KR20140006040A - 신규 유럽형 ｐｒｒｓｖ 스트레인 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 PRRSV 유럽형 스트레인을 함유하는 변형된 생 PRRS 개량 백신 및 이러한 백신의 사용 및 제조 방법에 관한 것이다.

Description

신규 유럽형 ＰＲＲＳＶ 스트레인{NOVEL EUROPEAN PRRSV STRAIN}

본 발명은 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)의 생약독화된 스트레인, 이러한 스트레인의 제조 방법, 이에 기초한 백신 및 이러한 백신의 제조 방법 및 돼지의 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.

돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)은 현재 전세계적으로 양돈 산업에 영향을 미치는 가장 중요한 질환으로서 대다수가 인정하고 있다. 이 증후군은 1987년에 미국에서 "신종 돼지 질환(mystery swine disease)"으로서 최초로 공개되었고, 전세계적으로 급속히 전파되었다. 이 증후군은 심각한 생식 감소를 일으키고, 이차 감염으로 인한 증가된 사망률과 관련이 있으며, 감소된 사료 전환 및 1일 평균 체중 증가와 연관되어 있다. 불행하게도, PRRS를 일으키는 바이러스의 제어는 곤란한 것으로 판명되어 왔다.

PRRS 바이러스(PRRSV)는 아테리비리대(Arteriviriae)과로 분류되는 외피 단일 가닥 RNA 바이러스이다(Cavanaugh, 1997). 이 바이러스는, 1987년에 미국에서 "신종 돼지 질환"으로서 최초로 공개된 돼지의 광범위한 질환을 일으킨다(Hill, 1990). 이 질환은 전연령 그룹의 돼지에서 호흡기 질병 증세로 나타내며, 일부 어린 돼지에서는 사망을 유도하고, 생식 적령기의 암컷에서는 심각한 생식 문제를 유도한다.

PRRSV의 전염은 감염된 돼지와 감수성 돼지 사이의 직접적인 접촉을 통해 발생할 수 있으며, 흔히 이러한 접촉을 통해 발생한다. 또한, 공기에 의한 또는 정액을 통한 매우 근거리에 걸친 전염이 발생할 수 있다. 일단 감염되면, 이 바이러스는 성체의 혈액에서 약 2주 동안 잔류하고, 감염된 돼지에서 1개월 내지 2개월 이상 동안 잔류한다. 감염된 수컷 돼지는 정액에 바이러스를 100일 이상 보관할 수 있다. 이러한 장기간의 바이러스혈증은 전염 가능성을 유의하게 증가시킨다. 또한, PRRS 바이러스는 임신 기간의 마지막 3분의 1기간 동안에 태반을 가로질러 자궁내 새끼 돼지를 감염시켜 새끼 돼지를 사산시키거나 허약하게 태어나게 할 수 있다.

매우 또는 보통의 건강한 상태의 돼지 또는 실외 사육시설 중 어느 하나로부터의 돼지를 포함한 모든 유형 및 크기의 무리는 PRRS 바이러스에 감염될 수 있다. 감염된 무리는 심각한 생식 감소뿐만 아니라, 불량한 성장을 동반한 증가된 수준의 이유(weaning) 후 폐렴도 경험할 수 있다. 생식상(reproductive phase)은 전형적으로 2개월 내지 3개월 동안 지속되지만; 이유 후 문제는 풍토성(endemic)이 되는 경우가 있다. 생식 질환은 임신 마지막 기간에 어미 돼지와 새끼 돼지 둘 다에 영향을 미치는 유산 발생을 특징으로 한다. 임신 109일 내지 112일 즈음에 조기 분만이 발생한다. 사산된 새끼 돼지 및 허약하게 태어난 새끼 돼지의 수는 증가하고, 이유 전 사망률에서 현저한 증가를 초래한다.

호흡기 상은 전통적으로 너서리(nursery), 특히 연속 급식 너서리에서 관찰되어 왔다. 그러나, PRRS 바이러스에 의해 발생된 호흡기 문제는 돼지 호흡기 질환 합병증(PRDC: porcine respiratory disease complex)의 일부로서 피니셔(finisher)에서도 발견될 수 있다. 성장률의 감소, 시장성이 없는 돼지의 비율(%) 증가 및 이유 후 사망률의 증가가 발생할 수 있다. 진단 소견은 이차 감염제로서 흔히 관찰되는 매우 다양한 다른 미생물과 함께 PRRS 바이러스와 연관되어 있는 고수준의 폐렴을 나타낸다. 세균성 분리체로는 특히 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 헤모필러스 수이스(Haemophilus suis), 액티노바실러스 플류로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 액티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida)가 포함될 수 있다. 통상적으로 연루된 바이러스제로는 돼지 인플루엔자 바이러스 및 돼지 호흡기 코로나 바이러스가 포함된다. 감염된 돼지는 고수준의 의약치료에 거의 반응하지 않으며, 올인/올아웃(all-in/all-out) 시스템은 이 질환을 제어하는데 실패해 왔다.

