DE69533690T2

DE69533690T2 - Recombinante prrs viren -proteine und dieselben diagnosesätze und impfstoffe enthaltenden

Info

Publication number: DE69533690T2
Application number: DE69533690T
Authority: DE
Inventors: Juan Plana Duran; Jose Ignacio Casal Alvarez; Isabel Climent Sanchez
Original assignee: Wyeth Farma SA
Current assignee: Wyeth Farma SA
Priority date: 1994-05-13
Filing date: 1995-05-10
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2015-05-11
Also published as: GB2289279A; HK1014546A1; US5888513A; WO1995031550A1; EP0717108A1; GB9509392D0; ITTO950367A1; ATE280829T1; PT717108E; TW450977B; DE19517773A1; JPH09500544A; DK0717108T3; FR2719845A1; ITTO950367A0; IT1277996B1; DK53595A; NL1000365C2; AU699385B2; AU2409495A

Description

Umfang der Erfindung
Diese Erfindung betrifft virale rekombinante Proteine des verursachenden Wirkstoffs von Porcinem Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom (PRRS), hergestellt in einem Expressionssystem aus rekombinanten Baculoviren, multipliziert in permissiver Wirtszellkultur. Diese Erfindung betrifft ebenfalls diagnostische Kits und Impfstoffe, welche mindestens eines der besagten rekombinanten Proteine umfassen.
Geschichte der Erfindung
In Spanien wurden die ersten Fälle von respiratorischen Veränderungen bei Ferkeln in einer Gruppe von 300 Ferkeln, importiert aus Deutschland, Mitte Januar 1991, nachgewiesen (Plana et al., Med. Vet., Vol. 8, Nr. 11, 1991). Kurz danach wurde in zwei Zuchtherden auf zwei Farmen, welche nahe der Herde lagen, wo das anfängliche Problem aufgetaucht war, eine Krankheit nachgewiesen, welche durch eine abnorm hohe Anzahl an Aborten während der letzten Trächtigkeitsphase, als auch 70% Sterblichkeit bei Ferkeln gekennzeichnet war.
Die Ursache für diese epidemischen Ausbrüche war nicht bekannt, aber ihre Symptomatik war ähnlich der klinischen Anzeichen, die für eine Schweinekrankheit beschrieben worden waren, welche zuerst in Europa in Deutschland (1991) nachgewiesen wurde, und zu der Krankheit mit der Bezeichnung Mystery Swine Disease, welche in den Vereinigten Staaten und Kanada in 1987 nachgewiesen wurde (Hill, Proceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting, 6. Oktober, 1990, Denver, USA). Diese Krankheit beeinflusst trächtige Säue und verursacht bei ihnen unter anderem Anorexie, Abort, Totgeburten, mumifizierte Föten, schwache Ferkel, welche innerhalb weniger Lebensstunden sterben und respiratorische Probleme nach dem Ferkelwurf. Gegenwärtig ist die Krankheit als „Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom" (PRRS) bekannt, obwohl es vorher als „Blue-eared Pig Disease", „Mysterious Reproductive Syndrome" (MRS), „Swine Infertility and Respiratory Syndrome" (SIARS) und „Porcine Epidemic Abortion and Respiratory Syndrome" (PEARS) bezeichnet wurde.
Gegenwärtig ist bekannt, dass der verursachende Wirkstoff dieser Krankheit ein Virus mit der Bezeichnung PRRS-Virus (PRRSV) ist. Dieses Virus wurde zum ersten Mal in den Nieder landen durch eine Gruppe von Forschern der CDI/Lelystad isoliert, welche es als Lelystad Virus (LV) bezeichneten (Wesvoort, G. et. al., Vet. Quarterly, Vol. 3, 121–130, 1991). Einige Monate später wurde ein weiteres Isolat in Spanien durch Laboratorios Sobrino/Cyanamid (Plana et al., Vet. Microbiol., 33: 203.211, 1992) erhalten, welches in dieser Beschreibung als PRRS-Olot identifiziert werden wird. von der Zeit an sind neue Isolate dieses Virus beschrieben worden (EP-Antrag Nr. 0529584 A2, PCT-Antrag Nr. WO-93/06211 und WO/93/07898).
Die strukturellen Merkmale des PRRS-Virus sind in zwei kürzlichen Veröffentlichungen beschrieben worden:

a) Meulenberg, J. J. M., et al., „Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV", Virology, 192: 62–72, (1993); und
b) Cozelmann, K. -K. et al., „Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory Syndrome virus, a member of the Arterivirus group". Virology, 193: 329–339, (1993).

Das PRRS-Virus hat eine Größe von 50–60 nm mit einem Envelope von etwa 30–35 nm, enthalten in dem Nucleocapsid, und ein einzelnes RNA-Molekül als Genmaterial. Basierend auf diesen morphologischen Daten wurde PRRSV anfänglich als Togavirus klassifiziert, obwohl es basierend auf seiner genomischen Struktur und Transkription und Translationsmechanismen näher an der Coronaviridae-Familie war. Kürzlich und basierend auf Unterschieden und/oder Ähnlichkeiten im Vergleich mit den vorhergehenden Gruppen wurde seine Klassifizierung innerhalb einer neuen Familie mit der Bezeichnung Arteriviridae vorgeschlagen (Cavanagh D., et al., Arch. Virology, 1994). Zusammen mit PRRSV sind in dieser Gruppe die Pferde-Arteritis-Viren (EAV), Milch-Dehydrogenase-Virus (LDV) und hemorrhagisches Fiebervirus bei Affen (SHFV) eingeschlossen.
Kürzlich wurde das gesamte Lelystad Virus (LV) Genom (Meulenberg et al., oben zitiert), ein Gensegment des Tübingen (Deutschland) PRRS-Virus Isolats (TV) (Cozelmann et al., oben zitiert) und ein Segment des PRRS-Olot Virus (Spanischer Patentanspruch Nr. ES-P9301973) kloniert und sequenziert. Basierend auf allen erhaltenen Ergebnissen kann dargelegt werden, dass das PRRSV-Genom aus einem einsträngigen RNA-Molekül besteht, welches am 3'-Ende einen Poly-A-Schwanz enthält. Die Länge des Genoms beträgt etwa 15000 Basenpaare (bp) und es enthält in seiner Struktur sieben offene Leserahmen (ORFs), welche für die viralen Proteine kodieren. Die ORFs sind als ORF1 bis ORF7 bezeichnet worden und sie zeigen kleine überlappende Segmente zwischen ihnen. Es ist vorgeschlagen worden, dass die Synthese der viralen Proteine von einer Gruppe aus subgenomischen Transkripten (mRNA) von unterschiedlicher Länge aber mit ähnlichem 3'-polyadenylierten Ende und 5'-Leitersequenz erzeugt wird, welche aus der nicht-kodierenden 5'-Endsequenz stammen. Diese Form von viraler Proteinexpression ist als nested mRNA bezeichnet worden und ist vorhergehend für Coraniviren beschrieben worden (Spaan, W. J. M., Cavanagh, D., und Horzineck, M. C., J. Gen. virol., 69: 2939–2952, 1988). Basierend auf der Lelystad (LV) und Tübingen (TV) PRRSV Virusisolat-Nucleotidsequenz und durch Homologie mit was bei anderen Arteriviren beobachtet worden ist, ist vorgeschlagen worden, dass in dem viralen Genom ORF1 (a und b) für virale Polymerase und Replikase kodiert. ORFs 2 bis 6 würden für die viralen Envelope-Proteine kodieren und ORF7 würde für das Nucleocapsid-Protein kodieren. Virale Replikase und Polymerase sind große Proteine von 260, bzw. 163 kDa und beide enthalten drei mögliche Glykosilierungsstellen. Envelope-Proteine (ORFs 2 bis 6), welche sich am 3'-Ende befinden, sind klein, zwischen 30 und 19 kDa. Alle enthalten mehr als zwei mögliche Glykosilierungsstellen, insbesondere ORF3, welches 7 Stellen enthält. Alle diese Proteine enthalten hydrophobe Sequenzen an den Amino-(N-) und Carboxy-(C-)terminalen Enden, die als Leitersequenz und Membrananker fungieren können. Im Allgemeinen gibt es hydrophobe Proteine gemäß ihrer Lage in Verbindung mit einer Membran. Auf ORF6 sollte hingewiesen werden, mit 3 hydrophoben Segmenten, welche sich innerhalb der 90-Aminosäurereste am N-terminalen Ende befinden. Andererseits ist das durch ORF7 kodierte Protein, möglicherweise entsprechend dem viralen Nucleocapsid, mit Arginin-, Lysin- und Histidinresten am N-terminalen Ende extrem basisch. Die Aminosäuresequenzen von LV und TV viraler Polymerase, Strukturproteinen und Nucleocapsid zeigen eine Identität von zwischen 29% und 67% im Vergleich mit LDV-Virus und zwischen 20% und 36% im Vergleich mit EAV-Virus. Dies legt nahe, dass die Evolution des PRRS-Virus näher an LDV, als an EAV ist.
Die durch PRRSV verursachte Krankheit ist für schwere Verluste in der Schweineindustrie verantwortlich. Aus diesem Grund sind Impfstoffe entwickelt worden, welche in der Lage sind, die durch PRRSV verursachte Infektion zu verhindern.
Im Allgemeinen sind die Impfstoffe gegen bekanntes PRRSV, welche in Patentansprüchen WO-92/21375, WO-93/06211, WO-93/07898 und ES-P9301973 beschrieben werden, Impfstoffe, welche aus Viren erhalten werden, welche auf Makrophagen gezüchtet und nachfolgend inaktiviert werden. Patentanmeldung ES-P9301973 sieht einen Impfstoff vor, welcher in der Lage ist, Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom (PRRS) zu vermeiden. Vom Impfstoff ist gezeigt worden, dass er beim Vermeiden von reproduktiven Veränderungen in Säuen wie Werfen von Totgeburt, mumifizierten oder lebenden, aber schwachen Ferkeln, Wiederholung von Estrus und ähnlichen Problemen wirksam ist, welche durch das verursachende Virus von PRRS erzeugt werden. Ähnlich ist verifiziert worden, dass der Impfstoff zelluläre Immunität bei den geimpften Tieren herbeiführt. Der besagte Impfstoff enthält eine geeignete Menge an PRRS viralem Antigen, Spanischer Stamm (PRRS-Olot), inaktiviert, zusammen mit einem Hilfsstoff und Konservierungsstoff.
Die vorliegende Erfindung sieht einen Impfstoff der zweiten Generation vor, bei welchem rekombinante DNA-Technologie mit dem Ziel eingesetzt worden ist, neuartige Impfstoffe zu erhalten, welche in der Lage sind, wirksam vor der durch PRRSV verursachten Infektion zu schützen. Die Impfstoffe dieser Erfindung enthalten mindestens ein rekombinantes PRRSV-Protein. Andererseits sieht die vorliegende Erfindung neuartige PRRSV diagnostische Systeme oder Kits vor, welche die Verwendung von enzymatischer Immuntest-Techniken (ELISA) einbeziehen, welche rekombinante PRRSV-Proteine verwenden. Diese rekombinanten Impfstoffe erfordern keine Manipulation des gesamten Virus, sondern nur von einem Teil davon, was das Risiko eines Unfalls eliminiert, welcher Virus freisetzen würde, was einen beträchtlichen Vorteil gegenüber den gegenwärtigen inaktivierten PRRSV-Impfstoffen darstellt. Diese neuartigen rekombinanten Impfstoffe erfordern keine Manipulation des gesamten Virus, sondern nur von einem Teil davon, was das Risiko eines Unfalls eliminiert, welcher Virus freisetzen würde, was einen beträchtlichen Vorteil gegenüber den gegenwärtigen inaktivierten PRRSV-Impfstoffen darstellt.
Die Herstellung von rekombinanten Proteinen mittels Gentechnik ist eine Tatsache, die vorhergehend beschrieben worden ist. Es sind zahlreiche Expressions- und Produktionssysteme von rekombinanten Proteinen bekannt. Eines der wirksamsten Systeme zur Herstellung von rekombinanten Proteinen in großem Maßstab basierte auf der Replikation von rekombinanten Baculoviren, abgeleitet vom Autographa californica nuklearen Polyhedrose-Virus (AcNPV) in Insektenzellen in Kultur. Die Beschreibung der Baculovirus-Expressionstechnik wird in den folgenden Artikeln beschrieben:

a) Luckow, V. A. & Summers, M. D., „Trends in the development of baculovirus expression vectors". Bio/Technology, 6: 47–55, (1988); and
b) Bishop, D. H. L., „Baculovirus expression vectors". Seminars in VIROLOGY, 3: 253–264 (1992).

