비-제한적 실시형태에서 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 언급되는 바와 같이, 비교의 목적을 위해, 야생형 유전자형 II PRRS 바이러스는 원형 유전자형 II 바이러스 VR2332인 것이 바람직하다. 바이러스 VR2332의 게놈은 서열번호 42의 핵산 서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 맥락에서, 아미노산 잔기들의 결실은 바람직하게는 연속적 아미노산 잔기들의 결실이다. 따라서, 예를 들면, 본원에서 기술되는 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들의 결실은 바람직하게는 9, 10, 11개 또는 그 이상의 연속적 아미노산 잔기들의 결실이고, 각각, 본원에서 기술되는 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들의 결실은 바람직하게는 5, 6, 7개 또는 그 이상의 연속적 아미노산 잔기들의 결실이다.
제4 양상 ((d))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실되거나 바람직하게는 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, PRRS 바이러스, 바람직하게는 유전자형 I PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 비-제한적 예시의 실시형태에서 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 11개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질이다.
각각, 제4 양상 ((D))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, PRRS 바이러스의 게놈이, 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실되거나 바람직하게는 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, PRRS 바이러스, 바람직하게는 유전자형 I PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 비-제한적 예시의 실시형태에서 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 11개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질은 서열번호 34의 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질이다.
본원에서 기술되는 바와 같이, 렐리스타드 바이러스와 관련된 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 전장 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 그러므로, 이러한 맥락에서 언급된 아미노산 위치의 번호매김은 (N-말단) 아미노산 위치 1에 메티오닌 잔기를 포함하는 183개 아미노산 잔기들을 갖는 렐리스타드 단백질의 ORF4 단백질에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 어구 "여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다"는 서열번호 43에 제시된 ORF4 단백질의 서열을 나타낸다.
제5 양상 ((e))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, 아미노산 위치 50 내지 67 사이에 5, 6, 7개 또느 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실되거나 바람직하게는 8, 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 PRRS 바이러스 VR2332의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 비-제한적 예시의 실시형태에서 아미노산 위치 50 내지 67 사이에 7개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질이다.
각각, 제5 양상 ((E))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는, PRRS 바이러스이 게놈이, 아미노산 위치 50 내지 67 사이에 5, 6, 7개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실되거나 바람직하게는 8, 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는, 유전자형 II PRRS 바이러스이고, 여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 PRRS 바이러스 VR2332의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 비-제한적 예시의 실시형태에서 아미노산 위치 50 내지 67 사이에 7개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질은 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 ORF4 단백질이다.
본원에 기술되는 바와 같이, PRRS 바이러스 VR2332와 관련된 아미노산 위치의 번호매김은 PRRS 바이러스 VR2332의 전장 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 그러므로, 이러한 맥락에서 언급된 아미노산 위치의 번호매김은 (N-말단) 아미노산 위치 1에 메티오닌 잔기를 포함하는 178개 아미노산 잔기들을 갖는 VR2332 바이러스의 ORF4 단백질에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 맥락에서 사용되는 어구 "여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 178개의 아미노산 잔기들을 갖는 PRRS 바이러스 VR2332의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다"는 서열번호 44에 제시된 ORF4 단백질의 서열을 나타낸다.
제6 양상 ((f))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는 본원에 기술되는 양상 (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 임의의 조합, 바람직하게는 양상 (a), (b) 및 (d)의 임의의 조합 또는 양상 (a), (c) 및 (e)의 임의의 조합이다. 이러한 맥락 내에서, 특히 어구 "(a), (b), (c), (d) 및 (e)의 임의의 조합" 및 "양상 (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 임의의 조합"은 각각 본원에서 기술되는 (a), (b), (c), (d) 및 (e)의 임의의 PRRS 바이러스의 특성들의 조합을 갖는 PRRS 바이러스를 의미하고, 여기서, 양상 (a), (b) 및/또는 (c)의 임의의 PRRS 바이러스의 특성의 조합 또는 양상 (a), (c) 및 (e)의 임의의 PRRS 바이러스의 특성의 조합이 특히 바람직함이 이해된다.
각각, 제6 양상 ((F))에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는 본원에 기술되는 양상 (A), (B), (C), (D) 및 (E)의 임의의 조합, 바람직하게는 양상 (A), (B) 및 (D)의 임의의 조합 또는 양상 (A), (C) 및 (E)의 임의의 조합이다. 이러한 맥락 내에서, 특히 어구 "(A), (B), (C), (D) 및 (E)의 임의의 조합" 및 "양상 (A), (B), (C), (D) 및 (E)의 임의의 조합"은 각각 본원에서 기술되는 (A), (B), (C), (D) 및 (E)의 임의의 PRRS 바이러스의 특성들의 조합을 갖는 PRRS 바이러스를 의미하고, 여기서, 양상 (A), (B) 및/또는 (D)의 임의의 PRRS 바이러스의 특성의 조합 또는 양상 (A), (C) 및 (E)의 임의의 PRRS 바이러스의 특성의 조합이 특히 바람직함이 이해된다.
본 발명의 PRRS 바이러스는 바람직하게는
- 서열번호 36의 아미노산 서열과 84.5%, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 ORF4 단백질, 또는
- 서열번호 37의 핵산 서열과 83.5% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 ORF4 단백질(여기서, 상기 PRRS 바이러스는 바람직하게는 유전자형 I PRRS 바이러스이다)을 포함하고,
여기서, 상기 PRRS 바이러스는 특히 유전자형 I PRRS 바이러스이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 특히 용어 "서열번호 36의 아미노산과의 서열 동일성"은 각각 용어 "서열번호 36의 길이에 걸친 서열번호 36의 아미노산 서열과의 서열 동일성"과, 또는 서열번호 36의 전체 길이에 걸친 서열번호 36의 아미노산 서열과의 서열 동일성"과 동등함이 이해된다.
추가로, 본원에서 사용되는 바와 같이, 특히 용어 "서열번호 37의 핵산 서열과의 서열 동일성"은 각각 용어 "서열번호 37의 길이에 걸친 서열번호 37의 핵산 서열과의 서열 동일성"과, 또는 서열번호 37의 전체 길이에 걸친 서열번호 37의 핵산 서열과의 서열 동일성"과 동등함이 이해된다.
본 발명의 제1 고려사항의 맥락에서의 서열 동일성은 진행방향 정렬(progressive alignment)에 기초하는 것으로서 이해된다(본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Feng, D. F. and Doolittle, R. F. (1987) Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees. J. Mol. Evol., 25(4):351-360]). 이러한 방법은 서열들을 정렬로 조합하는 것에 기초하고, 이는 결국 다른 서열 또는 정렬과 조합되어 보다 큰 정렬이 형성될 수 있다. 입력 서열이 단일 다중 정렬(single multiple alignment)에 결합될 때까지 상기 절차를 반복한다. 본 발명의 목적을 위해, 서열 동일성 백분율(%)은 소프트웨어 CLC MAIN WORKBENCH 4.1.1(CLC BIO)로 측정한다.
한 예시적이고 비-제한적인 실시형태에서, 본 발명의 PRRS 바이러스는, PRRS 바이러스의 게놈이 서열번호 38의 핵산 서열과 84.5% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자에 의해 암호화되는 RNA 분자를 포함하는, 유전자형 I PRRS이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 특히 용어 "서열번호 38의 핵산 서열과의 서열 동일성"은 각각 "서열번호 38의 길이에 걸친 서열번호 38의 핵산 서열과의 서열 동일성"과, 또는 서열번호 38의 전체 길이에 걸친 서열번호 38의 핵산 서열과의 서열 동일성"과 동등함이 이해된다.
다른 바람직한 양상에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는 수태한 암퇘지에서의 생식기 증상 및/또는 새끼 돼지에서의 호흡기 증상을 유도할 수 있다.
추가의 바람직한 양상에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는 수퇘지에서의 호흡기 증상을 유도할 수 있다.
따라서, 본 발명의 PRRS 바이러스는 바람직하게는 감염성 PRRS 바이러스이다.
본 발명에 따른 용어 "감염성 PRRS 바이러스"는 특히 돼지(swine)를 감염시키는, 관련 질환, 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 야기하는 PRRS 바이러스로서 이해된다.
본 발명의 PRRS 바이러스에 의한 돼지의 상기 감염은 특히 숙주 세포에의 바이러스의 부착, 상기 세포로의 바이러스의 진입, 비리온의 분해(disassembly), 바이러스성 게놈의 복제 및 전사, 바이러스성 단백질의 발현 및 새로운 감염성 바이러스성 입자의 조립 및 방출을 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 추가로 PRRS 바이러스 내에 외인성 RNA를 포함하도록 유전학적으로 변형된 PRRS 바이러스, 바람직하게는 본 발명의 PRRS 바이러스에 관한 것이고, 여기서, 상기 외인성 RNA는 바람직하게는
a) 서열번호 1 내지 서열번호 12 또는 서열번호 13 내지 서열번호 24로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 암호화하는 상기 바이러스의 ORF4 유전자의 영역에;
b) 야생형 유전자형 I PRRS 바이러스의 ORF4 단백질과 비교하여, 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이에 위치하는 영역을 암호화하는 상기 바이러스의 ORF4 유전자의 영역에;
c) 야생형 유전자형 II PRRS 바이러스의 ORF4 단백질과 비교하여, 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이에 위치하는 영역을 암호화하는 상기 바이러스의 ORF4 유전자의 영역에;
d) 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 위치하는 영역을 암호화하는 상기 바이러스의 ORF4 유전자의 영역에(여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다); 또는
e) 아미노산 위치 50 내지 67 사이에 위치하는 영역을 암호화하는 상기 바이러스의 ORF4 유전자의 영역에(여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 PRRS 바이러스 VR2332의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다)
삽입된다.
본원에서 사용되는 용어 "외인성 RNA" 또는 "외인성 핵산 서열"은 특히 외부적 공급원으로부터의, 예를 들면, 재조합 서열로부터의 PRRS 바이러스의 게놈에 도입된 핵산 서열을 나타낸다. 이러한 외부적 공급원의 예로는 PRRSV 유도된 서열뿐만 아니라 비 PRRSV 유도된 서열도 포함된다. 보다 구체적으로, 외인성 핵산 서열의 도입은 각각 비-자연 발생 부분을 갖는 게놈 또는 유전자를 초래한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "외인성 RNA"는 특히 PRRS 바이러스 게놈에서 자연적으로 발견되지 않는 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 이러한 비-자연 발생 부분 또는 자연적으로 발견되지 않는 서열은 또한 각각 하나의 자연 발생 뉴클레오타이드 서열을 다른 자연 발생 뉴클레오타이드 서열에 삽입하는 것의 결과물일 수 있다.
본원에 기술되는 외인성 RNA는 특히 목적하는 에피토프, 생체 반응 조절제, 성장 인자, 인식 서열, 및 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 발현 생성물을 암호화하고, 여기서, 상기 목적하는 에피토프는 바람직하게는 항원 또는 수의 병원체(veterinary pathogen) 또는 독소로부터의 목적하는 에피토프이다.
한 바람직한 실시형태에서, 상기 목적하는 에피토프는 PRRS 바이러스의 ORF5 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드이고, 여기서, PRRS 바이러스의 ORF5 유전자에 의해 암호화되는 상기 펩타이드는 특히 서열번호 39에 제시된 서열의 4개 이상의 연속적 아미노산 잔기들을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 보다 구체적으로는 PRRS 바이러스의 ORF5 유전자에 의해 암호화되는 상기 펩타이드는 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 바람직한 실시형태에서, 상기 목적하는 에피토프는 상이한 PRRS 바이러스 스트레인의 ORF4 단백질(GP4)의 엑토도메인이고, 여기서, 상기 상이한 PRRS 바이러스 스트레인의 GP4의 상기 엑토도메인은 특히 서열번호 40에 제시된 서열의 4개 이상의 연속적 아미노산 잔기들을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 보다 구체적으로 상이한 PRRS 바이러스 스트레인의 GP4의 상기 엑토도메인은 서열번호 40의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본 발명은 추가로 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기술되는 바와 같은 PRRS 바이러스 내에 외인성 RNA를 포함하도록 유전학적으로 변형된 PRRS 바이러스를 제공한다.
또한, 본 발명은 특히 본원에 기술되는 PRRS 바이러스가 동물에게 투여되는 경우에 내재적으로 백신접종 효과를 유도하는 경우 챌린지 바이러스로서 사용하기 위한 PRRS 바이러스를 제공한다.
본 발명의 특히 본 발명의 PRRS 바이러스가 동물에게 투여되는 경우에 백신접종 효과를 유도하지 않는 경우 챌린지 바이러스로서의 본 발명의 PRRS 바이러스의 용도를 추가로 제공한다.
본원에 언급되는 용어 "동물"은 특히 돼지(swine), 보다 구체적으로는 피그(pig), 바람직하게는 가축용 피그를 나타낸다.
바람직하게, PRRS 바이러스는 동물에게 비강내, 근육내, 경구 또는 자궁내 경로를 통해 각각 투여될 예정이거나 투여된다.
또한, 본 발명은 바람직하게는 감염된 동물과 백신접종된 동물 사이의 차이(DIVA)에 대한 검출 마커로서의 본원에 기술되는 PRRS 바이러스의 용도를 제공한다.
추가의 양상에 따르면, 본 발명은 또한 본원에 기술되는 PRRS 바이러스를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이고, 여기서, 상기 DNA 분자는 바람직하게는 단리된 DNA 분자이고/이거나, 상기 DNA 분자는 바람직하게는 서열번호 38의 핵산 서열과 84.5% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 추가로 본원에 기술되는 DNA 분자를 포함하는 DNA 작제물을 제공하고, 여기서, 상기 DNA 작제물은 특히 플라스미드와 같은 DNA 벡터이다. DNA 벡터 또는 플라스미드에 본 발명의 DNA 분자가 삽입될 수 있는 DNA 벡터 또는 플라스미드는 당해 분야 숙련가들에게 인지될 것이다. 본원에 기술되는 DNA 작제물은 바람직하게는 단리된 DNA 작제물이다. 본원에서 사용되는 용어 "DNA 분자를 포함하는"은 특히 용어 "DNA 분자의 서열을 포함하는"과 동등함이 이해된다.
추가로, 본 발명은 본원에 기술되는 DNA 작제물의 RNA 전사물을 제공하고, 여기서, 상기 RNA 전사물은 바람직하게는 단리된 RNA 전사물이다.
또한, 본 발명은 본원에 기술되는 DNA 작제물로 형질감염된 세포를 제공하고, 여기서, 상기 세포는 바람직하게는 단리된 세포이다.
추가로, 본 발명은 본원에서 언급되는 RNA 전사물로 형질감염된 세포를 제공하고, 여기서, 상기 세포는 바람직하게는 단리된 세포이다.
