PL176856B1 - Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń - Google Patents
Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świńInfo
- Publication number
- PL176856B1 PL176856B1 PL92301787A PL30178792A PL176856B1 PL 176856 B1 PL176856 B1 PL 176856B1 PL 92301787 A PL92301787 A PL 92301787A PL 30178792 A PL30178792 A PL 30178792A PL 176856 B1 PL176856 B1 PL 176856B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- lelystad
- factor
- swine
- virus
- respiratory
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespolem nieplodnosci i zaburzen oddechowych swin, znamienna tym, ze zawiera co najmniej 1 TCID50/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespolu nie- plodnosci i zaburzen swin przy czym wspomniany czynnik Lelystad odpowiada zasadni- czo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) zlozonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu I-1102, oraz fizjologiczny roztwór soli. PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej 1 TCIDso/ml wyizolowanego czynnika Lelyustad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany czynnik Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu 11102, oraz fizjologiczny roztwór soli. Korzystnie kompozycja ta zawiera co najmniej 2 TCIDso/ml wyizolowanego czynnika Lelystad.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej 1 TCID50/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem
176 856 chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany czynnik Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu I-1102 oraz syntetyczną pożywkę minimalną (MEM). Korzystnie kompozycja ta zawiera co najmniej 2 TCID30/ml wyizolowanego czynnika Lelystad.
Kompozycja według wynalazku może zawierać żywy, zabity lub atenuowany wyizolowany czynnik Lelystad; wektor rekombinacyjny otrzymany z czynnika Lelystad; wyizolowaną część lub składnik czynnika Lelystad; wyizolowane lub syntetyczne białko, (poli)peptyd lub kwas nukleinowy pochodzące z czynnika Lelystad; rekombinacyjny kwas nukleinowy, zawierający sekwencję nukleotydów pochodzącą z genomu czynnika Lelystad; (poli)peptyd mający sekwencję aminokwasów pochodzącą z białka czynnika Lelystad, który to (poli)peptyd jest wytwarzany przez komórki zdolne do produkowania go dzięki inżynierii genetycznej przeprowadzonej z odpowiednim rekombinacyjnym DNA.; wyizolowane lub syntetyczne przeciwciało, które rozpoznaje swoiście część lub składnik czynnika Lelystad; lub wektor rekombinacyjny, który zawiera kwas nukleinowy, zawierający sekwencję nukleotydów, kodującą białko lub peptyd antygenowy pochodzący z czynnika Lelystad.
Na poziomie DNA przedmiotem wynalazkujest kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jeden wyizolowany kwas nukleinowy/ml czynnika Lelystad, któryjest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany czynnik Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu I-1102, oraz fizjologiczny roztwór soli.
W korzystnej postaci wynalazku kompozycja zawiera co najmniej dwa wyizolowane kwasy nukleinowe/ml czynnika Lelystad.
Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jeden rekombinowany kwas nukleinowy/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany kwas nukleinowy czynnika Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu 1-1102, oraz fizjologiczny roztwór soli.
W korzystnym wykonaniu kompozycji zawiera ona co najmniej 2 rekombinowane kwasy nukleinowe/ml izolowanego czynnika Lelystad.
Zawarty z kompozycji według wynalazku rekombinacyjny kwas nukleinowy, zwłaszcza rekombinacyjny DNA, który zawiera sekwencję nukleotydów swoistą dla czynnika Lelystad, pokazaną na figurze 1. Korzystnie, wspomniana sekwencja nukleotydów swoista dla czynnika Lelystad jest wybrana z dowolnej z ORF (otwarta ramka odczytu - Open Reading Frame) pokazanych na figurze.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, charakteryzująca się tym, że zawiera co najmniej jeden rekombinowany kwas nukleinowy/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany kwas nukleinowy czynnika Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu I-1102, oraz chlorowodorek 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiolu (T ris-HCl).
W korzystnej postaci kompozycja według wynalazku zawiera co najmniej 2 rekombinowane kwasy nukleinowe/ml izolowanego czynnika Lelystad.
Na poziomie peptydu/białka kompozycja może być zdefiniowana przez peptyd zawierający sekwencję aminokwasów swoistą dla czynnika Lelystad, pokazaną na figurze 1. W oparciu o wyizolowany czynnik Lelystad można sporządzić kompozycję szczepionki do szczepienia zwierząt, w szczególności ssaków, zwłaszcza świń lub trzody chlewnej, do zabezpieczenia ich przed tajemniczą chorobą świń, zawierająca czynnik Lelystad żywy,
176 856 zabity albo atenuowany; lub wektor rekombinacyjny, który zawiera kwas nukleinowy, zawierający sekwencję nukleotydów kodującą białko lub peptyd antygenowy pochodzący z czynnika Lelystad; część antygenową lub składnik czynnika Lelystad; białko lub polipeptyd antygenowy pochodzący od czynnika Lelystad albo peptyd naśladujący antygenowy składnik czynnika Lelystad; oraz odpowiedni nośnik lub adiuwant.
Można także otrzymywać kompozycję szczepionki do szczepienia zwierząt, w szczególności ssaków, zwłaszcza świń lub trzody chlewnej, zabezpieczającą je przed chorobą powodowaną przez patogen, zawierającą wektor rekombinacyjny, otrzymany z czynnika Lelystad, przy czym kwas nukleinowy wektora rekombinacyjnego zawiera sekwencję nukleotydów kodującą białko lub peptyd antygenowy pochodzący z patogenu oraz odpowiedni nośnik lub adiuwant. Na podstawie kompozycji weterynaryjnej według wynalazku można utworzyć zestaw diagnostyczny do wykrywania kwasu nukleinowego czynnika Lelystad w próbce, w szczególności w próbce biologicznej, takiej jak krew lub surowica krwi, plwocina, ślina lub tkanka, pochodzącej od zwierzęcia, w szczególności ssaka, zwłaszcza świni lub trzody chlewnej, zawierający sondę kwasu nukleinowego lub primer, który zawiera sekwencję nukleotydów pochodzącą z genomu czynnika Lelystad oraz odpowiedni środek do detekcji techniki detekcji kwasu nukleinowego.
Zestaw diagnostyczny można także stosować do wykrywania antygenu z czynnika Lelystad w próbce, w szczególności w próbce biologicznej, takiej jak krew lub surowica krwi, plwocina, ślina lub tkanka, pochodzącej od zwierzęcia, w szczególności ssaka, zwłaszcza świni lub trzody chlewnej, zawierającej przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje część lub składnik czynnika Lelystad, oraz odpowiedni środek do detekcji techniki detekcji antygenu. Możliwe jest także utworzenie zestawu diagnostycznego do wykrywania przeciwciał, które specyficznie rozpoznaje czynnik Lelystad w próbce, w szczególności w próbce biologicznej, takiej jak krew lub osocze krwi, plwocina, ślina lub tkanka, pochodzącej od zwierzęcia, w szczególności ssaka, zwłaszcza świni lub trzody chlewnej, zawierający czynnik Lelystad; część antygenową lub składnik czynnika Lelystad; białko lub polipeptyd antygenowy pochodzący od czynnika Lelystad; lub peptyd naśladujący składnik antygenowy czynnika Lelystad; oraz odpowiedni środek detekcji do detekcji w technice oznaczania przeciwciała. Kompozycja weterynaryjna umożliwia zatem przeprowadzenie diagnozowania czy zwierzę jest zakażone wirusem polegającym na przygotowaniu odpowiedniej próbki pochodzącej od zwierzęcia i zbadaniu znanymi metodami czy próbka ta zawiera wirusowy kwas nukleinowy albo antygen wirusowy względnie specyficzne dla wirusa przeciwciało polegający na tym, że oznacza się obecność kwasu nukleinowego czynnika Lelystad, antygenu czynnika Lelystad albo przeciwciał specyficznego dla czynnika Lelystad, przy czym wspomniany czynnik Lelystad jest czynnikiem sprawczym tajemniczej choroby świń i zasadniczo odpowiada izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91), złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, Paryż, Francja, pod numerem 15 depozytu I-1102, a w oznaczaniu tym stosuje się sondę kwasu nukleinowego albo primer zawierający nukleotydowe sekwencje pochodzące od genomu czynnika Lelystad, albo przeciwciało, które specyficznie rozpoznaje część lub komponent czynnika Lelystad, albo część antygenową, lub komponent czynnika Lelystad, albo białko, albo polipeptyd antygenowy pochodzący od czynnika Lelystad, albo peptyd naśladującego antygenowy komponent czynnika Lelystad.
Wynalazek jest rezultatem połączonych wysiłków Centralnego Instytutu Weterynarii (Central Veterinary Institute CVI) i Regionalnych Zwierzęcych Służb Ochrony Zdrowia (Regional Animal Health Services RAHS) w Holandii, mających na ceiu znalezienie przyczyny nowej choroby MSD. Farmy, na których świnie zostały dotknięte tą chorobą, zostały odwiedzone przez weterynarzy polowych RAHS. Chore świnie, materiały do badań od chorych świń oraz surowice krwi macior, pobrane w czasie fazy ostrej i rekonwalescencyjnej choroby, zostały przesłane w ceiu izolacji wirusa do RAHS i CVI. Sparowane surowice macior dotkniętych chorobą, zostały zbadane na obecność przeciwciał przeciwko dziesięciu znanym wirusom świńskim. Wyizolowano trzy wirusy, wirus zapalenia mięśnia sercowego opon mózgowych, enterowirus świński typ 2, enterowirus świński typ 7 oraz nieznany czynnik, Lelystad (LA). Maciory, które zostały porażone chorobą stały się sero6
176 856 pozytywne głównie na LA, i prawie wcale na inne izolaty wirusów lub znane patogeny wirusowe. W celu eksperymentalnego odtworzenia MSD osiem ciężarnych macior zaszczepiono donosowo LA w 84 dni ciąży. Jedna z macior urodziła 109 dnia ciąży siedem martwych i czworo żywych, lecz bardzo słabych prosiąt; cztery żywe prosięta zmarły następnego dnia po urodzeniu. Inna maciora urodziła dnia 116 trzy zmumifikowane, sześć martwych prosiąt i trzy prosięta żywe; dwoje żywych prosiąt zmarło w ciągu dnia. Trzecia maciora urodziła dnia 117 dwa zmumifokowane płody, osiem martwych i siedem żywych prosiąt. Inne maciory urodziły około dnia 115 i miały mniej poważne straty. Średnia liczba żywych prosiąt od wszystkich ośmiu macior wynosiła 7,3, a średnia liczba martwych prosiąt wynosiła 4,6. Przeciwciała skierowane przeciwko LA wykryto w 10 z 42 próbek surowicy zebranych przed rozpoczęciem przez maciory karmienia. LA wyizolowano z trzech prosiąt, które zmarły zaraz po urodzeniu. Rezultaty te uzasadniają wyciągnięcie wniosku, że LA jest czynnikiem sprawczym tajemniczej choroby świń.
LA namnaża się z efektem cytopatycznym w makrofagach płuc świńskich i może być zidentyfikowany przez wybarwianie w technice immunoperoksydazowej monowarstwowej (IPMA) poinfekcyjnej surowicy świń c 829 i b 822 lub dowolnej poinfekcyjnej surowicy świń SPF zestawionych w tabeli 5. Przeciwciała dla LA mogą być zidentyfikowane za pomocą bezpośrednich procedur wybrania w technice IPMA. LA nie namnażał się w żadnym innym badanym układzie komórkowym. LA nie był zobojętniany przez surowicę homologeniczną ani przez surowicą skierowaną przeciwko zestawowi znanych wirusów (tabela 3). LA nie aglutynuje z badanymi czerwonymi ciałkami krwi. LA jest mniejszy niż 200 nm, ponieważ przechodzi przez filtr o takiej wielkości porów. LA jest wrażliwy na chloroform. Powyższe rezultaty wskazują, że czynnik Lelystad nie został jeszcze zidentyfikowany jako należący do pewnej grupy wirusów lub innych cząstek mikrobiologicznych. Został on złożony do depozytu 5 czerwca 1991 pod numerem I-1102 w Instytucie Pasteura w Paryżu, Francja.
Obecnie wykryte zostały dla LA organizacja genomu, sekwencja nukleotydów i pochodzące od nich peptydy. Dane te razem z danymi innych autorów (patrz poniżej) upoważniają do sklasyfikowania LA (zwanego w dalszym ciągu również wirusem Lelystad Lub LV) jako członka nowej rodziny wirusów. Arteriviridae. Jako prototyp tej nowej rodziny proponujemy wirusa Equine Arteritis (EAV), pierwszego członka nowej rodziny, dla którego dostępne są dane dotyczące strategii replikacji genomu i organizacji genomu (de Vries et al., 1990 oraz odnośniki cytowane). Na podstawie porównania naszych danych dotyczących sekwencji z danymi dostępnymi dla wirusa podnoszącego poziom dehydrogenay mleczanowej (LDV; Godeny et al., 1990) proponujemy, że LDVjest również członkiem rodziny Arteriviridae.
Przy danej organizacji genomu i strategii translacji Arteriviridae wydaje się właściwe umieszczenie tej nowej rodziny wirusów w superrodzinie koronawirusów (Snijder et al., 1990a).
Wspólną cechą Arterivirusów jest to, że ich pierwszymi komórkami celowymi w odpowiednich gospodarzach są makrofagi. Jak wykazano, replikacja LDV jest ograniczona do makrofagów gospodarza - myszy, podczas gdy taka ścisła skłonność do makrofagów nie została wykryta dla EAV i LV.
Arteriwirusy są sferycznymi, opłaszczonymi cząstkami, mającymi średnicę 45-60 nm i zawierającymi ikozaedralny nukleokapsyd (Brinton-Darnell i Plagemann, 1975; Horzinek et al., 1971; Hyllseth, 1973).
Genom Arteriviridae składa się z nici plus poliadenylowanej cząsteczki RNA o wielkości około 12-13 kilozasad (kb) (Brinton-Darnell and Plagemann, 1975; van der Zeijst et al., 1975). EAV ulega replikacji poprzez 3'zagnieżdżony zestaw sześciu subgenomowych mRNAs o wielkości zawartej w zakresie od 0,8 do 3,6 kb, które składają się z sekwencji liderowej, pochodzącej od końca 5' RNA genomowego, która jest przyłączona do końca 3' części głównych sekwencji (de Vries et al., 1990).
Wykazujemy tu, że organizacja genomu i strategia replikacji LV są podobne jak u EAV, koronawirusów i torowirusów, podczas gdy wielkości genomów koronawirusów i torowirusów są całkowicie różne od LV i EAV.
176 856
Genom LV składa się z genomowej cząsteczki RNA o długości około 14,5 do 15,5 kb (oznaczona na obojętnym żelu agarozowym), która ulega replikacji poprzez 3' zagnieżdżony zestaw sześciu subgenomowych RNAs subgenomowy RNAs składa się z sekwencji liderowej, której długość nie jestjeszcze znana, pochodzącej od końca 5' genomowego RNA i która jest sprzężona z częścią główną sekwencji, pochodzącą od końca 3' genomowego RNA (figura 2).
Sekwencja nukleotydów genomowego RNA dla LV została oznaczona z nakładających się klonów cDNA. Kolejność sekwencji dla 15,088 kb uzyskano pokrywając prawie cały genom LV (figura 1). W tej sekwencji zidentyfikowano 8 otwartych ramek odczytu (ORF): ORF 1A, ORF 1B i ORF 2 do 7.
Przypuszcza się, że ORF 1A i ORF IB kodują wirusową replikazę lub polimerazę, natomiast ORF od 2 do 7 kodują białka strukturalne membrany wirusowej (otoczki). ORF 7 koduje białko strukturalne nukleokapsydu wirusowego.
Ponieważ produkty ORF 6 i ORF 7 LV wykazują znaczne podobieństwo odpowiednio do VpX i Vpl LDV, przypuszcza się, że sekwencje ORF 6 i 7 będą również w wysokim stopniu zachowane w antygenowych wariantach LV.
Kompletna sekwencja nukleotydów przedstawiona na fig. 1 oraz wszystkie sekwencje i produkty białkowe kodowane przez ORF od 1 do 7 i inne możliwe ORF umiejscowione w sekwencji przedstawionej na fig. 1 są szczególnie odpowiednie do opracowania szczepionki w dowolnym znaczeniu, oraz do opracowania narzędzi diagnostycznych, w dowolnym znaczeniu. Wszystkie możliwe sposoby są znane specjalistom z tej dziedzinie.
Ponieważ możliwe jest obecnie jednoznaczne zidentyfikowanie LA, czynnika chorobotwórczego MSD, możliwe jest przeprowadzenie testu czy świnie są zainfekowane LA czy nie. Takie testy diagnostyczne nie były do tej pory dostępne.
Test może być przeprowadzony przez izolację wirusa w makrofagach lub innych systemach hodowli komórek, w których LA może się namnażać, i wybarwienie zainfekowanych hodowli przeciwciałami skierowanymi przeciwko LA (takimi jak surowica poinfekcyjna c 829 lub b 822), ale możliwe jest również opracowanie i zastosowanie innych rodzajów testów diagnostycznych.
Na przykład możliwe jest zastosowanie pośrednich lub bezpośrednich technik wybarwiania immunohistologicznego, na przykład z przeciwciałami skierowanymi przeciwko LA, znakowanymi związkami fluorescencyjnymi takimi jak izotiocy’anian lub znakowanymi enzymami, takimi jak peroksydaza z chrzanu. Techniki te mogą być zastosowane do wykrycia antygenu LA w skrawkach tkanek lub innych próbek od świń podejrzanych o MSD. Przeciwciałami potrzebnymi do tych testów mogą być c 829 lub b 822 lub inne przeciwciała polikłonalne skierowane przeciwko LA, ale mogą być również stosowane przeciwciała monokłonalne skierowane przeciwko LA.
Ponadto, ponieważ natura i organizacja genomu LA oraz sekwencja nukleotydów tego genomu zostały oznaczone, mogą być zidentyfikowane sekwencje nukleotydów swoiste dla LA oraz wykorzystane do opracowania sekwencji oligonukleotydowych, które mogą być zastosowane jako sondy lub primery w technikach diagnostycznych takich jak hybrydyzacja, reakcja PCR lub dowolne inne techniki opracowane do specyficznego wykrywania sekwencji kwasów nukleinowych.
Możliwe jest również przeprowadzenie testu na obecność przeciwciał przeciwko LA. Tabela 5 pokazuje, że eksperymentalnie zainfekowane świnie gwałtownie wytwarzają przeciwciała przeciwko LA, tabela 4 pokazuje, że świnie w warunkach naturalnych również wykazują silne odpowiedzi przeciwciał przeciwko LA. Zatem możliwe jest również ustalenie, czy świnie były zainfekowane LA w przeszłości. Takie testowanie ma bardzo duże znaczenie dla ustalenia, czy świnie lub stada świń lub populacja świń w całych regionach lub krajach są pozbawione LA. Test może być wykonany przez użycie IPMA tak jak opisano, ale możliwe jest również opracowanie i zastosowanie do wykrywania przeciwciał skierowanych przeciwko LA innych rodzajów testów diagnostycznych.
W testach takich mogą być zastosowane białka, polipeptydy i peptydy swoiste dla LA lub sekwencje peptydów naśladujące antygenowe składniki LA. Takie białka mogą być
176 856 otrzymane z samego LA, ale jest również możliwe wytwarzanie takich białek technikami rekombinacji DNA lub technikami syntezy peptydów. W testach tych mogą być wykorzystane swoiste przeciwciała poliklonalne i/lub monoklonalne skierowane przeciwko LA lub swoiste składniki LA i/lub systemy komórkowe zainfekowane LA lub systemy komórkowe ekspresji antygenu LA. Przeciwciała mogą być wykorzystane na przykład jako środek do immobilizacji antygenu LA (powierzchnia stała jest powleczona przeciwciałem, po czym antygen LA jest związany przez przeciwciało), co prowadzi do wyższej swoistości testu, lub mogą być wykorzystane w technice kompetycyjnej (przeciwciało znakowane i nieznane przeciwciało w próbce współzawodniczą o dostęp do antygenu LA).
Ponadto opisane powyżej możliwości diagnostyczne mogą być zastosowane do testowania, czy inne zwierzęta, takie jak ssaki, ptaki, owady lub ryby, albo rośliny lub inne istoty żywe mogą być, albo są, albo były zainfekowane LA lub podobnymi czynnikami.
Ponieważ obecnie zidentyfikowano LA jako czynnik sprawczy MSD, możliwe jest wytworzenie szczepionki do zabezpieczani świń przeciwko tej chorobie. Taka szczepionka może być wytworzona po prostu przez namnażanie LA w hodowlach makrofagów z płuc świńskich, lub w innych systemach komórkowych w których LA namnaża się. LA może być następnie oczyszczony lub nie, oraz zabity uznanymi technikami, takimi jak inaktywacja formaliną lub światłem nadfiletowm. Inaktywowany LA może być następnie połączony z adiuwantami, takimi jak adiuwant Freund’a lub wodorotlenek glinu i kompozycja ta może być następnie wstrzyknięta świniom.
Szczepionki martwe mogą być również wytworzone za pomocą technik rekombinacji DNA z preparatów białka LA, pochodzących z hodowli zainfekowanych LA lub pochodzących z innych systemów komórkowych, w których następuje swoista ekspresja białka LA. Takie podjednostki DNA mogą być następnie poddawane opisanej powyżej obróbce, w wyniku czego mogą być otrzymane szczepionki podjednostkowe.
