ES2872500T3 - Cepa atenuada del PRRS y uso potencial en preparados inmunizantes - Google Patents

Abstract

Cepa atenuada del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) depositada en virtud del Tratado de Budapest en the Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), con n. CNCM 1-4859 el 5 de junio de 2014.

Description

DESCRIPCIÓN

Cepa atenuada del PRRS y uso potencial en preparados inmunizantes

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una cepa atenuada del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) y uso del mismo como una vacuna para inducir una respuesta inmune.

Antecedentes de la invención

El virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, comúnmente indicado con el acrónimo "PRRS", se aisló por primera vez en los Países Bajos en 1990 durante un brote de infección de una patología reproductiva en granjas porcinas (19). Poco a poco esta manifestación clínica se extendió a otros países, no solo en Europa, sino también en Estados Unidos y Asia (2, 6, 9, 15). El virus se clasificó en el orden Nidovirales, familia Arteriviridae, género Arterivirus (5, 12). El agente etiológico mencionado anteriormente se distingue por un ácido nucleico de RNA (SS ), y el genoma consiste en 9 marcos de lectura abiertos (ORFs) que codifican diferentes proteínas virales, tanto estructurales como no estructurales (1, 3, 18). Aunque se aisló por primera vez hace más de 20 años, todavía representa uno de los principales problemas de tipo sanitario en las granjas porcinas. Además de las patologías del sistema reproductor, es responsable de infecciones del tracto respiratorio, a menudo agravadas por infecciones secundarias sostenidas por otros agentes etiológicos con las consiguientes grandes pérdidas de animales y enormes daños económicos. Las dificultades para controlar esta infección son atribuibles a dos factores principales: 1) la continua variabilidad genética y antigénica del virus (9, 10, 11, 13, 17); y 2) la incapacidad del organismo huésped para activar una respuesta inmune completa. (14)

Se demostró que el virus del PRRS no era capaz de activar el pase de la respuesta innata a la adaptativa, con el consecuente retraso en la síntesis de anticuerpos que neutralizan la infectividad viral y de citocinas tal como el interferón gamma, que da como resultado una persistencia del virus en una forma sin oposición en el organismo y su eliminación de los animales infectados después de períodos prolongados de tiempo y la consiguiente transmisión de la infección a otros animales receptivos. Todo esto conduce a la persistencia de la infección en las granjas infectadas.

Existen varias vacunas específicas para el virus del PRRS, atribuibles a los siguientes tipos: recombinantes, vivas y atenuadas e inactivadas (16).

La Solicitud de Patente Internacional WO2012153160 se refiere a una vacuna recombinante viva o inactivada, que comprende un vehículo, adyuvante y/o excipiente viral y farmacéuticamente aceptable, caracterizado porque el vector viral es un virus capaz de generar una respuesta inmune debido a un aumento en la producción de interferón alfa y/o gamma, y es capaz de replicarse rápidamente, y en el que se inserta una secuencia de nucleótidos ORF 5 y ORF 6 del virus del PRSS.

La Solicitud de Patente Internacional WO2013017570 se refiere al campo de los virus vivos atenuados utilizados como vacunas o medicamentos para prevenir o tratar cerdos con síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS), y se basa en el descubrimiento de una cepa del virus del PRRS que es capaz de inducir una respuesta al interferón de tipo I en el huésped natural infectado por dicho agente etiológico. En una realización, el virus del PRRS es un mutante del virus del PRRS que comprende, en comparación con el genoma de una cepa de tipo nativo, una mutación en el gen que codifica la proteína no estructural 1 (nsp1) de dicho virus.

La Solicitud de Patente Internacional WO2013017568 se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende el genoma de un clon del virus del PRRS del genotipo I (UE) infeccioso útil para estudiar el PRRS y en el desarrollo de vacunas, terapias y diagnósticos para la profilaxis, tratamiento y diagnóstico del PRRS. La solicitud de Patente describe que la generación del clon infeccioso se inició a partir de una cepa de virus (EUX) recuperada de los pulmones de un lechón. La Solicitud de Patente US2012189655 se refiere a una vacuna viva atenuada que ofrece una protección inmunológica significativa a los cerdos frente al PRRS.

La Solicitud de Patente Internacional WO9800165 se refiere a vacunas frente al PRRS producidas por atenuación de cepas de tipo nativo del virus seleccionado del grupo de NADC-8, NADC-9 y NVSL-14 atenuados. La cepa NADC-8 se aisló del único cerdo vivo de una camada que, por lo demás, se presume que murió como resultado de una infección natural con PRRSV. La cepa NADC-9 se aisló del pulmón de un cerdo que presentaba lesiones de consolidación pulmonar, presumiblemente como resultado de una infección natural por PRRs . La cepa NVSL-14 se seleccionó de un grupo de 20 cepas de campo del PRRSV porque se replicaba a un título de alta infectividad en una línea celular susceptible (MARC-145). Cada una de las cepas se purificó mediante 3 diluciones terminales y luego se atenuó mediante un proceso único de pase rápido en serie (a intervalos diarios) en células MARC-145 con dilución de inóculo (<1:50000) en cada pase, y luego se evaluó la atenuación después de su 84 y después de sus 250 pases en cultivo celular mediante la administración a primerizas gestantes susceptibles al final de la gestación.

J. Hu et al., Transboundary and emerging diseases, vol.61, no.2, 2013 describen el desarrollo de candidatos a vacunas del PRRSV vivas atenuadas mediante múltiples pases en serie en una línea celular continua, refiriéndose a Tian et al. (2009), o mediante ingeniería genética de cepas de tipo nativo.

Los límites de las vacunas actualmente disponibles están vinculados a su incapacidad para impartir una respuesta inmune protectora también frente a cepas virales con diferencias significativas en las regiones genómicas que codifican principalmente la glicoproteína estructural 5 (GP5), codificada por ORF 5 y, en menor medida, la proteína nucleocápside interna (N), codificada por ORF 7. Además, las vacunas de subunidades o las que utilizan vectores recombinantes son escasamente efectivas ya que no evocan la respuesta del organismo de manera completa.

Descripción de la invención

Los inventores seleccionaron una cepa del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) que se caracteriza por una alta atenuación de la virulencia y que es capaz de producir una respuesta de anticuerpos típica del virus del PRRS.

De hecho, los inventores han descubierto sorprendentemente que al realizar infecciones por PRRS en serie en vivo en el huésped natural, es decir, el cerdo, los huéspedes mostraron una gran reducción en la virulencia del virus del PRRS. De hecho, los cerdos infectados presentaron síntomas clínicos menos graves, mientras que la viremia todavía era detectable en menor grado y durante un tiempo reducido.

Los inventores analizaron la característica del virus inoculado en cada ciclo de infección según los siguientes parámetros:

• manifestaciones clínicas e hipertermia

• presencia del virus a nivel hemático (viremia)

• estimulación del sistema inmune (respuesta humoral)

• observaciones macroscópicas realizadas a nivel de necropsia

• presencia del virus en los órganos diana.

En primer lugar, el virus fue capaz de inducir manifestaciones clínicas graves en los animales infectados que presentaban síntomas caracterizados por letargo, taquipnea, temblores, edema del párpado, tos, disnea e hiperplasia persistente de los ganglios linfáticos en la ingle hasta 20 días. Algunos sujetos también murieron. Los animales también presentaron hipertermia con valores superiores a 40°C durante días.

El virus fue detectable en el suero sanguíneo a partir del segundo día de infección y persistió durante más de 20 días, en algunos casos hasta los 30 días.

La infección activó una respuesta de anticuerpos clásica ya detectable después de 7 días, con valores superiores a los 14 días.

En la fase de necropsia los animales presentaron neumonía intersticial, esplenomegalia e hiperplasia de los ganglios linfáticos de la ingle. El virus estaba presente en el pulmón, las amígdalas y en los ganglios linfáticos mediastínicos e inguinales.

Dichas condiciones se modificaron gradualmente en los siguientes pases y los cerdos infectados presentaron síntomas clínicos de entidad menor, mientras que la viremia aún fue detectable.

Desde el pase 18 in vivo, las manifestaciones clínicas se redujeron más gradualmente para conducir también a la ausencia de hipertermia.

Los inventores repitieron después los pases in vivo para obtener en los cerdos, durante al menos 4 pases posteriores, ausencia de síntomas clínicos, hipertermia moderada (temperatura corporal no superior a 39°C), ausencia de fase virémica, de lesiones histopatológicas en los órganos diana (pulmones, amígdalas, ganglios linfáticos mediastínicos) y de neumonía intersticial e hiperplasia de los ganglios linfáticos. Los inventores descubrieron que el virus todavía estaba presente en los pulmones y las amígdalas y esporádicamente en los ganglios linfáticos y que mantenía la capacidad de estimular el sistema inmune con la inducción de anticuerpos humorales. Después, los inventores aislaron la cepa viral, adaptaron la cepa viral seleccionada y purificada a cultivos celulares y secuenciaron su genoma.

Se describe en la presente memoria una cepa atenuada del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) caracterizada por comprender un polinucleótido que codifica al menos una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ iD NO: 3, Se Q ID No : 4, SEQ ID: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 o fragmentos funcionales o derivados funcionales de los mismos.

Preferiblemente, dicho polinucleótido codifica para al menos una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, s Eq ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10. Dicho polinucleótido preferiblemente comprende una molécula de RNA que corresponde a al menos un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene al menos un 85% de identidad con los nt. 218-7327 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 89% de identidad con los nt.

7309-11691 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 87% de identidad con 11711-12460 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 85% de identidad con los nt. 11716-11928 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 89% de identidad con los nt. 12319-13086 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 87% de identidad con los nt. 12861-13412 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 86% de identidad con los nt. 13409-14014 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con los nt. 14002-14523 de SEQ ID NO: 1, o una secuencia que tiene al menos un 94% de identidad con los nt. 14513-14899 de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, el polinucleótido que codifica al menos una proteína como se definió anteriormente comprende una molécula de RNA que corresponde a al menos un polinucleótido que tiene esencialmente la secuencia con los nt. 218-7327 de SEQ ID NO: 1, o la secuencia con los nt. 7309-11691 de Se Q ID NO: 1, o la secuencia con los nt. 11711-12460 de SEQ ID NO: 1, o la secuencia con los nt. 11716-11928 de SEQ ID NO: 1, o la secuencia con los nt.

12319-13086 de SEQ ID NO: 1, o la secuencia con los nt. 12861-13412 de SEQ ID NO: 1, o la secuencia con los nt.

13409-14014 de SEQ ID NO: 1, o la secuencia con los nt. 14002-14523 de SEQ ID NO: 1, o la secuencia con los nt.

14513-14899 de SEQ ID NO: 1.