본원에서 언급되는 용어 "세포들" 또는 "세포"는 바람직하게는 포유동물 세포, 특히 돼지 또는 유인원 세포, 예를 들면, MA-104 세포 또는 MARC-145 세포 또는 베로(Vero) 세포를 나타내고, 보다 바람직하게는 용어 "세포들" 또는 "세포"는 PRRS 바이러스의 숙주 세포, 즉, 돼지 대식세포를 나타냄이 이해된다. 따라서, 본원에서 언급되는 세포는 바람직하게는 돼지 세포, 유인원 세포, MA-104 세포, MARC-145 세포, 베로 세포 및 돼지 대식세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
추가의 양상에서, 본 발명은 본원에 기술되는 PRRS 바이러스의 생산 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은 본원에 기술되는 DNA 작제물로 세포를 형질감염시키고, 임의로 세포 및/또는 배지로부터 상기 바이러스를 수거하는 단계를 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본원에 기술되는 PRRS 바이러스를 생산하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은 본원에 기술되는 RNA 전사물로 세포를 형질감염시키고, 임의로 세포 및/또는 배지로부터 상기 바이러스를 수거하는 단계를 포함한다.
본원에 기술되는 핵산/DNA 분자의 생산은 당해 분야 기술 범위 내이고, 그 중에서도 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; 및 Erlich (ed), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York]에 기술되어 있는 재조합 기술에 따라 수행될 수 있고, 상기 문헌들은 전부 본원에 인용에 의해 포함된다.
2. 본 발명의 제2 고려사항
이 섹션에서 상세하게 설명되는 제2 고려사항에 따르면, 본 발명은 한 양상에서 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하고 세포에 형질감염되는 경우에 생 바이러스를 생산할 수 있는 핵산 분자를 제공하고, 여기서, 상기 분자는
- 서열번호 45의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 제1 핵산 서열,
- 상기 제1 핵산 서열의 5' 말단을 플랭킹하고 서열번호 46의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 제2 핵산 서열,
- 상기 제1 핵산 서열의 3' 말단을 플랭킹하고 서열번호 47의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 제3 핵산 서열, 및
- 상기 제3 핵산 서열의 3' 말단을 플랭킹하는 폴리아데닌 뉴클레오타이드 서열
을 포함한다.
바람직하게는,
- 상기 제1 핵산 서열은 서열번호 45의 핵산 서열과 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;
- 상기 제2 핵산 서열은 서열번호 46의 핵산 서열과 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;
- 상기 제3 핵산 서열은 서열번호 47의 핵산 서열과 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;
- 상기 폴리아데닌 뉴클레오타이드 서열은 n개의 아데닌 뉴클레오타이드로 이루어지고, 여기서, n은 1 내지 51 사이의 임의의 정수이고, 여기서, n은 바람직하게는 12, 13 또는 14이다.
본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 DNA 분자이다. 바람직하게, 상기 핵산 분자는 단리된 핵산 분자이다.
본 발명의 맥락 내에서, 특히 용어 "폴리아데닌 뉴클레오타이드 서열"은 각각 용어 "폴리아데닐산 서열" 또는 "폴리 (A) 테일"과 동등함이 이해된다. 본원에 기술되는 용어 "아데닌 뉴클레오타이드(들)"는 특히 용어 "데옥시아데닐레이트(들)"와 동등함이 이해된다.
본원에 기술되는 어구 "…의 5' 말단을 플랭킹하는 뉴클레오타이드 서열"은 특히 어구 "…의 5' 말단과 공유결합적으로 링크된 뉴클레오타이드 서열" 또는 각각 "뉴클레오타이드 서열의 3' 말단 뉴클레오타이드가 …의 5' 말단 뉴클레오타이드와 공유결합적으로 링크된 뉴클레오타이드 서열"과 동등하고, 여기서, 특히 상기 2개의 말단 뉴클레오타이드는 펜토스의 5' 탄소에 부착된 포스페이트 그룹과 인접한 펜토스의 3' 탄소 원자 사이에 공유결합적으로 링크됨이 이해된다.
본원에 기술되는 어구 "…의 3' 말단을 플랭킹하는 뉴클레오타이드 서열"은 특히 어구 "…의 3' 말단과 공유결합적으로 링크된 뉴클레오타이드 서열" 또는 각각 "뉴클레오타이드 서열의 5' 말단 뉴클레오타이드가 …의 3' 말단 뉴클레오타이드와 공유결합적으로 링크된 뉴클레오타이드 서열"과 동등하고, 여기서, 특히 상기 2개의 말단 뉴클레오타이드는 펜토스의 3' 탄소 원자와 인접한 펜토스의 5' 탄소에 부착된 포스페이트 그룹 사이에 공유결합적으로 링크됨이 이해된다.
본원에서 사용되는 어구 "…의 핵산 서열과 100%의 서열 동일성을 갖는"은 각각 어구 "…의 핵산 서열과 동일한" 또는 "…의 핵산 서열로 이루어지는"과 동등함이 추가로 구체적으로 이해된다.
특히 바람직한 양상에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열변호 48의 핵산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 여기서, 상기 핵산 분자는 서열번호 48의 핵산 서열과 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열의 RNA 카피를 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에서 언급되는 용어 "세포들" 또는 "세포"는 바람직하게는 포유동물 세포, 특히 돼지 또는 유인원 세포, 예를 들면, MA-104 세포 또는 MARC-145 세포 또는 베로 세포를 나타내고, 보다 바람직하게는 용어 "세포들" 또는 "세포"는 PRRS 바이러스의 숙주 세포, 즉, 돼지 대식세포를 나타냄이 이해된다. 따라서, 본원에 언급되는 세포는 바람직하게는 돼지 세포, 유인원 세포, MA-104 세포, MARC-145 세포, 베로 세포 및 돼지 대식세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명에 따른 용어 "생 바이러스"는 특히 (불활성화된(사멸된) 바이러스와는 대조적으로) 적절한 대상체를 감염시키는 능력을 갖고/갖거나 바이러스의 감염성이 본래 바이러스와 유사하거나 동일한 PRRS 바이러스로서 이해된다. 특히, 생 바이러스는 이의 본래 숙주 세포를 감염시킬 수 있다.
특히 본 발명의 핵산 분자에 의해 생산된 PRRS 바이러스에 의한 숙주 세포의 상기 감염은 숙주 세포에의 바이러스의 부착, 상기 세포로의 바이러스의 진입, 비리온의 분해, 바이러스성 게놈의 복제 및 전사, 바이러스성 단백질의 발현 및 새로운 감염성 바이러스성 입자의 조립 및 방출을 포함한다. 추가로 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자에 의해 생산된 PRRS 바이러스에 의한 숙주 세포의 상기 감염은 특히 BHK 세포에서 기능성 RNA 분자를 수득하기 위한 cDNA 서열의 전사, 상기 RNA 분자로의 배양된 세포, 바람직하게는 돼지 세포, 유인원 세포, MA-104 세포, MARC-145 세포, 베로 세포 및 돼지 대식세포의 형질감염, 상기 배양된 세포에서의 바이러스성 복조에 의한 생 비리온의 생성, 이러한 비리온의 단리 및 숙주 세포의 감염을 포함한다.
특히, 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하거나, 각각 본 발명의 핵산 분자는 세포에 형질감염되는 경우 약독화된 생 바이러스를 생산할 수 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 핵산 분자는 돼지에서 중증의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 유도할 수 없는 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하거나, 각각 본 발명의 핵산 분자는 세포에 형질감염되는 경우 생 바이러스를 생산할 수 있고, 여기서, 상기 생 바이러스는 맹독성 필드(virulent field) PRRS 바이러스에 의해 야기되는 바와 같은 돼지에서의 중증의 야생형 바이러스-유사 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)를 유도할 수 없다.
한 특정 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 MA104 세포의 감염 후 24시간 이내에 밀리리터(ml)당 적어도 1x105 내지 1x106 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)의 역가에 도달할 수 있는 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하고, 여기서, 상기 MA104 세포는 상기 바이러스로 0.001 내지 0.1의 MOI(감염 다중도)로 감염되는 것이 바람직하다.
특히, 본 발명의 핵산 분자는 MA104 세포의 감염 후 48시간 이내에 밀리리터(ml)당 5x106 내지 1x107 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)의 역가에 도달할 수 있는 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하고, 여기서, 상기 MA104 세포는 상기 바이러스로 0.001 내지 0.1의 MOI(감염 다중도)로 감염되는 것이 바람직하다.
따라서, 본 발명의 핵산 분자는 바람직하게는
0.001 내지 0.1의 MOI(감염 다중도)로,
특히 0.001 또는 0.01 또는 0.1의 MOI로
- 24시간 이내에 밀리리터(ml)당 적어도 5x105 내지 1x106 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)의 역가에 도달할 수 있고/있거나
- 48시간 이내에 밀리리터(ml)당 적어도 5x106 내지 1x107 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)의 역가에 도달할 수 있는
유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화한다.
본원에 기술되는 PRRS 바이러스의 맥락에서, 용어 "유전자형 I"은 PRRSV의 맥락에서 문헌에 빈번하게 사용되는 용어 "유전자형 1" 또는 "1형" 또는 "유럽형(EU)"과 동등함이 이해된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 48에 제시된 핵산 서열과 99.1% 또는 99.2% 이상, 바람직하게는 99.3% 또는 99.4% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 또는 99.6% 이상, 더욱 바람직하게는 99.8% 또는 99.9% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99.95% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 제2 고려사항의 맥락에서 서열 동일성은 뉴클레오타이드 서열들 사이의 쌍별로(pairwise) 측정된 유사성에 기초하는 것으로서 이해된다. 2개의 서열 사이의 동일성 백분율(%)의 측정은 바람직하게는 수학적 알고리즘, 특히, 익히 공지되어 있는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘(Smith and Waterman, M. S. (1981) J Mol Biol, 147(1):195-197)을 이용하여 달성된다. 본 발명의 목적을 위해, 뉴클레오타이드 서열의 서열 동일성 백분율은 25의 갭 개방 페널티(gap open penalty) 및 5의 갭 연장 페널티(gap extension penalty)를 이용한 스미스-워터맨 상동성 연구 알고리즘을 이용하여 측정한다. 스미스-워터맨 상동성 연구 알고리즘은 본원에 인용에 의해 포함되는 문헌[Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489]에 교시된다. 이러한 서열 동일성의 측정은 예를 들면, TimeLogic Version G로부터의 DeCypher Hardware Accelerator를 이용하여 수행할 수 있거나, 서열 동일성은 소프트웨어 CLC MAIN WORKBENCH 4.1.1(CLC BIO)로 측정한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 특히 용어 "서열번호 Y의 핵산 서열과 X% 이상의 서열 동일성을 갖는"(또는 대안으로 용어 "서열번호 Y에 제시된 핵산 서열과 X% 이상의 서열 동일성을 갖는)은 각각 용어 "서열번호 Y의 길이에 걸친 서열번호 Y의 핵산 서열과 X% 이상의 서열 동일성을 갖는" 또는 용어 "서열번호 Y의 전체 길이에 걸친 서열번호 Y의 핵산 서열과 X% 이상의 서열 동일성을 갖는"과 동등함이 이해된다. 이러한 문맥에서, "X"는 95 내지 100의 임의의 수이고, 특히, 95 내지 99로부터 선택되는 임의의 정수이고, "X% 서열 동일성"은 본원에서 언급되는 임의의 서열 동일성 백분율(%)을 나타낸다. 각각, 이러한 맥락에서 "Y"는 1 내지 6으로부터 선택되는 임의의 정수이고, "서열번호 Y"는 본원에서 언급되는 서열번호들 중 임의의 하나를 나타낸다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 서열번호 48의 핵산 서열을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 핵산 분자는 돼지에서의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 유도할 수 없는 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하거나, 각각 본 발명의 핵산 분자는 세포에 형질감염되는 경우 생 바이러스를 생산할 수 있고, 여기서, 상기 감염성 바이러스는 돼지에서 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 유도할 수 없다.
본원에서 사용되는 용어 "돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 유도할 수 없는"은 특히 각각 야생형 PRRS 바이러스와 비교하는 경우 PRRS의 임상 징후의 감소 또는 새끼 돼지에서의 폐 병변, 수태한 암퇘지에서의 생식 부전 및/또는 연장된 PRRSV 바이러스혈증과 같은 PRRSV 감염과 관련된 징후의 감소를 나타낸다. 따라서, 한 양상에서, 돼지에서 PRRS를 유도할 수 없는 유전자형 I PRRS 바이러스는 돼지에게 투여되는 경우에 돼지에게 투여된 야생형 PRRS 바이러스와 비교하여 하나 이상의 감소된 임상 징후를 보여주는 바이러스이다. 본원에 언급되는 용어 "야생형 PRRS 바이러스"는 특히 야생형 유전자형 I PRRS 바이러스를 나타낸다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 DNA 작제물을 제공하고, 여기서, 상기 DNA 작제물은 특히 플라스미드와 같은 DNA 벡터이다. DNA 벡터 또는 플라스미드에 본 발명의 뉴클레오타이드 분자가 삽입될 수 있는 DNA 벡터 또는 플라스미드는 당해 분야 숙련가들에 의해 인지될 것이다. 본원에 기술되는 DNA 작제물은 바람직하게는 단리된 DNA 작제물이다. 본원에서 사용되는 용어 "핵산 분자를 포함하는" 또는 "DNA 분자를 포함하는"은 각각 특히 용어 "핵산 분자의 서열을 포함하는" 또는 "DNA 분자의 서열을 포함하는"과 동등한 것으로 이해된다.
추가로, 본 발명은 본원에 기술되는 DNA 작제물의 RNA 전사물을 제공하고, 여기서, 상기 RNA 전사물은 바람직하게는 단리된 RNA 전사물이다.
또한, 본 발명은 본원에 기술되는 DNA 작제물로 형질감염된 세포를 제공하고, 여기서, 상기 세포는 바람직하게는 단리된 세포이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 세포에 의해 생산된 유전자형 I PRRS 바이러스를 제공하고, 여기서, 상기 유전자형 I PRRS 바이러스는 바람직하게는 단리된 유전자형 I PRRS 바이러스이다.
추가로, 본 발명은 본원에 언급된 RNA 전사물로 형질감염된 세포를 제공하고, 여기서, 상기 세포는 바람직하게는 단리된 세포이다.
따라서, 본 발명은 또한 상기 언급된 세포에 의해 생산된 유전자형 I PRRS 바이러스를 제공하고, 여기서, 상기 유전자형 I PRRS 바이러스는 바람직하게는 단리된 유전자형 I PRRS 바이러스이다.
본 발명은 추가로 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 본 발명의 핵산 분자를 포함하거나 이의 게놈이 본 발명의 핵산 분자에 의해 암호화되는 RNA 분자를 포함하는 유전자형 I PRRS 바이러스를 제공하고, 여기서, 상기 유전자형 I PRRS 바이러스는 바람직하게는 단리된 유전자형 I PRRS 바이러스이다.