Diese Erfindung sieht rekombinante PRRSV-Proteine vor, insbesondere des PRRS-Olot Isolats, hergestellt in einem Expressionssystem von Baculoviren, multipliziert an permissiver Wirtszellkultur. Die rekombinanten Baculoviren, welche in der Lage sind, solche rekombinanten Proteine herzustellen, als auch die verwendeten Transfervektoren, stellen zusätzliche Gegenstände der Erfindung dar. Die Verfahren zum Erhalten solcher rekombinanten Baculoviren und Proteine sind ebenfalls Gegenstand dieser Erfindung.
Die Erfindung sieht ebenfalls neuartige Impfstoffe zur Impfung von Schweinen zu ihrem Schutz vor der durch PRRSV verursachten Infektion vor, welche mindestens ein rekombinantes Protein von denjenigen, welche durch diese Erfindung vorgesehen werden, und einen angemessenen Träger oder Hilfsstoff umfassen.
Die Erfindung sieht ebenfalls ein diagnostisches Kit vor, um die Gegenwart von Antikörpern nachzuweisen, die speziell PRRSV in einer biologischen Probe von Schweinen (z. B.: Blut, Serum, Auswurf, Speichel oder Milch) erkennen. Das Kit umfasst mindestens ein rekombinantes Protein von jenen, welche durch diese Erfindung vorgesehen werden, und angemessene Nachweisverfahren.
Die Erfindung sieht ebenfalls ein diagnostisches Kit zum Nachweis der Gegenwart von Antigen (PPRSV) in einer biologischen Probe von Schweinen (z. B.: Blut, Serum, Auswurf, Speichel, Milch oder Gewebe) vor. Das Kit umfasst mindestens einen Antikörper, welcher speziell PRRSV erkennt, erhalten durch Immunisieren von Tieren mit mindestens einem rekombinanten Protein von jenen, welche durch diese Erfindung vorgesehen werden, und angemessenen Nachweismitteln.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt die fortlaufende Sequenz des 3383 bp, kloniert vom PRRS-Olot Isolat.
2 zeigt die Aminosäuresequenz entsprechend den Proteinen, welche durch ORF2 (2A), ORF3 (2B), ORF4 (2C), ORF5 (2D), ORF6 (2E) und ORF7 (2F kodiert werden.
3 zeigt die unterschiedliche Extension von Klonen pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148, pPRRS-153 und pPRRS-3 im Vergleich mit LV, als auch die ORFs, welche in jedem von ihnen enthalten sind. In dieser Figur wird auf das PRRSV Genom (a), Größe in Kb (b) und Zahl des Klons (c) verwiesen.
4 zeigt pPRRS-3 Klon, welcher das Gen des durch ORF2 kodierten Proteins enthält.
5 zeigt pPRRS-121 Klon, welcher das Gen des durch ORF3 kodierten Proteins enthält.
6 zeigt pPRRS-146 Klon, welcher das Gen des durch ORF4 kodierten Proteins enthält.
7 zeigt pPRRS-132 Klon, welcher das Gen des durch ORF5 kodierten Proteins enthält.
8 zeigt pPRRS-8 Klon, welcher die Gene der durch ORF6 und ORF7 kodierten Proteine enthält.
9 zeigt die Ergebnisse von Antigen-Titration durch ELISA (Extinktion überwacht bei 405 nm). 9 zeigt die Ergebnisse von Antigen-Titration durch ELISA. In der Figur wird auf die Antigen-Titration (a), Extinktionswerte gelesen bei 405 nm (b) und Antigen-Verdünnungen [in Einheiten von 1/] (c) verwiesen.
10 zeigt die Ergebnisse der Titration durch ELISA von einem PRRS-Feldserum, welches in einem infizierten Tier erhalten wurde. Die Figur verweist auf die Titration des Serums (a), Extinktionswerte, gelesen bei 405 nm (b) und Serumverdünnungen [in Einheiten von 1/] (c).
11 zeigt die Ergebnisse, welche aus einem Probennahmeversuch mit mehreren Dutzend Feldseren erhalten wurden. Die Figur verweist auf die Titration der Seren (a), Extinktionswerte, gelesen bei 405 nm (b) und die Seren (c).
Beschreibung der Erfindung
Unser Labor hat in den letzten Jahren eine Suche nach dem PRRS verursachenden Wirkstoff durchgeführt. Die Hauptkonsequenz hiervon ist die Isolierung des Virus mit der Bezeichnung PRRS-CY-JPD-P5-6-91 gewesen. Es wurde am ECACC (mit der Eingangsnummer V93070108) hinterlegt und ein Impfstoff gegen PRRSV wurde entwickelt, welcher das inaktivierte Virus enthielt (Patentanmeldung ES-P9301973).
Seitdem haben sich unsere Forschungsanstrengungen auf die Isolierung und Klonierung des PRRSV (PRRS-CY-JPD-P5-6-91) Genoms, bezeichnet als PRRS-Olot in dieser Beschreibung gerichtet, um die Entwicklung von neuartigen rekombinanten Impfstoffen zu ermöglichen, welche gegen die durch PRRSV verursachte Infektion wirksam sind. Zu dem Zweck ist ein Genomsegment des besagten PRRS-Olot Genoms kloniert worden. Das klonierte Fragment entspricht dem 3'-Virusgenom und stellt eine fortlaufende Sequenz aus 3338 bp dar. Dieses Segment enthält die sechs offenen Leserahmen, entsprechend ORFs 2 bis 7, welche für LV und TV beschrieben wurden. Sie kodieren für die Strukturproteine des Virus (Nucleocapsid und Envelope), welche möglicherweise in viraler Antigenizität und Immunogenizität einbezogen sind. Die durch PRRS-Olot ORFs 2 bis 7 kodierten Proteine ähneln den entsprechenden LV und TV Proteinen. Ihre Merkmale werden in Tabelle 1 zusammengefasst, wo in Bezug auf jedes ORF die relativen Positionen der Nucleotide, die Anzahl der Basepaare (bp), die Anzahl der Aminosäuren (Aac), das Molekulargewicht jedes Proteins (in KDa) und die Glykosilierungsstellen angezeigt werden.
Tabelle 1 Merkmale der PRRS-Olot Virus ORFs
1, welche diese Beschreibung begleitet, zeigt die vollständige fortlaufende Sequenz der 3385 bp des klonierten Fragments entsprechend dem 3'-Ende des PRRS-Olot Virusgenoms. Diese Nucleotidsequenz zeigt 95% Homologie im Vergleich mit den entsprechenden Sequenzen der LV und TV Isolate. Diese beiden letzteren Isolate zeigen untereinander 99% Homologie. Die Veränderungen in der Nucleotidsequenz in dem PRRS-Olot Isolat werden entlang der gesamten Sequenz gefunden, aber konzentrieren sich besonders im 5'-Ende. Wir sollten im Vergleich mit LV die Deletion von drei Nucleotiden an Position 1860 von PRRS-Olot herausstreichen.
2 (2A–2F) dieser Beschreibung zeigt die Aminosäuresequenzen der Proteine, kodiert durch ORFs 2 bis 7 des PRRS-Olot Virus. Auf Protein-Level wird 99% Homologie zwischen PRRS-Olot und LV ORF7 beobachtet, wie erwartet für ein Nucleocapsid-Virusprotein und daher das mehr konserviertere. Der Prozentsatz an Homologie für den Rest der Proteine rangiert zwischen 93% für ORFs 3, 4 und 5 und erreicht einen Wert von 96,5% für ORFs 2 und 6. Alle davon zeigen Glykosilierungsstellen ähnlich denjenigen, welche für LV beschrieben werden, außer für ORF4 des PRRS-Olot Virus, welches eine extra Glykosilierungsstelle hat. Bezüglich der oben erwähnten Veränderungen bei den PRRS-Olot Protein Aminosäuren sind 50% der Veränderungen in chemisch ähnlichen Aminosäuren, während der Rest der Veränderungen in unterschiedlichen Aminosäuren ist. Wie für LV erwähnt, zeigt außer ORF7 der Rest der Proteine einen hohen Grad an Hydrophobizität, möglicherweise in Übereinstimmung mit ihrer Verbindung zu Membranen, da sie virale Envelope-Proteine sind.
Rekombinante Proteine, welche der Expression von PRRS-Olot ORFs 2 bis 7 entsprechen, können in einem geeigneten Expressi onssystem hergestellt werden und vorteilhafterweise in einem Expressionssystem aus rekombinanten Baculoviren, multipliziert in permissiver Wirtszellkultur. Das globale Verfahren für den Erhalt dieser rekombinanten Proteine umfasst grundsätzlich die folgenden allgemeinen Stufen:

I. Herstellung der cDNA-Sequenz, welche in einen Baculovirus zu insertieren ist; und
II. Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche die rekombinanten Proteine exprimieren.

Diese allgemeinen Stufen werden ihrerseits in weitere Unterstufen unterteilt. Auf diese Weise umfasst die Herstellung der zu insertierenden cDNA Sequenz die Unterstufen:

I.a Isolierung und Reinigung des PRRS-Olot Virus;
I.b Isolierung der viralen RNA des PRRS-Olot Virus; und
I.c Synthetisieren der cDNA aus der PRRS-Olot Genom-RNA.

Andererseits umfasst der Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche die rekombinanten Proteine entsprechend PRRS-Olot ORFs 2 bis 7 exprimieren, die Unterstufen:

II.a Herstellung des zu insertierenden PRRS-Olot ORF Gens;
II.b Insertieren des besagten Gens in einen Baculovirus-Transfervektor;
II.c Transfektion von permissiven Wirtszellen mit dem besagten Transfervektor, dem das entsprechende PRRS-Olot ORF Gen insertiert wurde;
II.d Selektion der rekombinanten Baculoviren, welche das rekombinante Protein exprimieren, entsprechend dem insertierten ORF.

Die Kennzeichnung der rekombinanten Baculoviren und die Analyse und Reinigung der rekombinanten Proteine werden dann durchgeführt.
Alle diese Stufen werden weiter unten in dieser Beschreibung detailliert beschrieben.
Das eingesetzte Verfahren für den Erhalt der rekombinanten Proteine, vorgesehen durch diese Erfindung, beginnt mit der Isolation und Reinigung des PRRSV, speziell PRRS-Olot, gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Protokoll. Sobald das PRRS-Olot isoliert und gereinigt worden ist, wurde die virale RNA isoliert und zu diesem Zweck wurde ein kommerzielles Kit (Pharmacia) verwendet, welches von einem Verfahren Gebrauch macht, welches auf der Selektion und Reinigung der viralen RNA basiert, welche eine Poly(A) Sequenz am 3'-Ende enthält (Beispiel 2). Die erhaltene RNA wurde in neutralen Agarosegels bei 0,7% durch Einfärben mit Ethidiumbromid analysiert und nur ein Materialband mit einem Molekulargewicht von zwischen 5000 und 23000 bp wurde beobachtet.
Danach wurde die cDNA entsprechend der 3'-Ende Virus-RNA mit einem kommerziellen Kit (Boehringer) mittels einer Strategie synthetisiert (Beispiel 3), welche die Gegenwart eines Poly(A)-Schwanzes nutzt und ein Oligo-d(T) als Extensionsprimer verwendet, welcher in der Lage ist, mit reversem Transkriptaseenzym erweitert zu werden und cDNA-Moleküle zu synthetisieren. Um die RNA-Regionen oberhalb von 3' zu klonieren, wurde ein Oligonucleotid verwendet, welches an eine spezielle virale Genomsequenz anlagert, die sich etwa bei 2500 bp vom 3'-Ende befindet. Eine zweite Synthese wurde unter Verwendung eines Oligonucleotids von 20 Nucleotiden anstelle des Oligo-d(T)₁₂ durchgeführt (Beispiel 3.1). Die cDNA-Synthese wurde mittels Zählen der in dem synthetisierten Material eingeschlossenen Radioaktivität und Elektrophorese in alkalischen und neutralen Agarosegels verifiziert und quantifiziert. Hiernach wurde das Klonieren und Sequenzieren der cDNA durchgeführt (Beispiel 3.2). Zu diesem Zweck war die erste Tat eine Größenselektion von synthetisierten cDNA-Fragmenten von zwischen 1000 und 5000 nt (Nukleotiden). Die gereinigte cDNA wurde in stumpfe Enden in pMTL25-Vektor kloniert. Die Analyse der PRRSV-positiven Klone wurde mittels Plasmid-DNA Präparaten und Mapping der Restriktionsstellen, basierend auf der LV-Sequenz durchgeführt. Nur 9 der 300 analysierten Plasmide waren positiv und enthielten Inserts von zwischen 800 und 2600 bp. Die definitive Verifizierung der Authentizität dieser cDNA Klone wurde durch ihr direktes Sequenzieren unter Verwendung des Dideoxys-Verfahrens durchgeführt, welches auf doppelsträngige Plasmide angewendet wird.
Die Mehrzahl der erhaltenen positiven PRRS-Klone enthielt ein gewöhnliches Poly(A)-Ende und unterschiedliche 5'-Enden. Die Klone wurden als pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148 und pPRRS-153 bezeichnet. Klon pPRRS-3 wurde aus der zweiten Synthese extrahiert.
Um die rekombinanten Baculoviren zu erhalten, welche die Gene der Proteine, kodiert durch PRRSV-Olot ORFs 2 bis 7 expri mieren, wurde dem folgenden Verfahren allgemein und separat gefolgt: Zuerst wurde das Gen von jedem zu insertierenden ORF hergestellt, außer das ORF3-Gen, welches keine vorhergehende Herstellung erforderte. Für die Herstellung dieser Gene und je nach jeweiligem besonderen Fall wurden die pMTL25, pMTL24 und pMTL22 Plasmide verwendet, bevor sie in Baculovirus-Transfervektoren transferiert wurden. Die Gene entsprechend ORFs 2 bis 7 wurden aus den Klonen erhalten, welche vorhergehend erhalten worden waren. Nach aufeinander folgenden Manipulationen erzeugten sie neuartige rekombinante Plasmide. Die rekombinanten Plasmide, welche die Gene entsprechend jedem insertierten ORF enthielten, wurden durch Folgen der alkalischen Lysis-Technik gereinigt und wurden durch Mapping mit Restriktions-Endonukleasen und Sequenzieren der Insertionsregionen gekennzeichnet. Die erhaltenen, neuartigen Vektoren wurden als pPRRS-ORFN bezeichnet, wobei N für die Zahl jedes ORF steht (N = 2 bis 7).
Dann wurde jedes ORF-Gen in einen geeigneten Transfervektor kloniert. Der verwendete Transfervektor war pAcYM1 (Matsuura et al., J. Gen Virol. 68, 1233–50). Nach aufeinander folgenden Manipulationen wurden neuartige rekombinante Plasmide erzeugt, von denen jedes das insertierte ORF-Gen enthielt. Die erhaltenen rekombinanten Plasmide wurden der alkalischen Lysis-Technik folgend gereinigt und durch Mapping mit Restriktions-Endonukleasen gekennzeichnet. Die Insert-Enden wurden sequenziert, um korrekte Insertregion-Sequenz zu verifizieren. Die erhaltenen neuartigen Transfervektoren wurden analysiert, um zu verifizieren, dass die insertierten Gene die richtige Ausrichtung für ihre Expression durch den AcNPV Virus Polyhedrin Promotor hatten. Die erhaltenen Transfervektoren waren:

Bezeichnung ORF

pPRRS-Bac8 2

pPRRS-Bac2 3

pPRRS-Bac9 4

pPRRS-Bac3 5

pPRRS-Bac5 6

pPRRS-Bac7 7
Spodoptera frugiperda Zellen, Sf 9 Klon, wurden dann mit Ge mischen aus gereinigter, infektiöser DNA des AcRP23-lacZ parenteralen Virus und dem entsprechenden Transfervektor transfiziert. Sobald diese Transfektion durchgeführt worden war, wurden die rekombinanten Baculoviren durch Plaque Phenotyp Farbtest nach dem Einfärben des viralen Abkömmlings mit X-gal identifiziert und dann gereinigt.
Die erhaltenen Baculoviren wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Whiltshire SP4 OJG (U.K.) hinterlegt.
Beispiele 4 bis 9 beschreiben detailliert den Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche die Gene exprimieren, welche durch ORFs 2 bis 7 kodiert werden.
Die PRRS-Olot ORF 2 bis 7 rekombinanten Proteine können zu Diagnosezwecken verwendet werden, um die Gegenwart von spezifischen PRRSV-Antikörpern nachzuweisen (Beispiel 12), und um die Gegenwart von Antigen (PRRSV) mittels Antikörpern nachzuweisen, die speziell das PRRSV identifizieren, welches durch Immunisierung von Tieren mit mindestens einem rekombinanten Protein entsprechend einem von PRRS-Olot ORFs 2 bis 7 erhalten wird. Zusätzlich können diese Proteine auch verwendet werden, um Tiere gegen PRRSV zu immunisieren. Daher können die besagten Proteine verwendet werden, um rekombinante Impfstoffe zu formulieren, welche in der Lage sind, Schweine vor Infektion wirksam zu schützen, welche durch PRRSV verursacht wird. Diese Impfstoffe können aktiv oder passiv sein. Aktive Impfstoffe können durch Suspendieren von mindestens einem der rekombinanten Proteine, welche durch diese Erfindung vorgesehen werden, in einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel und einem Hilfsstoff hergestellt werden. Ein passiver Impfstoff kann durch Immunisieren von Tieren mit den besagten Proteinen und Isolieren der polyklonalen Antikörper gegen die besagten Proteine erhalten werden. Nach Antikörperisolierung und Reinigung können sie in Impfstoffanwendungen verwendet werden. In einer speziellen Ausführungsform dieser Erfindung werden rekombinante Impfstoffe erhalten, welche in der Lage sind, vor der durch PRRSV verursachten Infektion wirksam zu schützen, welche das virale Antigen (antigene Phase) zusammen mit einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel und einem Hilfsstoff umfassen.
Für die Herstellung der antigenen Phase wurden Insektenzel len, vorzugsweise Spodoptera frugiperda Zellen, mit unterschiedlichen rekombinanten Baculoviren infiziert, welche in der Lage waren, die rekombinanten Proteine entsprechend den PRRSV ORFs 2 bis 7 herzustellen, und unter Bedingungen inkubiert, welche für die Expression der besagten Proteine geeignet sind. Direkt danach wurden die Zellen gesammelt, gewaschen, in geeignetem Puffer resuspendiert und dann bei der Herstellung der vorher erwähnten rekombinanten Impfstoffe verwendet.
In einer speziellen Ausführungsform setzt sich die antigene Phase aus einem Homogenat von Insektenzellen, infiziert mit rekombinanten Baculoviren zusammen, welche ein einzelnes rekombinantes PRRSV-Protein exprimieren, wie vorzugsweise ORF3, ORF5 und ORF7 (Beispiel 13). In einer weiteren speziellen Ausführungsform setzt sich die antigene Phase aus einem Homogenat von einem Gemisch aus Insektenzellen, infiziert mit unterschiedlichen rekombinanten Baculoviren zusammen, welche jeweils ein unterschiedliches rekombinantes PRRSV-Protein exprimieren, wie ein Gemisch aus Insektenzellen, infiziert mit den rekombinanten Baculoviren, welche zum Beispiel die Proteine exprimieren, welche ORF3, ORF5 und ORF7 entsprechen.
Im Allgemeinen wurden Impfstoffe formuliert, welche als antigene Phase eine Menge von etwa 50 × 10⁶ Insektenzellen, infiziert mit Baculoviren enthalten, welche die rekombinanten fraglichen Proteine exprimieren. Wenn der Impfstoff unterschiedliche rekombinante Proteine enthält, setzt sich die antigene Phase aus einer Menge von etwa 50 × 10⁶ Insektenzellen, infiziert mit Baculoviren pro fraglichem rekombinanten Protein zusammen, also für eine Formulierung eines Impfstoffs, welcher die Proteine entsprechend ORFs 3, 5 und 7 enthält, setzt sich die antigene Phase aus etwa 50 × 10⁶ Insektenzellen, infiziert mit Baculoviren, welche das ORF3 rekombinante Protein exprimieren, 50 × 10⁶ Insektenzellen, infiziert mit Baculoviren, welche das ORF5 rekombinante Protein exprimieren und 50 × 10⁶ Insektenzellen, infiziert mit Baculoviren, welche das rekombinante ORF7 Protein exprimieren, zusammen (Beispiel 13).
Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen (PBS) oder andere ähnliche Kochsalzlösungen können als immunologisch annehmbare Verdünnungsmittel verwendet werden.
Als Hilfsstoff kann im Allgemeinen jeder der Hilfsstoffe verwendet werden, die üblicherweise verwendet werden, um Impfstoffe zu formulieren, entweder wässerig, wie Aluminiumhydroxid, Tonerde-Gel-Suspensionen, QuilA oder weitere, wie ölige Hilfsstoffe, basierend auf Mineralölen, Glyceriden und Olein-Ether-Säure Derivate. Insbesondere ist bestätigt worden, dass ein öliger Hilfsstoff, bestehend aus einem Gemisch aus Marcol^® 52, Simulsol^® 5100 und Montanide^® 888 sehr gute Ergebnisse ergibt. Marcol^® 52 ist ein Mineralöl mit geringer Dichte, hergestellt durch Esso Espanola S. A., Simulsol^® 5100 ist ein Polyethoxyoleatether, kommerzialisiert durch SEPIC und Montanid^® 888 ist ein Anhydromannitol-Octadecenoatether von hoher Reinheit, kommerzialisiert durch SEPIC.
Die Impfstoffe dieser Erfindung können auch Zellresponsepotentiator(CRP)-Substanzen enthalten, also Substanzen, welche Helfer T-Zellen Unterpopulationen (Th₁ und TH₂) potenzieren, wie IL-1 (Interleukin-1), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN (Gamma Interferon), Zellnekrosefaktor und ähnliche Substanzen, welche theoretisch Zellimmunität in geimpften Tieren hervorrufen könnten. Diese CRP-Substanzen könnten in Impfstoffformulierungen mit wässerigen, als auch öligen Hilfsstoffen verwendet werden.
Ähnlich können weitere Hilfsstofftypen verwendet werden, die Zellresponse modulieren und immunstimulieren, wie MDP (Muramyldipeptid), ISCOM (Immuno Stimulant Complex) oder Liposome.
Die Impfstoffe dieser Erfindung können durch Suspendieren oder Mischen der antigenen Phase mit dem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel und dem Hilfsstoff erhalten werden. Wenn der Hilfsstoff ölig ist, wird eine Emulsion gebildet, welche in einem speziellen und bevorzugten Fall, falls der Hilfsstoff ein Gemisch aus Marcol 52, Simulsol 5100 und Montanide 888 ist, der Impfstoff eine doppelte Wasser/Öl/Wasser Emulsion, Typ w/o/w sein wird.
In dem Fall, dass der Impfstoff CRP-Substanzen enthalten wird, können diese Substanzen sowohl zur antigenen Phase, als auch zum Hilfsstoff zugegeben werden. Alternativ, falls der Impfstoff keine CRP-Substanzen enthält, können diese, falls so gewünscht, gleichzeitig in eine getrennte Stelle injiziert werden, welche sich von der Stelle der Inokulation unterscheidet.
Zusätzlich können diese Impfstoffe Kombinationen aus unterschiedlichen porcinen Pathogenen enthalten, welche neben einem rekombinanten PRRSV-Protein oder mehreren ein oder mehrere der unten erwähnten Pathogene enthalten, was die Herstellung von polyvalenten Impfstoffen erlaubt. Unter diesen Pathogenen, aber nicht exklusiv darauf beschränkt, sind Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Porcines Parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcines Respiratorisches Virus, Rotavirus oder gegen die Pathogene, welche für Aujeszky-Krankheit, Schweine-Influenza und übertragbare Gastroenteritis verursachend sind.
Sicherheits- und Wirksamkeitsversuche mit den Impfstoffen der vorliegenden Erfindung haben bewiesen, dass die besagten Impfstoffe sicher und zur gleichen Zeit wirksam sind.
Es ist möglich gewesen zu bestätigen, dass eine Dosis von 2 ml von einer Menge an viralem Antigen oder antigener Phase gleich oder höher als 50 × 10⁶ infizierten Insektenzellen, welche ein oder mehrere der rekombinanten PRRSV-Proteine exprimieren, verabreicht auf tiefem intramuskulären Weg, gefolgt von einer Wiederimpfung mit einer Dosis von 2 ml Impfstoff, geimpfte Tiere vor der durch PRRSV verursachten Infektion wirksam schützen kann. Ähnlich ist es möglich gewesen zu verifizieren, dass einige der Impfstoffe die Gegenstand des Versuchs waren, jene, welche als rPRRS C und rPRRS D identifiziert wurden, fähig sind, zelluläre Immunität in geimpften Tieren herbeizuführen, basierend auf der Tatsache, dass Säue, welche mit besagten Impfstoffen geimpft und wiedergeimpft wurden, sich im Moment des Challenge nicht serologisch zeigten und dennoch geschützt wurden (Beispiel 14, Tabellen 4 und 10).
Zum Zweck der Bestimmung und Bewertung der Wirksamkeit der hergestellten rekombinanten Impfstoffe beim Verhindern von PRRS bei trächtigen Säuen wurde ein Test entworfen, welcher aus der Impfung von trächtigen Säuen mit den unterschiedlichen Impfstoffen und dann ihre Unterwerfung unter einen Aussetzungstest mit virulenten Viren bestand. Basierend auf den erhaltenen Ergebnissen ist es möglich gewesen, die Wirksamkeit der Impfstoffe die Gegenstand dieses Tests waren zu bewerten. Um die Wirksamkeit dieser Impfstoffe zu bewerten, wurden die reproduktiven Ergebnisse, die Anzahl sowohl der lebenden, als auch toten Ferkel bei unterschiedlichen Stadien des Lebenszeitraums der Ferkel, als auch die Analyse der serologischen Ergebnisse in Säuen und Ferkeln in Betracht gezogen (Beispiel 14).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung (Beispiele)
Beispiel 1. Erhalt und Reinigung des PRRS-Olot Virus
1.1 Erhalt von Aleveolar-Makrophagen von Schweinelunge
1.1.1 Tiere
7 bis 8 Wochen alte Schweine, eine Kreuzung zwischen Belgischer Landrasse und Large White Zucht wurde verwendet. Die Tiere von unseren eigenen Farmen waren seronegativ gegenüber den folgenden Krankheiten: Aujeszky, porciner Parvovirose, Maul-und-Klauen, klassischem Schweinefieber, Schweine-Influenza (Typen H1N1 und H3N2) und übertragbarer Gastroenteritis.
1.1.2 Isolierung von Makrophagen
Die Tiere wurden durch Injizieren von 0,1 g Natriumthiopental pro 10 kg Körpergewicht in die Halsader anästhetisiert. Dann wurden sie geopfert und die Lungen wurden nach Abbinden der Trachea unterhalb der Epiglottis und Aufteilung oberhalb der Abbindung entnommen. Die entnommene Lunge wurde außen mit PBS gewaschen. Aufeinander folgende innere Wäschen wurden durchgeführt (4 bis 5) mit insgesamt 500 ml PBS, ergänzt durch Antibiotika bei 1 : 500 (PEG-Lösung: 1000 IU/ml Penizillin, 1 mg/ml Streptomycin und 0,5 mg/ml Gentamicin), um Makrophagen zu erhalten. Diese Wäschen wurden zusammen gesammelt und bei 300 g für 15 Minuten zentrifugiert. Der folgende Schritt war, die Zellen zweimal mit PBS mittels aufeinander folgender Zentrifugation/Sedimentation zu waschen, um zum Schluss in DMEM-Medium (DMEM, ergänzt durch nicht-essentielle Aminosäuren bei 100×, GIBCO) zu resuspendieren, welches Natriumpyruvat 1 mM und Antibiotika (1 : 1000 PEG) enthielt.
Die Zellen wurden durch Färben mit Trypan-Blau in einer Newbauer-Kammer gezählt. Es wurden 0,1 ml von 10^–1 Makrophagensuspension zu 0,4 ml DMEM und 0,5 ml Trypan-Blau Lösung zugegeben. In der Mehrzahl der Fälle lag die Anzahl der erhaltenen Zellen zwischen 1 und 1,2 × 10⁹.
Sterilitätskontrollen wurden an den Makrophagenzellen mittels Saaten in Kulturmedien durchgeführt, welche für den Nachweis von Bakterien und Pilzen geeignet sind. Abwesenheit von Mycoplasma wurde durch zytochemischen Nachweis mit DAPI (4',6-Diamidino-2-phenylindol) verifiziert, welches sich selektiv an die DNA bindet, und bildet hochgradig spezifische DNA-DAPI-Fluo reszenzkomplexe.
1.2 Replikation des Virus in Alveolar-Makrophagen von Schweinen
Zellkulturvialen (150 cm²) wurden verwendet, welche 100 ml einer Makrophagen-Suspension (3 × 10⁶ Zellen/ml) in dem oben beschriebenen DMEM-Medium enthielten, außer der Zugabe von fötalem Kälberserum (FCS) bei 5%. Die Zellen wurden mit PRRS-Olot Virus infiziert, isoliert durch Laboratorios Sobrino und mit der Bezeichnung PRRS-JPD-P5-6-91 (ECACC, Eingangsnummer V93070108). Die Infektion wurde bei 10^–3 Infektionsmultiplizität durchgeführt und die infizierten Zellen wurden bei 37°C für 24 Std. inkubiert. Nachdem dieser Zeitraum verstrichen war, wurde das Medium entzogen und durch frisches DMEM substituiert, welches 2% FCS und Antibiotika enthielt; die Inkubation wurde bei 37°C fortgesetzt.
Die Kulturen wurden periodisch mit dem Mikroskop beobachtet, um den zytopathischen Effekt (CPE) zu bestimmen, welcher durch das Virus an den Makrophagen erzeugt wurde. Im Allgemeinen betrug CPE bei 3–4 Infektionstagen 70–80%. Es erschienen riesige, deformierte Zellen. Normalerweise war der Titer dieser Präparate 10^6,55 TCID₅₀/ml (Gewebekultur infektiöse Dosis 50 pro Milliliter). Bei 10^–4 Multiplizität infizierte Makrophagen erzeugten virale Ausbeuten von einer Größenordung weniger.
Die Gegenwart von Virus in diesen Zellen wurde durch die Immunperoxidase in Monoschicht-Test an Makrophagenzellen von Schweinen, erhalten wie in Beispiel 1 beschrieben (1.1.2), bestimmt. Kurz wurde dies auf folgende Weise durchgeführt: In 96-Mulden Titrationsplaques wurden 100 μl Makrophagen mit 50 μl PRRS-Olot Virus, repliziert an Makrophagen, infiziert. Die Plaques wurden für 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Sobald die Inkubation abgeschlossen war, wurde das Medium entzogen und die Plaques zweimal mit Kochsalzlösung (0,1 M NaCl) gewaschen. Nachfolgend wurden sie mit 20% Formaldehyd fixiert, nach aufeinander folgenden Inkubationen bei 37°C, –30°C und Formaldehyd bei 20%. Nach zweimal Waschen mit Kochsalzlösung, 50 μl einer 1 : 50 Verdünnung eines Anti-PRRS-Serums von einem Tier, das gechallenged wurde. Gleichzeitig wurden Inkubationen mit einem negativen Serum von einem nicht infizierten Tier durchgeführt. Inkubation betrug 1 Stunde bei 37°C. Nach Entzug der vorhergehenden Lösung wurden sie zweimal mit Kochsalzlösung gewaschen. Sofort wurden 0,1 μg Protein A (Sigma) in 50 μl zugegeben und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Der Test wurde mit AEC (3-Amino-9-ethyl-carbazol) entwickelt, gelöst in Dimethylformamid in Gegenwart von Acetatpuffer und oxidiertem Wasser. Nach 15–30 Minuten bei Raumtemperatur in der Dunkelheit wurden die Schalen durch das Mikroskop beobachtet. Infizierte Zellen erschienen dunkelrot gefärbt, im Vergleich mit nicht infizierten Zellen, welche farblos waren.
