JP5818059B2 - ウイルスの識別方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ウイルス由来のプロテアーゼに対する基質特異性に基づく、ウイルスの識別方法に関する。
ウイルス遺伝子にコードされているタンパク質は、大きな前駆体タンパク質として転写・翻訳され、ウイルス特有のプロテアーゼによって切断された後、ウイルスを構成する成熟タンパク質となる。このため、ウイルス由来のプロテアーゼはウイルスの成熟において重要な役割をしており、医薬品開発の標的分子となっている。例えば、エイズ（後天性免疫不全症候群）の原因であるヒト免疫不全ウイルス（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ；ＨＩＶ）の治療薬として、ＨＩＶプロテアーゼの阻害剤（例、インジナビル、サキナビル、リトナビルなど）が開発され、治療薬として使われている。また、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ；ＨＣＶ）のプロテアーゼを阻害する化合物を投与することで、血中のＨＣＶ量を減少できることも報告されている。この他にも、重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ；ＳＡＲＳ）の原因であるＳＡＲＳウイルスやコクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ノロウイルスなどのウイルスプロテアーゼを標的とした治療薬の開発が行われている。
ウイルス性疾患における最大の問題として、ウイルス遺伝子の変異による薬剤耐性ウイルスの出現がある。例えば、ＨＩＶは非常に変異しやすいウイルスであり、現在の長期薬剤投与によるエイズ治療においては、ＨＩＶプロテアーゼをコードする遺伝子上に変異がおこり、変異プロテアーゼと阻害剤の親和性が低下するため、薬剤耐性ウイルスへと変化する。したがって感染しているウイルスが薬剤耐性ウイルスであるか否かを検査することは、適切な治療計画や新薬の開発において極めて重要なことである。現在のところ、ウイルスの突然変異体の同定は遺伝子解析法に委ねられている。
遺伝子解析法は、変異体ウイルスの遺伝子をポリメラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）によって増幅して塩基配列を決定する。したがって変異体ウイルスの場合は未知の変異配列を解読できるプライマーＤＮＡをその都度開発する必要があり、その作製に相当時間を要するため迅速に検査結果を得がたい。さらに塩基配列に変異が認められても、プロテアーゼ阻害剤をもとに開発された抗ウイルス薬に対して耐性であるか否かを直接判定できない欠点がある。
また、ウイルスの多重感染（例えば、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の同時感染）では、多重感染に気づかなかった場合、他のウイルスによる感染を見逃す危険性がある。
また、ウイルスの多重感染（例えば、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の同時感染）では、多重感染に気づかなかった場合、他のウイルスによる感染を見逃す危険性がある。
一方で発明者らは、逆相液体クロマトグラフィーとペプチドＮ末端部位における蛍光体形成反応とを利用したペプチド定量方法を開発した（非特許文献１参照）。
Ｋａｂａｓｈｉｍａ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２９（２００８）ｐｐ．３５６−３６３
変異体ウイルスを迅速かつ容易な手段で検出可能な方法、また塩基配列の変異と抗ウイルス薬に対する耐性との関係を迅速かつ容易に判定可能な方法、およびウイルスを同時に識別できる方法が望まれている。
本発明者らは変異ウイルスの識別に際し、遺伝子変異を検出するのではなく、ウイルス中のウイルスプロテアーゼの基質特異性を調べることによってもウイルスが変異しているか否かを識別することができ、またこの方法では、たとえ複数のウイルスが存在しても、どのようなウイルスが存在し、さらに変異しているか否かを同時に識別できるという考えに至った。
そしてウイルス由来のプロテアーゼに対する基質の特異的な分解産物の生成率を判定するために、プロテアーゼの基質特異性判定において、ペプチドへの蛍光体形成反応と逆相液体クロマトグラフィーとを利用したペプチド定量方法を適用し、変異が疑われるウイルスと野生型ウイルスのプロテアーゼ活性を比較することで、当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別できることを初めて見出した。そして複数の基質ペプチドを組み合わせることで、複数のウイルスプロテアーゼを含む、試料中の複数のウイルスを同時に識別できることも初めて見出した。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
そしてウイルス由来のプロテアーゼに対する基質の特異的な分解産物の生成率を判定するために、プロテアーゼの基質特異性判定において、ペプチドへの蛍光体形成反応と逆相液体クロマトグラフィーとを利用したペプチド定量方法を適用し、変異が疑われるウイルスと野生型ウイルスのプロテアーゼ活性を比較することで、当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別できることを初めて見出した。そして複数の基質ペプチドを組み合わせることで、複数のウイルスプロテアーゼを含む、試料中の複数のウイルスを同時に識別できることも初めて見出した。
本発明者らはこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を行った結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
［１］ 以下の工程：
（１）ウイルス由来のプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程；
（２）ホウ酸溶液中、酸化剤存在下で、工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体とを反応させて、蛍光体を製造する工程；
（３）工程（２）で得られた蛍光体を検出する工程
を含む、ウイルスの識別方法。
［２］ カテコールまたはその誘導体が、式（Ｉ）
［１］ 以下の工程：
（１）ウイルス由来のプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程；
（２）ホウ酸溶液中、酸化剤存在下で、工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体とを反応させて、蛍光体を製造する工程；
（３）工程（２）で得られた蛍光体を検出する工程
を含む、ウイルスの識別方法。
［２］ カテコールまたはその誘導体が、式（Ｉ）
（式中、Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル−カルボキシル、カルボキシルを示す）で表される化合物である、［１］に記載の方法。
［３］ 基質ペプチドのＮ末端アミノ基が保護されている、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 基質ペプチドが２種以上の基質ペプチドである、［１］〜［３］のいずれか一に記載の方法。
［５］ 酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法。
［６］ 工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体との反応が、９０℃〜１１０℃で行われる、［１］〜［５］のいずれか一に記載の方法。
［７］ 変異ウイルスの識別方法である、［１］〜［６］のいずれか一に記載の方法。
［８］ 以下の工程：
（１）変異が疑われるプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程；
（２）ホウ酸溶液中、工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールとを反応させて、蛍光体を製造する工程；
（３）工程（２）で得られた蛍光体の蛍光強度を測定する工程
を含む、変異プロテアーゼの検出方法。
［９］ カテコールまたはその誘導体が、式（Ｉ）
［３］ 基質ペプチドのＮ末端アミノ基が保護されている、［１］または［２］に記載の方法。
［４］ 基質ペプチドが２種以上の基質ペプチドである、［１］〜［３］のいずれか一に記載の方法。
