KR20080083107A - 바이러스 검출을 위한 조성물 및 이 조성물을 사용하는방법 - Google Patents

바이러스 검출을 위한 조성물 및 이 조성물을 사용하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 분리된 펩티드를 제공한다. 분리된 펩티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47 중에서 선택한 아미노 서열을 포함하는 분리된 펩티드를 제공하며, 아미노산 서열은 14개 아미노산 길이보다 길지 않다. 또한 본 발명은 펩티드를 포함하는 조성물 및 바이러스 검출시 이 조성물의 용도를 제공한다.
바이러스 검출, 바이러스 프로테아제, SARS,

Description

바이러스 검출을 위한 조성물 및 이 조성물을 사용하는 방법{COMPOSITIONS AND METHODS USING SAME FOR THE DETECTION OF VIRUSES}
본 발명은 촉매 분자의 절단 활성을 간단하고 빠르게 검출하기 위한 신규한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 조성물을 사용하는 진단 테스트 및 키트 또한 제공한다.
질병 또는 건강 위험의 마커, 일반 및 병원성 과정 또는 질병의 마커 또는 병원체 또는 외부 병원체 및 이의 부산물의 지표와 같은 건강-관련 병인의 빠르고 특이적이고 비용면에서 효과적인 검출에 대한 필요성이 증가하고 있다. 이는 HIV, SARS, 조류독감(Avian Flu), 웨스트나일열(West Nile Fever), 내성 병원성 박테리아 질환 등과 같은 세계 도처의 전염성 질환의 유포의 반복되는 발생률에 의해 더욱 분명해졌다. 질병의 유행성 및 범유행성 발생의 증가하는 위협에 직면하여 질병 병인의 초기 발견은 적적한 치료 및 예방에 결정적인 역할을 한다. 그러나 병원균 검출 및 형벌(typing)의 현재 가능한 많은 방법의 비용, 복잡성 및 비효율성은 검역, 매개충 박멸 및 예방접종과 같은 미심쩍은 성공을 거두고 있는, 시간이 소요되고 노동 집약적이며 궁극적으로 비용이 많이 들고 비효율적인 정책을 실행함에 의한 것이다. 게다가 질병 및 병리학적 과정의 많은 마커들이 다양한 암의 텔레오메 라제(teleomerase), 백혈병에서의 말단 디옥시누클레오티딜 트랜스퍼라제(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase; TdT) 및 알츠하이머병의 β- 및 γ-세크리타제(secretase)와 같은 촉매 활성을 포함하는 일부에 의해 확인되었다.
1918년에 세계에 스페인 독감이 발생하여 유럽에서 25만명 이상이 사망하였다. 그 이후 의료 비상상태의 공포가 다시 돌아왔다. 몇 년 전에 동양에서 치명적인 SARS 바이러스가 발생하여 세계 경제를 마비시키는 위협이 되었다. SARS 발생은 서서히 진행되고 최종적으로는 극복되었으나 이는 다만 열로부터 격리시키는 것과 같은 건강한 사람과 환자를 장기 격리시키는 것을 포함하는 극단적으로 분열시키는 수단에 의한 것이다. 최근에는 조류독감의 발생이 위험한 병원균의 빠른 검출을 위한 개선된 방법의 중요성을 세계에 다시 한번 상기시켰다.
21세기에서 새로운 유행병이 퍼지는 위험이 항공 여행에서의 높은 감염 가능성 및 개인 및 집단의 증가 된 이동성에 의해 엄청나게 증가하였다. 병원균의 검출에 널리 사용되는 방법은 효소 결합 면역흡수 검정법 (eenzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 효소 면역검정법(enzyme immunoassay; EIA) 및 면역형광 검정법(immunofluorescence assay; IFA)과 같은 면역학적 검출을 포함하며 이 방법은 초기 감염 후 10-20일에 RT-PCR에 의한 항-병원체 항체의 검출에 의지하는데 이는 비용이 많이 들고 시간이 오래 걸리며 종종 부정확하며 또한 조직 배양 감염성은 시간이 소요되고 비용이 많이 든다. 그러므로 공항 및 그외 공공 장소에서 질병에 걸리거나 잠재적으로 전염력을 가진 개인을 검출하기 위한 빠르고 간단한 진단 방법 및 키트가 시급하게 요구된다. 방법은 현재의 바이러스 균의 매우 다 양한 특성에 직면하여 고도의 병원균 종을 돌연변이화하고 형성할 수 있는 적절한 검출을 가능하게 할 수 있어야 한다. 좀더 강한 바이러스 유형의 생산 혼합 교차된 감염성의 가능성을 배제하기 위해 여러 바이러스 병원균을 즉시 검출해야될 필요성이 있다. 병원체의 빠르고 정확한 형벌 또한 우선시된다. 병원 세팅 또는 집에서 치료의 선택을 위한 정확한 데이터를 제공하고 다른 병원균의 혼합 및 감염을 예방할 뿐만 아니라 치료 프로토콜의 현장 모니터링 및 미세 조정을 용이하게 하는 많은 병원체의 빠른 검출이 필요하다.
많은 생물은 성장 또는 분화, 대사 등의 특이 단계에 관련된 특징적인 촉매 활성을 갖는다. 마찬가지로 병리학적 과정은 종종 암 마커 및 심장 효소와 같은 진단에 사용할 수 있는 특징적인 효소 활성을 갖는다. 진단 및 분류를 위한 촉매 활성의 검출에 기초한 방법은 예를 들어 병원성 박테리아의 진단 및 분류(예를 들어 Maiden 등의, J. Clin. Micro, 1996;34:376-84 및 Godsey 등의 미국 특허 번호 제5,888,760호 참조), 발암작용에서의 DNA-phytolyases (예를 들어 Kundu 등의 ChemiBioChem 2002;3:1053-60), 알츠하이머병에서의 β-시크리타제(secretase) 활성(Hazuda 등의 미국 특허 출원 번호 제200302555호 참조), 살아 있는 세포에서의 대사 활성의 맵핑(mapping)(Boonacker 등의, J of Histochem and Cytochem 2001;49:1473-86 참조), 카스파제(caspase) 및 기타 세포자살(apoptosis)-관련 효소(Weber 등의 미국 특허 출원 번호 제20020150885호 참조) 및 바이러스의 검출(예를 들어 Kettner 등의 미국 특허 번호 제4,952,493호 참조)에 대하여 기술되었다.
이러한 촉매 활성의 효과적인 측정 및 임상 사용은 쉽게 검출 가능하게 만들 수 있는 잘 정의되고 특이적인 기질을 요구한다. 이러한 잠재적 진단 촉매 활성은 바이러스 감염의 특이 프로테아제 활성이다.
SARS 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus), 코로나바이러스(coronavirus), C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus) 등과 같은 많은 바이러스가 복제되는 동안 바이러스 유전 물질은 폴리프로테인(polyprotein)을 형성하기 위해 복사되며 이는 궁극적으로 둘 또는 그 이상의 생물학적으로 활성인 단백질로 분열되었다. 바이러스 폴리프로테인의 각각의 단백질로의 분열은 바이러스 생명 주기의 결정적인 부분이다. 아데노바이러스(adenovirus), 바쿨로바이러스(baculovirus), 코모바이러스(comovirus), 피코마바이러스(picomavirus), 레트로바이러스(retrovirus) 및 토가바이러스(togavirus) 과(families)를 포함하는 많은 바이러스는 바이러스 복제에 요구되는 활성 단백질을 형성하기 위한 특이 분열 위치에서 바이러스 폴리프로테인을 분열하는 프로테아제를 코드한다. 예를 들어 콕스푸트 반점 바이러스(Cocksfoot mottle virus)[소베모바이러스(Sobemovirus) 속]의 복제 동안의 폴리프로테인 프로세싱(processing)은 참고문헌으로 본원에 편입된 Makinen 등의 J. Gen. Virol.2000;81:2783-89에 기재되어 있다. 참고를 위해 바이러스 프로테아제 및 그외 효소의 몇몇 알려진 실례의 자세한 목록은 하기에 제공되었다.
몇몇 바이러스성-코드된 프로테아제는 오직 특이 바이러스의 폴리프로테인만을 분열한다. 그외의 프로테아제는 한 유형 이상의 바이러스의 폴리프로테인을 분열한다. 프로테아제 작용의 특이성은 폴리프로테인의 분열 영역에서 프로테아제가 상호작용하는 성질로부터 기인한 것이다. 게다가 이러한 위치에서의 분열율은 분열 위치를 둘러싸고 있는 폴리프로테인의 펩티드 서열에 따라 다양하다.
이러한 바이러스 프로테아제에 의해 인식되는 바이러스 단백질에 따른 분열 부분은 잘 보존된 아미노산 서열을 함유함을 보여주며 이는 진단 및 치료 방법으로 도입될 수 있는 가능성을 제시한다.
예를 들어 Kettner 등의 미국 특허 번호 제4,952,493호는 바이러스 프로테아제에 의해 인식되는 보존된 분열 부위에 따라 설계된 바이러스-특이 프로테아제 활성의 검출용 펩티드 기질을 기술한다. 이러한 펩티드 기질의 분열 부위는 바이러스 폴리펩티드의 서열결정에 의해 결정된 바이러스-특이 분열 부위의 아미노산 서열에 따라 또는 바이러스 게놈의 코딩 서열에 따라 성립되었으며 다른 바이러스 폴리펩티드 서열과 정렬하여 비교할 수 있다. 특정 아미노산 잔기의 다른, 생물학적으로 유사한 잔기로의 보존적 치환은 허용할 수 있는 것으로 간주되었다.
Tan 등의 미국 특허 출원 번호 제20050214890호는 시료에서 기생충, 원생동물, 바이러스 및 그외의 프로테아제 활성을 검출하기 위한 매트릭스(matrix)-결합된 재조합 형광성 융합 기질의 사용에 대해 기재하며, 여기에서 검출은 다중 기질의 프로테아제 인식의 패턴에 기초한다. 분열 및/또는 인식 기질은 알려진 공통 분열 및/또는 결합 서열로부터 설계되었다. 목표 프로테아제의 증가 된 검출은 다중 기질의 동시 검정에 의한 것이다.
그러나 상기 기재된 방법들 중 어느 것도 최상의 친화도가 신규 균주의 특이적인 인식뿐만 아니라 다중 시료 및 다중 바이러스의 신속한 동시 분석으로 최종적 으로 수득 되는 것과 같은 바이러스 기질을 선별하는 것을 기재하거나 제시하거나 언급하지 않았다.
기질 분열 서열의 최적화된 설계에 의한 프로테아제 검출 검정의 증가 된 효율은 바이러스 감염의 우수한 신속성, 감수성 및 검출 비용 및 특성화를 제공할 것이다. 게다가 기질 분열 서열의 설계 방법 및 이의 산물은 항-바이러스 의약품의 스크리닝 및 개선에 사용될 수 있다.
그러므로 광범위하게 인식되도록 하는 요구가 있으며 이는 상기와 같은 제한이 없는 분열 활성에 의해 특징지어지는 질환 및 감염 과정의 신속하고 특이적인 검출을 위한 촉매성 분자의 분열 활성을 검출하기 위한 최적화된 기질 및 방법을 갖기에 매우 유리할 것이다.
본 발명의 한 양상에 따라, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47 중에서 선택한 아미노 서열을 포함하는 분리된 펩티드를 제공하며, 아미노산 서열은 14개 아미노산 길이 보다 길지않다.
본 발명의 다른 양상에 따라, 적어도 하나의 검출가능한 성분에 부착된 바이러스 프로테아제 기질을 포함하는 조성물을 제공하며 이 기질은 아미노산 서열을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 적어도 하나의 검출가능한 성분은 FRET 쌍이며 이에 반하여 기질의 분열은 FRET 쌍으로부터 신호를 생성한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 조성물은 추가로 분리 성분(separating moiety)을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 하기 일반식을 갖는 조성물을 제공한다:
X-Y-Z
위 식에서:
Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며 이 기질은 아미노산 서열을 포함하고 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
X는 검출가능한 성분을 포함하며; 및
Z는 2개 상 분리 시스템의 분리상에 결합이 가능한 분리 성분을 포함하며;
여기에서 X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않는다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 검출가능한 성분 X는 효소, 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 단백질, 선구효소(proenzyme), 화학발광(chemiluminescent)기질 및 방사성동위원소(radioisotope) 중에서 선택한 표지제(labeling agent)를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 분리 성분 Z는 면역학적 결합제, 자기(magnetic) 결합 성분, 펩티드 결합 성분, 친화성 결합 성분 및 핵산 성분 중에서 선택한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 하기 일반식을 갖는 조성물을 제공한다:
X-Y-Z
위 식에서:
Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며 이 기질은 아미노산 서열을 포함하고 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
X 또는 Z는 적절한 방법으로 분열된 조성물 및 분열되지 않은 조성물 사이의 분리를 가능하게 하는 마커인, 검출가능한 성분 및/또는 분리 성분을 포함한다.
여기에서 X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않는다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 여기에서 마커인 성분 X 또는 Z는 효소, 형광단, 발색단, 단백질, 화학발광 기질, 소광제(quencher), FRET 쌍, 비드(bead), 펩티드, 전구효소(pre-enzyme) 및 방사성동위원소(radioisotope) 중에서 선택한 표지제, 면역학적 결합제, 자기 결합 성분, 펩티드 결합 성분, 친화성 결합 성분 및 핵산 성분을 포함한다.
본 발명의 추가적인 양상에 따라, 시료에서 적어도 하나의 바이러스를 검출하는 방법을 제공하며 이 방법은 다음 단계를 포함한다:
(a) 기질이 분열되는 조건 하에서 조성물 중 적어도 하나를 시료와 접촉시키는 단계; 및
(b) 기질의 분열을 확인하는 단계, 여기에서 기질의 분열은 시료에서 적어도 하나의 바이러스의 존재를 나타낸다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 단계 (a)는 다른 바이러스 프로테아제의 적어도 2개의 기질과 시료를 접촉함을 포함하며 여기에서 적어도 두 개의 기질 중 어느 것도 분열되지 않는 것은 시료에 바이러스가 없음을 나타내는 것이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라 시료는 점액, 타액, 인후 세척액, 코 세척액, 척수액, 가래, 뇨, 정액, 땀, 대변, 혈장, 혈액, 기관지폐포액(broncheoalveolar fluid), 질액, 눈물 및 조직 생검 중에서 선택한 것이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 시료에서의 분열 활성의 검출은 의학 증상의 진단이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 동질성 검정을 사용하여 확인한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 이질성 검정을 사용하여 확인한다.
본 발명의 다른 추가적인 양상에 따라, 시료에서 적어도 하나의 바이러스를 검출하기 위한 키트를 제공하며 이 키트는 적어도 하나의 조성물 및 기질의 분열을 검출하기 위한 시약을 포함한다.
본 발명의 또 다른 추가적인 양상에 따라, 포장재(packaging material) 및 다수의 바이러스의 존재를 검출하기 위한 다수의 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공하며 각 조성물은 하기의 일반식을 갖는다:
X-Y-Z
위 식에서:
Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
X 또는 Z는 적절한 방법으로 분열된 조성물 및 분열되지 않은 조성물 사이의 분리를 가능하게 하는 마커인 검출가능한 성분 및/또는 분리 성분을 포함하고;
여기에서 X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않으며;
여기에서 X 또는 Z 각각은 적어도 하나의 특징적인 검출가능한 성분을 갖고 이에 반하여 포장재는 키트가 시료에서 다수의 바이러스를 검출하기 위한 것임을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
본 발명의 추가 양상에 따라, 포장재(packaging material) 및 다수의 바이러스의 존재를 검출하기 위한 다수의 조성물을 포함하는 진단용 키트를 제공하며 각 조성물은 하기의 일반식을 갖는다:
X-Y-Z
위 식에서:
Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며, 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
X는 검출가능한 성분을 포함하며; 및
Z는 2개 상 분리 시스템의 분리상에 결합이 가능한 분리 성분을 포함하며;
여기에서, X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않고;
여기에서, X 각각은 적어도 하나의 특징적인 검출가능한 성분을 갖고 이에 반하여 포장재는 키트가 시료에서 다수의 바이러스를 검출하기 위한 것임을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 다수의 조성물은 단일 고형 지지물에 부착된다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 특징적인 검출은 단일 고형 지지물 상의 추적가능한 위치(addressable location)에 의해 이루어진다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 특징적인 검출은 다른 검출가능한 성분에 의해 달성된다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 다수의 조성물 각각은 고형 지지물에 부착된다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 고형 지지물은 비드로써 형성된다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 비드는 착색 비드, 자기 비드, 표지된(tagged) 비드 및 형광 비드 중에서 선택된 것이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 코로나 바이러스, SARS, HMPV(Human Meta pneumo virus; 인간 메타 폐 바이러스), 인플루엔자 A+B, 조류 독감, 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus; 호흡기세포융합 바이러스), 리노 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 호흡기 키트이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 호흡기 키트는 한타 바이러스(Hanta virus) 및 라 크로세 뇌염(La Crosse Encephalitis)을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 로타 바이러스(Rota virus), 아데노 40/41, A형 간염, C형 간염, E형 간염, 칼리시바바이러스(calicivirus) 및 CMV(Cytomegalovirus; 사이토메갈로바이러스) 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 소화기 키트이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 진단 키트는 엔테로바이러스(Enterovirus)(1-80), 웨스트 나일 바이러스, 단순포진(Herpes Simplex) 1, 2 및 6 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 수막염(meningitis) 키트이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 진단 키트는 토가 바이러스(Toga virus), 플라비 바이러스(Flavi virus) 및 광견병 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 수막염 키트이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 진단 키트는 HIV 균주, 단순포진 1, 단순 포진 2, HSV-1, HSV-2, HPV(Human Papilloma Viruses; 인간 유두종 바이러스) 및 HTLV-1 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 성인성 질환(sexually transmitted diseases) 키트이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 진단 키트는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, HIV, 포진(Herpes) 바이러스 1 및 2 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 여행자용 키트이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 진단 키트는 광견병 및 디스템퍼(Distemper) 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 수의용(veterinarian) 키트이다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 적어도 하나의 시료는 다수의 시료를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 적어도 하나의 바이러스는 다수의 바이러스를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 아데노바이러스이고 기질은 서열 번호 1 또는 2를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 알파바이러스(alphavirus)이고 기질은 서열 번호 3을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 루벨라(Rubella) 바이러스이고 기질은 서열 번호 4를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 HIV이고 기질은 서열 번호 5를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 HTLV이고 기질은 서열 번호 6, 7 또는 8을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 아테리(Arteri) 바이러스이고 기질은 서열 번호 9를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 코로나 바이러스이고 기질은 서열 번호 10을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 SARS 코로나 바이러스이고 기질은 서열 번호 11 또는 12 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 토로바이러스이고 기질은 서열 번호 13을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 CMV 바이러스이고 기질은 서열 번호 14 또는 15를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 포진 바이러스이고 기질은 서열 번호 16을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 플라바이러스이고 기질은 서열 번호 17을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 댕기바이러스이고 기질은 서열 번호 18, 19 또는 20을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 웨스트 나일 바이러스이고 기질은 서열 번호 21, 22 또는 23을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 황열(Yellow fever) 바이러스이고 기질은 서열 번호 24, 25 또는 26을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 일본 뇌염(Japanese Encephalitis) 바이러스이고 기질은 서열 번호 27, 28 또는 29를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 진드기 매개(Tick borne) 바이러스이고 기질은 서열 번호 30, 31 또는 32를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 C형 간염 바이러스이고 기질은 서열 번호 33, 34 또는 35를 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 페스티바이러스(Pestivirus)이고 기질은 서열 번호 36을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 A형 간염 바이러스이고 기질은 서열 번호 37 또는 38을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 HRV이고 기질은 서열 번호 39 또는 40을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 엔테로바이러스이고 기질은 서열 번호 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47을 포함한다.
하기에 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 HRV이고 기질은 서열 번호 143-151을 포함한다.