Preferiblemente, el polinucleótido que codifica al menos una proteína como se definió anteriormente comprende una molécula de RNA que corresponde a un polinucleótido que comprende una secuencia que tiene al menos un 87% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

Preferiblemente, dicha molécula de RNA corresponde a un polinucleótido que tiene esencialmente la secuencia de SEQ ID NO: 1.

Preferiblemente, dicho polinucleótido es ADNc.

En otras palabras, la cepa atenuada descrita en la presente memoria comprende preferiblemente una molécula de RNA que codifica al menos una proteína o fragmentos funcionales o derivados funcionales de la misma como se definió anteriormente. Preferiblemente, la cepa atenuada de la invención comprende una molécula de RNA que corresponde a un polinucleótido de ADN de SEQ ID NO: 1.

Se describe una cepa atenuada del PRRSV que comprende una molécula de RNA que corresponde a un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia que tiene al menos un 87% de identidad con la SEQ ID NO: 1.

También se describe en la presente memoria una cepa atenuada del PRRSV que comprende una molécula de RNA que corresponde a un polinucleótido de ADN de SEQ ID NO: 1.

En la presente cepa, la secuencia con los nt. 218-7327 de SEQ ID NO: 1 corresponde a ORF1a, la secuencia con los nt.

7309-11691 de s Eq ID NO: 1 corresponde a ORF1b, la secuencia con los nt. 11711-12460 de SEQ ID NO: 1 corresponde a ORF2a, la secuencia con los nt. 11716-11928 de SEQ ID NO: 1 corresponde al ORF 2b, la secuencia con los nt. 12319­ 13086 de SEQ ID NO: 1 corresponde al ORF 3, la secuencia con los nt. 12861-13412 de SEQ ID NO: 1 corresponde al ORF 4, la secuencia con los nt. 13409-14014 de SEQ ID NO: 1 corresponde al ORF 5, la secuencia con los nt. 14002­ 14523 de SEQ ID NO: 1 corresponde al ORF 6, y la secuencia con los nt. 14513-14899 de SEQ ID NO: 1 corresponde al ORF 7.

Las secuencias con los nt. 1-217 y con los nt. 14900-15012 de SEQ ID NO: 1 corresponden respectivamente a 5'UTR y 3'UTR del genoma viral.

Preferiblemente, la cepa según la invención fue depositada bajo el Tratado de Budapest en la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), con el número CNCM 1-4859 el 5 de junio de 2014 (información del depósito:

N° de acceso al depósito de microorganismos: CNCM 1-4859;

Nombre taxonómico: virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino;

Nombre de la institución depositaria: Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM);

Dirección de la institución depositaria: Institut Pasteur, 25-28, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France.

Fecha de depósito: 5 de junio de 2014).

Por tanto, un objetivo de la invención es una cepa atenuada del PRRSV con la información de depósito anterior.

La cepa de la presente invención fue designada como PRRS/IZSLER/2014 por los inventores. La cepa según la presente invención se caracteriza por una alta atenuación de la virulencia y es capaz de producir una respuesta de anticuerpos típica del virus del PRRS.

Se describe en la presente memoria una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 o fragmentos funcionales o derivados funcionales de los mismos, preferiblemente una proteína que tiene esencialmente la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO: 7, SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, SEC ID NO: 10.

En la presente memoria se describe un polinucleótido aislado que comprende al menos uno de los polinucleótidos definidos anteriormente, o una secuencia complementaria. Un objetivo de la invención es un polinucleótido aislado que comprende la molécula de RNA que corresponde a un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido de SEQ ID NO: 1, o la secuencia complementaria del mismo.

Otros objetivos de la invención son un vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido que comprende la molécula de RNA que corresponde a un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido de SEQ ID NO: 1, o la secuencia complementaria del mismo.

; una célula huésped que comprende dicho vector de expresión recombinante o que comprende el polinucleótido como se definió anteriormente, siendo preferiblemente seleccionada dicha célula huésped de una célula animal, vegetal, de levadura, bacteriana o de insecto, siendo más preferiblemente una célula porcina o de cerdo.

El polinucleótido según la invención comprende preferiblemente una molécula de RNA que corresponde al polinucleótido de SEQ ID NO: 1 o al polinucleótido de SEQ ID NO: 1 o la secuencia complementaria del mismo.

Otro objetivo de la invención es una composición inmunogénica que comprende la cepa como se definió anteriormente, o al menos un polinucleótido como se definió anteriormente, o al menos un vector como se definió anteriormente o al menos una célula huésped como se definió anteriormente y al menos un vehículo y/o adyuvante aceptable para uso veterinario. La composición inmunogénica es preferiblemente para uso médico, más preferiblemente para uso como vacuna.

Un objetivo adicional de la invención es la cepa como se definió anteriormente o el polinucleótido como se definió anteriormente o el vector como se definió anteriormente, o la célula huésped como se definió anteriormente para su uso como un medicamento, en particular para su uso en la terapia de vacunas para el síndrome reproductivo y respiratorio porcino. El sujeto de la terapia es preferiblemente cerdo o puerco.

Otro objetivo de la invención es la cepa según la invención o la composición inmunogénica de la invención para su uso en un método para prevenir a un cerdo de la infección por un PRRSV o desarrollar PRRS.

En la presente memoria se describe un método para evitar que un cerdo se infecte por un PRRSV o desarrolle PRRS, que comprende inocular al cerdo con la cepa tal como se definió anteriormente o con la composición inmunogénica o de vacuna tal como se definió anteriormente.

La composición inmunogénica o de vacuna como se define anteriormente comprende una cantidad eficaz de partículas virales por dosis; preferiblemente comprende aproximadamente de 105 TCID⁵⁰/ ml donde TCID⁵⁰ es la dosis infecciosa media para cultivos de tejidos ("Dosis infecciosa de cultivo de tejidos50”). La cantidad de dosis de un plásmido como se definió anteriormente o de un polinucleótido como se definió anteriormente en una vacuna de la presente invención varía preferiblemente de aproximadamente 0,1 pg a aproximadamente 100 mg. Un tamaño de dosis adecuado varía de aproximadamente 0,5 ml a aproximadamente 10 ml, y más preferiblemente de aproximadamente 1 ml a aproximadamente 5 ml. En el contexto de la presente invención, una "composición inmunogénica o de vacuna" se refiere a una composición que provocará una respuesta inmune protectora, que puede comprender la inducción de anticuerpos y/o de una respuesta de células T, en un animal que estuvo expuesto a la composición de la vacuna.

En el contexto de la presente invención, "polinucleótido" significa un polinucleótido de ADN, ADNc o RNA e incluye moléculas tanto monocatenarias como bicatenarias.

Cualquier combinación de los polinucleótidos o proteínas descritos anteriormente puede estar comprendida en la presente invención.

En la presente invención, "molécula de RNA que corresponde a al menos un polinucleótido" significa una molécula de RNA que es idéntica a dicho polinucleótido, excepto por el hecho de que la secuencia de RNA contiene uracilo en lugar de timina y el esqueleto de la molécula de RNA contiene ribosa en lugar de desoxirribosa.

Por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ADNc que corresponde a o codifica el genoma de RNA de la cepa viral de la presente invención. Por lo tanto, una secuencia de ADN complementaria a la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 1 es, por ejemplo, una plantilla para, es decir, es complementaria a o codifica, el genoma de RNA de la cepa viral de la presente invención.

En el contexto de la presente invención, la referencia a SEQ ID NO: 1 incluye la SEQ ID NO: 1, la secuencia de RNA que corresponde a SEQ ID NO: 1 y una secuencia de ADN o RNA complementaria a SEQ ID NO: 1.

El término secuencia "complementaria" se refiere a un polinucleótido que no es idéntico a la secuencia pero que tiene una secuencia de bases complementaria a la primera secuencia o codifica la misma secuencia de aminoácidos que la primera secuencia. Una secuencia complementaria puede incluir polinucleótidos de ADN y RNA. El término "fragmento funcional" o "derivado funcional" puede entenderse como capaz de ser reconocido como un epítopo por la molécula de anticuerpo o como capaz de provocar una respuesta inmune protectora. Los "fragmentos" son preferiblemente al menos 10 aa., 20 aa., 30 aa., 40 aa., 50 aa., 60 aa., 70 aa., 80 aa., 90 aa., 100 aa., 150 aa., 200 aa., 300 aa., 400 aa., 500 aa., 600 aa., 700 aa., 800 aa., 900 aa., 1000 aa., 1200 aa., 1400 aa., 1600 aa., 1800 aa. o 2000 aa de largo. Los "derivados" pueden ser recombinantes o sintéticos. El término “derivado”, como se usa en la presente memoria en relación con una proteína, significa una proteína modificada químicamente o un análogo de la misma, en la que al menos un sustituyente no está presente en la proteína no modificada o un análogo de la misma, es decir, una proteína que ha sido modificada covalentemente. Las modificaciones típicas son amidas, carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres y similares. Como se usa en la presente memoria, el término "derivados" también se refiere a proteínas más largas o más cortas y /o que tienen por ejemplo, un porcentaje de identidad de al menos un 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, más preferiblemente de al menos un 99% con SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10.

En el contexto de la presente invención, cepa "atenuada" significa una cepa viral que es capaz de infectar y/o replicarse en un huésped susceptible, pero que no es patógena o es menos patógena para el huésped susceptible. Por ejemplo, el virus atenuado puede causar manifestaciones no observables/ indetectables o manifestaciones clínicas más leves, o mostrar una reducción en la eficiencia de la replicación viral y/o infectividad en comparación con las cepas de campo aisladas relacionadas. La expresión huésped "susceptible", como se usa en la presente memoria, se refiere a un animal que puede ser infectado por el PRRSV. Cuando se introduce en un animal susceptible, una cepa atenuada del PRRSV también puede inducir una respuesta inmune frente al PRRSV y, de esta manera, hacer que el animal sea inmune a la infección por PRRSV.

En la presente invención, "al menos un 87% de identidad" significa que la identidad puede ser al menos un 87% o un 90% o 95% o 100% de identidad de secuencia con las secuencias referidas. Esto se aplica a todo el % de identidad mencionado. Preferiblemente, el % de identidad se refiere a la longitud completa de la secuencia referida.

En el contexto de la presente invención, un vehículo puede ser cualquier vehículo o composición implicada en la administración de la vacuna al sujeto o que facilitó el almacenamiento de la composición.

En el contexto de la presente invención, un "vector" puede referirse a un vehículo que puede administrar un polinucleótido diana en una célula huésped, como, por ejemplo, plásmidos y vectores virales.

En el contexto de la presente invención, la "célula huésped" tal como se definió anteriormente es preferiblemente una célula en la que se puede introducir el vector, por ejemplo, mediante transducción, transfección, electroporación, infección o fusión celular.