［５］ 酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、［１］〜［４］のいずれか一に記載の方法。
［６］ 工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体との反応が、９０℃〜１１０℃で行われる、［１］〜［５］のいずれか一に記載の方法。
［７］ 変異ウイルスの識別方法である、［１］〜［６］のいずれか一に記載の方法。
［８］ 以下の工程：
（１）変異が疑われるプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程；
（２）ホウ酸溶液中、工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールとを反応させて、蛍光体を製造する工程；
（３）工程（２）で得られた蛍光体の蛍光強度を測定する工程
を含む、変異プロテアーゼの検出方法。
［９］ カテコールまたはその誘導体が、式（Ｉ）
（式中、Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルキル−カルボキシル、カルボキシル）で表される化合物である、［８］に記載の方法。
［１０］ 基質ペプチドのＮ末端アミノ基が保護されている、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］ 基質ペプチドが２種以上の基質ペプチドである、［８］〜［１０］のいずれか一に記載の方法。
［１２］ 酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、［８］〜［１１］のいずれか一に記載の方法。
［１３］ 工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールとの反応が、９０℃〜１１０℃で行われる、［８］〜［１２］のいずれか一に記載の方法。
に関する。
［１０］ 基質ペプチドのＮ末端アミノ基が保護されている、［８］または［９］に記載の方法。
［１１］ 基質ペプチドが２種以上の基質ペプチドである、［８］〜［１０］のいずれか一に記載の方法。
［１２］ 酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、［８］〜［１１］のいずれか一に記載の方法。
［１３］ 工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールとの反応が、９０℃〜１１０℃で行われる、［８］〜［１２］のいずれか一に記載の方法。
に関する。
本発明の識別方法は、遺伝子変異を直接検出する従来型の変異ウイルスの検出・識別方法とは異なり、特定の基質ペプチドに対するプロテアーゼ活性の変化を指標にウイルス変異および他のウイルスを識別することを特徴とする。したがって、従来型の方法では未知の遺伝子変異を検出するためのプライマーをその都度試行錯誤して調製する必要があったが、本発明の方法によればその必要がない。従って従来型の変異ウイルスの検出・識別方法よりも、迅速かつ簡便にウイルスが変異しているか否かを識別することができる。
また、基質ペプチドの種類を２種以上に増やすことで、複数のウイルス変異を一回の測定で高い識別能をもって判定できる。
基質ペプチドの種類を２種以上に増やすことによっては、さらに複数のウイルスについて同時にウイルス変異を識別することができるようになる点で有用である。すなわち、本発明の識別方法はウイルス変異を基質ペプチドに対するプロテアーゼ活性の変化を指標に識別するため、プロテアーゼ反応により得られたペプチド断片が分離可能である限り、理論上、反応系内にウイルス（プロテアーゼ）が複数種存在しても同時にそれぞれのウイルス変異を識別することができるのである。
また、基質ペプチドの種類を２種以上に増やすことで、複数のウイルス変異を一回の測定で高い識別能をもって判定できる。
基質ペプチドの種類を２種以上に増やすことによっては、さらに複数のウイルスについて同時にウイルス変異を識別することができるようになる点で有用である。すなわち、本発明の識別方法はウイルス変異を基質ペプチドに対するプロテアーゼ活性の変化を指標に識別するため、プロテアーゼ反応により得られたペプチド断片が分離可能である限り、理論上、反応系内にウイルス（プロテアーゼ）が複数種存在しても同時にそれぞれのウイルス変異を識別することができるのである。
またプロテアーゼ活性の変化というウイルスの機能に関わる部分をウイルス変異の判断材料としていることから、本発明の識別方法は抗ウイルス薬の効果を判別する方法としても適用可能である。
さらに、本発明の識別方法で得られたペプチド断片のパターンと、変異ウイルスの表現型をデータベース化することによって、変異が疑われるウイルスがどのような表現型を示すかを予測することも可能となる。
図１に本発明の識別方法の概略図を示す。Ｎ末端アミノ基が保護されたペプチドを基質として、ウイルス酵素と反応させ、生成したペプチド断片の蛍光誘導体化を行う。その後、ペプチドの蛍光誘導体を分離するが、変異型ウイルスのプロテアーゼでは、変異によって基質特異性が変化しているため、野生型（ａ）と比較して、ピークの消失（ｂ）や減少（ｃ）が観察される。このように分離パターンを比較することで、ウイルスが変異しているか否かを識別することができる。
本発明は、以下の工程：
（１）変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程；
（２）ホウ酸溶液中、酸化剤存在下で工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体とを反応させて、蛍光体を製造する工程；
（３）工程（２）で得られた蛍光体を検出する工程
を含む、ウイルスの検出方法を提供する。以下、各工程に分けて説明する。
（１）変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程；
（２）ホウ酸溶液中、酸化剤存在下で工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体とを反応させて、蛍光体を製造する工程；
（３）工程（２）で得られた蛍光体を検出する工程
を含む、ウイルスの検出方法を提供する。以下、各工程に分けて説明する。
工程（１）：基質ペプチドを分解させる工程
本工程は、変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程である。
本工程は、変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼとその基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程である。
本明細書中「変異が疑われるウイルス」とは、ウイルスの遺伝子が突然変異することによって、これまで効果のあったウイルス治療薬が効かなくなったことが疑われたウイルス、その活性や増殖が強められたウイルス、あるいは他のウイルス活性をも持つようになったウイルスなど、ウイルス遺伝子の突然変異によって技術常識から予想し得ない機能を有することになったウイルスのことをいう。変異の種類としては特に限定されず、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異などの遺伝子変異が挙げられる。またウイルスの遺伝子変異の箇所は特に限定されず、ウイルスを構成する蛋白質のいずれをコードする遺伝子であってもよいが、本発明がプロテアーゼ活性を指標に遺伝子変異を判別するものである関係上、ウイルスプロテアーゼをコードする遺伝子上の箇所（例、ＨＩＶの場合はｇａｇ領域下流のｐｏｌ領域）、あるいはウイルスプロテアーゼに関連する蛋白質をコードする遺伝子上の箇所であることが好ましい。
当該ウイルスの種類としては特に限定されず、プロテアーゼを有するウイルス全般が挙げられ、例えばＨＩＶ、ラッサウイルス、インフルエンザウイルス、ノロウイルス、サポウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ポリオウイルス、エボラウイルス、肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ヒトＴリンパ球ウイルスなどである。本発明の方法において後述の基質ペプチドとして各ウイルスに好適な基質ペプチドを適用すれば、上記したどのようなウイルスに対してもその変異の有無を判別することが可能である。
本工程で用いられる「変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼ」は、変異が疑われるウイルスから自体公知の方法で抽出してもよいし、ウイルスに感染している対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）の体液（例、血液、リンパ液、唾液など）から採取してもよい。また変異ウイルスの変異プロテアーゼ遺伝子が判明していれば自体公知の蛋白質発現系を利用して、変異プロテアーゼを調製してもよい。