본 발명의 또 다른 추가 양상에 따라, 바이러스의 프로테아제에 대한 동역학적으로 최적인 기질을 설계하는 방법을 제공하며 이 방법은 다음의 단계를 포함한다:
(a) 적어도 하나의 바이러스 균주의 폴리프로테인의 다수의 분열 서열을 확인하는 단계, 여기에서 분열 서열은 프로테아제에 의한 가장 빠른 분열 동역학을 나타낸다; 및
(b) 가장 빠른 분열 동역학을 나타내는 과-광범위(family-wide) 공통 분열 서열을 확인하는 단계, 과-광범위 공통 분열 서열은 바이러스의 프로테아제에 대한 동역학적으로 최적인 기질을 설계하는 데 유용하다.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스의 프로테아제는 바이러스성 코드 프로테아제(viral encoded protease)이다.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스 중에서 선택된 것이다.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스는 텍티바이리대(Tectiviridae),파포바바이리대(Papovaviridae),시르코바이리대(Circoviridae) 및 헤파드나바이리대(Hepadnaviridae), 시스토바이리대(Cystoviridae), 비르나바이리대(Birnaviridae),레오바이리대(Reoviridae),코로나바이리데(Coronaviridae),플라비바이리대(Flaviviridae),토가바이리대(Togaviridae),아테리바이러스,아스트로바이리대(Astroviridae),칼리시바이리대(Caliciviridae),피코르나바이리대(Picornaviridae),포티바이리대(Potyviridae),레트로바이리대(Retroviridae),오르토믹소바이리대(Orthomyxoviridae),필로바이리대(Filoviridae),파라믹소바이리대(Paramyxoviridae),라브도바이리대(Rhabdoviridae),및부니아바이리대(Bunyaviridae),아데노바이리대(Adenoviridae),헤르페스바이리대(Herpesviridae),피코르나바이리대(Picornaviridae) 중에서 선택한 것이다.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 바이러스 프로테아제는 세린 프로테아제, 메탈로프로타아제, 아스파르트 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 3C 프로테아제, PA 트랜스크립타제, 아데닌 프로테아제, 2A 프로테아제, 키모트립신(chimotrypsin) 또는 트립신 중에서 선택한 것이다. 예를 들어: NS3, NS2, NS-프로 시스테인 프로테아제, nsP2 시스테인 프로테아제, nsP23프로, C 단백질 프로테아제, SFV NS, HIV 아스파르트 프로테아제, nsp4 아테리바이러스 프로테아제, HCMV 프로테아제, NS2-3, NS3-4Ap 프로테아제, HTLV-1 PR.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 방법은 다음 단계를 추가로 포함한다:
(c) 과-광범위 공통 분열 서열을 갖는 다수의 분열 서열을 설계하는 단계; 및
(d) 다수의 분열 서열을 확인하는 단계, 분열 서열은 프로테아제를 갖는 가장 빠른 분열 동역학을 갖는다.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 설계는 최적 가용성, 온도 감수성 및/또는 pH 감수성을 갖는 분열 서열을 설계함을 포함한다.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 단계 (a)의 확인은 경험적 실험을 포함한다.
하기 기재된 본 발명의 바람직한 실시형태의 추가 특성에 따라, 단계 (a)의 확인은 데이타 마이닝(data mining)을 포함한다.
본 발명의 다른 추가 양상에 따라, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47 중에서 선택한 아미노 서열을 포함하는 분리된 펩티드를 제공하며 아미노산 서열은 14개 아미노산 길이보다 길지 않고 각각의 바이러스 프로테아제의 저해 활성에 대한 유사물을 포함한다.
본 발명의 다른 추가 양상에 따라, 바이러스 감염을 치료하기 위해 확인된 약제의 제조시 펩티드의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 추가 양상에 따라, 유효 성분으로서 분리된 펩티드를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 바이러스를 검출하기 위한 조성물 및 방법을 제공함에 의한 현재 알려진 구성의 단점을 성공적으로 제기하였다.
다른 방식으로 정의되지 않는다면 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 발명이 속하는 분야의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질을 본 발명의 실행 또는 시험에 사용할 수 있지만 적절한 방법 및 물질은 하기에 기재되어 있다. 불일치할 경우, 정의를 포함하는 특허 명세서는 조정될 것이다. 게다가 물질, 방법 및 실시예는 오직 설명하기 위한 것이며 한정하고자 하는 의도가 아니다.
본 발명은 단지 실례로서 수반되는 도면에 관하여 본원에 기재하였다. 상세히 도면에 관한 특정 참조로, 이는 실시예로서 나타낸 것이고 단지 본 발명의 바람직한 실시형태의 실례가 되는 검증을 위한 목적이며 본 발명의 원칙 및 개념 양상의 묘사를 쉽게 이해시키고 가장 유용하다고 여기지는 것을 제공하기 위해 표현된 것임을 강조한다. 이에 관련하여 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필수적인 것보다 더 자세히 발명의 구조적 사항을 보여줄 의도는 없으며 발명의 상세한 설명은 발명의 여러 형태가 어떻게 실제로 구체화되는지를 본 분야의 숙련자에게 자명하도록 만드는 도면을 갖는다.
도 1a 내지 1b는 각각 HRV 16 3C 및 SARS 3Cl 프로테아제를 갖는 플라스미드 pMND1(1a) 및 pMND2(1b)를 나타낸 것이다.
도 2는 E.coli에서 SARS 및 HRV로부터 재조합 3C 프로테아제의 발현의 시간 경과를 나타낸 것이다. 형질전환된 클론을 0.4mM IPTG로 유도하고, 전체 세포 용해질(lysate)을 프로테인 200 플러스 칩 키트(Protein 200 plus chip kit, 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재의 Agilent Technologies, Inc)를 사용하는 바이오아날라이저 2100 랩-온-칩(Bioanalyzer 2100 lab-on-chip) 상에서 전기영동으로 분석하였다. 1 레인-MW 레더(ladder); 2-4 레인-각각 유도 후 0, 1 및 6시간에서 pMND-2; 4-6 레인-각각 유도 후 0, 1 및 6시간에서 pMND-1. 시간에 따라 SARS 3CL 및 HRV 16 3C 프로테아제 발현의 꾸준한 증가를 주목하라.
도 3은 설계된 천연 분열 부위(Ori 2)의 기질 특성에 비해 PEP1 기질의 우수한 기질 특성을 그래프로 나타낸 것이다. 5μM 형광 기질 및 500nM 재조합 3C 프로테아제를 함유하는 시약은 340/490±15nm에서 형광측정법에 의해 측정된다. 효소 농도는 500pM-1μM Pep1(검은 타원형); Ori2(검은 다이아몬드 모양); Pep1 대조(검은 직사각형); Ori 2 대조(검은 삼각형)이다. Pep1를 갖는 우수한 기질 분열을 주목하라.
도 4는 3nM 내지 4μM의 기질 농도 범위에서, 합성 Pep1 기질을 갖는 HRV 3C 프로테아제(250nM)에 대해 우수한 반응 동역학을 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 HRV 3C 프로테아제를 갖는 분열에 있어 합성 Pep1 기질의 특이성을 그래프로 나타낸 것이다. 형광 Pep 1 기질을 E.coli 용해질(검은 사각형), 재조합 SARS 3CL 용해질(검은 원형), 재조합 HRV 3C 용해질(검은 삼각형) 및 대조(용해질 아님)(검은 다이아몬드형)으로 항온하였다. HRV 3C 프로테아제에 대한 Pep 1의 절대적인 특이성을 주목하라.
도 6은 코 세척액 조건 하에서 HRV 3C 프로테아제에 의한 Pep 1 기질의 효과적인 분열을 그래프로 나타낸 것이다. 형광 Pep 1 기질을 50% 부피의 코 세척액(시료 E 0052)의 부재(검은 사각형) 및 존재(검은 원형)시에 재조합 HRV 3C와 반응시켰다. 대조는 코 세척액(E 0052)(검은 다이아몬드형) 단독이다. 기질 분열에서의 코 세척액의 효과의 부재를 주목하라.
도 7은 분열 사건의 검출에 사용할 수 있는 본 발명의 조성물을 도식화한 것이다.
도 8은 상기 도 7에서 기재된 조성물을 사용하는 시스템의 기초 사건을 나타내는 도식이다.
도 9는 다중 바이러스의 분리 메카니즘을 나타내는 도식이다.
도 10a 내지 도 10e는 세 유형의 분열 작용이 일어난 세 분자의 동시 검출을 나타내는 도식이다.
도 11은 NS3 프로테아제에 의한 C형 간염 폴리프로테인의 순차적 단백질분해를 묘사하는 도식이다.
바람직한 실시형태의 상세한 설명
본 발명은 바이러스 검출용 조성물 및 이 조성물을 사용하여 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 원리 및 작용은 도면 및 수반되는 설명에 의해 쉽게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 실시형태를 자세하게 설명하기 전에 본 발명은 하 기 발명의 상세한 설명에 설명되는 상세한 내용으로 본 발명의 적용이 제한되지 않으며 실시예에 의해 예로서 설명하려는 것임이 이해될 것이다. 본 발명은 다른 실시형태 또는 다양한 방식으로 실행하는 것이 가능하다. 또한, 본원에서 사용된 표현 및 용어는 설명을 목적으로 하는 것이며 이로 한정하려는 것은 아니다.
급성 감염을 검출하기 위한 진단 검정의 분야는 단일 피분석물 검출로부터 다중 피분석물 검출까지 임상 실험실로부터 현장진단(point-of-care)으로 항체 검출부터 병원체 검출까지 신속하게 변하며 생물학적 시료를 수집하기 위한 침입성이 적은 접근을 사용하여 검출하는 것에 더 초점을 맞춘다. 새로운 검정은 통상적인 검정보다 전형적으로 더 민감하며 병원체 또는 병원체에 반응하는 숙주를 특성화하는 더 많은 정보를 제공하는 것이 가능하다. 공공 건강 관점으로부터 독특한 유전자 서열 또는 항원성 특성을 기초로 하는 병원체의 추적을 가능하게 하는 분자 전염병학의 출현은 전염병학자가 어떻게 전염병을 조사하고 평가하며 풍토병을 평가하는 지에 대해 변혁을 일으켰다. 게다가 현장진단(POC; point-of-care) 장치의 용도는 감염의 검출 및 감시에 강한 영향을 줄 수 있으며 병의 발생을 정확하게 확인하기 위한 능력을 증가시킬 것이다.
바이러스 효소 활성의 확인을 통한 백신 검출은 Dorit Arad의 미국 특허 번호 제4,952,493호 및 미국 특허 출원 번호 제20050048473호에서와 같이 이미 제시되었다. 효소 활성에 기초한 이러한 진단 검정은 후자가 방해가 되므로 실행하는데 시간이 걸리고 비용도 많이 드는 폴리머라제 사슬 반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)과 같은 분자 검정에 비해 훨씬 우수하다. 게다가 현재 가능한 PCR 방법은 방법이 비효과적이고 또한 안전하지 못함을 나타내는 40%의 잘못된 양성 및 음성 결과(이들은 또한 불활성 바이러스를 확인하기 때문임)를 갖는다. 일반적으로, 살아있는 시료에서의 바이러스 프로테아제의 검출은 신체에서 살아있고 활성인 바이러스 감염의 존재를 나타낸다. 이는 살아있는 바이러스에 관련되지 않은 DNA 또는 RNA 서열을 검출할 수 있는 PCR 분석 및 바이러스에 대한 신체의 면역 반응의 존재를 측정하는 항체 검출 검정과는 상당히 반대되는 것이다. 반대로, 바이러스 항원을 검출하는 항체 검정은 바이러스 항원이 하나의 질병 생명 주기 내에서도 특이 항체에 대하여 변하고 돌연변이되기 때문에 살아있는 바이러스의 존재를 항상 나타내지는 않는다.
본 발명에 대하여, 발명자는 프로테아제 효소 활성 검정에 대한 최적 기질은 분열 동역학이 가장 빠른 폴리프로테인(즉, 프로테아제 천연 기질)의 공통 분열 부위일 것이라는 가정을 하였다. 이러한 서열에 따른 기질은 같은 프로테아제를 공유하는 많은 바이러스의 신속하고 광범위한 확인을 위한 효소 진단 시험에서 유용하게 사용할 수 있다.
하기 본원에 설명된 바와 같이(그리고 C형 간염 NS3 프로테아제에 대한 실시예 1에 상세히 설명된 바와 같이), 본 발명의 발명자는 많은 바이러스과에 대한 동역학적으로 최적인 기질을 확인하였다(즉, DNA 및 RNA 바이러스, 실시예 2 참조). 확인된 HRV 및 엔테로바이러스의 기질은 코 및 뇌척수액(cerebral-spinal fluid; CSF)에서 각각의 바이러스를 성공적으로 검출하기 위해 사용되며 RT-PCR 분석과 비교하였다(실시예 4 및 5). 그러나, 언급된 바와 같이, RT-PCR 검출의 정확성은 의 심스러운 반면, 본 발명의 프로테아제 검출은 상기 기재된 바와 같이 RT-PCR에 의한 검출보다 상당한 장점을 갖는다.
그러므로, 본 발명의 한 양상에 따라 바이러스 프로테아제에 대한 동역학적으로 최적인 기질을 설계하기 위한 방법을 제공한다.
본원에서 사용된 바와 같은 문구 "동역학적으로 최적인 기질"은 프로테아제에 의해 가장 빠르게 분열되는 천연 분열 부위에 상응하는 보존된 아미노산 서열을 의미한다[효소가 미카엘-멘텐 동역학(Michaelis-Menten kinetic)을 따름을 나타내는 K(1M), k(cat)/K(m)에 의해 정의됨].
기질은 아미노산 기질(즉, 아미노산 서열을 포함함) 또는 이의 유사물일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 문구 "바이러스의 프로테아제"는 바이러스성 코드된 프로테아제를 의미한다(프로테아제의 예가 하기에 제공되었다). 바이러스는 단백질분해 효소를 발현하는 모든 바이러스일 수 있다(바람직하게는 숙주 프로테아제의 분열 특이성을 나타내지 않는다).
본 발명의 이러한 양상의 방법은 (a) 바이러스의 적어도 하나의 균주의 폴리프로테인의 다수의 분열 서열(예를 들어, 도 11 참조)에서 확인함에 의해 달성되고 분열 서열은 프로테아제에 의한 가장 빠른 분열 동역학을 나타내며 (b) 가장 빠른 분열 동역학을 나타내는 과-광범위 분열 서열을 확인하고 상기 과-광범위 분열 서열은 바이러스의 프로테아제에 대해 동역학적으로 최적인 기질을 설계하는데 유용하다.
경험적 동역학 특성화는 일반적으로 재조합 또는 합성 방법(예를 들어, HPLC-기저 검정)을 사용함에 의한 수용성의 플루오로제닉(fluorogenic) 기질의 제조를 포함하는 본 분야에서 알려진 어떤 방법을 사용하여 달성할 수 있다. 대안적으로, 펩티드 기질의 세포성 라이브러리(celluar library)를 사용할 수 있다[에를 들어, Boulware 및 Daugherty 2006 PNAS 103:20-7583:7588을 참조]. 또한, 본원에 참고문헌으로서 도입된 Orr D.C. 등의 "Hydrolysis of a series of synthetic peptide substrates by the human rhinovirus 14 3C proteinase, cloned and expressed in E.coli", J.Gen.Vir.Vol. 70, pp.2931-42(1989)를 참조하라.
대안적 또는 추가적 문헌 데이타 마이닝은 하기 실시예 중 실시예 1에 상세히 기재된 바와 같이, 가장 빠른 분열 동역학을 나타내는 분열 서열을 설명하기 위해 사용될 수 있다.
가장 빠른 분열 동역학을 나타내는 분열 서열이 가까이 있으면 가장 빠른 분열 동역학을 나타내는 과-광범위 공통 분열 서열이 확인된다.
본원에서 사용된 바와 같은 "과-광범위 공통"은 동일한 바이러스 과에 속하는 폴리프로테인의 가장 빠른 분열 서열에 상응하는 서열의 정렬된 열의 각 위치에서 가장 일반적으로 발생하는 아미노산을 의미한다.
이는 BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST를 통해 사용가능한 Basic Local Alignment Search Tool) 또는 스미스-워터맨 알고리즘(Smith-Waterman algorithm)과 같은 서열 정렬 알고리즘을 사용하는 일반 생물정보학적 도구를 사용하여 이루어진다(하기 실시예 중 실시예 1 참조).
과-광범위 공통을 확인하면 이러한 공통 서열을 포함하는 펩티드를 설계할 수 있으며 이들의 서열을 필요하다면 대상 생화학적 특성을 나타내도록 개조할 수 있다. 실례는 최적 가용성, 온도 안정성 및 pH 안정성을 포함한다. 이러한 펩티드는 본 발명의 기질로서 여겨진다.
본원에서 사용된 용어 "펩티드"는 천연 펩티드(분해 산물, 합성된 펩티드 또는 재조합 펩티드) 및 펩티드유사체(peptidomimetics)(일반적으로, 합성 펩티드)뿐만 아니라 펩티드 유사체인 펩토이드(peptoids) 및 세미펩토이드(semipeptoid)를 포함하며 이들은 예를 들어, 신체 내에서 더 안정하거나 세포 내로 더 침투할 수 있는 펩티드가 되도록 하는 변이를 갖는다. 이러한 변이는 CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH을 포함하나 이에 한정되지 않는 N 말단 변이, C 말단 변이, 펩티드 결합 변이, 주쇄(backbone) 변이 및 잔기 변이를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 펩티드유사체 화합물을 제조하는 방법은 본 분야에 널리 알려져 있으며 예를 들어 본원에서 완전히 설명된 것과 같이 참고문헌으로 도입된 Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F.Choplin Pergamon Press(1992)에서 명시되어 있다. 이에 관한 더 상세한 내용은 하기에 제공되었다.
펩티드 내의 펩티드 결합(-CO-NH-)은 예를 들어 N-메틸화 결합(-N(CH3)-CO-), 에스테르 결합(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-), 케토메틸렌 결합(-CO-CH-), α-아자(α-aza) 결합(-NH-N(R)-CO-)(R은 모든 알킬, 예를 들어, 메틸), 카르바(carba) 결합(-CH2-NH-), 히드록시에틸렌 결합(-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 결합(-CS-NH-), 올레핀 이중 결합(-CH=CH-), 레트로 아미드 결합(-NH-CO-), 펩티드 유도체(-N(R)-CH2-CO-)(R은 탄소 원자상에서 자연적으로 나타나는 "정상" 측쇄)로 치환할 수 있다.
이러한 변이는 펩티드 사슬을 따른 결합의 어느 부분에서 및 심지어는 동시에 여러 부분(2-3)에서 일어날 수 있다.
천연 방향족 아미노산인 Trp, Tyr 및 Phe를 페닐글리신, Tic, 나프틸알라닌(Nal), 페닐이소세린, 트레오닌올, Phe의 고리-메틸화 유도체, Phe의 할로겐화 유도체 또는 o-메틸-Tyr과 같은 비-천연 합성 산으로 치환할 수 있다.
상기에 추가로, 본 발명의 펩티드는 또한 하나 또는 그 이상의 변이된 아미노산 또는 하나 또는 그 이상의 비-아미노산 단량체(예를 들어 지방산, 복합 탄수화물 등)을 포함할 수 있다.
명세서 및 하기 청구범위에서 사용된 바와 같은 용어 "아미노산" 또는 "아미노산들"은 20개의 자연 발생 아미노산을 포함하는 것으로 이해된다; 이러한 아미노산은 종종 예를 들어, 히드록시프롤린, 포스포세린 및 포스포트레오닌을 포함하는, 생체내 번역 후 변이된다; 및 다른 일반적이지 않은 아미노산은 2-아미노아디프산, 히드록시리신, 이소데스모신, 노르-발린, 노르-루신 및 오르니틴을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 게다가, 용어 "아미노산"은 D-아미노산 및 L-아미노산 둘 다를 포함한다.
하기 표 1 및 표 2는 본 발명에서 사용할 수 있는 자연 발생적 아미노산(표 1) 및 비-통상적 또는 변이된 아미노산(예를 들어 합성, 표 2)을 나타낸 것이다.
표 1
Figure 112008023221282-PCT00001
표 2
Figure 112008023221282-PCT00002
Figure 112008023221282-PCT00003
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본 발명의 펩티드는 가용성 형태가 될 펩티드를 요구하는 진료소에서의 바람직하게 사용할 수 있으므로 본 발명의 펩티드는 히드록실-함유 측쇄에 기인한 펩티드 가용성을 증가시킬 수 있는 세린 및 트레오닌을 포함하나 이에 한정되지는 않는 하나 또는 그 이상의 비-천연 또는 천연 극성 아미노산을 바람직하게 포함한다.
본 발명의 펩티드를 펩티드 합성 분야의 숙련자에게 알려진 모든 기술에 의해 합성할 수 있다. 고형상 펩티드 합성에 있어서 많은 기술의 요약을 다음의 문헌에서 발견할 수 있다: Stewart, J.M. 및 Young J.D. (1963), "Solid Phase Peptide Synthesis" W.H. Freeman Co.(San Francisco); 및 Meienhofer, J.(1973) "Hormonal Proteins and Peptides", vol.2, p.46, Academic Press (New York).
일반적으로, 펩티드 합성 방법은 성장 펩티드 사슬에 하나 또는 그 이상의 아미노산 또는 적절히 보호되는 아미노산을 순차적으로 첨가함을 포함한다. 보통은, 첫 번째 아미노산의 아미노기 또는 카르복시기 중 하나는 적절한 보호기에 의해 보호된다. 그런 다음 보호되거나 변이된 아미노산은 아미드 결합을 형성하기에 적합한 조건 하에서, 적절하게 보호되는 우대(아미노 또는 카르복실)기를 갖는 서 열에서 다음 아미노산을 추가함에 의해 불활성 고형 지지체에 부착될 수 있거나 용액에서 사용할 수 있다. 그런 다음 보호기를 이러한 새로 첨가된 아미노산 잔기로부터 제거하고 다음 아미노산(적절하게 보호됨)을 첨가하며; 전통적으로 이러한 과정은 마찬가지로 세척 과정을 수반한다. 원하는 아미노산 모두를 적절한 서열에 결합시킨 후, 남아있는 모든 보호기(및 모든 고형 지지물)를 순차적으로 또는 동시에 제거하여 최종 펩티드 화합물을 공급하였다. 이러한 일반 절차의 간단한 변이에 의해, 예를 들어 탈보호 후에 펜타펩티드 등을 형성하기 위한 적절히 보호된 디펩티드와 보호된 트리펩티드의 결합(키랄 중심을 라세미화하지 않는 조건 하에서)에 의해 성장 사슬에 하나 이상의 아미노산을 동시에 첨가하는 것이 가능하다.