PRRSV 바이러스는 약 50%의 서열 상동성을 공유하는 "US" 유형 및 "EU" 유형으로서 나타내어지는 2개의 유전자형으로 존재한다(Dea S et al. (2000). Arch Virol 145:659-88). 또한, 이들 2개의 유전자형은 이들의 면역학적 특성에 의해서도 구별될 수 있다. 다양한 분리체에 대한 대부분의 서열 정보는 바이러스 게놈 중 약 4%에 불과한 구조적 단백질, 즉 외피 단백질 GP5에 기초하고, 한편, 비구조적 단백질(nsp)에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. PRRSV의 분리 및 백신의 제조는 다수의 공보에 기재되어 있다(WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930).

백신접종은, PRRS 감염으로부터 회복하는 돼지들이, 이들을 정상적인 환경 하에서 동일한 바이러스 스트레인에 의해 재차 감염되는 것을 보호하는 면역 반응을 발생시키기 때문에, PRRS의 부담을 완화시키는 주요 방법이다. 그러나, PRRS 바이러스는, (돌연변이 또는 재조합에 의해) 변화할 수 있는 능력을 갖고; 따라서 신규 바이러스 스트레인이 발생할 수 있다. 이러한 경우에, 스트레인 사이의 교차 보호가 존재하지 않을 수 있고, 사전에 감염되었던 농장에서 새로운 발병이 관찰될 수 있다. 따라서, 추가의 백신들에 대한 지속적인 요구가 존재한다.

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 생약독화 스트레인, 이러한 스트레인을 제조하는 방법, 이 스트레인을 기본으로 하는 백신 및 이러한 백신을 제조하는 방법 및 돼지를 치료하는데 사용하기 위한 그 백신의 용도에 관한 것이다.

발명의 간단한 요약

본 발명은 유럽형 유전자형의 변형된 생 PRRS의 개량 백신 및 이러한 백신의 제조에 사용될 수 있는 신규한 PRRSV 스트레인에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 부다페스트 협약의 규정에 따라 2011년 1월 25일에 각각 수탁번호 ECACC 11012501 및 ECACC 11012502로 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 기탁된 PRRS 바이러스의 개량 스트레인 또는 상기 스트레인들 중 임의의 후손 또는 자손을 제공한다.

특정 실시형태로서, 본 발명은 수탁번호 ECACC 11012501 또는 수탁번호 ECACC 11012502 하에 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 기탁된 스트레인인 유럽형 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)를 기술한다.

본 발명의 PRRSV는 변형된 PRRS 바이러스가 PRRSV에 취약한 돼지 또는 다른 포유동물에 투여되는 경우 PRRSV 질환의 임상 징후를 일으키는데 실패하지만 PRRSV의 병원성 형태에 대하여 포유동물을 면역화하는 면역 반응을 유도할 수 있도록 세포 배양을 통해 36회 이상 계대함으로써 약독화되었다는 점을 특징으로 한다.

또한, 유럽형의 MA 104-성장된 PRRSV를 비-MA 104 포유동물 세포에 적응시킴을 포함하는, 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 수탁번호 ECACC 11012502 하에 기탁된 생약독화 PRRSV 또는 수탁번호 ECACC 11012501로 기탁된 모 스트레인로부터 약독화된 PRRSV를 제조하는 방법이 고려된다.