En la composición inmunogénica o de vacuna como se definió anteriormente, los vehículos adecuados pueden incluir agua, tampones, solución salina, liposomas, materiales poliméricos, conservantes, aceites, emulsiones, estabilizantes y/o partículas de vehículo. El experto en la materia puede seleccionar vehículos adecuados. Una referencia para las formulaciones de vacunas es el libro de Remington ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins, 2000). En cuanto a la administración de la vacuna, ésta se puede realizar por vía intramuscular, intranasal, subcutánea, por aspersión, pulverización o en agua de bebida.

SECUENCIAS

SEQ ID NO:l:

ORIGEN l XGTGTAGGGT ATTCCCCCTA CGCGCGCAAC ACTTCTAGTG TTTGTGTGCC TTGGAGGCGT

61 GGGTATAGCC CCGCCCCACC TCTTGGCCCC TGTTCTAGCC CAACAGGAAT CCTTCTCCCT

121 CGGGGCGAGT GCGCCGCCTG CTGCTCCCTT GCAGTAGGAA GGACCTCCCG AGTATTTCCG

181 GAGAGCACCT GCTTTACGGG ACCTCCACCC TTTAACCATG TCTGGGACGT TTTCCCGGTG

241 CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGGTATTTTG GAACGCCGGC CAAGTCTTTT GCACACGGTG

301 TCTCAGTGCA CGGCCTCTTC TCCCTCCGGA GCTTCAGGAC ACTGATCTTG GTGGAATTGG

361 CTTATTTTAC AGGCCCAAAG ACAAGCTTCC CTGGAAAGTT CCCATTGGCA TCCCCCAAGT

421 GGAGTGCACG CCATCCGGGT GCTGCTGGCT GTCAGCCGTT TTCCCTTTGG CGCGCATGAC

481 CTCCGGCAAC CACAATTTCG TCCAACGACT TGTGAAAGTT GCTGATGTGT TGTACCGTGA

541 CGGTTGCTTG ACCCCTCGAC ACCTTCGTGA ACTCCAAGTT TACGAGCGTG GTTGCAACTG

601 GTACCCGATC ACGGGGCCCG TGCCCGGGAT GGGTTTGTTC GCGAACTCCA TGCACGTGTC

661 TGACCAACCG TTCCCTGGTG CCACCCATGT GTTGACGAAC TCGCCTCTGC CTCAGCAGGC

721 TTGTCGACAG CCGTTCTGCC CATTTGAGGA GGCCCATTCT GACGTGTATA AGTGGAAGGA

781 AGTTGTGGTT TTCATGGACT CCTCCCCCAA CGGTCGATCT CGCATGATGT GGATGCCGGA

841 GTCCGGTGAT TCAGCTGCCC TGGAGGCATT ACCGCCTGAG TTAGAACGTC AAGTCGAAAT

901 CCTCATTCGG AGCTTTCCTG CCCACCATCT TGTTGACCTT ACCGACTGGG AGCTCACTGA

961 GTCCCCTGAG CACGGTTTTT CCTTCGGCAC GTCTTATCCT TGTGGTTACC TTGCCCAAAA

1021 CCCTTATGGT TTTGATGGCA AGTGTTGGCT CTCCTGCTTC TTGGGCCTGC CGACCAAAGT

1081 TTGGCGTCAT GAGGAGTATC TAGCTAGCGC TTTCGGTTAT CAGACCAAGT GGGGCGTACA

1141 TGGCAAATAC CTCCAGCGTA GGCTTCAAAT TAACGGTGTC CGTGCTGCGG TCGATCCTGA

1201 CGGTCCCATC CACGTTGAAG CGCTGTCTTG CCCCCAGTCT TGGATTAGGC ACCTGACTTT

1261 GGACGATGAT GTTACCCCAG GATTCGTTCG CCTGATGTCC CTCCGCATTG TACCGAACAC

1321 AGAGCCTACT ACCCTCCCAA TCTTCCGGTT TGGGGCGCAT AAATGGTATG GGGCAGCTGG

1381 CAAACGAGCT CGCGCCAAGC GTGCTGCCAA AGGTAAGGGG GATTCGAATT CCACCCCCGA

1441 AGTTGCCCGA GTGGCTCCCA CTCACGGGGT TATCACCTAT TCCCCACCGG CAGATGGGTC

1501 CTGTGGTTGG CATGTTATTG CCGCCGTGAT GAACCATATG ATGAATGGTG AACTCACGTC

1561 CCCTCTGACT CCGTACAACA GACCAGAGGA CGACTGGGCT TCTGATTATG ATCTTGTCAA

1621 GACAATCCAA TATTTGCAAC TGCCCGCAAC CGTGGTTCGG GCCCGCGCCT GTCCCAACGC

1681 TAAGTACCTT GTTAAGCTTA ATGGGGTCCA TTGGGAAGTA GAGATGAGGC CGGGAGTGGC

1741 CCCTCGCTCC CTTCCTCGCG AATGTGTAGT TGGCGTCTGC TCTGAAGGCT GCGTCACGCC

1801 GCCTCTTTCA GAGAGGGTGT TGCCTGACCG TGCACTCGAG GCCCTGGCAT CTGCTTACAG

1861 ATTGCCTTCC GACTGTGTCT GTGACGCTGT TGCTGACTTC CTCTCCAACC CGCCCTCTCA

1921 AGGATCCTGG ACTCTCGACA GAATGCTAAC CTCCCCGTCA CCAGAACAGT CTGGTTTTTC

1981 TAGCTTGTAC AGACTGCTAT TGGAGGTTGT TCCGCAGAAA TGCGGAGCCA CAGAGGGGGC

2041 TTTCGTCTAT GCCGTTGACA GGATGTTGAA GGATTGTCCG AGCCCTAAAC AAGCCATGGC

2101 CCTTTTGGGG AAAATCAAAA TCCCATCCTC GAAGGCCTCG TCTGTGTCCT TGGACGAGTG 2161 CTTTCCTACA GATGTTTTGA CTGTCCCCGG GTCGGTGTTT CAGGAAGAGC CCCAAAGCTT O 0 i TGACAACGCC atcgccctgt GTTCGCTGGA AAAACAAAAG GAAACTGAGG GGGCAAGCCC OOO AGGAAAAGCt CAAGAAAGTG ATTGTAAGAC CTTCCGCTCT GTGGTTCCTG 6 CGAGAAACC 2341 TAACATGCAG CAAGTGCCGT TGGTTGAGGA TGAGCAATTG AAGCTOGGCG GTTGTGACTC 2401 AGCCGTTGCG ACGGTTGATA GTGA.TCGGGG AAATGAACCG T7AGACCTAT CLaAATaAaa ^{24 el CCCAAC7GCA ACAACAACCT CCGXCGGAGG g c g a g c a c c c AAjAAAACa AA GCCCCAACAC} Or _{TAGCGTCCGC TCCACTACCG TTCAAGAGTC GGTTCCGGGG AGGCCCGTGC CCCGCCTTGT} • “: TCAGOGA^GC GGGG7GGAGT CGGA.CAACAG CÁATTCGCCG C7GGATTTGT AXAAGAAAAA 2641 GACCCCAGAC CGGCCCGTGG ACCTÁTCTTT AGCCGCTTG'3 ACAAXAAaaa CTACTGCGTC 270 i TGACCCCGGT TGGGTCGACG GTAGGCGCGA ACCTGTCTTC GTTAAGCCTC GCGGTGCCTT ^{2761 CTa T'JTACAAA GAGTCAGTCA TTCGGTTTGG GGGGGTT7CT GAGACTAGCI CTATCA77GA} Oo ; _{GTTTGACCGG ACAGAAGAAA CTCCGGTGAC TGACGTCCCC ATCGACTTAA CAACTTCAAA} O ^{O \} CGAGACTCTT TCCGGGGCAG ACCCCTTCGA ACTTGCTGAA CCTAAGCGTC C.GCGCCTCTC 2341 CGCTCAAGCT TTGATTGACC GAGGTGGCCC AGTTGCTGAT A 1 AAAioAAA AAATAAAAAA 300i TCGAGTGTAT GAACAGTGCC TCCA.GGCTTG CGAACCCGGC AGTCGTGCAA CCCCAGCCAC 3061 AAAGGAA.TGG GT'OGACAAAA GGTGGGAGAG GGTCGATATG AAAA 1jAXAAC GTTGTACCTC 3121 GCAGTTCCAA gcagcctaca GACGCGGGCC CCTGAAATTC CTTCCAGATA TGATTCGTGA 318i CGCGCCACCT CCTGTCCCCA GGAAGGATCG GGCTTGTGAC AGTGCCAGCT TGAAGCAATT 3241 ¿iAXAAAAaAA XAAAAaAAAA GATTGAATGC AGTCCCTCTT AAAAaAAaaA _XahAaaaaA 330i GCTTGGCCGG ACCGCTCCCT CGTCCGTGAA TGCCCAGCCA GAAGAAGCCA TCCCTTCCGA 3361 TGGACCACCT CAAGCGCCGG ACCCTCCTGG ACCAACAAGT GCTGGTAGGG GTTTTAAAGG 3¿i 2 i ACTTATATCC CCCGGCATCC GCCTTATAGG G7CCGCTAGC CAGCGCTTCA TGACATGGGT 3- _ TTTTGAAATT TACTCGCATC GCC6AGCTTT tato:tcaca CTTXXCXaGC CAO-GGi-CTr 354^ TATGGTTACA AGTGATTGGC GGTGTGCAGG TGTTGTTTTA XTTGCXCXa'C TGTTTTGTCG 3:3_ TTCTTGCCCG ATACTCGGGT GCCTACCGCT A7TGGGTGTC TTTTCTGGTT CTGTGGGGTG 3:•_ TGTTCGTCTG GGCGTTTTTG GCTCTTGGAT GGCTTTTGCT GTATTTTTAT TCTCGACTCC 3721 AACCAATCCA ATCGGTTCTT CTTGTGACCA CGATTCGCCG GAGTGTCA7G CTGAGCTTT7 3781 GGCTCTTGAG CAGCGCGAAC 7T7GGGAACC TGTGC.GCAGC CTTGTGGTTG GCCCCTCAGG 3841 CCTCTCATGC GICA7TCTGG GTAAGCTGC7 AaATAAATAA CGTTATCTCT GGCATGTTGT 33'0_l ATXAa&TTXA TGCATGCTCG CGGACTTGGC CGTTTCTCTT AT7TATGTGG TGTCCCAAGG 3:•_ GCGTTGTTAC AAGTGTTGGG GAAAGTGTAT AAGGACAGCT CCTGCAGAGG 7GGCCCTCAA 402± TGTGTTTC'CC TTCTCGCGCG CCACTCGTTC TTCTCTTGTA TCCTTGTGCG ATCGGTTCCA 4281 GGCGCCAAAA GAGG7TGACC CCGTGCACTT aaaAACAaaT TGGCGCGGGT GTTGGCGTGG 4141 TGAGAGTCCC ATTCATCAAG CGCACCAGAA GCCTATAGCT TACGCCAGCC TGGATGAAAA 4201 GAAGATATCT GCCCA'~ACGG mGGrT’T¡3CTGrr’GCCG7ACGAT CCTAGTCAGG rCGTCAAATG 4261 CTTAAAGGTT XTAAAAAaAA GTGGAGCCAT CGTGGATCAA CCTGTTCCTG AGGTCATCCG 4332i TGTGTCOGAA GTTCCTTTCT CAGCCCCATT CTTTCCAAAG GTTAAAGXAA A.CCCAGATTG 4381 TAGGGTTGTG GTGGATTCGG ACACCTTTG7 GGCCGCGGTT CGCTGCGGTT ACTCGACGGC 4441 ACAACTGATC CTAGGTCGAG GCAACTTTGC CAAGTTAAAC CAGACCCCAC CCAAGAACTC 4501 CATCCCCACC AAaXAAACCA GTGGGGCCTC TTACACCCTT GCCGTGACCC AAGTGTCTGT 4361 gtggactttg GTACACTTCA TCATGGGCCT TTGGTTGACG TCGCCTCAGG TGTGTGG7CG 4621 GGGAACCTCA GACCCGTGGT GTTCAAATCC TTTTTCGTAC CCTACTTATG GCCCTGGAGT 468 ^TGTGTGCTCC TCTCGACTTT GTGTGTCTGC TGACGGGGTC ACCCTACCGT 7GTTTTCAGC 4741 CGTGGCTCAA CTCTCTGGCA GAGAGGTGGG GGTTTTTATT TTGGTGCTCG TCTCCTTGAT 4 ñ :j i CTCCTTAGCC CATCGCCTGG i j X 0 T 0 AAj-3 í i70 AGATATGC TG GTGGTCTTTT CGGCATTTTG 4 í :6 i TGGTTACGCC IGGCGCATGA GCTCCTGGTT GATTTGCTTC TTTCCGATAC TCGT^ jA í j l "^fTG 4 521 GGTCAGCCTT CACCCTCTCA CTATGCTTTG GGTACATTCA TTTCTAGTGT TTTGCCTGCC 4 9 ^C I AGCTGGCGGC GTCCTTTCAC TGGGTATATC TGGTTTCCTC TGGGCAGTTG GCCGTTTCAC 5041 TCAGGTTGCC GGAATTATAA CACCTTATGA CATCCACGAA TATACTTCCG GGCCGCGGGG 5101 CGCGGCCGCT GTAGCAACGG GCCGTGAAGG CACCTACATG GCCGCCGTTC GGAGA.GCTGC SlfcA CTTGACCGGT CGGACTTTGA TTTTCAGGCC ATCAGCAGTT GGATCCCTCC TTGAAGGTGG r r7« 7 , TTTTAGGAGT AATAAGCCCT C-GCTGAACAC ^'■AJÍ “T ^{ÍjtA A T Í} líTC GTAGGTTGCT C T C T G GG G T C c 2 R •: CGGGGGTGTC TTCACCGTGG GTGGCAGTAA GATAATTATC ACAGCCAGCC ACGTGCTGAA 5341 CGGTGATGCA GCTAGGGTCA GCC4GCC4ACTG TTACAA7 CGT ATGCACAGTT T T AAAACCAA 5 4 :j i TGGTGATTAT GCCTGGTCCC GTGCTGATGA CTGGCAGGGT GTCGCTCCTG CTGTTAAAGT 5 46 1 C G C ¡ G AAi G A G G TACCGTGGCC GTGCCTACTG GGAAACATGA ACTGGTGTCG AGCCCGGCAT 55 2 i C'ATTGGGGAG GGGTTCGC1' TCTl-TTTCAG CAACTGTGGC GACTCAGGAT CACCTGTCAT r ÍT C; -1 TTCAGAGACT GC4TGACCT' TCGGGGTTCA CACCGGC'TCA AACAAAGTTG GTTCTGGTCT 5641 TGTAACGACC CCTGAAGGGG AGACCTGCTC CATCAAAGAA ACTAAGCTCT CTGAACTTTC 57 0 TAGATACTTT GCAGGTGGGA GTGTCCGTCT gggggáA-Tg AGGTTAAGTC CGGCCATTAT