自体公知の蛋白質発現系を利用した変異プロテアーゼの調製方法としては、例えば、次のような方法が挙げられる。
まずプロテアーゼ遺伝子に自体公知の方法で変異を導入し、この変異遺伝子を適切なベクターに導入して、大腸菌やファージ内で遺伝子を増幅する。次いで増幅した遺伝子を精製し、別の蛋白質発現ベクターに導入し、大腸菌や動物細胞内でプロテアーゼを発現させる。最後に発現したプロテアーゼを自体公知の方法で精製することで、変異プロテアーゼを得ることができる。
まずプロテアーゼ遺伝子に自体公知の方法で変異を導入し、この変異遺伝子を適切なベクターに導入して、大腸菌やファージ内で遺伝子を増幅する。次いで増幅した遺伝子を精製し、別の蛋白質発現ベクターに導入し、大腸菌や動物細胞内でプロテアーゼを発現させる。最後に発現したプロテアーゼを自体公知の方法で精製することで、変異プロテアーゼを得ることができる。
本明細書中「基質ペプチド」とは、ウイルスのプロテアーゼの基質となり得るペプチドのことをいう。基質ペプチドは対象とするウイルスによって異なり、ウイルスのプロテアーゼの基質となり得る限りその配列は特に限定されず、自体公知の基質ペプチドが用いられるが、ウイルスがＨＩＶ−１の場合には、例えば
Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号１）、
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ（配列番号２）、
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３）、
Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（配列番号４）
などのペプチドが挙げられる。またウイルスがＨＣＶの場合には、例えば
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ-Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号５）
などのペプチドが挙げられる。
Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号１）、
Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ（配列番号２）、
Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３）、
Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（配列番号４）
などのペプチドが挙げられる。またウイルスがＨＣＶの場合には、例えば
Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ-Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号５）
などのペプチドが挙げられる。
これらの基質ペプチドは、その対応するウイルスプロテアーゼによって分解され、断片化する。各ウイルスに対する特異的な基質ペプチドは、当業者であれば適宜選択することが可能である。これらの基質ペプチドが断片化するパターンは、対応するウイルスプロテアーゼによって通常一定であるが、対応するウイルスの遺伝子が突然変異することに起因してその断片化するパターンが変化する。このように、ペプチド断片の生成率に基づくウイルスプロテアーゼ分解パターンの変化を検出することによって、当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別することができる。
本発明において、基質ペプチドはそのＮ末端のアミノ基が保護されていることが望ましい。Ｎ末端のアミノ基が保護されていることによって、プロテアーゼ分解した基質ペプチドとプロテアーゼ分解されない基質ペプチドを区別することができる。
基質ペプチドのＮ末端アミノ基の保護に用いられる、「アミノ基の保護基」としては、ペプチドのＮ末端アミノ基の保護基として通常用いられるものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜選択することが可能である。当該アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、スクシニル基などが挙げられる。
基質ペプチドのＮ末端アミノ基の保護に用いられる、「アミノ基の保護基」としては、ペプチドのＮ末端アミノ基の保護基として通常用いられるものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜選択することが可能である。当該アミノ基の保護基としては、ベンジルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基、ベンゾイル基、スクシニル基などが挙げられる。
基質ペプチドとしては、単一の基質ペプチドを用いてもよいが、２種以上の複数の基質ペプチドを用いて同時にプロテアーゼとの反応に付すことが望ましい。
複数の基質ペプチドを用いることによって、得られるペプチドの分解パターンの情報が増えるので、複雑な遺伝子変異の表現型を詳細に分析することが可能になる。例えば変異ＨＩＶ−１プロテアーゼの検出をする場合、上記した４種類のペプチドを全て変異が疑われるＨＩＶ−１プロテアーゼまたは野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼとの反応に付し、後述する解析方法によって、ペプチド断片の生成率に基づくウイルスプロテアーゼ分解パターンを比較することで、当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別することができる。
また２種以上の基質ペプチドを用いることによって、異なる種類のウイルスの変異についても一回の測定で同時に検証することが可能となる。つまり異なる種類のウイルスプロテアーゼに対応するそれぞれの基質ペプチドは断片化パターンが異なるので、それぞれのペプチド断片の生成率を分析することによってどのようなウイルスが存在するか、また当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別することも可能である。
複数の基質ペプチドを用いることによって、得られるペプチドの分解パターンの情報が増えるので、複雑な遺伝子変異の表現型を詳細に分析することが可能になる。例えば変異ＨＩＶ−１プロテアーゼの検出をする場合、上記した４種類のペプチドを全て変異が疑われるＨＩＶ−１プロテアーゼまたは野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼとの反応に付し、後述する解析方法によって、ペプチド断片の生成率に基づくウイルスプロテアーゼ分解パターンを比較することで、当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別することができる。
また２種以上の基質ペプチドを用いることによって、異なる種類のウイルスの変異についても一回の測定で同時に検証することが可能となる。つまり異なる種類のウイルスプロテアーゼに対応するそれぞれの基質ペプチドは断片化パターンが異なるので、それぞれのペプチド断片の生成率を分析することによってどのようなウイルスが存在するか、また当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別することも可能である。
さらに変異ウイルスの表現型とプロテアーゼ分解パターンとの相互関係をデータ化することによって、変異が疑われるウイルスのプロテアーゼ分解パターンを解読すれば、そのウイルスがどのような表現型を表すかについて予測することも可能となる。
これらの基質ペプチドの製造方法は特に限定されず、当業者であれば適切な製造方法を適用することが可能である。例えば、当業者であれば自体公知のペプチド合成法を用いて製造することができるし、また市販品があればそれを購入して用いてもよい。
プロテアーゼとその基質ペプチドとの接触は、プロテアーゼが機能して基質ペプチドが分解し得る条件であればいかなる条件で行ってもよく、通常のプロテアーゼアッセイのプロトコルに沿って決定することが可能であるが、このような条件としては、例えば２５℃〜４０℃、好ましくは体温付近（３５℃〜３７℃）で１分〜２４時間、好ましくは５分〜４時間の条件が挙げられる。
プロテアーゼの量、基質ペプチドの量、反応液の組成などは、通常のプロテアーゼアッセイのプロトコルに沿って決定することが可能である。