Możliwe jest również stosowanie jako szczepionek martwych szczepionek otrzymanych przy zastosowaniu jeszcze mniejszych składników LA, takich jak polipeptydy, peptyd lub peptyd naśladujące składniki antygenowe LA.
Martwe szczepionki przeciwko MSD mogą być również wytworzone z wykorzystaniem technik rekombinacji DNA, za pomocą których genom LA lub jego część jest włączany do systemów wektorów takich jak wirus ospy bydlęcej, wirus opryszczki, wirus wścieklizny rzekomej, adenowirus, baculovirus lub innych odpowiednich systemów wektorów, które mogą powodować ekspresję antygenu LA w odpowiednich systemach komórkowych. Antygen LA z tych systemów może być następnie użyty do opracowania szczepionki jak opisano powyżej, a u świń zaszczepionych takimi produktami rozwinie się ochronna odpowiedź immunologiczna przeciwko LA.
Szczepionki przeciwko MSD mogą być również oparte na żywych preparatach LA. Ponieważ infekcja zdaje się poważnie dotykać tylko młode prosięta i ciężarne maciory, możliwe jest zastosowanie nieatenuowanego LA, namnażanego w makrofagach z płuc świńskich, jako szczepionki dla starszych prosiąt lub macior rozpłodowych. W ten sposób maciory mogą być zabezpieczone przed MSD zanim staną się ciężarne, czego rezultatem jest zabezpieczenie przed poronieniami i martwymi urodzeniami oraz przed wrodzonymi infekcjami u prosiąt. Również przeciwciało matczyne zaszczepionych macior zabezpiecza ich potomstwo przed chorobą.
Ateunowane szczepionki (modyfikowane szczepionki żywe) przeciwko MSD mogą być wytwarzane przez kolejne pasażowanie LA w świńskich makrofagach płucnych, w makrofagach płucnych innych gatunków lub w innych systemach komórkowych, lub w innych zwierzętach, takich jak króliki, aż do utraty przez niego patogenności.
Żywe szczepionki przeciwko MSD mogą być również wytwarzane technikami rekombinacji DNA, za pomocą których genom LA lub jego części są włączane do systemów wektorowych takich jak wirus ospy bydlęcej, wirus opryszczki, wirus wścieklizny rzekomej, adenowirus lub innych odpowiednich systemów wektorowych, w których może zachodzić ekspresja antygenu LA. W świniach zaszczepionych takimi żywymi systemami wektorowymi rozwija się następnie ochronna odpowiedź immunologiczna przeciwko LA.
176 856
Czynnik Lelystad jako taki jest szczególnie odpowiedni do stosowania jako żywy system wektorowy. Do genomu LA mogą być włączone geny obce, które mogą powodować ekspresję odpowiadającego im białka podczas infekowania makrofagów. Komórka tak, która jest komórką prezentującą antygen, będzie przetwarzać obcy antygen i prezentować go lomfocytom B i limfocytom T, które będą reagować odpowiednią odpowiedzią immunologiczną.
Ponieważ LA wydaje się posiadać wysoką swoistość komórkową i być może również wysoką swoistość gatunkową, ten system wektora może być systemem bardzo bezpiecznym, który nie uszkadza innych komórek ani gatunków.
Krótki opis rysunków.
Figura 1 przedstawia sekwencję nukleotydów genomu LV. Przedstawiono wydedukowane sekwencje aminokwasów zidentyfikowanych ORF. Metioniny kodowane przez (przypuszczalne) miejsca startowe ATG są wskazane przez pogrubienie, a przypuszczalne miejsca N-glikozylacji są podkreślone. Przedstawiono różnicę sekwencji nukleotydów i aminokwasów, zidentyfikowane przez sekwencjonowanie różnych klonów cDNA. Sekwencja nukleotydu primeru 25, który stosowano w eksperymentach hybrydyzacyjnych (patrz fig. 2 i rozdział Wyniki) jest podkreślona.
Figura 2 przedstawia organizację genomu LV. Klony cDNA, które stosowano do oznaczania sekwencji nukleotydów, są wskazane w górnej części figury. Części klonów, które sekwencjonowano, są zaznaczone na czarno. W dolnej części figury pokazano ORF zidentyfikowane w sekwencji nukleotydów i zestaw subgenomowych mRNAs, kodujących te ORF. Przerywane linie w ORF odpowiadają alternatywnym miejscom inicjacji (ATG) tych ORF. Sekwencja liderowa genomowych i subgenomowych RNA jest wskazana przez zamalowany prostokąt.
Figura 3 przedstawia charakterystyki wzrostu LA:
- kwadraty puste odpowiadają mianu wirusa wolnego od komórek;
- kwadraty zapełnione odpowiadają mianu wirusa połączonego z komórką;
- linie stałe odpowiadają procentowi efektu cytopatycznego (CPE).
Materiały i metody
Pobieranie próbek
Próbki i świnie zbierano w farmach, w których podejrzewano wybuch epizoozy MSD. Ważnymi kryteriami wyboru farmy jako zainfekowanej MSD były: maciory pozbawione apetytu, występowanie martwych urodzeń i poronień, słabe potomstwo, zaburzenia oddychania i zgony młodych prosiąt. Badano próbki z czterech grup świń:
1) próbki tkanek i wymazy z gardła od prosiąt dotkniętych chorobą w warunkach naturalnych (tabela 1A).
2) próbki krwi i wymazy z gardła od macior dotkniętych chorobą w warunkach (tabele 1B i 4).
3) próbki tkanki, wymazy z nosa i próbki krwi zebrane od pozbawionych swoistego pateogenu świń (SBF) zaifekowanych doświadczalnie przez kontakt z chorymi maciorami z warunków naturalnych lub
4) próbki tkanki, wymazy z nosa i próbki krwi zebrane od pozbawionych swoistego patogenu świń (SPF) zaifekowanych doświadczalnie przez zaszczepienie próbkami krwi chorych macior z warunków naturalnych (tabele 2 i 5).
Przygotowanie próbek
Próbki do izolacji wirusa uzyskano od prosiąt i macior, które podejrzewano o MSD na podstawie objawów klinicznych oraz od zainfekowanych doświadczalnie świń SPF, macior i ich prosiąt.
Próbki tkanki pocięto mikrotomem kriostatowym a skrawki poddano bezpośredniemu badaniu immunofluorescencyjnemu (IFT) z koniugatami skierowanymi przeciwko różnym patogenom świń.
Przygotowano 10% zawiesiny próbek tkanki w płynie Hanka BSS suplementowanym antybiotykami, a wymazy z gardła i z nosa zanurzono w płynie Hanka BSS suplementowanym antybiotykami. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej zawiesiny oczyszczono
176 856 przez wirowanie przez 10 minut przy 6000 g, a supernatant przechowywano w -70°C do dalszego użytku. Frakcje leukocytów izolowano z krwi poddanej obróbce EDTA lub heparynowanej w sposób opisany poprzednio (Wensvoort and Terpstra, 1988) i przechowywano w -70°C. Osocze i surowicę do izolacji wirusa przechowywano w -70°C.
Surowicę do badań serologicznych uzyskano od macior podejrzanych o ostrą fazę MSD, surowicę sparowaną pobierano 3-9 tygodni później. Ponadto pobierano surowicę od doświadczalnie zainfekowanych świń SPF w regularnych odstępach oraz pobierano surowicę i smółkę od zainfekowanych doświadczalnie macior i ich prosiąt. Surowice do badań serologicznych przechowywano w -20°C.
Komórki
Świńskie makrofagi płucne uzyskiwano z płuc 5-6 tygodniowych świń SPF lub z płuc dorosłych macior SPF z własnego stada Centralnego Instytutu Weterynarii. Płuca przemywano pięć do ośmiu razy solanką buforrowaną fosforanem (PBS). Każdą wielokrotność płynu przemywającego zbierano i wirowano przez 10 minut przy 300 g. Uzyskaną paletkę komórkową przemywano ponownie w PBS i ponownie zawieszano w pożywce do hodowli komórkowych (160 ml pożywki 199, suplementowanej 20 ml 2,95% fosforanu tryptozy, 20 ml cielęcej surowicy płodowej (FBS) i 4,5 ml 1,4% węglanu sodu) do stężenia 4 x 107 komórek/ml. Następnie zawiesinę komórek mieszano powoli z równą objętością mieszaniny DMSO (6,7 ml powyższej pożywki, 1,3 ml FBS, 2 ml 97% dimetylosulfotlenku), podzielono na próbki do ampułek 2 ml i przechowywano w ciekłym azocie.
Makrofagi z jednej ampułki przygotowywano do hodowli komórkowej przez dwukrotne przemycie płynem Earle’a MEM i ponowne zawieszenie w 30 ml pożywki hodowlanej (MEM Earle’a, suplementowany 10% FBS, 200 j‘/ml penicyliny, 0,2 mg/ml streptomycyny, 100 j/ml mykostatyny i 0,3 mg/ml glutaminy). Komórki PK-15 (American Type Culture Collection, CCL33) i komórki SK-6 (kasza et al., 1972) namnażano w sposób opisany przez Wensvoorta et a. (1989). Wtórne komórki nerek świńskich (PK2) namnażano w MEM Earle’a, suplementowanym 10% FBS i powyższymi antybiotykami. Wszystkie komórki namnażano w boksie do hodowli komórkowych w 37°C i przy zawartości CO 2 w atmosferze 5%.
Procedury izolacji wirusa
Izolację wirusa przeprowadzono według ustalonych technik stosując komórki PK2, PK-15 i SK-6 oraz świńskie makrofagi płucne. Pierwsze trzy komórki namnażano w 25 ml kolbach (Greinera) i zaszczepiono próbką badaną, gdy monowarstwy osiągnęły stopień podpłynięcia równy 70-80%. Makrofagi wysiewano próbkami po 100 μ\ na 96-dołkowych płytkach do mikromiareczkowań (Greiner) lub w większych objętościach w odpowiednich kolbach i zaszczepiano próbką badaną w ciągu godziny od wysiania. Efekty ^opatyczne (CPE) w hodowlach obserwowano codziennie, a hodowle zamrożono w -70°C gdy CPE osiągnęły 50-70% lub po pięciu do dziesięciu dniach hodowli. Następnych pasaży dokonywano z rozmrożonym materiałem z pasażu poziomu 1 i 2 lub wyższego. Niektóre próbki zaszczepiano również dziewięcio- do dwunastodniowe zarodkowane jaja kurze. Dwa razy subszczepiono płyn alantoinowy, stosując przedział inkubacji trzy dni i badano komórki zebrane po trzecim pasażu za pomocą hemoaglutynacji w 4°C przy użyciu czerwonych ciałek krwi kurczaka oraz za pomocą testu ELISA wykrywającego swoiście nukleoproteinę wirusów grypy A (De Boer et al., 1990).
Serologia
Surowicę testowano w testach hamowania hemaglutynacji (HAI) w ceiu zbadania rozwoju przeciwciał przeciwko aglutynującemu wirusowi zapalenia mięśnia sercowego (HEV) i świńskiemu wirusowi grypy H1N1 i H3N2 według protokołu Masurela (1976). Wy'ściowe rozcieńczenia surowicy w HAI wynosiły 1:9, po czym surowice rozcieńczano dwukrotnie.
Surowicę badano za pomocą techniki enzymatycznego odczynu immunoadsorpcy'nego (ELISA) dla przeciwciał przeciwko glikoproteinie gl wirusa wścieklizny rzekomej (PRV; Van Oirschot et al., 1988), świńskiego parwowirusa (PPV;Westenbrink et al., 1989), wirusa biegunki bydlęcej (BVDV; Westenbrink et al., 1986) i wirusa pomoru świń (HCV;
176 856
Wensvoort et al., 1988). Wyjściowe rozcieńczenie w ELISA wynosiła 1:5, po czym surowicę rozcieńczano dwukrotnie.
Surowice badano na obecność przeciwciał zobojętniających przeciwko 30-300 TCID50 wirusów zapalenia mięśnia sercowego i opon mózgowych (EMCV), enterowirusów świńskich (PEV) i czynnika Lelystad (LA) zgodne z protokołem Terpstry (1978). Wyjściowe rozcieńczenia surowicy w testach zobojętniania surowicy (SNT) wynosiły 1:5, po czym surowice rozcieńczano dwukrotnie.
Surowiec testowano na wiązanie w LA w monowarstwowej technice immunoperoksydazowej (IPMA). Czynnik Lelystad (LA; kod CDI-NL-2,91) wysiewano na płytkach do mikromiareczkowania przez dodanie 50 ml pożywki hodowlanej, zawierającej 100 TCID50 do dołków płytki do mikromiareczkowań, zawierającej świeżo wysiane makrofagi płucne. Komórki namnażano przez dwa dni, a następnie utrwalono w sposób opisany (Wensvoort, 1986). Surowice testowe rozcieńczono w stosunku 1:10 w 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 80, 4% surowicy końskiej lub rozcieńczano dodatkowo w czterech etapach, dodano do dołków i następnie inkubowano przez jedną godzinę w 37°C. Owcze immunoglobuliny antyświńskie (Ig) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRPO, DAKO) rozcieńczano w tym samym buforze i stosowano w drugiej inkubacji przez jedną godzinę 37°C, po czym płytki zabarwiano w sposób opisany (Wensvoort et al., 1986). Intensywne czerwone zabarwienie cytoplazmy zainfekowanych makrofagów wskazywało na wiązanie surowicy do LA..
Procedury identyfikacji wirusa
Tożsamość izolatów cytopatycznych badano przez oznaczanie gęstości pławnej w CsCl, przez określanie wielkości cząstek w negatywowo zabarwionych preparatach za pomocą mikroskopii elektronowej, przez oznaczenie wrażliwości izolatu na chloroform i przez zobojętnianie CPE izolatu surowicą o znanej swoistości (tabela 3). Jeśli izolat był swoiście zobojętniany przez surowicę skierowaną przeciwko znanemu wirusowi, izolat był uważany za przedstawiciela tego znanego wirusa.
Izolaty wykazujące CPE w hodowlach makrofagów były również badane przez wybarwianie w technice IPMA z poinfekcyjną surowicą świń c 829 lub b 822. Izolaty zaszczepiano ponownie na hodowlach makrofagów i utrwalano 2 dnia po zaszczepieniu zanim izolat wykazał CPE. Jeśli izolat wykazywał reaktywność w technice IPMA z poinfekcyjną surowicą świń c 829 lub b 822, uznawany był za przedstawiciela czynnika Lelystad. Przedstawiciele innych izolatów namnażanych na makrofagach lub makrofagi niezainfekowane byli również zabarwiani z tą surowicą w celu sprawdzenia swoistości surowicy. Dodatkowa identyfikacyjna czynnika Lelystad.
Czynnik Lelystad był następnie badany przez hemaglutynację w 4°C i 37°C z czerwonymi ciałkami krwi kurczaka, świnki morskiej, świni, owcy lub ludzkimi. Jako kontrolę dodatnią w badaniach hemaglutynacyjnych SIV zastosowano podgatunek H3N2.
Wiązanie surowicy odpornościowej świńskiej swoiście skierowanej przeciwko wirusowi wścieklizny rzekomej (PRV), zakaźnym enterowirusom przewodu pokarmowego (TGE), wirusowi epidemicznej biegunki świń (PED), aglutynującemu wirusowi zapalenia mięśnia sercowego (HEV), wirusowi gorączki afrykańskiej świń (ASFV), wirusowi pomoru świń (HCV) i wirusowi grupy świń (SIV) typ H1N1 i H3N2, surowicy odpornościowej bydlęcej swoiście skierowanej przeciwko bydlęcym wirusom opryszczki typu 1 i 4(BHV 1 i 4), wirusowi influenzy koni (MCF), wirusowi grypy rzekomej 3 (PI3), wirusowi RS bydła (BRSV) i wirusowi białaczki bydlęcej (BLV), oraz surowicy ptasiej skierowanej swoiście przeciwko wirusowi białaczaki ptasiej (ALV) i wirusowi zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV) badano w swoistych dla IG gatunkowego koniugatach HRPO techniką IPMA na zainfekowanych LA i niezainfekowanych świńskich makrofagach płucnych jak opisano powyżej.
Badano również techniką IPMA surowice odpornościowe różnych gatunków sierowane przeciwko wirusowi świnki, wirusowi Sendai, wirusowi nasówki, wirusowi księgosuszu, wirusowi odry, wirusowi zapalenia płuc myszy, bydlęcemu wirusowi RS, wirusowi wścieklizny, wirusowi spienionemu, wirusowi maedi i visna, kociemu i małpiemu wirusowi niedoboru odpornościowego, wirusowi limfocytowego zapalenia opon i splotów naczyniowych, kociemu wirusowi zakaźnego zapalenia otrzewnej, mysiemu wirusowi zapalenia wątroby,
176 856 wirusowi Breda, wirusowi Hantaan, wirusowi choroby Nairobi owiec, wirusom wschodniego, wenezuelskiego i zachodniego końskiego zapalenia opon mózgowych i rdzenia, wirusowi różyczki, wirusowi zapalenia tętnicy koni, wirusowi dehydrogenazy mleczanowej, wirusowi żółtej febry, wirusowi kleszczowego zapalenia mózgu i wirusowi zapalenia wątroby typu B.
LA pasażowano na ślepo w komórkach PK-2, PK-15 i SK-6 oraz w zarodkowanych jajach kurzych. Po dwóch pasażach materiał zaszczepiano ponownie na hodowlach świńskich makrofagów płucnych w ceiu ponownego wyizolowania LA.
Oznaczenie miana LA przeprowadzano w świńskich makrofagach płucnych przed i po przejściu przez filtr 0,2 mikrometra (Schleicher and Schuell). LA wykrywano techniką IPMA i poprzez jego CPE. Miana obliczano według Reeda i Muencha (1938).
Następnie przygotowano surowicę odpornościową świnką skierowaną przeciwko LA. Dwie świnie SPF (21 i 23) zainfekowano donosowo LA z piątego pasażu w hodowli komórkowej w ilości 105 TCIDso- Dwie świnie (25 i 29) zainfekowano donosowo świeżo sporządzoną zawiesiną płuc prosiąt SPF zainfekowanych LA, zawierającą 105 TCID50. Próbki krwi pobierano w 0,14, 28 i 42 dni po zainfekowaniu (dpi).
Następnie namnażano LA w świńskich makrofagach pęcherzykowych w celu oznaczenia jego charakteiystyki wzrostu w czasie. Świńskie makrofagi pęcherzykowe posiewano w kolbach F25 (Greiner), infekowano LA w ilości 0,01 TCID50 na komórkę. W 8,16,24,32, 40,48,56 i 64 godzin po infekcji badano jedną kolbę i oznaczano' procent CPE w stosunku do niezainfekowpnej hodowli kontrolnej. Następnie pożywkę hodowlaną zbierano i zastępowano równą objętością solanki buforowanej fosforanem. Pożywkę i kolbę przechowywano w -70°C. Po zebraniu wszystkich hodowli oznaczano miana LA i wyrażano je jako log TCID50 ml’1.
Morfologię LA badano za pomocą mikroskopii elektronowej. LA hodowano jak opisano powyżej. Po 48 h hodowle zamrożono i rozmrożono i wirowano przez 10 minut przy 6000 g. Następnie 30 ml supematanta zmieszano z 0,3 ml surowicy świńskiej swoistej dla LA i mkubowano przez 1,5 h w 37°C. Po wirowaniu przez 30 min. przy 125000 g uzyskane peletki zawieszono w 1% Seakem agarozie ME w solance buforowanej fosforanem w 40°C. Po koagulacji blok agarozowy zanurzono w 0,8% aldehydzie glutarowym i 0,8% tetratlenku osmu (Hirsch et al., 1968) w buforze weronal/octan o pH 7,4 (230 mOsm/kg H2O) i utrwalono promieniowaniem mikrofalowym. Procedurę tę powtórzono raz ze świeżym utrwalaczem. Próbkę przemyto wodą, zanurzono w 1% octanie uranylu i wybarwiano promieniowaniem mikrofalowym. We wszystkich etapach próbkę utrzymywano w 0°C, a urządzenie mikrofalowe (Samsung RE211D) było ustawione na rozmrażanie na 5 minut. Cienkie skrawki przygotowano standartowymi technikami, wybawiono cytrynianem ołowiu (Venable et al., 1965) i badano stosując mikroskop elektronowy Philips CM 10.
Kontynuowano izolowanie LA z surowic świńskich pochodzących z przypadków MSD. Próbki surowicy pochodziły z Holandii (przypadek połowy Holandia 2), Niemiec (przypadek połowy Niemcy 1 i Niemcy 2; dzięki uprzejmości Dr Bemer z Monachium i dr Nienhoff z Munster) oraz ze Stanów Zjednoczonych (przypadek eksperymentalny Stany Zjednoczone 1 (eksperyment przeprowadzano z ATCC VR-2332; dzięki uprzejmości dr Collins z St. Paul i dr Chladek z St. Joseph) oraz z przypadków polowych Stany Zjednoczone 2 i Stany Zjednoczone 2; dzięki uprzejmości dr van Alstine z West 1Lpfayette i dr Slife z Galeburg. Wszystkie próbki przesłano do Centraal Diergenee^skundig Instituut, lelystad w celu zdiagnozowania LA. Wszystkie próbki użyto do izolacji wirusa na świńskich makrofagach pęcherzykowych w sposób opisany powyżej. Izolaty cytopatyczoe pasażowano trzy razy i zidentyfikowano jako LA przez swoistą immunorekację barwną z anty-LA po infekcp surowicą b 822 i c 829.