CCCTGATGTG GCGTTTATTC CGAGTGATTT AGCATCGCTC CTTGCTTC'TG TCCCTGTAAT

GGAGGGCGGC CTCTCAACCG TCCAACTTCT AT GT G T T T TC TTTCTTCTCT GGCGCATGAT

GGGCCATGCT TGGACAGCCA TTATTGCCGT AAGCTTCTTT TTACTGAATG AAATTCTTf 554. AGCAGTTTTG GTCCGTGCTG TATTTTCTTT TGCACTTTTT GTGCTTGCGT GGGCOACC'f 60 0. TTGGTCTGCA CAGGTGTTGA TGATAAGAC5 CCTCACTGCG GGGCTCAACG GTAACAGGC 6 O 6 TTCTCTAGCT TTTTATGCAC TCGGGGGTGT TGTCGGCTTA GCTGCTGAGA. TCGGGACTTT 612. TGCTGGTAAA CTGACTGAAT TGTCCCAGGT CTTGTCCACA TACTGCTTTC TACC:CAGGGT d í ;-: CATTGCCATG ACTAGTTGTG TCCCCGTCAT CATCATCGGT GGGCTTCACG CCGTCGGTGT 624 : AATCCTATGG CTGTTCAAGC ACC GTTGCC T C 6'. AC AAT ATG GTGGTTGGTG Ac'GGGAGTTT 6 3 O1 CTCAAGCGCC TTCTTCGTGG C-GTATTCT04G Aí^AjMí^G i. A/Vl GTTAGGAAAG GCGTCTCGCA 63 tf. GTCTTGTGGC atg ag taa I'G AATCCTTAAC GGCTGCTCTG GuCT^TaAGT TGTCGCAGGC