다른 양상에서, 본 발명은 유전자형 I PRRS 바이러를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 기술되는 DNA 작제물로 세포를 형질감염시킴을 포함하는, 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 유전자형 I PRRS 바이러를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 본원에 언급되는 RNA 전사물로 세포를 형질감염시킴을 포함하는, 방법을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제 중에 현탁된 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 기술되는 핵산 분자의 생산은 당해 분야 기술 범위 내이고, 그 중에서도 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, et al., 2003, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Innis et al. (eds), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; 및 Erlich (ed), 1994, PCR Technology, Oxford University Press, New York]에 기술되어 있는 재조합 기술에 따라 수행될 수 있고, 상기 문헌들은 전부 본원에 인용에 의해 포함된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 추가로 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 생산하기 위한 본 발명에 따른 핵산 분자의 용도 또는 본원에 기술된 DNA 작제물의 용도에 관한 것이고, 여기서, 상기 핵산 분자에 또는 상기 DNA 작제물에 하나 이상의 돌연변이가 도입된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자에 또는 본원에 기술된 DNA 작제물에 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하는, 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본원에 기술된 하나 이상의 돌연변이는 서열번호 45의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 제1 핵산 서열에 도입된다.
본원에서 기술되는 용어 "약독화된 PRRS 바이러스"는 특히 시험관내에서 그리고/또는 생체내에서, 보다 구체적으로는 민감성(susceptible) 세포주 및/또는 숙주에서 약독화되는 PRRS 바이러스를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주"는 특히 PRRS 바이러스로 감염가능한 동물, 특히 돼지, 보다 구체적으로는 피그, 예를 들면, 가축용 피그를 가리킨다.
본원에서 언급된 "약독화된"은 특히 병원체, 구체적으로 야생형 PRRS 바이러스의 감소된 병독성(virulence)에 관한 것이고, 여기서, "병독성"은 병원성의 정도인 것으로 이해되며, 여기서, "병원성"은 숙주 또는 숙주의 후손(offspring)에서 임상 징후, 예를 들면, 생식 부전을 유도하는 병원체의 능력을 가리킨다.
본원에서 사용되는 용어 "야생형 PRRS 바이러스" 또는 "야생형 PRRSV"는 특히 각각 구체적으로 돼지에서 PRRS를 야기할 수 있는 감염성 병원성 PRRS 바이러스를 가리킨다. 하나의 특히 바람직한 실시형태에서, 용어 "야생형 PRRS 바이러스"는 PRRS 바이러스의 게놈이 RNA 서열을 포함하거나 RNA 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 PRRS 바이러스를 가리키고, 여기서, 상기 RNA 서열 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 41(렐리스타드 바이러스 완전 게놈에 상응함)의 RNA 카피이다.
바람직하게, 본원에 기술되는 상기 하나 이상의 돌연변이는 하나 이상의 점 돌연변이(point mutation) 및/또는 하나 이상의 게놈 결실 및/또는 하나 이상의 삽입을 포함하거나 이들로 이루어진다.
또한, 본 발명은 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 포함하지만, 여기서, 서열번호 45의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 제1 핵산 서열은 암호화된 PRRS 바이러스를 약독화시키고/시키거나 암호화된 PRRS 바이러스를 손상시켜 상기 바이러스에 의해 감염된 세포에 의한 인터페론 I형 생산 및 분비를 억제시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 제공하고, 여기서, 상기 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스는 바람직하게는 단리된 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스이다.
본 발명은 추가로 예를 들면, PRRSV 감염의 임상 징후를 감소시킴으로써, 예를 들면, PRRSV 바이러스혈증의 지속기간을 감소시킴으로써 PRRSV 감염의 임상 징후로부터 동물을 예방하기 위한 의약, 특히, 백신 또는 백신 조성물의 제조를 위한 본원에 기술된 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스의 용도를 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "예방하는" 또는 "감소시키는"은 각각 동물에의 PRRSV 항원, 즉, 본원에 기술되는 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스의 투여를 포함하는 프로세스를 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 여기서, 상기 PRRSV 항원은 상기 동물에게 투여되는 경우 PRRSV에 대한 상기 동물에서의 면역 반응을 유발하거나 유발할 수 있다. 종합해보면, 이러한 치료 결과는 각각 PRRS의 임상 징후의 감소 또는 PRRSV 감염과 관련된 징후의 감소를 초래한다. 보다 구체적으로, 본원에서 사용되는 용어 "예방하는"은 일반적으로 동물이 질환 프로세스(PRRS)를 유도하거나 개시하기 전에 본 발명의 면역원성 조성물에 노출되는 예방 프로세스를 의미한다.
본원에서, "PRRSV 감염의 임상 징후를 감소시키는 것"은 야생형 PRRS 바이러스 감염과 비교하여, 한 그룹에서 감염된 대상체의 수를 감소시키는 것, 감염의 임상 징후를 나타내는 대상체의 수를 감소시키거나 제거하는 것, 또는 대상체에서 존재하는 임의의 임상 징후의 중증도를 감소시키는 것을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 병원체 부하의 임의의 감소, 병원체 쉐딩(shedding), 병원체 전달의 감소, 또는 PRRSV 감염의 전형적인 임의의 임상 징후, 구체적으로 생식 부전 및/또는 폐 병변의 유도의 감소를 나타내야만 한다. 바람직하게, 이들 임상 징후는 본 발명의 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 투여받지 않아 감염될 수도 있는 대상체와 비교하여 상기 조성물을 투여받은 대상체에서 10% 이상 감소된다. 보다 바람직하게, 임상 징후는 본 발명의 조성물을 투여받은 대상체에서 20% 이상, 바람직하게는 30% 이상, 보다 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 더욱 더 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 더 바람직하게는 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 100% 감소된다.
본원에서 언급되는 용어 "대상체"는 특히 동물에 관한 것이다.
본원에서 언급되는 용어 "동물"은 특히 돼지, 보다 구체적으로는 피그, 바람직하게는 가축용 피그를 나타낸다.
용어 "PRRSV 바이러스혈증의 지속기간을 감소시키는 것"은 당해 조성물을 투여받지 않아 야생형 PRRSV에 의해 감염되는 대상체와 비교하여 동물의 혈류에 진입하는 PRRS 바이러스의 지속기간을 1일 이상 감소시키는 것을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
용어 "바이러스혈증"은 예를 들면, 혈청 중의 PRRSV RNA 카피의 검출에 의해 반영되는 바와 같은 감염된 동물의 혈액 중의 PRRSV의 존재를 나타낸다.
또한, 본 발명은 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제 중에 현탁된 본원에 기술되는 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
본원에서 언급되는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제는 용매, 분산 매질, 항원보가제, 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제, 및 흡수 지연제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
바람직한 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 용량당 본원에 기술된 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스의 101 내지 107개의 바이러스 입자, 바람직하게는 용량당 103 내지 106개의 입자, 보다 바람직하게는 용량당 104 내지 106개의 입자의 양을 포함한다.
다른 바람직한 양상에서, 본 발명의 면역원성 조성물은 용량당 적어도 약 103 TCID50/mL, 바람직하게는 용량당 103 내지 105 TCID50/mL의 바이러스 역가와 동등한 본 발명에 따른 PRRS 바이러스의 양을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "백신 조성물"은 특히 당해 조성물에 노출되어온 동물에서 보호성 면역 반응을 유발할 것인 조성물을 말한다. 면역 반응은 항체의 유도 및/또는 T-세포 반응의 유도를 포함할 수 있다.
일반적으로, "면역 반응"으로는 하기 효과들 중 하나 이상이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 목적하는 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 대해 특이적으로 지시되는, 항체, B 세포, 보조 T 세포(helper T cell), 억제제 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생산 또는 활성화. 바람직하게, 숙주는 치료학적 또는 보호성 면역학적 (기억) 반응 중 어느 하나를 나타내어 새로운 감염에 대한 저항성이 향상되고/되거나 당해 질환의 임상 중증도가 감소될 것이다. 이러한 보호는 병원체의 감염과 관련된 임상 징후들 중 하나 이상의 수, 또는 이의 중증도의 감소, 또는 이의 결여, 바이러스혈증 개시의 지연, 감소된 바이러스 지속성, 전체 바이러스 부하의 감소 및/또는 바이러스 분비의 감소에 의해 입증될 것이다.
따라서, "면역 반응"은 특히 목적하는 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개된 면역 반응의 서브세트의 발달을 의미하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
추가로, 본 발명은 예를 들면, PRRSV 감염의 임상 징후를 감소시킴으로써, 예를 들면, PRRSV 바이러스혈증의 지속기간을 감소시킴으로써 PRRSV 감염의 임상 징후로부터 동물을 예방하기 위한 방법에서 사용하기 위한 본 발명의 백신 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 예를 들면, PRRSV 감염의 임상 징후를 감소시킴으로써, 예를 들면, PRRSV 바이러스혈증의 지속기간을 감소시킴으로써 PRRSV 감염의 임상 징후로부터 동물을 예방하기 위한 방법을 제공하고, 여기서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 동물에게 본 발명의 백신을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 제2 고려사항에 따른 실시형태들
하기 항목들도 본원에 기술된다:
1. 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하고 세포에 형질감염되는 경우에 생 바이러스를 생산할 수 있는 핵산 분자로서, 상기 분자는
- 서열번호 45의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 제1 핵산 서열,
- 상기 제1 핵산 서열의 5' 말단을 플랭킹하고 서열번호 46의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 제2 핵산 서열,
- 상기 제1 핵산 서열의 3' 말단을 플랭킹하고 서열번호 47의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는, 제3 핵산 서열, 및
- 상기 제3 핵산 서열의 3' 말단을 플랭킹하는 폴리아데닌 뉴클레오타이드 서열
을 포함하는, 핵산 분자.
2. 항목 1에 있어서,
- 상기 제1 핵산 서열은 서열번호 45의 핵산 서열과 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;
- 상기 제2 핵산 서열은 서열번호 46의 핵산 서열과 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;
- 상기 제3 핵산 서열은 서열번호 47의 핵산 서열과 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 100%의 서열 동일성을 갖고/갖거나;
- 상기 폴리아데닌 뉴클레오타이드 서열은 n개의 아데닌 뉴클레오타이드로 이루어지는(여기서, n은 1 내지 51 사이의 임의의 정수이고, 여기서, n은 12, 13 또는 14인 것이 바람직하다),
핵산 분자.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 바이러스가 약독화되고/되거나 상기 바이러스가 돼지에서 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스로의 감염 후 질환의 호흡기 및/또는 생식기 징후에 대한 보호성 면역 반응을 유도할 수 있는, 핵산 분자.
4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스가 MA104 세포의 감염 후 24시간 내에 밀리리터(ml)당 적어도 5x105 내지 1x106 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)의 역가, 바람직하게는 0.001 내지 0.1의 MOI(감염 다중도)에 도달할 수 있는, 핵산 분자.
5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스가 MA104 세포의 감염 후 48시간 내에 밀리리터(ml)당 적어도 5x106 내지 1x107 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)의 역가, 바람직하게는 0.001 내지 0.1의 MOI(감염 다중도)에 도달할 수 있는, 핵산 분자.
6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자가 서열번호 48의 핵산 서열과 91% 또는 92% 이상, 바람직하게는 93% 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 또는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 또는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자가 서열번호 48의 핵산 서열과 99.1% 또는 99.2% 이상, 바람직하게는 99.3% 또는 99.4% 이상, 보다 바람직하게는 99.5% 또는 99.6% 이상, 더욱 바람직하게는 99.8% 또는 99.9% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99.95% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자가 서열번호 48의 핵산 서열을 포함하는, 핵산 분자.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스가 맹독성 필드 PRRS 바이러스에 의해 야기되는 돼지에서의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS)을 유도할 수 없는, 핵산 분자.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 분자가 DNA 분자인, 핵산 분자.
11. 항목 10에 따른 DNA 분자를 포함하는, DNA 작제물.
12. 항목 11의 DNA 작제물의 RNA 전사물.
13. 항목 11의 DNA 작제물로 형질감염된 세포.
14. 항목 12의 RNA 전사물로 형질감염된 세포.
15. 항목 13의 세포에 의해 생산된 유전자형 I PRRS 바이러스.
16. 항목 14의 세포에 의해 생산된 유전자형 I PRRS 바이러스.
17. 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 핵산 분자를 포함하거나, 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 핵산 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 포함하는, 유전자형 I PRRS 바이러스.
18. 항목 11의 DNA 작제물로 세포를 형질감염시킴을 포함하는, 유전자형 I PRRS 바이러스의 생산 방법.
19. 항목 12의 RNA 전사물로 숙주 세포를 형질감염시킴을 포함하는, 유전자형 I PRRS 바이러스의 생산 방법.
20. 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제 중에 현탁된 항목 1 내지 10 중 어느 한 항의 핵산 분자를 포함하는 조성물.
21. 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 생산하기 위한 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 핵산 분자의 용도 또는 항목 11의 DNA 작제물의 용도로서, 상기 핵산 분자에 또는 상기 DNA 작제물에 하나 이상의 돌연변이가 도입되는, 핵산 분자의 용도 또는 DNA 작제물의 용도.
22. 항목 1 내지 10 중 어느 하나의 핵산 분자에 또는 항목 11의 DNA 작제물에 하나 이상의 돌연변이를 도입하는 단계를 포함하는, 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스의 생산 방법.
23. 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 핵산 분자에 의해 암호화된 RNA 분자를 포함하지만, 여기서, 서열번호 45의 핵산 서열과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 상기 제1 핵산 서열이, 상기 암호화된 PRRS 바이러스를 손상시켜 상기 바이러스에 의해 감염된 세포에 의한 인터페론 I형 생산 및 분비를 억제하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스.
24. PRRSV 감염의 임상 징후로부터 동물을 예방하기 위한 의약의 제조를 위한 항목 21 내지 23 중 어느 하나의 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스의 용도.
25. 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제 중에 현탁된 항목 21 내지 23 중 어느 하나의 약독화된 유전자형 I PRRS 바이러스를 포함하는 백신 조성물.
26. 항목 25에 있어서, PRRSV 감염의 임상 징후로부터 동물을 예방하기 위한 방법에서 사용하기 위한 백신 조성물.
27. 항목 26의 백신 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, PRRSV 감염의 임상 징후로부터 동물을 예방하기 위한 방법.
3. 본 발명의 제3 고려사항
본 섹션에서 상세하게 설명되는 제3 고려사항에 따르면, 본 발명은 본 발명의 제1 고려사항이 본 발명의 제2 고려사항과 조합될 수 있다고 하는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명의 제3 고려사항은 (1) 본 발명의 제1 고려사항의 양상들 및 실시형태들과 (2) 본 발명의 제2 고려사항의 양상들 및 실시형태들의 조합에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 제1 고려사항의 모든 가능한 특성 및 정의, 구체적으로 유전자형 I PRRS 바이러스에 관한 특성 및 정의는 본 발명의 제2 고려사항의 모든 특성 및 정의와 임의로 조합될 수 있다.
따라서, 한 양상에서, 본 발명의 제2 고려사항에 따른 핵산 분자는 청구항 36 내지 청구항 42 중 어느 하나에 인용된 바와 같은 본 발명의 제1 고려사항에 따른 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스를 암호화한다.
따라서, 다른 양상에서, 각각, 본 발명의 제1 고려사항에 따른 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스는 청구항 56 또는 청구항 57에 인용된 바와 같은 본 발명의 제2 고려사항에 따른 핵산 분자에 의해 암호화된다.
따라서, 본 발명의 제1 고려사항의 모든 가능한 양상들의 본 발명의 제2 고려사항의 모든 가능한 양상들과의 조합은 특히 또한 상기 청구항들 및 이에 종속하는 청구항에 의해 반영된다.