Badano również zależności antygenowe izolatów NL1 (pierwszy izolat LA; kod DCINL-2,91), NL2, GE1, GE2, US1, US2 i US3. Izolaty nam^ża^ w makrofagach w sposób opisany powyżej i badano techniką IPMA z zestawem surowic uzyskanych w warunkach naturalnych oraz dwoma zestawami suriwc doświadczalnych. Surowice badano również techniką IPMA z makrofagami oiezaiofekowaoymi.
176 856
Surowice uzyskane w warunkach naturalnych (polowe) były następujące: Dwie surowice seropozytywne na LV (TH-187 i TO-36) wybrano z zestawu LA-pozytywnych holenderskich surowic polowych. Dwadzieścia dwie surowice wybrano z surowic polowych przesłanych do Lelystad z zagranicy do diagnozy serologicznej. Surowice pochodziły z Niemiec (BE-352, BE-392 i NI-f2; dzięki uprzejmości de Berner i Monachium i dr Nienhoff z Munster), Wielkiej Brytanii (PA-141615, PA-141617 i PA-142440); dzięki uprzejmości dr Paton, Weybridge), Belgii (PE-1960; dzięki uprzejmości prof, Pensaert z Gent), Francji (EA-2975 i EA-2985; dzięki uprzejmości Dr Albina z Ploufragan), Stanów Zjednoczonych (SL-441, SL-451, AL-RP9577, AL-P10814/33, A1-4994A, AL-7525, JC-MN41, JC-MN44 i JC-MN45; dzięki uprzejmości dr Slife z Galesburg, dr van Alstine z West Lafayette i dr Collins z St. Paul) oraz z Kanady (RB-16, RB-19 i RB-23; dzięki uprzejmości dr Robinson z Quebec).
Surowice doświadczalne były następujące: Powyżej opisany zestaw surowic świńskich pobranych w 0,14,28 i 42 dni po zakażeniu. Zestaw surowic doświadczalnych (otrzymanych dzięki uprzejmości dr Chładek z St. Joseph i dr Collins z St. Paul), które pochodziły od sześciomiesięcznych loszek, prowokowanych izolatem ATCC VR-2332 w ilości W5' TCID50. Próbki krwi pobrano od loszki 2B w 0,20,36 i 63 dni po zakażeniu; od loszki 9B w 0,30, 44 i 68 dni po zakażeniu; od loszki 16W w 0, 25, 40 i 64 dni po zakażeniu; a od loszki 16Y w 0, 36 i 64 dni po zakażeniu.
Do badań białek LA w zainfekowanych świńskich makrofagach pęcherzykowych metodą radioimmunoprecypitacji (RIP; de Mazancourt et al., 1986) makrofagi zainfekowane LA i niezainfekowane namnażano przez 16 godzin w obecności znakowanej pożywki, zawierającej 35S-cysteinę. Następnie znakowane komórki zgodnie ze standartowymi metodami precypitowano z surowicą pobraną 42 dni po infekcji (42 dpi) świni b 822 i świni 23 oraz z surowicą MN8, otrzymaną 26 dni po zainfekowaniu maciory izolatem ATCC VR-2332 (dzięki uprzejmości dr Collins z St. Paul). Wytrącone białka analizowano za pomocą elektroforezy w 12% żelu SDS-PAGE i wizualizowano przez fluorografię.
W ceiu scharakteryzowania genomu LA ekstrahowano DNA jądrowe i RNA cytoplazmatyczne z hodowli makrofagów zainfekowanych LA i namnażanych przez 24 godziny lub hodowli nieinfekowanych. Pożywkę hodowli komórkowej odrzucano, a komórki przemywano dwukrotnie solanką buforowaną fosforanem. DNA ekstrahowano w opisany sposób (Strauss, 1987). RNA cytoplazmatyczne ekstrahowano w opisany sposób (Favaloro et al., 1980), oczyszczano przez wirowanie w 5,7 M CsCl (Setzer et al., 1980), działanie DNazą pozbawioną RNazy (Pharmacia) i analizowano na 0,8% obojętnym żelu agarozowym (Moormann and Hulst, 1988).
Klonowanie i sekwencjonowanie
W ceiu sklonowania RNA czynnika LV wewnątrzkomórkowy RNA świńskich pęcherzykowych makrofagów płucnych zainfekowanych LV (10 μ g) inkubowano z 10 mM wodorotlenku metylortęciowego przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Zdenaturowany DNA inkubowano w 42°C z 50 mM Tris-Hcl, pH 7,8,10 mM MgCh, 70 nM KCl, 0,5 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 0,6 gg primerów oligonukleotydowych z grasicy cielęcej pd(N)6 (Pharmacia) i 300 jednostkami odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki mysiej Moloney (Bethesda Research Laboratories) w łącznej objętości 100μ 1. Po 1 godzinie dodano 20 mM EDTA; następnie mieszaninę reakcyjną ekstrahowano mieszaniną fenol/chloroform, przepuszczono przez kolumnę Sefadeks G50 i wytrącono etanolem.
Do syntezy drugiej nici cDNA użyto polimerazę DNA I (Boehringer) i RNazę H (Pharmacia) (Gubler and Hoffman, 1983). W ceiu wytworzenia tępych końców dwuniciowy cDNA inkubowano z polimerazę DNA faga T4 (Pharmacia) w mieszaninie reakcyjnej, która zawierała 0,05 mM trifosforanów deoksynukleotydowych. Następnie cDNA frakcjonowano w 0,8% obojętnym żelu agarozowym (Moorman and Hulst, 1988). Fragmenty o długości 1 do 4 kb eluowano metodą elektroforezy, ligowano z miejscem Smal plazmidu pGEM-4Z (Promega) i użyto do transformacji szczepu Escherichia coli DH5a (Hanahan, 1985), Filtry z koloniami poddano hybrydyzacji ze znakowaną 32P sondą z jednoniciowego cDNA. Sondę poddano odwrotnej transkrypcji z RNA czynnika LV, frakcjonowanym na
176 856 obojętnym żelu agarozowym (Moormann and Hulst, 1988). Przed użyciem sondę z jednoniciowego DNA inkubowano z cytoplazmatycznym RNA ze sztucznie zainfekowanych pęcherzykowych makrofagów płucnych.
Zależność między klonami cDNA LV ustalono za pomocą analizy restrykcyjnej i przez hybrydyzację techniką przeniesienia Southema trawionego DNA z sondami cDNA znakowanymi metodą translacji nacięć (Sambrook et al., 1989).
Dla uzyskania końca 3' genomu wirusowego skonstruowano wtórną bibliotekę cDNA, stosując oligo(dt)12-18 i oligonukleotyd swoisty dla końca i 3' czynnika Lv, który był komplementarny do nici minus genomu wirusowego jako primer w reakcji pierwszej nici. Warunki reakcji syntezy pierwszej i drugiej nici były identyczne jak warunki opisane powyżej. Bibliotekę tę poddano skriningowi za pomocą sond oligonukleotydowych specyficznych dla końca 3' wirusa.
Większość (>95%) sekwencji cDNA oznaczono za pomocą sekwencera DNA Automated Laser Fluorescent A. L. F. ™ z firmy Pharmacia LKB. Sekwencjonowanie z użyciem fluorescencyjnych primerów oligonukleotydowych przeprowadzono na dwuniciowym DNA, stosując zestaw sekwencjonujący AutoRead™ (Pharmacia) zgodnie z procedurami C i D, opisanymi w protokole do zestawu sekwencjonującego AutoRead™. Primery fluorescencyjne przygotowano stosując FluorePrime™ (Pharmacia). Pozostałą część sekwencji oznaczono poprzez sekwencjonowanie dwuniciowego DNA, stosując primery oligonukleotydowe w połączeniu z zestawem sekwencjonującym opartym na polimerazie T7 (Pharmacia) i α-32S-dATP (Amersham). Wyniki sekwencjonowania analizowano stosując programy do analizy sekwencji PCGENE (Intelligenetics, Inc, Mountain View, USA) i FASTA (Pearson and Lipman, 1988).
Doświadczalne odtworzenie MSD
Czternaście hodowanych w sposób konwencjonalny macior w 10-11 tygodniu ciąży zbadano na obecność przeciwciał przeciwko LA techniką IPMA. Wszystkie wyniki były negatywne. Następnie utworzono dwie grupy po cztery maciory i przeniesiono do CVI. W 12 tygodniu ciąży maciory te zaszczepiono donosowo 2 ml LA (pasaż 3, miano 104’8 TCID 5o/ml). 10 dnia po zaszczepieniu pobrano próbki surowicy i krwi EDTA. Pobraną ilość pożywienia, temperaturę w odbycie i inne objawy kliniczne obserwowano codziennie. Przy porodzie zapisywano datę urodzin oraz ilość martwych i żywych prosiąt dla każdej maciory oraz pobierano próbki do izolacji wirusa i badań serologicznych.
Wyniki.
Immunofluorescencja
Skrawki tkankowe od świń chorych na MSD barwiono techniką IFT za pomocą koniugatów FITC skierowanych przeciwko wirusowi afrykańskiej choroby świń, wirusowi pomoru świń, wirusowi wścieklizny rzekomej, świńskiemu parwowirusowi, wirusowi grypy świń, wirusowi zapalenia mięśnia sercowego świń i wirusowi chlamydia psitacci. Skrawki barwiono, badano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i stwierdzono, że wszystkie wyniki były negatywne. Izolacja wirusa od świń z farm dotkniętych MSD
Izolaty cytopatyczne wykryto w hodowlach makrofagów zaszczepionych próbkami tkanek pobranych od dwu- do dziesięciodniowych prosiąt. Szesnaście z 19 prosiąt pochodzących z pięciu farm miało wyniki pozytywne (tabela 1A). Wszystkie te izolaty reagowały w technice IPMA z poinfekcyjną surowicą świń c 829, natomiast niezaszczepione hodowle kontrolne nie reagowały. Izolaty były zatem reprezentatywne dla LA. Jeden raz wykryto izolat cytopatyczny w hodowli komórkowej SK-6, zaszczepionej zawiesiną wymazu z jamy ustnej prosięta z farmy szóstej (farma VE) (tabela 1A). Izolat ten wykazywał charakterystykę pikornawirusów i był zobojętniany przez surowicę swoistą dla PEV 2, zatem izolat ten zidentyfikowano jako PEV 2 (tabela 3). Komórki PK2, PK-15 i jaja kurze zaszczepione próbkami z tej grupy pozostały negatywne przez cały czas.
Izolacja wirusa od macior z farm dotkniętych MSD
Izolaty cytopatyczne wykryto w hodowlach makrofagów zaszczepionych próbkami pobranymi od macior dotkniętych MSD. 41 z 63 macior pochodzących z 11 farm miało wyniki pozytywne (tabela 1B). Wszystkie te izolaty reagowały w technice IPMA z poinfe176 856 kcyjną surowicą świń b 822, były zatem reprezentatywne dla LA. Jeden raz wykryto izolat cytopatyczny w hodowli komórkowej PK2, zaszczepionej zawiesiną frakcji leukocytów od maciory z farmy HU (tabela 1B). Izolat ten wykazywał charakterystykę pikomawirusów i był zobojętniany przez surowicę swoistą dla EMCV, zatem izolat ten zidentyfikowano jako EMCV (tabela 3). Komórki SR-6, PK-15 i jaja kurze zaszczepione próbkami z tej grupy pozostały negatywne. Izolacja wirusa od świń SPF pozostających w kontakcie z maciorami dotkniętymi MSD.
Izolaty cytopatyczne wykryto w hodowlach makrofagów zaszczepionych próbkami pobranymi od świń SPF, pozostających w kontakcie z maciorami dotkniętymi MSD. Cztery z 12 świń miało wyniki pozyyywne (tabela 2). Wszystkie te izolaty reagowały w technice IPMA z poifekcyjną surowicą świni c 829 i świni b 822 i były zatem reprezentatywne dla LA. Izolaty cytopatyczne wykryto również w hodowlach komórkowych PK-2, PK-15 i SK-6, zaszczepionych próbkami od tych świń SPF. Siedem z 12 świń miało wyniki pozytywne (tabela 2), a wszystkie izolaty były zobojętniane przez surowicę skierowaną przeciwko PEV 7. Jeden z tych siedmiu izolatów był badany dalej, a inne charakterystyki również zidentyfikowały izolat jako PEV 7 (tabela 3).
Izolacja wirusa ze świń SPF szczepionych krwią pochodzącą od macior dotkniętych MSD.
Izolaty cytopatyczne wykryto w hodowlach makrofagów zaszczepionych próbkami pobranymi od świń SPF, które zaszczepiono krwią od macior dotkniętych MSD. Dwie z ośmiu świń miało wyniki pozytywne (tabela 2). Wszystkie te izolaty reagowały w technice IPMA z poinfekcyjną surowicą świni c 829 i świni b 822 i były zatem reprezentatywne dla LA. Komórki PK-2, PK-15 i SK-6, zaszczepione próbkami od tej grupy pozostały negatywne.
Podsumowując, badaniom na obecność czynników, które mogły być kojarzone z tajemniczą chorobą świń (MSD), poddano cztery grupy świń.
W grupie pierwszej, to jest w grupie prosiąt dotkniętych MSD, czynnik Lelystad (LA) wyizolowano z 16 do 20 prosiąt; jeden raz wyizolowano PEV 2.
W grupie drugiej, to jest w grupie macior dotkniętych MSD, czynnik Lelystad wyizolowano z 41 z 63 macior; jeden raz wyizolowano EMCv. Ponadto u 123 z 165 macior dotkniętych MSD zaobserwowano za pomocą techniki IPMA serokonwersję do czynnika Lelystad. Taka masowa serokonwersja nie była obserwowana przy żadnym innym z badanych patogenów.
W grupie trzeciej, to jest w grupie świń SPF pozostających w kontakcie z maciorami dotkniętymi MSD, LA wyizolowano z czterech z 12 świń; PEV 7 wyizolowano z siedmiu świń. U wszystkich 12 świń zaobserwowano serokonwersję do LA i PEV 7.
W grupie czwartej, to jest w grupie świń SPF zaszczepionych krwią macior dotkniętych MSD, LA wyizolowano od dwóch świń. U wszystkich ośmiu świń zaobserwowano serokonwersję do LA.
Serologia macior z farm dotkniętych MSD.
Sparowane surowice od macior dotkniętych MSD badano przeciwko szeregowi patogenów wirusowych i przeciwko izolatom otrzymanym podczas tych badań (tabela 4). Większość odpowiedzi przeciwciał skierowanych przeciwko LA mierzono techniką IPMA (75% macior zareagowało serokonwersją, serokonwersję stwierdzono z 23 z 26 farm) podczas gdy nie stwierdzono wyraźnej serokonwersji w przypadku żadnego innego patogenu wirusowego. Przeciwciał zobojętniających skierowanych przeciwko LA nie wykryto.
Serologia świń SPF, pozostających w kontakcie z maciorami dotkniętymi MsD.
U wszystkich ośmiu świń SPF zaobserwowano w technice IPMA odpowiedź przeciwciał przeciwko LA (tabela 5). Żadna z tych surowic nie była seropozytywna w badaniu techniką IPMA przeprowadzoną na makrofagach niezainfekowanych. Żadna z tych surowic nie była sero-pozytywna w badaniu techniką SNT dla LA. Surowice pobrane w dwa tygodnie po kontakcie miały wysokie miana przeciwciał zobojętniających (>12801) przeciwko PEV 7, natomiast surowice pobrane przed infekcją były negatywne (>10), co wskazuje na to, że wszystkie świnie były również zainfekowane PEV 7.
176 856
Serologia świń SPF zaszczepionych krwią macior dotkniętych MSD.
Wszystkie z ośmiu świń SPF wykazywały w technice IPMa odpowiedź przeciwciał przeciwko LA (tabela 5). Żadna z surowic nie była serępozytywna w technice IPMA przeprowadzonej na makrofagach niezainfekowanych. Żadna z tych surowic nie była pozytywna dla LA w technice SNT. Surowice pobrane przed zaszczepieniem i w dwa tygodnie po zaszczepieniu były negatywne (>10) przeciwko PEV 7.
Dalsza identyfikacja czynnika Lelystad
LA nie aglutynował z czerwonymi krwinkami kurczaka, świnki morskiej, świni, owcy łub ludzkimi grupy 0.
LA nie reagował w technice IPMA z surowicami przeciwko PRV, TGE, PED, ASFV, etc.
Po dwóch ślepych pasażach LA nie namnażał się w komórkach PK2, PK-15 lub SK-6 ani w zarodkowanych jajach kurzych, zaszczepionych drogą alantoinową.
LA był ciągle zakaźny po przefiltrowaniu przez filtr 0,2 mikrometra, miana przed i po .filtracji oznaczone techniką IPMA wynosiły 10505 i 105’3 TCID50.
Krzywe wzrostu dla LA (patrz fig. 3). Maksymalne miana wirusa pozbawionego komórek wynosiły w 32-48 h po zaszczepieniu około 105*5 TCID50 ml'1. Po tym czasie makrofagi były zabijane przez efekt cytopatyczny LA.
Mikroskopia elektronowa. Stwierdzono obecność klasterów sferycznych cząstek LA. Cząstki miały średnicę 45-55 nm i zawierały nukleokapsyd o wielkości 30-35 nm, który był otoczony dwuwarstwową membraną lipidową. W zainfekowanych hodowlach, na które działano surowicą negatywną lub w negatywnych preparatach kontrolnych cząstek LA me wykryto.
Izolaty z Holandii, Niemiec i Stanów Zjednoczonych. Wszystkie siedem izolatów wyizolowano ze świńskich makrofagów pęcherzykowych i posażowano trzy do pięciu razy. Wszystkie izolaty powodowały efekt cytopatyczny w makrofagach i mogły być swoiście immunobarwione surowicą anty-LAb 822 i surowicą 23 42 dpi. Izolaty nazwano NL2, GE1, GE2, US1, US2 i US3.
Zależności antygenowe izolatów NL1, NL2, GE1, GE2, GE3, US1, US2 i US3. Żadna z surowic uzyskanych w warunkach naturalnych nie reagowała w technice IPMA z makrofagami niezainfekowanymi, ale wszystkie surowice zawierały przeciwciała skierowane przeciwko jednemu lub więcej z siedmiu izolatów (tabela 7). Żadna z surowic doświadczalnych nie reagowała w technice IPMA z makrofagami niezainfekowanymi i żadna z surowic doświadczalnych zebranych po 0 dpi nie reagowała z żadnym z siedmiu izolatów w technice IPMA (tabela 8). Wszystkie z siedmiu izolatów LS reagowały ze wszystkimi lub z większością surowic z zestawu doświadczalnych surowic świń 21, 23, 25 i 29, pobranych po 0 dpi. Jedynie izolaty US1, US2 i US3 reagowały ze wszystkimi lub z większością surowic z zestawu surowic doświadczalnych od loszek 2B, 9G, 16W i 16Y, pobranych po 0 dpi.
Badania metodą radioimmunoprecypitacji. Siedem białek swoistych dla LA wykryto w makrofagach zainfekowanych LA, precypitowanych z surowicą świń b 822 i 23 pobraną po 42 dpi, ale nie wykryto ich w makrofagach niezainfekowanych. Przybliżony ciężar cząsteczkowy białek wynosił 65,39,35,26,19,16 i 15 kilodaltonów. Jedynie dwa z tych białek swoistych dla LA, to jest białka o ciężarze 16 i 15 kilodaltonów, były również wytrącone przez surowicę MN8 pobraną po 26 dpi.
Sekwencja i organizacja genomu LV
Naturę genomu LV ustalano, analizując DNA i RNA z zainfekowanych makrofagów świńskich pęcherzyków płucnych. Nie wykryto DNA swoistego dal LV. Wykryto natomiast RNA swoisty dla LV. W 0,8% obojętnym żelu agarozowym RNA LV migrował nieco wolniej niż preparat RNA wirusa pomoru świń o ciężarze 12,3 kb (Moorman et al., 1990). Chociaż na obojętnych żelach agarozowych nie można przeprowadzić dokładnych pomiarów wielkości, oszacowano, że długość swoistego RNA LV wynosi około 14,5 do 15,5 kb.