1.3 PRRS Virusreinigung
Das Virus wurde von PRRSV-infizierten Zellkulturen gereinigt. Die Kultur wurde mittels Zentrifugation (20 Minuten, 6500 g) geklärt. Der Flüssigkeitsüberstand wurde durch Verwenden eines Millipore-Minitan Ultrafiltrationssystems (4,5 pSi, Filter mit 300 kDa Porengröße) konzentriert. Dann wurde das Virus mittels Zentrifugation (5 Std., 20000 g) sedimentiert. Der Flüssigkeitsüberstand wurde verworfen und der Niederschlag mit PBS, welches 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Sigma) enthielt, bei 4°C über Nacht gelöst. Das Virus wurde in diskontinuierlichem Sucrosegradienten (20–50% Gew./Vol.in PBS) mittels Zentrifugation bei 95000 g für 3 Std. gereinigt. Sobald die Zentrifugation abgeschlossen war, wurde das Band, welches das Virus enthielt, aus dem Gradienten extrahiert, mit Tris/EDTA-Puffer verdünnt und zum Schluss über Nacht bei 26000 g für Virussedimentation zentrifugiert.
Das gereinigte Virus wurde mittels Elektrophorese in Polyacrilamid-SDS Gels bei 12% (Laemmli, U.K., Nature, 227: 680, 1970) analysiert. Das ganze Protein wurde durch Färben mit Coomassie-Blau und Immunoblots nachgewiesen (Towbin, H., Staehelin, T. und Gordon, J., 1979; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350–4354). Die Blots wurden mit Peroxidase-Protein A (Sigma) Konjugat unter Verwendung eines kovaleszenten Anti-PRRSV Serums entwickelt. Es war aufgrund von Verunreinigung mit Proteinen von den Makrophagen nicht möglich, ein spezifisches Band bezogen auf PRRSV in Coomassie-gefärbten Gels zu beobachten. Jedoch wurden mehrere virale Proteine mit Molekulargewichten zwischen 15,5 und 30 KDa durch Immunoblot identifiziert. Bei längeren Entwicklungszeiten war es ebenfalls möglich, Bänder mit Molekulargewichten über 60 KDa zu beobachten, aber diese wurden auch in nicht infizierten Makrophagen nachgewiesen, es wurde gefolgert, dass sie keine PRRS-Virus bezogenen Proteine waren.
Beispiel 2. Isolation der viralen RNA
Ein kommerzielles Pharmacia P-L Biochemicals Kit wurde verwendet. Dieses Verfahren basiert auf der Selektion und Reinigung der viralen RNA, welche einen 3'-End Poly(A)-Schwanz enthält. Der virale Capsidriss wurde mit Guanidiniumchlorid-Reinigung von RNA-Poly(A) mit einer Oligo-Cellulose (dT) Matrix durchgeführt.
Kurz: die Isolierung der PRRS-Olot Virus-RNA wurde auf folgendem Weg durchgeführt: das gereinigte Virus sedimentierte durch Zentrifugation bei 40000 g über Nacht. Danach wurde der Flüssigkeitsüberstand verworfen und der Niederschlag löste sich mit 0,4 ml des Kit Extraktionspuffers. Nach Adsorption in die Cellulose-d(T)-Matrix und aufeinander folgende Wäschen mit den Puffern mit der niedrigen und hohen Salzkonzentration wurde die RNA-Poly(A) mit hoher ClNa Konzentration eluiert. Die RNA wurde durch Zugeben von 1 : 10 Volumen von 2,5 M Kaliumacetat, 0,25 mg/ml Glycongen und 2 Volumina Ethanol (> 2 Std. bei –20°C) ausgefällt. Sobald dieser Zeitraum verstrichen war, wurde die RNA durch Zentrifugation bei 16000 g für 30 Minuten zurückgewonnen. Nach Waschen des Niederschlags mit Ethanol bei 75% wurde sie in 20 μl TE-Puffer (10 mM Tris-ClH pH = 8,0 und 1 mM EDTA) resuspendiert.
Die erhaltene RNA wurde in 0,7% neutralen Agarosegels durch Einfärben mit Ethidiumbromid analysiert. Ein einzelnes Materialband innerhalb eines Molekulargewichts von 5000 und 23000 bp wurde beobachtet. Die Abwesenheit von Material mit geringem Molekulargewicht muss hervorgehoben werden, und daher die Möglichkeit von zellulärer DNA oder RNA. Jedoch war die Menge an erhaltenem Material gering, nicht höher als 100 ng RNA/250 ml mit dem Virus infizierte Makrophagenkultur. Diese niedrige Ausbeute stimmt mit der niedrigen Ausbeute an gereinigtem Virus überein, wie durch Elektrophorese in Polyacrilamidgels und Elektronenmikroskopie gezeigt (Daten werden nicht gezeigt).
Beispiel 3. cDNA-Synthese aus der PRRS-Olot Virus Gen-RNA
3.1 Herstellung der cDNA
Die cDNA, welche der 3'-Ende RNA des PRRS-Olot Virusisolats entspricht, wurde synthetisiert. Die Strategie nutzt die Gegenwart eines Poly(A)-Schwanzes, um das Oligo-d(T) als Extensionsprimer zu verwenden, welcher mit reverser Transkriptase erweitert werden kann und DNA-Molekülkopien synthetisieren kann. Um die RNA-Regionen vor dem 3'-Ende zu klo nieren, wurde ein Oligonucleotid mit spezifischer Sequenz des viralen Genoms verwendet, welche sich bei etwa 2500 bp des 3'-Endes befand. Die cDNA-Synthese wurde unter Verwendung eines kommerziellen Kits (Boehringer) durchgeführt. Das Verfahren war in Kürze: 0,1 μg PRRS RNA-Poly(A), erhalten wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben, wurde in Gegenwart von 1 mM von jeweils dNTPs (dATP, dCTP [5–10 μCi von ³²P-α-dCTP], dGTP und dTTP), 25 Einheiten eines RNase Hemmers, 0,8 μg Oligo-d(T)₁₂ und 40 Einheiten von reverser Transkriptase in 20 μ Endvolumen inkubiert. Die Umsetzung wurde bei 42°C für 1 Std. inkubiert und dann wurde die Synthese des zweiten Stranges in der gleichen Röhre gestartet. Zu diesem Zweck wurden Puffer, RNasa und 25 Einheiten von E. coli DNA-Polymerase zugegeben. Inkubation fand für 1 Stunde bei 22°C und 10 Minuten bei 65°C statt. Zum Schluss wurden 4 Einheiten von DNA T4 Polymerase zugegeben, um stumpfe Enden zu erzeugen. Nach 10 Minuten bei 37°C wurde die Umsetzung durch Zugeben von EDTA und Sarkosyl gestoppt. Eine zweite cDNA-Synthese wurde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt, außer hinsichtlich der Tatsache, dass 5'CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3'-Oligonucleotid anstelle von Oligo-d(T)₁₂ verwendet wurde. In beiden Fällen wurde das Gemisch mit Phenol: Chloroform extrahiert und das Material wurde mit Ethanol ausgefällt, wie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben. Die cDNA-Synthese wurde mittels Zählen der Radioaktivität, welche im synthetisierten Material eingeschlossen war, und Elektrophorese in alkalischen und neutralen Agarosegels überprüft und quantifiziert.
3.2 Klonieren und Sequenzieren
Zuerst wurde die synthetisierte cDNA nach Größe selektiert, um das Klonieren von übertrieben kleinen Segmenten zu vermeiden. Zu diesem Zweck wurde das Material von der cDNA-Synthese durch Zentrifugation (30 Minuten, 16000 g) gewonnen. Der Niederschlag wurde Vakuum-getrocknet, mit Tris/EDTA-Puffer (TE) pH = 8,0 gelöst und in 1% Agarosegel geladen. Die cDNA-Fragmente zwischen 1000 und 5000 bp wurden mit DEAE-Zellulosepapier aus dem Gel gewonnen und von Letzterem durch Elution mit ClNa und nachfolgender Ausfällung. Gereinigte cDNA wurde in stumpfe Enden in den pMTL25 Vektor kloniert, einem vom pUC18 hergeleiteten Vektor. Zu diesem Zweck wurde der Vektor mit SmaI linearisiert und mit alkalischer Phosphatase behandelt, um den Vektorhintergrund zu verringern. Nach Ligation mit DNA T4 Ligase, wurden E. coli XL-1Blue kompetente Zellen mit dem Ligationsgemisch in Gegenwart von X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) (Boehringer) und IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) (Gold Bioch) transformiert, welches die anfängliche Selektion von rekombinanten Kolonien durch Farbe (blaue Kolonien ohne Insert im Vergleich zu weißen mit Insert) erlaubt.
Die Analyse der positiven PRRS-Klone wurde mittels Plasmid-DNA Präparaten (Birnboim & Doly, Nucleic Acids, Res., 7, 1513–1523, 1979) und Mapping von Restriktionsstellen basierend auf LV-Sequenz durchgeführt. Nur 9 der 300 analysierten Plasmide waren positiv und enthielten Inserts zwischen 800 und 2600 bp. Die definitive Verifikation der Authentizität dieser cDNA-Klone wurde durch ihre direkte Sequenzierung unter Verwendung des Dideoxyketten-Terminationsverfahrens durchgeführt, welches auf doppelsträngige DNA angewendet wird (Sanger, F., et al., J. Mol. Biol., 94: 441–448, 1975). Die universalen Oligonucleotide (5'GTAAAACGACGGCCAGT3') und reversen (5'AACAGCTATGACCATG3') Oligonucleotide wurden verwendet, um alle Klone zu sequenzieren. Die Mehrzahl der erhaltenen PRRs-Klone enthielt einen gewöhnlichen Poly(A)-Schwanz und unterschiedliche 5'-Enden. Die Klone wurden als pPRRS-8, pPRRS-108, pPRRS-121, pPRRS-132, pPRRS-146, pPRRS-147, pPRRS-148 und pPRRS-153 bezeichnet. Aus der zweiten cDNA-Synthese wurde Klon PRRS-3 erhalten. 3 zeigt die unterschiedliche Extension dieser Klone im Vergleich mit LV, als auch die ORFs, welche in jedem enthalten sind. Andererseits zeigt 1 die fortlaufende Sequenz des 3383 bp, kloniert aus dem PRRS-Olot Isolat, und 2 (2A–2F) zeigt die Aminosäuresequenzen, welche den durch jedes ORF kodierten Proteinen entsprechen.
Beispiel 4. Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche das durch ORF2 kodierte Protein-Gen exprimieren
4.1 Herstellung des ORF2-Gens
Die pMTL25, pMTL24 und pMTL22 Gene, abgeleitet vom pUC18-Vektor, wurden für die Herstellung der in dieser Beschreibung erwähnten unterschiedlichen ORFs verwendet, bevor sie in Baculovirus-Transfervektoren kloniert wurden. Der verwendete Vektor wird für jeden besonderen Fall angezeigt. Das ORF2-Gen hat eine Größe von 747 bp und wurde vom cDNA pPRRS-3 Klon erhalten (4). Die DNA wurde mit MaeI verdaut und das Insert von etwa 900 bp wurde in Agarosegel gereinigt. Die kohäsiven Insert-Enden wurden mittels Behandlung mit dem Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase in stumpfe Enden umgewandelt. Klonierung wurde im pMTL25 durchgeführt, behandelt mit SmaI, alkalischer Phosphatase und in 1% niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt. Nach Ligation mit DNA T4 Ligase (Boehringer) wurden E. coli XL-1Blue Zellen mit dem Ligationsgemisch transformiert und die positiven Klone anfänglich durch Farbe selektiert. Die rekombinanten Plasmide, welche das insertierte ORF2 Gen enthielten, wurden gemäß dem alkalischen Lysis-Verfahren (Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 7, 1513–1523, 1979) gereinigt und durch Mapping mit Restriktions-Endonucleasen und Sequenzieren der insertierten Regionen gekennzeichnet.
Der neu erhaltene Vektor wurde als pPRRS-ORF2 bezeichnet. In diesem befindet sich der ORF2 Anfangs-Codon (ATG) etwa bei 50 bp vom Beginn des Inserts und der BamHI-Stelle.
4.2 Insertion des ORF2-Gens in einen Baculovirus-Transfervektor
Der Baculovirus-Transfervektor, welcher in allen in diesem Patentanspruch beschriebenen Versuchen verwendet wird, war pAcYM1-Vektor (Matsuura et al., J. Gen Virol. 68, 1233–50), welcher eine einzelne BamHI-Insertionsstelle hat.
Der Vektor wurde durch Professer D. H. L. Bishop (I. V. E. M., Oxford, United Kingdom) gespendet. Für die Insertion wurde der Vektor gründlich mit der BamHI-Endonuclease verdaut und dann mit dem alkalischen Phosphatase-Enzym behandelt, um Vektor-Religation zu vermeiden. ORF2 kodiert für ein 28,4 KDa-Protein. Kurz: die Insertion des entsprechenden Gens in den pAcYM1-Vektor verwendete pPRRS-ORF2 Plasmid als Ausgangsmaterial. In diesem Plasmid wird das ORF2-Gen durch zwei BamHI-Stellen flankiert. So wird das pPRRS-ORF2 mit BamHI verdaut und in 1% niedrig schmelzendes Agarosegel geladen, um das 935 bp Fragment zu erhalten. Dieses Fragment wurde in die BamHI-Stelle von pAcYM1 gemäß dem Struhl-Verfahren (Biotechniques 6, 452–453, 1985) unter Verwendung der DNA T4 Ligase (Boehringer) insertiert, um das Insert in den Vektor zu ligieren. Das Ligationsgemisch wurde verwendet, um E. coli DH5-Zellen zu transformieren. Die erhaltenen rekombinanten Plasmide, welche das insertierte ORF2 Gen enthielten, wurden gemäß dem alkalischen Lysis-Verfahren (Birnboin & Doly, supra) gereinigt, durch Mapping mit Restriktions-Endonucleasen gekennzeichnet und die Insert-Kanten sequenziert, um die richtige Sequenz der Insertions-Regionen zu bestätigen. Der neu erhaltene Transfervektor wurde als pPRRS-Bac8 bezeichnet und von ihm wurde gezeigt, dass er das PRRS-Gen in der richtigen Ausrichtung für seine Expression durch den AcNPV Baculovirus-Polyhedrin-Promotor hat.
4.3. Transfektion und Selektion von Baculoviren
Spodoptera frugiperda Zellen, Sf 9 Klon, wurden mit einem Gemisch aus gereinigter, infektiöser DNA von Stammvirus AcRP23-lacZ (500 ng), gespendet durch Dr. Posee (I. V. E. M., Oxford, U.K.) und der Transfervektor pPRRS-Bac8 DNA (2 μg) co-transfiziert. Die Stammvirus-DNA wurde mit dem Bsu36I-Enzym innerhalb des lacZ-Gens (Kitts et al., Nuc. Acids Res. 18, 5667–72, 1990) linearisiert, um die Effizienz der Rekombination zu erhöhen. Für Co-Transfektion wurde das Lipofectin (Gibco-BRL) Verfahren verwendet (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413–7417, (1987)). Nach Co-Transfektion wurden die Zellen für 5 Tage in komplettem TNMFH-Medium, ergänzt durch 5% fötales Kalbserum (FCS) und Antibiotika inkubiert, bis zytopathische Wirkung beobachtet wurde.
Dann wurde der Transfektions-Flüssigkeitsüberstand zurückgewonnen und die rekombinanten Viren wurden durch Plaque-Test identifiziert. Das AcRP23-lacZ Stammvirus zeigt blaue Lysis-Plaques in Gegenwart von X-gal Substrat, weil das β-Galactosidase-Gen exprimiert wird. Rekombinante Viren wurden anfänglich durch die klaren Plaques nach Einfärben der viralen Nachkommen mit X-gal identifiziert. Eine Anzahl an Plaques von jedem Virus wurde gewählt und drei Reinigungsrunden unterworfen, bevor ein Virus-Vorrat mit hohem Titer hergestellt wurde. Der letztendlich erhaltene rekombinante Baculovirus wurde als AcNPV, PRRS 2 bezeichnet. Er wurde bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) mit Eingangsnummer V94021007 hinterlegt.
Beispiel 5. Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche das durch ORF3 kodierte Protein-Gen exprimieren