プロテアーゼの量、基質ペプチドの量、反応液の組成などは、通常のプロテアーゼアッセイのプロトコルに沿って決定することが可能である。
本工程により、ウイルス（プロテアーゼ）変異に対応した基質ペプチドのペプチド断片が調製される（本明細書中、当該ペプチド断片のことを「分解ペプチド」と記載する）。この分解ペプチドを次の工程（２）に付す。
工程（２）：蛍光体を製造する工程
本工程は、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下で工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体とを反応させて、蛍光体を製造する工程である。
本工程は、ホウ酸溶液中、酸化剤存在下で工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体とを反応させて、蛍光体を製造する工程である。
本工程における「酸化剤」としては特に限定されるものではなく、例えば過酸化水素、過ヨウ素酸ナトリウム、過ホウ素酸ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、ｍ−クロロ過安息香酸などの酸化剤が挙げられる。なかでも過ホウ素酸ナトリウムまたは過酸化水素が好ましく、望ましい蛍光体形成との関係上、過ヨウ素酸ナトリウムであることがより好ましい。
酸化剤の添加量は、後述する蛍光体形成反応を進行させ、特定の波長で発光する蛍光体が形成される限り特に限定されるものではない。しかしながら、反応系中に酸化剤と反応するような物質が存在する場合や、後述する蛍光体形成を妨げるような物質が存在する場合は、酸化剤が消費されて実質的に工程（２）で用いられる酸化剤の量が減少するので、酸化剤の量を増やす必要がある。例えば工程（１）で用いられた、変異が疑われるウイルス（プロテアーゼ）のサンプルが血液や血清であった場合、本工程において血液や血清中のプロテアーゼ以外の物質によって酸化剤が消費される場合がある。このような場合は、通常よりも酸化剤の量を増やすことで本工程を進行させることができる。
このような酸化剤の量は、当業者であれば適宜決定することが可能である。
酸化剤の添加量は、後述する蛍光体形成反応を進行させ、特定の波長で発光する蛍光体が形成される限り特に限定されるものではない。しかしながら、反応系中に酸化剤と反応するような物質が存在する場合や、後述する蛍光体形成を妨げるような物質が存在する場合は、酸化剤が消費されて実質的に工程（２）で用いられる酸化剤の量が減少するので、酸化剤の量を増やす必要がある。例えば工程（１）で用いられた、変異が疑われるウイルス（プロテアーゼ）のサンプルが血液や血清であった場合、本工程において血液や血清中のプロテアーゼ以外の物質によって酸化剤が消費される場合がある。このような場合は、通常よりも酸化剤の量を増やすことで本工程を進行させることができる。
このような酸化剤の量は、当業者であれば適宜決定することが可能である。
本工程における「カテコールの誘導体」とは、下記式
で表されるカテコールの芳香環上の水素原子を適当な置換基で置換してなる化合物、すなわち式（Ｉ）
で表される化合物のことをいう。当該置換基Ｒとしては、後述する蛍光体形成反応の進行を妨げず、かつ特定の波長で発光する蛍光体が形成される限り特に限定されるものではない。このような置換基としては、例えば水素原子、Ｃ１−６アルキル基（例、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基など）、アルコキシ基、ヒドロキシ基、ハロゲン基、カルボキシル基、Ｃ１−６アルキル−カルボキシル基などが挙げられる。好ましくは、Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボキシル基、カルボキシル基である。ベンゼン環上におけるＲの置換位置も特に限定されないが、好ましくは３位または４位である。
また「カテコールの誘導体」としては、カテコールのベンゼン環のかわりにナフタレン環、ピリジン環などを配してもよい。
また「カテコールの誘導体」としては、カテコールのベンゼン環のかわりにナフタレン環、ピリジン環などを配してもよい。
本発明のカテコール誘導体として好ましくは、カテコール分子におけるベンゼン環の３位または４位に、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキル−カルボキシル基またはカルボキシル基を有する化合物であり、より好ましくは、３−メチルカテコール、４−メチルカテコール、３−フルオロカテコール、４−フルオロカテコール、３−クロロカテコール、４−クロロカテコール、３−ブロモカテコール、４−ブロモカテコール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸であり、更に好ましくは、３−メチルカテコール、４−メチルカテコール、３−フルオロカテコール、４−フルオロカテコール、４−クロロカテコール、４−ブロモカテコール、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸である。
本工程（２）においては、上記した酸化剤の存在下において、分解ペプチドのＮ末端のアミノ基がカテコールまたはその誘導体と共にイミン体を形成し、これがホウ酸溶液中のホウ酸と反応して蛍光体を形成する。
本工程（２）における分解ペプチドとは、基質ペプチドがプロテアーゼ等により分解されて形成される断片化されたペプチドのことをいう。断片化されたペプチドとしては特に限定されず、本発明のカテコールまたはその誘導体が、本工程（２）の反応によって蛍光体を形成する限りどのような配列のものであってもよい。
例えば本工程（２）の反応において、Ｎ末端にプロリンやグリシンを持つペプチドはカテコールとは反応しにくく、ほとんど蛍光体を形成できないが、カテコールの誘導体は、以下の実施例で示されるように、Ｎ末端にプロリンやグリシンを持つペプチドであっても、蛍光体を形成することができる。一方で、Ｎ末端にアデニンを持つペプチドはカテコールまたはその誘導体と反応して蛍光体を形成できる。このようにして、本発明のカテコールまたはその誘導体を組み合わせることで、様々な種類の分解ペプチドを蛍光体化することが可能であり、結果として、様々なウイルスについて検出することが可能となる。
例えば本工程（２）の反応において、Ｎ末端にプロリンやグリシンを持つペプチドはカテコールとは反応しにくく、ほとんど蛍光体を形成できないが、カテコールの誘導体は、以下の実施例で示されるように、Ｎ末端にプロリンやグリシンを持つペプチドであっても、蛍光体を形成することができる。一方で、Ｎ末端にアデニンを持つペプチドはカテコールまたはその誘導体と反応して蛍光体を形成できる。このようにして、本発明のカテコールまたはその誘導体を組み合わせることで、様々な種類の分解ペプチドを蛍光体化することが可能であり、結果として、様々なウイルスについて検出することが可能となる。
分解ペプチドと反応するカテコールまたはその誘導体の量としては、分解ペプチドの量がウイルスの数、基質ペプチドの量、ウイルス変異の数や部位などによって毎回異なり、定まらないため特に限定されるものではないが、基質ペプチド１モルあたり、通常８．３〜６６．７モルであり、好ましくは１６．７〜３３．３モルである。また酸化剤の量についても特に限定されるものではないが、基質ペプチド１モルあたり、通常３．３〜３３．３モルであり、好ましくは３．３〜１６．７モルである。血清を含む試料の場合には、基質ペプチド１モルあたり、８．３〜１６．７モルである。
工程（２）における一回の反応で用いられるカテコールまたはその誘導体の種類としては、特に限定されず、１種類であってもよいし、２種類以上のカテコールまたはその誘導体を同時に用いてもよい。特に、複数のカテコールまたはその誘導体を用いることによって、得られるペプチドの蛍光修飾パターンの情報が増えるので、複雑な遺伝子変異の表現型を詳細に分析することが可能になる。例えば変異ＨＩＶ−１プロテアーゼの検出をする場合、上記したペプチドに対し、種々のカテコールまたはその誘導体を全て変異が疑われるＨＩＶ−１プロテアーゼまたは野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼとの反応に付し、後述する解析方法によって、蛍光修飾の質的、量的パターンに基づくウイルスプロテアーゼ分解パターンを比較することで、当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別することができる。