Dla oznaczenia złożoności RNAs swoistych dla LV w zainfekowanych komórkach i ustalenia sekwencji nukleotydów w genomie LV przygotowano cDNA i RNA zainfekowanych LV makrofagów świńskich pęcherzyków płucnych oraz dokonano selekcji i mapowa176 856 nia w sposób opisany w rozdziale Materiały i Metody. Swoistość klonów cDNA potwierdzono dodatkowo przez hybrydyzację swoistych klonów, umiejscowionych w nakładającej się sekwencji cDNA, z otrzymanymi techniką przeniesienia Northerna plamami RNA z makrofagów zainfekowanych LV i niezainfekowanych. Niektóre z klonów cDNA w wysokim stopniu hydrydyzowały z RNA o długości 14,5 do 15,5 kb wykrytymi tylko w zainfekowanych makrofagach, natomiast inne hybrydyzowały z RNA o długości 14,5 do 15,5 kb, jak również z zestawem 4 lub 5 RNAs o niższym ciężarze cząsteczkowym (przybliżona wielkość 1 do 4 kb). Klony z drugiej grupy były zgrupowane przy jednym końcu mapy cDNA i pokrywały około 4 kb DNA. Dane te zasugerowały, że organizacja genomu LV może być podobna do organizacji genomu koronawirusów (Spaan et al., 1988), genomu wirusa Berne (BEV; Snijder et al., 1990b), torowirusów i wirusa EAV (de Vries et al., 1990), to jest oprócz RNA genomowego istnieją subgenomowe mRNAs, które tworzą zagnieżdżony zestaw ulokowany przy końcu 3' genomu. Założenie to zostało potwierdzone gdy dostępne stały się sekwencje klonów cDNA i mogły być wyselekcjonowane swoiste primery do sondowania plam. Zestawienie danych hybrydyzacji otrzymanych dla klonów cDNA i swoistych primerów, które były hybrydyzowane z plamami otrzymanymi techniką przeniesienia typu Northern, niosącymi RNA makrofagów zainfekowanych LV i makrofagów niezaifekowanych, są pokazane na fig. 2. Klony 12 i 20, które są umiejscowione odpowiednio w części 5' i w środku sekwencji, ulegają hybrydyzacji z genomowym RNA o długości 14,5 do 15,5 kb, wykrytym tylko w komórkach zainfekowanych. Klony 41 i 39 rozpoznają jednakże genomowy RNA o długości odpowiednio 14,5 do 15,5 kb i zestaw RNAs 4 i 5 o niższym ciężarze cząsteczkowym. Najbardziej pouczający i rozstrzygający schemat hybrydyzacji otrzymano jednak z primerem 25, który jest umiejscowiony przy najdalszym końcu 5' w sekwencji LV (porównaj fig. 1). Primer 25 ulega hybrydyzacji z układem 7 RNAs o przybliżonym ciężarze cząsteczkowym w zakresie od 0,7 do 3,3 kb (mRNAs subgenomowe), jak również z genomowym RNA. Najbardziej prawdopodobnym wyjaśnieniem schematu hybrydyzacji primera 25 jest to, że koniec 5' sekwencji genomowych, których długość nie jest jeszcze znana, sprzęga się z główną częścią mRNAs, które są transkrybowane od końca 3' genomu. Rzeczywiście, schemat hybrydyzacji uzyskany z primerem 25 sugeruje, że koniec 5' sekwencji genomowu działa jako tak zwana sekwencja liderowa w subgenomowych RNAs. Taki wzorzec transkrypcji jest znamieniem replikacji coronaviridiae (Spaan et al., 1988) i EAV (de Vries et a., 1990).
Jedyną znaczącą różnicą między LV a EAV, która jest widoczna na podstawie powyższych danych jest to, że genom LV jest o około 2,5 kb większy niż genom EAV.
Zgodna sekwencja nukleotydów nakładających się klonów cDNA jest pokazana na fig. 1. Długość sekwencji wynosi 15088 par zasad, co jest zgodne z ustaloną wielkością genomowego RNA LV.
Ponieważ biblioteka cDNA dla LV została sporządzona przez przypadkowe primowanie reakcji odwrotnej transkryptazy z primerami pd(N)6 z grasicy cielęcej, nie otrzymano żadnych klonów cDNA rozpoczynających się odcinkiem poly-A na końcu 3'. Dla sklonowania końca 3 ' genomu wirusowego skonstruowano drugą bibliotekę cDNA, stosując w reakcji odwrotnej transkryptazy oligo (dT) i primer 39U183R. Primer 39U183R jest komplementarny do nici minus RNA LV, która jest prawdopodobnie obecna w preparacie RNA, wyizolowanym z komórek zainfekowanych LV. Biblioteka ta została poddana skriningowi sondami sowistymi dla wirusa (klon cDNA 119, otrzymany metodą translacji nacięć i oligonukleotyd 119R64R), w wyniku czego wyizolowano pięć dodatkowych klonów cDNA (na przykład klon cDNA 151, fig. 2). Sekwencjonowanie tych klonów cDNA wykazało, iż Lv zawiera na końcu 3' ogon poly(A). Długość ogona poly(A) jest różna w różnych klonach cDNA, ale maksymalna jego długość wynosi dwadzieścia nukleotydów. Oprócz klonów 25 i 155 (fig. 2) wyizolowano cztery dodatkowe klony cDNA na końcu 5' genomu, które były tylko o dwa do trzech nukleotydów krótsze niż najdalszy nukleotyd 5' pokazany na fig. 1. Mając to odkrycie oraz sposób syntezy cDNA założono, że koniec 5' sekwencji genomowego RNA LV jest bardzo blisko.
176 856
Prawie 75% sekwencji genomu LV koduje ORF 1A i ORF 1B. ORF 1A rozpoczyna się prawdopodobnie przy pierwszym kodonie AUG (pozycja nukleotydu 212, fig. 1) spotkanym w sekwencji LV. Koniec C ORF 1A nakłada się na przypuszczalny N-koniec ORF 1B na krótkim odcinku o długości 16 nukleotydów. Wydaje się zatem, że translacja ORF 1B przebiega poprzez zmianę rybosomowej fazy odczytu, co jest cechą charakterystyczną sposobu translacji genu polimerazy lub replikazy koronawirusów (Boursnell et al., 1987; Bredenbeek et a., 1990) i torowirusa BEV (Snijder et al., 1990a). Obecność charakterystycznej pseudowęzłowej struktury DNA, która jest przewidywana w miejscu zmiany rybosomowej fazy odczytu stwierdzana jest również w tym miejscu w sekwencji LV (wyników nie przedstawiono).
ORF 1B koduje sekwencję aminokwasów o długości prawie 1400 reszt, która jest dużo mniejsza niż dla ORF 1B koronawirusów MHV i IBV (około 3700 reszt amino kwasowych; Bredenbeek et al., 1990; Boursnell et al., 1987) i wirusa BEV (około 2300 reszt aminokwasowych; Snijder et al., 1990a). Charakterystyczne cechy ORF IB członków superrodziny coronaviridiae, takie jak motyw replikazy i domena typu zinc finger można również stwierdzić w ORF IB czynnika LV (wyników nie przedstawiono).
Podczas gdy ORF 1A i ORF 1B kodują polimerazę wirusową i w związku z tym uważa się, że kodują niestrukturalne białko wirusowe, to uważa się, że ORF 2 do 7 kodują strukturalne białka wirusowe.
Produkty ORF 2 do 6 wykazują cechy właściwe dla białek membrany (otoczki). ORF 2 koduje białka złożone z 249 aminokwasów, zawierające dwa przewidywane miejsca N-glikozylacji (tabela 9). Na końcu N zidentyfikowano sekwencję hydrofobową, która może działać jako tak zwana sekwencja sygnałowa. Koniec C również zakończony jest sekwencją hydrofobową, która w tym przypadku może działać jako region transmembranowy, który kotwiczy produkt ORF 2 w membranie otoczki wirusowej.
ORF 3 może zaczynać się przy kodonie AUG rozpoczynającym się przy pozycji nukleotydu 12394 lub przy kodonie AUG rozpoczynającym się w pozycji nukleotydu 12556 i koduje zatem białka składające się odpowiednio z 265 i 211 aminokwasów. Białko złożone z 265 reszt zawiera siedem przypuszczalnych miejsce N-glikozylacji, natomiast białko złożone z 211 reszt zawiera cztery miejsca N-glikozylacji (tabela 9). Przy końcu N białka złożonego z 265 reszt zidentyfikowano sekwencję hydrofobową.
Analiza hydrofobowości usprawiedliwia stwierdzenie, że topologia białka kodowanego przez ORF 4 jest podobna do topologii białka kodowanego przez ORF 2, jeśli produkt ORF 4 rozpuszcza się przy kodonie AUG startującym z pozycji nukleotydu 12936. Jednakże ORF 4 może również rozpoczynać się przy dwóch innych kodonach AUG (porównaj fig. 1 i 2), startujących odpowiednio z pozycji sekwencji 12981 i 13068. Dotychczas nie jest jasne, który kodon startowy jest wykorzystywany. Zależnie od użytego kodonu startowego, ORF 4 może kodować białko o 183 aminokwasach, zawierające cztery przypuszczalne miejsca N-glikozylacji, białko o 168 aminokwasach zawierające cztery przypuszczalne miejsca N-glikozylacji lub białko o 139 aminokwasach, zawierające trzy przypuszczalne miejsca N-glikozylacji (tabela 9).
ORF 5 przypuszczalnie koduje białko o 201 aminokwasach, mające dwa przypuszczalne miejsca N-glikozylacji (tabela 9). Charaktetystyczną cechą produktu ORF 5 jest wewnętrzna sekwencja hydrofobowa między aminokwasem 108 a aminokwasem 132.
Analiza odległości segmentów membrany i hydrofobowości produktu ORF 6 wykazuje, że zawiera on trzy transmembranowe segmenty rozdzielające w 90 N-końcowych aminokwasach swojej sekwencji. Ta istotna cecha jest również charakterystyczna dla małej glikoproteiny M lub El otoczki szeregu koronawirusów, na przykład wirusa zakaźnego zapalenia oskrzeli (IBV); Boursnell et al., 1984) i wirusa mysiego zapalenia wątroby (MHV; Rottier et al., 1986). Przewiduje się zatem, że białko kodowane przez ORF6 ma topologię otoczki analogiczną jak białko M lub El koronawirusów (Rottier et al., 1986). Drugą charakterystyką białka M lub El jest tak zwany heliks powierzchniowy, który jest umiejscowiony bezpośrednio w sąsiedztwie przypuszczalnego trzeciego regionu transmembranowego. Sekwencja ta o długości około 25 aminokwasów, która jest bardzo dobrze
176 856 zachowana wśród koronawirusów, jest również rozpoznana w czynniku LV, jakkolwiek w postaci znacznie bardziej zdegenerowanej. Przypuszcza się zatem, że produkt ORF 6 czynnika LV ma analogiczną funkcję związaną z otoczką co białko M lub El koronawirusów. Ponadto białko kodowane przez ORF 6 wykazuje znaczne podobieństwo (53% identycznych aminokwasów) do VpX (Godeny et al., 1990) LDV.
Białko kodowane przez ORF 7 ma długość 128 reszt aminokwasów (tabela 9) i jest o 13 aminokwasów dłuższe niż Vpl LDV (Godeny et al., 1990). Jeszcze znaczniejsze podobieństwo (43% identycznych aminokwasów) zaobserwowano między białkiem kodowanym przez ORF 7 a Vpl. Następną wspólną cechą między produktem ORf 7 a Vpl jest wysokie stężenie reszt zasadowych (Arg, Lys i His) w N-końcowej połowie białka. Do aminokwasów 55 sekwencja LV zawiera 26% Arg, Lys i His. Odkrycie to jest całkowicie zgodne z proponowaną funkcją produktu ORF 7 lub Vpl (Godeny et al., 1990), mianowicie enkapsydację genomowego RNA wirusa. Na podstawie powyższych danych zaproponowano, że produkt ORF 7 czynnika LV jest białkiem N nukleokapsydu wirusa.
Schematyczne przedstawienie organizacji genomu LV jest pokazane na fig. 2. Mapa nakładających się klonów, użyta do ustalenia sekwencji LV, jest pokazana w części górnej. Liniowa kompilacja tej mapy, wskazująca koniec 5' i 3' sekwencji nukleotydów LV, pokazana na fig. 1, łącznie z podziałką w kilozasadach, jest pokazana poniżej mapy klonów cDNA i pozwala na umiejscowienie tych klonów w sekwencji. Pozycja ORF zidentyfikowanych w genomie LV jest wskazana poniżej liniowej mapy sekwencji LV. Część dolna pokazuje zagnieżdżony zestaw subgenomowych mRNAs i pozycję tych RNAs w stosunku do sekwencji LV.
Zgodnie ze strategią translacji subgenomowych mRNAs koronawirusów, torowirusów i arteriwirusów przypuszcza się, że ORF 1 do 6 ulegają translacji od charakterystycznego.) końca 5' ich genomu lub mRNAs. Za tę charakterystyczną część uważana jest ta część mRNAs, którą otrzymuje się gdy RNA o niższym ciężarze cząsteczkowym jest odejmowany od RNA o wyższym ciężarze cząsteczkowym, który jest następny w kolejności. Chociaż RNA 7 stanowi koniec 3' wszystkie innych genomowych i subgenomowych RNAs i w związku z tym nie posiada charakterystycznego regionu, to uważa się, że ORF 7 ulega translacji tylko z tego mRNA o najmniejszych rozmiarach. Sekwencja liderowa na końcu 5' subgenomowego RNAs jest wskazana zamalowanym prostokątem. Długość tej sekwencji wynosi około 200 zasad, ale dokładne miejsce fuzji z częścią główną genomowego RNAs musi być dopiero ustalone.
Doświadczalne odtworzenie MSD
Osiem ciężarnych macior zaszczepiono czynnikiem LA i odtworzono w nich kliniczne objawy choroby, takie jak brak apetytu i utrata wagi. Od dnia czwartego do dnia 10-12 po zaszczepieniu (p.i.) wszystkie maciory wykazywały brak chęci dojedzenia. Żadna z macior nie miała podwyższonej temperatury ciała. Dwie maciory dnia 9 i 10 p. i. miały niebieskie oczy. W tabeli 6 podano datę porodu i ilość prosiąt żywych i martwych dla każdej z macior. LA wyizolowano z 13 narodzonych prosiąt.
Tabela 1
Opis i wyniki izolacji wirusa z próbek pobranych w warunkach naturalnych
A. Próbki prosiąt podejrzanych o zakażenie MSD.
| Farma | Ilość świń | Wiek dni | Wykorzystany materiał | Wyniki* |
| RB | 5 | 2 | płuca, migdałki i mózgi | 5 x LA |
| DV | 4 | 3 | płuca, mózgi, miedniczki nerkowe, śledziona | 3 x LA |
| TH | 3 | 3-5 | płuca, miedniczki nerkowe migdałki | 3 x LA |
| DO | 3 | 10 | płuca, migdałki | 2xLA |
| ZA | 4 | 1 | płuca, migdałki | 3 x LA |
| VE Łącznie | 1 20 | ? | wymaz z gardła | 1x PEV2 16xLA 1x PEV 2 |
176 856
B. Próbki od macior podejrzanych o zakażenie MSD
| Farma | Ilość macior | Wykorzystany materiał | Wyniki |
| TH | 2 | osocze i leukocyty | 1 xLA |
| HU | 5 | osocze i leukocyty | 2 x LA, 1 x EMC |
| TS | 10 | osocze i leukocyty | 6 x LA |
| HK | 5 | osocze i leukocyty | 2 x LA |
| LA | 6 | osocze i leukocyty | 2 x LA |
| VL | 6 | surowica i leukocyty | 5 x LA |
| TA | 15 | surowica | 11 xLA |
| LO | 4 | osocze i leukocyty | 2xLA |
| JA | 8 | osocze i leukocyty | 8xLA |
| VD | 1 | osocze i leukocyty | 1 x LA |
| VW | 1 | surowica | 1 xLA |
| Łącznie | 53 | 41 x LA, 1 x EMCV |
* Wyniki podano jako liczbę świń, u których dokonano izolacji.
Niekiedy izolat wykryto w więcej niż jednej próbce na świnię.
LA = czynnik Lelystad PEV 2 = enterowirus świński typ 2
EMCV = wirus zapalenia mięśnia sercowego i opon mózgowych
Tabela 2
Opis i wyniki izolacji wirusa z próbek od świń z infekcją wywołaną doświadczalnie
| Maciora | Świnia® | Użyty materiał | Wyniki* |
| A (LO) # | c835 | płuca, migdałki | 2x LA |
| c836 | wymazy z nosa | 2xPEV7 | |
| c 837 | wymazy z nosa | ||
| B (JA) | c 825 | płuca, migdałki | |
| c821 | wymazy z nosa | 1xPEV7 | |
| c 823 | wymazy z nosa | 4xPEV7 | |
| C (JA) | c 833 | płuca, migdałki | 1 x LA, 1 x PEV 7 |
| c 832 | wymazy z nosa | 2xPEV7 | |
| c829 | wymazy z nosa, osocze i leukocyty | 3 x LA, 2 x PEV 7 | |
| D(VD) | c 816 | płuca, migdałki | |
| c813 | wymazy z nosa | 1 x LA | |
| c815 | wymazy z nosa | 1x PEV 7 | |
| Łącznie izolaty od zarażonych świń | 7 x LA, 13 x PEV 7 | ||
| A | b 809 | wymazy z nosa | |
| b 817 | wymazy z nosa | ||
| B | b 818 | wymazy z nosa, osocze i leukocyty | 1 xLA |
| b 820 | wymazy z nosa | ||
| C | b 822 | wymazy z nosa | |
| b 826 | wymazy z nosa | ||
| D | b 830 | wymazy z nosa | 1 x LA |
| b 834 | wymazy z nosa | ||
| Łącznie izolaty z krwi zaszczepionych świń | 2 x LA |
@ Świnie SPF trzymano w kontakcie (c) z maciorami podejrzanymi o infekcję MSD lub podawano im domięśniowo 10 ml kompleksu krwi tych świń z EDTA w dniu 0 doświadczenia. Grupę jednej maciory i trzech świń SPF (c) trzymano w jednej przegrodzie, a wszystkie cztery grupy trzymano w jednej chlewni. W dniu 6 na świnię SPF z każdej z grup zabito i wykorzystano migdałki oraz płuca do izolacji wirusa Cztery grupy świń SPF zaszczepionych krwią (b) trzymano w czterech różnych przegrodach w innej chlewni Wymazy z nosa świń SPF pobrano w dniach 2,5,71 9 doświadczenia, kompleks krew-EDTA do izolacji wirusa z osocza i leukocytów pobrano od świń , gorączkujących
Wyniki podano jako ilość izolatów na świnię
LA = czynnik Lelystad
PEV 7 = świńskich enterowirus typ 7 # W nawiasach inicjały farmy pochodzenia świń
176 856
Tabela 3
Identyfikacja izolatów wirusa
| Pochodzenia i hodowla komórkowa | Gęstość pławna w CsCl | Wielkość cząstek EM (nm) | Wrażliwość na chloroform | Zobojętniane przez surowicę przeciw (miano) |
| leukocyty maciory farma HU PK-15, PK2 SK6 | 1,33 g/ml | 28-30 | nie wrażliwy | EMCV (1280) |
| wymazy z gardła prosięta z farmy VE SK6 | nie oznaczano | 28-30 | nie wrażliwy | PEV 2 (>1280) |
| wymazy z gardła, migdałki, świnie SPF CVI PK-15, PK2, SK6 | nie oznaczano | 28-30 | nie wrażliwy | PEV 7 (>1280) |
| różne próbki różne farmy makrofagi płuc świńskich | 1,19 g/ml | pleomorficzne | wrażliwy | żadna (wszystkie < 5) |
1) Gęstość pławną w liniowych gradientach CsCl w PBS oznaczano zgodnie ze standardowymi technikami (Brakke, 1967) Podano gęstość, przy której stwierdzono pik zakaźności.