5.1 Insertion von ORF3 Gen in einen Baculovirus-Transfervektor
ORF3 kodiert für ein Protein mit einem geschätzten Molekulargewicht von 30,8 KDa. pPRRS-121 Plasmid DNA wurde als Aus gangsmaterial für die Insertion des entsprechenden Gens in den pAcYM1 Transfervektor verwendet (5). In diesem Vektor befindet sich das ORF3 Anfangs-Codon 10 bp von der BamHI-Stelle. Das Gen kann durch doppelte Digestion mit den BamHI- und Sau3A-Enzymen ausgeschnitten werden, was kohäsive Enden erzeugt, welche mit BamHI kompatibel sind. Nach Digestion wurde das Gemisch in 1% niedrig schmelzendes Agarosegel geladen und ein 1009 bp Fragment wurde gereinigt. Es wurde isoliert und dann an den pAcYM1 Vektor ligiert, behandelt mit BamHI und alkalischer Phosphatase unter Verwendung des T4 Ligase-DNA-Enzyms. Nachfolgend wurden E. coli DH5 Zellen transformiert und die rekombinanten Plasmide gemäß den oben beschriebenen Verfahren gereinigt und gekennzeichnet. Sobald die richtige Sequenz und Insert-Ausrichtung zum Polyehdrin-Promotor verifiziert worden war, wurde der neuartige Transfervektor als pPRRS-Bac2 bezeichnet.
5.2. Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren
Das für die Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren verwendete Verfahren war ähnlich dem oben für ORF2 (Beispiel 4.3) beschriebenen. Das erhaltene rekombinante Baculovirus wurde als AcNPV, PRRS 3 bezeichnet. Es wurde bei ECACC mit Eingangsnummer V94011325 hinterlegt.
Beispiel 6. Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche das durch ORF4 kodierte Protein-Gen exprimieren
6.1 Herstellung des ORF4-Gens
Die Größe des ORF4-Gens ist 549 bp. Es wurde aus dem pPRRS-146 Klon (6) erhalten, verdaut mit den BamHI, AflIII und PstI Enzymen. Die ersten beiden Enzyme flankieren das Insert und PstI wurde verwendet, um ein Vektor-DNA-Fragment von ähnlicher Größe wie das ORF4-Gen abzuspalten, welches Gen-Isolierung schwierig gemacht hätte. Ein 1112 bp Fragment wurde in niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt und in pMTL22-Vektor kloniert, verdaut mit BamHI und NcoI (kompatibel mit AflIII). Nach Ligation mit T4 Ligase DNA und Transformation von E. coli DH5 Zellen wurden die rekombinanten Plasmide gemäß dem alkalischen Lysis-Verfahren (Birmboin & Doly, supra) gereinigt und durch Restriktions-Endonuclease Mapping gekennzeichnet. Der neu erhaltene Vektor wurde pPRRS-ORF4 genannt. Er enthält das ORF4 Anfangs-ATG-Cdon, welches sich 5 bp von der BamHI-Stelle befindet.
6.2 Insertion des ORF4-Gens in einen Baculovirus-Transverfektor
ORF4 kodiert für ein 20,0 KDa Protein. Das entsprechende Gen wurde aus dem pPRRS-ORF4 Plasmid durch Digestion mit BamHI plus BglII erhalten. Das 1112 bp Fragment wurde in 1% niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt und direkt in pAcYMI-BamHI kloniert. Die Verfahren für die Identifikation und Kennzeichnung der rekombinanten Klone waren identisch mit den oben beschriebenen (Beispiel 4.2). Sobald die richtige Ausrichtung und Insertsequenz verifiziert worden war, wurde das neuartige Plasmid als pPRRS-Bac9 bezeichnet. Dieses Plasmid wurde für spätere Transfektionsversuche und Herstellung von rekombinanten Baculoviren verwendet.
6.3 Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren
Das Verfahren, welchem für die Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren gefolgt wurde, war ähnlich dem oben für ORF2 beschriebenen Verfahren (Beispiel 4.3). Das rekombinante Baculovirus wurde als AcNPV, PRRS4 bezeichnet. Es ist beim ECACC mit Eingangsnummer V94021008 hinterlegt worden.
Beispiel 7. Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche das durch ORF5 kodierte Protein-Gen exprimieren
7.1 Herstellung des ORF5 Gens
Die Größe von ORF5 ist 600 bp. Es wurde aus dem Klon pPRRS-132 (7) erhalten. Die DNA wurde mit den BstXI und BfrI Enzymen verdaut und ein 700 bp Fragment, welches ORF5 enthielt, wurde in 1% niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt. Nach Umwandeln der Fragmentenden von kohäsiv zu stumpf mittels Behandlung mit T4 Polymerase DNA wurde das Fragment in den pMTL25/SmaI Vektor kloniert. Das verwendete Verfahren ähnelte den in Beispiel 4.1 beschriebenen Verfahren. Der neu erhaltene Vektor wurde als pPRRS-ORF5 bezeichnet. Er enthält das ORF5 Anfangs-ATG-Codon, welches sich 15 bp vom Beginn des Gens befindet.
7.2 Insertion des ORF5-Gens in einen Baculovirus-Transfervektor
ORF5 kodiert für ein 22,4 KDa Protein. Um das entsprechende Gen in den Transfervektor zu insertieren, wurde der pPRRS-ORF5 Vektor mit Enzym BamHI verdaut. Das 706 bp Fragment wurde in 1% niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt und direkt an den pAcYm1-BamHI Transfervektor ligiert. Die rekombinanten Plasmide wurden wie oben beschrieben gekennzeichnet. Der neue Transfer vektor wurde als pPRRS-Bac3 bezeichnet. Er wurde in nachfolgenden Transfektionsversuchen verwendet.
7.3 Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren
Das Verfahren, welchem für die Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren gefolgt wurde, war ähnlich dem oben für ORF2 beschriebenen Verfahren (Beispiel 4.3). Das erhaltene rekombinante Baculovirus wurde als AcNPV, PRRS5 bezeichnet und ist beim ECACC mit Eingangsnummer V94011326 hinterlegt worden.
Beispiel 8. Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche das durch ORF6 kodierte Protein-Gen exprimieren
8.1 Herstellung des ORF6-Gens
Die Größe des ORF6-Gens ist 519 bp. Es wurde aus dem pPRRS-8 Gen-Klon (8) hergestellt. Zuerst wurde die DNA mit dem AflIII-Enzym verdaut, was die Eliminierung von Bändern erlaubte, welche sich in der Größe dem ORF6-Gen annäherten. Ein 990 bp AflIII-AflIII Fragment wurde in 1% niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt und mit TagI verdaut. Das neue 790 bp Fragment wurde in niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt und in den pMTL24-Vektor kloniert, behandelt mit AccI und alkalischer Phosphatase. Nachfolgend wurden die in Beispiel 4.1 beschriebenen Schritte durchgeführt. Der neue Vektor wurde als pPRRS-ORF6 bezeichnet. Er enthält das ORF6 Anfangs-Codon, welches sich bei 46 bp vom Beginn des Gens befindet.
8.2 Insertion des ORF6-Gens in einen Baculovirus-Transfervektor
ORF6 kodiert für ein 19,0 KDa Protein. Dies soll das Envelope-Protein sein und unter Berücksichtigung seiner hydrophoben Natur wird es als ein Membran-spannendes Protein angesehen. Für die Insertion des entsprechenden Gens in den Transfervektor wurde der pPRRS-ORF6 Vektor, welcher das an der pMTL24 AccI-Stelle klonierte ORF6-Gen enthält, mit dem BamHI-Enzym verdaut. Das 790 bp Fragment wurde von dem 1% Agarosegel gereinigt und direkt an Vektor pAcYM1-BamHI ligiert. Der neue Transfervektor wurde als pPRRS-Bac5 bezeichnet. Er wurde in nachfolgenden Transfektionsversuchen verwendet.
8.3 Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren
Das Verfahren, welchem für die Transfektion und Selektion von rekombinanten Viren gefolgt wurde, war ähnlich dem oben für ORF2 beschriebenen Verfahren (Beispiel 4.3). Das erhaltene rekombinante Baculovirus wurde als AcNPV, PRRS6 bezeichnet. Es ist beim ECACC mit Eingangsnummer V94011327 hinterlegt worden.
Beispiel 9. Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche das durch ORF7 kodierte Protein-Gen exprimieren
9.1 Herstellung des ORF7-Gens
Die Größe des ORF7-Gens ist 384 bp. Es wurde aus dem pPRRS-8 Gen-Klon (8) hergestellt. Das in Beispiel 8.1 beschriebene Fragment AflIII-AflIII wurde mit dem HpaI-Enzym verdaut. Das 430 bp AflIII-HpaI-Fragment, welches das ORF7-Gen enthält, wurde in niedrig schmelzendem Agarosegel gereinigt und nachfolgend in den pPMTL25-Vektor kloniert, verdaut mit NcoI-SmaI. Die Analyse und Kennzeichnung von rekombinanten Kolonien wurde wie in Beispiel 4.1 beschrieben durchgeführt. Der neue Vektor wurde als pPRRS-ORFT bezeichnet. Er enthält den ORF7-Anfangs-Codon, welcher sich bei 16 bp vom Beginn des Gens befindet.
9.2 Insertion des ORF7-Gens in einen Baculovirus-Transfervektor
ORF7 kodiert für ein 13,8 KDa Protein. Dies soll das virale Nucleoprotein sein. Für die Insertion des entsprechenden Gens in den Transfervektor wurde das pPRRS-ORF7 Plasmid mit den BglII und BamHI-Enzymen verdaut. Das sich ergebende 430 bp Fragment wurde aus einem niedrig schmelzenden Agarosegel isoliert und direkt innerhalb des pAcYM1-BamHI Vektors ligiert. Nach den geeigneten Kennzeichnungen wurde der neue pPRRS-Bac7 Transfervektor erhalten. Er wurde in nachfolgenden Transfektionsversuchen verwendet.
9.3 Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren
Das Verfahren, welchem für die Transfektion und Selektion von rekombinanten Baculoviren gefolgt wurde, war ähnlich dem oben für ORF2 beschriebenen Verfahren (Beispiel 4.3). Das erhaltene rekombinante Baculovirus wurde als AcNPV, PRRS7 bezeichnet. Es ist beim ECACC mit Eingangsnummer V94011328 hinterlegt worden.
Beispiel 10. Analyse von rekombinanten Proteinen und Immunnachweis
Sf9-Zellen wurden mit unterschiedlichen rekombinanten Baculoviren bei Infektionsmultiplizität von 1 PFU/Zelle infiziert und bei 27°C inkubiert, bis die Kulturen geerntet wurden. Unter schiedliche Zellkulturen wurden in Monoschicht und in Suspension verarbeitet. In allen Zellen waren die Ergebnisse ähnlich. Die Kulturen wurden bei unterschiedlichen Zeiten nach Infektion geerntet. Die optimale Erntezeit für jedes rekombinante Virus wurde bestimmt. Diese reichte von zwischen 48 und 96 p. i. h. (Stunden nach Infektion). Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 1500 U/Min. für 10 Min. geerntet, zweimal mit PBS pH: 7,4 gewaschen und nachfolgend mit 25 mM Bicarbonatlösung resuspendiert und lysiert. Sie wurden bei 10000 U/Min. für 10 Minuten zentrifugiert und die lösliche Zytoplasma-Fraktion wurde von der verbleibenden, nicht löslichen Zelldebris abgetrennt. Die gesamten Zellextrakte, als auch die unterschiedlichen Fraktionen, wurden durch Elektrophorese in 11% Polyacrilamidgels analysiert und mit Coomassie-Blau eingefärbt oder zum immunologischen Nachweis auf Nitrocellulosemembranen übertragen. Es wurden Bänder durch Einfärben mit Coomassie-Blau mit Molekulargewichten von 28,4, 30,8, 20,0, 22,4, 19,0 und 13,8 KDa beobachtet. Diese Größen entsprechen jeweils den Größen, welche für die durch ORFs 2, 3, 4, 5, 6 und 7 kodierten Gene erwartet werden. Es gibt eine signifikante Variation bei den Expressionsgraden der unterschiedlichen Gene, ORFs 3, 5 und 7 bei beträchtlichem Grad, ORFs 2 und 4 bei nennenswertem Grad und ORF6 bei geringem Grad. Die niedrigeren Expressionsgrade der Gene, entsprechend ORFs 2 und 6, können Folge des größeren Abstands von 42, bzw. 39 Nucleotiden zwischen dem Protein-Anfangs-ATG-Codon und dem Polyhedrin-Baculovirus-Promotor sein. Bei mehreren Gelegenheiten ist gezeigt worden, dass dieser Abstand im Wesentlichen bei einem Minimum gehalten werden sollte, um eine gute Expression zu erhalten. Ein weiterer Faktor, der für niedrige Expression verantwortlich ist, könnte die hochgradig hydrophobe Natur dieser Proteine sein.
Wenn die löslichen und nicht löslichen Fraktionen der infizierten Zellen getrennt analysiert werden, ist es beobachtet worden, dass außer für ORF7 die meisten der exprimierten PRRS-Proteine nicht löslich sind und mit der Membrandebris verbunden bleiben. Dies kann Folge der hydrophobischen und glykosilierten Natur dieser Proteine sein. Die Mehrheit dieser Glycoproteine enthält Transmembranregionen, die sie an den Membranen verankern. Solche Merkmale machen die Reinigung dieser Proteine von Zellextrakten schwierig.
Für Immunnachweis wurden die Proteine auf Nitrocellulosemembranen übertragen, gemäß Standardverfahren (Burnette, Anal. Biochem. 112, 195–203, 1981; Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350–4354, 1979). Der Proteintransfer wurde in einer halbtrockenen Vorrichtung (Bio-Rad) bei 22 V für 30 Minuten durchgeführt. Dann wurden die Nitrocellulosestreifen mit 3% Magermilchpulver in Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM (TBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Nachfolgend wurden die Streifen zuerst für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit einem Anti-PRRS Schweine Antiserum (C-45) inkubiert, verdünnt 1/100 in TBS-0,05% Tween 20, mit TBS-0,05% Tween 20 für 30 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und dann mit Anti-Schwein IgG, konjugiert an alkalische Phosphatase (Verdünnung 1/1000) (Sigma) für 1 Stunde inkubiert. Die Streifen wurden nochmal gewaschen und zum Schluss mit einer NBT (Nitro-Blau Tetrazolium) (Sigma) und BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat) (Sigma) Lösung in NaCl 100 mM, MgCl₂ 5 mM, Diethanolamin 100 mM, pH: 9,5 bis zum Erscheinen von sichtbaren Bändern entwickelt. Die Umsetzung wurde mit destilliertem Wasser gestoppt. In allen Fällen, bei welchen spezifische Reaktionen durch Immunoblot gesehen wurden, wurden Proteine mit einem Molekulargewicht äquivalent zu den geschätzten ORF-Größen erhalten. In einigen Fällen, speziell bei ORFs 3 und 5, wurde die Gegenwart von anderen Bändern mit größerer Größe bis 45 KDa beobachtet. Diese Bänder würden unterschiedliche Proteinglykosilierungsformen in Übereinstimmung mit den vorhergesehenen potentiellen Stellen darstellen.
10.1 Antigene Kennzeichnung der rekombinanten Proteine
Die richtige Antigenizität der rekombinanten Proteine, exprimiert in Baculovirus, wurde durch ihre Reaktion auf unterschiedliche Tierseren in einem Immunoblot-Test untersucht.
Rekombinante Proteine, exprimiert und auf Nitrocellulose übertragen gemäß dem obigen Verfahren, wurden dazu gebracht, mit einer Sammlung von vorher gekennzeichneten Schweineseren zu reagieren, welche Anti-PRRSV-Antikörper enthielten. Die Seren waren bei Tieren erhalten worden, welche experimentell (Nr. 1–4) oder natürlich (Nr. 5–8) infiziert worden waren.
Proteine entsprechend ORFs 3, 5 und 7 waren die zuerst untersuchten. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Reaktivität von Seren von infizierten Tieren gegen ORF3, ORF5 und ORF7 rekombinante Proteine