펩티드 합성의 자세한 설명은 미국 특허 번호 제6,472,505호에 기재되어 있다. 본 발명의 펩티드 화합물을 제조하는 바람직한 방법은 고형 지지물을 사용하는 고형-상 펩티드 합성을 포함한다. 대규모 펩티드 합성은 Andersson Biopolymers 2000, 55(3), 227-50에 의해 기재되었다.
상기 기술을 사용하여 어떠한 바이러스의 검출을 위해 궁극적으로 사용될 수 있는 기질을 확인하는 것이 가능하며 그러한 것으로 무수한 연구 및 임상 적용에 사용할 수 있다.
본 발명의 기술에 따라 확인된 최적 기질의 예는 하기 실시예 2에 제시되어 있다(예를 들어, 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47).
본 발명에 따라 확인된 바람직한 펩티드는 20 미만, 바람직하게는 19 미만, 바람직하게는 18 미만, 바람직하게는 17 미만, 바람직하게는 16 미만, 바람직하게는 15 미만, 바람직하게는 14 미만, 바람직하게는 13 미만, 바람직하게는 12 미만, 바람직하게는 11 미만, 바람직하게는 10 미만, 바람직하게는 11 미만, 바람직하게는 10 미만, 바람직하게는 9 미만, 바람직하게는 8 미만, 바람직하게는 7 미만, 바람직하게는 6 미만, 바람직하게는 5 미만, 바람직하게는 4 미만, 바람직하게는 3 미만의 아미노산 길이로 설계되었다.
본 발명은 미국 특허 출원 번호 제20050048473호에서 기재하고 청구하는 어떤 펩티드를 포함하는 것을 의도하지 않으며 본원에 기재된 원리에 따라 알려진 모든 펩티드로서 이들은 본 발명으로부터 특이적으로 배재되어 있다.
본 발명의 펩티드는 분열 검출을 위한 수단을 추가로 포함하는 조성물에 포함된다[이러한 수단은 하기에 자세히 기재되어 있다. 예를 들어 검출가능한 성분(또한 시그널링 성분 및 소광제 성분으로서 본원에 언급됨) 및 분리 성분].
게다가, 본 발명의 또 다른 양상에 따라, 시료에서 적어도 하나의 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 양상에 따라 검출될 수 있는 바이러스는 분열 활성이 검출을 위한 기초로서 제공될 수 있는 프로테아제를 포함하는 것이다(숙주 세포에 의해 발현되지는 않는다). 활성이 본 발명의 이러한 양상에 따라 검출될 수 있는 프로테아제의 비-제한적인 예는 세린 프로테아제, 메탈로프로테아제, 아데닌 프로테아제, 2A 프로테아제, 키모트립신 또는 트립신을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어: NS3, NS2, NS-프로 시스테인 프로테아제, nsP2 시스테인 프로테아제, nsP23프로, C 프로테인 프로테아제, SFV NS, HIV 아스파르트 프로테아제, nsp4 아테리바이러스 프로테아제, HCMV 프로테아제, NS2-3, NS3-4Ap 프로테아제 및 HTLV-1 PR.
본 발명이 이러한 양상에 따라 검출할 수 있는 바이러스의 비 제한적 예는 하기 실시예 2에 제공되었다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "검출"은 바이러스의 존재를 확인하고 바이러스를 분류하고 바이러스와 관련된 의학 조건을 진단하는 것을 의미한다.
본원에 기재된 바와 같은 용어 "진단"은 의학 조건을 분류하고, 이러한 질병의 중대성을 결정하고 질병의 진행을 확인하고 회복 가능성 및/또는 질환의 결과를 예상하는 것을 의미한다.
그러므로, 아데노바이러스를 검출하기 위하여 기질은 서열 번호: 1 또는 2를 포함할 수 있다.
알파바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 3을 포함한다.
루벨라 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 4를 포함한다.
HIV 검출을 위해 기질은 서열 번호: 5를 포함한다.
HTLV 검출을 위해 기질은 서열 번호: 6, 7 또는 8을 포함한다.
아테리 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 9를 포함한다.
코로나 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 10을 포함한다.
SARS 코로나 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 11 또는 12를 포함한다.
토로바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 13을 포함한다.
CMV 검출을 위해 기질은 서열 번호: 14 또는 15를 포함한다.
포진 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 16을 포함한다.
플라비바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 17을 포함한다.
댕기바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 18, 19 또는 20을 포함한다.
웨스트 나일 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 21, 22 또는 23을 포함한다.
황열 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 24, 25 또는 26을 포함한다.
일본 뇌염 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 27, 28 또는 29를 포함한다.
진드기 매개 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 30, 31 또는 32를 포함한다.
C형 감염 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 33, 34 또는 35를 포함한다.
페스티바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 36을 포함한다.
A형 간염 바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 37 또는 38을 포함한다.
HRV 검출을 위해 기질은 서열 번호: 39 또는 40을 포함한다.
엔테리바이러스 검출을 위해 기질은 서열 번호: 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47을 포함한다.
다른 바이러스가 유사한 아미노산 서열을 갖는다면 단일 프로테아제는 이러 한 바이러스 폴리프로테인을 분열할 수 있음을 인식할 수 있을 것이다. 그러므로, 본 발명은 단일 바이러스 유형 또는 하나 이상의 바이러스 유형에 특이적인 검출 방법을 제공하기 위한 이러한 특이성의 이점을 갖는다. 이는 본 발명의 방법은 또한 동일한 증상을 야기하는 바이러스와 같은 비-과 관련 바이러스의 확인(다중 바이러스 검출)을 위해 설계될 수 있으며 실시형태는 하기 및 실시예 3 및 6에서 상세히 기술되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "시료"는 바이러스를 포함하거나 복제가 가능하게 할 수 있는 모든 생물학적 시료(예를 들어, 조직 배양 시료 또는 체액/조직 시료)를 의미한다. 바람직하게 생물학적 시료는 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 뇨, 림프액, 호흡기의 다양한 외부 분비물(예를 들어, 코 세척 시료), 위장관 및 비뇨생식기로, 눈물, 침, 정액, 땀, 배설물 및 유즙뿐만 아니라 백혈구, 악성 조직, 양수 및 융모와 같은 체액을 의미한다.
본 발명의 이러한 양상의 방법은 본원에 기재된 기질의 분열을 가능하게 하는 조건 하에서 상기 기질 중 어떤 기질과 시료를 접촉시키고; 상기 기질의 분열을 확인하여 이루어지며, 여기에서 상기 기질의 분열은 상기 시료의 적어도 하나의 상기 바이러스가 존재함을 나타내는 것이다.
단백질분해 기질 분열을 확인하기 위한 본 분야에 알려진 모든 검정을 본 발명의 이러한 양상에 따라 사용할 수 있다.
바람직하게 기질 분열 서열은 예를 들어 적어도 하나의 검출 가능한 성분을 검출하기 위한 수단을 추가로 제공하는 조성물에 포함된다. 실례는 본원에 참고문 헌으로 전체가 도입된 Dorit Arad의 미국 특허 출원 번호 제20050048473호에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "검출가능한 성분"은 직접적으로(예를 들어, 형광, 방사성동위원소) 또는 간접적으로(예를 들어, 전구-효소) 검출될 수 있는(시각화, 계수화 등) 모든 분자를 의미한다.
그러므로, 단백질분해 분열을 확인하는 것은 바이러스 검출을 위한 동질성 검정에 의해 이루어질 수 있다. 선택된 기질을 합성하여 분열 영역의 한 측면에서 시그널링 성분 및 분열 영역의 다른 측면에서 소광제 성분으로 결합시킨다. 분열 서열의 한 말단에 위치할 수 있는 모든 성분을 필요로 함이 자명할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같은 문구 "동질성 검정"은 다른 검정 성분으로부터 시그널링 성분의 분리를 요구하지 않는 검정을 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, "소광제 성분"은 시그널링 성분에 의해 발생 되는 신호를 감소시키거나 제거할 수 있는 모든 기질을 의미한다. 예를 들어, 소광제 성분은 시그널링 성분 또는 에너지 전환 메카니즘에 의해 발생되는 신호의 흡수에 의해 작요알 것이다. 시그널링 성분 및 소광제 성분 사이의 차이는 기질이 시그널링 및 소광제 성분의 분리를 야기하는 위치에서 분열되지 않는다면 소광제 성분의 존재가 시그널링 성분으로부터 발생 되는 신호를 실질적으로 감소시키거나 제거하는 것과 같다.
하나의 실시형태에서, 시그널링 성분 및 소광제 성분은 3 또는 5개 미만의 아미노산 잔기로 분리된다. 다른 실시형태에서, 시그널링 성분 및 소광제 성분은 10개 미만의 아미노산 잔기로 분리된다. 또 다른 실시형태에서, 시그널링 성분 및 소광제 성분은 15개 미만의 아미노산 잔기로 분리된다. 또 다른 실시형태에서, 시그널링 성분 및 소광제 성분은 20개 미만의 아미노산 잔기로 분리된다. 하기에 상세히 기재된 바와 같은 검출을 위한 수단(예를 들어, 이질성 검정)으로서 사용되는 다른 성분은 이러한 가이드라인에 따라 결합 될 수 있다. 또한, 검출 수단(예를 들어, 성분)의 어떤 것도 기질에 직접적 또는 간접적으로 기질에 순차적으로 결합하거나 펩티드 분열 서열 자체의 아미노산 중 어느 하나에 아미노산 변이에 의해 겹합할 수 있다.
조성물을 바이러스의 존재를 시험할 시료와 접촉시킨다. 시료에 바이러스가 존재한다면, 바이러스 프로테아제 또한 존재한다. 이 프로테아제는 기질을 분열하며 시그널링 성분으로부터의 신호의 변화가 관찰될 수 있다. 이러한 동질성 형광 검정 및 비색분석법(colorimetric assay)은 본 분야의 숙련자들에게 알려져 있다. 예를 들어, Biochemistry, Allinger, Wang Q.M. 등의 "A continuous calorimetric assay for rhinovirus-14 3C protease using peptide p-nitroanilides as substrates" Anal.Biochem. Vol252, pp.238-45(1997) 및 Basak S. 등의 "In vitro elucidation of substrate specificity and bioassay of proprotein convertase 4 using intramolecularly quenched fluorogenic peptide" Biochem.J. Vol.380, pp.505-14(2004)를 참조하라.
본 발명의 다른 실시형태에서, 시그널링 성분은 화학발광 시그널링 성분이다. 화학발광 시그널링 성분은 기질의 분열 영역의 한쪽 측면에 부착되며 형광 허 용 소광제 성분은 분열 영역의 다른 측면에 부착된다. 본원에 참고문헌으로서 도입된 미국 특허 번호 제6,243,980호는 시그널링 성분으로서 화학발광 1, 2-디옥세탄 화합물의 사용을 포함하는 검출 시스템을 기재하고 있다. 바이러스 프로테아제가 시료에 존재하지 않는다면, 기질의 분열도 일어나지 않는다. 1, 2-디옥세탄 화합물로부터의 에너지는 형광 허용 성분으로 전환되고 1, 2-디옥세탄의 발광 스펙트럼(emission spectrum)으로부터 뚜렷한 파장을 방출한다. 기질이 분열된다면, 형광 허용 성분은 1, 2-디옥세탄으로부터 분리되며 디옥세탄 화합물로부터의 화학발광 발생이 관찰되었다.
다른 실시형태에서, 시그널링 성분은 형광 화합물이며 소광제 성분은 시그널링 성분의 발광 스펙트럼과 겹쳐지는 들뜬 상태 스펙트럼(excitation spectrum)을 갖는 형광 화합물이다. 여기에서, 두 성분은 형광 성분이 공명 에너지 공여체로서 작용할 수 있도록 형광 공명 에너지 전환으로 일관된 거리로 떨어져 분리된다.
다른 실시형태에서, 비-형광 흡수 염료(non-fluorescent absorbing dye)와 같은 소광 그룹(quenching group)은 형광 허용 소광제 성분 대신에 사용된다. 적절한 소광 그룹은 본원에 참고문헌으로 도입된 미국 특허 번호 제6,243,980호에 기재되어 있다.
검출 방법을 사용하여 바이러스가 존재할 경우 프로테아제에 의해 기질이 분열되도록 하는 조건 하에서 시험 시료를 기질과 접촉시킨다. 한 실시형태에서 온도는 조절된다. 예를 들어 온도는 효소 작용에 대해 최적 조건을 제공하기 위해 37℃로 조절될 수 있다. 그런 다음 분열된 기질 단편으로부터의 신호를 사용된 표지에 따라 적절한 검출 장치를 사용하여 검출한다.
본 발명의 다른 실시형태는 바이러스 검출을 위한 이질성 검정을 제공한다. "이질성 검정"은 검정하는 동안 다른 검정 성분으로부터 고형상이 분리되는 검정이다. 이질성 검정의 완전한 설명 및 실례는 하기 실시예 6에 제공된다.
이러한 경우에서 기질은 하기 일반식을 갖는 조성물에 포함된다.
X-Y-Z
위 식에서:
Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며, 상기 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며, 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
X는 검출가능한 성분을 포함하며; 및
Z는 2개 상 분리 시스템의 분리상에 결합이 가능한 분리 성분을 포함하며;
여기에서, X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않는다.
검출가능한 성분 X는 직접적으로 또는 간접적으로 검출되며 효소, 형광단, 발색단, 단백질(예를 들어, 에피토프 표지), 화학발광 성분 및 방사성동위원소와 같은 표지제를 포함할 수 있다.
분리 성분 Z는 두 상 분리 시스템(예를 들어 고형상 및 액상)의 분리상에 직접적 또는 간접적으로 결합 될 수 있다. 분리 성분 Z의 예는 면역학적 결합제, 자기(magnetic) 결합 성분, 펩티드 결합 성분, 친화성 결합 성분 및 핵산 성분을 포 함한다. 추가 예는 하기 실시예 6에 제공된다.
본 발명의 조성물은 시료와 항온하기 전에, 동시에 또는 후에 분리 시스템과 항온할 수 있다.
본 발명의 이질성 검정을 사용하는 분열 확인은 도 7-10에 도식적으로 나타낸 실시예 6의 실시형태를 사용하여 달성할 수 있다.
측정은 검출가능한 성분이 분리 성분에 결합하지 않는 것으로 실행될 수 있다.
한 실시형태에서 본 발명의 검출가능한 성분은 전구-효소이다. 기질 분열에 따라서, 효소가 활성화되고 검출(동일한 것의 촉매 활성의 검출에 의함)될 수 있다. 이러한 전구-효소의 예는 선구-트롬빈(pro-Thrombin)(인자 II) 또는 이 연속단계(cascade)에서의 다른 효소이다.
본원에 기재된 실시형태 중 어느 것에서 모든 성분은 공유결합에 의해 펩티드에 직접적으로 연결되거나 각 말단에 결합된 기능기를 갖는 스페이서 분자를 통해 간접적으로 연결될 수 있다. 이러한 연결체는 알킬, 글리콜, 에테르, 폴레에테르, 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 분자를 포함한다.
이질성 검정에서 사용하기에 적절한 고형상은 시험관, 미세역가 플레이트, 미세역가 웰(microtiter well), 비드, 딥스틱(dipsticks), 중합체 미세입자, 자기 미세입자, 니트로셀룰로스, 칩 어레이(chip arrays) 및 본 분야의 숙련자들에게 익숙한 그외 다른 고형상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이질성 검정에서 사용되는 시그널링 성분은 본 분야의 숙련자에게 알려진 모든 표지(label)일 수 있다. 이러한 표지는 방사성 표지, 열량(calorimetric) 표지, 형광 표지 및 발광 표지를 포함한다.
프로테아제 검출용 이질성 화학발광 검정은 본원에 참고문헌으로 도입된 미국 특허 번호 제6,243,980에 기재되어 있다. 한 실시형태에서, 본 발명의 동질성 또는 이질성 검정 방법은 시험에서 바이러스 질환에 의해 감염될 피실험자의 견해에 노출될 의학 스탭의 필요 없이 결과를 얻을 수 있도록 자동화되었다. 예를 들어, 피실험자를 청정실(clean room)(예를 들어, P3 유형 실, 이에 한정되지 않음)에서 검사할 수 있다. 피실험자가 청정실로 들어가기 전에 진단 키트를 가질 수 있으며, 이는 상기 논의된 유형의 표지된 펩티드로 코팅된 고형상을 포함한다. 예를 들어, 고형상은 펩티드로 함침된 조직 또는 임신 검사에 사용되는 유형으로부터 유래될 수 있는 검사 스틱일 수 있다. 피실험자는 고형상에 미리 준비된 지점에 침 시료와 같은 시료를 제공할 수 있다.
그런 다음 시료를 포함하는 고형상을 효소 작용이 일어나도록 항온시킨다. 한 실시형태에서, 작용 온도는 효소 작용을 위한 최적 조건을 제공하기 위해 37℃로 조절된다. 항온이 완료되었을 때, 검사할 시료를 원격 조정을 사용하여 분광광도계로 측정하거나 방 외부로부터 메뉴얼대로 작동하는 기계 시스템에 의해 측정할 수 있다. 시료를 정성적(qualitative) 색깔 또는 UV 검출에 대해 검사하였다. 검사 후 시료를 자동화 시스템 또는 시료를 파기하는 원격 작동 핸들로 처분할 수 있다.
많은 바이러스의 존재를 한번에 검출하기 위해(특이 증상 또는 특이 숙주에 관련된 바이러스를 검출하기 위한 것, 예를 들어, 실시예 3 참조하라), 다중 바이 러스의 검출을 위해 개조된 본 분야에서 알려진 방법 또는 상기 기재된 방법 중 어떤 것도 사용하는 것이 가능하다.
하기는 이러한 수단의 비-소모적 예를 제공한다.
X 웰 플레이트에서의 마이크로플레이트. 각 웰은 다른 바이러스에 상응하는 상이하고 특이적인 펩티드 서열을 포함한다. 의학 시료의 첨가로,적절한 파장에서의 표준 마이크로플레이트 판독기 및 웰이 효소 활성을 증명하는 기록을 사용하여 작용을 확인한다. 각 웰이 하나의 특이 펩티드를 포함하므로, 미아크로플레이트 판독기에 의해 제공되는 데이타에 따라 의학 시료에 바이러스 효소가 존재하는 지를 밝힐 수 있다. 효소의 존재로 바이러스의 존재를 확인한다.
메디셀 칩 기술(Medisel chip technology)(Schiffenbauer 등의 2002 Anticancer Res.22:2663-9) - 메디셀 기술을 사용하여 칩 상에서 특이 펩티드(대상 바이러스에 상응하는)를 고정시키는 것이 가능하다. 의학 시료의 첨가로, 레이저 빔을 사용하여 반응을 확인한다. 칩 상에서의 각 포인트가 하나의 특이 펩티드를 포함하므로 메디셀 장치에 의해 제공되는 데이타에 따라 의학 시료에서 바이러스 효소가 존재하는 지를 밝히는 것이 가능하다. 효소의 존재로 바이러스의 존재를 확인한다.
컬럼 상에서의 분리 - 특이 펩티드(대상 바이러스에 상응하는)를 비드로부터 독특한 DNA 스페이서를 갖는 시판 소스에 부착시킬 수 있다. 의학 시료의 첨가로 반응이 일어난다. 특이 펩티드의 분열이 (의학 시료에서의 특이 바이러스 효소에 의해) 일어나면, 소광제가 방출되고 비드는 형광을 발생시킨다. 그런 다음 비드를 독특한 DNA 스페이서로 혼성화(hybridization)를 통해 분리시키고 형광을 적절한 파장에서 표준 형광계(fluorometer)를 사용하여 (각각 다른 바이러스에 상응하는) 각 유형의 비드를 측정하였다. 바이러스 효소에 의해 분열된 비드만이 형광을 발생시킨다. 그런다음 의학 시료에 바이러스 효소가 존재하는 지를 밝히는 것이 가능하다. 효소의 존재로 바이러스의 존재를 확인한다.
비드 FACS 분리(Bead FACS separation) - 컬럼 분리와 유사하며 각 특이 펩티드가 다른 색을 갖는 비드에 부착되었을 때 FACS에 의해 분리 단계가 끝난다. 이 방법에서 스페이서는 DNA 또는 펩티드 또는 펩티드-유사체 EH는 탄수화물 또는 모든 유기 성분 스페이서일 수 있다[Gonzalez(2005) Clin. Biochem. 38:966-72].