D Zainfekowane i niezainfekowane hodowle komórkowe badanych izolatów zamrażano i rozmrażano Lizaty komórkowe wirowano przez 30 min przy 130000 g, otrzymaną peletkę barwiono standardowymi technikami (Brenner and Home, 1959) i badano przy użyciu mikroskopu elektronowego Philips CM 10 Podano wielkość cząstek, które były obecne w hodowlach zainfekowanych i nieobecne w hodowlach niezamfekowanych
3) Wrażliwość na chloroform oznaczano zgodme ze standardowymi technikami (Grist, Ross i Bell; 1974) 44 Sto do 300 TCID50 izolatów mieszano z różnymi rozcieńczeniami swoisiych antysurowic i namnażano w odpowiednich systemach komórkowych az do zaobserwowania całkowitego CPE Surowice o mianach wyzszych niż 5 badano ponownie, a surowice blokujące CPE przy wysokich mianach uważane były za swoiste dla izolatu Izolaty niewrażliwe na chloroform były badane z surowicami skierowanymi swoiście przeciw enterowirusom świńskim (PEV) 1 do 11 (dzięki uprzejmości Dr Knowles, Pirbnght, Wielka Brytania), przeciwko wirusowi zapalenia mięśnia sercowego (EMCV, dzięki uprzejmości Dr Ahl, Tubmgen, Niemcy), przeciwko parowirusow świńskiemu i przeciwko chorobie pęcherzykowej świń. Izolaty (kod' CDI-NL-2,91) wrażliwy na chloroform testowano z surowicą skierowaną swoiście przeciwko wirusowi wścieklizny rzekomej, wirusowi opryszczki bydlęcej 1, wirusowi opryszczki bydlęcej 4, wirusowi influenzy koni H1N1 i H3N2, wirusowi popodobnemu 3, bydlęcemu wirusowi RS, zakaźnym wirusowi RS, zakaźnym wirusom przewodu pokarmowego, wirusowi epidemicznej biegunki świń, aglutynującemu wirusowi zapalenia mięśnia sercowego, wirusowi zakaźnego zapalenia oskrzeli, bydlęcemu wirusowi białaczki, ptasiemu wirusowi białaczki, wirusowi maedi-visna i surowicy eksperymentalnej otrzymanej od świń SPF (patrz tabela 5)
Tabela 4
Wyniki badań serologicznych sparowanych surowic pobranych w warunkach naturalnych od macior podejrzanych o MSD. Surowice pobrano w ostrej fazie choroby i 3-9 tygodni później. Podano liczbę macior, u których zaobserwowano czterokrotny lub wyzszy wzrost miana/liczbę badanych macior.
| Farma | Przedział1 w tygodniach | HAIHEV | H1N1 | H3N2 | ELISA BRV | BPV | BVDV | HCV |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| TH | 3 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/5 | 0/6 |
| RB | 5 | 0/13 | 1/13 | 0/13 | 1/9 | 0/7 | 0/6 | 0/9 |
| HU | 4 | 0/5 | 0/5 | 3/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| TS | 3 | 1/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/4 | 0/10 |
| VL | 3 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 1/5 | 0/5 | 0/5 |
| JA | 3 | 0/11 | 1/11 | 3/11 | 0/11 | 2/11 | 0/11 | 0/11 |
| WE | 4 | 1/6 | 1/6 | 1/6 | 3/7 | 3/7 | 0/7 | 0/7 |
| GI | 4 | 0/4 | 1/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 |
| SE | 5 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/6 | 0/3 | 0/8 |
| KA | 5 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | n.o. | 0/1 |
| HO | 3 | 1/6 | 0/5 | 1/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| NY | 4 | 0/5 | 1/5 | 1/5 | 0/3 | 0/4 | 0/2 | 0/4 |
| JNf | 3 | 0/10 | 5/10 | 0/10 | 0/10 | 1/10 | 0/10 | 0/10 |
| KO | 3 | 1/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 2/10 | 0/10 | 0/10 |
| OE | 9 | n.o. | n.o. | n.o. | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| LO | 6 | n.o. | n.o. | n.o. | 0/3 | 0/3 | 0/2 | 0/3 |
| WI | 4 | n.o. | n.o. | n.o. | 0/1 | 1/1 | 0/1 | 0/3 |
| RR | 3 | n.o. | n.o. | n.o. | 1/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 |
| RY | 4 | n.o. | n.o. | n.o. | 0/3 | 0/4 | 0/3 | 0/4 |
| BE | 5 | n.o. | n.o. | n.o. | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 |
176 856
Tabela 4 - ciąg dalszy
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| BU | 3 | n.o. | n.o. | n.o. | 1/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| 3 | n.o. | n.o. | n.o. | 1/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | |
| KW | 5 | n.o. | n.o. | n.o. | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 0/10 |
| VR | 5 | n.o. | n.o. | n.o. | 1/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 |
| HU | 4 | n.o. | n.o. | n.o. | 1/4 | 0/3 | 0/3 | 0/4 |
| ME | 3 | n.o. | n.o. | n.o. | 0/5 | 1/5 | 0/5 | 0/5 |
| łącznie ujemnychn | 19 | 41 | 29 | 97 | 16 | 140 | 165 | |
| łącznie dodatnichp | 77 | 48 | 62 | 55 | 131 | 1 | 0 | |
| łącznie serokonwersji6 | 4 | 10 | 9 | 9 | 11 | 0 | 0 | |
| łącznie badanych | 100 | 99 | 100 | 161 | 158 | 141 | 165 |
Surowice badano w testach hamowania hemaglutynacji (HAI) w celu wykrycia przeciwciał przeciw aglutynującemu wirusowi zapalenia mięśnia sercowego (HEV) i wirusom grupy świń H1N1 i H3N2, w testach odczynu immunoadsorpcji (ELISA) w celu wykrycia przeciwciał przeciw glikoproteinie gl wirusa wścieklizny rzekomej (PRV), przeciwko parwowirusowi świńskiemu (PPV), bydlęcemu wirusowi biegunki epidemicznej (BVDV) i wirusowi pomoru świń (HCV).
Tabela 4 ciąg dalszy
| Farma | Przedział w tygodniach | SNT EMCV | EMCVi | PEV2 | PEV2i | PEV7 | PEV7i | LA | IPMA LA |
| TH | 3 | 0/6 | 0/6’ | 0/5 | 0/5 | 0/6 | 0/5 | 0/6 | 6/6 |
| RB | 5 | 1/7 | 1/9 | 0/6 | 2/6 | 1/8 | 0/6 | 0/13 | 7/9 |
| HU | 4 | n.o. | 0/5 | 0/5 | 0/5 | n.o. | 0/5 | 0/5 | 5/5 |
| TS | 3 | 0/10 | 0/10 | 0/7 | 0/4 | 0/10 | 0/7 | n.o. | 10/10 |
| VL | 3 | n.o. | n.o. | 1/5 | 0/5 | n.o. | 0/5 | n.o. | 5/5 |
| JA | 3 | 0/11 | 0/11 | 0/11 | 0/11 | 1/11 | 2/11 | 0/5 | 8/11 |
| WE | 4 | 1/7 | 1/6 | 1/6 | 1/7 | 1/7 | 1/7 | 0/7 | 7/7 |
| GI | 4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 | 0/4 |
| SE | 5 | 0/8 | 0/8 | 0/6 | 1/8 | 0/8 | 1/5 | 0/8 | 6/8 |
| KA | 5 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 | 0/1 |
| HO | 3 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 0/6 | 4/6 |
| NY | 4 | 0/4 | 0/4 | 0/2 | 0/2 | 0/4 | 0/3 | 0/4 | 4/4 |
| JNf | 3 | 0/10 | 0/10 | 1/10 | 0/9 | 0/10 | 0/10 | 0/10 | 5/10 |
| KO | 3 | 0/10 | 0/10 | 2/10 | 2/10 | 1/10 | 3/10 | n.o. | 8/10 |
| OE | 9 | 0/6 | 0/6 | 1/6 | 1/5 | n.o. | 1/6 | n.o. | 4/6 |
| LO | 6 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | 0/3 | n.o. | 3/3 |
| WI | 4 | n.o. | n.o. | 0/1 | 0/1 | n.o. | 0/1 | n.o. | 0/3 |
| RR | 3 | 0/8 | 1/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | n.o. | 8/8 |
| RY | 4 | 0/4 | n.o. | 0/4 | 0/1 | n.o. | n.o. | 1/4 | 1/4 |
| BE | 5 | n.o. | n.o. | 0/10 | 0/10 | n.o. | 1/10 | n.o. | 0/10 |
| BU | 3 | n.o. | n.o. | 0/6 | 0/6 | n.o. | 0/6 | n.o. | 6/6 |
| KR | 3 | n.o. | n.o. | 0/4 | 0/4 | n.o. | 0/4 | n.o. | 1/4 |
| KW | 5 | n. o. | n. o. | 0/10 | 0/10 | n.o. | 1/10 | n.o. | 10/10 |
| VR | 5 | n.o. | n.o. | 0/6 | 1/6 | n.o. | 0/6 | n.o. | 6/6 |
| HU | 4 | n.o. | n.o. | 0/3 | 0/4 | n.o. | 0/3 | n.o. | 3/4 |
| ME | 3 | n.o. | n.o. | 0/5 | 0/5 | n.o. | 0/5 | n.o. | 2/5 |
| łącznie negatywnych | 15 | 29 | 0 | 0 | 2 | 1 | 69 | 15 | |
| łącznie pozytywnych^ | 88 | 74 | 144 | 138 | 90 | 136 | 0 | 27 | |
| łącznie serokonwersji4 | 2 | 3 | 6 | 8 | 4 | 10 | 0 | 123 | |
| łącznie badanych | 105 | 107 | 150 | 146 | 96 | 147 | 69 | 165 |
Surowice badano w testach zobojętniania surowicy (SNT) w celu wykrycia przeciwciała zobojętniającego, skierowanego przeciwko wirusowi zapalenia mięśnia sercowego (EMCV), izolowanym wirusom EMCV (i), eneterowirusom świńskim (PEV) 217 oraz izolatom PEV (i), oraz przeciwko czynnikowi Lelystad (LA), a także techniką immunoperoksydazową monowarstwową (IPMA) w celu wykrycia przeciwciała skierowanego przeciwko czynnikowi Lelystad. tuczniki, czas między pobraniem pierwszej i drugiej próbki
176 856 n łączna ilość świń, u których pierwsza surowica była ujemna w badanym teście, i u których druga surowica była również ujemna lub wykazywała mniej niz czterokrotny wzrost miana.
p łączna liczba świń, u których pierwsza surowica była dodatnika i u których druga surowica wykazywała mniej niż czterokrotny wzrost miana q łączna liczba świń, u których druga surowica miała miano cztery razy lub więcej wyższe niż surowica pierwsza w badanym teście, n o. = nie oznaczano
Tabela 5
Rozwój przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikowi Lelystad mierzony techniką IPMA
| A Świnia w kontakcie tygodnie po kontakcie: Świnia | Miana surowicy mierzone techniką IPMA | ||||
| 0 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| c836 | 0 | 10 | 640 | 640 | 640 |
| c 837 | 0 | 10 | 640 | 640 | 640 |
| c 821 | 0 | 640 | 640 | 640 | 640 |
| c 823 | 0 | 160 | 2560 | 640 | 640 |
| c 829 | 0 | 160 | 640 | 10240 | 10240 |
| c 832 | 0 | 160 | 640 | 640 | 2560 |
| c 813 | 0 | 640 | 2560 | 2560 | 2560 |
| c815 | 0 | 160 | 640 | 640 | 640 |
| B. Świnie zakażone krwią | Miana surowicy mierzone techniką IPMA | ||||
| Tygodnie po zaszczepieniu: Świnia | 0 | 2 | 3 | 4 | 6 |
| b 809 | 0 | 640 | 2560 | 2560 | 2560 |
| b 817 | 0 | 160 | 640 | 640 | 640 |
| b 818 | 0 | 160 | 640 | 640 | 640 |
| b 820 | 0 | 160 | 640 | 640 | 640 |
| b 822 | 0 | 640 | 2560 | 2560 | 10240 |
| b 826 | 0 | 640 | 640 | 640 | 10240 |
| b 830 | 0 | 640 | 640 | 640 | 2560 |
| b 834 | 0 | 160 | 640 | 2560 | 640 |
Opis doświadczenia: patrz tabela 2. Wszystkim świniom pobierano krew w regularnych odstępach czasowych a wszystkie surowice badano techniką immunoperoksydazowa monowarstwową (IPMA) w celu wykrycia przeciwciał skierowanych przeciwko czynnikowi Lelystad (LA).
Tabela 6
Doświadczalne odtworzenie MSD
| Maciora | Długość ciąży | Ilość urodzonych prosiąt | Liczba zgonów tydzień 1 | LA1 u prosiąt martwo zmarłych | ||
| żywych | martwych | urodzonych | w tygodniu 1 | |||
| (ilość | przeciwciał)2 | |||||
| 52 | 113 | 12 (5) | 3(2) | 6 | 2 | 4 |
| 965 | 116 | 3(0) | 9(3) | 2 | 4 | |
| 997 | 114 | 9(0) | 1(0) | 0 | ||
| 1305 | 116 | 7(0) | 2(0) | 1 | ||
| 134 | 109 | 4(4) | 7(4) | 4 | 3 | |
| 941 | 117 | 7 | 10 | |||
| 1056 | 113 | 7(1) | 3(0) | 4 | ||
| 1065 | 115 | 9 | 2 |
1) LA wyizolowano z płuc, wątroby, śledziony, nerek lub płynów puchlinowych
2) Przeciwciała skierowane przeciwko LA wykryto w próbkach surowicy pobranych zanim prosięta zaczęły ssać lub w płynach puchlinowych prosiąt zmarłych
176 856
Tabela 7
Reaktywność w technice IPMA surowic pobranych w warunkach naturalnych z Europy i Ameryki Północnej testowanych z izolatami LA z Holandii (NL1 i NL2), Niemiec (GE1 i GE2) oraz Stanów Zjednoczonych (US1, US2 i US3)
| Izolaty | NL1 | NL2 | GE1 | GE2 | US1 | US2 | US3 |
| Surowice z: Holandii | 3,5l | ||||||
| ΤΉ-187 | 3,5 | 2,5 | 3,5 | ||||
| TO-36 | 3,5 | 3,0 | 2,5 | 3,0 | 1,0 | ||
| Niemiec | |||||||
| BE-352 | 4,0 | 3,5 | 2,5 | 3,0 | - | 1,5 | |
| BE-392 | 3,5 | 3,5 | 2,5 | 2,5 | 1,5 | 1,5 | 0,5 |
| NI-f2 | 2,5 | 1,5 | 2,0 | 2,5 | - | ||
| Wielkiej Brytanii | |||||||
| PA-141615 | 4,0 | 3,0 | 3,0 | 3,5 | - | ||
| PA-141617 | 4,0 | 3,5 | 3,0 | 3,5 | - | 2,5 | |
| PA-142440 | 3,5 | 3,0 | 2,5 | 3,5 | 2,0 | 2,5 | |
| Belgii | |||||||
| PE-1960 | 4,5 | 4,5 | 3,0 | 4,0 | 1,5 | ||
| Eianfiil | |||||||
| EA-2975 | 4,0 | 3,5 | 3,0 | 3,0 | 2,0 | - | |
| EA-2985 | 3,5 | 3,0 | 3,0 | 2,5 | - | ||
| USA | |||||||
| SL-441 | 3,5 | 1,5 | 2,5 | 2,5 | 3,5 | 3,5 | 3,0 |
| SL-451 | 3,0 | 2,0 | 2,5 | 2,5 | 3,5 | 4,5 | 4,0 |
| AL-RP9577 | 1,5 | - | - | 1,0 | 3,0 | 4,0 | 4,0 |
| AL-L10814/33 | 0,5 | 2,5 | - | 2,5 | 3,5 | 3,0 | |
| AL-4094A | - | - | - | - | 1,0 | 2,0 | 0,5 |
| AL-7525 | - | - | - | 1,0 | «, | ||
| JC-MN41 | - | - | - | - | 1,0 | 3,5 | 1,0 |
| JC-MN44 | - | - | - | - | 2,0 | 3,5 | 2,0 |
| JC-MN45 | - | - | - | - | 2,0 | 3,5 | 2,5 |
| Kanadv | |||||||
| RB-16 | 2,5 | - | 3,0 | 2,0 | 3,0 | 3,5 | |
| RB-16 | 1,0 | - | 1,0 | 2,5 | 1,5 | ||
| RB-22 | 1,5 | - | 2,0 | 2,5 | 2,5 | 3,5 | |
| RB-23 | - | - | - | - | 3,0 | - |
Miano wyrażono jako ujemny log; - = negatywny
Tabela 8
Reaktywność w technice IPMA kolekcji surowic uzyskanych w warunkach doświadczalnych w odpowiedzi na LA i SIRSV, testowana z izolatami LA z Holandii (NL1 i NL2), Niemiec (GE1 i GE2) i USA (US1, US2 i US3)
| Izolaty; | NL1 | NL2 | GE1 | GE2 | US1 | US2 | US3 |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Surowice; anty-LA: 14 dpi | 2,5‘ | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 1,5 | 2,0 | 1,5 |
| 28 dpi | 4,0 | 3,5 | 3,5 | 4,0 | 2,5 | 1,5 | |
| 42 dpi | 4,0 | 3,5 | 3,0 | 3,5 | 1,5 | 2,5 | 2,0 |
| 14 dpi | 3,0 | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 1,0 | 2,0 | 1,0 |
| 28 dpi | 3,5 | 3,5 | 3,5 | 4,0 | 1,5 | 2,0 | 2,0 |
| 42 dpi | 4,0 | 4,0 | 3,0 | 4,0 | - | 2,5 | 2,5 |
| 14 dpi | 2,5 | 2,0 | 2,5 | 3,0 | 1,5 | 2,0 | 1,0 |
| 28 dpi | 4,0 | 3,5 | 4,0 | 3,5 | - | 1,5 | 2,0 |
| 42 dpi | 3,5 | 4,0 | 3,5 | 3,5 | 1,5 | 2,0 | 2,0 |
| 14 dpi | 3,5 | 3,5 | 3,0 | 3,5 | - | 2,0 | 1,5 |
| 28 dpi | 3,5 | 3,5 | 3,0 | 3,5 | - | 2,5 | 2,0 |
| 42 dpi | 4,0 | 3,5 | 3,5 | 4,0 | 1,5 | 2,5 | 2,5 |
176 856
Tabela 8-ciąg dalszy
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| anty-SIRSV20 dpi | 2,0 | 2,0 | |||||
| 36 dpi | - | - | - | - | 1,5 | 2,0 | - |
| 63 dpi | - | - | - | - | 1,0 | 2,0 | - |
| 30 dpi | - | - | - | - | 2,5 | 3,0 | - |
| 44 dpi | - | - | - | - | 2,5 | 3,5 | - |
| 68 dpi | - | - | - | - | 2,0 | 3,5 | 1,5 |
| 25 dpi | - | - | - | - | 2,0 | 3,0 | - |
| 40 dpi | - | - | - | - | 2,0 | 3,0 | - |
| 64 dpi | - | - | - | - | 2,5 | 2,5 | 1,5 |
| 36 dpi | - | - | - | - | 1,0 | 3,0 | 1,0 |
| 64 dpi | - | - | - | - | 2,5 | 3,0 |
t = miano wyrażone jako ujemny log, - = negatywny
Tabela 9.
Charakterystyki ORF wirusa Lelystad
| ORF | Nukleotydy (pierwszy-ostatni) | Liczba aminokwasów | Obliczona wielkość peptydu niemodyfikowanego (kDa) | Liczba miejsc glikozylacji |
| ORF1A | 212-7399 | 2396 | 260,0 | 3 |
| ORF1B | 7384-11722 | 1463 | 161,8 | 3 |
| ORF2 | 11786-12532 | 249 | 28,4 | 2 |
| ORF3 | 12394-13188 | 265 | 30,6 | 7 |
| 12556-13188 | 211 | 24,5 | 4 | |
| ORF4 | 12936-13484 | 183 | 20,0 | 4 |
| 12981-13484 | 168 | 18,4 | 4 | |
| 13068-13484 | 139 | 15,4 | 3 | |
| ORF5 | 13484-14086 | 201 | 22,4 | 2 |
| ORF6 | 14077-14-86 | 173 | 18,9 | 2 |
| ORF7 | 14588-14971 | 128 | 13,8 | 1 |
Bibliografia
Boer, G. F. de Back, W., and Osterhaus, A.D.M.E., (1990) An ELISA for detection of antibodies against influenza A nucleoprotein in human and various animal species, Arch. Virol. 115, 47-61.
Boursnell, M.E.G., Brown T.D.K., and Binns, M.M., (1984) Sequence of the membrane protein gene from avian coronavirus IBV, Virus Res. 1, 303-314.
Boursnell, M.E.G., Brown, T.D.K., Foulds, I.J., Green, P. F.,Tomley, F.M., and Binns, M.M., (1987) Completion of the sequence of the genome of the coronavirus avian infectious bronchitis virus, J.Gen. Virol. 68, 57-77.
Brakke, M.K., (1967) In: Methods in Virology, Volume II, pp. 93-117 (Edited by K. Maramorosch and H. Koprowski) New York, Academic Press.
Bredenbeek, P.J., Pachuk, C.J., Noten, J.F.H., Charite, J., Luytjes, W., Weiss, S.R., and Spaan, W.J.M., (1990) The primary structure and expression of the second open reading frame of the polymerase gene of coronavirus MHV-A59. Nucleic Acids Res. 18, 1825-1832.
Brenner, S., and Horne, R.W., (1959) A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses, Biochimica et Biophysica Acta 34,103-110.
Brinton-Darnell, M., and Plagemann, P.G., (1975) Structure and chemical-physical characteristics of lactate dehydrogenase-elevating virus and its RNA, J. Virol. 16, 420-433.
Favaloro, J., Treisman, R. and Kamen, R., (1980) In: Methods in Enzymology, vol. 65, 718-749 (ed. Grossman, L. and Moldave, K.) Academic Press, New York.
Godeny, E.K., Speicher, D.W., and Brinton, M.A., (1990) Map location of lactate dehydrogenase-elevating virus (LDV) capsid protein (Vpl) gene, Virology, 177, 768-771.
Grist, N.R., Ross, C.A., and Bell, E.J., (1974) In: Diagnostic Methods in Clinical Virology, str. 120, Oxford, Blackwell Scientific Publications.
Gubler, U., and Hoffman, B.J., (1963) A simple and very efficient method for generating cDnA libraries, Gene 25, 263-269.
Hanahan, D., (1985) In: DNA Cloning I; A Practical Approach, Rozdział 6,109-135.
Hill, H., (1990) Overwiew and History of Mystery Swine Disease (Swine Infertility Respiratory Syndrome), In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, Październik 6,1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison WI, USA
Hirsch, J.G. and Fedorko, M.E., (1986) Ultrastructure of human leucocytes after simultaneous fixation with glutaraldehyde and osmi.umtetroxide and postfixation in uranylacetate, Journal of Cellular Biology 38, 615.
