CN104046684B - 基于甘露糖受体mrc-1基因的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于甘露糖受体（MRC-1）基因的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法，通过设计与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染紧密关联的基因的荧光实时定量PCR引物，利用该引物检测猪感染前MRC-1基因在猪体内的正常表达水平，然后检测感染5天后该基因的表达水平，如果MRC-1基因的表达量显著上调，则可以确定该品种猪对PRRSV具有较强的抗性，为抗蓝耳病猪品种，有利于优良品系猪的繁育工作。

Description

基于甘露糖受体MRC-1基因的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

技术领域

本发明涉及抗蓝耳病猪的分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种基于甘露糖受体MRC-1基因的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS），俗称“蓝耳病”是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的，该病毒是巢状病毒目动脉炎病毒科的一个成员，同属的病毒还有马动脉炎病毒，鼠乳酸脱氢酶酶病毒和猴出血热病毒。该病主要引起猪的繁殖与呼吸症状，表现为间质性肺炎和母猪流产木乃伊胎等，每年对全世界的养猪业造成了巨大的经济损失。2007年在中国爆发了一场高热病，该病迅速在全国范围扩散，超过200万头猪被感染，40万头猪死亡，该病最后证实是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的。PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞，现在研究表明在感染PRRSV后，先天免疫中PRRSV感染不能引起有效的I型干扰素应答，体液免疫不能及时产生有效的中和抗体，而且会形成抗体依赖的病毒增强效应，最终导致免疫抑制和持续感染，由于该病毒的突变率极高，传统疫苗方法也不能有效控制该病，很多研究都致力于寻找RNAi，干扰素等新的方法来针对该病毒，用于弥补传统方法的不足。

由于不同的猪品种和个体的遗传背景差异，对蓝耳病的抗性也不同，研究表明在临床症状和生理生化指标上，通城猪、梅山猪等国内猪品种相较于国外长白猪、大白猪等感染高致病性PRRSV后有较强的抗性。通过高通量测序的方法，对感染PRRSV前后长白猪和通城猪的组织做差异基因表达分析，某些免疫相关的基因表达量在感染前后两个品种间有显著的差异。通过对不同品种间PRRSV感染造成的基因表达差异的分析，不仅可以研究蓝耳病的感染机制，还可以找出抗性或易感相关的基因，从而为蓝耳病的治疗和预防提供新办法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于甘露糖受体MRC-1基因的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法。

甘露糖受体（MRC-1）是一种位于巨噬细胞或树突状细胞表面的C-型凝集素，它可以识别病原表面的甘露糖，激活补体途径。该受体通过识别糖蛋白表面的碳水化合物参与许多生物学过程，包括细胞互作，巨噬细胞吞噬等。本发明人首次发现在两个不同抗性的猪品种：长白猪（易感猪）、通城猪（抗病猪）感染PRRSV后，甘露糖受体（MRC-1）基因受到了不同的调控，从而可以通过检测该基因的表达来预测猪的抗病性。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于检测甘露糖受体MRC-1基因的特异性PCR引物对，其包括：

上游引物MRC-1-F：5′-GGCGTGTCCACTTACCACAA-3′和

下游引物MRC-1-R：5′-TTGCCTATGAGATCTTTCGTGTCA-3′。

本发明还提供一种筛选抗蓝耳病猪的方法：通过检测猪体内甘露糖受体MRC-1基因的表达量来筛选抗蓝耳病猪品种，抗蓝耳病猪品种在感染猪繁殖与呼吸综合征病毒后（例如感染PRRSV5天后），猪体内甘露糖受体MRC-1基因的表达量上调。

优选通过荧光实时定量PCR检测感染PRRSV前后（即感染第0天、感染第5天）猪体内甘露糖受体MRC-1基因的表达量。荧光实时定量PCR使用的引物为：

目的基因MRC-1：

上游引物MRC-1-F：5′-GGCGTGTCCACTTACCACAA-3′

下游引物MRC-1-R：5′-TTGCCTATGAGATCTTTCGTGTCA-3′；以及

内参基因RPL32：

上游引物RPL32-F：5′-CAACAAGAAAACAAAGCACATGCT-3′

下游引物RPL32-R：5′-GCGGTTCTTGGAAGAGACGTT-3′。

荧光实时定量PCR检测步骤为：

1）提取待测猪样品组织中的总RNA，反转录成cDNA；

2）以步骤1）中的cDNA为模板，分别以MRC-1-F和MRC-1-R、RPL32-F和RPL32-R为引物，进行荧光实时定量PCR反应；

3）分析PCR产物。

荧光实时定量PCR反应体系为：

荧光实时定量PCR反应条件为：在ABI7300荧光实时定量PCR仪上进行反应，荧光实时定量反应程序模板设置为ddCtPlate，反应循环参数设置为：55℃5min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环；采用相对定量2^-△△CT法计算相对表达量。

本发明进一步提供含有引物MRC-1-F和MRC-1-R的用于检测抗蓝耳病猪品种的试剂盒。

本发明提供的一种基于甘露糖受体MRC-1基因的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法，通过设计与PRRSV感染紧密关联的基因的荧光实时定量PCR引物，利用该引物检测猪感染前MRC-1基因在猪体内的正常表达水平，再检测感染5天后该基因的表达水平，如果MRC-1基因的表达量显著上调，则可以确定该品种猪对PRRSV具有较强的抗性，为抗蓝耳病猪品种，有利于优良品系猪的繁育工作。