추가로, 본 발명은 유전자형 I PRRS 바이러스, 특히 PRRS 바이러스의 게놈이 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하고 세포에 형질감염되는 경우에 생 바이러스를 생산할 수 있는 핵산 분자에 의해 암호화되는, 상기 언급된 PRRS 바이러스에 관한 것이고, 여기서, 상기 분자는 서열번호 48의 핵산 서열과 91% 또는 92% 이상, 바람직하게는 93% 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 또는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 또는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지만, 여기서, 상기 핵산 서열은 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 9, 10, 11개 또는 그 이상의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는 상기 바이러스의 생산을 초래하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
또한, 본 발명은 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하고 세포에 형질감염되는 경우에 생 바이러스를 생산할 수 있는 핵산 분자에 의해 암호화되는 유전자형 I PRRS 바이러스에 관한 것이고, 여기서, 상기 분자는 서열번호 48의 핵산 서열의 핵산 서열과 91% 또는 92% 이상, 바람직하게는 93% 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 또는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 또는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지만, 여기서, 상기 핵산 서열은 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 17개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는 상기 바이러스의 생산을 초래하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
또한, 본 발명은 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 유전자형 I PRRS 바이러스를 암호화하고 세포에 형질감염되는 경우에 생 바이러스를 생산할 수 있는 핵산 분자에 의해 암호화되는 유전자형 I PRRS 바이러스를 고려하고, 여기서, 상기 분자는 서열번호 48의 핵산 서열의 핵산 서열과 91% 또는 92% 이상, 바람직하게는 93% 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 또는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 또는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하지만, 여기서, 상기 핵산 서열은 아미노산 위치 57 내지 69 사이에 13개의 아미노산 잔기들이 결실된 ORF4 단백질을 포함하는 상기 바이러스의 생산을 초래하는 돌연변이를 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
본원에 언급되는 돌연변이는 결실인 것이 바람직하다.
바람직하게, 본 발명의 PRRS 바이러스는 PRRS 바이러스 내에 외인성 RNA를 포함하도록 유전학적으로 변형되고, 여기서 상기 외인성 RNA는 상기 바이러스의 orf4 유전자에 삽입되고, 여기서, 상기 외인성 RNA는 특히 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 위치한 영역을 암호화하는 상기 바이러스의 orf4 유전자의 영역에 삽입되고, 상기 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
다른 바람직한 양상에서, 상기 외인성 RNA는 상기 바이러스의 orf4 유전자에 삽입되고 본 발명의 맥락 내에서 결실된 아미노산 잔기들을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 대체한다.
추가의 바람직한 양상에 따르면, 외인성 RNA는 목적하는 에피토프, 생물학적 반응 조절제, 성장 인자, 인식 서열, 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 발현 생성물을 암호화하고, 여기서, 상기 목적하는 에피토프는 항원 또는 수의 병원체 또는 독소로부터의 목적하는 에피토프인 것이 바람직하다.
특히, 상기 목적하는 에피토프는 PRRS 바이러스의 orf5 유전자에 의해 암호화된 펩타이드이거나 PRRS 바이러스의 orf5 유전자에 의해 암호화된 아미노산 서열이고, 여기서, PRRS 바이러스의 orf5 유전자에 의해 암호화된 상기 펩타이드 또는 아미노산 서열은 바람직하게는 서열번호 39 또는 서열번호 50의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나, 바람직하게는 서열번호 39 또는 서열번호 50에 제시된 서열의 4개 이상의 연속적 아미노산 잔기들을 포함하거나 이들로 이루어지거나, 바람직하게는 서열번호 51 또는 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 바람직한 양상에 따르면, 외인성 RNA는 서열번호 53 내지 서열번호 55로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 아미노산 서열을 암호화한다.
특히 바람직한 양상에서, 본 발명은 비제한적 실시형태로서 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 서열번호 56 내지 서열번호 59 중 어느 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 유전자형 I PRRS 바이러스를 제공한다.
청구항 58 내지 청구항 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스가 단리된 바이러스이고/이거나 상기 돌연변이가 결실인, PRRS 바이러스.
본원에 언급되는 PRRS 바이러스는 바람직하게는 단리된 바이러스 및/또는 비-자연 발생 바이러스이다.
추가로, 본 발명은 유전자형 I PRRS 바이러스에 관한 것이고, 여기서, 상기 바이러스는 아미노산 위치 56에 프롤린 잔기를 갖고/갖거나 아미노산 위치 66에 글루타민 잔기를 갖는 ORF4 단백질을 포함하고, 여기서, 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 여기서, 상기 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 43에 제시된 서열이다.
또한, 본 발명은 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 아미노산 위치 56에 프롤린 잔기를 갖고/갖거나 아미노산 위치 66에 글루타민 잔기를 갖는 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전자형 I PRRS 바이러스에 관한 것이고, 여기서, 아미노산 위치의 번호매김은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 아미노산 서열을 나타내고, 여기서, 상기 바이러스의 게놈은 바람직하게는 핵산 분자에 의해 암호화되고, 여기서, 상기 분자는 서열번호 45 또는 서열번호 48의 핵산 서열의 핵산 서열과 91% 또는 92% 이상, 바람직하게는 93% 또는 94% 이상, 보다 바람직하게는 95% 또는 96% 이상, 더욱 바람직하게는 98% 또는 99% 이상, 그리고 특히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.
유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 아미노산 위치 56에 프롤린 잔기를 갖는 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 이러한 유전자형 I PRRS 바이러스는 예시의 비-제한적 양상에서 PRRS 바이러스의 게놈이 서열번호 58의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 PRRS 바이러스이다.
다른 예시의 비-제한적 양상에서, 유전자형 I PRRS 바이러스의 게놈이 아미노산 위치 66에 글루타민 잔기를 갖는 ORF4 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 이러한 유전자형 I PRRS 바이러스는 PRRS 바이러스의 게놈이 서열번호 57의 핵산 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는 PRRS 바이러스이다.
본 발명의 PRRS 바이러스는 바람직하게는 특히 돼지에서의 돼지 생식기 및 호흡기 증후군의 의약으로서 사용하기 위한 또는 돼지 생식기 및 호흡기 증후군의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 것이고, 여기서, 임의로 상기 바이러스는 각각 동물에게, 특히 돼지에게 비강내, 근육내, 경구 또는 자궁내 경로를 통해 투여될 예정이거나 투여된다.
본 개시에 걸쳐 언급되는 의약은 바람직하게는 백신이다.
다른 양상에 따르면, 본 발명의 PRRS 바이러스는 바람직하게는 감염된 동물과 백신접종된 동물 사이의 차이(DIVA)에 대한 검출 마커로서 사용되는 것이 바람직하다.
다른 추가의 양상에서, 본 발명은 본 발명의 PRRS 바이러스를 암호화하는 DNA 분자에 관한 것이고, 여기서, 상기 DNA 분자는 바람직하게는 서열번호 56 내지 58로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열을 갖는 핵산 분자를 포함한다.
다른 추가의 양상에서, 본 발명은 바람직하게는 상기 DNA 분자를 포함하는 단리된 DNA 작제물에 관한 것이고, 바람직하게는 이의 단리된 RNA 전사물에 관한 것이다.
또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 또한 바람직하게는 상기 DNA 작제물 또는 상기 RNA 전사물로 형질감염된 단리된 세포에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 PRRS 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기서, 상기 방법은 상기 DNA 작제물로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하거나 상기 RNA 전사물로 숙주 세포를 형질감염시키는 단계를 포함한다.
결론적으로, 유전자형 I PRRSV와 같은 PRRS 바이러스의 GP4의 엑토도메인을 암호화하는 서열에 본 발명에 따른 정도로 결실을 삽입하는 능력(possibility)을 갖는 것의 인식은 다수의 이로운 용도들을 제공한다:
- 이러한 인식에 기초한 바이러스는 비경구, 경구, 비강내, 자궁내 감염을 위한 그리고 PRRSV 양성 및 PRRSV 나이브(naive) 및/또는 PRRSV 민감성 종에서의 정자(sperm) 수단에 의한 감염을 위한 챌린지 단리물로서 사용될 수 있다.
- 본 발명은 결실이 각각의 부위에 이미 존재하는지 아닌지에 관계없이 유전자형 II의 PRRSV 스트레인에 대한 각각의 PRRSV 스트레인의 혈청학적 차이에 대한 결실마커 또는 서열 차이(DIVA 개념)에 대한 결실 마커를 제공한다.
- 추가로, 다른 에피토프와 관련하여 또는 다른 에피토프와 조합하여 혈청학적 차이에 대한 결실 마커도 제공된다. 예를 들면, 결실이 없는 PRRS 바이러스는 이러한 에피토프에 대해 지시되는 항체를 이용함으로써, 이들 에피토프(예를 들면, 렐리스타드 GP4 aa60-aa71: 서열번호 43에 포함되는 AAQEKISFGKS)의 완전 또는 부분적 결실을 갖는 PRRS 바이러스와 혈청학적으로 구별될 수 있다. 예를 들면, 이러한 영역/도메인에 결실을 갖는 2개의 PRRS 바이러스는 다른 에피토프와 함께 서로 구별될 수 있다.
본 발명은 추가로 본 발명에 따른 결실이 위치하는 위치(GP4의 엑토도메인)에 바이러스성 RNA 대신에 외인성 RNA의 도입을 위한 삽입 영역/도메인을 제공한다.
상기 삽입은 각종 목적을 위해 그리고 모든 가능한 PRRSV 스트레인에 대해, 또한, 이미 이러한 영역에 작은 결실을 갖는 유전자형 II의 PRRSV 스트레인에 대해 이루어질 수 있다.
외인성 서열의 삽입은 예를 들면, 본원에 기술된 PRRSV 유전자형 I 스트레인 BI EU에서 발생하고 상기 스트레인의 GP4의 엑토도메인을 암호화하는 서열을 아미노산(aa) 서열 aa54-aa70(QSHRASTAQGTTPLRRS(서열번호 40))으로 또는 이의 단축되거나 돌연변이유발된 유도체로 대체할 수 있다.
또한, 면역 반응의 향상을 위해,
a) PRRSV의 다른 유전자/게놈 영역으로부터, 예를 들면 (i) 본원에 기술되는 PRRSV 유전자형 I 스트레인 BI EU의 당단백질 5(aa)를 암호화하는 영역, 예를 들면, 아미노산(aa) aa36-aa52(SSHLQLIYNLTICELNG(서열번호 39))를 또는 이의 단축되거나 돌연변이유발된 유도체를 암호화하는 서열로부터, 또한 적합한 링커(들)를 이용하여, 예를 들면, aa 모티프 GSS를 이용하여; 따라서, 또한 다른 PRRSV 단리물로부터, 예를 들면, PRRSV 유전자형 I 원형 단리물 렐리스타드 또는 따라서 PRRSV의 다른 유전자형으로부터, 예를 들면, PRRSV 유전자형 II 원형 단리물 VR2332로부터;
b) 상기 병원체(들)에 대한 면역 반응을 확립하거나 향상시키기 위해, 다른 병원체로부터, 예를 들면, 다른 돼지 병원체로부터;
c) 또한 a)와 함께 유전학적 또는 혈청학적 양성 마커로서의 비-PRRSV-특이적 T- 또는 B-세포 에피토프로부터;
d) 또한 b)와 함께 a)와 상이한 면역-향상제, 예를 들면, 인터류킨과 같은 사이토카인으로부터
하나 이상의 순차적 T- 또는 B-세포 에피토프를 삽입할 수도 있다.
면역 반응의 향상을 위해, 바이러스의 변원성의 감소를 위한 하나 이상의 순차적 T- 또는 B-세포 에피토프를 삽입할 수도 있다.
도면의 목록
도 1: A. BI EU cDNA 클론으로부터 회수된 감염성 바이러스는 명시야 현미경에 의해 보여지는 바와 같이 MA104 세포에 대해 강한 CPE를 유도하였다. B. BI EU-감염된 MA104 세포의 PRRSV 캡시드 단백질-특이적 면역형광(IF) 염색 .
도 2: MA104 세포에서의 감염성 cDNA 클론 BI EU로부터 회수된 바이러스의 성장.
도 3: 몇몇의 US(II형, 상단) 및 EU(I형, 하단) PRRSV 스트레인의 nsp1β N-말단 도메인(NTD) 아미노산 서열 얼라인먼트. BI EU의 NTD 아미노산 서열은 최하단에 제공된다. 아미노산 R22, PR24, E32, SFP 및 H52는 얼라인먼트 위에 나타내고, nsp1β 동종이량체화에 결정적인 것으로 밝혀졌다(Xue et al., 2010). nsp1β 돌연변이 유발을 위한 표적 영역은 적색 프레임으로 표시된다. SDGRSR 모티프는 PRRSV EU cDNA 클론 LoN94-13을 이용한 WO 2013017570 A1에 기술된 영역에 상응한다.
도 4: BI EU-nsp1β 결실 돌연변이체의 아미노산 서열 얼라인먼트.
도 5: IFN-컴피턴트 MA104 세포에서의 BI EU-nsp1β 결실 돌연변이체의 성장.
도 6: BI EU-nsp1β 결실 돌연변이체 또는 모 BI EU 바이러스로 감염된 MA104 세포의 세포 배양 상청액에서 상이한 시점에 측정된 IFN-β 수준.
도 7: ORF4 단백질 내에 결실 또는 삽입을 지닌 재조합 BI EU 바이러스의 성장 동력학.
도 8: 재조합 바이러스 BI EU-GP5-36-46-AtoC 및 모 바이러스 BI EU에 대한 혈청 중화 시험.
실시예
실시예 1
a) PRRSV의 단리
이전에 PRRSV EU형 검출 PCR에서 양성으로 시험된 혈액 샘플(bS-720789)로부터 PRRSV를 단리하였다. MA104 세포에 대해 바이러스의 단리를 수행하였다. MA104 세포 상에서의 단리된 EU형 PRRSV의 증식 후, 완전 게놈 서열분석을 위한 바이러스 스톡을 슈크로스 쿠션 상에서의 초원심분리, 이어서, RNase 및 DNase 처리에 의해 조제하였다. 마지막으로, 상기 바이러스 스톡으로부터 바이러스성 RNA를 추출하였고, 완전 게놈 서열분석(Roche 454 플랫폼)을 수행하였다. 얻어진 게놈 서열(14 854 뉴클레오타이드)을 렐리스타드 스트레인의 EU형 참조 게놈 서열과 비교하였고, 이는 ORF4에서의 33개 뉴클레오타이드의 결실을 밝혀냈다.
b) 감염
a)의 바이러스로의 수퇘지의 감염은 PRRS의 중증의 임상 징후를 생성시킨다.
실시예 2
a) 신규한 EU형 PRRSV 감염성 cDNA 클론의 생성 및 특성확인
본 실시예는 하기에 "BI DU"라고 명명하는 신규한 EU형 PRRSV 감염성 cDNA 클론의 생성 및 특성확인을 기술한다. BI EU는 약독화된 EU형 PRRSV 스트레인에 기초하지만, 이와 동일한 것은 아니고, 각각 뉴클레오타이드 수준에서 EU 원형 스트레인 렐리스타드 바이러스와 89% 동일하거나 EU형 PRRSV 감염성 cDNA클론 LoN94-13의 PRRSV cDNA 삽입물(WO 2013017568 A1)과 87% 동일하다. BI EU의 cDNA 서열은 서열번호 48에 제공된다.