Horzionek, M.C., Maess, J., and Lufs, R., (1971) Studies on the substructure of togaviruses II. Analysis of equine arteritis, rubella, bovine viral diarrhoea and hog cholera viruses, Arch. Gesamte Virusfrosch. 33,306-318.
Hyllseth, B., (1973) Structural proteins of equine arteritis virus, Arch. Gesamte Virusforsch. 40,177-188.
Kasza, L., Shadduck, J.A., and Christoffinis, G.J., (1972) Establishment, viral susceptiblity and biological characteristics of a swine kidney cell line SK-6, Res. Vet. Sci. 13,46-51.
Loula, T., (1990) Clinical Presentation of Mystery Pig Disease in the breeding herd and suckling piglets, In: Proceedings of Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6,1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison WI, USA.
Masurel, N., (1976) Swine influenza virus and the recycling of influenza viruses in man, Lancet ii, 244-247.
Mazancourt, A. de, Waxham, M.N., Nicholas, J.C., and Wolinsky, J.S., (1986) Antibody response to the rubella virus structural proteins in inffants with the congenital rubella syndrome. J.Med. Virol. 19,1.11-122.
Mengeling, W.L., and Lager, K.M., (1990) Mystery Pig Disease; Evidence and considerations for its etiology, In: Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, October 6,1990, Denver, Colorado, Livestock Conservation Institute, Madison WI, USA.
Moormann, R.J.M., and Hulst, M.M., (1988) Hog cholera virus: identification and characterzation of the viral RNA and virus-specific RNA synthesized in infected swine kidney cells, Virus Res., 11, 281-291.
Moormann, R.J.M., Wamerdam, P.A.M., van der Meer, B., Schaaper, W.M.M., Wensvoort, G., and Hulst, M.M., (1990) Molecular cloning and nucleotide sequence of hog cholera virus strain Brescia and mapping of the genomic region encoding envelope protein E1, Virology, 177,184-198.
Oirschot, J.T. van, Houwers, D.J., Rziha, H.J., and Moonen, P.J.L.M., (1988) Development of an ELISA for detection of antibodies to glycoprotein I of Aujeszky's disease virus: a method for the serological differentiation between infected and vaccinated pigs,
J.Virol. Meth. 22,1911-206.
Pearson, W.R., and Lipman, D.J., (1988) Improved tools for biological sequence comparison. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 244-2448.
Reed, L.J., and Muench, H., (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints, Am. J. Hyg. 27, 493-497.
Rottier, P.J.M., Welling, G.W., Welling-Wester, S., Niesters, H.G.M., Lenstra, J.M., and van der Zeijst, B.A.M., (1986) Predicted membrane topology ofthe coronavirus protein El. Biochemistry 25,1335-1339.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor NY.
Sethna, P.B., Hung. S-L., and Brian, D.A., (1989) Coronavirus subgenomic minusstrand RNAs and the potential for mRNA replicons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5626-5630.
176 856
Setzer, D.R., McGrogan, M., Nunberg. J.H., and Schimke, R.T., (1980) Size heterogeneity in the 3'-end of the dehydrofolate reductase messenger RNA's in mouse cells, Cell 22, 361-370.
Snijder, E.J., den Boon, J.A., Bredebeek, P.J., Horzinek, M.C., Rinjbrand, R., and Spaan, W.J.M., (1990a) The carboxyl-terminal part of the putative Berne virus polymerase is expressed by ribosomal frameshifting and contains sequence motifs which indicate that toro- and coronaviruses are evolutionar related, Nucleic Acids Res. 18, 4535-4542.
Snijder, E.J., Horzinek, M.C., and Spaan, W.J.M., (1990b) A 3 '-coterminal nested set of independently transcribed mesenger RNAs is generated during Berne Virus replication. J. Virol. 64, 355-363.
Spaan, W.J.M., Cavanagh, D., and Horzinek, M.C., (1988) Coronaviruses: structure and genome expression. J.Gen. Virol. 69, 2939-2952.
Strauss, W.M., (1987) Preparation of genomic DNA from mammalian tissue, In: Current protocols in molecular biology (ed. Ausubel F.M. et al.) 2.2.1 John Wiley and Sons, New York.
Terpstra, C., (1978) Detection of Border disease antigen in tissues of affected sheep and in cell cultures by immunofluorescence, Res. Vet. Sci. 25, 350-355.
Venable, J.H. and Coggeshall, R., (1965) A simplified lead citrate stain for use in elektronmicroscopy, Journal of Cellular Biology 25,407.
Vries, A.A.F. de, Chirnside, E.D., Bredenbeek, P.J., Gravestein, L.A., Horzinek, M.C., and Spaan, W.J.M., (1990) All subgenomic mRNAs of equine arteritis virus contain a common 1 eader sequence, Nucleic Acids Res., 18, 3241-3247.
Wensvoort, G., Terpstra, C., and Bloemraad, M., (1998) An enzyme immunoasay, employing monoclonal antibodies and detecting specifically antibodies against classical swine fever virus, Vet. Microbiol. 17,129-140.
Wensvoort, G., Terpstra, C., Boonsta, J., Bloemraad, M., and Zaane, D, van, (1986) Production of monoclonal antibodies against swine fever virus and their use in laboratory diagnosis, Vet. Microbiol. 12,101-108.
Wensvoort, G., Terpstra, C., and Kluyver, E.P. de, (1989) Characterization of porcine and some ruminat pestviruses by cross-neutralization, Vet. Microbiol. 20.291-30)6.
Westenbrink, F., Mideel, W.G.J., Straver, P., and Leeuw, P.W. de. (1986) A blocking enzyme-linked immunosorbent asay (ELISA) for bovine virus serology, J. Vet. Med. B33, 345-361.
Westenbrink, F., Veldhuis, M.A., and Brinkhof, J.M.A., (1989) An enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to porcine parvo virus, J.Virol. Meth. 23, 169-178.
Zeijst, B.A.M. van der, Horzinek, M.C., and Moennig, V., (1975) The genome of equine arteritis virus, Virulogy, 68, 418-425.
Fig. 1(1)
AGCCCCGCCCCACCCCTTOGCCCCI5ZIS3KfiGG£a^£aSS2aSXTTCTCTCTCGGGGC 120
GAGTGCGCCGCCTGCTGCTCCCTTGCAGCGGGAAGGACCTCCCGAGTATTTCCGGAjAGC 180
ACCTCCTTTACXjGGATCTCCACCCTTTAACCATCTCTGGGACGTTCTCCCXSGTGCATGTG 240
OKPIA MSGTFSRCMC 10
CACCCCYjGCTGCCCGGGTATTTTGGAACGCCGGCCAASTCTTTIGCACACGGIGTCTCAG 300
TPAARVFWNAGQVFCTRCLS 30
TXXX3C3GTCTCTTCTCTVrCCAGAGCITGAGGACACT2ACCTCGGTGCAGTTGGCTTGTT 360
ARSLLSPELQDTDLGAVGLF 50
TTACAAGCCTAGGGACAAGCTTCACTGGAAAGTCCCTATCGGCATCCCTCAGGTGGAAIG 420
YKPRDKLHWKVPIGIPQVEC 70
TACTCCATCCGGGTGCIGTTCGCTCTCAGCTGITTTCCCTTTGGCGC?GTATGACCTCCGG 480
TPSGCCWLSAVFPLARMTSG 90
CAATCACAACTTCCTCCAACX1ACTTCTGAAGGITCCTCATGTTTTCTACCX3TCACGGTTG 540
NHNFLQRLVKVADVLYRDGC 110
CTTGGCACCTCGACACCTTCGTGAACTCCAAGTTTAG3AGGGCGGCTGCAACIGGTACCC 600
LAPRHLRELQVYERGCNWYP 130
GATCACGGGGCCCGTGCCCCaGGATGGGTTTGTTTGCGAACTCCATGCACGTATCCGACCA 660
ITGPVPGMGLFANSMHVSDQ 150
GCCGTTCCCIGGTGCCACCCATGTGITGACrAACTCGCCTTrGCCTCAACAGGCTTGTCG 720
PFPGATHVLTNSPLPQQACR 170
GCAGCCGTTCTCTCCATTTGAGGAGGCTCATTCTAGCGTGTACAGGTGGAAGAA&rTTGT 780
QPFCPFEEAHSSVYRWKKFV 190
GGITTTCACGGACTCCTCCCTCAACGGTCZGATCTCGCATGATGTGGACGCCGGAATCCGA 840
VFTDSSLNGRSRMM$TPESD 210
TGATTCAGCCGCCCTGGA3GTACTACCGCCTGA3TTAGAACGTCAGGTCGAAATCCTCAT 900
DSAALEVLPPELERQVEILI 230
TOGGAGTTTTCCTGCTCATCACCCIGTCGACCrGGCCGACTGGGAGCTCACTGAGTCCCC 960
RSFPAHHPVDLADWELTESP 250
TGAGAACGGmTTCCTTCAACACGTCTCATTCTIGOjGTCACCTTGTCCAGAACCCCGA 1020
Ε K G F S F _ŁL TSHSCGHLVQNPD 270
176 856
Fig. 1(2)
CGTCTTTGATCGCAAGTCCIGGCTCTCC?1GCTTITTGGGCCAGTCGGTCGAAGTGCGCTG 1080 VFDGKCWLSCFLGQSVEVRC 290
CCATGAGGAACATCTAGCrGACGCCTTCGGTTACCAAACCAAGTGGGGCGTGCAlGGTAA 1140 HEEHLADAFGYQTKWGVHGK 310
GTACCZTCCAGCGCAGGCTTCAAGTTCGCGGCATTCGTGCTGTAGTCGATCCTGATGGTCC 1200 YLQRRLQVRGIRAVVDPDGP 330
CATTCACXnTGAA3CGCTGTCTTGCCCCCAGTCITGGATCAGGCACCroACTCTGGATGA 1260 IHVEALSCPQSWIRHLTLDD 350
TGATGTCJ^CCCCAGGAlTQ?ITCGCCTGACArCCCTTCGCArTGTGCOGAACACAGAGCC 1320 DVTPGFVRLTSLRIVPNTEP 370
TACCACTTCCCGGArCTTTCGGTTTGGAGCGCArAAGTCGTKTGGCGCrGCCGGCAAAOG 1380 TTSRIFRFGAHKWYGAAGKR 390
GGCTCGTGCTAAGCGTGCCGCTAAAAGTGAGAAGGATTOGGCTCCCACCCCCAAGGTTGC 1440 ARAKRAAKSEKDSAPTPKVA 410
CCTCCCGGTCCCCAC^TTGTGGAATTACCACCTACTCTCCACCGACAGACGGGTCTTCIGG 1500 LPVPTCGITTYSPPTDGSCG 430
TTCGCATCTCCITGCOTCCATAATCAACCGGAiriATAAATGGTCACTIOtCGTCCCCTCT 1560 WHVLAAIMNRMINGDFTSPL 450
GMTTCAGTACAACAGACCAGAGGATGAITGGGCITCTGArTATGATCTTGTTCAGGCGAT 1620 TQYNRPEDDWASDYDLVQAI 470
TCftATGTCTACGACTGCCTGCTACCGTGGTTCGGAATCGCGCCIGTCClAACGCCAAGTA 1680 QC LRLPATVVRNRACPHAKY 490
CCCTATAAAACTIAACGGAGTTCACTGGGASGTAGAGGTGAGGTCTGGAATGGCTCCTCG 1740 LIKLHGVHWEVEVRSGMAPR 510
CTCCCTITTCTCGTGAATGTCTCGTTCGCGTITCCTCTCAASGCTGTCTWCACCGCCTTA 1800 SLSRECVVGVCSEGCVAPPY 530
TCCAGCAGACGGGCTACCTAAACGTGCACTCGAGGCCTTGGCGTCTGCTTACAGACTACC 1860 PADGLPKRALEALASAYRLP 550
CTCCGATTGTGTIAGCTCTGGTATTGCIGACTTTCTTGCTAATCCACCTCCTCAGGAATT 1920 SDCVSSGIADFLANPPPQEF 570
CTGGACCCTCGACAAAATGTTCACCTCCCCGTCACCAGAGCGGTCCGGdTCTCTAGTTT 1980 WTLDKMLTSPSPERSGFSSL 590
176 856
Fig. 1(3)
GTATAAATTACTATTAGAGGTTGTTCCGCAAAAATGCGGTGCCADGGAASGGGCmCAT 2040 YKLLLEVVPQKCGATEGAFI 610
CTArGCTGTTGAGAGGATGTTGAAGGATTGTCCGAGCTCCAAACASGCCATGGCCCTrCT 2100 YAVERMLKDCPSSKQAMALL 630
GGCAAAAArTAAAGTTCCATCCTCAAAGGCCCCGTCTGTGTCCCTGGACGAGTGTTTCCC 2160 AKIKVPSSKAPSVSLDECFP 650
TACX3GATGTTTTA3CCGACTTCGA3CCAGCATCTCAGGAAAGGCCCCAftAGTTCCGGCGC 2220 TDVLADFEPASQERPQSSGA 670
A
AVVLCSPDAKEFEEAAPEEV 690
TCAAGAGASTGGCCACAAGGCCGTCCACTCTGCACTCCTTGCCGAGGCTCCrAACAArGA 2340 QESGHKAVHSALLAEGPNNE 710
GCAGGTACAGGTGGTTGCOGGTGAGCAACTGAAGCTCGGCGGTTGTGGTTTGGCAGTCGG 2400 QVQVVAGEQLKLGGCGLAVG 730
GAArGCTCATGAAGGTCCTCTGGTCTCAGCTGGTCTAATTAACCTGGTASGCGGGAATTT 2460 NAHEGALVSAGLINLVGG8?L 750
GTCCCCCTCAGACCC?CATGAAAGAAAACATGCTCAATAGCCGGGAAGACGAACCACTGGA 2520 SPSDPMKENMLWSREDEPLD 770
TTTGTCCCAACCfiGCACCAGCTTCCACAACGACCCTTGTGAGAGAGCAAACACCXGACAA. 2580 LSQPAPASTTTLVREQTPDN 790
CCCAGGTTCTGATGCCGGTGCCCTCCCCGTCACCGTTCGAGftATTTGTCCCGACGGGGCC 2640 PGSDAGALPVTVREFVPTGP 810
TATACTCTGTCATGTTWtGCACTGCGGCACGGAGTCGGGCGACAGCAGTTCGCCTTTGGA 2700 ILCHVEHCGTBSGDSSSPLD 830
TCHATCTCATGCGCAAACCCTGGACCASCCTTIAAATCTATCCCTGGCCGCTTGGCCAGT 2760 LSDAQTLDQPL N LSLAAWPV 850
GAGGGCCACCGCGTCTGACCCTGGCTGGGTCCACGGTAGGCGCGAGCCTGTCTTTGTAAA 2820 RATASDPGWVHGRREPVFVK 870
GCCTC^łAAATCClTrCTCTGArGGCGATTCAGCCCTTCAGTTCGGGGASClTTCTGAATC 2880 PRNAFSDGDSALQFGELSES 890
176 856
Fig. 1(4)
CAGCTCTGTCATCGAGTTTGACCGGACAAAAGATGCTCCGGTGGTTGACGCCCCTGTCGA 2940 SSVIEFDRTKDAPVVDAPVD 910
CTTGAjCGACTTCGAACGAGGCCCTCTCTGTAGTCGATCCTTTCGAATTTGCCGAACTCAA 3000 LTTSNEALSVVDPFEFAELK 930
GtZGCCCGCGTTTCTCCGCACAAGCClTAATTGACCGASGCGGTCCACnGCCGATGTCCA 3060 RPRFSAQALIDRGGPLADVH 950
TGCAAAAATAAASAACCGGGTATATGAACAGTGCCTCCAAGCTTGTGAGCCCGGTAGTCG 3120 ARIKNRVYEQCLQACEPGSR 970
TGCAACCCCAGCCACCAGGGAGTGGCTCGACAAAATGTGGGATAGGGTGGACATGAAAAC 3180 ATPATREWLDKMWDRVDMKT 990
TTGGCGCTOCACCTC^CAGTTCCAAGCTGGTCGCATTCTTGCGTCCCTCAAATTCCTCCC 3240 WRCTSQFQAGRILASLKFLP 1010
TGACATCArrCAAGACACACCGCCTCCTGTTCCCAGGAAGAACCGAGCTAGTGACAATGC 3300 DMIQDTPPPVPRKNRASDNA 1030
CSGCCTGAAGCAACTGGTGGCACAGTGGGASAGGAAMTGAGTGTGACCCCCCCCCCAAA 3360 GLKQLVAQWDRKLSVTPPPK 1050
ACCGGTTGGGCCAGTGCTTGACCAGATCGTCCCTCOGCCTACGGATATCCAGCAAGAAGA 3420 PVGPVLDQIVPPPTDYQQED 1070
TGTCACCCCCTCCGATGGGCCACCCCA!rGCGCCGGATTTTCCI3M3TCGflGTGAGCACX3GG 3480 VTPSDGPPHAPDFPSRVSTG 1090
CX3GGAGTTGGAAAGGCCTTATGCTXTCCGGCACCCGTCTCGCGGGGTCTOTCAGCCAGCG 3540 GSWKGLMLSGTRLAGSI SQR 1110
CSZlTATGACATGGGTTrrTGAAGTTITCTCCCACCrCCCAGCTFITATGCrCACACnTT 3600 LMTWVFEVFSHLPAFMLTLF 1130
CTCGCCGCXX3GGCTCTATGGC7XX^O37Wm\3GlTmTrGCAGGTGTO37TTrACTTGC 3660 S PRGSMAPGDWLFAGVVLLA 1150
TCTCTTGCIXZT<7ro3T2CTTACCCGATACnOGGATGCCTTCCCTEATTGGGTGTCTrTTC 3720 LLLCRSYPILGCLPLLGVFS 1170
G S L R R V R L G V F G S W M A F A V ^F 1190 'mATTCTOSACTCCATCCAACCCAGTCGGTTCTTCTTGTGACCACGAITCGCCGGAGTG 3840 LFSTPSNPVGSSCDHDS PEC 1210
176 856
Fig. 1(5)
TCATGCTCAGCTTTIGGCTCTTCAGCAGCGCCAACTTTGGGAACCTGTGCGCGGCCTTCT 3900 HAELLALEQRQLWEPVRGLV 1230
GGTCGGCCCCTCAGGCCTCTTATOTCTCATTCTTGGCAAGTTACTCGGTGGGTCACGTTA 3960 VGPSGLLCVILGKLLGGSRY 1250
TCTCTGGCATGTTC^CTACGTlTAIGCArcCrTGCAGATTlGGCCCTTrCTCTTGftTEA 4020 LWHVLLRLCMLADLALSLVY 1270
TCTCGTGTCCCAGGGGCGITGTCACAAGTCTTGGGGAAAGTGTATAAGGACAGCTCCTGC 4080 VVSQGRCHKCWGKCIRTAPA 1290
GGAGGTGGCTCTTAATGTATlTCCTITCTCGCGCGCCACCęYjTGrrCTCTCTTGTfiTCCTT 4140 EVAL NVFPFSRATRVSLVSL 1310
GTGTGATCGATTCCAAACGCCZAAAAGGGGTTGArCCTGTGCACrrGGCAACX3GGTTGGCG 4200 CDRFQTPKGVDPVHLATGWR 1330
CGGGYGCTGGCGTGGTGAGAGCCCCATCCATCAACCACACCAAAAGCCCAIAGCTTATGC 4260 GCWRGESPIHQPHQKPIAYA 1350
CAATTTGGATGAAAAGAAAATGTCTCCCCAAACGGTGGTTGCTGTCCCATACGATCCCAG 4320 NLDEKKMSAQTVVAVPYDPS 1370
T^ZAGGCTATCAAATGCCTGAAAGTTCTGCAGGCGGGAGGGGCCATCGTGGACCAGCCTAC 4380 QAIKCLKVLQAGGAIVDQPT 1390
ACC7TGAGGTCXnTCGTGTGTCCGAGATCCC(7ITCTCAGCCCCATITITCCCAAAAGTTCC 4440 PEVVRVSEI PFSAPFFPKVP 1410
AGTCAACCCAGATTGCAGGGTTCTCGIAGAITCGGACACTITTGTGGCTGCGGTTCGCTG 4500 VNPDCRVVVDSDTFVAAVRC 1430
C
CGGTTACTOSACAGCACAACIGGTICIGGGCCGGGGCAACTTTGCCAflGTTAAArCAGAC 4560 GYSTAQLVLGRGNFAKLNQT 1450
CCCCCCCLAGGAACTCTATCTCCACCAAAACGACIWTGGGGCCTCTTACACCCTTGCTGT 4620 PPRNS ISTKTTGGASYTLAV 1470
GGCTCAAGTCTCTGCGTGGACTCTOm’CAITrcATCCTCGGTCITTGGITCACATC^.CC 4680 AQVSAWTLVHFILGLWFTSP 1490