본 발명에 따라 사용할 수 있는 다른 방법은 각각 본원에 참고문헌으로 도입된 Tozzoli 등의 (2006) Clin. Chem. Lab Med. 44:837-42; Abreu (2005) Ann.N.Y. Acad. Sci. 1050:357-63; Buliard (2005) Ann. Biol. Clin.(Paris) 63:51-8; Yinnaki(2004) J. Immunoassay Immunochem. 25:345-57; Rouquette (2003) 120:676-81; Toellner (2006) Clinical Chemistry 52:1575-1583; Horejsh (2005) Nucl. Acids Res. 33dp 기재되었다.
본 발명의 기술에 따라 확인된 펩티드 분열 서열을 새로운 바이러스 균주의 검출에 사용할 수 있다. 예를 들어, 원조 바이러스과(예를 들어 코로나)와 상동성을 나타내는 SARS 유행병의 검출이다. 이는 세계적 유행병을 야기하는 새로운 바이러스에 대한 검출 방법의 빠른 적용에 의지한다.
그러므로, 신생 바이러스의 게놈이 확인되고 이의 생식 시스템이 알려지면, 바이러스 프로테아제 및 이러한 프로테아제에 의해 분열되는 바이러스 프로테아제의 영역을 신생 바이러스 서열 및 알려진 바이러스의 서열 사이의 서열 상동성을 실험하여 검출할 수 있다. 이러한 최적 분열 서열의 정렬 선택에 기초하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 펩티드를 포함하는 키트 또한 제공된다. 다른 키트 구성성분은 분리된 용기에 포장될 수 있으며 사용하기 바로 전에 혼합할 수 있다. 분리된 구성성분의 이러한 포장은 유효성분 기능의 손실 없이 장기간 보관을 가능하게 한다. 동일한 용기에 둘 또는 그 이상의 구성성분이 발견되는 실시형태는 또한 오염된다. 전형적인 키트는 이질성 검정을 사용하여 하나 또는 그 이상의 하기 시약을 포함할 수 있다: 이질성 검정에 사용하기 위한 세척 완충용액 시약; 기질 분열을 가능하게 하는 프로테아제가 없는 음성 대조 시약; 기질 분열을 가능하게 하는 프로테아제를 포함하는 양성 대조; 시그널링 성분으로부터의 검출가능한 신호의 발생을 위한 신호 생성 시약; 및 주사기, 인후면봉(throat swab) 또는 그외 시료 수집 장치와 같은 시료 수집 수단.
상기 기재된 바와 같이 하나 또는 그 이상의 바이러스를 검출하기 위한 다중 바이러스 검출 키트에서 각 다중 패널 키트를 동일하거나 유사한 질병을 야기하는 다른 바이러스, 동일한 조직 또는 기관에 감염된 바이러스, 같은 과, 아과(subfamily) 등으로 분류되는 바이러스와 같은 밀접한 계통발생적 관계의 바이러스, 침, 코 분비물, 혈액, 뇨, 배설물등과 같은 동일한 체액에서 검출할 수 있는 바이러스, 일반적이고 널리 퍼져있는 바이러스, 동일한 체액을 통해 퍼지는 바이러 스 등과 같은 공통 테마에 따라 설계할 수 있다.
키트에 포함되는 시약은 다른 성분의 수명이 보존되고 용기의 물질에 의해 흡수되거나 대체되지 않는 모든 부류의 용기 내에 공급될 수 있다. 예를 들어, 밀봉된 유리 앰플은 동결건조된 시약 또는 질소와 같은 천연의 비-반응성 가스 하에서 포장된 완충용액을 포함할 수 있다. 앰플은 유리, 폴리카보네이트, 폴리스티렌 등과 같은 유기 중합체; 세라믹 금속 또는 유사한 시약을 붙잡기 위해 통상적으로 사용하는 그외 모든 금속과 같은 모든 적절한 물질로 구성될 수 있다. 적절한 용기의 다른 예는 앰플과 같은 유사한 재료로 제작된 단순한 병 및 알루미늄 또는 합금과 같은 포일을 내부에 붙인 봉투를 포함한다. 다른 용기는 시험관, 바이알, 플라스크, 병, 주사기 등을 포함한다. 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 스토퍼(stopper)를 갖는 병과 같은 멸균 접근 포트(sterile access port)를 가질 수 있다. 다른 용기는 구성성분들이 막의 제거로 혼합되게 하는 쉽게 제거가능한 막에 의해 분리되는 두 구획을 가질 수 있다. 제거가능한 막은 유리, 플라스틱, 고무 등일 수 있다.
키트는 또한 사용설명서 자료와 함께 제공될 수 있다. 사용설명서는 종이 또는 그외 기질에 인쇄되고/인쇄되거나 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오테이프, 오디오테이프 등과 같은 전자-판독 매개체로서 공급될 수 있다. 상세한 사용설명서는 키트와 물리적으로 연관되어 있지 않을 수 있으며; 대신 사용자는 키트의 제조업자 또는 판매자에 의해 특성화된 인터넷 웹사이트로 직접적으로 연결할 수 있거나 전자 메일로서 공급될 수 있다.
본 발명은 바이러스 단백질분해 활성 및 이에 따른 바이러스 복제 및 감염성을 저해하는 치료제의 설계시 본 발명의 펩티드의 용도를 추가로 제시한다. 바람직하게는, 펩티드 서열이 프로테아제에 결합하고 프로테아제의 활성을 저해하기 위해 변형된다(예를 들어, 비-가역성 저해제). 프로테아제 인식이 유지되는 한, 적어도 하나의 비-펩티드 결합(상기 기재된 바와 같은)에 의해 비-분열 서열로 분열 서열을 치환하는데 이러한 펩티드 유사체를 사용할 수 있다.
본 발명의 치료 펩티드는 대상으로 하는 바이러스 질환을 치료하기 위해 확인된 약학적 조성물 내에 포함될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 조성물을 사용하여 항-바이러스제를 스크리닝함을 추가로 제시하였다.
그러므로, 본 발명은 치료 및 진단을 위해 사용될 수 있는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 추가 목표, 장점 및 신규 특성은 하기 실시예의 검토에 따라 본 분야의 숙련자에게 자명해 질 것이나 이에 한정하려는 의도는 아니다. 게다가, 상기에서 묘사되고 하기 청구범위에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시형태 및 양상 각각은 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
하기 실시예에 의해 참고되며 상기 발명의 상세한 설명과 함께 본 발명을 비-제한적 방식으로 설명한다.
일반적으로, 본원에서 사용된 학술용어 및 본 발명에서 사용된 실험 과정은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 일어한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등의 (1989); "Current Protoclas in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed.(1994); Ausubel 등의 "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley 및 Sons, Baltimore, Maryland(1988); Watson 등의, "Recombinant DNA", Scientific American Book, New York; Birren 등의 (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manul Serises", Vols. 1-4, Cold Spring Habor Laboratory Press, New York(1998); 미국 특허 번호 제4,666,828호, 제4,801,531호, 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 설명된 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed.(1994); Stites 등의 (des) "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell 및 Shiigi(eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술된 허용가능한 면역검정법, 예를 들어 미국 특허 번호 제3,791,932호, 제3,839,153호, 제3,859,752호, 제3,850,578호, 제3,853,987호, 제3,867,517호, 제3,879,262호, 제3,901,654호, 제3,935,074호, 제3,984,533호, 제3,996,345호, 제4,034,074호, 제4,098,876호, 제4,879,219호, 제5,011,771호 및 제5,281,521호 참조; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hamens, B. D., 및 Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Cultrue" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) 및 "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등의 "Strategies for Protein Purfication and Characterization - A Laboratory Clurse Manual" CSHL Press (1996); 이들 모두는 본원에서 충분히 설명된 바와 같이 참고문헌으로서 인용되었다. 다른 일반적 참고문헌이 이 문서 전체에 제공되었다. 본원의 과정은 본 분야에서 널리 알려진 것으로 여겨지며 독자의 편의를 위해 제공된 것이다. 본원에 포함된 모든 정보는 참고문헌으로서 본원에 인용되었다.
실시예 1
C형 간염 NS3 프로테아제 공통 분열 서열 확인
다음은 C형 간염의 NS3 프로테아제에 대한 최적의 분열 서열의 확인을 기술한 것이다.
1 단계: 바이러스 프로테아제에 의한 폴리프로테인의 분열 메카니즘, 필수적으로 바이러스의 생명 주기 동안 분열 사건의 서열을 유도하는 단계(1, 4, Hepatitis C Virus(HCV): Model structure and genome organization. Vol 4; November 19, 2003, Cambridge University Press로부터 개조된 도 11을 참조하라).
2 단계: Swiss prot., Pubmed, Gene bank 및 OWL과 같은 데이타 베이스를 사용하고 FASTA 소프트웨어를 사용하여 정렬하는 것이 가능한 동일한 바이러스의 많은 균주의 모든 분열 서열을 비교하는 단계(하기 표 1 참조).
Figure 112008023221282-PCT00005
Figure 112008023221282-PCT00006
Figure 112008023221282-PCT00007
3 단계: 치환 또는 하기 표 2의 참고문헌에 따른 데이타 마이닝에 의한 동역학적으로 최적인 부위에 따라 가장 빠른 절ㄹ단 서열을 유도하는 단계.
Figure 112008023221282-PCT00008
Figure 112008023221282-PCT00009
Figure 112008023221282-PCT00010
Figure 112008023221282-PCT00011
Figure 112008023221282-PCT00012
Figure 112008023221282-PCT00013
시스-작용(Cis-acting) 프로테아제는 오직 근접한 분열 부위만을 분열한다. 트랜스-작용(Trans-acting) 프로테아제는 멀리 떨어져 있는 분열 부위에 작용한다.
시스 -
1. P1 - 트레오닌을 갖는다.
2. P4 - 비-극성 지방족 측쇄를 갖는 대부분의 잔기를 받아들였다.
3. P2 - 충진된 잔기(chargedd residues)를 더 선호함을 나타낸다.
4. 프로테아제 시스-분열 부위 NS4A/C 접합의 특이성은 상당히 쇠퇴되었으며(6) 이는 분열이 폴리프로테인 접힘(folding)에 의해 저해됨을 나타낸다.
트랜스-
1. P1 - 시스테인이 중요하므로 치환될 수 없다.
2. P3 - 단지 발린, 글루탐산, 트레오닌 및 이소루신에 적용된다. Glu을 Asn 또는 Lys로 치환하는 것은 효과가 없다.
3. P4 - 대부분의 잔기를 묵인하였다.
4. P2 - 루신을 더 선호함을 나타낸다. Glu을 Asn 또는 Lys로 치환하는 것은 효과가 없다.
5. P5 - 바람직한 충진된 잔기(음성적으로 충진된 잔기→아스파테이트).
6. P6 - 산성 잔기가 중요하다(티로신).
7. P3 - 잔기는 효과적인 기질 인식에 기여하였다(gln).
8. P4' - 잔기는 효과적인 기질 인식에 기여하였다(소수성 잔기→Leu).
9. P7 - Phe를 His 또는 Arg로 치환. 효과는 없다.
10. P5 - Glu를 Lys로 치환하는 것은 효과가 없다.
11. P2' - Gln을 Lys로 치환하는 것은 효과가 없다.
12. P1' - Ser을 Ile, Thr, Arg, Asp 또는 His로 치환하는 것은 효과적인 분열을 허용한다. 그러나 Pro로 치환하는 것은 분열을 극적으로 저해한다(7).
13. 생체외 분열의 효율은 적어도 10개의 잔기 스패닝 ( spanning ) P6 내지 P4'의 펩티드 기질을 요구한다.
4 단계: 두 개의 가장 빠른 부위에 및 3 단계로부터의 치환에 따른 공통 서열을 유도하고 3 단계로부터 허용된 변이에 따라 4 단계로부터 공통서열 식을 일반화하는 단계. 종합된 모든 데이타는 다음 서열에서 HCV NS3 프로테아제를 야기한다:(T/S/산성)X(E/T/I/N/K/D/V)(C/F)C -/- X(M/norL)(S/D)(Y/소수성) (서열 번호:33)
실시예 2
본 발명의 기술에 따라 확인된 동역학적으로 최적인 기질
하기 기호는 공통 서열의 표시에 사용되었다.
소수성: G, A, V, L, I, M, W, F, Y, H
염기성: Q, N, K, H, R
HB 공여체: K, R, S, C, T, Q, N, Y
산성: E, D, Y
방향족: Y, F, H, W
-/-: 분열 지점
아데노바이리대 (1-9)
유인원: 아데노바이러스 25, 아데노바이러스 24, 아데노바이러스 23, 아데노바이러스 22, 아데노바이러스 21, 아데노바이러스 19.
돼지: 아데노바이러스 C, 아데노바이러스 B, 아데노바이러스 A, 아데노바이러스 5, 아데노바이러스 4, 아데노바이러스 3, 아데노바이러스 2, 아데노바이러스 1.
양: 아데노바이러스 B, 아데노바이러스 A, 아데노바이러스 5, 아데노바이러스 4, 아데노바이러스 3, 아데노바이러스 2, 아데노바이러스 1.
쥐: 아데노바이러스 A, 아데노바이러스 1.
인간: 아데노바이러스 F, 아데노바이러스 E, 아데노바이러스 D, 아데노바이러스 C, 아데노바이러스 B, 아데노바이러스 A, 아데노바이러스 9, 아데노바이러스 8, 아데노바이러스 7, 아데노바이러스 6, 아데노바이러스 51, 아데노바이러스 50, 아데노바이러스 5, 아데노바이러스 49, 아데노바이러스 48, 아데노바이러스 47, 아데노바이러스 46, 아데노바이러스 45, 아데노바이러스 44, 아데노바이러스 43, 아데노바이러스 42, 아데노바이러스41, 아데노바이러스 40, 아데노바이러스 4, 아데노바이러스 39, 아데노바이러스 38, 아데노바이러스 37, 아데노바이러스 36, 아데노바이러스 35, 아데노바이러스 34, 아데노바이러스 33, 아데노바이러스 32, 아데노바이러스 31, 아데노바이러스 30, 아데노바이러스 3, 아데노바이러스 29, 아데노바이러스 28, 아데노바이러스 27, 아데노바이러스 26, 아데노바이러스 25, 아데노바이러스 24, 아데노바이러스 23, 아데노바이러스 22, 아데노바이러스 21, 아데노바이러스 20, 아데노바이러스 2, 아데노바이러스 19, 아데노바이러스 18, 아데노바이러스 17, 아데노바이러스 16, 아데노바이러스 15, 아데노바이러스 14, 아데노바이러스 13, 아데노바이러스 12, 아데노바이러스 11, 아데노바이러스 10, 아데노바이러스 1.
말: 아데노바이러스 B, 아데노바이러스 A, 아데노바이러스 2, 아데노바이러스 1.
개: 아데노바이러스 2, 아데노바이러스 1, 아데노바이러스.
소: 아데노바이러스 C, 아데노바이러스 B, 아데노바이러스 A, 아데노바이러스 9, 아데노바이러스 3, 아데노바이러스 2, 아데노바이러스 10, 아데노바이러스 1.
Figure 112008023221282-PCT00014
토가바이리대 (10-33)
알파바이러스: 아우라 바이러스(Aura virus), 바마 포리스트(Barmah Forest) 바이러스, 북미동부말 뇌염(Eastern equine encephalitis), 미델뷔르흐(Middelburg) 바이러스, 은두무(NMdumu) 바이러스, 베바루(Bebaru) 바이러스, 치쿤구니아(Chikungunya) 바이러스, 게타(Getah) 바이러스, 마야로(Mayaro) 바이러스, 오뇽뇽(O'nyoung-nyong) 바이러스, 로스강(Ross River) 바이러스, 셈리키 포리스트(Semliki forest) 바이러스, 우나(Una) 바이러스, 트로카라(Trocara) 바이러스, 카바쏘우(Cabassou) 바이러스, 무캄보(Mucambo) 바이러스, 픽수나(Pixuna) 바이러스, 베네주엘라 말 뇌염(Venezuelan equine encephalitis) 바이러스, 포트 모건(Fort Morgan) 바이러스, 하이랜즈 제이(Highlands J) 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 웨스턴 말 뇌척수염(Western equine encephalomyelitis), 와타로아(Whataroa) 바이러스, 알파바이러스(Alphavirus) HBb17, 노르웨이 연어(Norwegian salmonid) 알파바이러스, 리오 네그로(Rio Negro) 바이러스, 바다표범 이(Seal louse) 바이러스.
Figure 112008023221282-PCT00015
루비바이러스 ( Rubivirus ): 루벨라(Rubella) 바이러스, 루벨라 바이러스(균주 BRD1), 루벨라 바이러스(균주 BRDII), 루벨라 바이러스[균주 센데힐(Cendehill)], 루벨라 바이러스(균주 M33), 루벨라 바이러스(균주 RN-UK86), 루벨라 바이러스(균주 THERIEN), 루벨라 바이러스(균주 TO-336 백신), 루벨라 바이러스(균주 TO-336), 루벨라 바이러스(백신 균주 RA27/3).
Figure 112008023221282-PCT00016
레트로바이리대 (34-60)
오르토레트로바이리내(Orthoretrovirinae), 렌티바이러스(Lentivirus), 영장류 렌티바이러스(Primate lentivirus) 군:
인간 면역결핍 바이러스 1: HIV-1 M:C_92BR025, HIV-1 M:C_ETH2220, HIV-1 M:F1_93BR020, HIV-1 M:F1_VI850, HIV-1 M:F2_MP255C, HIV-1 M:F2_MP257C, HIV-1 M:G_92NG083, HIV-1 M:G_SE6165, HIV-1 M:H_90CF056, HIV-1 M:H_VI991, HIV-1 M:J_SE9173, HIV-1 M:J_SE9280,HIV-1 M:K_96CM-MP535, HIV-1 M:K_97ZR-EQTB11, HIV-1 N_YBF106, HIV-1 N_YBF30, HIV-1 O_ANT70, HIV-1 O_MVP5180, 인간 면역결핍 바이러스 3, 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (ARV2/SF2 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (BH10 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (BH5 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (BH7 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (BH8 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (BRAIN ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (BRU ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (CDC-451 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (CLONE 12), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (ELI ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (HXB2 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (HXB3 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (YU2 분리균), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (JH3 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (JRCSF ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (KB-1 분리), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (Lai 분리균), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (MAL ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (MFA ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (MN ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (NDK ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (NEW YORK-5 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (NIT-A ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (OYI ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (PV22 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (RF/HAT ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (SC ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (SF162 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (SF33 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (STRAIN UGANDAN / ISOLATE U455), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (WMJ1 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (WMJ2 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (Z-84 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (Z2/CDC-Z-34 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (ZAIRE 3 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (ZAIRE 6 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 (ZAIRE HZ321 ISOLATE), 인간 면역결핍 바이러스 유형 1 lw12.3 isolate.
인간 면역결핍 바이러스 2: 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE BEN), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE ROD), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE ST), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE ST/24C#2), HIV-2 B_EHO, HIV-2 B_UC1, HIV-2.D205, 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE D205,7), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE 7312A), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE CAM2), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE D194), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE GHANA-1), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE KR), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE NIH-Z), 인간 면역결핍 바이러스 2 (ISOLATE SBLISY).
Figure 112008023221282-PCT00017
레트로바이리대 ( Retroviridae ); 오르토레트로바이리내 ( Orthoretrovirinae ); 델타레트로바이러스( Deltaretrovirus ); 영장류 T-림프친화성
인간 T-세포 림프친화성 바이러스 유형 1 (카리비안 분리균), 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 유형 1 (분리균 MT-2), 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 유형 1 (균주 ATK), 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 유형 1 (아프리카 분리균), 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 유형 1 (북아메리카 분리균).
Figure 112008023221282-PCT00018
니도바이러스성 ( Nidovirales ): 아테리바이리대 (78-82)
아테리바이러스 : 말 동맥염 바이러스 부사이러스(Bucyrus), 락테이트 디하이드로게나제(Lactate dehadrogenase) 상승, C형 바이러스, 락테이트 디하이드로게나제 상승 바이러스 플라게만(Plagemann), 리스타트(Lelystad) 바이러스, PRRSV 16244B, PRRSV HB-1(sh)/2002, PRRSV HB-2(sh)/2002, PRRSV HN1, PRRSV VR2332, 유인원 출혈열(Simian hemorrhagic fever) 바이러스,
Figure 112008023221282-PCT00019
니도바이러스성: 코로나바이리대 ( Coronaviridae )(61-77)
코로나바이러스: 개과 코로나바이러스, 고양이과 코로나바이러스, 인간 코로나바이러스 229E, 돼지 유행성 설사병(Porcine epidermic diarrhea) 바이러스, 전염성 위장염(Transmissible gastroenteritis) 바이러스, 소 코로나바이러스, 인간 코로나바이러스 OC43, 쥐 간염 바이러스, 돼지 적혈구응집성 뇌염 (hemagglutinating encephalomyelitis) 바이러스, 파피노오시스(Puffinosis) 코로나바이러스, 랫 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스, 전염성 기관지염(Infectious bronchitis) 바이러스, 칠면조 코로나바이러스, 박쥐 코로나바이러스 차이나(China) 2005, 박쥐 코로나바이러스 균주 61, 박쥐 코로나바이러스 ZS-2005, 조류 드로핑(droppings) 코로나바이러스, 닭 장관계(entric) 코로나바이러스, 오리 코로나바이러스, 거위 코로나바이러스, 인간 코로나바이러스 NO, 앵무새 코로나바이러스 AV71/99, 비둘기 코로나바이러스.