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GAAAAATGCT GCCGGC GAl-T ACATCGAAGC AGCGTACGCC AAAGCCCTGC GTCAGGAGTT 6 54 - AtuCCTC T'^TA GTCCAAGTCG ACAAAATGAA AGGGGTTCTG TCCAA04CTGG AAGCTTTTGC ó i:" 0 _ TGAGATGG’CT ACTCCATCCC TGGATACAGG AGATGTGGTT GTTCTACTCG GCCAAGACGO 6 661 T CRAC' [3GGT C C ATTCTTGACA TCAATC-TTG'i: GAO 2. G/íAAGV-J AAGACCGIGT GTGTGt -CAA13 A, 6 72 i AACCGGAAGC CTAGGCGGGT GGAAATTCAC4 TGTGTGGACG GTT64TGTGGA A ■C A1O 3 C C C i 3T 6 761 TGAGGCGGTG ACCGGCATTG 1 A.C C T C A.G Aj 3 ACORA* 2CCCA CTGTTTGAGA AT C4C4C-CCÁCC4 60 i4 i CCA.CC GCAGC íjAGíjAT íuATG ATCTTAAGGT TGAGAGGATG AAGAAACACT GCGTCTCCCT 6 90 ^ CüGCITCCAT AATATCAATG GCAAGATTTA C C G C AJRG G T C TGGGACAAGT CAACCGGTGA G 911 GAGCTTCTAG AGGGATGATT CCGGGTATAC G GAAGAG G AT GCCTTTCAGG ATAGGTCAGG 7 02 i TGATTACAGA 13 A T A33 G> 3 A13 T ATGAGGGTGT GCAAATCGCC CCTCAACAAG GA1TTCGACCC 7 f¡ R GATGTCTGAA A.CCCCCGTTG GCACTGTTGT AATTGGGGGT ATCAGGTACA GTAGGTACCT 71 41 AGTTAAAGGC AAGCrAGGTL-T TGATCCCCAA AGCGGAGAAG CATTTTGAhG CCGCCAAGCT 72 01 TTCCGTCGAG CAAGCCCTCG CTGGGATGG'3 GCAGACTTGT GAGCTTAGAG CTGCCgAGGT 72 61 í A-AGAAJtíC T! jt AAGGGCATTA TCAGTCAACT CGAAGGCGTA AG GAG T GAAC AGGCTTTAAA 73 21 CTGTTAGCCG CCAGCGGTTT GAC4C.CGCTGT GGCG’GCGGCG GGTTGGTTGT GAC AG4AAA.CG 7 3 R i G03GTAAAAA TTGTGAAATA CCACAGTAGA ACTTTCACT7 TAGGGCCTCT AGACT TAAAA 74 41 GTCACTTCTG AGGCGGAAGT AAAGAAATGA AC T GAGCAGG GCCACGCTGT T *3 T A G -RAAAC 7501 TTATGCTCCG GTGTCGTCTT AATGAGGCCT CACCCGCCAT CTCTTGTTGA TGTTCTTCTG 7701 ACACCTGGAC TTGACACAGC ACCCGGOATT CAACCAGGC4C ATGG04GCCGG AAACATGGGT 7TjZl1 'GTGAACGGTG CCATCTGGGA TTTCGAAACT GCACCCACTA AíjGLAíjAaCT CGAGTTGTCC 70&1 AAGCAAATAA TTCAGGCCTG TGAGGTTAGG CCCOGAACCT ccaactcccc 7741 TACAAGCTCC ACCCTGTTAG GGGAGACCCT 04AACGGCGCA ATGGCCGTCT CATGAACACC 7 ¡27 AGGTTCGGAG ATTTGCCCTA CAAGACCCCC CAGGACACTA GGTCCGCGAT GCACGCGGCT 7801 TfcrGTGCGTGG ATCCCAACGG GGTCCCGGTG TCTGATGGCA AAGCIACÁTT AGGCACCACT 7721 CCCCAGCGTG GTTTTGAGCT TTACGTTCCC ACAGTACCTT ACAC4TGTCTT AGAGTACCTT 7 ^í1 gattcacgcc CTGATACCCC GTTCATGTG7 ACTAAACAT04 GTACTGCTGA GC4CGGCTGCA 8041 GAGGACCTCC AAAAATACAA CCTGTCCACT GAAGGGTTTG TCCTGCCTGG AGTCCTGCGC 8101 CTAGCTCGTA GATTCATCTT TGGCCACATT GGAAAGGO’GC CGGCAGT04GA CCTCCCATCA 8101 ACTTATCCTG CCAAAAACCC TATGGCAC4C4A ATCAATGGGC AAAC404TTCCC AACAAAGGAT O 7-: GCCCAGAGCA TACCTGAGGT TGACGAAATG TGCGCTCGCG CCGTGAAAGA TaATTgGLA 1i: r¡ 9 ^{o :} ACTACGACGC CTTGCACCGT GAAGAAAGAG TACTGTTCCA AACCCAAAAC TAGGACTATC 834i CCG04GCACTA ATAACTTCAT TGCCTTGGCC CATAGATCGG CACTGAGTGG CGTCACCCAG 8401 GCGTTCATGA AGAAAGCTTG f ^jtA A A T cccga AGTGCGTTGG G’GAAGAA*jaa ATTCAAGGAf2 u4í: 1 TCGCACTGCG CTGTCGCTGG CAGGTGCCTC GAGGCCGACC TGGCGTCCTG GGAGCGCAGT 8521 ACGCCAGGCA TTGTGAGGGG GTTCACCGCC AATCTCCTGT ATGAACTTGG AGC4ATGTC4AG 8581 GAATAGTTGC CTAGCTATGT GCTCAACTGG TGTCACGACC TCGTGGCGAC TCAGGATGGC 804i GCTTTTACAA j-LrlL--Grl^íjilT G TCTGTCGTCT GGGGACCCCC4 TCACCAGTGT GTCGAACACC -1 ”i; GTGTATTCAC TC4GTGATTCA TGCCCAGCAC AGGGTGCTGT CAGCCTTGAA AATGGGCCAC 87ti GAAATTGGCC TTAAATTCCT CGAC4GAACAG CGTAGATTCG AsGGACCTCAT GGAAATCCAG 'j7¿ij. CGGATGTTGG TGCACTCCGA TGACCTTGTC TGGTATGCTC4 AGAA!GCCCAC CTTGCCCAAT ooo; TACCATTGGT CCTTGACTTG AGGCGG04GCT TCAAAACGGA CCCGAAAAA '■2 8041 ACCATCATAA CTGATAAACC CAGCTTCCTC GGCTGCAGAA TTGAGGCAGG GCGtrCAGTTA 9001 GCCCCCAATC GCC4AGC04TAT CCTGGCCGCT CGTGCATAOC AfJAT12AAAf21J GCAGAACGCC 900i TCAGAGTATT ACGCGTCTGC TGCCGCAATC CGCATGGATT CATGTGCTCG CATGGACTAT 9121 GACCCTGAGT GGTAiTGAG 1 ^jp± TCTCATCT04T GGTATTGCTC GGTGTGCTCG TGAAGATGGC 9181 TATAGTTTTC CAGGCCCGGC ATTCTTCATG TCCATGTGGC4 AGAAGCTGAA AAGCCACAAT 9241 GAGG*jiGAAAA AATTCCGCO.'A CTGCGGCATC TGTGATGCTA AGGCCGACCA TGCGTCCGCC ^{9 3} 0i TGTGGGCTTG ACTTGTGTTT GTTCCACTCG CATTTTCATC AACACTGTCC CGTTACACTG 9301 AGCTGCGGTC ACCAIGCTGG TTCAAAAGAG TGCCCGCAGT gtcagtcacc i 2 lCG'JT^GjO 1 9421 GGCAAGTCCC CTCT7GACAC TGTGTTGCAG CAAATCCCGT ATAAACCACC TCGCACTGTC '• ^-S ATAATGAAGG TGAACAATAA AACAACAGCC C7TGACCCGG GGAGGTA'CCA GTCCCG7CGG 9541 GGTCTTGTOC CAGTCAAGAG bb^AATTbCA GGCAATGAGG TTGATCTTGC TGACGGGGAC 9601 TACCAGGTGG TGCCCCTCCT GCCGACCTGC AAAGATATAA ACATGGTAAA GG7GGC7TGC ■;i_ AATGTGTTAC TCAGCAAG7T CATAGTGGGG CCGCCCGGC7 CCGGAAAAAC CACbTbbTXA 9721 OJTGAACOJAAG TTCAAGAGGA TGTTGTCATC TACACACCCA CCCATCAAAC TATGTTfG ^j AC f 17R ATAGTCAGTG CCCTCAAGGT 7TGCAGGTA7 TCAATCCCAG GAGCC7CAGG GCTCCCCTTC 9841 CCACO'GCCTG CCAGA7CTGG ACCGTGGG7C AGA07TG7CG CCAGCGGGCA CATTCCTGGC m7oi CGAGTITCAT ACCTTGACGA GGCTGGGTA7 TGCAACCATC TGGACATC.CT CAGACTGCT7 99ti TCCAAAACAC CCCT7GTG7G 7TTGGGTGAC C7TCAACAAC TCCACCCTGT TGGCTTTGAT 1C021 TCC7GCTGTT A7GT77T7AA 7CAGATGCC7 CACAAACAGC TGACTACCAT TTACAGGTTC 10081 bi■rOOGC.Ari.CA TCTGTGCTGC 7ATCCAGCC7 TGTTACAAGG A.:RA^aAC'TTGA ATCCAAGGCA 1G141 AGGAACACCA GGGTAG1T7T CACCATTCGA CCTGTGGCTT ATGGTCAAGT GCTGA.CACCA 10201 TTTCACAAGG ATCGCbTTbG CTCAGCCA7A ACCATAGAT7 ^{c a}7^o:^{t c a} G(-^g GG¡C7A¡CCTT7 10201 GATGTTGTGA CGCTGCAT7T GCCAACACCA AGATCCC7GA A1AAA_C^h ..G AGiCACTTGTA lo:321 GCCATTACTC GGGCGAGGGA CGGGTTGTTC A7CTACGATC CCCACAACCA ACTCCAGGAG 10381 TTCTTCÁACC TAACCCCTGA GGGTACTGA7 TGCAATCTCG TGCTCAACCG CGGGGGTGAA 10441 CTGGTCGTTC TGÁA77CAGA T^a ATGCAGTC ACAACTGTAG CGAAGGTCCT GGAGGC7GGC 10001 CCGTCTCAAT 77CGGGTA7C GGACCCGAGG TGCAAGTCCC TCTTGGCCGC TTGCTCAGTC 10001 AGCCTAGAAG GGAGC7GCAT GCCAGTACCG bAA^TGbCTb ATAAC7TGGG GTTCTACTTT 10621 TCCCCA¡RACA GTCCGGCGTT CGCACCTC7G CCAAAAGAAT TGGCACCGCA TTGGCCAGTG ICOOi GTC'ACCTGCC AGAACAACCA AGCATGGCCT GACCGACTCG TTGCCAGCAT GCGCCCGAT7 10741 GATGCCCGTT AbAbbAAGbb 7A7GG7TGG7 bbbbGA1Abb TTGTTGGACC GTCAAi'JCTTT 10801 CTGGGAACTC CTGG7GTGGT GTCATACTA7 C7CACACIG7 ACATTAAGGG TGAACCCCGG 10801 GCCTTGCCAG AAACACTCGT CTCAACAGGG CGCATAGCCA CAGAC7GTCG GGA.GTACCT7 1092i GATGCGGCAG AAbi"ibbAAGG AGCCAAGGAA C7 ^{C C C} CCAT¡3 CT7TCATAGG TGATGTCAAG 1C981 GGTACCACAG TGGGGGGGGG 7CATCACA7C ACATCAAAGT ATCTACCCAG GTCCCTGCCC 1i041 AAGGACTCTG TTGCCGTGGT TGGGGTAAG7 TCGCCCGGCA AGGCTGCTAA AGCCGTGTGC 11101 ACTCTCACTG ATGTG7ATCT CCCCGACGTG CGGCCATATC TGCAACCAGA GACAGCATCA 1-101 AAATGCTGGA AACTCAAA7T GGAC.TTCAGG GACGTCAGAC TGATGGTTTG GAAAGGGGCC 1_221 ACCGCCTATT TT■CAGTTG17A AGGGCTTAGA TGGTCGGCAC TACCCGACTA TGCCAGbTTC ^{1-281 ATTCAGCTGC bGAAA1jATf-C 7G77GTGTA7 A7TGACCCGT GCATAGGACC GGCAACAGCO:}

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12 061 GCATTCTGGC CAAGCGGCCT GGAAGCAGGT GGTTGCTGAA GCCACTCTCA CAAAGCTATC

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14 041 ACACAGAAAC TTGTGTTAGC TTTCAGCATC ACATATACAC CCATCATGAT ATACGCCCTT

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1500 1 GTGACCGAAA TT

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SEQ ID NO: 2 (ORFla o una poliproteína de ORFla):

"MSGTFSRCMCTPAARVFWNAGQVFCTRCLSARPLLPPELQDTDL

GGIGLFYRPKDKLPWKVPIGIPQVECTPSGCCWLSAVFPLARMTSGNHNFVQKLVKVA DVLYRDGCLTPRHLRELQVYERGCNWYPITGPVPGMGLFANSMHVSDQPFPGATHVLT NSPLPQQACRQPFCPFEEAHSDVYKWKEVWFMDSSPNGRSRMMWMPESGDSAALEAL PPELERQVEILIRSFPAHHLVDLTDWELTESPEHGFSFGTSYPCGYLAQNPYGFDGKC WLSCFLGLPTKVWRHEEYLASAFGYQTKWGVHGKYLQRRLQINGVRAAVDPDGP1HVE ALSCPQSWIRHLTLDDDVTPGFVRLMSLRIVPNTEPTTLPIFRFGAHKWYGAAGKRAR AKRAAKGKGDSNSTPEVARVAPTHGVITYSPPADGSCGWHVIAAVMNHMMNGELTSPL TPYNRPEDDWASDYDLVKTIQYLQLPATWRARACPNAKYLVKLNGVHWEVEMRPGVA PRSLPRECWGVCSEGCVTPPLSERVLPDRALEALASAYRLPSDCVCDAVADFLSNPP SQGSWTLDRMLTSPSPEQSGFSSLYRLLLEWPQKCGATEGAFVYAVDRMLKDCPSPK QAMALLGKIKIPSSKASSVSLDECFPTDVLTVPGSVFQEEPQSFDNAIALCSLEKQKE TEGASPGKAQESDCKTFRSWPAEKPNMQQVPLVEDEQLKLGGCDSAVATVDSDRGNE PLDLSRSAPTATTTSVGGRAPDNPGPNTSVRSTTVQESVPGRPVPRLVERCGVESDNS NSPLDLSKAQTPDRPLDLSLAAWPVRATASDPGWVDGRREPVFVKPRGAFSDSESVIR FGGVSETSSIIEFDRTEETPVTDVPIDLTTSNETLSGADPFELAEPKRPRLSAQALID RGGPLADVHAKIKNRVYEQCLQACEPGSRATPATKEWLDKMWERVDMKTWRCTSQFQA AYILGPLKFLPDMIRDAPPPVPRKDRACDSASLKQLVARWEKRLNAVPLQGPVEPELG RTAPSSVNAQPEEAIPSDGPPQAPDPPGPTSAGRGFKGLISPGIRLIGSASQRFMTWV FEIYSHLPAFMLTLFSPRGSMVTSDWLFAGWLFALLFCRSCPILGCLPLLGVFSGSV RCVRLGVFGSWMAFAVFLFSTPTNPIGSSCDHDSPECHAELLALEQRQLWEPVRSLW GPSGLSCVILGKLLGGSRYLWHWLRLCMLADLALSLIYWSQGRCYKCWGKCIRTAP AEVALNVFPFSRATRSSLVSLCDRFQAPKEVDPVHLATGWRGCWRGESP1HQAHQKPI AYASLDEKKISAQTWAVPYDPSQAVKCLKVLQAGGAIVDQPVPEVXRVSEVPFSAPF FPKVPVNPDCRVWDSDTFVAAVRCGYSTAQLILGRGNFAKLNQTPPKNSIPTKSTGG ASYTLAVTQVS'Í/WTLVHFIIGLWLTSPQVCGRGTSDPWCSNPFSYPTYGPGWCSSRL CVSADGVTLPLFSAVAQLSGREVGVFILVLVSLISLAHRLALKADMLWFSAFCAYAW PMSSWLICFFPILLRWVTLHPLTMLWVHSFLVFCLPAAGVLSLGISGFLWAVGRFTQV AGIITPYD1HQYTSGPRGAAAVATAPEGTYMAAVRRAALTGRTLIFTPSAVGSLLEGA FRTNKPCLNTVNWGSSLGSGGVFTVGGSXIIITATHVLNGDAARVTGDSYNRMHTFK TNGDYAWSRADDWQGVAPAVKVAKRYRGRAYWQTSTGVEPGIIGEGFAFCFTNCGDSG SPVISETGDLIGVHTGSNKLGSGLVTTPEGETCSIKETKLSELSRYFAGPSVPLGDVR LSPAIIPDVAFIPSDLASLLASVPVMEGGLSTVQLLCVFFLLWRMMGKAWTPIIA.VSF FLLNEILPAVLVRAVFSFALFVLAWATPWSAQVLMIRLLTAALNRNRLSLAFYALGGV VGLAAEIGTFAGKLTELSQVLSTYCFLPRVIAMTSCVPVIIIGGLHALGVILWLFKHR CLHNMLVGDGSFSSAFFLRYFAEGNLRKGVSQSCGMSNESLTAALACKLSQADLDFLS GLTNFKCFVSASNMKNAAGQYIEAAYAKALRQELASLVQVDKMKGVLSKLEAFAEMAT PSLDTGDVWLLGQHPHGSILDINVGTERKTVSVQETRSLGGSKFSVCTWSNTPVDA LTGIPLQTPTPLFENGPRHRSEDDDLKVERMKKHCVSLGFHNINGKIYCKVWDKSTGD TFYTDDSRYTQDHAFQDRSADYRDRDYEGVQIAPQQGFDPMSETPVGTWIGGITYSR YLVKGKEVLIPKPDNHFEAAKLSLEQALAGMGQTCDLTAAEVEKLKRIISQLQGLTTE QALNC"