TCAAGTOTGTGGCOIAGGAACCGCTCACCCATGGTGTTCAAATCCITITTCATATCCTAC 4740 QVCGRGTADPWCSNPFSYPT 1510
YGPGVVCSSRLCVS 1530
176 856
Fig. 1(6)
GCCA.TOGTTCTCAGCCGTGGCACAACTCTCCGGTAGAGAGGTGGGGA3TTTTATTTTGGT 4860 PLFSAVAQLSGREVGIFILV 1550
GCTCGTCTCCTTGACTGCTTTGGCCCACCGCATGGCTCTTAAGGCAGACATGTTAGTGGT 4920 L V S LTALAHRMALKADMLVV 1570
CITITCGGCTTITIGTGCITACGCCIGGCCCATCAGCTCCIGGTTAATCTGCITCITTCC 4980 FSAFCAYAWPMSSWLICFFP 1590
TAIACTCTTCAAGTCGGTIACCCTTCACCCTCTTACTATGCTITGGGTGCACTCATTCTT 5040 I L L KWVTLHPLTMLWVHSFL 1610
OGTCTTITGTCTCCCAGCAGCCGGCATCCTCTCACTASGGATAACTGGCCTTCTTTGGGC 5100 VFCLPAAGILSLGITGLLWA 1630
AATTGGCCGCTTTACCCAGGTTGCCGGAATTAITACACCTTATGACATCCACCAGTACAC 5160 IGRFTQVAGIITPYDIHQYT 1650
CTCTGGGCCACGTCGTGCASCTGCTGTGGCCACAGCCCCAGAAGGCACTEATAIGGCCGC 5220 SGP RGAAAVATAPEGTYMAA 1670
OGTCCGGAGAGCTGCTTTAACTGGGCGAACTTIAATCTTCACCCCGTCTGCACTIGGATC 5280 VRRAALTGRTLIFTPSAVGS 1690
CCITCTCGAAGGTGCTITCAGGACTCftTAAACCCTGCCTTAACACCGTGAATGTIGTAGG 5340 LLEGAFRTHKPCLNTVHVVG 1710
CTCITCCCTTGGTTCCGGAGGGGTITrCACCATTGATGGCAGAAGAACTGTCGTCACTGC 5400 SSLGSGGVFTIDGRRTVVTA 1730
TGCCCATGTGTTGAACGGCGACACflGCTAGAGTCACCGGCGACTCCTACAACCGCAIGCA 5460 AHVLNGDTARVTGDSYNRMH 1750
CACTTTCAASACCAATGGTCATTATCCCTGGTCCCATGCTGATGACTGGCAGGGCGTTGC 5520 TFKTNGDYAWSHADDWQGVA 1770
CCCTGTGGTCAAGGTTGCGAAGGGGTACCGCGGTCGTGCCTACTGGCAAACATCAACTGG 5580 PVVKVAKGYRGRAYWQTSTG 1790
TCTCGAACCCX3GTATCATIGGGGAAGGGTICG<X7ITCTCTTTTACTAACTGCGGCGATTC 5640 V Ε P G I IGEGFAFCFTNCGDS 1810
GGGGTCACCCX3TCATCTCAGAATCTGGIWkTCTTATTGGAAKX^CACCGGTTCAAACAA 5700 GSPVISESGDLIGIHTGSNK 1830
ACTTGGTTCTGGTCTTGTGACAACCCCTGAAGGGGAGACCTGCACCATCAAAGAAACCAA 5760 LGSGLYTTPEGETCTIKETK 1850
176 856
Fig. 1(7)
GCTOTCIKIACCTTTCCAGACATTTTGCAGGCCCAAGCGTTCCTCTTGGGGACATTAAATT 5820 LSDLSRHFAGPSVPLGDIKL 1870
GAGTCCXXSCC^TCATCCCTGATGTAACATCCATTCCXiAGTGACTTGGCATCGCTCCTAGC 5880 S PAII P D V T S I PSDLASLLA 1890
CTCCGTCCCTIGTAGTCGAAGGCGGCCTCTCGACCGTTCAACTTrTGTGTCSTCTTTTrCCT 5940 SVPVVEGGLSTVQLLCVFFL 1910
TCTCTGGOTCATGATGGGCCAIGCCTGGACACCCZATTGITGCC^SIGGGCTTCTTITrGCT 6000 LWRMMGHAWTPIVAVGFFLL 1930
NEILPAVLVRAVFSFALFVL 1950
TGCATGGGCCACCCCCTGGTCTGCACAGGTGTTGATGATTAGACTCCTCACGGCATCTCr 6120 AWATPWSAQVLMIRLLTASL 1970
CAACCGCAAGAftGCTTTCTCTGGCGTTCTACGCACTCGGGGGTGTCGTCGGTTTGGCAGC 6180 MRKKLSLAFYALGGVVGLAA 1990
TGAAATCGGGACTITICClGGCAGAITGI^nGAAITGTCTCAAGCrCTTTCGACATACTG 6240 EIGTFAGRLSELSQALSTYC 2010
ClTCTTACCTAGGGTCCTTGCrATGACCAGTTGTGTTCCCACCATCATCATTGGTGGACT 6300 FLPRVLAMTSCVPTIIIGGL 2030
G
CCATACCCTCGGTCIGATTCTGTGGTTATTCAAATACCGGTGCCTCCACAACATGCTGGT 6360 HTLGVILWLFKYRCLHNMLV 2050
TGGTCATCGGAGITITrcAAGCGCCTrCTTCCTACGGTATTTTGCAGAGGGTAATCTCAG 6420 GDGSFSSAFFLRYFAEGNLR 2070
AAAAGGI^ITTCAG^IOCTCTGGCATCAATAACGAGTCCCTAACGGCZGCTTFAGCTTG 6480 KGVSQSCGMN _JL ESLTAALAC 2090
CAAGITCTCACAGGCTGACCTTCMTTTTIGTCCASCTTAACGAACTTCAAGTGCITTGT 6540 KLSQADLDFLSSLTNFKCFV 2110
ATCTGCTTCAAACATCAAAAATCCTGCCGGCCAGTACATTCAAGCAGCGTATGCCAAGGC 6600 SASNMKNAAGQYIEAAYAKA 2130
CCTGCGCCAAGASTTCGCCTCTCTAGTTCAGATTGACAAAATGAAAGGAGTTTTGTCCAA 6660 LRQELASLVQIDKMKGVLSK 2150
176 856
Fig. 1(8)
GCTCGAGGCCnTGCTGAAACAGCCACCCCGTCCCTTGACATAGGTGACGTGATTGTTCT 6720 LEAFAETATPSLDXGDVXVL 2170
GdTGGGCAACATCCTCACGGATCCATCCTCGATATTAATGTGGGGACTGAAAGGAAAAC 6780 LGQHPHGSILDXNVGTERKT 2190
TGTGTCCGTGCAAGAGACCCGGA3CCTAGGCGGCTCCAAATTCAGTGTTTGTACTGTCC?r 6840 VSVQETRSLGGSKFSVCTVV 2210
A _
GTCCAACACACCCGTGGACX5CCTTGACCGGCATCCCACTCCAGACACCAACCCCTCXaITT 6900
SNTPVDALTGI PLQTPTPLF 2230
TGAGAA.TGGTCCGCGTCATCGCAGCGAGGAAGACGATCTTAAAGTCGAGAGGATGAAGAA 6960 ENGPRHRSEEDDLKVERMKK 2250
ACACTIGTGTATCCCTCGGCTTCCACAACArCAArGGCAAAGTTIACrGCAAAATTrGGGA 7 020 HCVSLGFHNXNGKVYCKIWD 2270
CAAGTCTACCGGTGACACCTTTTACAOGGATGATTCCOGGTACACCCAAGACCATGCTTT 7080 KSTGDTFYTDDSRYTQDHAF 2290
TCAGGACASGTCAGCCGACTACAGAGACAGGGACTATGAGGGTGTGCAAACCACCCCCCA 7140 QDRSADYRDRDSETPVGTVV 2310
ACAGGGATTTGArCCAAAGTCTGAAACCCCTGTTGGCACTGTTGTGArC^CGGTATTAC 7 200 IGGITYYEGVQTTPQQGFDP 2330
GTATAACAGGTATCTGATCAAASSTAAGGAGGTTCTGGTCCCCAAGCCTGACAACTGCCT 7 260 KNRYLXKGKEVLVPKPDNCL 2350
IKlAAGCTGCCAAGCIOTCCCTRłAGCAAGCTCTCGCTGGGATGGGCCAAACrrGCGACCT 7 320 EAAKLSLEQALAGMGQTCDL 2370
TACAGCYGCCGAGGTGGAAAASCT&AASCGCATCATTAGTCAACTCCAAGGTTTGACCAC 7380 TAAEVEKLKRIXSQLQGLTT 2390
OSP AB
TGAACAGGCTITAAACTGTTASCCGCCftGOGGCrTGACCCGCTGTGGCGSCGGCGGCCTA 7440 E Q A L N C - 2396
TGFKLŁAASGLTRCGRGGL 19
GTTGTGACIGAAACGGCGGTAAAAATTATAAAATACCACAECASAACTTTCACCTTAGGC 7500 VVTETAVKXXKYHSRTFTLG 39
CCTTTA3ACCTAAAAGTCACXTCCGA3GXGGAGGTAAAGAAATCAACXGAGCAGGGCCAC 7 560 PLDLKVTSEVEVKKSTEQGH 59
176 856
Fig. 1(9)
GCTGTTGTGGCAAACTTATGTTCCGGTGTCATCTTGATGAGACCTCACCCACCGTCCCTT 7 520 AVVANLCSGVILMRPHPPSL 79
GTCGACX3ITCTrC7UAAACCa3GACTTGACACAATACCC?GGCATTCAACCAGGGCATGGG 7 680 VDVLLKPGLDTIPGIQPGHG 99
GCCGGGAATATGGGCGTGGACGGTTCTATTTGGGATTTTGAAACCGCACCCACAAAGGCA 7740 AGNMGVDGSIWDFETAPTKA 119
GAACTCGAGTTATCCAAGCAAATAATCCAAGCATGTGAAGTTAGGCGCGGGGACGCCCCZG 7 800 ELELSKQIIQACEVRRGDAP 139
AACCTCCAACTCCCTTACAAGCTCTATCCTGTTAGGGGGGATCCTGAGCGGCATAAAGGC 7 860
NLQLPYKLYPVRGDPERHKG 159
CGCCrTATCAATACCAGGTTTGGAGATTTACCITACAAAACTCCTCAAGACACCAAGTCC 7920 RLINTRFGDLPYKTPQDTKS 179
GGAATCCACGCGGCITGTTGCCTGCACCCCAACGGGGCCCCCGIGTCTGArGGTAAATCC 7980 AIHAACCLHPNGAPVSDGKS 199
ACACTAŚGTACCACTCTTCAACATGGTTTCGAGCrTTATGTCCCTACTGTGCCCTATAGT 8040 TLGTTLQHGFELYVPTVPYS 219
GTCATGGAGTACCTTGATTCACGCCCrGACACCCCTnTATGTGTACTAAACAIGGCACT 8100 VMEYLDSRPDTPFMCTKHGT 239
TCCAAGGCTGCTGCASAGGACCTCCAAAAATACGACCTATCCACCCAAGGATnGTCCTG 8160 SKFVLPGVLRLVRRFIFAAA 259
CCTGGGGTCCTACGCCTAGTACGCAGATTCATCTTTGGCCZATATrGGTAAGGCGCCGCCA 8220 EDLQKYDLSTQGGHIGRAPP 279
TTGTTKXTCCCATCAACXTATCCCGCayy3AACTCTAIGGCA3GGATCAATGGCCAGAGG 8280 LFLPSTYPAKNSMAGINGQR 299
TTCCCAACAAAGGACGTTCAGAGCATACCTGAAATTGATGAAATGTGIGCCCGGGCnGTC 8340 FPTKDVQSIPEIDEMCARAV 319
AAGGAGAATTGGCAAACTGTGACACCTTGCACCCTCAAGAAACAGTACTGTTCCAAGCCC 8400 KENWQTVTPCTLKKQYCSKP 339
AAAACCAGGACCATCCTG{3GCACCAACAACmATTGCCTTGGCTCACA3ATCGGCGCTC 8460 KTRTILGTNNFIALAHRSAL 359
A3TGGTGTCACCCA3GCATTCATGAAGAAGGCTTGGAAGTCCCCAATTGCCTTGGGGAAA 8520 SGVTQAFMKKAWKSPIALGK 379
176 856
Fig. 1(10)
AACLAAATTCAAGGAGCTGCATTGCAC?TCTCGCO3GCAGGTGTVrTGAGGCCGACTrGGCC 8580 NKFKELHCTVAGRCLEADLA 399
TCCTCTGACCGCAGCACCCCCGCCATTGTAAGATGGTTIGTrGCCZAACCTCCTGTATGAA 8640 SCDRSTPAIVRWFVANLLYE 419
CTTGCAGGATCTGAAGAGTACTTGCCTAGCTATGTGCTTAATTGCTGCCATGACCTCGTG 87 00
LAGCEEYLPSYVLNCCHDLV 439
GCAACACAGGATGGTGCCTTCACAAAACGCGGTGGCCTGTCX3TCCGGGGACCCCGTCACC 8760 ATQDGAFTKRGGLSSGDPVT 459
AGTGTGTCCAACACCGTATATTCACTGGTAATTTATGCCCAGCACATGGTATTGTCGGCC 8820 SVSNTVYSLVIYAQHMVLSA 479
ITGAAAATGGGTCATGAAATTGGTCTTAAGTrCCTCGAGGAACAGCTCAAGTTCGAGGAC 8880 LKMGHEIGLKFLEEQLKFED 499
CTCCTTCAAAITCAGCCTATGTTCGTATACTCTGATGATCITGTCTTGTACGCTGAAAGA 8940 LLEIQPMLVYSDDLVLYAER 519
C
CCCACAITTCCCAATTACCACTGGTGGGTCGAGCACCTTGACCrGATGCTGGGlTrCAGA 9000 PTFPNYHWWVEHLDLMLGFR 539
ACGGACCCAAAGAAAACO3TCATAACTE3ATAAACCCfiGCTTCCTCGGCTGCAGAAriGAG 9060 TDPKKTVITDKPSFLGCRIE 559
GCAGGGCGACAGCTAGTCCCCAATCGOGACCGCATCCTGGCTGCrCTTGCATATCACATG 9120 AGRQLVPNRDRILAALAYHM 579
AASGCGCAGAACGCCTCAGAGTATTATGCGTCTGCTGCCGCAAICCTGATGGATTCATGT 9180 K A Q _H_ A S Ε Y Y A S A A A I L M D S C 599
GCTTGCA1TGACCATGACCCTGAGTGGTA2GAGGACCTCATCTGCGGTATTGCCCGGTGC 9240 ACIDHDPEWYEDLICGIARC 619
GCCCGCCAGGATGGTTATAGCTTCCCAGGTCCGGCATTlTrCATGI\XATGTGGGAGAAG 9300 ARQDGYSFPGPAFFMSMWEK 639
CTGAGAAGTCATAATGAAGGGAAGAAATTCCGCCACTGCGGCATCTGCGACGCCAAAGCC 9360 DRSHNEGKKFRHCGI GDAKA 659
GACTATGCGTCCGCCTGTGGGCTTGATTTGTGTTTGTTCCATTCGCACITTCATCAACAC 9420 DYASACGLDLCLFHSHFHQH 679
176 856
Fig. 1(11)
C
TGCCCTGTCACTCTGAGCTGCGGTCACCArGCCGGTTCAAAGGAATGITCGCAGTGTCAG 9480 CPVTLSCGHHAGSKECSQCQ 699
TCACCTGTTGGGGCTGGCAGATCCCCTCTIGATGCCGTGCTAAAACAAArTCCArACAAA 9540 S P V G A G R S PLDAVLKQI PYK 719
CCTCCTCGTACTGTCATCATGAAGGTGGGTAATAAAACAACGGCCCTCGATCCGGGGAGG 9600 P PRTVIMKVG M-- KTTALDPGR 739
TACCAGTCCCGTCGAGGTCTCGTTGCAGTCZAAGAGGGGTAITGCAGGCAATGAAGTTGAr 9660 YQSRRGLVAVKRGIAGNEVD 759
A
CTTTCTGAIOGGGACrACCAAGTGGTGCCTCTTTTGCCGACTTGCAAAGACATAAACATG 9720 LSDGDYQVVPLLPTCKDINM 779
GTGAAGGTGGCTTGCAATGTACTACTCAGCAAGTTCATAGTAGGGCCACCA3GTTCCGGA 9780 VKVACNVLLSKFIVGPPGSG 799
T
AAGACCACCTGGCIACTGAGTCAAGTCCAGGACGArGATGTCATTTACACACCCACCCAT 9840 KTTWLLSQVQDDDVIYTPTH 819
I
CASACTATGTTTGArATAGTCASTGCTCTCAAAGTTTGCASGTATTCCAITCCAGGAGCC 9900 QTMFDIVSALKVCRYSIPGA 839
TCAGGACTCCCTTTCCCACCACCTGCCAGGTCCGGGCCGTGGGTTAGGCTTATTGCCAGC 9960 SGLPFPPPARSGPWVRLIAS 859
GGGCACGTCCCIGGCCGAGTATCATACCTCGATGAGGCTGGATATTGTAATCATCTGGAC 10020 GHVPGRVSYLDEAGYCNHLD 879
ATTCTTAGACTGCITrCCAAAACACCCCTTGTGTGTTTGGGTGACCTTCAGCAACTTCAC 10080 ILRLLSKTPLVCLGDLQQLH 899
CCTGTCGGCTTTCAITCCTACTGTTATGTGTTCGATCAGATGCCTCAGAAGCAGCTGACC 10140 PVGFDSYCYVFDQMPQKQLT 919
ACTATTTACAGAITTGGCCCTAACATCTGCGCACGCArCCAGCCrTGTTACAGGGAGAAA 10200 TIYRFGPNICARIQPCYREK 939
LESKARNTRVVFTTR ^959
CASGTGCTGACACCATACCATAAASATCGCATCGGCTCTGCGAIAACCATAGATTGATCC 10320 QVLTPYHKDRIGSAITIDSS 979
176 856
Fig. 1(12)
CAGGGGGCCACCTTTGATATTGTGACATTGCATCTACCATCGCCAAAGTCCCTAAAIAAA 10380 QGATFDXVTLHLPSPKSL K 999
TCCCGAGCACTTGTAGCCArCACTCGGGCAASACACGGGTTGTTCATrTftTGACCCTCAT 10440 SRALVAITRARHGLFXYDPH 1019
NQLQEFFNLTPERTDCNLVF 1039
AGCCGTGGGGATGAGCTSSTAGTrCTGAATGCGGATAATGCfiGTCACAACTGTASCGAAG 10560 SRGDELVVLNADNAVTTVAK 1059
GCCCTTGAGACA3GTCCA3’CrCGATTTCGAGTArCA3ACCCGA3GXGCAAGTCTCTCTTA 10620 ALETGPSRFRVSDPRCKSLL 1079
GCCGCITTGTTCGGCCAGTCTGGAAGGGAGCTGTATGCCACTACGGCAAffrGGCACATAAC 10680 AACSASLEGSCMPLPQVAHN 1099
CTOGGGTTTrACTrTTCCCCGGACAGTCCAACATTTGCACCTCTGCCAAAAGAGTTGGCG 10740 LGFYFSPDSPTFAPLPKELA 1119
CCACATTCGCCAGTGGTTACCCACCAGAATAArCGGGCGTGGCCTGATCGACTTGTCGCT 10800 PHWPVVTHQNNRANPDRLVA 1139
AGTATCCGCCCAMTGATGCCCGCTACftGCAAGCCAATGGTCGGTGCftGGGTATGTGGTC 10860 SMRPIDARYSKPMVGAGYVV 1159
GGGCCGTCCACCITrCTTGGTACTCCIGGIGTOGTGTCATACTATCTC&CACTftTACATC 10920 GPSTFLGTPGVVSYYLTLYX 1179
AGGGGTGAGCCCCZSGGCCTTGCCTGAAACZACTCGTTTCAACAGGGCGTATAGCCZACAGAT 10980 RGEPQALPETLVSTGRXATD 1199
TGTCGGGAGTATCTCSSACGCGGCTGAGGSAGAGGCfiGCAAAftGAACTCCCCCACGCArTC 1104 0 CREYLDAAEEEAAKEŁPHAF 1219
ATTGGCGATGTCAAA3GIACCAa3GlTGGGGGGTGTCATCACATIACAXCAAAMACCTA 11100 XGDVKGTTVGGCHHXTSKYL 1239
CCTAGGTCCCTCCCTAASGACTCTGTTGCCGTftGTTGGAGTAASTTCaCCCGGCAGGGCT 11160 PRSLPKDSVAVVGVS SPGRA 1259
GCTAAAGCCXjTGTGCACTCTCACC?GATCTGTACCTCCCCGAACTCCGGCCATATCTGCAA 11220 AKAVCTLTDVYLPELRPYLQ 1279
CCTGAGACGGCZArCAAAATGCTGGAAACTCAAATTASACTTCAGGGACGTCCGACrAATG 11280 P ETAS KCWK-LKLDFRDVRLM 1299
Fig. 1(13)
| GTCTGGAAAGGAGCCACCGCCTAnTCCAGTTGGAAGGGCTTACATGGTGGGOGCTGCCC VWKGATAYFQLEGLTWSALP | 11340 1319 |
| C GACTATGCCAGGTTTATTCAGCTCCCCAAGGATGCCGTTGTATACATTGATCCGTGTATA DYARFIQLPKDAVVYIDPCI | 11400 1339 |
| GGACCGGCAACAGCCAACCGTAAGGTCGTGCGAACCACAGACrGGCXX3GCCGACCTGGCA GPATANRKVVRTTDWRADLA | 11460 1359 |
| GTGACACCGTATGATTACGGTGCCCAGAACATTPIGACAACAGCCTGGTTOGAGGACCTC VTPYDYGAQNILTTAWFEDL | 11520 1379 |
| GGGCCGCAGTGGAAGATTrTGGGGTTGCAGCCCTTTAGGCGAGCATTTGGCTFIGAAAAC GPQWRILGLQPFRRAFGFEN | 11580 1399 |
| ACPGAGGATTGGGCAATCCTTGCACGCCGTATGAATGACGGCAAGGACTACACrGACTAT TEDWAILARRMNDGKDYTDY | 11640 1419 |
| AACTGGAACTGTGTTCGAGAACGCCCACACGCCATCTACGGGCGTGCTCGTGACCATACG NWNCVRERPHAIYGRARDHT | 11700 1439 |
| TATCATTTrGCCCCTTGGCACAGAAITGCAGGTAGAGCTAGGTAAACCCCGGCTGCCGCCT YHFAPGTELQVELGKPRLPP | 11760 1459 |
| GGGCAAGTGCCGTGAATTCGGGGTGATGCAATGGGGTCACTGTGGAGTAAAATCAGCCAG G Q V P - oaya mQWGHCGVKSAS | 11820 1463 12 |
| T CIGTTCGTGGACGCCITCACTGAGTTCCTTGTTAGTGTGGTIGATATTGCCATTITCCTr CSWTPSLSSLLVWLILPFSL S | 11880 32 |
| GCCATACTIOTTTGGGITCACCGTCGCAGGATGGITACTGGTCTTTCTTCTCAGAGTGGTr PYCLGSPSQDGYWSFFSEWF | 11940 52 |
| TGCTCCGOGCTTCrcCGTTCGCGCTCTGCCATTCACTCTCCCGAACTATCGAAGGTCCTA APRFSVRALPFTLPNYRRSY | 12000 72 |
| TGAAGGCTTGTTGCCCAACTGCAGACCGGATGTCCCACAAITTGCAGTCAAGCACCCATT EGLLPNCRPDVPQFAVKHPL | 12060 92 |
| C G GGGTATGTTTTGGCACZATGOGAGTTTCCCACTTGATTGATGAGATGGTCTCTCGTOGCAT GMFWHMRVSHLIDEMVSRRI V | 12120 112 |
176 856
Fig. 1(14)
TEACCAGACCATGGAACATTCAGGTCAAGCGGCCTGGAAGCAGGTGGTTGGTGAGGCCAC Y Q T Μ Ε H S GQAAWKQVVGEAT
TCrcACGAAGCTGTCAGGGCTCGATATAGTTACTCATTTCCAACACCTGGCCGCAGIGGA
LTKLSGLDIVTHFQHLAAVE
GGCGGATIKnTGtZOGCTrTCTCAGCTCAOaACTCGIGATGCTAAAAAATCTTGCCGTrGG ADSCRFL SSRLVMLKNLAVG
CAATGTGAGCCTACZAGTACAACACCACGTrGGACCGCGTTGAGCrCATCITCCCCACGCC N V S L Q Y _Sł_ TTLDRVELIFPTP
AGGTACGAGGCCC^AGITGACCGATITCAGACAAIGGCTCAIK^GTCTGCACGCTTCCAT
GTRPKLTDFRQWLISVHASI
0873 MAHQCARFH
TTITTCKTrCTCTGGCTTCATCTGTTACCITGTTCAIAGTGCTTTGGCTTCGAAITCCAGC
FSSVASSVTLFIVLWLRIPA
FFLCGFI CYLYHSALAS N S S
LRYVFGFHWPTATHHSS STLCFWF PLAHG _IŁ_ T S F E L T I
AACTACACCATATGCATGCCCrGTTCTACCAGTCAAGCjGCrCGCCAAASGCTCGASCCC _K_ YTICMPCSTSQAARQRLEP
GGTCGTAACATGTGGTGCAAAATAGGGCATGACAGGTGTGA3GAG0GTGACCATGATGAG
GRNMWCKIGHDRCEERDHDE
TTOTIAATGTCCArCCOGTCCGGGTAGGACAACCTCAAACTTGAGGGTTAITATGCITGG
LLMSIPSGYDNLKLEGYYAW
CTGGCTTTTTTGTCCrrrrCCTACGCGGCCCAfiTTCCArCOGGAGTrGITCGGGAIAGGG LAFLSFS YAAQFHPELFGIG