합성의 캡핑된 전사물을 BHK21 세포에 형질감염시시키고 형질감염된 세포로부터의 세포 배양 상청액을 PRRSV-민감성 MA104 세포로 후속적으로 이동시킨 후 cDNA 클론 BI EU로부터 생 바이러스를 회수하였다. 강한 세포병변 효과(CPE)는 형질감염된 BHK21 세포로부터의 세포 배양 상청액의 MA104 세포로의 이동 후 3 내지 4일 내에 검출가능하였다(도 1 A). 상기 세포를 PRRSV 캡시드 단백질-특이적 모노클로날 항체 SDOW17(Rural Technologies)로 염색한 후, CPE 양성 MA104 세포에서 강한 신호가 검출가능하였지만(도 1 B), 모의(mock) 형질감염된 BHK21 세포의 상청액을 투여받은 세포에서는 검출불가능하였다(도시하지 않음).
BI EU cDNA 클론-유도된 바이러스의 성장을 시험하기 위해, MA104 세포를, 각각 0.001, 0.01 또는 0.1의 감염 다중도(MOI)를 이용하여 회수된 바이러스로 감염시켰다. 감염된 세포의 상청액을 감염 후 0, 24, 48, 72 및 96시간째에 수집하였고, MA104 세포를 함유하는 96-웰 플레이트 상에서 일련의 바이러스 희석물에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. BI EU로부터 회수된 바이러스에 대해 얻어진 성장 곡선은 도 2에 나타낸다.
MA104 세포의 감염에 사용된 MOI와 독립적으로, 바이러스 BI EU는 감염 후 24시간 내에 밀리리터(ml)당 5x105 내지 1x106 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)의 역가에 도달하였다. 역가는 1x106 내지 1x107 TCID50/ml로 감염 후 대략 48시간째에 정점이었고, 이는 MA104 세포에 대한 BI EU 바이러스의 고도로 효율적인 복제를 입증한다.
이러한 발견은 BI EU를 PRRSV 백신 연구를 위한 플랫폼으로서, 예를 들면, 바이러스 감염에 대한 숙주 면역 반응과의 PRRSV 상호작용을 조사하기 위한 다수의 적용들 중 하나로서 사용하는 것을 가능하게 한다.
b) PRRS 백신 연구에서의 신규한 EU형 PRRSV 감염성 cDNA 클론의 사용
PRRSV 감염에 대한 특이적 면역 반응은 중화성 항체의 지연된 유도(Lopez and Osorio, 2004) 및 짧은 세포-매개된 면역 반응(Xiao et al., 2004)에 의해 특성확인한다. 이들 효과는 디코이(decoy) 에피토프의 제시(Ostrowski et al., 2002; Ansari et al., 2006) 및 바이러스성 외피 단백질의 글리칸 차폐(Ansari et al., 2005)와 함께 숙주의 선천적 면역 시스템의 바이러스성 억제에 부분적으로 기여할 수 있음이 통상적으로 받아들여진다. PRRSV 감염은 민감성 세포주(돼지 폐포 대식세포, 원숭이 신장 세포 MARC-145) 및/또는 돼지(Buddaert et al., 1998)에서 I형 인터페론(IFN), (인터페론-α 및 인터페론-β; (Miller et al., 2004)) 또는 II형 IFN, (인터페론-γ; (Meier et al., 2003))의 생산을 유도하지 않거나 단지 약하게 또는 지연적으로 유도함이 입증되어 왔다.
IFN은 바이러스 감염에 대한 효과적인 적응성 면역 반응을 확립하는데 있어서 중요한 역할을 하고, 따라서, 다수의 바이러스들이 숙주의 선천적 면역 시스템의 개시에 대응하기 위한 전략을 개발하여 왔다(Haller and Weber, 2009). 예상되는 PRRSV IFN 길항제(들)를 동정하기 위하여, 목적하는 유전자를 안정하게 발현하는 세포주 또는 단백질-발현 플라스미드로 형질감염된 세포에 기초한 광범위한 스크리닝 분석은 I형 IFN의 유도를 차단하는데 관여하는 nsp1(하기 참조), nsp2(Beura et al., 2010; Li et al., 2010), nsp4(Beura et al., 2010) 및 nsp11(Beura et al., 2010; Shi et al., 2011a)을 포함하는 몇몇의 PRRSV 비구조적 단백질(nsp)을 동정하였다.
nsp1은 PRRSV ORF1a-유도된 폴리단백질 1a의 N-말단에 위치하고, 2개의 다기능성 서브유닛인 nsp1α 및 nsp1β에 프로세싱되고, 이의 각각은 바이러스성 폴리단백질로부터의 자기-방출에 필수적인 파파인-유사 시스테인 프로테아제(PCP) 도메인을 포함한다(den Boon et al., 1995; Chen et al., 2010). nsp1α는 N-말단 아연-집게(zinc-finger) 도메인 및 PCPα 프로테아제 도메인을 포함하고, 한편, nsp1β는 PCPβ를 포함한다. nsp1 서브유닛 nsp1α 및 nsp1β 둘 다에 관해서, 3-차원 결정 구조가 해상되었다(Sun et al., 2009; Xue et al., 2010). 이들 분석에 따르면, nsp1β는 N-말단 도메인(NTD), 링커 도메인(LKD), PCP 도메인(PCP 베타) 및 C-말단 연장(CTE)으로 이루어진다; (Xue et al., 2010). nsp2로부터 nsp1의 C-말단, nsp1β-매개된 개열은 PRRSV US 스트레인에 관한 WYG/AGR 부위에서 발생하거나(Kroese et al., 2008) PRRSV EU 스트레인에 관한 WYG/AAG 부위에서 예측되고(Chen et al., 2010), 한편 nsp1α/nsp1β 개열은 PRRSV US 스트레인에 관한 ECAM/AxVYD 부위에서 발생하거나 PRRSV EU 스트레인에 관한 EEAH/SxVYR 부위에서 예측된다(Chen et al., 2010).
몇몇의 연구는, PRRSV nsp1 및/또는 이의 자가개열-유도된 서브유닛들 nsp1α 및/또는 nsp1β가 IFN 전사를 방해함으로써 I형 IFN 생산을 억제한다는 기계론적 상세설명을 입증하였다(Song et al., 2010; Kim et al., 2010; Chen et al., 2010; Beura et al., 2010). 또한, nsp1β가 인터페론에 대한 세포 반응(인터페론 신호전달)을 방해한다는 것도 입증되었다; (Chen et al., 2010). 또한, PRRSV 감염은 시험관내에서 PRRSV 감염된 세포에서 IFN-α 및/또는 IFN-β 생산을 억제한다는 것이 입증되었고(Kim et al., 2010; Beura et al., 2010), nsp1(서브유닛)의 하위세포 위치선정이 결정되었고(Song et al., 2010; Chen et al., 2010), 단일 단백질 발현 실험과 다른 실험에 의해 얻어진 I형 IFN 억제의 기계론적 양상은 PRRSV로 감염된 세포에서 확인되었다(Shi et al., 2010). 마지막으로, nsp1 단백질 발현에 기초한 nsp1 돌연변이유발 연구는 바이러스성 IFN 억제에 대한 효과를 조사하였다(Shi et al., 2011b).
민감성 세포(MARC145)에서 I형 IFN(IFN-β) 생산을 유도한 nsp1β 유전자에 돌연변이(결실)를 포함한 이전의 생존가능한 PRRSV(EU) 스트레인이 (WO 2013017570 A1에 기술된 바와 같이) 생성되었다.
이러한 또한 상이한 IFN 유도성 바이러스 돌연변이체가 신규한 감염성 클론 BI EU에 기초하여 생성될 수 있는지 여부를 시험하기 위해서, nsp1β 유전자에 결실을 갖는 바이러스의 세트를 고안하였다. 보다 정확하게, 이들 결실은 nsp1β의 N-말단 도메인(NTD)에 위치하였고, 이는 단백질의 동종이량체화에 요구되는 것으로 밝혀졌다(Xue et al., 2010). 도 3은 몇몇의 US 및 EU형 PRRSV 스트레인의 nsp1β 아미노산 서열 정렬을 나타낸다. 표시된 것은 스트랜드를 형성하는 것(청색) 또는 알파 헬릭스(적색)를 형성하는 것으로 예측되는 아미노산이다.
감염성 cDNA 클론 BI EU에 기초하여 10개 nsp1β 결실 돌연변이체를 생성시켰다. 결실은 베타 스트랜드 또는 알파 헬릭스 형성에 관여하지 않는 것으로 예측된 아미노산 및 얼라인먼트에서 분석된 모든 EU형 PRRSV 스트레인 내에 (부분적으로) 보존된 아미노산(도 3의 적색 프레임 표시)을 포함하였다.
nsp1β 유전자에 도입된 결실은 도 4에 나타낸 아미노산 서열 얼라인먼트에 가시화된다. BI EU-nsp1β 결실 돌연변이체는 각각 BI EU-nsp1β-delALEV, BI EU-nsp1β-delEV, BI EU-nsp1β-delLEVL, BI EU-nsp1β-delLE, BI EU-nsp1β-delDD, BI EU-nsp1β-delSDDS, BI EU-nsp1β-delHH, BI EU-nsp1β-delGRSR, BI EU-nsp1β-delRSR 및 BI EU-nsp1β-delSDGRSR로 명명한다.
nsp1β 결실 돌연변이체의 생존력을 시험하기 위해, 각각의 결실을 지닌 BI EU cDNA의 합성 전사물을 BHK21 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터 PRRSV-민감성 MA104 세포로의 세포 배양 상청액의 이동 후, 세포병변 효과(CPE) 및 PRRSV 돌연변이체 생존력을 나타내는 뉴클레오캡시드-특이적 면역형광 염색은 생성된 10개의 nsp1β 결실 돌연변이체 중 9개에 대해 검출가능하였다(도시하지 않음). 이들 발견은 BI EU-nsp1β-delLEVL을 제외하고는 모든 nsp1β 결실 돌연변이체가 생존가능하였음을 입증하였다. 추가로 nsp1β 결실 돌연변이체가 IFN-컴피턴트(IFN-competent) MA104 세포 상에서 높은 역가로 성장할 수 있는지를 분석하기 위해, BI EU 바이러스에 관해 상기 기술된 바와 같이 근본적으로 성장 곡선을 수행하였다. 간략하게, MA104 세포를 상기 9개의 nsp1β 결실 돌연변이체 중 하나 또는 대조군으로서의 바이러스 BI EU로 감염시켰다. 감염 후 0, 24, 48, 72 및 93시간째에 세포 배양 상청액을 수거하였고, 96웰 플레이트의 MA104 세포에 대해 적정하였다. 바이러스 역가는 CPE-양성 웰에 기초하여 계산하였다. 도 5는 2개의 독립적 실험의 결과를 나타내고, BI EU-nsp1β 결실 돌연변이체가 MA104 세포 상에서 모(parent) BI EU 바이러스만큼 효율적으로 성장될 수 있음을 입증한다. 감염 후 48시간째에 5x106 내지 1x107 TCID50/ml의 피크 역가가 관찰되었다.
이어서, nsp1β 유전자에 도입된 결실이 실제로 nsp1β 단백질의 IFN 길항제 활성을 파괴할 것인지를 분석하였다. 따라서, 상기 기술된 성장 곡선 실험에 걸쳐 감염 후 0, 24, 48, 72 및 93시간째에 수집된 100㎕ 샘플 중의 IFN-β 수준을 사람 IFN-β에 대해 특이적인 시판 ELISA(Invitrogen)를 이용하여 측정하였다. 제조사에 따르면, 이러한 ELISA는 또한 비-사람 영장류 IFN-β의 검출에 적용될 수 있고, 녹색 원숭이(Green Monkey) 신장 상피 세포인 MA104 세포로부터의 샘플에 대해 우수하게 작용하였다(도 6 참조). 얻어진 결과의 정량을 위해, ELISA 제조사의 양성 대조군을 이용한 캘리브레이션 곡선이 포함되었다.
9개의 생존가능한 nsp1β 결실 돌연변이체 중 하나로 또는 모 BI EU 바이러스로 감염되었고 2개의 독립적 실험으로부터 얻어진 MA104 세포의 상청액에서 측정된 IFN-β 수준은 도 6에 나타낸다.
예측되는 바와 같이, 모 BI EU는 기능성 바이러스성 IFN 길항제(들)에 기여하는 감염의 과정에 걸친 IFN-β의 분비를 효율적으로 차단하였다. 없거나 단지 소량의 IFN-β가 각종 BI EU-nsp1β 결실 돌연변이체로 감염 후 0, 24, 및 48시간째의 세포 배양 상청액에서 검출가능하였다. 그러나, 더 늦은 시점에, 몇몇의 돌연변이체들은 감염된 MA104 세포에서 IFN-β의 발현을 억제할 수 없었고, 이는 nsp1β IFN 길항제 활성의 결함을 나타낸다. 흥미롭게도, 이러한 결함은 분석된 9개의 BI EU-nsp1β 결실 돌연변이체들 사이에 유의하게 상이하였다. 돌연변이체의 대부분은 100㎕의 세포 배양 상청액당 50 국제 단위(IU: international unit) 미만의 IFN-β 수준을 유도하였지만, 돌연변이체 BI EU-nsp1β-delALEV는 감염된 MA104 세포에서 IFN-β의 발현을 길항시키는 것이 완전히 불가능하였다. 감염 후 72 및 93시간째에 측정된 IFN-β의 양은 심지어 100㎕당 약 200IU로 설정되는 ELISA 시험의 한계를 초과하였다. 이러한 결과는 nsp1β 단백질의 IFN 길항제 활성이 BI EU 감염성 cDNA 클론에서 아미노산 A30LEV33을 결실시킴으로써 파괴될 수 있음을 명확하게 입증하였다.
종합하면, 녹색 원숭이 신장 MA104 세포에서 1x107 TCID50/ml의 역가로 효율적으로 성장될 수 있는 신규한 EU형 PRRSV 감염성 cDNA 클론이 생성되었다. 이러한 클론에 기초하여, 단백질의 동종이량체화에 필요한 것으로 밝혀져 온(Xue et al., 2010) nsp1β의 NTD에 결실을 지닌 9개의 생존가능한 BI EU-nsp1β 돌연변이체를 생성하였다. 이들 돌연변이체는 모두 MA104 세포에서 높은 역가로 성장될 수 있었다. 돌연변이체 BI EU-nsp1β-delALEV, BI EU-nsp1β-delEV, BI EU-nsp1β-delLE, BI EU-nsp1β-delSDDS, BI EU-nsp1β-delGRSR, BI EU-nsp1β-delRSR 및 BI EU-nsp1β-delSDGRSR은 모두 감염 후기 시점에 IFN-β의 분비를 유도하였고, 이는 모 BI EU 바이러스와 매우 대조적이다. 이들 7개의 돌연변이체 중에서, 4개의 돌연변이체 BI EU-nsp1β-delALEV, BI EU-nsp1β-delEV, BI EU-nsp1β-delLE 및 BI EU-nsp1β-delSDDS는 WO 2013017570 A1에 이전에 기술되지 않았던 새로운 부류의 돌연변이체를 제시한다. 특히, 돌연변이체 BI EU-nsp1β-delALEV로의 감염은 MA104 세포에서 극도로 높은 양의 IFN-β를 유도하였고, 이는 이러한 바이러스가 IFN I형의 유도를 차단하는 것이 매우 손상되어 있다는 결론을 초래한다.