Figure 112008023221282-PCT00020
토로바이러스(Torovirus): 소 토로바이러스, 브레다(Breda) 토로바이러스, 말 토로바이러스, 베른(Berne) 바이러스, 인간 토로바이러스, 돼지 토로바이러스, 돼지 토로바이러스(균주 P10).
Figure 112008023221282-PCT00021
헤르페스바이리대 ( Herpesviridae )(83-105);
베타헤르페스바이리내 ( Betaherpesvirinae ): 사이토메갈로바이러스
레서스(Rhesus) 사이토메갈로바이러스 균주 68-1, 인간 헤르페스바이러스 5(균주 1042), 인간 헤르페스바이러스 5(균주 119), 인간 헤르페스바이러스 5(균주 2387), 인간 헤르페스바이러스 5(균주 4654), 인간 헤르페스바이러스 5(균주 5035), 인간 헤르페스바이러스 5(균주 5040), 인간 헤르페스바이러스 5(균주 5160), 인간 헤르페스바이러스 5(균주 5508), 인간 헤르페스바이러스 5 균주 AD169, 인간 헤르페스바이러스 5 균주 아이슨하트(Eisenhardt), 인간 헤르페스바이러스 5 균주 메를린(Merlin), 인간 헤르페스바이러스 5 균주 PT, 인간 헤르페스바이러스 5 균주 톨레도(Toledo), 인간 헤르페스바이러스 5 균주 타운(Towne), 침팬지 사이토메갈로바이러스, 아오틴(Aotine) 헤르페스바이러스 1, 개코원숭이(Baboon) 사이토메갈로바이러스 OCOM4-37, 체르코세부스 아길리우스(cercocebus agilis) 사이토메갈로바이러스 1, 콧수염원숭이(Cercopithecus cephus) 사이토메갈로바이러스 1, 콜로버스 바디우스(Colobus badius) 사이토메갈로바이러스 1, 동부흑백콜로버스(Colobus guereza) 사이토메갈로바이러스 1, 만포땃쥐(Crocidura russula) 사이토메갈로바이러스 1, 게잡이원숭이(Macaca fascicularis) 사이토메갈로바이러스 1, 맨드릴(Mandrillus) 사이토메갈로바이러스, 혹멧돼지(Phacochoerus africanus) 사이토메갈로바이러스 1, 오랑우탄(Pongo pygmaeus) 사이토메갈로바이러스 1, 돼지 사이토메갈로바이러스, 유인원 사이토메갈로바이러스.
Figure 112008023221282-PCT00022
알파헤르페스바이리내 ( Alphaherpesvirinae ):심플렉스바이러스(Simplexvirus):
소 헤르페스 바이러스 유형 2(균주 BHM-1), 소 헤르페스 바이러스 유형 2(균주 BMV), 세르코피테신(Cercopithecine) 바이러스 1(균주 E2490), 세르코피테신 바이러스 16, 세르코피테신 바이러스 2(SA8), 단순포진 바이러스(유형 1/균주 17), 단순포진 바이러스(유형 1/균주 A44), 단순포진 바이러스[유형 1/균주 안젤로티(Angelotti)], 단순포진 바이러스(유형 1/균주 CL101), 단순포진 바이러스(유형 1/균주CVG-2), 단순포진 바이러스(유형 1/균주F), 단순포진 바이러스(유형 1/균주 HFEM), 단순포진 바이러스(유형 1/균주 HZT), 단순포진 바이러스(유형 1/균주 MGH-10), 단순포진 바이러스(유형 1/균주 MP), 단순포진 바이러스[유형 1/균주 패튼(Patton)], 단순포진 바이러스(유형 1/균주 R19), 단순포진 바이러스(유형 1/균주 SC16), 단순포진 바이러스 1 균주 R-15, 인간 헤르페스바이러스 7 균주 JI, 인간 헤르페스바이러스 1 균주 KOS, 인간 헤르페스바이러스 2(단순포진 바이러스 유형 2), 단순포진 바이러스(유형 2/균주 B4327UR), 인간 헤르페스바이러스 2 균주 186, 인간 헤르페스바이러스 2 균주 333, 인간 헤르페스바이러스 2 균주 G, 인간 헤르페스바이러스 2 균주 HG52, 인간 헤르페스바이러스 2 균주 SA8, 인간 헤르페스바이러스 2 균주 SN03, 인간 헤르페스바이러스 2 균주 SS01, 인간 헤르페스바이러스 2 균주 ST04.
Figure 112008023221282-PCT00023
플라비바이리대 ; 플라비마이러스 (106-133)
알푸이(Alfuy) 바이러스, 알크후르마 출혈열(Alkhurma hemorrhagic fever) 바이러스, 아포이(Apoi) 바이러스, 아로아(Aroa) 바이러스, 바가자(Bagaza) 바이러스, 반지(Banzi) 바이러스, 바투 케이브(Batu Cave) 바이러스, 보우보우이(Bouboui) 바이러스, 부칼라사 박쥐(Bukalasa bat) 바이러스, 버슈쿠아라(Bussuquara) 바이러스, CY1014 바이러스, 카시파코레(Cacipacore) 바이러스, 캐리 아일랜드(Carey Island) 바이러스, 세포 융합제(Cell fusing agent) 바이러스, 카우본 릿지(Cowbone Ridge) 바이러스, 다카르 박쥐(Dakar bat) 바이러스, 사슴 진드기(Deer tick) 바이러스, 엣지 힐(Edge Hill) 바이러스, 엔테베 박쥐(Entebbe bat) 바이러스, 플라비바이러스 CbaAr4001, 플라비바이러스 FSME, 플라비바이러스 sp., 가제트 걸리(Gadget Gully) 바이러스, 그리스 염소 뇌염(Greek goat encephalitis) 바이러스, 이과페(Iguape) 바이러스, 일헤우스(Ilheus) 바이러스, 이스라엘 칠면조 수막뇌골수염(Israel turkey menigoencephalomyelitis) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 저그라(Jugra) 바이러스, 후티아파(Jutiapa) 바이러스, 카담(Kadam) 바이러스, 카미티 리버(Kamiti River) 바이러스, 카르쉬(Karshi) 바이러스, 케도우고우(Kedougou) 바이러스, 코코베라(Kokobera) 바이러스, 코우탕고(Koutango) 바이러스, 쿰린지(Kumlinge) 바이러스, 쿤진(Kunjin) 바이러스, 키야사나 삼림병(Kyasanur forest disease) 바이러스, 랑가트(Langat) 바이러스, 랑카트 바이러스 (균주 TP21), 랑가트 바이러스(균주 Yelantsev), 도약병(Louping ill) 바이러스, 메아반(Meaban) 바이러스, 모독(Modoc) 바이러스, 몬타나 박쥐 백질뇌염(Montana myotis leukoencephalitis) 바이러스, 무레이 밸리(Murray Valley) 뇌염 바이러스, 나란잘(Naranjal) 바이러스, 네기쉬(Negishi) 바이러스, 엔타야(Ntaya) 바이러스, 옴스크 출혈열(Omsk hemorrhagic fever) 바이러스, 프놈펜 박쥐(Phnom Penh bat) 바이러스, 포티스쿰(Potiskum) 바이러스, 포와산(Powassan) 바이러스, 리오 브라보(Rio Bravo) 바이러스, 로시오(Rocio) 바이러스, 로얄 팜(Royal Farm) 바이러스, 러시아 춘하 뇌염(Russian Spring-Summer encephalitis) 바이러스, 사보야(Saboya) 바이러스, 살 비에야(Sal Vieja) 바이러스, 샌 페를리타(San Perlita) 바이러스, 소마레즈 리프(Saumarez Reef) 바이러스, 세픽(Sepik) 바이러스, 세티아완(Sitiawan) 바이러스, 소콜룩(Sokoluk) 바이러스, 스페인 양 뇌염(Spanish sheep encephalitis) 바이러스, 스폰드웨니(Spondweni) 바이러스, 세인트루이스 뇌염(St. Louis encephalitis) 바이러스, 스타트포드(Statford) 바이러스, 타마나 박쥐(Tamana bat) 바이러스, 템부수(Tembusu) 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 진드기 매개 플라비바이러스, 진드기 매개 포와산 바이러스(균주 1b), 터키 양(Turkish sheep) 뇌염 바이러스, 티우레니이(Tyuleniy) 바이러스, 우간다 에스(Uganda S) 바이러스, 우수투(Usutu) 바이러스, 왕 통(Wang Thong) 바이러스, 베셀스브론(Wesselsbron) 바이러스, 웨스트 나일(West Nile) 바이러스, 야운데(Yaounde) 바이러스, 황열(Yellow fever) 바이러스, 요코세(Yokose) 바이러스, 지카(Zika) 바이러스, 모기 매개 바이러스.
Figure 112008023221282-PCT00024
플라비바이리대 ; 헤파시바이러스 ( Hepacivirus )(134-142); C형 간염 바이러스
C형 간염 바이러스 아형 1a, C형 간염 바이러스 아형 1b, C형 간염 바이러스 아형 1c, C형 간염 바이러스 아형 1d, C형 간염 바이러스 아형 1e, C형 간염 바이러스 아형 1f, C형 간염 바이러스 아형 2a, C형 간염 바이러스 아형 2b, C형 간염 바이러스 아형 2c, C형 간염 바이러스 아형 2d, C형 간염 바이러스 아형 2f, C형 간염 바이러스 아형 2i, C형 간염 바이러스 아형 2k, C형 간염 바이러스 아형 3a, C형 간염 바이러스 아형 3b, C형 간염 바이러스 아형 3g, C형 간염 바이러스 아형 3k, C형 간염 바이러스 아형 4a, C형 간염 바이러스 아형 4c, C형 간염 바이러스 아형 4d, C형 간염 바이러스 아형 4f, C형 간염 바이러스 아형 4h, C형 간염 바이러스 아형 4k, C형 간염 바이러스 아형 5a, C형 간염 바이러스 아형 6a, C형 간염 바이러스 아형 6b, C형 간염 바이러스 아형 6d, C형 간염 바이러스 아형 6g, C형 간염 바이러스 아형 6h, C형 간염 바이러스 아형 6k, C형 간염 바이러스(분리균 EC1), C형 간염 바이러스(분리균 10), C형 간염 바이러스[분리균 글라스고우(Glasgow)], C형 간염 바이러스(분리균 HC-J2), C형 간염 바이러스(분리균 HC-J5), C형 간염 바이러스(분리균 HC-J7), C형 간염 바이러스(분리균 HCT18), C형 간염 바이러스(분리균 HCT27), C형 간염 바이러스(분리균 HCV-476), C형 간염 바이러스(분리균 HCV-KF), C형 간염 바이러스(분리균 인간), C형 간염 바이러스(분리균 TH), C형 간염 바이러스(분리균 TH), C형 간염 바이러스(분리균 VT204), C형 간염 바이러스(분리균 VT316), C형 간염 바이러스(분리균 VT681), C형 간염 바이러스(분리균 VT886), C형 간염 바이러스(분리균 VT3887), C형 간염 바이러스(분리균 VT897), C형 간염 바이러스(분리균 VT898).
Figure 112008023221282-PCT00025
플라비바이리대; 페스티바이러스(Pestivirus)(143-144);
보르더병(Border disease) 바이러스, 소 바이러스성 설사증(Bovine viral diarrhea) 바이러스, 샤모아(Chamois) 페스티바이러스, 돼지열병(Classical Swine Fever) 바이러스, 돼지 콜레라(Hog cholera) 바이러스, 양 페스티바이러스, 페스티바이러스, 돼지 페스티바이러스, 북미산 영양(Pronghorn antelope) 페스티바이러스.
Figure 112008023221282-PCT00026
피코르나바이리대 ( Picornaviridae ); 헤파토바이러스 ( Hepatovirus ); A형 간염 바이러스(145-151):
A형 간염 바이러스 (균주 18F), A형 간염 바이러스 (균주 24A), A형 간염 바이러스 (균주 43C), A형 간염 바이러스 (균주 CR326), A형 간염 바이러스 (균주 GA76), A형 간염 바이러스 (균주 HM-175), A형 간염 바이러스 (균주 LA), A형 간염 바이러스 (균주 LCDC-1), A형 간염 바이러스 (균주 Mbb), A형 간염 바이러스 (균주 MSM1), A형 간염 바이러스 (균주 AGM-27), 유인원 A형 간염 바이러스 (균주 CY-145).
Figure 112008023221282-PCT00027
피코르나바이리대 ; 리노바이러스 ( Rhinovirus )(152-163);
인간 리노바이러스 10, 인간 리노바이러스 100, 인간 리노바이러스 11, 인간 리노바이러스 12, 인간 리노바이러스 13, 인간 리노바이러스 15, 인간 리노바이러스 16, 인간 리노바이러스 18, 인간 리노바이러스 19, 인간 리노바이러스 1A, 인간 리노바이러스 1B, 인간 리노바이러스 2, 인간 리노바이러스 20, 인간 리노바이러스 21, 인간 리노바이러스 22, 인간 리노바이러스 23, 인간 리노바이러스 24, 인간 리노바이러스 25, 인간 리노바이러스 28, 인간 리노바이러스 29, 인간 리노바이러스 30, 인간 리노바이러스 31, 인간 리노바이러스 32, 인간 리노바이러스 33, 인간 리노바이러스 34, 인간 리노바이러스 36, 인간 리노바이러스 38, 인간 리노바이러스 39, 인간 리노바이러스 40, 인간 리노바이러스 41, 인간 리노바이러스 43, 인간 리노바이러스 44, 인간 리노바이러스 45, 인간 리노바이러스 46, 인간 리노바이러스 47, 인간 리노바이러스 49, 인간 리노바이러스 50, 인간 리노바이러스 51, 인간 리노바이러스 53, 인간 리노바이러스 54, 인간 리노바이러스 55, 인간 리노바이러스 56, 인간 리노바이러스 57, 인간 리노바이러스 58, 인간 리노바이러스 59, 인간 리노바이러스 60, 인간 리노바이러스 61, 인간 리노바이러스 62, 인간 리노바이러스 63, 인간 리노바이러스 64, 인간 리노바이러스 65, 인간 리노바이러스 66, 인간 리노바이러스 67, 인간 리노바이러스 68, 인간 리노바이러스 7, 인간 리노바이러스 71, 인간 리노바이러스 73, 인간 리노바이러스 74, 인간 리노바이러스 75, 인간 리노바이러스 76, 인간 리노바이러스 77, 인간 리노바이러스 78, 인간 리노바이러스 8, 인간 리노바이러스 80, 인간 리노바이러스 81, 인간 리노바이러스 82, 인간 리노바이러스 85, 인간 리노바이러스 88, 인간 리노바이러스 89, 인간 리노바이러스 9, 인간 리노바이러스 90, 인간 리노바이러스 94, 인간 리노바이러스 95, 인간 리노바이러스 96, 인간 리노바이러스 98, 인간 리노바이러스 B, 인간 리노바이러스 14, 인간 리노바이러스 17, 인간 리노바이러스 26, 인간 리노바이러스 27, 인간 리노바이러스 3, 인간 리노바이러스 8001, 인간 리노바이러스 Nov1995, 인간 리노바이러스 35, 인간 리노바이러스 37, 인간 리노바이러스 6253, 인간 리노바이러스 Sep1994, 인간 리노바이러스 9166, 인간 리노바이러스 Sep1995, 인간 리노바이러스 4, 인간 리노바이러스 42, 인간 리노바이러스 9864, 인간 리노바이러스 Sep1996, 인간 리노바이러스 5, 인간 리노바이러스 52, 인간 리노바이러스 7425, 인간 리노바이러스 Dec1995, 인간 리노바이러스 5928, 인간 리노바이러스 May1995, 인간 리노바이러스 70, 인간 리노바이러스 72, 인간 리노바이러스 79, 인간 리노바이러스 83, 인간 리노바이러스 8317, 인간 리노바이러스 Aug1996, 인간 리노바이러스 86, 인간 리노바이러스 7851, 인간 리노바이러스 Sep1996, 인간 리노바이러스 92, 인간 리노바이러스 93, 인간 리노바이러스 97, 인간 리노바이러스 99, 앤트웨프 리노바이러스 98/99, 인간 리노바이러스 263 베를린 2004, 인간 리노바이러스 균주 행크스(Hanks), 비유형(Untyped) 인간 리노바이러스 OK88-8162, 아메리카 진드기(Amblyomma americanum), 인간 리노바이러스 UC.
Figure 112008023221282-PCT00028
피코르나바이리대 ; 엔테로바이러스 ( Enterovirus )(164-179)
소 엔테로바이러스, 소 엔테로바이러스 균주 K2577, 소 엔테로바이러스 균주 SL305, 소 엔테로바이러스 유형 2, 콕삭키에바이러스(Coxsckievirus) A16, 콕삭키에바이러스 B3, 엔테로바이러스 A01-2A-1, 엔테로바이러스 H02-2A-3, 엔테로바이러스 H02-2B-1, 엔테로바이러스 H04-2B-2, 엔테로바이러스 Hu, 엔테로바이러스 S01-1-2, 엔테로바이러스 S01-2A-1, 엔테로바이러스 S02-1-6, 엔테로바이러스 S03-1-3, 엔테로바이러스 S06-1-1, 인간 콕삭키에바이러스 A16, 인간 콕삭키에바이러스 A9, 인간 콕삭키에바이러스 A9B, 콕삭키에바이러스, 엔테로바이러스 69, 엔테로바이러스 74, 엔테로바이러스 79, 엔테로바이러스 81, 엔테로바이러스 82, 엔테로바이러스 83, 엔테로바이러스 86, 엔테로바이러스 옌볜(Yanbisn) 96-83csf, 엔테로바이러스 옌볜 96-85csf, 인간 콕삭키에바이러스 A1, 인간 콕삭키에바이러스 A10, 인간 콕삭키에바이러스 A11, 인간 콕삭키에바이러스 A12, 인간 콕삭키에바이러스 A13, 인간 콕삭키에바이러스 A14, 인간 콕삭키에바이러스 A15, 인간 콕삭키에바이러스 A17, 인간 콕삭키에바이러스 A18, 인간 콕삭키에바이러스 A19, 인간 콕삭키에바이러스 A2, 인간 콕삭키에바이러스 A20, 인간 콕삭키에바이러스 A21, 인간 콕삭키에바이러스 A22, 인간 콕삭키에바이러스 A24, 인간 콕삭키에바이러스 A3, 인간 콕삭키에바이러스 A4, 인간 콕삭키에바이러스 A5, 인간 콕삭키에바이러스 A6, 인간 콕삭키에바이러스 A7, 인간 콕삭키에바이러스 A8, 인간 콕삭키에바이러스 B1, 인간 콕삭키에바이러스 B2, 인간 콕삭키에바이러스 B4, 인간 콕삭키에바이러스 B5, 인간 콕삭키에바이러스 B6, 인간 에코바이러스(echovirus) 1, 인간 에코바이러스 11, 인간 에코바이러스 12, 인간 에코바이러스 13, 인간 에코바이러스 14, 인간 에코바이러스 15, 인간 에코바이러스 16, 인간 에코바이러스 17, 인간 에코바이러스 18, 인간 에코바이러스 19, 인간 에코바이러스 2, 인간 에코바이러스 20, 인간 에코바이러스 21, 인간 에코바이러스 24, 인간 에코바이러스 25, 인간 에코바이러스 26, 인간 에코바이러스 27, 인간 에코바이러스 29, 인간 에코바이러스 3, 인간 에코바이러스 30, 인간 에코바이러스 31, 인간 에코바이러스 32, 인간 에코바이러스 33, 인간 에코바이러스 4, 인간 에코바이러스 5, 인간 에코바이러스 6, 인간 에코바이러스 7, 인간 에코바이러스 8, 인간 에코바이러스 9, 인간 엔테로바이러스 68, 인간 엔테로바이러스 69, 인간 엔테로바이러스 70, 인간 엔테로바이러스 71, 인간 엔테로바이러스 73, 인간 엔테로바이러스 74, 인간 엔테로바이러스 75, 인간 엔테로바이러스 77, 인간 엔테로바이러스 78, 인간 엔테로바이러스 89, 인간 엔테로바이러스 90, 인간 엔테로바이러스 91, 인간 엔테로바이러스 B, 인간 폴리오바이러스(poliovirus) 1, 인간 폴리오바이러스 2, 인간 폴리오바이러스 3, 돼지 엔테로바이러스 10, 돼지 엔테로바이러스 9, 돼지 엔테로바이러스 J10, 돼지 엔테로바이러스 J4, 돼지 엔테로바이러스 J6, 유인원 피코르나바이러스 7, 유인원 피코르나바이러스 7', 돼지 수포병(Swine vesicular disease) 바이러스, 야생 폴리오바이러스 유형 3.