AATGTGTCGCGCGTCTTCGTGGACAA3CGACACCAGTTCATTTGTGCCGAGCATGATGGA _H_ V SRVFVDKRHQFI CAEHDG
CACAATIt^ACCGTAlCTACCGGAęACAACATCTCCGCMTATATGCGGCATATTACCAC HX S T V S T G E JLI SAL YAAYYH
CACCAAATAGACGGGGGCAAITGGTTCCAlTTGGAATGGCTGOGGCCACTCTTrTCTTCC
HQIDGGNWFHLEWLRPLFSS
0874 HAAATLFF
12180
132
12240
152
12300
172
12360
192
12420
212
12480
232
12540
249
12600
12660
12720
109
12780
129
12840
149
12900
169
12960
189
176 856
Fig. 1(15)
TGGCTGGTCCTCAACATATCATGGTXTCTGAGGCGTTCGCCT5TAASCCCTGTTTCTCGA 13020 W L V L H ISWFLRRSPVSPVSR 209
LAGAQHXKtVSEAFACKPCFS 28
CGCATCTArCAGAKTTGAGACCAACACGACCGCGGCIGCCGGTTTCAKaGTCCTTCAGG 13080 RXYQXLRPTRPRLPVSWSFR 229
THLSDIET M.. TTAAAGFssVLQ 48
AO^TCAATTGTITCCGACCTCACGGGGTCTCSGCAGCGCAAGftGAA&ATTTCCTTOGGAA 1314 0 TSXVSDLTGSQQRKRKFPSE 249
DXNCFRPHGVSAAQEKXSFG 68
AGTCGTCCC^A3GTCGTGAAGCC?GTCGGTACrCCCX^GTAOVrcACGA3AACGGCTAA.CG 13200 S RPNVVKPSVLPSTSR- 265
KSSQCREAVGTPQYITITA M 88
TGACCłACGAATCAJACTTGTACAACSCGGACCTGCIGATGCITTCTGOGTGCCTTTTCT 13260 VTDESYLYKADLLMLSACLF 108
ACGCCTCflGAAATGASCGAGAAASGClTCfiASGTCATCmGGGAATGrCTCTGGGGTTG 13320 YASEMSEKGFKVXFG V S G V 128
TTTCTGCTTGTGTCflATTTCACAGATTATGTGGCCCATGTGACCCAACATACCCAGCAGC 13380 V S A C V „KL FTDYVAHVTQHTQQ 148
ArcATCTGGTAAFTGATCACMTCGGTTGCTGCATTTCCTGACACCATCTGCAATGAGGT 1344 0 HHLVXDHXRLLHFLTPSAMR 168
GGGCTACAACCAITGCrTGTTTGTTG3CCAITCTCITGGCAAIATGA£sATGTTCTCACAA 13500 WATTXACLFAXLLAX- 183
632·5 H R C S Η K 6
ATTG^SOTSyTTCITCACrCaSC^rcTTGOTCraGTGGCTTTTTTTGCTGlGraCCGG 13560
CTTGTCX7rGGTCCTTTGCCGATGGCAACGGCGACAGCTCGACAJACCAA3ACftTATATAA 13620 ŁSWSFADGKGDSSTYQYXYJS 46
CTTGAZGAIATGiSlAGCTGAArGGGACCGACTGGTIGTCCAGCGArTTTKaTTGGGCAGT 13680 L T X C E L M - GTDWLSSHFGWAV 66
GGAGACCTTTGTGCTTTArcCX3GTTGCXZACTCATATCCTCTCACTGGGTTTTCTCACAAC 13740 ETFVLYPVATHILSLGFLTT 86
AAGCCATTTrTTTGACGCGCTCGGTCTCGGOGCTGTATCCACTGCftGGATTr{jI'TGGCGG 13800 SHFFDALGLGAVSTAGFVGG 106
176 856
Fig. 1(16)
GCGGTACGTACTCIGCAGCGTCTACGGCGCTTGTGCITTCGCAGCGTTCGTATGTTTTGT 13 860 RYVLCSVYGACAFAAFVCFV 126
CATCCGTGCTGCTAAAAAITGCATGGCCTGCCjCTATGCCCGTACCCGGTTTACCAACTT 13920 IRAAKNCMACRYARTRFTNF 146
CATTGTGGACGACCGGGGGAGAGITCATCGATGGAAGTCTCCAMAGTGGTAGAAAAATT 13980 XVDDRGRVHRNKSPXVVEKL 166
GGGCAAAGCCGAAGTCGATGGCAACCTCGTCACCATCAAACATGTCGTCCTCGMGGGGT 14 040 GKAEVDGNLVTXKHVVLEGV 186
TAAAGCTCAACCCTTGACGAGGACTTCGGCTGAGCAATGGGAGGCCTAGACGATTTTTGC 14100 KAQPLTRTSAEQWEA- 201
OS?6 SSGGLDDFC 8
AACGATCCTATCGCCGCACAAAASCTCGTGCTAGCCTTTAGCATCACAIACACACCTATA 14160 NDPIAAQKLVLAFSXTYTPX 28
AIGATATACGCCCTTAASGTGTCACGCGGCGaACTCCTGGGGCTGTTGCACATCCIAAEA 14220 MIYALKVSRGRLLGLLHILX 48
TITCTCAACTGTTCCTTTACATTCGGATACArGACATATGTGGAITTTCAATCCACCAAC 14280 F L N CSFTFGYMTYVHFQSTN 68
GaTGTCGCACTTACCCIGGGGGCTGTTGTOGCCCTTCTGTGGGGTGTTTACAGCTTCACA. 14340 RVALTLGAVVALLWGVYSFT 88
ESWKFXTSRCRLCCLGRRYX ^108
CIGGCCCCTGCCCAIGACGTAGAAAGTGCTGCAGGTCTCCATTCAATCTCAGCGTCTGGT 14460 LAPAHHVESAAGLHSXSASG 128
AACCGAGCftTACGCIGTGAGAAftGCCCGGACIAACATCAGTGAACGGCftCTCTAGTACCA 14520 NRAYAVRKPGLTSV _JL. G T L V P 148
GGACTTCGGAGCCTCGTGCTGGGOGGCAAACGAGCTGTTAAACGAGGftGTGGTTAACCTC 14580 GLRSLVLGGKRAVKRGVVNL 168
GTCAAGTATGGCCGGTAftAAACCAGAGCCAGSAGAAAARGAAfiAGIACftGCTCCGATGGG 14640 V K Y G R - 173 oaS7 £3 A G K QSQKKKKSTAPMG 18
GftAXGGCCAGCCA3TCAATCAACTGTGCCA3TTGCTGGGTGCAftTGASAftAGTCCCAGCG 14700 NGQPVNQLCQLLGAMXKSQR 38
176 856
Fig. 1(17)
Τ
CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCCTGAGAAGCCACATrTTCCCCT 14760 QQPRGGQAKKKKPEKPHFPL 58
GGCIOCTCAAGATGACATCCGGCACCACCTCACCCAGACTGAACGCTCCCTCTGCTTGCA 14820 AAEDDIRHHLTQTERSLCLQ 78
A
ATCGATCCAGACGGCTTTCAATCAAGGCGCASGAACTGCGTCGCTTTCATCCAGOGGGAA 14880 SXQTAFNQGAGTASLSSSGK 98
GGTCAGTTTrCAGGTTGAGITrATGCTGCCIKnTGCrCATACAGTGCGCCTGAITCGCGT 14940 VSFQVEFMLPVAHTVRLIRV 118
GACTTCTACATCCGCCAGTCAGGGTGCAASTIAATTTGACAGTCAGGTGAATGGCCGCGA 15000 TSTSASQGAS- 128
TCGCGTGTGGCCIVIOAGTCACCTA7TCAATTAGGGC3ATCACATCGGGGTCATACrTAA 15060
TTCAGGCAGGAACCATGTGACCGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
15088
176 856
Fig. 2
611
155 η:
121
201
731
111
100 ora
80H=H 581
22·»» liii a 59tzzaa
BB
151
99(3888 119
DESSZO 551 fc*3 m j 0 βηηίβ'κμεμ 120 60 R&assasss l kb a 66 Μ '1 118 o
5’ lr
4 6 8 10
I I III_1_L-L
14
-I-1-1-L 3·
Ib pyrhftr 0RFs
B.
-JO>UI A M M
176 856 iog miana wirusa
LU
CL
O +» c
(1) o
o
CL
20 30
50 60 czas (godziny)
Fig. 3
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.
Claims (4)
- Zastrzeżenia patentowe1. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, znamienna tym, że zawiera co najmniej 1 TCID50/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności1 zaburzeń świń przy czym wspomniany czynnik Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu 1-1102, oraz fizjologiczny roztwór soli.2. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera co najmniej2 TClDso/ml wyizolowanego czynnika Lelystad.3. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, znamienna tym, że zawiera co najmniej 1 TCID50/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności ΐ zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany czynnik Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu 1-1102 oraz syntetyczną pożywkę minimalną (MEM).4. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, według zastrz. 2, znamienna tym, że zawiera co najmniej 2 TClDso/ml wyizolowanego czynnika Lelystad.5. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, znamienna tym, że zawiera jeden wyizolowany kwas nukleinowy/ml czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych, świń przy czym wspomniany czynnik Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu I-1102, oraz fizjologiczny roztwór soli.6. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, według zastrz. 5, znamienna tym, że zawiera co najmniej dwa wyizolowane kwasy nukleinowe/ml czynnika Lelystad.7. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, znamienna tym, że zawiera co najmniej jeden rekombinowany kwas nukleinowy/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany kwas nukleinowy czynnika Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu ^^1102, oraz fizjologiczny roztwór soli.8. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń według zastrz. 7, znamienna tym, że zawiera co najmniej 2 rekombinowane kwasy nukleinowe/ml izolowanego czynnika Lelystad.9. Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń, znamienna tym, że zawiera co najmniej 1 rekombinowany kwas nukleinowy/ml wyizolowanego czynnika Lelystad, który jest czynnikiem chorobotwórczym zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń przy czym wspomniany kwas nukleinowy czynnika Lelystad odpowiada zasadniczo izolatowi czynnika Lelystad (CDI-NL-2.91) złożonemu do depozytu 5 czerwca 1991 w Instytucie Pasteura, o numerze depozytu 1-1102, oraz chlorowodorek 2-amino-2-(hydroksymetylo)-1,3-propanodiolu.176 85610. Kompompja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń według ztstrz. 9, znamienna tym, że zawiera co najmniej 2 et^i^c^i^łbii^cowćlr^ei kk^misy nuWemoweeml ezokwanego cszyunka ZweysSad.Wynalazek dotyczy kompozycji weterynaryjnej do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń.Wynalazek służy do charakteryzacji i wykorzystania czynnika chorobotwórczego zespołu niepłodności i zaburzeń oddechowych świń zwanego tajemniczą chorobą świń (Mystery Swine Disease - MSD). W wynalazku wykorzystano odktycie czynnika powodującego chorobę oraz ustalenie organizacji jego genomu, sekwencji nukleotydów genomu i białek kodowanych przez genom do uzyskania ochrony przed infekcjami oraz uzyskania metody diagnostycznej, w szczególności ochrony przed infekcjami MSD oraz metody diagnozowania infekcji MSD, oraz do uzyskania kompozycji szczepionek i zestawów diagnostycznych, do stosowania w MSD lub w innych chorobach powodowanych przez patogeny.Zimą i wczesną wiosną 1991 holenderski przemysł hodowli świń został dotknięty nagłym wybuchem nowej choroby wśród macior reprodukcyjnych. Większość macior cierpiała na brak łaknienia, część poroniła w późnym okresie ciąży (około 110 dnia), część urodziła martwe prosięta lub zmumifikowane płody i część miała gorączkę. Niekiedy znajdowano maciory o niebieskich uszach, w związku z czym chorobę powszechnie nazywano 'Abortus Blauw. Chorobie u macior towarzyszył często zespół zaburzeń oddechowych oraz śmierć ich młodych prosiąt, a często zespół zaburzeń oddechowych i opóźnienia wzrostu prosiąt starszych i tuczników.Przyczyna tej epidemii zwierzęcej nie była znana, ale objawy przypominały objawy podobnej choroby, występującej w Niemczech od końca roku 1990, oraz przypomniały objawy tak zwanej tajemniczej choroby świń, obserwowanej od 1987 roku na środkowym zachodzie Stanów Zjednoczonych Ameryki i w Kanadzie (Hill, 1990). Chorobę nazywano również innymi nazwami, w Niemczech jest znana pod nazwą Seuchenhafter Spatabort der Schweine, a w Ameryce Północnej jest również znana jako tajemnicza choroba świń, tajemniczy zespół reprodukcyjny oraz 'Zespół niepłodności i zaburzeń oddechowych świń. W Ameryce Północnej Loula (1990) opisał następujące ogólne oznaki kliniczne:1) Brak łaknienia, chorę zwierzęta w różnym wieku
- 2) Poronienia, martwe porody, słabe prosięta, porody mumii
- 3) Problemy oddechowe po porodzie
- 4) Problemy z rozmnażaniemDotychczas nie zidentyfikowano czynnika sprawczego, ale wśród możliwych przyczyn wymieniano wirusa zapalenia mięśnia sercowego (EMCV), parwowirusy świńskie (PPV), wirusa wścieklizny rzekomej (PRV), wirusa grypy świń (SlV), wirusa biegunki bydlęcej (BVDV), wirusa pomoru świń (HCV), eoterowirusp świń (PEV), wirusa grypopodobnego, chlamidie, leptospira (między innymi Loula, 1990; Mengeliny i Lager, 1990).Istota wynalazku
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91201398 | 1991-06-06 | ||
| PCT/NL1992/000096 WO1992021375A1 (en) | 1991-06-06 | 1992-06-05 | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL176856B1 true PL176856B1 (pl) | 1999-08-31 |
Family
ID=8207701
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92301787A PL176856B1 (pl) | 1991-06-06 | 1992-06-05 | Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL176856B1 (pl) |
| RU (1) | RU2124051C1 (pl) |
-
1992
- 1992-06-05 PL PL92301787A patent/PL176856B1/pl unknown
- 1992-06-05 RU RU93058622/13A patent/RU2124051C1/ru active IP Right Revival
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2124051C1 (ru) | 1998-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0587780B2 (en) | Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits | |
| US6592873B1 (en) | Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids | |
| Hedges et al. | Genetic divergence with emergence of novel phenotypic variants of equine arteritis virus during persistent infection of stallions | |
| JPH07138186A (ja) | ブタ呼吸器及び生殖器疾病を惹起するウイルスに対して免疫応答を高めるワクチン、該ウイルスによって惹起される病気からブタを保護する方法、該ウイルスに対する免疫応答を高めるワクチンを生産する方法、及び該ウイルスから得られたｄｎａ | |
| WO1996006619A9 (en) | Polynucleic acids and proteins from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof | |
| JP2020511945A (ja) | 先天性振戦ａを引き起こす新規ペスチウイルスの単離 | |
| KR0183368B1 (ko) | 페스트바이러스 뉴클레오티드 서열 및 폴리펩티드 | |
| PL176856B1 (pl) | Kompozycja weterynaryjna do zabezpieczania przed zespołem niepłodności i zaburzeń oddechowych świń | |
| US6605283B1 (en) | Nucleotide sequence for the Avian Metapneumovirus (Colorado) attachment glycoprotein gene | |
| RU2765658C9 (ru) | Выделение нового пестивируса, вызывающего врожденный тремор а | |
| Porntippa Nawagitgul | Characterization of a variant of transmissible gastroenteritis virus (TGEV) | |
| None | Characterization of a variant of transmissible gastroenteritis virus (TGEV) | |
| Wang | Molecular studies of the infectious bronchitis virus genome | |
| Stachowiak | Infectious bronchitis virus surveillance in Ontario layers | |
| Meng et al. | SEQUE. HIG | |
| kZ TkkS | eeeSeeeeSSS SzYkSkS | |
| Karaca | Development of molecular probes for diagnosis and epidemiology of avian infectious bronchitis virus | |
| Knoetze | Investigation into the variation of Infectious Bronchitis virus serotypes in KwaZulu-Natal poultry flocks | |
| Vaughn | Molecular characterization of porcine respiratory coronavirus isolates with varying pathogenicity | |
| Moore | Studies with infectious bronchitis virus: RNA recombination in vitro and characterization of monoclonal antibody neutralization-resistant mutants | |
| Alenius et al. | Molecular Epidemiology of Bovine | |
| Warg | The development of a reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) for diagnosis of porcine epidemic diarrhea virus | |
| MX2007005302A (es) | Aislamiento y caracterizacion de cepas mexicanas del virus del sindrome respiratorio y reproductivo porcino (prrs). |