SEQ ID NO: 3 (ORFlb o una poliproteína de ORFlb):

"TGFKLLAASGLTRCGRGGLWTETAVKIVKYHSRTFTLGPLDLK

VTSEAEVKKSTEQGHAWANLCSGWLMRPHPPSLVDVLLIPGLDTAPGIQPGHGAGN MGVNGAIWDFETAPTKAELELSKQIIQACEVRRGPAPNLQLPYKLHPVRGDPERRNGR LINTRFGDLPYKTPQDTRSAIHAACCLHPNGVPVSDGKSTLGTTLQRGFELYVPTVPY SVLEYLDSRPDTPFMCTKHGTSEAAAEDLQKYNLSTQGFVLPGVLRLVRRFIFGHIGK APPLYLPSTYPAKNSMAGINGQRFPTKDVQSIPEVDEMCARAVKDNWQTTTPCTLKKQ YCSKPKTRTILGTNNFIALAHRSALSGVTQAFMKKAWKSPIALGKNKFKELHCAVAGR CLEADLASCDRSTPAIVRWFTANLLYELAGCEEYLPSYVLNCCHDLVATQDGAFTKRG GLSSGDPVTSVSNTVYSLVIYAQHMVLSALKMGHEIGLKFLEEQLRFEDLIEIQPMLV YSDDLVLYAEKPTFPNYHWWVEHLDLMLGFKTDPKKTIITDKPSFLGCRIEAGRQLVP NRDRILAALAYHMKAQNASEYYASAAAILMDSCACIDYDPEWYEDLICGIARCARQDG YSFPGPAFFMSMWEKLKSHNEGKKFRHCGICDAKADHASACGLDLCLFHSHFHQHCPV TLSCGHHAGSKECPQCQSPVGAGKSPLDTVLQQIPYKPPRTVIMKVNNKTTALDPGRY QSRRGLVAVKRGIAGNEVDLADGDYQWPLLPTCKDINMVKVACNVLLSKFIVGPPGS

GKTTWLLNQVQEDWIYTPTHQTMFDIVSALKVCRYSIPGASGLPFPPPARSGPWVRL VASGHIPGRVSYLDEAGYCNHLDILRLLSKTPLVCLGDLQQLHPVGFDSCCYVFNQMP HKQLTTIYRFGPNICAAIQPCYKEKLESKARNTRWFTIRPVAYGQVLTPFHKDRVGS AITIDSSQGATFDWTLHLPTPRSLNKSRALVAITRARKGLFIYDPHNQLQEFFNLTP ERTDCNLVFNRGGELWLNSDNAVTTVAKVLEAGPSQFRVSDPRCKSLLAACSVSLEG SCMPLPQVAHNLGFYFSPDSPAFAPLPKELAPHWPWTCQNNQAWPDRLVASMRPIDA RYSKPMVGAGYWGPSTFLGTPGWSYYLTLYIKGEPRALPETLVSTGRIATDCREYL DAAE EEAAKELPHAFIGDVKGTTVGGCHHITSKYLPRSLPKDS VAWGVS SPGKAAKA VCTLTDVYLPDLRPYLQPETASKCWKLKLDFRDVRLMVWKGATAYFQLEGLTWSALPD YARFIQLPKDAWYIDPCIGPATANRKWRTTDWRADLAVTPYDYGAQTILTTAWFED LGPQWKILGLQPFKRAFGFENTEDWAILARRMNDGRDYTDYNWTCVRERPHAIYGRAR DHTYHFAPGAELQVELGKPRLPPE"

, SEQ ID NO: 4 (ORF2a o "proteína de envoltura GP2a glicosilada")

"MQWGHCGVKSPSCLWMPLLSSLSVWLTLSSFLPYCSGSPSQDGY

WSFYSEWFAPRFSVRALPFTLPNYRRSYEGLLPNCRPDVPQFAIKHPLGILWHMRVSH LIDEMVSRRVYQTMEHSGQAAWKQWAEATLTKLSQLDIVTHFQHLAAVEADSCRFLS SRLVMLKNLAVGNVS LLYNTTLDRVELIFPTPGTRPKLTDFRQWLISVHASIFS SVAS SVTLFWLWLRVPILRYVFGFHWPTATRRLS"

, SEQ ID NO: 5 (ORF2b o "proteína de envoltura GP2b glicosilada")

"MGSLWSKITQLFVDAFTEFLISWDIIIFLAILFGFTVAGWLLV

F L L R W C SAI LRSRTAVHS PELSKVL "

, SEQ ID NO: 6 (ORF3 o "proteína de envoltura GP3") "MAHQCARLHLLFCGLVSHFVRGALASGPNSTLCFWFPLAHGNTS

FELTINYTVCKPCLTRDAARQRLEPGRNMWCKIGHDRCEDRDHDELSMTIPPGYDNLK LEGYYAWLAFLSFSYAAQFHPELFGIGNVSRVFVDKVHQFVCAVHDGQNSTVSNGHNI SALYAAYYHHQIDGGNWFHLEWLRPFFSSWLVLNISWFLRRSPASPVSRHIYQILRPT RQRLPVSWSFKT SAASSLMGVQKRKAPAFMGS H L NW ”

, SEQ ID NO: 8 (ORF5 o GP5) "MRCSHKLGCILTPYPCCCWLFLLCTGLSWSFADGNGNSSTYQYI

YNLTICELNGTAWLSNHFQWAVETFVLYPWTHILSLGFLTTSHFFDTLGLGAVSVTG FCHTRYVLSSVYGVCALAAFICFTIRAAKNCMACRYARTRFTNFI'VDDRGRIHRWKSP IWEKLGKAEIGNDLITIKHWLEGVKAQPLTRTSAEQWEA"

, SEQ ID NO: 9 (ORF6 o "proteína de membrana M) "MGGIDDFCYDPTATQKLVLAFSITYTPIMIYALKVSRGRLLGLL HILIFLNCSFTFGYMTYVHFQSTNRVALTMGAWALLWGIYSFIESWKFITSRCRLCC LGRRYILAPAHHVESAAGLHSIPASGNRAYAVRKPGLTSVNGTLVPGLRSLVLGGKRA VKRGWNLVKYGR"

, SEQ ID NO: 10 (ORF7 o "proteína de la nucleocápside N") "MAGNNQSQRKKKNAAPMGNGQSVNQLCQLLGTMMKSQRQRSRGG QAKRKKPEKPHFPLAAEDDVRHHLTQTERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSPSGKIGFQ VEFMLPVTHTVRLIRVTSTSASQGVS"

La presente invención se describirá mediante ejemplos no limitantes, haciendo referencia a las siguientes figuras: Figura 1. Representación gráfica del grado de identidad de las secuencias del virus 14D 4A 3A con el prototipo europeo representado por el virus Lelystad (GenBank M96262.2 (SEQ ID NO: 20)). En la parte superior de la figura se reporta la extensión de la secuencia consenso, en la parte inferior se reporta la alineación de la secuencia del clon 14D 4A 3A con la del virus Lelystad, y en el centro se reporta el histograma que representa el grado de identidad entre las dos secuencias a lo largo de sus diversas porciones.

Figura 2. Representación gráfica del grado de identidad de las secuencias del virus 14D 4A 3A con el prototipo Norteamericano VR 2332 (GenBank U87392.3 (SEQ ID NO: 21)). En la parte superior de la figura se muestra la extensión de la secuencia consenso, en la parte inferior se muestra la alineación de la secuencia del clon 14D 4A 3A con la del prototipo Norteamericano VR 2332, y en el centro se muestra el histograma que representa el grado de identidad entre las dos secuencias a lo largo de las diversas porciones de las mismas.