Figure 112008023221282-PCT00029
여기에서 제공된 서열에 대한 데이타 마이닝은 본원의 마지막에 있는 참고문헌을 기초로 한다.
실시예 3
대표적인 다중패널 검출 키트
Figure 112008023221282-PCT00030
위장관 키트 :
바이러스 균주
로타 바이러스
아데노 40/41
A형 간염
C형 간염
E형 간염
칼리시바이러스
CMV(사이토메갈로바이러스)
수막염 키트 :
바이러스 균주
엔테로바이러스(1-80) (폴리오 바이러스 1,2,3 포함)
웨스트 나일 바이러스
단순포진 1 & 2 & 6
특별 수막염 키트
토가 바이러스(이스턴/웨스턴 말)
플라비 바이러스(세인트 루이스 뇌염, 일본 뇌염...)
광견병
성인성 질병 키트 :
바이러스 균주
HIV 균주
단순포진 1
단순포진 2
HSV-1
HSV-2
HSV(인간 유두종 바이러스)
HTLV-1
여행자용 키트 :
바이러스 균주
A형 간염
B형 간염
C형 간염
HIV
포진 바이러스 1 & 2
수의용 키트 :
바이러스 균주
광견병
디스템퍼
하기에 상기 언급된 키트를 사용하여 검출할 수 있는 질환의 예를 제공한다.
호흡기 키트 :
상세불명 병원체( unspecified organism )의 백일해( whooping cough )
달리 분류된 상태에서 폐렴균 감염; 상세불명부위( unspecified site )
상세불명부위에서의 달리 분류된 상태에서 아데노바이러스 감염
알콜중독증에서의 급성 알콜 중독, 일시적 음주 행위
상세불명의 비화농성 중이염( Nonsuppurative otitis media )
급성 장액성( serous ) 중이염
급성 점액성( mucoid ) 중이염
급성 혈액성( sanguinous ) 중이염
급성 알레르기성 장액성 중이염
급성 알레르기성 점액성 중이염
급성 알레르기성 혈액성 중이염
고막의 자연 파열이 없는 급성의 화농성( suppurative ) 중이염
고막의 자연 파열이 있는 급성의 화농성 중이염
만성 이관고실성 ( tubotympanic ) 화농성 중이염
상세불명의 만성 화농성 중이염
상세불명의 화농성 중이염
상세불명의 중이염
합병증이 없는 급성 유양돌기염( mastoiditis )
유양돌기의 골막하 농양( subperiosteal abscess of mastoid )
상세불명의 고막의 천공( perforation of tympanic membrane )
고막의 중심성 천공( central perforation )
고막의 상고 천공( attic perforation )
고막의 기타 변연성 천공( other marginal perforations )
고막의 다발성 천공( multiple perforation )
고막의 전체 천공( total perforation )
위축성 이완( atrophic flaccid ) 고막
위축성 비이완 ( atrophic nonflaccid ) 고막
고막의 상세불명 장애
급성 비인두염( nasopharyngitis )(일반 감기)
급성 상악동염( maxillary sinusitis )
급성 전두동염( frontal sinusitis )
급성 사골동염( ethmoidal sinusitis )
급성 접형동염( sphenoidal sinusitis )
기타 급성 부비동염( sinusitis )
상세불명의 급성 부비동염
급성 인후염( pharyngitis )
급성 편도염( tonsillitis )
급성 후두염( laryngitis )
폐쇄 기재( mention of obstruction )가 없는 급성 기관염( tracheitis )
폐쇄를 동반한 급성 기관염
폐쇄 기재가 없는 급성 후두기관염( laryngotracheitis )
폐쇄를 동반한 급성 후두기관염
폐쇄 기재가 없는 급성 후두개염( epiglottitis )
폐쇄를 동반한 급성 후두개염
크룹( croup )
급성 인후두염( laryngopharyngitis )
기타 다중 부위의 급성 상기도 감염( upper respiratory infection )
상기불명 부위의 급성 상기도 감염
급성 기관지염( bronchitis )
아데노바이러스에 의한 폐렴
세포기 융합 바이러스에 의한 폐렴
파라인플루엔자 바이러스에 의한 폐렴
달리 분류되지 않은 기타 바이러스에 의한 폐렴
상세불명의 바이러스성 폐렴
폐렴구균성 ( pneumococcal ) 폐렴
크렙지엘라 ( klebsiella pneumoniae ) 폐렴
녹농균( pseudomonas )에 의한 폐렴
헤모필루스 인플루엔자(h. influenzae )에 의한 폐렴
상세불명의 세균성 폐렴
거대세포봉입체증( cytomegalic inclusion disease )에서의 폐렴
백일해에서의 폐렴
탄저(anthrax)에서의 폐렴
아스페르질루스증(aspergillosis)에서의 폐렴
기타 전신성 진균증(systemic mycoses)에서의 폐렴
달리 분류된 기타 감염성 질환에서의 폐렴
상세불명 병원체의 기관지폐렴( bronchopneumonia )
폐렴을 수반한 인플루엔자
기타 호흡성 발현( respiratory manifestation )을 수반한 인플루엔자
기타 발현을 수반한 인플루엔자
급성 또는 만성으로서 상세불명의 기관지염
기타 만성 기관지염
천식 지속상태( status asthmaticus ) 기재가 없는 외인성 천식( extrinsic asthma )
천식 지속상태를 수반한 외인성 천식
천식 지속상태 기재가 없는 내인성 천식( intrinsic asthma )
천식 지속상태를 수반한 내인성 천식
천식 지속상태 기재가 없는 상세불명 유형의 천식
천식 지속상태를 수반한 상세불명 유형의 천식
흡입( inhalation )(음식물, 구토 또는 n.o.s.)에 의한 폐실질염( pneumonitis )
누공(fistula)을 수반한 축농증( empyema )
누공의 기재가 없는 축농증
삼출( effusion ) 또는 현재 결핵( current tuberculosis )의 기재가 없는 늑막염( pleurisy )
삼출을 수반하며 tbc 이외의 것에 의해 야기되는 세균성 늑막염
결핵성을 제외한, 흉막 삼출액( pleural effusion )의 기타 상세 형태
상세불명의 흉막 삼출액
폐의 농양( abscess )
종격(mediastinum)의 농양
폐 허탈( pulmonary collapse )
호흡 부전( respiratory failure )
달리 분류되지 않은, 호흡기의 기타 질병
호흡기의 상세불명의 질병
독성 위장염( gastroenteritis ) 또는 결장염( colitis )
기타 및 상세불명의 비감염성 위장염 또는 결장염
청색증( cyanosis )
상세불명의 호흡 이상( respiratory abnormality )
과도호흡( hyperventilation )
좌위호흡( orthopnea )
기타 호흡곤란( dyspnea ) 및 호흡 이상
기침
질식( asphyxia )
위장염 키트 :
비브리오 콜레라( vibrio cholerae )에 의한 콜레라( cholera )
비브리오 콜레라 el tor 에 의한 콜레라
상세불명의 콜레라
장티푸스( typhoid fever )
파라장티푸스 a( paratyphoid fever )
파라장티푸스 b
파라장티푸스 c
상세불명의 파라장티푸스
살모넬라성 위장염( salmonella gastroenteritis )
살모넬라성 패혈증( salmonella septicemia )
상세불명의 국소 살모넬라 감염( localized salmonella infection )
살모넬라성 수막염( salmonella meningitis )
살모넬라성 폐렴
살모넬라성 관절염( salmonella arthritis )
살모넬라성 골수염( salmonella osteomyelitis )
기타 국소 살모넬라 감염
기타 상세의 살모넬라 감염
상세불명의 살모넬라 감염
시겔라 플렉스네리( shigella flexneri )
시겔라 보이디( shigella boydii )
시겔라 손네( shigella sonnei )
기타 상세의 시겔라 감염
상세불명의 시겔라증( shigellosis )
포도구균성 식중독( staphylococcal food poisoning )
보틀리누스중독증( botulism )
클로스트리듐 퍼프린젠스( clostridium perfringens )(c. welchii )에 의한 식중독
기타 클로스트리디아(clostridia)에 의한 식중독
장염 비브리오균(vibrio parahaemolyticus)에 의한 식중독
상세불명의 식중독
농양 기재가 없는 아메바성 이질( amebic dysentery )
농양 기재가 없는 만성 아메바성 대장염( intestinal amebiasis )
아메바성 비이질성 대장염( Amoebic nondysenteric colitis )
아메바성 간 농양( amebic liver abscess )
아메바성 폐 농양
아메바성 뇌 농양
아메바성 피부 궤양( skin ulceration )
기타 부위의 아메바성 감염
상세불명의 아메바증( amebiasis )
발란티듐증( balantidiasis )
지아르디아증( giardiasis )
장관성 트리코모나스증( intestinal trichomoniasis )
기타 상세의 원충성 창자 질환( protozoal intestinal disease )
상세불명의 원충성 창자 질환
파라 대장균( paracolon bacilli )의 아리조나군(arizona group)에 의한 장 감염
아레로박터 아에로게네스(aerobacter aerogenes)에 의한 장 감염
프로테우스( proteus )(미라빌리스; mirabilis )( 모르가니 ; morganii )에 의한 장 감염
포도상구균( staphylococcus )에 의한 장 감염
슈도모나스( pseudomonas )에 의한 장 감염
기타 상세 박테이라에 의한 장 감염
상세불명의 세균성 장염( bacterial enteritis )
달리 분류되지 않은 기타 병원균에 의한 장 감염
감염성 대장염, 장염 및 위장염
감염성 기원이라고 추정되는 대장염, 장염 및 위장염
감염성 설사( infectious diarrhea )
감염성 기원이라고 추정되는 설사
수막염 키트 :
상세불명의 균혈증(bacteremia)
균혈증
패혈증(septicemia)
폐렴구균성 패혈증(pneumococcal septicemia)
세균성 수막염
폐렴구균성 수막염
달리 분류된 기타 세균성 질환에서의 수막염
기타 상세 박테리아에 의한 수막염
상세불명의 수막염
감염성 관절염(septic arthritis)
안와골 세포염(periorbital cellulitis)
유양돌기염(mastoiditis) 및 관련 증상
급성 유양돌기염
합병증이 없는 급성 유양돌기염
폐렴구균성 복막염(pneumococcal peritonitis)
포진성 수뇌막염(herpetic meningoencephalitis)
포진성 패혈증
성인성 질환( sexually transmitted diseases ; std ) 키트 :
단순포진(herpes simplex)
눈꺼풀의 단순포진성 피부염(dermatitis)
단순포진성 원판형 각막염(disciform keratitis)
단순포진성 홍체모양체염(iridocyclitis)
단순포진성 수막염
단순포진성 외이도염(otitis externa)
눈 합병증을 수반하는 단순포진
기타 눈 합병증을 수반하는 단순포진
기타 상세 합병증을 수반하는 단순포진
상세불명의 합병증을 수반하는 단순포진
상세불명의 눈 합병증을 수반하는 단순포진
합병증 기재가 없는 단순포진
대상포진(herpes zoster)
눈꺼풀의 대상포진성 피부염
대상포진성 홍체모양체염
대상포진성 각결막염(keratoconjunctivitis)
수막염을 수반하는 대상포진
눈 합병증을 수반하는 대상포진
기타 신경계 합병증을 수반하는 대상포진
기타 눈 합병증을 수반하는 대상포진
기타 상세 합병증을 수반하는 대상포진
상세불명의 합병증을 수반하는 대상포진
상세불명의 신경계 합병증을 수반하는 대상포진
포진성 치은구내염(gingivostomatitis)
음경의 포진성 감염
포진성 수뇌막염
포진성 패혈증
음문의 포진성 궤양
포진성 외음질염(vulvovaginitis)
포진성 생인손(whitlow)
실시예 4
프로테아제 클로닝 및 활성 검정
물질 및 대표적인 방법
프로테아제 검정:
HRV 3C: HRV 3C 활성의 전형적인 생체외 검정을 실온에서 25mM HEPES, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 5% 글리세롤, pH 7.5 및 총 부피 1ml 내에서 실행하였다. HRV 3C 프로테아제 활성을 시료, 세포 용해질, 형질전환 세포 추출물(재조합체) 및 정제된 재조합체 HRV16 3C의 시료에서 확인하였다. 형광 기질(pep 1, 5, 6, 8, Ori 2; EDANS/DANCYL)을 4μM의 농도에서 전형적으로 사용하였다. 검출가능한 기질은 Ori 2, PEP1을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. EDANS/ DABCYL 기의 여기/방사(excitation/emission) 특성에 상응하는 여기/방사 340/490±15nm에서 형광계를 사용하여 반응을 확인하였다. 효소 농도는 1μM 내지 500pM으로 다양하다.
대안적으로, 3C 프로테아제 검정을 25mM 트리스 HCl pH 8.0, 150mM NaCl, 1mM EDTA pH 8.0, 6mM DTT, 2-6uM 기질, 2% DMSO, 416nM 3C 프로테아제 및 필요에 따라 저해제를 함유하는, 96 웰 포맷에서 30℃, 100μl 부피의 7-메톡시 쿠마린-4-아세트산(7-Methoxy coumarin-4-acetic acid; MOC) 형광색소 및 디니트로페놀(Dinitrophenol; DNP) 소광제로 표지한 기질을 사용하여 실행하였다. 형광을 10nm 컷오프(cutoff)를 갖는 328nM에서의 여기 및 393nM에서의 방사에 의해 확인된다. 다음의 방정식을 갖는 비선형 회귀분석 프로그램 EnzFitter(BioSoft)으로 데이터를 분석하였다:
Ki+(I/((Vmax x S)/V0)/Ks)-I-S
사용된 기질 농도는 기질의 Km(16.8uM)보다 낮으므로 S/Km 기간에 대한 보정은 사용되지 않았다.
반응물에 DTT, 글리세롤, Na2SO4, BSA 및 코 세척액을 첨가하였다.
엔테로바이러스 (비- 폴리오 엔테로 바이러스 NPEV ) 활성 검정: 신선한 CSF 시료(4℃에서 1-2일간 저장)를 4℃에서 3x20sec로 초음파처리하였다. 100μl의 용해질을 기질로서 Pep 1 4μl를 사용하여 100μl의 2x 반응 완충용액에 첨가하였다. 반응을 실온에서 실행하고 각각 여기/방사 340/490±15nm에서 형광계를 사용하여 확인하였다.
조직 배양 검정: H1 HeLa 세포 를 5% FBS, 1% 펜-스트렙(pen-strep) 및 1% 비필수 아미노산이 보충된 DMEM 배지에 성장시켰다. H1 HeLa 세포의 융합 플라스크(Confluent flask)를 1-10 PFU/세포의 MOI에서 HRV 스테레오타입(sterotype)14 및 1A로 감염시켰다. 세포를 감염시킨 후 48시간에 트립신 처리 또는 스크레핑(scraping) 중 하나를 사용하여 수확하였다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 반응 완충용액에 재현탁시켰다. 세포를 얼음 상에서 3x15sec로 초음파처리하여 파괴시킨 후 4℃, 1300rpm에서 10분간 원심분리하였다. 순수한 용해질(수용성 3C pro 포함)을 검정에 사용하였다.
SARS 및 HRV 16 3C 프로테아제의 클로닝: SARS 및 HRV 프로테아제를 실험 및 키트를 위한 프로테아제의 소스로서 클로닝하였다.
HRV 16: 프라이머를 게놈 내의 4320-4869bp 위치로 설계하였다. 전진 프라이머(forward primer)를 5' 프라임 확장, CACC으로 첨가하여 토포아이소머라제(topoisomerase) 클로닝 벡터 내로 직접적 클로닝을 촉진하였다. 역전사 프라이머(reverse primer)를 3' 프라임 말단에 종결 코돈(TGA)을 도입하기 위해 사용하였다. 이러한 프라이머를 사용한 예상된 PCR 산물은 556bp이다. 사용된 주형은 HRV 16 cDNA를 포함하는 벡터[진뱅크(GenBank) 기탁 번호 gi:3915817]로부터 기원한 것이다.
HRV 16 fwd: 5' CACCGGTCCAGAAGAAGAAT 3' 서열 번호: 48
HRV 16 rev: 5' TCATTGTTGTTCAGTGAAGTAT 3' 서열 번호: 49
SARS: 프라이머를 게놈 내의 9985-10902bp 위치로 설계하였다(SARS 3CL, 진뱅크 기탁 번호 gi:37999886). 전진 프라이머를 5' 프라임 확장, CACC으로 첨가하여 직접적 클로닝을 촉진하였다. 역전사 프라이머를 3' 프라임 말단에 종결 코돈(TAA)을 도입하기 위해 사용하였다. 이러한 프라이머를 사용한 PCR 산물은 925bp이다. 사용된 주형은 Dr. Av-Gay(Av Gay, Vancouver, Canada)로부터 수득된 cDNA 라이브러리로부터 기원한 것이다.
SARS fwd : 5' CACCAGTGGTTTTAGGAAAATGGC 3' 서열 번호: 50
SARS rev : 5' TTATTGGAAGGTAACACCAGAGC 3' 서열 번호: 51
유전자의 PCR 증폭을 표준 반응 혼합물(1 x 반응 완충용액, 0.5mM dNTPs, 100pmol 프라이머 및 1유닛 pfu)에서 교정 폴리머라제(proof reading polymerase; Pfu)를 사용하여 실행하였다(다음의 사이클링 과정을 사용하였다 - 94℃에서 3분 , 그 후 94℃에서 1분, 59℃에서 1분, 72℃에서 1분 및 72℃에서 10분의 35사이클). SARS 3CL 및 HRV 16 3C 프로테아제 둘 다로부터의 PCR 산물을 pET 151/D-TOPO(Invitrogen, Carlsbad CA) 내로 직접적으로 클로닝하였다(도 1a 및 1b). HRV 16 3C 프로테아제에 대해 스크리닝한 35개 콜로니 중에서 1개가 양성인 것을 발견하였다. SARS 3CL 프로테아제에서, 스크리닝한 15개 중 3개에서 양성이 발견되었다.
실험 결과
SARS 및 HRV 16 3C 프로테아제의 클로닝: SARS 3CL 및 16 프로테아제를 상기 기재된 바와 같이, pET 151/D-TOPO(Invitrogen, Carlsbad CA) 내로 클로닝하였다. HRV 16 3C 프로테아제에 대해 스크리닝한 35개 콜로니 중에서 1개가 양성인 것을 발견하였다. SARS 3CL 프로테아제에서, 스크리닝한 15개 중 3개에서 양성이 발견되었다. 재조합체 HRV 16 3C 및 SARS 3CL 프로테아제 활성이 형질전환된 박테리아로부터의 전체 세포 용해질에서 검출되었다(도 2).
최적 분열 서열 기질 펩티드를 사용하는 우수한 기질 활성- 생체외 검정
펩티드 설계: 대상 프로테아제의 검출 및 특성화를 위한 선택적인 최적의 유효한 기질을 제공하기 위해 천연 펩티드 기질 및 설계된 펩티드 기질의 분열을 생체외 검정과 비교하였다. 펩티드 기질을 HRV 3C 프로테아제에 대한 검정에 사용하기 위해 설계하였다. 펩티드 기질 서열을 천연 기질 부위 서열에 따라 설계하거나 또는 본 발명의 방법에 따라 선택하였다. 전형적으로, 기질 서열 설계를 알려진 많은 HRV 분열 부위의 다중 서열 정렬을 실행하고 이의 생물정보학적 특성에 기초하는 특이 위치에서 가장 최적인 아미노산을 결정함에 의해 결정하였다. 하기 표 14는 생체외 검정에서 사용된 3C 프로테아제 기질 및 이의 기원을 나타낸 것이다.
Figure 112008023221282-PCT00031
3C 프로테아제에 대한 최적 펩티드 기질의 결정: 3C 프로테아제에 대한 가장 최적의 분열 기질을 결정하기 위해 재조합체 3C 프로테아제(예를 들어 상기 실시예 1)에 의한 합성 펩티드 기질 Pep1-Pep9(상기 표 14 참조)의 분열을 천연 기질 서열 Ori 2의 분열과 비교하였다. Pep1-Pep9 중에서 가장 빠른 동역학을 나타내는 기질은 다중 HRV 3C 분열 부위 및 생물정보학을 기초로 하여 설계된 Pep1이다. 도 3은 Ori 2와 비교했을 때 3C 프로테아제 검정의 우수한 동역학을 나타낸 것이다. 도 4는 250nM의 3C 프로테아제를 사용한, 0.003μM 내지 4μM의 기질 농도 범위에서 재조합 3C 프로테아제에 의한 Pep1의 분열 동역학을 나타낸 것이다. 적어도 3분의 반응에서의 선형 동역학을 검정된 모든 기질 농도에 대하여 발견되었다.