工程（２）における一回の反応で用いられるカテコールまたはその誘導体の種類としては、特に限定されず、１種類であってもよいし、２種類以上のカテコールまたはその誘導体を同時に用いてもよい。特に、複数のカテコールまたはその誘導体を用いることによって、得られるペプチドの蛍光修飾パターンの情報が増えるので、複雑な遺伝子変異の表現型を詳細に分析することが可能になる。例えば変異ＨＩＶ−１プロテアーゼの検出をする場合、上記したペプチドに対し、種々のカテコールまたはその誘導体を全て変異が疑われるＨＩＶ−１プロテアーゼまたは野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼとの反応に付し、後述する解析方法によって、蛍光修飾の質的、量的パターンに基づくウイルスプロテアーゼ分解パターンを比較することで、当該ウイルスが変異ウイルスであるか否かを識別することができる。
またホウ酸溶液中のホウ酸量も、分解ペプチドの量がウイルスの数、基質ペプチドの量、ウイルス変異の数や部位などによって毎回異なり、定まらないため特に限定されるものではないが、基質ペプチド１モルあたり、通常６６０〜１６６０モルであり、好ましくは１０００〜１６６０モルである。
ホウ酸溶液の組成としては特に限定されず、本工程における反応を阻害しないのであればどのような溶媒であってもよいし、どのような化合物が含まれていても構わない。本工程におけるホウ酸溶液として好ましくは、ホウ酸水溶液である。ホウ酸溶液がホウ酸水溶液である場合のｐＨは特に限定されないが、中性（ｐＨ６．５〜７．５）付近が好ましく、ｐＨ７がより好ましい。
本工程における反応温度は、通常８０℃〜１２０℃であり、好ましくは９０℃〜１１０℃である。反応時間は、通常３〜１５分間であり、好ましくは５〜１３分間である。
本工程により、例えばペプチドとの反応にカテコールを用いた場合は、励起波長約４００ｎｍ、蛍光波長約５００ｎｍの蛍光体が製造される。この蛍光体を次の工程（３）に付す。
工程（３）：蛍光体を検出する工程
本工程は、工程（２）で得られた蛍光体を検出することで、ウイルスやそのプロテアーゼが変異しているか否かを分析する工程である。
本工程は、工程（２）で得られた蛍光体を検出することで、ウイルスやそのプロテアーゼが変異しているか否かを分析する工程である。
蛍光体の検出方法は特に限定されるものではないが、多数の分解ペプチドが生じる点や、多様な基質ペプチドの切断パターンを分析する必要性を鑑み、ＨＰＬＣにより検出することが望ましい。また、マイクロチップ電気泳動による分離も可能である。ＨＰＬＣやマイクロチップ電気泳動を利用することで、多様な分解ペプチドを分離分析することが可能である。
ＨＰＬＣ条件としては、例えばカテコールを用いた場合は、励起波長を４００ｎｍ近傍に、蛍光波長を５００ｎｍ近傍にそれぞれ設定する。カテコール誘導体を用いる場合は、その都度適宜最適な条件を設定することが可能である。これ以外のＨＰＬＣ条件は特に限定されず、当業者であれば適宜条件を設定することが可能である。
ＨＰＬＣ条件としては、例えばカテコールを用いた場合は、励起波長を４００ｎｍ近傍に、蛍光波長を５００ｎｍ近傍にそれぞれ設定する。カテコール誘導体を用いる場合は、その都度適宜最適な条件を設定することが可能である。これ以外のＨＰＬＣ条件は特に限定されず、当業者であれば適宜条件を設定することが可能である。
以上の工程を経て、変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼを用いた場合に得られる蛍光体と、野生型ウイルス由来のプロテアーゼを用いた場合に得られる蛍光体とを比較して、問題とするウイルスが変異しているか否かを識別する。
例えば、蛍光体の検出をＨＰＬＣで行う場合は、変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼを用いた場合のＨＰＬＣピークと、野生型プロテアーゼを用いた場合のＨＰＬＣピークのパターンを比較して、問題とするウイルスが変異しているか否かを識別する。より具体的には図１のように、変異ウイルスのプロテアーゼでは、変異によって基質特異性が変化しているため、野生型（ａ）と比較して、ピークの消失（ｂ）や減少（ｃ）が観察される。このように分離パターンを比較することで、ウイルスが変異しているか否かを識別することができる。
また、ＨＰＬＣのように得られる蛍光体の検出を同時に行えるのであれば、基質ペプチドの種類を増やすことで、たとえ試料中に複数のウイルスが含まれる場合であっても、一回の測定で識別することが可能となる。
例えば、蛍光体の検出をＨＰＬＣで行う場合は、変異が疑われるウイルス由来のプロテアーゼを用いた場合のＨＰＬＣピークと、野生型プロテアーゼを用いた場合のＨＰＬＣピークのパターンを比較して、問題とするウイルスが変異しているか否かを識別する。より具体的には図１のように、変異ウイルスのプロテアーゼでは、変異によって基質特異性が変化しているため、野生型（ａ）と比較して、ピークの消失（ｂ）や減少（ｃ）が観察される。このように分離パターンを比較することで、ウイルスが変異しているか否かを識別することができる。
また、ＨＰＬＣのように得られる蛍光体の検出を同時に行えるのであれば、基質ペプチドの種類を増やすことで、たとえ試料中に複数のウイルスが含まれる場合であっても、一回の測定で識別することが可能となる。
本発明の識別方法を、どのようなウイルスに感染しているかの診断に適用する場合は、例えば次のようにすればよい。
ウイルスに羅患していることが疑われる対象（例、ヒトなどの哺乳動物）の血液や唾液などを採取し、これをウイルスプロテアーゼのサンプルとしてそのまま、または精製して、工程（１）に付す。次いで得られた分解ペプチドを工程（２）に付し、最後に工程（３）で蛍光体を検出する。そして事前に得ておいた特定のウイルスプロテアーゼの基質ペプチドの分解パターンと比較することで、羅患したウイルスがどのようなウイルスであるかを診断することが可能である。
ウイルスに羅患していることが疑われる対象（例、ヒトなどの哺乳動物）の血液や唾液などを採取し、これをウイルスプロテアーゼのサンプルとしてそのまま、または精製して、工程（１）に付す。次いで得られた分解ペプチドを工程（２）に付し、最後に工程（３）で蛍光体を検出する。そして事前に得ておいた特定のウイルスプロテアーゼの基質ペプチドの分解パターンと比較することで、羅患したウイルスがどのようなウイルスであるかを診断することが可能である。
以下に実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。なお以下の実施例は本願発明の一例を挙げるに過ぎず、本発明をこの範囲に限定するものではない。
実施例１：変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子の作製
ｐＭａｌｃ２ｘベクターに配列番号６で示される野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドを鋳型に、ＰＣＲを用いたランダムミューテーションを行った。
ｐＭａｌｃ２ｘベクターに配列番号６で示される野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドを鋳型に、ＰＣＲを用いたランダムミューテーションを行った。
ＰＣＲで使用したプライマー：
Ｆｗｄプライマー：５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号７）
Ｒｅｖプライマー：５’−ＡＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号８）
Ｆｗｄプライマー：５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＣＴＣＡＧＡＴＣＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号７）
Ｒｅｖプライマー：５’−ＡＧＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号８）