PRRSV에 대한 천연 숙주의 면역 반응은 결실을 도입함으로써, 예를 들면, 유전자형 I PRRSV 스트레인의 nsp1β 단백질에서 아미노산 A30LEV33을 결실시킴으로써 유의하게 향상될 수 있음이 추정될 수 있으므로, 이러한 발견은 PRRSV 백신 개발에 관한 강한 영향을 갖는다.
본원에 기술되는 nsp1β 결실 돌연변이체는 단독으로 또는 다른 약독화 돌연변이와 함께 수명 약독화된(life attenuated) PRRSV 백신에 대한 유망한 후보물을 제시한다.
실시예 3
a) EU형 PRRSV 감염성 cDNA 클론 BI EU의 ORF4 단백질 내의 결실의 도입
본 발명의 제1 고려사항에 따라 기술된 바와 같은 결실이 바이러스 복제에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 임의의 PRRS 바이러스 스트레인의 ORF4 유전자에 도입될 수 있는지를 시험하였다. 따라서, EU형 PRRSV 감염성 cDNA 클론 BI EU의 아미노산 위치 50 내지 71(서열번호 48의 서열 포함) 사이의 ORF4 단백질의 엑토도메인을 암호화하는 게놈 영역에 결실이 도입되었다. BI EU의 ORF4 단백질 내의 결실은 (서열번호 49에 의해 암호화되는) 아미노산 57 내지 69를 포함하였다.
ORF4 결실 돌연변이체의 생존력을 시험하기 위해서, 결실을 지닌 BI EU cDNA의 합성 전사물을 BHK21 세포에 형질감염시켰다. 형질감염된 세포로부터 PRRSV-민감성 MA104 세포로의 세포 배양 상청액의 이동 후, 형질감염된 BHK21 세포로부터 MA104 세포로의 세포 배양 상청액의 이동 후 3 내지 4일 내에 세포병변 효과(CPE)가 검출가능하였다. 상기 세포를 PRRSV 캡시드 단백질-특이적 모노클로날 항체 SDOW17(Rural Technologies)로 염색한 후, CPE 양성 MA104 세포에서는 강한 신호가 검출가능하였지만, 모의 형질감염된 BHK21 세포의 상청액을 투여받은 세포에서는 검출불가능하였다(도시하지 않음). 이들 발견은 BI EU-ORF4 결실 돌연변이체가 생존가능하였음을 입증하였다. 회수된 돌연변이체 바이러스는 하기에 BI EU-GP5-36-46-ctr(비교예 b)로서 명명한다.
추가로 BI EU-GP5-36-46-ctr이 MA104 세포에서 높은 역가로 성장될 수 있는지를 분석하기 위해서, 성장 동력학(growth kinetics)을 수행하였다. 따라서, MA104 세포는 0.01의 감염 다중도(MOI)를 이용하여 회수된 바이러스 및 대조군으로서의 모 BI EU 바이러스로 감염시켰다. 감염된 세포의 상청액을 감염 후 0, 24, 48, 72 및 96시간째에 수집하였고, MA104 세포를 함유하는 96-웰 플레이트 상의 일련의 바이러스 희석에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 도 7은 3개의 독립적 실험의 결과를 나타내고, BI EU-GP5-36-46-ctr이 모 BI EU 바이러스만큼 효율적으로 MA104 세포에서 성장될 수 있음을 입증한다. 감염 후 48시간째에 상기 바이러스들 둘 다에 대해 약 1x107 TCID50/ml의 피크 역가가 관찰되었다.
종합하면, ORF4 단백질 내의 아미노산 57-69의 결실은 BI EU의 성장에 부정적 영향을 미치는 것은 아니고, 이는 이러한 영역 내의 서열 변이(variation)가 시험관내 PRRSV에 의한 내성이 우수하다는 것을 나타낸다. 이들 결과로부터 결론지으면, BI EU ORF4 단백질의 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 위치한 영역은 또한 외인성 서열에 대한 삽입 부위로서 사용될 수도 있다.
b) 외인성 RNA를 삽입하기 위한 ORF4 단백질 결실 부위의 사용: 감염성 cDNA 클론 BI EU의 ORF4 유전자로의 PRRSV ORF5 단백질 중화성 에피토프 서열의 삽입
이러한 실시예는 BI EU ORF4 단백질의 아미노산 위치 50 내지 71 사이에 위치한 영역으로의 외인성 RNA의 삽입을 기술한다. 이러한 실시예에서 외인성 RNA는 PRRS 바이러스의 ORF5 단백질 내에 위치한 중화성 에피토프를 암호화하고(Ostrowski, M. et al.), 서열번호 39의 아미노산 1 내지 11로 이루어진다. 이러한 서열(서열번호 51)은, 백신접종된 동물에서 면역 반응을 향상시키는 잠재적 백신 후보물 중의 ORF5 중화성 에피토프의 접근가능성을 증가시키기 위해서 ORF4 단백질의 엑토도메인에 삽입되도록 선택되었다.
재조합 바이러스를 생성하기 위해, 외인성 서열을 예 a)에 기술된 ORF4 결실 부위에 도입하였고, G-G 링커에 의해 플랭킹된 서열번호 39의 아미노산 1-11(2형 PRRSV 스트레인의 ORF5 단백질 내의 아미노산 36-46을 제시함)에 의해 BI EU ORF4 단백질의 아미노산 57-69를 대체하였다. 상기 삽입은 BI EU의 ORF4 단백질 내에 Gly57-Ser-Ser-His-Leu-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asn-Leu-Thr-Gly69(서열번호 53)의 최종 서열을 초래하였다. 삽입을 지닌 재조합 바이러스 숙주는 하기에 BI EU-GP5-36-46(서열번호 56의 서열 포함)으로서 명명한다.
BI EU-GP5-36-46이 회수될 수 있는지를 시험하기 위해서, 돌연변이를 지닌 BI EU cDNA의 합성 전사물을 BHK21 세포에 형질감염시켰다. 재조합 바이러스는 상기 기술된 바와 동일한 방법에 의해 구제될 수 있다. 세포병변 효과(CPE)는 형질감염된 BHK21 세포로부터 PRRSV 민감성 MA104 세포로의 세포 배양 상청액의 이동 후 3 내지 4일 내에 관찰가능하였다. 도한, PRRSV 캡시드 단백질-특이적 염색은 CPE 양성 MA104 세포에서 검출가능하였지만, 모의 형질감염된 BHK21 세포의 상청액을 투여받은 세포에서는 검출불가능하였다(도시하지 않음).
재조합 바이러스가 높은 역가로 성장될 수 있는지를 시험하기 위해서 성장 동력학을 수행하였다. 따라서, MA104 세포는 0.01의 MOI를 이용하여 BI EU-GP5-36-46 및 대조군으로서의 모 BI EU 바이러스로 감염시켰다. 감염된 세포의 상청액을 감염 후 0, 24, 48, 72 및 96시간째에 수집하였고, MA104 세포를 함유하는 96-웰 플레이트 상의 일련의 바이러스 희석에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 3개의 독립적 실험의 결과를 도 7에 도시한다. 감염 후 48시간째에, 바이러스 돌연변이체 BI EU-GP5-36-46은 모 BI EU 바이러스와 동일한 약 1x107 TCID50/ml의 피크 역가에 도달하였고, 이는 ORF4 단백질 내의 삽입된 서열이 높은 역가 바이러스 성장에 부정적인 영향을 미친 것은 아님을 나타낸다.
MA104 세포에 대한 추가의 실험은 외인성 RNA 서열이 다중 계대에 걸쳐 안정하게 유지되었음을 밝혔다. 서열 분석은 분석된 모든 계대에 걸쳐 삽입물의 안정성을 입증하였다. 흥미롭게도, 삽입 부위의 업스트립(upstream)의 위치 56에서의 Pro으로의 His의 아미노산 교환을 초래하는 티민으로의 아데닌의 단일 뉴클레오타이드 돌연변이는 독립적인 실험에서 계대 1 후에 검출가능하였다. 따라서, 이러한 추가의 돌연변이는 역 유전학에 의해 BI EU-GP5-36-46에 삽입되었다. 이러한 재조합 바이러스를 생성하기 위해, 외인성 서열을 예 a)에 기술된 ORF4 결실 부위에 도입하였고, 아미노산 서열 PG에 의해 N-말단 플랭킹되고 G-링커에 의해 C-말단 플랭킹된 서열번호 39의 아미노산 1-11(2형 PRRSV 스트레인의 ORF5 단백질 내의 아미노산 36-46을 제시함)에 의해 BI EU ORF4 단백질의 아미노산 56-69를 대체하였다. 상기 삽입은 BI EU의 ORF4 단백질 내에 Pro56-Gly-Ser-Ser-His-Leu-Gln-Leu-Ile-Tyr-Asn-Leu-Thr-Gly69(서열번호 55)의 최종 서열을 초래하였다. 얻어진 재조합 바이러스는 하기에 BI EU-GP5-36-46-AtoC(서열번호 58의 서열 포함)으로서 명명한다. 도 7에 도시된 성장 동력학은 BI EU-GP5-36-46-AtoC가 각각 BI EU-GP5-36-46 및 BI EU 야생형과 유사한 역가로 성장될 수 있음을 입증하였다.
BI EU-GP5-36-46-AtoC에서 ORF4의 엑토도메인-암호화 영역의 ORF5-유도된 서열이 돌연변이체 바이러스를 혈청 중화에 더 민감성이 되게 하는지를 시험하기 위해, 혈청 중화 시험(SNT)을 수행하였다. ORF4 단백질 엑토도메인에 위치한 삽입된 ORF5-유도된 중화성 에피토프의 증가된 접근가능성이 모 바이러스 BI EU와 비교하여 중화 항체의 작용에 대한 재조합 바이러스의 향상된 민감성을 초래할 수 있음이 상정되었다.
SNT를 위해, BI EU 야생형 바이러스로의 백신접종 후 48일째에 6마리의 암퇘지로부터 취한 혈청을 일련 희석하였고, BI EU-GP5-36-46-AtoC와 또는 야생형 BI EU와 혼합하였다.
37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안의 항온배양 후, MA104 세포를 샘플에 부가하였다. 비-중화 바이러스에 의해 유도된 CPE에 기초하여 4일 후에 혈청 역가를 측정하였다. 백신접종 전의 동일한 동물로부터 취한 혈청은 음성 대조군으로서 작용하였다(도시하지 않음). 2개의 독립적인 실험의 평균값 및 표준 편차는 도 8에 도시한다.
분석된 6마리 동물들 사이에 관찰가능했던 편차에도 불구하고 BI EU-GP5-36-46-AtoC는 BI EU 야생형 바이러스와 비교하는 경우 시험관내 중화에 대해 지속적으로 더 민감성이었음이 입증될 수 있었다. BI EU-GP5-36-46-AtoC에 대해 측정된 혈청 역가는 모 바이러스 BI EU에 대해 측정된 역가보다 3 내지 15배 더 높았다(도 8). 상이한 실험으로부터 얻어진 데이터는 추가로, BI EU-GP5-36-46-AtoC에 대한 혈청 역가는, N-글리코실화가 ORF5 중화성 에피토프를 자연적으로 차폐하므로((Ansari et al., 2006) 및 데이터 도시하지 않음), ORF5-유도된 서열(서열번호 50 및 서열번호 52)에 존재하는 N-글리코실화 부위(서열번호 39의 아미노산 N9)를 Asn9로부터 Gln9로 돌연변이시킴으로써 더욱 증가될 수도 있음을 시사하였다. 요약하면, 도 8에 도시된 발견은, ORF4 단백질 엑토도메인에 삽입된 ORF5-유도된 중화성 에피토프는 재조합 바이러스 BI EU-GP5-36-46-AtoC에 고도로 접근가능함을 강하게 나타냈고, 이는 후자를 유망한 백신 후보물이 되게 한다. PRRSV-특이적 중화 항체를 포함하는 혈청에 대해 입증된 보다 높은 민감성은 백신 바이러스의 보다 신속한 제거율 및 증가된 안정성을 가능하게 한다.
또한, PRRSV-특이적 중화 항체는 모 바이러스 BI EU로 백신접종된 동물과 비교하는 경우 BI EU-GP5-36-46-AtoC로 백신접종된 새끼돼지 또는 암퇘지에서 보다 높은 수준으로 그리고 보다 이른 시점에 유도될 것임이 예측될 수 있다. 백신접종 후 중화 항체의 조기 유도는 보다 신속한 제거율을 초래하고, 따라서, 적은 백신 바이러스의 쉐딩을 초래하고(증가된 안정성), PRRSV로의 자연 감염 후 보다 효율적인 면역 반응을 초래하여야만 한다(증가된 효율).
따라서, 재조합 바이러스 BI EU-GP5-36-46-AtoC는 안전성 및 효율이 향상된 수명 약독화된 PRRSV 백신에 대한 유망한 후보물을 제시한다.