+: positiv
–: negativ
ND: nicht bestimmt

Dieser Test zeigte, dass rekombinante Proteine 3, 5 und 7 ähnlich antigen sind, wie die natürlichen Virus-Proteine 3, 5 bzw. 7.
Wenn der Test mit rekombinanten Proteinen 2, 4 und 6 durchgeführt wurde, waren die Ergebnisse von größerer Variabilität was Erkennung durch Feldseren angeht. Die Gründe für diese Variabilität können ihr niedriger Expressionsgrad und/oder ihre hohe Hydrophobizität sein.
Diese Tests zeigen, dass PRRSV rekombinante Proteine, welche im Baculosystem exprimiert werden, nicht von natürlichen Virusproteinen antigenisch unterscheidbar sind.
Beispiel 11. Reinigung der rekombinanten Proteine
Die Strategie, welche für Reinigung von rekombinanten Proteinen entworfen wird, sollte die strukturellen Merkmale der Proteine in Betracht ziehen. Zwei dieser Merkmale sollten hervorgehoben werden:
(1) Hydrophobische Natur, welche sie nicht löslich macht und (2) Gegenwart einer großen Anzahl an Transmembranregionen, was ihnen große Affinität für Membranen verleiht. In den meisten Fällen machen diese Merkmale Proteinextraktion und Reinigung nicht bequem, z. B.: für ihre Verwendung als Impfstoff, wenn voll ständige infizierte Zellen verwendet werden können, wie durch unterschiedliche Autoren beschrieben (Hall S. L. et al., Vaccine, 9, 659–667, Sept. (1991); Tordo N., et al., Virology, 194, 5269 (1993)). Trotzdem sind Versuche gemacht worden, diese Proteine unter Verwendung von ORF3 Protein als Modell zu reinigen.
11.1 Reinigung des von ORF3 abgeleiteten Proteins
Sf9-Zellen wurden mit dem rekombinanten AcNPV, PRRS3 Virus gemäß dem im vorhergehenden Beispiel beschriebenen Verfahren infiziert. Die infizierten Zellen wurden durch Zentrifugation bei 400 g für 10 Min. gesammelt, mit PBS gewaschen und bei 20 × 10⁶ Zellen/ml in PBS resuspendiert. Die Zellen wurden durch Gefrieren/Tauen zerrissen und die lösliche Fraktion wurde von der nicht löslichen Fraktion durch Zentrifugation getrennt. In allen Fällen wurde die nicht lösliche Fraktion für die nachfolgenden Behandlungen verwendet.
Unten befindet sich eine Beschreibung von einigen der verwendeten Verfahren:
Behandlung mit chaotropen Wirkstoffen
Die nicht lösliche Fraktion wurde zuerst mit 1 M NaCl und dann mit 2 M oder 4 M Guanidiniumchlorid gewaschen. Die Zellpellets wurden in den unterschiedlichen Puffern resuspendiert und bei Raumtemperatur für 1 Stunde gehalten. Dann wurde das Präparat bei 15000 U/Min. für 5 Minuten zentrifugiert. Die Gegenwart des rekombinanten Proteins in den unterschiedlichen Fraktionen wurde durch Elektrophorese in 15% Polyacrylamid-SDS-Gels (Natriumdodecyl-natriumsulfat) analysiert.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen an, dass die aufeinander folgende Behandlung mit diesen Salzen ein Protein von 30% bis 50% Reinheit ergibt. Von diesem gereinigten Protein ist gezeigt worden, dass es analog zu natürlichen Proteinen antigenisch ist, wie es durch Seren von infizierten Tieren erkennbar ist, bestimmt entweder durch Immunoblot oder indirekten ELISA.
Behandlung mit Detergenzien
Es wurden Detergenzien mit den folgenden Konzentrationen verwendet:

– NP40 0,5%

– Octylglucosid 2%

– SDS 0,5%, 1% und 2%

– Natriumdeoxycholat 0,5%, 1% und 2%
In allen Fällen wurden die Zellherstellungen analog zu der oben beschriebenen durchgeführt. Zelldebris, welches rekombinantes Protein enthielt, wurde mit den obigen Detergens-Konzentrationen und unter den beschriebenen Bedingungen behandelt. Im Allgemeinen kann angeführt werden, dass unter diesen Bedingungen Behandlung mit den unterschiedlichen Detergenzien nicht die Löslichkeit einer signifikanten Menge an rekombinantem Protein ermöglichte. Nur 0,5% SDS ergab Protein von 50% geschätzter Reinheit, allerdings in sehr geringer Ausbeute. Antigenisch reagiert dieses Protein mit infizierten Tierseren durch direkten ELISA, obwohl die Wirksamkeit niedriger ist, als was mit dem mit chaotropen Wirkstoffen gereinigten Protein erhalten wird. Zusammenfassend könnten diese teilweise gereinigten Proteine in Anti-PRRSV-Impfstoffen verwendet werden.
Beispiel 12. Diagnostische Verwendung
Eine der Hauptanwendungen der rekombinanten Proteine, welche durch diese Erfindung vorgesehen werden, ist ihre Verwendung bei der Herstellung von Kits zur Diagnose von PRRSV Feldinfektionen.
12.1 Herstellung von Antigen exprimiert in Sf9 zur Anwendung bei Diagnose
Sf9-Zellen, gewachsen in Monoschicht oder in Suspension, wurden bei Infektionsmultiplizität von 0,5 bis 1 mit den jeweiligen rekombinanten Baculoviren infiziert. Je nachdem, welches rekombinante Virus verwendet wurde, wurden die Kulturen zwischen 48 und 72 Stunden nach Infektion geerntet. Sie wurden bei 400 g bei 15°C für 10 Minuten zentrifugiert und mit PBS gewaschen.
Zum Schluss wurden die Zellpellets, welche die rekombinanten Proteine enthielten, in PBS mit 2% Octylglucosid (Sigma) resuspendiert und durften dann für 1 Stunde auf Eis stehen. Sie wurden dann bei 1000 g für 10 Minuten zentrifugiert, um Zelldebris zu eliminieren. Die Flüssigkeitsüberstände wurden erschöpfend gegen PBS dialysiert, um das Detergens zu entfernen, bei 10000 g für 30 Minuten zentrifugiert, um Niederschläge zu entfernen, und bei –70°C bis zur späteren Verwendung gelagert.
12.2 ELISA zur Diagnose
Polystyrol 96-Mulden ELISA Immunoschalen (Polisorp, NUNC) wurden mit unterschiedlichen Verdünnungen des rekombinanten Extraktgemisches (ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 und ORF7), hergestellt in 50 mM Carbonatpuffer pH: 9,6 (100 μl/Mulde) durch Inkubation über Nacht bei 4°C überzogen. Wie in 9 gezeigt, betrug die optimale Verdünnung, welche für die Schalenüberzüge gewählt wurde, 1/100. Die Schalen wurden mit blockierendem Puffer (1% Magermilch in PBS) für 30 Minuten bei Raumtemperatur geblockt. Nachfolgend wurden unterschiedliche Verdünnungen der Anti-PRRSV Antiseren, bereitet in Blockierungspuffer zugegeben. Inkubation wurde für 1 Stunde bei 37°C fortgesetzt. Nach Waschen mit PBS, welches 0,05% Tween 20 enthielt, wurde Peroxidase-markiertes Protein A (1/5000 Verdünnung) zugegeben und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Eine Wäsche wie die Vorhergehende wurde durchgeführt und die Umsetzung wurde bei Raumtemperatur für 10 Minuten unter Verwendung von ABTS [2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)] als Substrat entwickelt. Die Umsetzung wurde mit 1% SDS gestoppt und die Extinktion wurde bei 405 nm überwacht. Übliche ELISA Titrationsergebnisse von einem Feldserum von einem infizierten Tier werden in 10 gezeigt. Feldserum-Titrationen reichen normalerweise von 1/100 bis 1/800 Verdünnungen. Diese in einem Probennahmeversuch mit mehreren Dutzend Feldseren erhaltenen Ergebnisse werden in 11 gezeigt. Es kann gesehen werden, dass Titer, welche für klar positive Seren erhalten werden, im Bereich von 0,4 bis 1,7 liegen. Titer von unsicheren Seren reichen von 0,2 bis 0,3. Negative Seren ergeben Titer unter 0,1. So ist die Schlussfolgerung, zu der man gelangt: die Verwendung dieser rekombinanten Proteine, exprimiert in Baculoviren, ist ein sicheres, verlässliches und reproduzierbares Verfahren, welches es ermöglicht, beweiskräftig zwischen infizierten und nicht infizierten Tieren zu unterscheiden.
Beispiel 13. Formulierung der rekombinanten Impfstoffe
Es wurden unterschiedliche Impfstoffe gemäß dem unten beschriebenen Verfahren hergestellt, welche unterschiedliche rekombinante PRRSV-Proteine enthalten, speziell PRRS-Olot [ECACC V93070108] in Emulsionsform.
Spodoptera frugiperda Zellen, Klon Sf9, hiernach Sf9, wurden bei einer Rate von 1 × 10⁶ Zellen/ml mit den rekombinanten Baculoviren:

– AcNPV, PRRS3, [ECACC V94011325],
– AcNPV, PRRS5, [ECACC V94011326] und
– AcNPV, PRRS7, [ECACC V94011328]

2

4

6

₂

⁷

Die Impfstoffe wurden durch Mischen eines infizierten Sf9-Zellhomogenats formuliert, welches 50 × 10⁶ Sf9-Zellen, welche jeweils eines der rekombinanten Proteine ORF3, ORF5 und ORF7 exprimieren, mit einem öligen Hilfsstoff oder einer öligen Phase, zusammengesetzt aus einem Gemisch aus:

Marcol^® 52 790,0 mg

Simulsol^® 5100 70,0 mg

Montanide^® 888 80,0 mg

enthält.
Unter diesen Bedingungen wurden 4 rekombinante Impfstoffe in Dosen von 2 ml, zusammengesetzt aus 53% antigener Phase und 47% der oben beschriebenen öligen Phase hergestellt, wobei das Verhältnis von öliger Phase/antigener Phase ein Gewicht/Volumen (Gew./Vol.) Verhältnis ist. Die hergestellten Impfstoffe zeigten die folgenden Formulierungen:

1. Als rPRRS C identifizierter Impfstoff: 53% nach Volumen antigene Phase, zusammengesetzt aus 50 × 10⁶ Sf9-Zellen welche ORF3 exprimieren und 47% nach Gewicht der öligen Phase wie oben beschrieben.
2. Als rPRRS D identifizierter Impfstoff: 53% nach Volumen antigene Phase, zusammengesetzt aus 50 × 10⁶ Sf9-Zellen welche ORF5 exprimieren und 47% nach Gewicht der öligen Phase wie oben beschrieben.
3. Als rPRRS E identifizierter Impfstoff: 53% nach Volumen antigene Phase, zusammengesetzt aus 50 × 10⁶ Sf9-Zellen welche ORF7 exprimieren und 47% nach Gewicht der öligen Phase wie oben beschrieben.
4. Als rPRRS F identifizierter Impfstoff: 53% nach Volumen antigene Phase, zusammengesetzt aus 50 × 10⁶ Sf9-Zellen welche ORF3 exprimieren, 50 × 10⁶ Sf9-Zellen, welche ORF5 exprimieren und 50 × 10⁶ Sf0-Zellen, welche ORF7 exprimieren (insgesamt 150 × 10⁶ Sf9-Zellen); und 47% nach Gewicht der öligen Phase wie oben beschrieben.

Beispiel 14. Wirksamkeit bei trächtigen Säuen
Dieser Test wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit der rekombinanten Impfstoffe zu bewerten, welche wie in Beispiel 13 beschrieben hergestellt wurden. Zu diesem Zweck wurden insgesamt 12 Säue, eine Kreuzung von Landrasse x Large White, verwendet. Die Tiere wurden zu den Sicherheitsställen des Forschungszentrums transportiert.
Zwei Säue wurden nach Zufall ausgewählt (Säue Nr. 400398 und 400298) und wurden mit dem als rPRRS C identifizierten Impfstoff geimpft. Zwei Säue (Säue Nr. 400118 und 400307) wurden mit dem als rPRRS D identifizierten Impfstoff geimpft. Mit dem als rPRRS E identifizierten Impfstoff wurden drei Säue geimpft (Säue Nr. 314010, 313426 und 400059) und mit dem als rPRRS F identifizierten Impfstoff wurden drei Säue geimpft (Säue Nr. 313524, 401236 und 401426). Die beiden verbleibenden Säue (Säue Nr. 1 und 20) wurden nicht geeimpft und wurden als Kontrolltiere verwendet.
Die Säue wurden auf tiefem intramuskulären Weg (IM) in den Nacken nahe dem Ohr mit einer Dosis von 2 ml Impfstoff geimpft und 21 Tage später mit der gleichen Dosis wieder geimpft.
Es wurden örtliche und allgemeine Reaktionen beobachtet, wie: rektale Temperatur, Futteraufnahme und klinische Anzeichen, sowohl Nach-Impfung, als auch Nach-Challenge. Zusätzlich wurden reproduktive Nach-Challenge-Ergebnisse bei den Säuen überwacht, als auch serologische Ergebnisse, sowohl bei den Säuen, als auch bei den Ferkeln. Die Analyse der Ergebnisse wurde bei der Bewertung der Wirksamkeit des Impfstoffs verwendet (Tabelle 1).
Der Challenge wurde in den Sicherheitsställen des Forschungszentrums durchgeführt. Alle Tiere wurden bei der Rate von 5 ml PRRSV-218-P6-Mϕ-F22055-29/10/94 infiziert, ein Stamm, welcher isoliert und in den Lagern des Forschungszentrums gehalten wird, mit einem Titer von 10^6,1 TCID₅₀/ml (Gewebekultur infektiöse Dosis 50%) auf intranasalem Weg (IN).
Für die Bewertung der reproduktiven Ergebnisse der Säue am Tag des Wurfs wurden die folgenden Daten festgehalten (Tabelle 3).

– Anz. an Ferkeln, welche lebend und bei guter Gesundheit geboren werden
– Anz. an Ferkeln, welche lebend aber schwach geboren werden
– Anz. an tot geborenen Ferkeln
– Anz. an Ferkeln mit partieller Autolyse (edematös)
– Anz. an mumifizierten Ferkeln
– Ferkel, welche nach der 1. Lebenswoche am Leben sind und
– Ferkel, welche zur Entwöhnungszeit (Alter von 25–30 Tagen) am Leben sind.