Ejemplos

La cepa viral objetivo de la presente invención se seleccionó a partir de un aislado (BS/114S/2000) del suero sanguíneo de un cerdo abortado durante un brote de infección por PRRS en una granja porcina italiana. Dicho aislado se caracterizó por una alta virulencia no solo en condiciones de campo sino también en condiciones experimentales. Los animales infectados experimentalmente presentaban síntomas típicos de la patología, con hipertermia, depresión y anorexia tan grave que incluso conducían a la muerte. El virus persistió en el torrente sanguíneo durante un período de tiempo prolongado, generalmente igual a 28 días. (4, 7, 8)

El aislado viral se utilizó para infectar cerdos sin patógenos específicos (SPF) de 20 días de edad procedentes del rebaño SPF del Instituto Zooprofilattico Sperimentale della Lombardia e dell'Emilia Romagna (Experimental Zooprophylactic Institute of Lombardy and Emilia Romagna), Brescia. Los animales se infectaron intranasalmente (1 ml/fosa nasal) e intramuscularmente (1 ml) y los cerdos infectados se sometieron a observación clínica y determinaciones de viremia y respuesta de anticuerpos. Los animales se sacrificaron a la altura del pico de una enfermedad clínica manifiesta y los órganos diana, representados por los pulmones, las amígdalas y los ganglios linfáticos, se homogeneizaron individualmente, se analizaron para detectar la presencia del virus del PRRS y se utilizaron para investigaciones adicionales in vivo investigaciones.

El proceso se realizó un total de 22 veces, utilizando para cada nueva infección el virus obtenido de uno de los órganos anteriormente mencionados que presentaba la mayor concentración viral. Los animales se infectaron intranasalmente (1 ml/fosa nasal) e intramuscularmente (1 ml).

Los inventores repitieron después los pases in vivo para obtener en los cerdos, durante al menos 4 pases posteriores. Los inventores descubrieron que el virus no inducía signos clínicos y se detectó hipertermia durante unos pocos días y sólo en unos pocos cerdos, se detectó viremia en algunos de los cerdos infectados durante un corto período de tiempo. En la necropsia se demostró que el virus todavía estaba presente en los pulmones y las amígdalas y esporádicamente en los ganglios linfáticos y que mantenía la capacidad de estimular el sistema inmune con la inducción de anticuerpos humorales.

Para los últimos experimentos llevados a cabo con virus en el 22 pase en serie en cerdos, se utilizaron cuatro cerdos de 30 días libres de infección por PRRS e se infectaron experimentalmente con un homogeneizado de tejido derivado del ensayo anterior. Los animales se infectaron intranasalmente (1 ml/fosa nasal) e intramuscularmente (1 ml) y se sometieron a observaciones clínicas e investigaciones virológicas y serológicas. Los resultados confirmaron la ausencia de cualquier síntoma clínico evidente, hipertermia esporádica (2 de 4 sujetos) limitada a 2-4 días después de la infección, presencia del virus en los órganos diana (ganglios linfáticos inguinales, pulmones, amígdalas) extirpados durante el examen de necropsia y una respuesta serológica. Durante el examen de necropsia no se detectaron lesiones macroscópicas atribuibles a la infección por el virus del PRRS. El virus estuvo presente en las muestras de suero sanguíneo de solo pocos animales y por breves períodos, no más de 4 días, en contraste con lo observado en los primeros experimentos, en los que el virus se pudo encontrar en el torrente sanguíneo de todos los animales infectados por hasta 28 días.

El ácido nucleico del virus se evaluó mediante un ensayo de biología molecular. El RNA total se extrajo de 200 pl de sangre total o suero usando el Mini Kit RNeasy™ (Qiagen, Milán, Italia) mediante la plataforma QIAcube (Qiagen, Milán, Italia) según las instrucciones del fabricante. La síntesis del ADNc de la primera hebra se llevó a cabo en un volumen final de 20 pl. Se usaron tres pl de RNA total extraído como plantilla para la síntesis de ADNc en presencia de transcriptasa inversa M-MLV y hexámero aleatorio usando el kit GeneAMP (AB, Monza, Italia) según las instrucciones del fabricante. La amplificación por PCR en tiempo real de la sonda TaqMan® se realizó en el sistema CFX96™ Real -Time (Bio-Rad, Milán, Italia). La amplificación del PRRS se realizó mediante una reacción en una sola etapa utilizando un conjunto de cebadores y una sonda diseñados en el gen ORF 6 del virus del PRRS. Cada mezcla de PCR de 20 pl consistió en 1 * QuantiTect Virus Master Mix, 1 * QuantiTect Virus RT Mix (Qiagen, Milán, Italia), 0,4 pM de cada cebador, 0,2 pM de la sonda y 3 pl de RNA total. Las condiciones de amplificación fueron: retrotrascripción de RNA a 50°C durante 20 min, después 95°C durante 5 min seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95°C durante 15 s, hibridación-extensión a 60°C durante 45 s y lectura de placa (adquisición de datos fluorescentes). El límite del umbral de fluorescencia del CFX96 ™ Real-Time System se estableció automáticamente.

A pesar de este comportamiento clínico atenuado, los cerdos mostraron una respuesta de anticuerpos típica del virus del PRRS caracterizada por la síntesis de anticuerpos humorales no neutralizantes de la clase IgG aproximadamente 7-10 días después de la infección y una aparición tardía, aproximadamente 60 días después de la infección, de anticuerpos neutralizantes.

En particular, la prueba serológica se llevó a cabo mediante la prueba ELISA de inmunoensayo ligado a enzima utilizando un kit comercial (IDEXX PRRS X3 Ab Test, USA).

Las cepas virales del PRRS aisladas de pulmones, amígdalas y ganglios linfáticos de cerdo en dichos últimos experimentos, en particular el virus encontrado en los pulmones de uno de estos cerdos (no. 247), se sometieron individualmente a adaptación y cultivo en serie en la línea celular MARC-145 (riñón de mono fetal; código de catálogo IZSBS: BS CL 127).

La adaptación y el cultivo en la línea celular MARC-145 se obtuvieron solo después de resolver varios problemas ligados a las condiciones de cultivo y concebir una nueva estrategia de co-cultivo, que permitió obtener líneas celulares MARC-145 infectadas. Anteriormente, la adaptación del virus BS/114S/2000 a la línea celular MARC-145 se logró mediante la realización de pases en serie y no fue necesario recurrir a técnicas más sofisticadas como el co-cultivo. Esta estrategia comprende una primera etapa de infección con las cepas virales del PRRS aisladas en el último pase mencionado anteriormente de cultivos de células primarias de macrófagos alveolares porcinos (SAM), conocidas por ser las células más receptivas al primer aislamiento viral. Tras su positividad, las células MAS infectadas se cultivaron conjuntamente (método de co-cultivo) con células de la línea MARC-145. Por tanto, el virus fue capaz de replicarse en micrófagos y, una vez liberado por este último, fue absorbido por las células MARC-145. Esta estrategia permitió transferir la infección a la línea celular MARC-145, en la que el virus comenzó a replicarse activamente, induciendo el efecto citopático (CPE) típico del virus del PRRS.

El virus adaptado a la línea celular indicada y capaz de replicarse activamente, induciendo así un efecto citopático (CPE), se utilizó para investigaciones in vitro de pruebas serológicas y virológicas. Un lote inicial de virus con una concentración infecciosa conocida (10674 DCP50/ml) se preparó después en el décimo pase en la línea celular MARC-145 y se purificó mediante aislamiento de 5 placas y posterior amplificación. Para esta investigación, se preparó la línea celular MARC-145 en placas de 6 pocillos con un medio de cultivo enriquecido con suero bovino fetal al 5% y se incubó a 37°C en CO2 al 5%. Una vez que se alcanzó la confluencia, se eliminó el medio y los cultivos se infectaron con diluciones en serie de 10 veces del virus. Después de un período de absorción de 60 minutos a 37°C en CO2 al 5% se eliminó y se añadió una capa de agar al 1% a los cultivos y se dejó solidificar a temperatura ambiente. A continuación, las placas se incubaron a 37°C en CO2 al 5% y se comprobó diariamente la aparición de alteraciones celulares inducidas por el virus que, debido a la presencia de agar, dieron como resultado placas. A la dilución más alta, se retiraron algunas placas y se disolvieron suavemente en medio de cultivo y se inocularon en la línea celular MARC-145 preparada en botellas de 25 cm2. Tras la aparición de CPEs y la destrucción del sustrato celular, el virus se sometió a un proceso de purificación adicional como se indica. El proceso de purificación descrito se realizó tres veces y se aislaron tres placas, indicadas con los siguientes códigos: 14D2A1A; 14D4A3A; 16D5A2A.

El clon obtenido mediante purificación por medio de placas e indicado con el código 14D4A3A se sometió a secuenciación del genoma completo.

Pruebas cualitativas

Todos los clones se sometieron a investigaciones encaminadas a detectar cualquier contaminación bacteriana, fúngica, micoplasmática y viral.

En particular, se inocularon en medios microbiológicos específicos para el cultivo de agentes microbianos y fúngicos. Se investigaron las contaminaciones por bacterias, hongos y levaduras tras la inoculación de 2 ml de cada suspensión celular en medios microbiológicos (Agar Sabouraud, Triptic Soy Agar y/o Brain Heart Infusion, incubados a 30°C y 37°C, respectivamente). Además, se buscó una posible contaminación del micoplasma mediante una investigación por PCR en tiempo real utilizando el kit Mycosensor (Agilent Company, IT; M-Medical S.r.l., Milán, Italia). Por último, se buscó cualquier contaminación viral por medio de reacciones de biología molecular específicas para los siguientes virus.

virus de la pseudorrabia (PRV)

Circovirus

Torque Teno Virus (TTV)

Pestivirus (virus de la diarrea viral bovina - BVD y peste porcina clásica - CSF)

Parvovirus (PPV)

Virus del herpes linfotrópico porcino (PLHV)

Retrovirus endógenos porcinos (PERVs)

Gripe A

Virus de la hepatitis E (HEV)

Sistema de calidad

La actividad se llevó a cabo según los dos sistemas de calidad aplicados por el laboratorio y representados respectivamente por:

• ISO 9001 2008 (producción de cultivos celulares y biobanco IZSLER);

• ISO IEC 17025 (virus de referencia y métodos de análisis).

Preparación de lotes

Como se indicó anteriormente, solo uno de los tres clones obtenidos con el método de la placa e indicado con el código 14D4A3A se amplificó, tituló y sometió a secuenciación. La concentración de infección del lote preparado en el decimocuarto pase en la línea celular MARC-145 fue igual a 10574 dosis citopáticas (CPD)50/ ml calculada según la fórmula de Reed y Muench.

Pruebas cualitativas

Las pruebas realizadas mostraron que las poblaciones virales seleccionadas estaban libres de contaminaciones bacterianas, fúngicas, por levaduras y micoplasmas y libres de virus extraños. Las contaminaciones por bacterias, hongos, levaduras y micoplasmas se investigaron como se describió anteriormente.

Investigaciones experimentales adicionales in vivo

Se realizó una investigación experimental adicional in vivo con el fin de comprobar que los procesos de purificación implementados no habían inducido alteraciones en las características biológicas del virus, con particular referencia a las características de atenuación de la virulencia.

Con este fin, se realizó una prueba in vivo en dos cerdos de 30 días libres de infección por PRRS obtenidos de una granja libre de infección por PRRS en la provincia de Brescia y sometidos a la infección con el clon 14D4A3A.