附图说明

图1为本发明实施例1中PRRSV感染前（第0天）和感染后（第5天）猪体内MRC-1基因的荧光实时定量PCR结果；其中，A为抗性猪PRRSV感染前后MRC-1基因的表达量，B为易感猪PRRSV感染前后MRC-1基因的表达量。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（NewYork:GoldSpringHarborLaboratoryPress,1989），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1基于甘露糖受体MRC-1基因的表达量筛选抗蓝耳病猪的方法

前期实验通过对6个品种猪（长白猪、大白猪、杜洛克猪、清平猪、梅山猪、通城猪）感染高致病性蓝耳病毒（PRRSV）进行抗病猪的筛选，通过临床症状记录：采食量、体温、生理生化、细胞因子以及存活时间等的检测，最后得到了对蓝耳病抗性差异较大的两个品种：长白猪（易感猪）、通城猪（抗病猪）。选取抗病猪和易感猪各8头，分别在第0天和感染高致病PRRSV后第5天宰杀取样，肺组织提取总RNA，建库进行高通量测序，通过生物信息学分析，发现在感染高致病性PRRSV后抗病猪的MRC-1基因表达上调，而易感猪表达下调，通过荧光定量PCR实验验证得出同样的结果。设计针对MRC-1基因（GenBank登录号为NM_001255969）的引物检测感染前后MRC-1基因的表达情况，可以用来筛选猪抗病猪。引物序列如下：

目的基因MRC-1：

上游引物MRC-1-F：5′-GGCGTGTCCACTTACCACAA-3′

下游引物MRC-1-R：5′-TTGCCTATGAGATCTTTCGTGTCA-3′

内参基因RPL32（GenBank登录号为NM_001001636）：

上游引物RPL32-F：5′-CAACAAGAAAACAAAGCACATGCT-3′

下游引物RPL32-R：5′-GCGGTTCTTGGAAGAGACGTT-3′

一、总RNA的提取

1.动物组织：取新鲜或-70℃冻存动物组织，每30-50mg组织加入1mlTrizol，匀浆仪进行匀浆处理。样品体积一般不要超过Trizol体积的10%。

2.将以上样品在15-30℃放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3.可选步骤：4℃12,000rpm(约13,400g)离心10分钟，取上清。

注意：如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

4.向以上溶液中加入氯仿，每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5.4℃12,000rpm(约13,400g)离心10-15分钟，此时样品分成三层：黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相（约500μl）转移到一个新的RNase-Free离心管中。

6.在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20-30分钟。

7.4℃12,000rpm(约13,400g)离心10分钟，弃上清。

8.加入75%乙醇（用RNase-free水配制）洗涤沉淀。每使用1mlTrizol用1ml75%乙醇对沉淀进行洗涤。

9.4℃5,000rpm(约2,300g)离心3分钟。用枪头小心吸出上层液体，保留沉淀。

注意：不要吸出沉淀，剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。

10.室温放置2-3分钟，晾干，加入30-100μlRNase-free水，充分溶解RNA。所得到RNA置-70℃保存。

二、反转录PCR

1.打开RNA二级结构

在一支无核酸酶污染的小离心管中加入：

RNA2μg

oligodT1μg

无核酸酶水补齐至15μl。

加热离心管到70℃，5分钟。

2．反转录PCR

向上述离心管中加入：

在42℃孵育60分钟进行反应。

三、利用荧光实时定量PCR技术检测MRC-1基因的表达情况

荧光实时定量PCR：

基本参照荧光实时定量PCRMix试剂盒（美国ABI公司）说明书操作。实验步骤如下：

1.按照下列反应体系在96孔板上加样

2.在ABI7900HT荧光实时定量PCR仪上按下列反应条件进行反应：荧光实时定量反应程序模板设置为ddCt（RelativeQuantitation）Plate，反应循环参数设置为：55℃5min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，共40个循环。

每个样品、阴性对照（ddH₂O）、内参基因各做3个重复。

4.优化反应体系，制作标准曲线，保证目的基因(MRC-1)和内参基因(RPL32)的斜率差值<0.1。

5.对待测的样品采用相对定量2^-ΔΔCt法进行荧光实时定量PCR验证：

ΔCt实验组=(实验组目的基因Ct-实验组内参基因Ct)

ΔCt对照组=(对照组目的基因Ct-对照组内参基因Ct)

2^-ΔΔCt=2^{-(ΔCt实验组-ΔCt对照组)}

6.结果分析：通过对3头易感猪（长白猪）和抗感猪（通城猪）PRRSV感染前（第0天）和感染后（第5天）MRC-1基因的检测表明，抗性猪在感染后MRC-1基因表达量显著升高，而易感猪在感染后该基因表达量显著下降。图1显示了PRRSV感染前（第0天）和感染后（第5天）猪体内MRC-1基因的荧光实时定量PCR结果。

PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞，而MRC-1是位于巨噬细胞表面的一种C-型凝集素，它可以识别病毒表面的甘露糖分子，参与细胞的抗病毒应答，而本发明的结果正好与该理论一致，一方面抗病猪MRC-1感染PRRSV后表达量上调有助于抑制病毒增殖，另一方面易感猪表达量下调不仅意味着其抵抗病毒的效果降低，而且可能由于PRRSV的感染造成易感猪的肺泡巨噬细胞数量减少，从而进一步加重了易感猪的病情。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.用于检测甘露糖受体MRC-1基因的特异性PCR引物对，其特征在于，所述PCR引物对包括：

上游引物MRC-1-F：5′-GGCGTGTCCACTTACCACAA-3′和

下游引物MRC-1-R：5′-TTGCCTATGAGATCTTTCGTGTCA-3′。

2.含有权利要求1所述的引物对的用于检测抗蓝耳病猪品种的试剂盒。