서열목록에서:
서열번호 1 내지 서열번호 24는 결실을 갖는 PRRSV ORF4 단백질의 엑토도메인의 서열에 상응한다;
서열번호 25 및 서열번호 26은 PRRSV(유전자형 I) ORF4 단백질의 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트의 서열에 상응한다;
서열번호 27 및 서열번호 28은 PRRSV(유전자형 II) ORF4 단백질의 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트의 서열에 상응한다;
서열번호 29 및 서열번호 30은 PRRSV(유전자형 I) ORF4 단백질의 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트의 서열에 상응한다;
서열번호 31 및 서열번호 32는 PRRSV(유전자형 II) ORF4 단백질의 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트의 서열에 상응한다;
서열번호 32는 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 11개의 아미노산 잔기들이 결실된 PRRSV(유전자형 I) ORF4 단백질의 (부분적) 서열에 상응한다;
서열번호 33은 처음 2개의 예측되는 N-말단 β-시트들 사이의 영역에 7개의 아미노산 잔기들이 결실된 PRRSV(유전자형 II) ORF4 단백질의 (부분적) 서열에 상응한다;
서열번호 34는 11개의 아미노산 잔기들이 결실된 PRRSV(유전자형 I) ORF4 단백질의 엑토도메인의 서열에 상응한다;
서열번호 35는 7개의 아미노산 잔기들이 결실된 PRRSV(유전자형 II) ORF4 단백질의 엑토도메인의 서열에 상응한다;
서열번호 36은 11개의 아미노산 잔기들이 결실된(그리고 각각 서열번호 34를 포함하는) PRRSV(유전자형 I) ORF4 단백질의 서열에 상응한다;
서열번호 37은 서열번호 36의 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 상응한다;
서열번호 38은 유전자형 I PRRSV의 게놈이 서열번호 36의 서열을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 유전자형 I PRRSV를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 상응한다;
서열번호 39는 PRRS 바이러스의 ORF5 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드의 서열에 상응한다;
서열번호 40은 PRRS 바이러스의 ORF5 유전자에 의해 암호화되는 펩타이드의 서열에 상응한다;
서열번호 41은 렐리스타드 바이러스 완전 게놈에 상응한다;
서열번호 42는 VR2332 바이러스 완전 게놈에 상응한다;
서열번호 43은 렐리스타드 바이러스의 ORF4 단백질의 서열에 상응한다;
서열번호 44는 VR2332 바이러스의 ORF4 단백질의 서열에 상응한다;
서열번호 45는 본원에 기술되는 제1 핵산 서열에 상응한다;
서열번호 46은 제1 핵산 서열의 5' 말단을 플랭킹하는 본원에 기술되는 제2 핵산 서열에 상응한다;
서열번호 47은 제1 핵산 서열의 3' 말단을 플랭킹하는 본원에 기술되는 제3 핵산 서열에 상응한다;
서열번호 48은 BI EU 완전 바이러스성 cDNA 삽입물에 상응한다;
서열번호 49는 이에 의해 13aa(aa 57-69)이 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 결실을 갖는 서열번호 48의 서열에 상응한다;
서열번호 50은 위치 9에서의 N->Q 치환을 갖는 서열번호 39의 서열에 상응한다;
서열번호 51은 서열번호 39의 aa1-11의 서열에 상응한다;
서열번호 52는 위치 9에서의 N->Q 치환을 갖는 서열번호 51의 서열에 상응한다;
서열번호 53은 Gly-Gly 링커를 갖는 서열번호 51의 서열에 상응한다;
서열번호 54는 Gly-Gly 링커를 갖는 서열번호 52의 서열에 상응한다;
서열번호 55는 N-말단 프롤린 잔기를 갖는 서열번호 53의 서열에 상응한다;
서열번호 56은 이에 의해 서열번호 53의 서열을 암호화하는 삽입물을 갖는 서열번호 49의 서열에 상응한다;
서열번호 57은 이에 의해 서열번호 54의 서열을 암호화하는 삽입물을 갖는 서열번호 49의 서열에 상응한다;
서열번호 58은 이에 의해 14aa(aa 56-69)가 결실된 ORF4 단백질을 암호화하는 결실을 갖는 서열번호 48의 서열에 상응하고, 여기서, 서열번호 55의 서열을 암호화하는 삽입물이 포함된다.
참조문헌 목록
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH <120> PRRS VIRUS VARIANT, EUROPEAN PRRS VIRUS CDNA CLONE, AND USES THEREOF <130> P01-2959/WO/1 <150> EP 13199177.0 <151> 2013-12-20 <150> EP 14175691.6 <151> 2014-07-03 <160> 58 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(19) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Phe Xaa Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Gln Cys Arg 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(18) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 2 Phe Xaa Val Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Gln 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(12)..(12) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 24 Phe Xaa Val Leu Xaa Xaa Ile Xaa Gln Cys Arg Xaa Ala 1 5 10 <210> 25 <211> 4 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 25 Phe Xaa Val Leu 1 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 26 Tyr Ile Thr Xaa Xaa Ala Asn 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 27 Phe Xaa Val Leu Xaa Asp 1 5 <210> 28 <211> 8 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 28 Val Tyr Ile Thr Xaa Thr Ala Asn 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 29 Phe Xaa Val Leu Gln 1 5 <210> 30 <211> 8 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 30 Gln Tyr Ile Thr Ile Xaa Ala Asn 1 5 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 31 Phe Met Val Leu Gln Lys Ile Glu Cys Leu Gln Ala Pro Gly Thr Arg 1 5 10 15 Ser Gln Cys Arg Glu Ala 20 <210> 32 <211> 23 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 32 Gln Lys Ile Glu Cys Leu Gln Ala Pro Gly Thr Arg Ser Gln Cys Arg 1 5 10 15 Glu Ala Ile Gly Thr Pro Gln 20 <210> 33 <211> 21 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 33 Asp Ile Ser Cys Leu Arg His Gly Arg Lys Ser Arg Gln Cys Arg Thr 1 5 10 15 Ala Ile Gly Thr Pro 20 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 34 Glu Cys Leu Gln Ala Pro Gly Thr Arg 1 5 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 35 Ser Cys Leu Arg His Gly His Lys Ser Arg 1 5 10 <210> 36 <211> 172 <212> PRT <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 36 Met Ala Ala Ala Ile Leu Phe Phe Leu Val Gly Ala Gln His Leu Met 1 5 10 15 Val Ser Glu Ala Phe Ala Cys Lys Pro Cys Phe Ser Thr His Leu Ser 20 25 30 Asp Ile Lys Thr Asn Thr Thr Ala Ala Ala Gly Phe Met Val Leu Gln 35 40 45 Lys Ile Glu Cys Leu Gln Ala Pro Gly Thr Arg Ser Gln Cys Arg Glu 50 55 60 Ala Ile Gly Thr Pro Gln Tyr Ile Thr Ile Gln Ala Asn Val Thr Asp 65 70 75 80 Glu Ser Tyr Leu Tyr Asn Ala Asp Leu Leu Met Leu Ser Ala Cys Leu 85 90 95 Phe Tyr Ala Ser Glu Met Ser Glu Lys Gly Phe Asn Val Ile Phe Gly 100 105 110 Asn Val Ser Gly Val Val Ser Ala Cys Val Asn Phe Thr Asp Tyr Val 115 120 125 Ala His Val Thr Gln His Thr Gln Gln His His Leu Val Ile Asp His 130 135 140 Val Arg Leu Leu His Phe Leu Ser Pro Pro Val Met Arg Trp Ala Thr 145 150 155 160 Thr Ile Ala Cys Leu Phe Ala Ile Leu Leu Ala Ile 165 170 <210> 37 <211> 519 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 37 atggctgcgg ccattctttt cttcctggtt ggtgctcaac atctcatggt ttctgaggcg 60 ttcgcctgca agccctgctt ctcgacgcat ttatcagata ttaagaccaa cacgaccgcg 120 gctgccggtt tcatggtcct tcagaaaatt gaatgcctcc aagcccctgg gacacggtcg 180 caatgtcgtg aagccatcgg taccccccag tacatcacga tacaggccaa cgtgaccgac 240 gaatcatact tgtataacgc ggacttgctg atgctctctg cgtgcctctt ctacgcctca 300 gaaatgagcg agaaaggctt caacgtcatc tttgggaatg tttctggcgt tgtttccgct 360 tgtgtcaatt tcacagatta cgtagcccac gtgactcaac acacccagca gcatcacctg 420 gtaatcgacc acgttaggct actacatttc ctgtcaccac ctgtaatgag gtgggccaca 480 accatcgctt gtttgttcgc cattcttttg gcgatatga 519 <210> 38 <211> 14854 <212> DNA <213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 38 acctcttggc ccctgttcta gcccaacagg tatccttctc tctcggggcg agtgcgccgc 60 ctgctgctct cttgcagcgg gaaggacctc ccgagtattt ccggagagca cctgctttac 120 gggatctcca ccctttaacc atgtctggga ctctctcccg gtgcatgtgc accccggctg 180 ctcgggtatt ttggaacgcc ggtcaagtct tctgcacacg gtgtctcagt gcgcggtctc 240 ttctccctcc tgagcttcag gacactgacc ttgctgcaat tggtttgttt tacaagccta 300 aggacaagat caaatggaaa gttcccattg gcattcctca ggtggaatgt actccatccg 360 ggtgctgttg gctctccgct attttcccct tagcgcgcat gacctccggt aatcacaact 420 tccttcaacg gcttgtgaag gttgctgacg ttttgtaccg tgacggttac ttggcacccc 480 aacaccttcg tgaactccaa gtctacgaac gcggctgcag ctggtacccg atcacggggc 540 ctgtgcccgg aatgggtttg tatgcaaact ccatgcacgt gtctgatcag ccgtttcctg 600 gtgccactca tgtgttaacc aactcaccct tgcctcaaca ggcttgtcgg caaccattct 660 gtccatttga ggaggctcat tccgacgtgt acaggtggaa gaaatttgtg attttcgtgg 720 attctcctct taacggtcga tctcgtatga tgtggacacc ggggtccgat gactcggctg 780 ccttagaagt gcttccgcct gaactagaac gtcgagtcga aatcctcatt cgaagttttc 840 ctgctcatca ctctgttgat ctcaccgaat gggaactcac tgaatcacct gagcacggtt 900 tttccttcag cacgttccat tctagtggtc acctcgccca aaaccccgac atgtttgatg 960 gcaagtgttg gctatcttgc tttttgagcc tgccgcccga agtgtggcgc catgaagaac 1020 agctggccaa cactctcggt taccaaacca agtggggtgt gcacggtaag tacctccagc 1080 gcaggcttca aattaacggc gtccgtgctg tggttgaccc taatggtccc attcacgttg 1140 aagcgctatc ttgctcccag tcttggatca gacatctgac tctggaagat gatgtaactc 1200 cggggttcgt tcgcctaatg tctctccgta ttgtgccgaa cacagaaccc accatcctcc 1260 aggttttccg gtttggggca cacaagtggt atggtgctgc cggcaagcga gctcgcacta 1320 agcgtgcagc aaagaaaggg aaggactcga ctatcactcc cgagactgcc caaccaacct 1380 ccgcttgcga aatcatcacc tattccccac cggcggacgg atcttgtggc tggcatgttc 1440 ttgccgccat agtgaaccga atgataagtg gtgacttcac gtccccccta actcagtaca 1500 ataggccaga ggatgattgg gcttctgatt atgatcttgc tcaagcgatt caatgcctgc 1560 aactgcctgc taccctggtt cggggtcgcg cctgtcctaa cgccaagtac cttataaaac 1620 ttaacggggt tcactgggag gtagaggtga ggcctggaat ggctcctcgc tccctttccc 1680 gcgaatgcgt ggttggcgtc tgctctgaag gctgtgtcgc gccgccttat ccagaaaacg 1740 ggctaccaaa acgcgcactc gaggccttgg cgtctgctta caggctacct tccgactgcg 1800 ttagctgtgg tattgctgac tttctcgcta accctcccct tccggaattc tggaccctcg 1860 acaaaatgtt gacctccccg tcaccagaac ggtccggctt ctctagtttg tataaattac 1920 ttttggaggt tgttccgcag aaatgtggtg cctcggaggg ggcttttatt tgtgctgttg 1980 aaaggatgtt gaaggattgt ccgagctcca aacaggccat ggcccttttg gcaaaaatta 2040 gaatcccatc ctcaagggcc ccgtctgttt ccttggatga gtgttttcct acggatgtcc 2100 cagccgactt tgaatcagcg tctcaggaaa ggccccaaac ttccggtgtc gctgttgccc 2160 agtgtctacc ggatgcaaaa gagctcgagg aaacagcccc gggaaaagtt caagagaatg 2220 gtcacaaggc catccatcct gcgcctcttg ctggttgtcc taacgacgag caagtacagg 2280 tgattgccag cgagcaactg aggcccggcg actgtgtttc gacagtcagg ggtgctcgcg 2340 atgatgctcc agtctcagcc ggcctgacta acctggcagg cgggaacccc ccttttccaa 2400 accccacgga aggaaatagg ccccatgact gggaagacgg acctttggat ctatcccgac 2460 cgaaaccagt tgccgagatg acccttgtaa gagagcaagt accctacaac ccaggtccta 2520 acactgatgt ctcccccgtc gccgctccgg gctttatccc gacggggctc gtatttcgtc 2580 atgttgagca ttgtggctcg gagtccggtg agagcgactc ccctctaaac ttgtctaatg 2640 tgcaaatttc ggaccagccc ctaaaccttt ccctgaccgc atggccggtg aaggccaccg 2700 cctctgaccc cggttgggtt catggtcgac gtgagcctgt ctttgcgaag cctcgaaatg 2760 ccttctctga cggtgactca gttgttcagt tcggggagct ttctgaatcc agctccgtcg 2820 tcgagtttga ccgagcaaaa aatgttacaa cggttgacgc ccctgtcgac ttgacgactc 2880 cgaataaggc cctctctgtg gtcgatcctt tcgagttcgc tgagcccaag cgcccacgtt 2940 tctccgcgca agccctgatt gaccgaggag gtccacttgc tgatgtccac gcaaaaataa 3000 agaatcgggt atacgaacag tgcctccagg cttgcgagcc cggtagtcgc gcaaccccag 3060 ccactagaga ctggctcgac aaaatgtggg agagggtgga catgaaaact tggcgctgca 3120 cctcacagtt tcaagctggt cgcattctcg cgtccctcaa gttcctccct gacatgattc 3180 aggacacacc gcctcctgct cccaggaaga gccgggctgg tgacagcacc ggcctaaaac 3240 aactggtggc acagtgggat aggaaattga gtgcggcccc tcctccgaaa ctggttgggt 3300 cagtgcctga ccagactgtc ctcccgtccg cggacaccca gcaagaagac gctgaccctc 3360 ctgatgggcc gccccacgcg ccggacattc ctagtcgagt aggtacagtc aggaattgga 3420 aaggttgcat gctttccggc acccgttttg cggggtccat gagtcagcgc ttcatgacat 3480 gggtttttga ggttctctcc catctcccag cttttgcgct cacacttttc tcgccgcggg 3540 gctctatggc tccaggtgat tggctgtttg caggtgttgt tttacttgct ctcctgctct 3600 gtcgctctta cccaattttc gggtgccttc ccttattggg tgtcttttct ggttctgtgc 3660 ggcgcgttcg tctgggtgtt tttggttctt ggatggcttt tgctgtattt ctattctcga 3720 ctccatccaa cccagtcggt tcttcttgtg accacgattc gccggagtgt cacgctgagc 3780 ttttggctct tgagcagcgc caactttggg aacctgtgcg cggccttgtg gtgggcccct 3840 caggtctctt atgcgtcgtt cttggcaagc tactcggtgg gtcacgttat ctctggcata 3900 ttctcttacg tttatgcatg cttgcagatt tggccctttc tcttgtttat gtggtgtccc 