최적 펩티드 기질을 사용한 3C 프로테아제 검정에서의 최적 조건의 결정: 설계된 기질을 사용하는 3C 프로테아제 검정에서의 최적 조건을 수립하기 위해, 반응 조건의 변경에 대한 감수성을 평가하였다. DTT, 글리세롤, Na2SO4 및 BSA와 같은 표준 반응 완충용액의 중요한 성분의 농도를 변경시키고 반응 속도(RFU/분)에서의 효과를 결정하였다. 결과는 Pep1 기질을 사용하기 위한 최적 반응 완충용액이 6mM DTT, 5% 글리세롤, 0.8M Na2SO4 및 0.1-1mg BSA/ml를 포함함을 나타낸다.
최적 펩티드 기질을 사용한 3C 프로테아제 검정의 감수성 결정: 의학 시료에서 효소의 농도는 종종 낮아지는 것으로 예상된다. 설계된 펩티드 기질을 사용하는 3C 프로테아제 활성의 검출의 하한(lower limits)을 결정하기 위해, 4μM의 Pep1을 재조합 효소 농도의 범위로 검정하였다. 이러한 검정의 프로테아제 검출의 하한은 0.5-1.0nM 3C 프로테아제로 결정된다.
최적 펩티드 기질을 사용한 3C 프로테아제 검정의 특이성 결정: 원하는 분열 활성에 대한 설계된 기질의 특이성은 실제 의학 시료에서 분열 활성의 평가에 결정적이다. Pep1에 대한 HRV 3C 프로테아제의 특이성을 시험하기 위해, SARS 프로테아제 및 E.coli 용해질과의 Pep1 기질의 효소 교차-반응성을 시험하였다.
도 5는 HRV 16 용해질에서 HRV 3C 프로테아제로 분열한 Pep1의 특이성, 및 SARS 3CL 용해질 또는 E.coli 용해질을 갖는 모든 검출가능한 반응의 결여를 보인다.
특이성에 대한 추가 시험을 원위치에서 실제 HRV 감염을 자극하기 위한 H1 HeLa 세포 배지를 사용하여 실행하였으며 이러한 조건 하에서 3C 활성의 검출에서 설계된 기질의 효율을 시험하였다. HRV 감염된 HeLa 세포의 초음파처리된 순수한 용해질을 기질 Pep1, Ori2 및 Pep6을 사용하여 검정하였다. 결과는 비특이 프로테아제 활성의 높은 백그라운드(high background)를 갖는다.
HeLa 세포가 작용하는 이러한 비특이 효과를 제거하기 위한 시도에서 HeLa 용해질에 의한 설계된 기질의 분열에서 알려진 다양한 프로테아제 저해제[EDTA, EGTA, PMSF 및 아프로티닌(Aprotinin)]의 효과를 평가하였다. 하기 표 15는 저해제 PMSF 및 아프로티닌에 대해 기질로서 Pep1을 사용한 단백질 분열 반응의 상대적 불민감(insensitivity)을 나타낸다. EDTA/EGTA는 Pep1의 3C 프로테아제 분열을 일부 저해한다.
Figure 112008023221282-PCT00032
임상 조건에서 최적 펩티드 기질을 사용한 3C 프로테아제 검정의 효율 결정: HRV 프로테아제의 검정을 위한 임상 환경을 점막 분비의 존재로 특성화하였다. 실제 임상 조건 하에서 3C 프로테아제에 의한 설계된 기질의 분열 효율을 결정하기 위해, 첨가된 코 세척 시료의 존재 및 부재시의 재조합 3C 프로테아제에 의한 Pep1 분열을 비교하였다. 도 6은 임상 사용에서 반응의 적합성을 나타내는 반응 동역학에서의 코 세척 시료의 효과의 부재를 나타낸다.
임상 코 세척 시료에서 최적의 분열 서열 기질 펩티드의 분열에 의한 리노바 이러스성 바이러스 감염의 정확한 검출 - 임상 세팅에서의 사용에서 설계된 펩티드 기질의 적합성을 시험하기 위해 피실험자로부터 수득한 코 세척 시료(점액 추출 키트 사용-필터를 갖는 뮤코세이프 익스트렉터(Mucosafe Extractor)-Maersk Medical A/S-덴마크)를 바이러스의 존재 여부에 대해 평가한 후 프로테아제 촉매 활성에 대해 본 발명의 방법으로 시험하였다. 각 시료의 일부를 조직 배양, 및 시판되는 모노클로날 항체(Chemicon International, Inc., Temecula, CA)를 사용하는 직접 면역형광 검정(Immunonofluorescence assay; IFA)을 사용하여 RSV, 인플루엔자 A 및 B 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 및 아데노바이러스의 존재에 대해 평가하였다. 잔여물을 HRV 존재에 대해 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다.
일반적으로, HRV 검출에 대한 "최상의 표본"은 존재하지 않는다. 조직 배양은 바이러스 감수성에 의한 일상적인 실험이 아니며 허용가능한 상업적인 면역검정 시험은 없다. 그러므로, RT-PCR 분석을 선택하고 시료를 The Central Laboraotry of Virology, Division of Infectious Diseases, Department of Internal Medicine, University Hospitals of Geneva, Geneva, Switzerland에서 분석하였다.
임상 코 세척 시험: 검정을 24개 임상 시료(코 세척액)을 사용하여 수생하였다. 합성 펩티드 기질 Pep1을 사용하는 3C 프로테아제 특이 활성을 총 단백질 농도에 대하여 계산하였다[브레드포드(Bradford)에 의해](특이 활성=RFU/분/mg 단백질).
표 16은 RT-PCR 및프로테아제 활성(MND 검정)에 의한 시료의 HRV 검출을 비교한 결과를 나타낸다. 24개 시료 중 17개가 RT-PCR 결과에 관하여 프로테아제-양성 또는 프로테아제-음성(각각 0.5RFU/분/mg 단백질보다 크거나 작은 특이 활성)임이 결정되었다. 남아있는 7개 시료 중 5개 시료가 RT-PCR에서 음성이고 프로테아제 검정에 따라 양성이며, 2개 시료가 RT-PCR에서 양성이고 프로테아제 검정에 따라 음성이다. RT-PCR의 절대 정확도를 추정한, 이러한 초기 결과의 통계학적 분석(표 17)은 75%의 감수성 적합성 및 70%의 특이성 적합성을 나타낸다.
Figure 112008023221282-PCT00033
Figure 112008023221282-PCT00034
그러나 RT-PCR 검출의 정확성은 문제가 될 수 있으며 본 발명의 방법을 사용한 프로테아제 검출은 RT-PCR에 의한 검출보다 명료한 이점을 갖는다. RT-PCR은 RNA만을 검출하므로 비활성 바이러스도 검출할 수 있다. 따라서, 이는 RT-PCR에서 양성이고 프로테아제 활성에 대해서 음성인 시료가 프로테아제 검정이 활성 형태의 바이러스만을 검출한다는 사실에 의한 것일 것이다. 게다가 시험할 시료를 사용하기 전에 3-4년 동안 -80℃에 저장할 수 있음이 자명할 것이다. 그러므로 RT-PCR에서 양성이고 프로테아제 검정에 대해 음성으로 시험된 시료는 장기간 저장에 기인하여 불활성 3C 프로테아제를 갖는다. 추가로 프로테아제 검출은 RT-PCR보다 더 민감할 수 있으며 이는 RT-PCR에서 음성이고 프로테아제에 대해 양성인 시험 시료에 반영될 것이다.
따라서, 최적 분열 서열 기질 펩티드를 사용하는 3C 프로테아제 검정을 임상 시료에서 HRV 16을 성공적으로 검출한다.
실시예 5
임상 CSF 시료에서 최적 분열 서열 기질 펩티드의 분열에 의한 엔테로바이러 스성 바이러스 감염의 정확한 검출
비-폴리오 엔테로바이러스(Non-polio enterovirus; NPEV) 감염은 매해 늦여름 및 초가을에 일반적이며 인간에서 가장 일반적인 바이러스성 감염균으로서 리노바이러스 다음이다. 무균성 내막염(aseptic meningitis) 경우의 90% 이상이 열, 심한 두통, 목 경직, 목 통증, 구역질 및 구토, 밝은 빛에 대한 민감성 및 가능하게는 발진의 전형적 증상을 수반하는, NPEV에 의해 발생된다.
CSF에서의 NPEV의 검출은 현재 PCR 및 조직 배양에 의해 이루어진다. NPEV PCR은 더 민감한 감수성을 가지며 바이러스 배양보다 짧은 시간 내에 시료 수취 후 5-24시간 내에 결과를 제공할 수 있다. 그러나, 조직 배양 및 RT-PCR 둘 다 비용이 많이 들며 빠른 현장 진단에 적합하지 않은 복잡한 장치들이 필요하다. 최적 분열 서열 기질 펩티드를 사용하는 엔테로바이러스 검출의 효율을 시험하기 위해, 인간 뇌척수액(cerebro-spinal fluid; CSF) 시료를 본 발명의 방법에 의해 그리고 최종 조직 배양 검정으로 NPEV에 대하여 검정하였다.
임상 CSF 시험: 표 18은 본 발명의 방법의 뛰어난 감수성을 나타낸다. Pep9를 CSF에서의 정확하고 민감한 검출을 위한 최적 서열 기질 펩티드로서 선택하였다. Pep9를 다음과 같은 이유로 사용하였다: 첫째로, NPEV 및 HRV의 프로테아제는 비-최적 검정 조건에서라도 결과가 여전히 얻어짐을 보이는 동일한 과에 속한다. 둘째는, HRV가 CSF 내에 존재하지 않으므로 교차반응의 위험이 없다. 신선한 CSF를 요추천자로 수득하였다.
Figure 112008023221282-PCT00035
7개의 신선한 CSF 시료에서, 완전한 상호작용이 조직 배양 검정의 결과 및 프로테아제 활성에 기초한 검출 사이에서 발견되었다. 조직 배양 결과 및 프로테아제 검출 결과 사이의 양성 상호작용이 세포 밀도(450 세포/mm3 - 1 세포/mm3의 범위)에 의해 영향을 받지 않음을 주목하라. 그러므로, 엔테로바이러스의 정확하고 빠른 검출은 임상 조건 하에서 CSF 시료의 최적 서열 기질 펩티드의 분열에 의한 프로테아제 검출을 사용하여 이루어질 수 있다.
모두 합쳐 생각해 보면, 이러한 결과는 비교 효소 동역학에 따라 설계되고 선택된 최적 펩티드 기질을 더 높은 감수성 및 정확성으로 진단하고자 하는 목표 효소를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 진단하고자 하는 이러한 목표 효소의 검출은 엔테로바이러스 및 리노바이러스와 같은 일반 질환의 빠른 진단을 매우 향상시킬 수 있으며 SARS 및 조류 독감과 강은 유행성 및 범 유행성 병원균을 알아낼 수 있다.
실시예 6
분리를 기초로 하는 프로테아제 검출
본 발명은 친화성 분리를 기초로 하는, 반응에서 실행되는 특정 기질 분열에 따라 하나 또는 그 이상의 반응 제제(효소 또는 특정 화학물질)의 동시 검출을 위한 신규한 방법을 제공한다. 분열의 검출은 검출이 요구되는 특정 반응의 존재를 나타낸다. 한 실시형태에서 이러한 방법의 적용은 특정 반응을 촉매 하는 특정 효소의 검출을 위한 것이다. 다른 실시형태에서 효소는 이의 검출이 요구되는 생물계의 일부이며, 다른 실시형태에서 생물계는 바이러스 또는 박테리아 또는 그외 병원체이다. 검출 방법은 다음의 두 단계의 조합으로 구성된다:
1 단계 - 반응에서 처리되는 분자 및 처리되지 않는 분자 사이의 분리. 2 단계 - 처리된 분자만을 검출.
분리 메카니즘은 예를 들어 항체-기질, 핵산 혼성화와 같은 두 분자의 특이 친화성 결합 또는 예를 들어 막, 칩, 비드 등과 같은 고정화된 표면으로의 부착을 사용할 수 있다. 검출 단계는 친화성 또는 예를 들어 형광계, 비색계, 효소와 같은 그외 모든 방식 중 하나 또는 둘 다를 기초로 할 수 있다.
검출될 특정 반응을 겪는 기질은 다음 3 부분 및 C를 포함한다: X, Y 및 Z(도 7). 특이 분열 부위를 갖는 중심 분자(Y 구획, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 확인되는 동역학적으로 최적인 기질)를 분열된 기질을 검출하는 것을 목표로 하는 표지 분자(X 구획, 즉 검출가능한 성분)의 한쪽 말단에 연결시킨다. 표지 분자의 다른 말단에는 처리되는 기질 및 처리되지 않는 기질 사이를 분리하는 메카니즘 부분(Z 구획, 분리 성분)이 연결된다. 분자 Y의 분열에서, 기질 분열 산물은 다음과 같이 형성된다: (1) X 부분 및 Y의 일부를 포함하는 표지 구획(Tagging Segment; TS, 본원에서 X-Y'로서 언급되기도 함) 및 (2) Z 및 Y의 일부를 포함하는 분리 구획(Separatingt segment; SS, 본원에서 Y"-Z로 언급되기도 함). 분자 분열 및 이의 검출을 시작하는 처리과정은 효소 반응, 화학 반응, 변성 또는 기타 처리과정일 수 있다.
도 8에 나타낸 기질은 이의 설계된 분열 성분과 반응한다. 분열이 일어나면, Z 구획(분리 구획)은 처리 및 비처리 기질 사이를 분리한다. 그러므로 진행된 기질(검출가능한 성분 포함)의 TS만이 검출가능한 분자에 높은 친화력으로 결합한다. 그러므로 친화성 결합 과정은 분열된 기질만을 검출한다. 검출은 존재하는 기존 또는 신규 방법을 기초로 할 수 있다. 이러한 방식에서 처리된 기질만을 검출할 수 있다(도 8).
다른 실시형태에서 상기 기술된 방법을 사용하여 많은 기질의 분열을 동시에 검출하는 것 또한 가능하다. 이러한 가능성은 기질이 이의 분리 메카니즘(Z)와 유사하지만 이의 특이 분열 분자(Y)와는 상이한 경우에 발생한다. 이러한 경우에 각 기질은 이의 중심 분자(Y)에 결합 될 수 있는 독특하고 상이한 검출가능한 성분(X)을 갖는다. 처리된 기질 및 비처리 기질 사이에 분열 및 분리 후에, 상이한(및 처리된) 기질의 TS만이 친화성에 의해 결합 된다(상기 기재된 방법에 따라). Z를 포함하는 모든 분자(비처리 기질 또는 처리 기질의 SS)는 분자 메카니즘에 의해 유지된다. 다른 기질의 다른 TS로의 추가 분리는 막, 칩 등을 설계함에 의해 수득되며, 미리 결정된 각 위치는 막, 칩 등에서의 다른 각 TS에 친화성을 갖는 성분을 포함한다. 예를 들어 각 위치는 한 종류의 TS에만 결합할 수 있다. 그런 다음 분리된 용액을 이러한 칩 또는 막과 접촉시켜 친화성 결합이 발생할 수 있다. 미리 결정된 위치가 다른 TS들에 친화력에 의해 결합한다는 사실에 의해, 기질이 처리되었음을 확인할 수 있다. 각 기질이 기질 분열을 시작하는 효소에 특이적이므로 효소가 이의 상응하는 기질을 분열함을 확인하고 용액에 프로테아제가 용액 내에 존재함을 추론하며 순차적으로 상응 효소에 해당하는 병원체 또는 병원균을 추론하는 것이 가능하다(도 9).
반작용 PH 시스템(Reverse PH System; RPHS) - 이 실시형태에서 C 구획은 완충화 용액 내에서 모든 기질들에 공통인 특별 분자이다. 다양한 기질에 상응하는 A 구획은 다른 색이 다른 PH에 반응하는 염료 분자 구성요소이다. 분열 후에 완충화된 용액을 C 구획에 대한 친화성을 갖는 컬럼을 통해 여과하였다. C 구획(비처리 기질 또는 처리 기질의 구획 SS)을 포함하는 모든 분자는 컬럼에 남아있을 것이다(C 구획에 상응하는 친화성 성분에 의한 것임). 처리 기질(C구획을 포함하지 않음)의 TS 구획만이 각각 다른 pH에서, 많은 세포를 갖는 챔버로 따르는 것이 가능할 것이다. TS 구획(A 포함)이 세포(다른 pH)와 접촉하면 세포는 A 구획의 특성에 따라 색이 변한다. 이는 기질이 처리되었음을 나타낸다.
분리의 메카니즘
분리 메카니즘의 목적은 TS만이 검출가능한 성분에 상응하는 친화성을 갖는 성분에 결합할 수 있는 것과 같이 TS 및 SS 사이를 분리하는 것이다. 많은 기질의 동시 검출의 경우 분리 메카니즘은 분열이 이러한 기질에 대하여 시작되지 않는 경우에서 손상되지 않은 기질을 제거하기 위한 추가 역할을 갖는다.
상기 기술된 시스템에서 모든 분리 방법이 사용될 수 있다. 하기에 이러한 분리 방법의 자세한 설명을 제공하였다.
1. 고정화 분리 시스템(Immobilized Separation System; ISS) - 이 시스템에서 Z는 비드, 니트로셀룰로스, 바이오틴-아비딘 또는 기타 친화성 쌍을 통해 고정화 표면에 연결된 스페이서이다. 완충화 용액에서의 분열 후에 모든 비처리 기질 또는 처리 기질의 SS가 완충화 용액으로부터 고정화 표면을 분리(추출, 원심분리, 여과 등에 의해)함에 의해 저거하여 처리 기질의 TS만을 남겼다. 이 방식에서 각 기질의 동역학을 확인하는 것이 가능하다.
2. 역학적 분리 시스템(Dynamic Separation System; DSS) - 이 시스템에서 Z는 완충화 용액에서 모든 기질에 대해 일반적이거나 독특한 특별 분자이다. 분열이 일어난 후, 완충화 용액을 특별히 설계된 막 또는 칩과 접촉시켰다.막은 수직이며 바닥에서 Z에 상응하는 친화성을 갖는 성분을 갖는다. 막의 인접한 부분은 다른 기질의 X에 상응하는 다른 위치를 포함한다. 그런 다음 완충화 용액을 모세관 현상 또는 전기력에 의해 막 또는 칩의 길이를 따라 이동시켰다. Z(비처리 기질 또는 처리 기질의 SS)를 포함하는 모든 분자는 막의 바닥에 남아있을 것이다(Z에 상응하는 친화성 성분에 의함). 처리 기질의 TS(Z를 포함하지 않음)만이 막에서 상승하여 그들의 미리 결정된 위치에 친화력에 의해 결합할 것이다(도 10a 내지 도 10e).
3. 친화성 여과 시스템(Affinity Filtration System; AFS) - 이 시스템에서 완충화 용액을 Z에 친화성을 갖는 컬럼을 통해 여과하여 Z(비처리 기질 또는 처리 기질의 SS)를 포함하는 모든 분자가 컬럼에 남아있을 것이다. 처리된 기질의 TS만이 흐르는 용액에 포함될 것이다.
친화성 쌍( affinity fair )의 예
이 시스템에서의 친화성 쌍은 본 분야에 알려진 모든 친화성 쌍일 수 있다. 친화성 쌍의 예는 바이오틴-아비딘, 항체-기질; 수용체-기질; 핵산 혼성화에 기초한 센스-안티센스 DNA/RNA; pH 의존성 발색 분자; FRET 또는 기타 형광 검출 방법을 기초로 할 수 있는 형광-검출가능한 성분을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
검출 방법의 예
항체/수용체-기질 - 형광 또는 발색 중 어느 하나를 기초로 하는 모든 기존의 또는 신규의 면역화학 방법이 적합하다.
마커 - 검출가능한 성분(X)은 색, 형광, FRET 또는 기타 모든 측정가능한, 시각적인 또는 쉽게 검출가능한 분자를 생성하는 분자이거나 이 분자에 부착될 수 있다.
DNA 혼성화 - 형광 또는 발색 중 어느 하나를 기초로 하는 모든 기존의 또는 신규의 면역화학 방법이 적합하다.
효소 반응 - 검출가능한 성분(X)은 색깔 또는 형광 또는 기타 모든 측정가능한, 시각적인 또는 쉽게 검출가능한 분자를 생성하는 분자이거나 이 분자에 부착될 수 있다.
항체 친화성을 기초로 하는 프로테아제 검출
특이 프로테아제 활성을 기초로 하는 임상 시료에서의 많은 바이러스의 존재를 검출한다. 많은 바이러스과를 그들의 생명 주기의 중요한 일부로서 특이 프로테아제 활성을 사용한다. 예를 들어, 리노바이러스(3C 프로테아제), 엔테로바이러스(3C 프로테아제) 및 SARS(3CL 프로테아제) 모두 자신의 바이러스과에 대해 독특한 분열 서열을 갖는 프로테아제를 사용한다.