ＰＣＲ反応液１００μＬ（５００ｎｇ鋳型プラスミド、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ，１μＭプライマー、１×Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ，２．５ｕｎｉｔ Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を調製し、９４℃，３０ｓｅｃ；４５℃，３０ｓｅｃ；７２℃，１ｍｉｎ（３０サイクル）の条件でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物（約０．３ｋｂ）は１．５％アガロースゲル電気泳動で分離後、ＱＩＡＥＸ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてゲルから抽出した。ＰＣＲ産物とｐＭａｌｃ２ｘベクターをそれぞれ、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩおよびＢａｍ ＨＩで消化後、ライゲーションを行い、大腸菌ＤＨ５αへ形質転換した。ＬＡ寒天培地（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地）上に生育したコロニーを、３ｍＬのＬＡ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。一晩培養した培養液から、プラスミドをＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて調製した。塩基配列は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。その結果、以下で示される４種の変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子を得た。
変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子１；配列番号９（Ｌｅｕ５→Ｐｒｏ，Ｇｌｙ５７→Ａｒｇ）、
変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子２；配列番号１０（Ｌｅｕ５→Ｐｒｏ，Ｇｌｙ５７→Ａｒｇ，Ａｓｎ８３→Ｔｙｒ）、
変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子３；配列番号１１（Ｌｅｕ５→Ｐｒｏ，Ｇｌｙ５７→Ａｒｇ，Ａｓｐ６０→Ｇｌｕ）、
変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子４；配列番号１２（Ｌｅｕ５→Ｐｒｏ，Ｇｌｙ５７→Ａｒｇ，Ｇｌｙ６８→Ａｒｇ）。
変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子２；配列番号１０（Ｌｅｕ５→Ｐｒｏ，Ｇｌｙ５７→Ａｒｇ，Ａｓｎ８３→Ｔｙｒ）、
変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子３；配列番号１１（Ｌｅｕ５→Ｐｒｏ，Ｇｌｙ５７→Ａｒｇ，Ａｓｐ６０→Ｇｌｕ）、
変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子４；配列番号１２（Ｌｅｕ５→Ｐｒｏ，Ｇｌｙ５７→Ａｒｇ，Ｇｌｙ６８→Ａｒｇ）。
実施例２：変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼの調製
実施例１で得られた変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子をもつ大腸菌を、２ｍＬのＬＡ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。一晩培養した培養液１ｍＬを１００ｍＬのＬＡ液体培地に植菌し、３７℃で３時間継代培養した。終濃度１ｍＭになるようにｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを加え、さらに３７℃で３時間培養した。４０００×ｇで２０分間遠心分離することで集菌し、菌体を１×ＰＢＳ １０ｍＬで洗浄した。菌体は、５ｍＬのａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．５），１．０Ｍ ＮａＣｌ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ，２．５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁後、Ｍｏｄｅｌ ３００ Ｖ／Ｔ（ＢｉｏＬｏｇｉｃｓ）を用いて超音波破砕（ｐｏｗｅｒ ４０％，ｐｕｌｓｅｒ ５０％，１５分間）を行った。次いで、１３，５００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼの各サンプル（変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ１〜４）とした。
実施例１で得られた変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ遺伝子をもつ大腸菌を、２ｍＬのＬＡ液体培地に植菌し、３７℃で一晩振盪培養した。一晩培養した培養液１ｍＬを１００ｍＬのＬＡ液体培地に植菌し、３７℃で３時間継代培養した。終濃度１ｍＭになるようにｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅを加え、さらに３７℃で３時間培養した。４０００×ｇで２０分間遠心分離することで集菌し、菌体を１×ＰＢＳ １０ｍＬで洗浄した。菌体は、５ｍＬのａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ５．５），１．０Ｍ ＮａＣｌ，１．０ｍＭ ＥＤＴＡ，２．５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ）に懸濁後、Ｍｏｄｅｌ ３００ Ｖ／Ｔ（ＢｉｏＬｏｇｉｃｓ）を用いて超音波破砕（ｐｏｗｅｒ ４０％，ｐｕｌｓｅｒ ５０％，１５分間）を行った。次いで、１３，５００×ｇで１０分間遠心分離を行い、上清を変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼの各サンプル（変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ１〜４）とした。
実施例３：変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼの検出
（１）ＨＩＶ−１プロテアーゼによるペプチド分解
４種類のアセチル化ペプチド：
基質１：Ａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号１）、
基質２：Ａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ（配列番号２）、
基質３：Ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３）、および
基質４：Ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（配列番号４）、
を基質として用いた。
（１）ＨＩＶ−１プロテアーゼによるペプチド分解
４種類のアセチル化ペプチド：
基質１：Ａｃｅｔｙｌ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号１）、
基質２：Ａｃｅｔｙｌ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｍｅｔ（配列番号２）、
基質３：Ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ（配列番号３）、および
基質４：Ａｃｅｔｙｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ（配列番号４）、
を基質として用いた。
実施例２と同様の方法で、野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼを作製した。次いで、これらのＨＩＶ−１プロテアーゼをそれぞれ含む大腸菌抽出液１０μＬ（タンパク質８μｇ）、各０．６２５ｍＭの４種類の基質ペプチドを含む混合液２４μＬ、ａｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ ６６μＬをそれぞれ混合し（全量１００μＬ：終濃度としてタンパク質０．０８μｇ／μＬ、各基質ペプチド０．１５ｍＭ）、３７℃で２時間反応させた。反応は０．１Ｍ ＮａＯＨ ５μＬ，１×ＰＢＳ ２０μＬを加え、ｐＨを７．０にすることで停止させた。
（２）蛍光体への変換、高速液体クロマトグラフィーによる分離と蛍光体の検出
上記（１）で得られた各反応液（１２５μＬ）に、それぞれ２．５ｍＭカテコール１００μＬ、３００ｍＭ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．０）５０μＬ、１．０ｍＭ ＮａＩＯ４ ５０μＬを加え（全量３２５μＬ：終濃度としてカテコール０．７７ｍＭ、Ｎａ３ＢＯ３ ４６ｍＭ、ＮａＩＯ４ ０．１５ｍＭ）、１００℃で１０分間加熱後、氷中にて５分間冷却した。冷却後、反応液を１３，５００ｇ，５分間遠心分離を行い、上清２０μＬをＨＰＬＣによって分析した。