Los métodos fueron los mismos que los utilizados en las pruebas anteriores y basados en la inoculación intranasal (1 ml/fosa nasal) y la inoculación intramuscular a la misma dosis (1 ml). Los animales no presentaron síntomas clínicos y ausencia de hipertermia. El virus se detectó en el torrente sanguíneo hasta el cuarto día después de la infección. Desde el quinto al sexto día se detectó en concentraciones extremadamente reducidas (en el límite de visualización) y fue completamente indetectable en los días siguientes.

Las investigaciones serológicas mostraron una respuesta de anticuerpos que ya era observable 6 días después de la infección (1 cerdo) y a los 14 días ambos cerdos presentaban anticuerpos específicos de acuerdo con lo encontrado en los experimentos anteriores.

En particular, la prueba serológica se llevó a cabo como se describió anteriormente.

El examen de necropsia realizado 14 días después de la infección no reveló ninguna lesión macroscópica atribuible a la infección por el virus del PRRS.

Los órganos diana (amígdalas, bazo, lóbulos pulmonares, ganglios linfáticos pulmonares, ganglios linfáticos mesentéricos, ganglios linfáticos inguinales) de los dos cerdos infectados resultaron positivos y la concentración viral más alta se encontró en las amígdalas y lóbulos pulmonares y apical, como se indica en la siguiente tabla.

El ácido nucleico del virus se evaluó mediante un ensayo de biología molecular, según los métodos descritos anteriormente.

Las pruebas microbiológicas, según los métodos descritos anteriormente, realizadas en los órganos diana de los dos cerdos no revelaron ninguna infección bacteriana o por micoplasma.

El clon viral 14D4A3A aislado ventajosamente no presentó ninguna variación en las características de la atenuación de la virulencia. Está indicado por los inventores como PRRS/IZSLER/2014.

Tabla 1. Resultados de la reacción de PCR en tiempo real realizada en los órganos de 2 cerdos infectados con el clon 14D4A3A del PRRS.

Los valores umbrales indicados con un asterisco son los que corresponden a una mayor concentración de ácido nucleico viral.

Secuenciación del genoma - Anotaciones y comparación con los virus Lelystad de referencia (GenBankM96262.2) y VR-2332 (GenBank U87392.3)

El clon 14D4A3A se centrifugó a 55000 g/60 min a 4°C; el sedimento se diluyó en 2 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) y se sometió a secuenciación del genoma como se indica a continuación. El clon 14D4A3A del virus del PRRS se sometió a extracción de RNA total con un kit específico con columnas (RNeasy mini kit, QIAGEN, Milán, Italia). El RNA extraído total se sometió a transcripción inversa con el cebador PRRS-RT (Tabla 2) específico para el virus del PRRS según procedimientos estándar.

El ADNc obtenido se sometió a amplificación con cebadores específicos con el fin de obtener 4 amplicones superpuestos capaces de cubrir el genoma del PRRS completo desde las regiones 5'UTR a 3'UTR (Tabla 2).

Los amplicones obtenidos mediante PCR se co-purificaron después con el kit NucleoSpin Gel and PCR Clean-up kit (MACh Er EY-NAGEL GmbH & Co. KG, Germany), se cuantificaron por espectrofotometría y se preparó la biblioteca de A d N para secuenciación con el kit Nextera-XT kit (Illumina, Inc. - Worldwide Headquarters, San Diego, CA 92122 USA). La reacción de secuenciación se llevó a cabo utilizando instrumentación Illumina MiSeq. El genoma viral se ensambló de novo con el software DNASTAR NGen (DNASTAR, Inc, WI, USA) y se analizó con DNASTAR Seqman Pro. Se obtuvo un solo contig de 15012 nucleótidos con el ensamblaje de 30712 secuencias elementales (lecturas), con una cobertura promedio de 372 (SEQ ID NO: 1). La secuencia obtenida se anotó con la ayuda del paquete de software GeneQuest DNASTAR.

Tabla 2. Secuencia de los cebadores usados para la transcripción inversa y amplificación del genoma del clon 14D4A3A del virus del PRRS.

La secuencia del clon del PRRSV en examen se alineó con las del virus Lelystad de la cepa del PRRSV de referencia (GenBank M96262.2), como prototipo de las cepas europeas, y VR-2332 (GenBank U87392.3), como prototipo de las cepas americanas.

El resultado de las alineaciones se muestra en forma agregada a continuación (Tabla 3).

Tabla 3. Similitud de secuencia de nucleótidos entre el clon 14D4A3 A del virus del PRRS y el virus Lelystad (GenBank M96262.2) y VR-2332 (GenBank U87392.3).

El clon 14D 4A 3A del virus del PRRS se alineó con el virus Lelystad (GenBank M96262.2) (prototipo europeo del virus del PRRS) y con VR-2332 (GenBank U87392.3) (prototipo americano del virus del p RRs ) utilizando el programa ClustalW.; el análisis mostró los porcentajes de identidad de nucleótidos indicados en la tabla no. 3. La Figura 1 y la Figura 2 son la representación gráfica de la alineación del clon 14D 4A 3A del virus del PRRS con el virus Lelystad (GenBank M96262.2) y con VR-2332 (GenBank U87392.3) respectivamente, preparado con Geneious.

REFERENCIAS

1) Balasuriya and Snijder (2008). "Arteriviruses". Animal Viruses. Molecular Biology. Caister Academic Press. ISBN 978­ 1-904455-22-6.

2) Barboza, David. Chinese Pig Virus Causes Concern Around the Globe. The New York Times. August 15, 2007.

3) Benfield D, Collins J, Dee S, Halbur P, Joo H, Lager K, et al. Porcine reproductive and respiratory syndrome. In: Straw BE, D'Allaire S, Mengeling WL, Taylor DJ, editors. Diseases of the swine. 8° ed. Ames, lowa: lowa State University Press; 1999. pp. 201-32.

4) Candotti P, Dotti S, Amadori M, Villa R, Lombardi G, RotaNodari S, Ferrari M. Experimental infection of pure bred landrace pigs with porcine respiratory and reproductive virus (PRRSV): clinical and laboratory findings. 20th IPVS Internationl Pig Veterinary Science Congress: Durban, South Africa, 22-26 June 2008: proceedings.

5) Cavenagh D. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. Arch Virol 1997; 142: 629-33. 6) Collins J, Benfield D, Christianson W, Harris L, Hennings J, Shaw D, et al. Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of the disease in gnotobiotic pigs. J Vet Diagn Invest 1992; 4: 117-26.

7) Corradi A, Ferrari M, Cantoni Am, Robotti C, Alborali L, of Lecce R, Candotti P, Sandri Gp, Borghetti P .Study on the virulence, cell-mediated immune response and histolesivity of three field PRRSV strains with an ORF 5 genetic variation Vet Res Commun . - Vol. 29 suppl 2 (2005). pp. 241-243.

8) Ferrari M, Tosini A, Corradi A, Borghetti P, Scalvini A, Cantoni Am, Ferrando L, Alborali° L. Experimental infection with a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) strain with relevant genomic mutations in the ORF5 region. PRRS PMWS swine influenza : 4th International Symposium on emerging and re-emerging pig disease: Rome, June 29th - July 2nd, 2003 : proceedings

9) Song J, Shen D, Cui J, Zhao B (Oct 2010). "Accelerated evolution of PRRSV during recent outbreaks in China". Virus Genes 41 (2): 241-5. PMID 20652733.

10) Kapur V, Elam MR, Pawlovich TM, Murtaugh MP. Genetic variation in porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the midwestern United States. J Gen Virol. 1996 Jun; 77 (Pt 6): 1271-6.

11) Lee, C. and Yoo, D. Cysteine residues of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus small envelope protein are non-essential for virus infectivity. J Gen Virol. 2005 Nov; 86 (Pt 11): 3091-6.

12) Meulenberg, J. J.; Hulst, M. M.; de Meijer, E. J.; Moonen, P. L.; den Besten, A.; de Kluyver, E. P.; Wensvoort, G., and Moormann, R. J. Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory síndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology. 1993 Jan; 192 (1): 62-72.

13) Meng XJ, Paul PS, Halbur PG, Morozov I. Sequence comparison of open reading frames 2 to 5 of low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J Gen Virol. 1995 Dec; 76 (Pt 12): 3181-8.

14) Murtaugh M.P, Xiao Z, Zuckermann F. Immunological responses of swine to porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Viral Immunol. 2002; 15: 533-547.

15) Nelsen C, Murtaugh M.P, Faaberg K. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continents. J Virol 1999; 73: 270-80.

16) Petrini S, Ramadori G., Villa R, Borghetti P, De Angelis E, Cantoni AM, Amici A, and Ferrari. Evaluation of Different DNA Vaccines against Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) in Pigs. Vaccines 2013, 1(4), 463- 480; doi: 10.3390/vaccines 1040463.

17) Stadejek T, Stankevicius A, Murtaugh MP, Oleksiewicz MB. Molecular evolution of PRRSV in Europe: Current state of play. Vet Microbiol. 2013; 165 : 21-8.

18) Thiel HJ, Meyers G, Stark R, Tautz N, Rumenapf T, Unger G, Conzelmann KK., Molecular characterization of positivestrand RNA viruses: pestiviruses and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Arch Virol Suppl.

1993; 7: 41-5.

19) Wensvoort G. Lelystad virus and the porcine epidemic abortion and respiratory syndrome. Vet Res 1993; 24: 117-24.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Cepa atenuada del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS) depositada en virtud del Tratado de Budapest en the Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes (CNCM), con n. CNCM 1-4859 el 5 de junio de 2014.

2. Polinucleótido aislado que comprende la molécula de RNA correspondiente a un polinucleótido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1 o el polinucleótido de SEQ ID NO: 1, o la secuencia complementaria del mismo.

3. Vector de expresión recombinante que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2.

4. Célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante según la reivindicación 3 o que comprende el polinucleótido según la reivindicación 2, preferiblemente dicha célula huésped se selecciona de la célula animal, vegetal, levadura, bacteria o célula de insecto, siendo más preferiblemente una célula porcina o de cerdo.

5. Composición inmunogénica que comprende la cepa según la reivindicación 1, o al menos un polinucleótido según la reivindicación 2, o al menos un vector según la reivindicación 3, o al menos una célula huésped según la reivindicación 4, y al menos un vehículo y/o adyuvante aceptable para uso veterinario.

6. La composición inmunogénica según la reivindicación 5 para uso médico, preferiblemente para uso como vacuna.

7. La cepa según la reivindicación 1, o el polinucleótido según la reivindicación 2, o el vector según la reivindicación 3, o la célula huésped según la reivindicación 4 para uso como medicamento, preferiblemente en la terapia de vacuna del síndrome reproductivo y respiratorio porcino.

8. La cepa según la reivindicación 1 o la composición inmunogénica de la reivindicación 5 para su uso en un método para prevenir que un cerdo se infecte por un PRRSV o desarrolle PRRS.