3960 aagggcgttg tcacaagtgt tggggaaagt gtataaggac agctcctgcg gaggtggctc 4020 tcaatgtatt tcctttctcg cgcgccaccc gttcctctat tgtatcctta tgtgatcgat 4080 tccaggcgcc aaaaggggtt gatcccgtac atttggcaac gggttggcgc gggtgctggt 4140 gcggcgatag ccccatccat caaccacacc agaaacccat agcttacgcc aacttggatg 4200 aaaagaaaat atctgcccag acggtggtcg ctgttccata cgatcccagc caggccatca 4260 aatgcctgaa agtcctacag gctggaggag ctattgtaga ccagccaaca cctgaggttg 4320 ttcgtgtttc cgaaatcccc ttctcagccc cattttttcc gaaagttccg gtcaatccaa 4380 actgtagggt tgtggtagat tcggacacct ttgtggccgc ggttcgctgc ggttactcaa 4440 caacacaact ggtcctgggc cggggcaact tcgccaagtt gaatcaaaca cctcttggga 4500 actctgtctc caccaaaacg actggtggtg cctcttacac ccttgctgtg gcgcaagtgt 4560 ccgtgtggac tctcatccat ttcatcctcg gtctttggtt cacatcgcct caagtgtgcg 4620 gccgaggtac cgctgatcca tggtgttcaa atcctttttc atatcccacc tatggccctg 4680 gagttgtctg ctcctctcga ctttgcgtgt ctgccgatgg agtcaccctg ccattgttct 4740 cagccgtggc acaactctcc ggtagggagg tgggaatttt cattctggtg ctcgtctcct 4800 tgatcgcttt ggcccaccat atggctctta aagcagatat gttggtgatc tttttggctt 4860 tctgcgccta cgcctggcct atgagttctt ggttaatttg tttctttccc atgcttttga 4920 agtgggttac ccttcaccct cttaccatgc tttgggtaca ctctttctta gtgttttgtc 4980 tgccagcagc tggcatcctt tcactaggga caactggcct tctctgggca gtcggccgct 5040 tcacccaggt agccggaatt attacacctt atgacattca ccgatacact tctgggccgc 5100 gtggtgctgc cgctgtagcc acagccccag aaggcactta catggccgcc gtccgtagag 5160 ctgccttaac tgggcgaact ttgatcttca ccccgtctgc agttgggtcc cttctcgagg 5220 gtgccttcag gactcataaa ccctgcctca acaccgtgaa tgtcgtgggt tcttcttttg 5280 gttctggagg agtctttacc attgatggga aaaaactgtt gttactgcga cacatgtgtt 5340 gaacggcgac acagccaggg tcaccggtga ctcctataac cgcatgctca ccttcaggac 5400 caacggtgat tacgcctggt cccatgctga tgactggcaa ggcgttgccc cagtggtcaa 5460 gatcgcgaaa gggtatcgcg gtcgtgccta ttggcaaaca tcaactggtg tcgaacccgg 5520 tgttgttggt gaaggattcg ccttctgttt tactaactgt ggtgactcgg ggtcacccgt 5580 catttcagaa tctggtgatc tcattggaat ccacaccggt tcgaacaaac ttggttctgg 5640 tcttgtgaca acccccgaag gggagacctg cactattaaa gaaaccaagc tctctgacct 5700 ttccagacac ttcgcgggcc caagcgttcc ccttggggac ataaaattaa gcccggccat 5760 catccctgat gtgacgtcca tcccaagtga cttggcatcg ctcctggctt ccgtccctgt 5820 agtggaaggc ggtctttcga ccgttcaact cttgtgtgtc tttttccttc tctggcgtat 5880 gatggggcat gcttggacac ccattgttgc cgtgggtttc tttttgctga atgaaattct 5940 tccagcagtc ttggtccgag ccgtgttctc ttttgcgctc tttgcgtttg catggctcac 6000 cccctggtct gcgcaggtgt tgatgatcag actcctcacg gcctccctca accgcaacaa 6060 gctttctctg gcgttctacg cactcggggg tgtcgtcggt ttggccgctg agatcgggac 6120 tttcgctggt aggttgtctg aattgtctca agccatttca acatactgct ttttacctag 6180 ggtccttgct atgaccagct gtgtccccat catcatcatt ggtggactcc atgctcttgg 6240 tgtaatcctg tggttgttca aatatcggtg tctccacaac acgctagttg gtgatgggag 6300 tttttcaagc gccttcttcc tgcggtactt tgcagagggt aatctcagaa aaggtgtttc 6360 acagtcctgt ggcatgagta atgaatcctt gacggctgct ttggcttgta agttgtcaca 6420 ggctgacctt gactttctgt ccggcctaac gaatttcaag tgttttgtgt ctgcttcaaa 6480 tatgaagaat gctgctggcc aatatattga agcagcgtac gccaaggcct tgcgccacga 6540 gttggcttcc ttagttcagg tcgacaaaat gaagggggtt ttgtccaagc tagaagcttt 6600 tgctgagacg gccaccccat cccttgatac aggtgacgta gttgttctgc ttggacaaca 6660 tcctcatgga tctattcttg acattaacgt agggactgaa aggaaaactg tgtctgtgca 6720 ggagactcgg agtttgggtg gctccaaatt cagtgtctgc accgttgtgt ccaacacacc 6780 tgtagacgcc ctgaccagca tcccacttca gacaccaact ccgcttttcg agaatggccc 6840 gcgtcatcgc ggtgaggaag acgatcttaa agtcgagagg atgaagaagc actgcatatc 6900 cctcggcttt cataacatta atggcaaagt ttactgcaaa atttgggaca agtctaccgg 6960 tgacaccttc tacacggatg actcccgata cacccaagac tgtgcctttc aggacaggtc 7020 agccgactat agagacaggg attatgaagg tgtgcagacc gccccccagc acggatttga 7080 cccaaagtcc gagacccctg tcggcactgt tgtgatcggc ggcattacgt ataacaggta 7140 tctggttaaa ggtaaagagg tcttgatccc caagcctgac aactgccttg aagccgccaa 7200 gctatccctt gaacaagctc tcgctggtat gggccagact tgtgacctca cggctgctga 7260 agtggaaaag ctaaagcgca ttattagcca actccaaggc ttgaccaccg agcaggcttt 7320 aaactgctag ccgccagtgg cttgacccgc tgtggccgcg gcggcttagt tgtgactgaa 7380 acggcggtga aaattgtgaa ataccacagc agaaccttca ccctaggccc tttagacctg 7440 aaagtcacct ctgaagtgga ggtgaagaaa tcaacagagc agggccacgc cgttgtagca 7500 aacctatgct ccggtgttgt gttgatgaga cctcaccctc cgtcccttgt tgatgttctt 7560 ctaaagcctg gacttgacac gacacctggc atccaaccgg ggcatggggc tggaaacatg 7620 ggtgtgaacg gttccatttg ggattttgaa actgccccca caaaggcgga actcgagtta 7680 tccaaacaaa taatccaagc gtgtgagatt aggcgcgggg atgccccgaa cctccaactc 7740 ccttataagc tctatcctgt taggggggat cctgagcggc atgaaggtcg ccttatcaat 7800 accaggttcg gggacttacc ttataagact cctcaagaca ccaagtccgc agtccacgcg 7860 gcttgttgcc tacaccccaa tggagccccg gtatttgacg gtaaatccat gctgggcacc 7920 actcttcagc atggttttga gctttatgtc cccactgtgc cctatagtgt tatggagtac 7980 cttgactcac gccctgacac tccttttatg tgtactaagc atggcacttc cagtgctgct 8040 gcagaggacc tccaaaagta tgacctatcc acccaaggat ttgtcttgcc tggtgtcttg 8100 cgcttagtgc gcaggttcat cttcagccat attggtaaag cgccaccatt gttcctccca 8160 tcaacttacc ccgctaagaa ctccatggca gggattaatg gtcagaggtt tccgacaaag 8220 gatattcaga gcatacctga aatcgatgaa atgtgtgccc gcgctgtcaa ggaaaattgg 8280 caaactgtta caccttgcac cctcaagaaa cagtattgtt ctaagcccaa aaccaggacc 8340 atcctgggca ctaacaactt tattgccttg gcccacagat cagcgcttag tggtgtcacc 8400 caggcgttca tgaaaaaggc ttggaattcc ccaattgcct tggggaagaa taaattcaag 8460 gagctgcatt gcaccgttgc cggcaggtgt cttgaggctg acttggcctc ctgcgaccgc 8520 agtacccccg ccattgtgag atggtttgtt gccaacctcc tgtatgaact tgcaggatgt 8580 gaagagtacc tgcccagcta cgtgcttaat tgctgccatg acctcgtggc aacacaaaat 8640 ggtgccttca caaaacgcgg tggcctgtcg tctggggacc ctgtcaccag tgtgtccaac 8700 accgtatatt cactgataat ttacgcccag cacatggtgt tgtcagccct aaaaatgggt 8760 catgagattg gtcttaagtt tcttgaggag caactcaagt tcgaagacct ccttgaaatt 8820 cagcctatgt tggtgtattc tgatgatctt gttttgtatg ctgaaaggcc ctccttcccc 8880 aattaccatt ggtgggtcga gcaccttgac ttgatgctgg gtttcaagac agacccaaag 8940 aagaccgtta taactgacaa gcccagcttt ctcggttgca gaattgaggc ggggcgacag 9000 ctagccccca atcgtgaccg cattctggct gctctcgcat atcacatgaa agcgcaggac 9060 gcatcagagt actatgcgtc tgctgccgca attctgatgg actcgtgtgc ttgcattgac 9120 tatgatcctg agtggtatga agacctcatc tgtggcatcg ctcagtgcgc ccgccaggat 9180 ggttatcgct tcccaggacc ggcatttttc atgtccatgt gggagagact gagaagccat 9240 aatgagggga agaaattccg ccattgcggc atctgtgacg ccaaagctga tcacgcgtct 9300 gcctgtgggc ttgacttgtg cttgtttcac tcgcactttc atcaacactg ccctgttatc 9360 ttgagttgcg gccaccatgc cggttccaaa gaatgttcgc agtgtcagtc acctgttggg 9420 tctggcaaga cccctcttga tgccgtgctg aagcaaatcc catacaaacc tcctcgtaca 9480 gcaatcatga gggtaagcga caaagtgaca gccctggatc cagggaggta ccagtctcgt 9540 cggggcctcg ttgcagtcaa aaggggtatc gcaggtaatg aagttgatct ccctgatggg 9600 gactatcagg tagtgcctct tttgccgacc tgcaaagaca ttaatatggt gaaggtggct 9660 tgtaatgttc tactcagcaa attcatagtg gggccaccag gttccgggaa gacaacctgg 9720 ctgctgagtc aagtccagga tgatgatgtt atttacacac ccactcatca gaccatgttt 9780 gatatagtca gtgctctcaa agtttgcagg tattccatcc caggggcctc aggactccct 9840 ttcccaccac ctgccaggtc cgggccatgg gtcaagctca ttgccagcgg acacgtccca 9900 ggccgagtgt catacctcga tgaggctgga tattgtaatc atctggacat cctcagactg 9960 ctttccaaaa cacctcttgt gtgtttgggt gaccttcagc aacttcaccc tgttggcttt 10020 gattcctact gttatgtgtt cgatcagatg cctcagaagc agctgaccac tatttataga 10080 tttggtccta acatctgtgc agccatccag ccttgttaca gggaaaaact tgaatctaag 10140 gctaggaaca ccagggtggg tttcaccacc cggcctgtgg ccttcggtca ggtgttgaca 10200 ccataccaca aagaccgtac tggctctgcg ataaccatag attcatccca aggggccact 10260 tttgatattg tgacattgca tctaccatcg ccgaagtcct taaacaaatc ccgagcactt 10320 gtagccatta ctcgagcaag acatgggttg ttcatttatg accctcataa ccagctccag 10380 gaatttttta atttaacccc tgagagcact gattgcaacc ttgtgttttg ccacggggat 10440 gagctggtag ttttggacgc cggtaatgca gtcacaactg tggcgaaggc cctagaaact 10500 ggtccgtcgc ggttccgtgt gtcggacccg agatgcaagt ccctcttagc tgcctgttca 10560 gccagtctgg aagggagctg catgccacta ccgcaagtgg cacataacct gggattttac 10620 ttttcccctg acagcccagc atttgcacct ctgccaaaag agctggcgcc acactggcca 10680 gtggtcactc atcagaataa tcgggcgtgg cctgatcgac ttgtcgccag catgcgcccg 10740 ctcgacaacc gttacagcaa gccaatggtc ggtgcagggt atgtggtcgg gccgtccacc 10800 tttctcggta cacccggcgt ggtgtcatac tatcttacac tatacattaa 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acgaggagtg gttaacctcg tcaagtatgg 14460 ccggtaagaa ccagagccag aagaaaagaa gaaatgcagc tccgatgggg aaaggccagc 14520 cagtcaatca actgtgccag ttgctgggta caatgataaa gtcccagcgc cagcaatcta 14580 ggggaggaca ggccaaaaag aagaagcctg agaagccaca ttttccccta gctgctgaag 14640 atgacattcg gcaccatctc acccaggccg aacgttccct ctgcttgcaa tcgatccaga 14700 cggctttcaa tcaaggcgca ggaactgcgt cgctttcatc cagcgggaag gtcagtttcc 14760 aggttgagtt catgctgccg gttgctcata cagtgcgcct gattcgcgtg acttctacat 14820 ccgccagtca gggtgcaaat taatttgaca gtcaggtgaa tggccgcgat tgacgtgtgg 14880 cctctaagtc acctattcaa ttagggcgat cacatggggg tcaaacttaa ttaggcagga 14940 accatgtgac cgaaattaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 14984

Claims (18)

  1. 유전자형 I 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스로서, 상기 바이러스의 게놈이 서열번호 49, 56, 57 및 58로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화되는, 유전자형 I 돼지 생식기 및 호흡기 증후군(PRRS) 바이러스.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 49의 서열을 포함하는, 바이러스.
  3. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 56의 서열을 포함하는, 바이러스.
  4. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 57의 서열을 포함하는, 바이러스.
  5. 제1항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 58의 서열을 포함하는, 바이러스.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 청구된 바이러스를 포함하는 백신으로서, 상기 백신이 바람직하게는 용매, 분산 매질, 항원보강제(adjuvant), 안정화제, 희석제, 보존제, 항균제 및 항진균제, 등장성 제제, 및 흡수 지연제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 약제학적으로 허용되는 부형제를 임의로 추가로 포함하는, 백신.
  7. 제6항에 있어서, 상기 백신이 용량당 104 내지 106개의 바이러스 입자들을 포함하는, 백신.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 돼지에서 PRRS의 치료 및/또는 예방 방법에 사용하기 위한, 백신.
  9. 제8항에 있어서, 상기 백신이 비강내, 근육내, 경구 또는 자궁내 경로에 의해 투여되는, 백신.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 투여가 상기 돼지에서 PRRS 증상을 감소시키고/시키거나 예방하는 PRRS에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는, 백신.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 56 또는 서열번호 58의 서열을 포함하는, 백신.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 감염된 동물과 백신접종된 동물 사이의 차이(DIVA)에 대한 검출 마커로서 사용하기 위한, 바이러스.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 청구된 바이러스를 암호화하는, 핵산 분자.
  14. 제13항에 있어서, 상기 분자가 DNA 분자인, 핵산 분자.
  15. 제14항에 청구된 DNA 분자를 포함하는, DNA 작제물.
  16. 제15항에 청구된 DNA 작제물의 RNA 전사물.
  17. 제15항에 청구된 DNA 작제물 또는 제16항에 청구된 RNA 전사물을 포함하는, 세포.
  18. 적합한 양의 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 부형제 중에 현탁된 제13항 또는 제14항에 청구된 핵산 분자를 포함하는, 조성물.
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