Tabelle 3 Reproduktive Ergebnisse
Dann wurden serologische Responses in den Säuen (Tabelle 4) und Ferkeln (Tabellen 5, 6, 7, 8 und 9) mittels eines Peroxidase-Monoschicht-Tests (IPMA) [Immuno Peroxidase Monolayer Assay, Wensvoort et al., Vet. Quaterly, Vol. 13, Nr. 3 (Juli 1991)] gemäß dem folgenden Programm analysiert:
D 0 (Tag 0): Blutung und Impfung
D + 14: Blutung [bei 14 Tagen nach Impfung]
D + 21: Blutung und Wiederimpfung [21 Tage nach Impfung]
D + 28: Blutung [28 Tage nach Impfung]
D + 35: Blutung [35 Tage nach Impfung]
D I: Blutung und Challenge
D I + 7: Blutung [bei 7 Tagen nach Infektion]
Die serologischen Ergebnisse bei den Säuen (Anti-PRRSV-Antikörper) werden in Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4 Serologische Ergebnisse (Anti-PRRSV-Antikörper)

NT: nicht getestet;
–: negativ

Sau Nr.: Referenz der Sau
Anz.: Anzahl Ferkel;
Ab: Antikörper;
–: negativ
REF: Referenz des Ferkels

Sau Nr.: Referenz der Sau
Anz.: Anzahl Ferkel;
Ab: Antikörper;
N. T.: nicht getestet;
–: negativ
REF: Referenz des Ferkels

Sau Nr.: Referenz der Sau
Anz.: Anzahl Ferkel;
Ab: Antikörper;
N. T.: nicht getestet;
–:: negativ
REF: Referenz des Ferkels

Sau Nr.: Referenz der Sau
Anz.: Anzahl Ferkel;
Ab: Antikörper;
REF: Referenz des Ferkels

Zum Zwecke der Bewertung der Impfstoffe, welche Gegenstand des Tests waren, sind serologische, als auch reproduktive Ergebnisse bewertet worden. Tabelle 10 zeigt einige der serologischen Daten, während Tabelle 11 die reproduktiven Daten der Säue zusammenfasst, welche in den Tests verwendet wurden, einschließlich Information bezüglich der Gesamtzahl geborener Ferkel, der Anzahl lebender Ferkel nach der 1. Woche, der Anzahl an entwöhnten Ferkeln und der Anzahl an Ferkeln, welche über 40 Tage alt sind. Tabelle 10 Zusammenfassung von serologischen und reproduktiven Daten

–: negativ;
+: positiv
D 0: Zeitpunkt der Impfung

Tabelle 11 Zusammenfassung der reproduktiven Daten
Die Ergebnisse machen in ihrer Gesamtheit deutlich, dass im Fall von Impfstoff rPRRS C eine Sau serokonvertierte (400298) und eine Sau nicht (400398); im Fall von Impfstoff D serokonvertierte keine der Säue; für Impfstoffe E und F gibt es starke Serokonversion hauptsächlich aufgrund des für ORF7 kodierten Proteins.
Es gibt ein vorteilhaftes Verhalten vor dem Challenge, wenn die geimpften Tiere mit den nicht geimpften verglichen werden, was es ermöglicht, positiv zu versichern, dass die rekombinanten Impfstoffe, welche Gegenstand des Versuchs sind, ein wirksames Mittel zur Verhinderung von PRRS darstellen.
Es ist verifiziert worden, dass geimpfte Säue ohne Antikörper, titriert mit der IPMA-Technik, geschützt sind, was belegt, dass die besagten Impfstoffe (rPRRS C und rPRRS D) in der Lage sind, zelluläre Immunität auszulösen.
Die Wirksamkeit des Impfstoffes wurde bewertet durch Vergleichen von:

a) dem Prozentsatz an Ferkeln, welche nach der 1. Woche am Leben sind, im Gegensatz zur Gesamtzahl der geborenen Ferkel,
b) dem Prozentsatz an entwöhnten Ferkeln im Gegensatz zur Gesamtzahl an geborenen Ferkeln und
c) dem Prozentsatz an Ferkeln mit einem Alter über 40 Tage im Gegensatz zur Gesamtzahl an geborenen Ferkeln.

Tabelle 12 zeigt die Daten bezogen auf den Prozentsatz an Ferkeln, welche nach der 1. Woche am Leben sind, dem Prozentsatz der entwöhnten Ferkel und dem Prozentsatz an Ferkeln, die über 40 Tage alt sind, im Gegensatz zur Gesamtzahl der geborenen Ferkel.
Es ist verifiziert worden, dass die Tiere ohne Antikörper, bewertet durch die IPMA-Technik, geschützt sind.
Tabelle 12 Prozentsatz an Ferkeln, welche nach der 1. Woche, entwöhnt und über 40 Tage am Leben sind im Gegensatz zur Gesamtzahl der geborenen Ferkel
Hinterlegung von Mikroorganismen
Die erhaltenen rekombinanten Baculoviren wurden bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, United Kingdom gemäß dem Budapes ter Vertrag von 1977 hinterlegt. Die Bezeichnung und Eingangsnummern der rekombinanten Baculoviren sind:

Bezeichnung ECACC Eingangsnummer

AcNPV, PRRS2 V94021007

AcNPV, PRRS3 V94011325

AcNPV, PRRS4 V94021008

AcNPV, PRRS5 V94011326

AcNPV, PRRS6 V94011327

AcNPV, PRRS7 V94011328
All diese Baculoviren wurden am 13. Januar 1994 hinterlegt, außer AcNPV, PRRS2 (V94021007) und AcNPV, PRRS4 (V94021008), welche am 10. Februar 1994 hinterlegt wurden.
Legende Figuren
3

a) PRRSV-Genom
b) Größe (Kb)
c) Klon-Nummer

9

a) Antigen-Titration durch ELISA
b) Extinktion bei 405 nm
c) Antigen Verdünnungen (1/ )
d) Serum bei 1/200 -------- Feld --+--+-- Experimentell --*--*-- Negativ

10

a) Serum-Titration durch ELISA
b) Extinktion bei 405 nm
c) Serumverdünnungen (1/ )
d) Positiv ------- Negativ --+--+--

11

a) Feldserum-Titration
b) Extinktion bei 405 nm
c) Sau-Serum

Claims

Rekombinante Proteine des verursachenden Virus von Porcinem Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom (PRRS), dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einem der durch ORFs 2 bis 7 des Virus PRRS-Olot kodierten Proteine ausgewählt werden.
Proteine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die in 2 gezeigten Aminosäuresequenzen umfassen.
Proteine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels Gentechnik in einem rekombinanten Baculovirus-Expressionssystem, multipliziert in einer permissiven Wirtszellkultur erhältlich sind.
Proteine gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass solche rekombinanten Baculoviren mindestens das Gen eines Proteins, kodiert durch ORFs 2 bis 7 des Virus PRRS-Olot ordentlich insertiert enthalten und exprimieren.
Proteine gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass solche permissive Wirtszellkultur eine Kultur aus permissiven Insektenzellen ist.
Proteine gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie mittels der Expression von rekombinanten Baculoviren, ausgewählt aus:
erhältlich sind.
Verfahren zum Erhalt von rekombinanten PRRS-Olot Proteinen, kodiert durch die Gene, welche in einer der ORFs 2 bis 7 von besagtem Virus enthalten sind, welches die Stufen umfasst: a) Herstellung der cDNA-Sequenz, synthetisiert aus der PRRS- Olot Genom-RNA, um in ein Baculovirus insertiert zu werden; und b) Erhalt von rekombinanten Baculoviren, die die rekombinanten Proteine entsprechend den insertierten ORFs exprimieren.
Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung der zu insertierenden cDNA-Sequenz die Stufen umfasst: a.1) Isolieren und Reinigen des Virus PRRS-Olot a.2) Isolieren der PRRS-Olot Virus-RNA; und a.3) Synthese von cDNA aus der PRRS-Olot Genom-RNA.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des Virus PRRS-Olot durch Replikation des besagten Virus auf permissiven Zellkulturen durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung der PRRS-Olot Virus-RNA durch Adsorption auf eine Oligo-d(T)₁₂-Cellulose durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Synthese von cDNA aus der PRRS-Olot Genom-RNA durch Inkubieren der besagten RNA mit den entsprechenden dNTPs, reverse Transkriptase und entweder einem Oligo-d(T)₁₂ oder alternativ einem Oligonucleotid mit der Formel 5'CGGGCTCGAGCCTTTGGCGA3' durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Erhalt von rekombinanten Baculoviren, welche rekombinante Proteine exprimieren, die ORFs 2 bis 7 von PRRS-Olot entsprechen, welches die Stufen umfasst: b.1) Insertion der entsprechenden ORF-Gene in Baculovirus-Transfervektoren; b.2) Transfektion von permissiven Wirtszellen mit den besagten Transfervektoren, welche die entsprechenden ORF-Gene insertiert haben; und b.3) Selektion der rekombinanten Baculoviren, welche die entsprechend insertierten ORF rekombinanten Proteine exprimieren.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass besagter Baculovirus-Transfervektor Vektor pAcYM1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Transfektion der besagten permissiven Wirtszellen für die Replikation von rekombinanten Baculoviren mit einem Gemisch aus DNA des Transfervektors, der das entsprechende ORF-Gen inser tiert hat, und DNA des Wild-Typ Baculovirus durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass besagte permissive Wirtszellen eine Insekten-Zellkultur ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der erhaltene rekombinante Baculovirus ein einzelnes rekombinantes Protein von PRRS-Olot exprimiert, ausgewählt aus einem der Proteine, kodiert durch ORFs 2 bis 7 des besagten Virus.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die erhaltenen rekombinanten Baculoviren ausgewählt werden aus:
Rekombinante Baculoviren, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein rekombinantes Protein entsprechend einem von ORFs 2 bis 7 von PRRS-Olot exprimieren.
Rekombinante Baculoviren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein einzelnes rekombinantes Protein von PRRS-Olot exprimieren, ausgewählt aus einem der Proteine, kodiert durch ORFs 2 bis 7 des besagten Virus.
Rekombinante Baculoviren gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ausgewählt werden aus:
Impfstoff, welcher für die Impfung und den Schutz von Schweinen vor Porcinem Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom (PRRS) geeignet ist, welcher mindestens ein rekombinantes Protein entsprechend einem der durch ORFs 2 bis 7 von PRRS-Olot kodierten Proteine und einen geeigneten Träger oder Hilfsstoff umfasst.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagte rekombinante Proteine durch Gentechniken in einem Expressionssystem aus rekombinanten Baculoviren, multipliziert in permissiven Wirtszellkulturen erhältlich sind.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Baculoviren, die besagte rekombinante Proteine exprimieren, ausgewählt werden aus:
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagte rekombinante Proteine teilweise gereinigt verwendet werden.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die antigene Phase ein einzelnes rekombinantes PRRSV-Protein enthält, ausgewählt aus der Gruppe, gebildet durch die rekombinanten Proteine, kodiert durch PRRS-Olot ORFs 3, 5 und 7.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagte antigene Phase aus Insektenzellen, infiziert mit dem gleichen rekombinanten Baculovirus besteht, welches nur eines der rekombinanten Proteine exprimiert, welche durch PRRS-Olot ORFs 2 bis 7 kodiert werden.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass besagte antigene Phase aus Insektenzellen, infiziert mit unterschiedlichen rekombinanten Baculoviren besteht, von welchen jedes einzelne nur eines der unterschiedlichen rekombinanten Proteine exprimieren, welche durch PRRS-Olot ORFs 2 bis 7 kodiert werden.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass er einen öligen Hilfsstoff enthält.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der besagte ölige Hilfsstoff aus einem Gemisch aus Marcol^®TM52, Simulsol 5100 und Montanide^®TM888 besteht.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass er einen wässerigen Hilfsstoff enthält.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass er zusätzlich Zellrespons-Potentiator(CRP)-Substanzen, wie IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, g-IFN, Zellnekrosefaktor und ähnliche Substanzen enthält.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Hilfsstoff ein Hilfsstoff ist, welcher in der Lage ist, Zellrespons zu modulieren und immunstimulieren, wie MDP, ISCOM oder Liposome.
Impfstoff gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass er in der Lage ist, zelluläre Immunität in geimpften Tieren herbeizuführen.
Zwei- oder vielwertiger Impfstoff, welcher in der Lage ist, Porcines Reproduktives und Respiratorisches Syndrom und eine andere oder andere porcine Infektionen zu verhindern, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein rekombinantes Protein umfasst, entsprechend einem der Proteine, welche durch eines der Gene kodiert werden, welche in einem von ORFs 2 bis 7 von PRRS-Olot enthalten sind, zusammen mit einem oder mehreren Schweine-Pathogenen, und einen geeigneten Träger oder Hilfsstoff.
Impfstoff gemäß Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass er mindestens ein porcines Pathogen einschließt, ausgewählt aus der Gruppe welche durch Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Porcine parvovirus, Leptospira, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Porcine respiratory coronavirus, Rotavirus oder vor Aujeszky-Krankheit, Schweine-Influenza oder transmissibler Gastroenteritis verursachenden Pathogenen gebildet wird.
Passiver Impfstoff, welcher zur Impfung und zum Schutz von Schweinen vor Porcinem Reproduktiven und Respiratorischen Syndrom (PRRS) geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass er spezifische Antikörper, welche mittels der Immunisierung von Tieren mit mindestens einem rekombinanten Protein entsprechend einem der Proteine erhalten werden, kodiert durch eines der Gene, welche in einem von ORFs 2 bis 7 von PRRS-Olot enthalten sind, und einen geeigneten Träger oder Hilfssstoff enthält.
Diagnostisches Kit für den Nachweis der Gegenwart von Antikörpern, die speziell PRRSV in einer biologischen Probe wie Blut, Serum, Auswurf, Speichel oder Milch von Schweinen identifizieren, welches mindestens ein rekombinantes Protein entsprechend einem von ORFs 2 bis 7 von PRRS-Olot und geeignete Nachweismittel enthält.
Diagnostisches Kit gemäß Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass besagte rekombinante Proteine durch Gentechnik in einem Expressionssystem aus rekombinanten Baculoviren, multipliziert in permissiven Wirtszellkulturen erhältlich sind.
Diagnostisches Kit gemäß Anspruch 38, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Baculoviren, welche das besagte rekombinante Protein exprimieren, ausgewählt werden aus:
Diagnostik für den Nachweis der Gegenwart von PRRSV in einer biologischen Probe wie Blut, Serum, Auswurf, Speichel, Gewebe oder Milch von Schweinen, welche Antikörper, die speziell das PRRSV identifizieren, erhalten durch Immunisieren von Tieren mit mindestens einem rekombinanten Protein entsprechend einem von ORFs 2 bis 7 von PRRS-Olot und geeignete Nachweismittel umfasst.