ＨＰＬＣ条件：移動層；１５−８０％メタノール＋５％ ０．２５Ｍ ｐＨ７．０ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（０−４０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、励起波長４００ｎｍ，蛍光波長５００ｎｍ，カラムＯＤＳ−１００Ｓ ＲＰ−１８ｅ ｔｙｐｅ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ，ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ５ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）。野生型および変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼに関する結果を図２に示す。
上記（１）で得られた各反応液（１２５μＬ）に、それぞれ２．５ｍＭカテコール１００μＬ、３００ｍＭ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．０）５０μＬ、１．０ｍＭ ＮａＩＯ４ ５０μＬを加え（全量３２５μＬ：終濃度としてカテコール０．７７ｍＭ、Ｎａ３ＢＯ３ ４６ｍＭ、ＮａＩＯ４ ０．１５ｍＭ）、１００℃で１０分間加熱後、氷中にて５分間冷却した。冷却後、反応液を１３，５００ｇ，５分間遠心分離を行い、上清２０μＬをＨＰＬＣによって分析した。
ＨＰＬＣ条件：移動層；１５−８０％メタノール＋５％ ０．２５Ｍ ｐＨ７．０ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（０−４０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、励起波長４００ｎｍ，蛍光波長５００ｎｍ，カラムＯＤＳ−１００Ｓ ＲＰ−１８ｅ ｔｙｐｅ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ，ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ５ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）。野生型および変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼに関する結果を図２に示す。
その結果、野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼと変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼの、基質４に対するペプチド断片の生成率（活性）に違いが見られた。野生型と比較して、変異型の基質４に対する活性は約５０％に低下していた。一方で、基質１〜３に対する活性は、野生型と変異型の間で違いは観察されなかった。
上記４種類のアセチル化基質ペプチドの分解率について、他の変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼについても比較すると、野生型に比べて変異型では、「ある基質に対する活性が著しく減少し分解物を生成しない」、一方で「別の基質には変わりなく分解する」など、各変異体によって分解パターン（蛍光体の生成されるパターン）が異なることが分かった。
以上の結果から、変異が疑われるＨＩＶ−１プロテアーゼの基質に対する活性と野生型ＨＩＶ−１プロテアーゼの基質に対する活性とを基質ペプチドの分解率を指標に比較することで、ＨＩＶ−１プロテアーゼが変異型であるか否かを識別することが可能であることが分かった。
実施例４：野生型および変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼ活性に及ぼす、阻害剤（抗エイズ薬も含む）の影響
抗エイズ薬のＨＩＶ−１プロテアーゼ活性の阻害効果を調べる１つの方法として、以下の実験を行った。
野生型および変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼをそれぞれ含む大腸菌抽出液とリトナビルまたはペプスタチンＡを混合し（全量９４μＬ：終濃度としてタンパク質０．１μｇ／μＬ、リトナビル０．１〜１０μＭ、ペプスタチンＡ１〜１００μＭ）、３７℃で１５分間保温した。この溶液に各２．５ｍＭの４種類の基質ペプチドを含む混合液６μＬを加え、３７℃で２時間反応させた。その後、実施例３と同様に、分解ペプチドを蛍光体へ変換して高速液体クロマトグラフィーによる分離と検出を行った。結果を図３および図４に示す。
抗エイズ薬のＨＩＶ−１プロテアーゼ活性の阻害効果を調べる１つの方法として、以下の実験を行った。
野生型および変異型ＨＩＶ−１プロテアーゼをそれぞれ含む大腸菌抽出液とリトナビルまたはペプスタチンＡを混合し（全量９４μＬ：終濃度としてタンパク質０．１μｇ／μＬ、リトナビル０．１〜１０μＭ、ペプスタチンＡ１〜１００μＭ）、３７℃で１５分間保温した。この溶液に各２．５ｍＭの４種類の基質ペプチドを含む混合液６μＬを加え、３７℃で２時間反応させた。その後、実施例３と同様に、分解ペプチドを蛍光体へ変換して高速液体クロマトグラフィーによる分離と検出を行った。結果を図３および図４に示す。
ＨＩＶ−１プロテアーゼの特異的な阻害剤であるリトナビルの阻害効果を調べたところ、野生型では、１μＭの濃度で活性は著しく阻害され、１０μＭで完全に阻害された。これに対して、変異型４では、１０μＭのリトナビルで処理しても、最大で約４０％の活性が残存していた（図３）。また同様に、ＨＩＶ−１プロテアーゼが属するアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤であるペプスタチンＡを用いて、阻害活性を調べたところ、野生型に比べて、変異型４はペプスタチンＡによる阻害を受けにくいことが観察された（図４）。
これらの結果は、変異によって、阻害剤（抗エイズ薬）に対する抵抗性を獲得したことを示すものであり、本発明の検出方法が、阻害剤をもとに開発された抗ウイルス薬に対して、変異ウイルスが耐性であるか否かを容易に判別できることを示している。
これらの結果は、変異によって、阻害剤（抗エイズ薬）に対する抵抗性を獲得したことを示すものであり、本発明の検出方法が、阻害剤をもとに開発された抗ウイルス薬に対して、変異ウイルスが耐性であるか否かを容易に判別できることを示している。
実施例５：血清存在下でのＨＩＶ−１プロテアーゼの検出
実施例３の酵素反応液の中に１０μＬのヒト血清を添加し、３７℃で２時間酵素反応を行った。その後、実施例３と同様に、分解ペプチドを蛍光体へ変換して高速液体クロマトグラフィーによる分離と検出を行った。このとき、蛍光体への変換反応におけるＮａＩＯ４の濃度を１．０ｍＭまたは２．５ｍＭとし、それぞれのクロマトグラムを比較した。結果を図５に示す。
血清存在下１．０ｍＭ ＮａＩＯ４を使用した場合、血清非存在下と比較すると、ピーク高さは５０％以下に低下した。しかし、蛍光誘導化反応に用いるＮａＩＯ４の濃度を上げることで、ピーク高さを７０％以上にまで回復することができた。これは、血清中の成分によって、酸化剤が消費され、蛍光誘導化反応に必要な酸化剤が不足したことを示している。
以上の結果から、酸化剤の濃度を調節することで、たとえサンプルが血液由来のものであっても、ウイルスプロテアーゼを検出可能であることが分かった。
実施例３の酵素反応液の中に１０μＬのヒト血清を添加し、３７℃で２時間酵素反応を行った。その後、実施例３と同様に、分解ペプチドを蛍光体へ変換して高速液体クロマトグラフィーによる分離と検出を行った。このとき、蛍光体への変換反応におけるＮａＩＯ４の濃度を１．０ｍＭまたは２．５ｍＭとし、それぞれのクロマトグラムを比較した。結果を図５に示す。
血清存在下１．０ｍＭ ＮａＩＯ４を使用した場合、血清非存在下と比較すると、ピーク高さは５０％以下に低下した。しかし、蛍光誘導化反応に用いるＮａＩＯ４の濃度を上げることで、ピーク高さを７０％以上にまで回復することができた。これは、血清中の成分によって、酸化剤が消費され、蛍光誘導化反応に必要な酸化剤が不足したことを示している。
以上の結果から、酸化剤の濃度を調節することで、たとえサンプルが血液由来のものであっても、ウイルスプロテアーゼを検出可能であることが分かった。
実施例６：ＨＩＶ−１プロテアーゼとＨＣＶプロテアーゼの同時識別
ＨＩＶ−１プロテアーゼを含む大腸菌抽出液とＨＩＶ−１プロテアーゼの基質ペプチドからなる酵素反応液の中に、ＨＣＶプロテアーゼおよびＨＣＶプロテアーゼの基質ペプチドを添加し（全量１００μＬ：終濃度としてタンパク質０．１μｇ／μＬ、各基質ペプチド０．０５ｍＭ、ＨＣＶプロテアーゼ１．２５または２．５ｎｇ／μＬ）、３７℃で２時間酵素反応を行った。