이 예에서 기질은 한쪽 말단에서 바이오틴으로 연결된 펩티드 분열 서열(Y에상응함)이다. 다른 쪽 말단은 특이 항체(X에상응함)에 친화성을 갖는 분자에 연결되었다. 이 기질의 분열은 SS 및 TS로의 분리를 야기한다(상기 기재된 바와 같음).
반응 혼합물은 상기 기재된 기질의 다른 유형을 포함한다. 모든 기질은 한쪽 말단에 바이오틴 성분을 포함한다. 펩티드는 특이 프로테아제에 상응하는 분열 서열 및 특이 분열 서열(예를 들어 A1, A2, A3...)과 결합 될 수 있는 독특한 항체 기질이 상이하다. 이 방식에서 각 기질은 다른 바이러스와 결합 될 수 있다.
반응 혼합물을 임상 시료와 접촉시켜 분열이 일어날 수 있다. 분열 후에, 반응 혼합물을 스트립(strip) 형태이고 이러한 목적을 위해 특이적으로 설계된 막 또는 칩 상에서 분석된다(도 10). 바닥에서 아비딘을 갖는 영역을 갖는다. 이 영역 위에서 다른 기질에 상응하는 항체[예를 들어 항 A1(항 X1에 상응함), 항 A2(항 X2에 상응함), 항 A3(항 X3에 상응함)...]를 갖는 다른 위치를 갖는다. 그런 다음 완충화 용액을 모세관 현상 또는 전기력에 의해 막 또는 칩의 길이를 따라 이동시켰다. 바이오틴(비처리 기질 또는 처리 기질의 SS)을 포함하는 모든 분자는 (아비딘에 대한 친화력에 의해) 막의 바닥에 남아있을 것이다. 처리 기질의 TS(바이오틴을 포함하지 않음)만이 막에서 상승하여 그들의 미리 결정된 위치에 친화력에 의해 결합할 것이다(예를 들어 A1-항 A1, A2-항 A2 등, 상기 기재한 명칭에 상응함).
각 위치가 다른 프로테아제를 나타내므로, 프로테아제가 임상 시료에 존재하는 처리 기질의 존재를 검출할 수 있다. 프로테아제의 존재는 상응하는 특이 바이러스의 존재를 확인한다.
핵산 혼성화에 기초한 프로테아제 검출
DNA 또는 RNA의 센스 및 안티센스 가닥은 서로를 향해 높은 친화성을 갖는다. 이 시스템은 상기 기재된 항체 실시예에 기재된 바와 같은 지침으로 설계되었다.
친화성 결합이 핵산 혼성화에 기초한다는 것이 다르다. 이 예에서 기질은 분리된 ssDNA 가닥(Z에 상응함)으로 한쪽 말단이 연결된 펩티드 분열 서열(Y에 상응함)이다. 다른쪽 말단은 독특한 ssDNA 가닥(X에 상응함)에 연결된다. 이 기질의 분열은 SS 및 TS로의 분리를 야기한다(상기 기재된 바와 같음).
반응 혼합물은 상기 기재된 기질의 다른 유형을 포함한다. 모든 기질은 동일한 분리된 ssDNA 가닥을 갖는다. 이들은 특이 분열 서열(예를 들어 A1ssDNA, A2ssDNA, A3ssDNA...)과 결합할 수 있는 독특한 ssDNA 및 특이 프로테아제에 상응하는 분열 서열에서 상이하다. 이 방식에서 각 기질은 다른 바이러스에 결합할 수 있다.
반응 혼합물을 임상 시료와 접촉시켜 분열이 일어날 수 있다. 분열 후에, 반응 혼합물을 스트립(strip) 형태이고 이러한 목적을 위해 특이적으로 설계된 막 또는 칩 상에서 분석된다(도 10). 바닥에서 안티센스 분리 DNA 가닥을 갖는 영역을 갖는다. 이 영역 위에서 다른 기질에 상응하는 독특한 ssDNA에 상응하는 안티센스 DNA 가닥(예를 들어 A1ssDNA, A2ssDNA, A3ssDNA...)을 갖는 다른 위치를 갖는다. 그런 다음 완충화 용액을 모세관 현상 또는 전기력에 의해 막 또는 칩의 길이를 따라 이동시켰다. ssDNA 가닥(비처리 기질 또는 처리 기질의 SS)을 포함하는 모든 분자는 (안티센스 분리 DNA 대한 친화력에 의해) 막의 바닥에 남아있을 것이다. 처리 기질의 TS(ssDNA를 포함하지 않음)만이 막에서 상승하여 그들의 미리 결정된 위치에 친화력에 의해 결합할 것이다(예를 들어 A1ssDNA-안티센스 A1ssDNA, A2ssDNA-안티센스 A2ssDNA 등).
각 위치가 다른 프로테아제를 나타내므로, 프로테아제가 임상 시료에 존재하는 처리된 기질의 존재를 측정할 수 있다. 프로테아제의 존재는 상응하는 특이 바이러스의 존재를 확인한다. 여러 바이러스를 고형상에서의 검정 산물의 추적할 수 있는 위치일 수 있는 단일 검출가능한 성분을 사용하여 검출할 수 있다.
각 실시형태에 명확하게 기재된 본 발명의 특정 특성들은 또한 단일 실시형태의 조합으로서 제공될 수 있음이 자명하다. 반대로 단일 실시형태의 형태로 간단히 기재된 본 발명의 다양한 특성 또한 분리하여 또는 적절한 아조합으로 제공될 수 있다.
본 발명이 이의 특이 실시형태에 관련하여 기재되었지만 많은 대안, 변이 및 변화가 본 분야의 숙련자들에게 자명함이 명백하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 정신 및 범주 내에 포함되는 이러한 모든 대안, 변이 및 변화를 포함하는 것을 의도한다. 본 발명의 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원의 명세서로 전체가 참고문헌으로서 인용되었으며 각 간행물 특허 또는 특허 출원이 참고문헌으로 본원에 인용됨을 상세하고 개별적으로 나타내는 것과 같다. 게다가 본 출원의 모든 참고문헌의 인용 및 확인은 본 발명 이전에 이러한 참고문헌이 이용될 수 있었음을 승인하는 것으로 해석되어서는 안된다.

Claims (70)

  1. 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47 중에서 선택한 아미노 서열을 포함하며, 상기 아미노산 서열은 14개 아미노산 길이보다 길지 않은 분리된 펩티드.
  2. 적어도 하나의 검출가능한 성분에 부착되는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며, 상기 기질은 제1항의 아미노산 서열을 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 적어도 하나의 검출가능한 성분은 전구-효소이며 상기 기질의 분열이 상기 전구-효소를 활성화하는 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 적어도 하나의 검출가능한 성분은 FRET 쌍이며 사이 기질의 분열이 상기 FRET 쌍으로부터 신호를 생성하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 조성물은 분리 성분을 추가로 포함하는 조성물.
  6. 다음의 일반식을 갖는 조성물:
    X-Y-Z
    위 식에서:
    Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며, 이 기질은 제1항의 아미노산 서열을 포함하고, 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며, 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
    X는 검출가능한 성분을 포함하며; 및
    Z는 2개 상 분리 시스템의 분리상에 결합이 가능한 분리 성분을 포함하며;
    여기에서, X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않는다.
  7. 제6항에 있어서, 검출가능한 성분 X는 효소, 형광단(fluorophore), 발색단(chromophore), 단백질, 선구효소(proenzyme), 화학발광(chemiluminescent) 기질 및 방사성동위원소(radioisotope) 중에서 선택한 표지제(labeling agent)를 포함하는 조성물.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 분리 성분 Z는 면역학적 결합제, 자기(magnetic) 결합 성분, 펩티드 결합 성분, 친화성 결합 성분 및 핵산 성분 중에서 선택한 조성물.
  9. 다음 식을 갖는 조성물:
    X-Y-Z
    위 식에서:
    Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며, 상기 기질은 제1항의 아미노산 서열을 포함하고, 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
    X 또는 Z는 적절한 방법으로 분열된 조성물 및 분열되지 않은 조성물 사이의 분리를 가능하게 하는 마커인, 검출가능한 성분 및/또는 분리 성분을 포함하며;
    여기에서 X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않는다.
  10. 제9항에 있어서, 마커인 성분 X 또는 Z는 효소, 형광단, 발색단, 단백질, 화학발광 기질, 소광제(quencher), FRET 쌍, 비드(bead), 펩티드, 전구효소(pre-enzyme) 및 방사성동위원소(radioisotope) 중에서 선택한 표지제, 면역학적 결합제, 자기 결합 성분, 펩티드 결합 성분, 친화성 결합 성분 및 핵산 성분을 포함하는 조성물.
  11. 다음의 단계를 포함하는, 시료에서 적어도 하나의 바이러스를 검출하는 방법:
    (a) 기질이 분열되는 조건 하에서 제2항, 제4항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8 항, 제9항 또는 제10항의 조성물 중 적어도 하나를 시료와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 기질의 분열을 확인하는 단계, 여기에서 기질의 분열은 시료에서 적어도 하나의 바이러스의 존재를 나타낸다.
  12. 제11항에 있어서, 단계 (a)는 다른 바이러스 프로테아제의 적어도 2개의 기질과 시료를 접촉함을 포함하며, 여기에서 적어도 두 개의 기질 중 어느 것도 분열되지 않는 것은 시료에 바이러스가 없음을 나타내는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 시료는 점액, 타액, 인후 세척액, 코 세척액, 척수액, 가래, 뇨, 정액, 땀, 대변, 혈장, 혈액, 기관지폐포액(broncheoalveolar fluid), 질액, 눈물 및 조직 생검 중에서 선택한 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 시료에서의 상기 분열 활성은 의학 증상의 진단인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 동질성 검정을 사용하여 확인하는 방법.
  16. 제11항에 있어서, 이질성 검정을 사용하여 확인하는 방법.
  17. 제2항, 제4항, 제5항, 제6항, 제7항, 제8항, 제9항 또는 제10항의 적어도 하 나의 조성물 및 기질의 분열을 검출하기 위한 시약을 포함하는, 시료에서 적어도 하나의 바이러스를 검출하기 위한 진단용 키트.
  18. 포장재(packaging material) 및 다수의 바이러스의 존재를 검출하기 위한 다수의 조성물을 포함하며 상기 각 조성물은 다음의 일반식을 갖는 진단용 키트:
    X-Y-Z
    위 식에서:
    Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며, 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하고, 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
    X 또는 Z는 적절한 방법으로 분열된 조성물 및 분열되지 않은 조성물 사이의 분리를 가능하게 하는 마커인 검출가능한 성분 및/또는 분리 성분을 포함하고;
    여기에서 X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않으며;
    여기에서, X 또는 Z 각각은 적어도 하나의 특징적인 검출가능한 성분을 갖고 이에 반하여 상기 포장재는 키트가 시료에서 다수의 바이러스를 검출하기 위한 것임을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
  19. 포장재(packaging material) 및 다수의 바이러스의 존재를 검출하기 위한 다수의 조성물을 포함하며 상기 각 조성물은 다음의 일반식을 갖는 진단용 키트:
    X-Y-Z
    위 식에서:
    Y는 바이러스 프로테아제의 기질을 포함하며, 바이러스 프로테아제에 의한 X-Y-Z의 분열은 분열 산물 X-Y' 및 Y"-Z를 형성하며, 여기에서 Y'은 Y의 첫 번째 분열 산물이고 Y"는 Y의 두 번째 분열 산물이며;
    X는 검출가능한 성분을 포함하며; 및
    Z는 2개 상 분리 시스템의 분리상에 결합이 가능한 분리 성분을 포함하며;
    여기에서, X-Y-Z는 천연 기질인 바이러스 프로테아제의 연속적인 일부를 형성하지 않고;
    여기에서, X 각각은 특징적으로 검출가능하며 이에 반하여 포장재는 키트가 시료에서 다수의 바이러스를 검출하기 위한 것임을 나타내는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 다수의 조성물이 단일 고형 지지물에 부착되는 진단용 키트.
  21. 제20항에 있어서, 특징적인 검출은 상기 단일 고형 지지물 상의 추적가능한 위치(addressable location)에 의해 이루어지는 진단용 키트.
  22. 제20항에 있어서, 특징적인 검출은 다른 검출가능한 성분에 의해 이루어지는 진단용 키트.
  23. 제18항, 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 다수의 조성물 각각은 고형 지지물에 부착되는 진단용 키트.
  24. 제23항에 있어서, 상기 고형 지지물은 비드로서 형성되는 진단용 키트.
  25. 제24항에 있어서, 상기 비드는 착색 비드, 자기 비드, 표지된(tagged) 비드 및 형광 비드 중에서 선택되는 진단용 키트.
  26. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 코로나 바이러스, SARS, HMPV(Human Meta pneumo virus; 인간 메타 폐 바이러스), 인플루엔자 A+B, 조류 독감, 아데노 바이러스, RSV(Respiratory Syncytial Virus; 호흡기세포융합 바이러스), 리노 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 호흡기 키트인 진단용 키트.
  27. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 한타 바이러스(Hanta virus) 및 라 크로세 뇌염(La Crosse Encephalitis)을 포함하는 호흡기 키트인 진단용 키트.
  28. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 로타 바이러스(Rota virus), 아데노 40/41, A형 간염, C형 간염, E형 간염, 칼리시바바이러스(calicivirus) 및 CMV(Cytomegalovirus; 사이토메갈로바이러스) 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이이러스를 포함하는 소화기 키트인 진단용 키트.
  29. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 진단 키트는 엔테로바이러스(Enterovirus)(1-80), 웨스트 나일 바이러스, 단순포진(Herpes Simplex) 1, 2 및 6 중에서 선택한 적어도 두 개의 바아러스를 포함하는 수막염(meningitis) 키트인 진단용 키트.
  30. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 토가 바이러스(Toga virus), 플라비 바이러스(Flavi virus) 및 광견병 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 수막염 키트인 진단용 키트.
  31. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, HIV 균주, 단순포진 1, 단순 포진 2, HSV-1, HSV-2, HPV(Human Papilloma Viruses; 인간 유두종 바이러스) 및 HTLV-1 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 성인성 질환(sexually transmitted diseases) 키트인 진단용 키트.
  32. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, A형 간염, B형 간염, C형 간염, HIV, 포진(Herpes) 바이러스 1 및 2 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 여행자용 키트인 진단용 키트.
  33. 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 광견병 및 디스템퍼(Distemper) 중에서 선택한 적어도 두 개의 바이러스를 포함하는 수의용(veterinarian) 키트인 진단용 키트.
  34. 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 시료는 다수의 시료를 포함하는 진단용 키트.
  35. 제17항에 있어서, 상기 적어도 하나의 바이러스는 다수의 바이러스를 포함하는 진단용 키트.
  36. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 1 또는 2를 포함하는 방법 및 키트.
  37. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 알파바이러스(alphavirus)이고 상기 기질은 서열 번호 3을 포함하는 방법 및 키트.
  38. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 루벨라(Rubella) 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 4를 포함하는 방법 및 키트.
  39. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 HIV이고 상기 기질은 서열 번호 5를 포함하는 방법 및 키트.
  40. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 HTLV이고 상기 기질은 서열 번호 6, 7 또는 8을 포함하는 방법 및 키트.
  41. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 아테리(Arteri) 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 9를 포함하는 방법 및 키트.
  42. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 코로나 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 10을 포함하는 방법 및 키트.
  43. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 SARS 코로나 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 11, 12, 148 또는 149를 포함하는 방법 및 키트.
  44. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 토로바이러스이고 상기 질은 서열 번호 13을 포함하는 방법 및 키트.
  45. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 CMV 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 14 또는 15를 포함하는 방법 및 키트.
  46. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 포진 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 16을 포함하는 방법 및 키트.
  47. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 플라바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 17을 포함하는 방법 및 키트.
  48. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 댕기바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 18, 19 또는 20을 포함하는 방법 및 키트.
  49. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 웨스트 나일 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 21, 22 또는 23을 포함하는 방법 및 키트.
  50. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 황열(Yellow fever) 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 24, 25 또는 26을 포함하는 방법 및 키트.
  51. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 일본 뇌 염(Japanese Encephalitis) 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 27, 28 또는 29를 포함하는 방법 및 키트.
  52. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 진드기 매개(Tick borne) 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 30, 31 또는 32를 포함하는 방법 및 키트.
  53. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 C형 간염 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 33, 34 또는 35를 포함하는 방법 및 키트.
  54. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 페스티바이러스(Pestivirus)이고 상기 기질은 서열 번호 36을 포함하는 방법 및 키트.
  55. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 A형 간염 바이러스이고 상기 기질은 서열 번호 37 또는 38을 포함하는 방법 및 키트.
  56. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 HRV이고 상기 기질은 서열 번호 39 또는 40을 포함하는 방법 및 키트.
  57. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 엔테로바이 러스이고 상기 기질은 서열 번호 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47을 포함하는 방법 및 키트.
  58. 제11항, 제17항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 바이러스는 HRV이고 상기 기질은 서열 번호 143-151, 150-151을 포함하는 방법 및 키트.
  59. 다음의 단계를 포함하는, 바이러스의 프로테아제에 대한 동역학적으로 최적인 기질을 설계하는 방법:
    (a) 적어도 하나의 바이러스 균주의 폴리프로테인의 다수의 분열 서열을 확인하는 단계, 여기에서 분열 서열은 프로테아제에 의한 가장 빠른 분열 동역학을 나타냄; 및
    (b) 가장 빠른 분열 동역학을 나타내는 과-광범위(family-wide) 공통 분열 서열을 확인하는 단계, 상기 과-광범위 공통 분열 서열은 바이러스의 프로테아제에 대한 동역학적으로 최적인 기질을 설계하는 데 유용하다.
  60. 제59항에 있어서, 바이러스의 상기 프로테아제는 바이러스성 코드 프로테아제(viral encoded protease)인 방법.
  61. 제59항에 있어서, 바이러스는 DNA 바이러스 및 RNA 바이러스 중에서 선택된 방법.
  62. 제61항에 있어서, 바이러스는 텍티바이리대(Tectiviridae), 파포바바이리대(Papovaviridae),시르코바이리대(Circoviridae)및
    헤파드나바이리대 (Hepadnaviridae),시스토바이리대(Cystoviridae),비르나바이리대(Birnaviridae),레오바이리대(Reoviridae),코로나바이리데(Coronaviridae),플라비바이리대(Flaviviridae),토가바이리대(Togaviridae),아테리바이러스,아스트로바이리대(Astroviridae),칼리시바이리대(Caliciviridae),피코르나바이리대(Picornaviridae),포티바이리대(Potyviridae),레트로바이리대(Retroviridae),오르토믹소바이리대(Orthomyxoviridae),필로바이리대(Filoviridae),파라믹소바이리대(Paramyxoviridae),라브도바이리대(Rhabdoviridae), 및 부니아바이리대(Bunyaviridae),아데노바이리대(Adenoviridae),헤르페스바이리대(Herpesviridae),피코르나바이리대(Picornaviridae) 중에서 선택한 방법.
  63. 제60항에 있어서, 바이러스 프로테아제는 세린 프로테아제, 메탈로프로타아제, 아스파르트 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 3C 프로테아제, PA 트랜스크립타제, 아데닌 프로테아제, 2A 프로테아제, 키모트립신(chimotrypsin) 또는 트립신 중에서 선택한 것으로, 예를 들어: NS3, NS2, NS-프로 시스테인 프로테아제, nsP2 시스테인 프로테아제, nsP23프로, C 단백질 프로테아제, SFV NS, HIV 아스파르트 프로테아제, nsp4 아테리바이러스 프로테아제, HCMV 프로테아제, NS2-3, NS3-4Ap 프로테아제, HTLV-1 PR인 방법.
  64. 제59항에 있어서, 다음의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    (c) 상기 과-광범위 공통 분열 서열을 갖는 다수의 분열 서열을 설계하는 단계; 및
    (d) 상기 다수의 분열 서열을 확인하는 단계, 분열 서열은 상기 프로테아제를 갖는 가장 빠른 분열 동역학을 갖는다.
  65. 제64항에 있어서, 설계는 최적 가용성, 온도 감수성 및/또는 pH 감수성을 갖는 상기 분열배열 설계를 포함하는 방법.
  66. 제59항에 있어서, 상기 단계 (a)의 확인은 경험적 실험을 포함하는 방법.
  67. 제59항에 있어서, 상기 단계 (a)의 확인은 데이타 마이닝(data mining)을 포함하는 방법.
  68. 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 및 47 중에서 선택한 아미노 서열을 포함하며, 아미노산 서열은 14개 아미노산 길이보다 길지 않고 각각의 바이러스 프로테아제의 저해 활성에 대한 유사물을 포함하는 분리된 펩티드.
  69. 바이러스 감염을 치료하기 위해 확인된 약제의 제조시 제68항의 펩티드의 용도.
  70. 유효 성분으로서 제68항의 분리된 펩티드를 포함하는 약학적 조성물.
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