このとき、ＨＩＶ−１プロテアーゼの基質ペプチドとしては実施例３で用いた４種類の基質（配列番号１〜４）を用い、またＨＣＶプロテアーゼの基質ペプチドとしては、Ａｃｅｔｙｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号５）を用いた。
その後、実施例３と同様の方法で分解ペプチドを蛍光体へ変換して、高速液体クロマトグラフィーにより蛍光体を分離し、検出した。結果を図６に示す。
ＨＩＶ−１プロテアーゼを含む大腸菌抽出液とＨＩＶ−１プロテアーゼの基質ペプチドからなる酵素反応液の中に、ＨＣＶプロテアーゼおよびＨＣＶプロテアーゼの基質ペプチドを添加し（全量１００μＬ：終濃度としてタンパク質０．１μｇ／μＬ、各基質ペプチド０．０５ｍＭ、ＨＣＶプロテアーゼ１．２５または２．５ｎｇ／μＬ）、３７℃で２時間酵素反応を行った。
このとき、ＨＩＶ−１プロテアーゼの基質ペプチドとしては実施例３で用いた４種類の基質（配列番号１〜４）を用い、またＨＣＶプロテアーゼの基質ペプチドとしては、Ａｃｅｔｙｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ（配列番号５）を用いた。
その後、実施例３と同様の方法で分解ペプチドを蛍光体へ変換して、高速液体クロマトグラフィーにより蛍光体を分離し、検出した。結果を図６に示す。
その結果、酵素反応液の中に、ＨＣＶプロテアーゼを１．２５ｎｇ／μＬ（図６Ｂ）、または２．５ｎｇ／μＬ（図６Ｃ）で添加した場合、ＨＣＶプロテアーゼを添加しない場合（図６Ａ）と比較して、図中の矢印で示した新たなピークが観察され、このピークは、ＨＣＶプロテアーゼの添加量の増加に従って高くなった。このことから、新たに出現したピークは、ＨＣＶプロテアーゼの基質ペプチドが、ＨＣＶプロテアーゼによって分解されたものである。また、このピークは、ＨＩＶ−１プロテアーゼ分解ペプチドとも十分に分離できた。
このように、基質ペプチドの種類を増やすことで、複数のプロテアーゼを同時に識別可能であることが分かった。
このように、基質ペプチドの種類を増やすことで、複数のプロテアーゼを同時に識別可能であることが分かった。
実施例７：カテコール誘導体によるペプチドの蛍光体への変換
種々のカテコール誘導体は、東京化成工業から購入した。分解ペプチドとしては、カテコールと反応して蛍光を生じるペプチドと蛍光を生じないペプチド（アラニン−グリシン；ＡＧ、プロリン−グリシン；ＰＧ、グリシン−プロリン；ＧＰ）を用意した。
４０μＭペプチド２５０μＬ、０．５ｍＭカテコール誘導体３７５μＬ、２００ｍＭ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．０）３１２μＬ、１．５ｍＭ ＮａＩＯ４ ６３μＬを加え（終濃度として、各ペプチド１０μＭ、各カテコール誘導体１８７．５μＭ、Ｎａ３ＢＯ３ ６２．４ｍＭ、ＮａＩＯ４ ９４．５μＭ）、１００℃で１０分間加熱後、氷中にて５分間冷却した。冷却後、反応液を１３，５００ｇで５分間遠心分離を行い、上清２０μＬをＨＰＬＣによって分析した。
ＨＰＬＣ条件：移動層；１５−８０％メタノール＋５％ ０．２５Ｍ ｐＨ７．０ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（０−４０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、励起波長３３０〜４２０ｎｍ，蛍光波長４３０〜５２０ｎｍ，カラムＯＤＳ−１００Ｓ ＲＰ−１８ｅ ｔｙｐｅ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ，ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ５ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）。
結果を図７に示す。
種々のカテコール誘導体は、東京化成工業から購入した。分解ペプチドとしては、カテコールと反応して蛍光を生じるペプチドと蛍光を生じないペプチド（アラニン−グリシン；ＡＧ、プロリン−グリシン；ＰＧ、グリシン−プロリン；ＧＰ）を用意した。
４０μＭペプチド２５０μＬ、０．５ｍＭカテコール誘導体３７５μＬ、２００ｍＭ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（ｐＨ ７．０）３１２μＬ、１．５ｍＭ ＮａＩＯ４ ６３μＬを加え（終濃度として、各ペプチド１０μＭ、各カテコール誘導体１８７．５μＭ、Ｎａ３ＢＯ３ ６２．４ｍＭ、ＮａＩＯ４ ９４．５μＭ）、１００℃で１０分間加熱後、氷中にて５分間冷却した。冷却後、反応液を１３，５００ｇで５分間遠心分離を行い、上清２０μＬをＨＰＬＣによって分析した。
ＨＰＬＣ条件：移動層；１５−８０％メタノール＋５％ ０．２５Ｍ ｐＨ７．０ Ｈ３ＢＯ３−ＮａＯＨ（０−４０ｍｉｎ ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）、励起波長３３０〜４２０ｎｍ，蛍光波長４３０〜５２０ｎｍ，カラムＯＤＳ−１００Ｓ ＲＰ−１８ｅ ｔｙｐｅ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ ｉ．ｄ，ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ ５ｍｍ，Ｔｏｓｏｈ）。
結果を図７に示す。
その結果、いずれのカテコール誘導体についても、ペプチドを蛍光体化できることが分かった。
本発明の検出方法は、従来型の変異ウイルスの検出方法よりも、迅速かつ簡便に変異ウイルスを検出することができる。またプロテアーゼ活性の変化に基づきウイルス変異を判断していることから、本発明の検出方法は、抗ウイルス薬の効果を判別する方法としても適用可能である。さらに、基質となるペプチドを変えることで、様々なウイルスを同時に、かつ詳細に検出・識別可能である。
Claims (7)
- 以下の工程：
（１）変異が疑われるプロテアーゼとその少なくとも２種のＮ末端アセチル化基質ペプチドとを接触させて、基質ペプチドを分解させる工程；
（２）ホウ酸溶液中、酸化剤存在下で、工程（１）で得られた分解ペプチドと、下記カテコールまたはその誘導体：
（式中、Ｒは、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ １−６ アルキル、Ｃ １−６ アルキル−カルボキシル、カルボキシル）
とを反応させて、蛍光体を製造する工程；
（３）工程（２）で得られた蛍光体をＨＰＬＣで測定する工程；および
（４）工程（３）で得られた測定結果から、変異が疑われるプロテアーゼの基質ペプチドに対する活性と野生型プロテアーゼの該基質ペプチドに対する活性とを該基質ペプチドの分解率を指標に比較し、該変異が疑われるプロテアーゼが変異型であるか否かを識別する工程
を含む、変異プロテアーゼの検出方法。 - 酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウムである、請求項１に記載の方法。
- 工程（１）で得られた分解ペプチドとカテコールまたはその誘導体との反応が、８０℃〜１１０℃で行われる、請求項１または２に記載の方法。
- 変異が疑われるプロテアーゼが血液または唾液の生体試料から採取されたものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
- 変異が疑われるプロテアーゼが血液または唾液の生体試料から採取され、該生体試料中に存在する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
- 変異が疑われるプロテアーゼがＨＩＶプロテアーゼである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
- 変異が疑われるプロテアーゼがＨＩＶプロテアーゼであり、以下の工程：
（０）血液または唾液からＲＮＡを抽出し、逆転写酵素を用いて、ＨＩＶウイルスのｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより、ＨＩＶプロテアーゼ遺伝子を増幅し、発現ベクターにクローニングして発現プラスミドを作製し、該発現プラスミドを用いて、大腸菌または動物細胞を形質転換することにより、ＨＩＶプロテアーゼを準備する行程
によりＨＩＶプロテアーゼを準備することをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
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