본 발명의 다른 양상은 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 수탁번호 ECACC 11012502로 기탁된 생약독화 PRRSV 또는 수탁번호 ECACC 11012501로 기탁된 모 스트레인로부터 약독화된 PRRSV 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, PRRSV 감염에 대한 돼지 보호용 백신에 관한 것이다. 이러한 백신은 유리하게는 하나 이상의 비-PRRSV 약독화 또는 불활성화 병원체 또는 이의 항원성 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 비-PRRSV 병원체는 슈도라비스(Pseudorabies) 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보바이러스(Porcine parvvovirus), 전염성 위장염 바이러스, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로 루시오파티애(Erysipelo rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 헤모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 액티노바실러스 플류로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)로부터 선택될 수 있다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 백신은 수탁번호 렐리스타드 바이러스 스트레인 하에 기탁된 PRRSV 스트레인(Lelystad Agent (CDI-NL-2.91)) 또는 수탁번호 ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM 수탁번호 I-1140, CNCM 수탁번호 I-1387, CNCM 수탁번호 I-1388, ATCC VR2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 및 VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 또는 ECACC V93070108 하에 기탁된 다른 PRRSV 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유럽형 PRRSV 스트레인을 추가로 포함할 수 있거나, 실제로 북미 PRRS 바이러스, pT7P129A; ATCC 수탁번호 VR-2332, ATCC 수탁번호 VR-2368, ATCC VR-2495, ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 및 ATCC VR 2402와 같은 미국 스트레인일 수 있다.

본 발명의 백신은 피내 또는 근육내 투여에 적합한 담체를 포함할 수 있음이 고려된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 백신은 동결 건조 형태이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 백신은 적어도 약 107개의 바이러스 입자를 포함한다.

본 발명의 다른 양상은 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 수탁번호 ECACC 11012502 하에 기탁된 생약독화 PRRSV 바이러스 또는 수탁번호 ECACC 11012501로 기탁된 모 스트레인로부터 약독화된 PRRSV 바이러스를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함을 포함하는, PRRS 퇴치용 생약독화 백신을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법에서, 생약독화 PRRSV는 바람직하게는 수탁번호 ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM 수탁번호 I-1140, CNCM 수탁번호 I-1387 및 CNCM 수탁번호 I-1388 하에 기탁된 PRRSV 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유럽형 PRRSV 스트레인을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 생약독화 PRRSV는 항원보강제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 감염되기 쉬운 돼지 또는 다른 포유동물에 투여되는 경우 PRRS 질환의 임상 징후를 일으키지 못하지만 PRRSV의 병원성 형태에 대하여 포유동물을 면역화하는 면역 반응을 유도할 수 있도록, 돼지에게, 세포 배양에서 36회 이상 계대되어 바이러스가 변형된 PRRS 94881 바이러스를 포함하는 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스와 약물학적으로 혼화가능한 담체 제제와 혼합된 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)에 대해 돼지를 면역화하는 방법이 고려된다.

일부 실시형태에서, 백신접종 후 돼지에 폐 병변이 전혀 나타나지 않는 면역화 방법이 수행된다. 다른 실시형태에서, 포르실리스(Porcilis) 백신접종과 비교하여 본 발명의 백신접종 후의 돼지에서 보다 적은 폐 병변이 나타난다.

본 발명의 다른 양상은 서열번호 1 또는 서열번호 10 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열과 95% 이상 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 PRRS 바이러스에 관한 것이다.

또한, 서열번호 2 내지 서열번호 9 또는 서열번호 11 내지 서열번호 18에 제시된 서열 중 어느 하나와 98% 이상 동일한 단백질을 암호화하는 하나 이상의 ORF를 포함하는 PRRS 바이러스가 고려된다.

또한, 서열번호 1 또는 서열번호 10 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 단편(여기서, 상기 단편은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 ORF를 암호화한다)의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 PRRS 바이러스가 고려된다.

본 발명은 추가로 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 ORF를 암호화하는 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는, 돼지 동물의 백신접종용 아단위 백신에 관한 것이다.

본 발명의 다른 양상은 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는, 돼지 동물의 백신접종용 아단위 백신에 관한 것이다.

또한, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 서열을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 조성물이 고려된다.

또한, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 분리된 핵산이 고려된다.

본 발명은 추가로, 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 PRRSV ORF를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 및/또는 이러한 발현 벡터를 포함하는 백신에 관한 것이다. 이러한 실시형태에서, ORF를 암호화하는 핵산은 바람직하게는 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.

도 1a: 유럽형 시험처리 스트레인을 사용한 호흡기 시험처리 모델에서의 기침 점수의 임상 관찰.
도 1b: 유럽형 시험처리 스트레인을 사용한 호흡기 시험처리 모델에서의 총 임상 점수의 임상 관찰.
도 2: 유럽형 시험처리 스트레인을 사용한 호흡기 시험처리 모델에서의 직장 온도 측정값.
도 3: 유럽형 시험처리 스트레인을 사용한 호흡기 시험처리 모델에서의 평균 1일 체중 증가 측정값.
도 4: 유럽형 시험처리 스트레인을 사용한 호흡기 시험처리 모델에서의 정량 PCR을 통해 나타낸 PRRS 바이러스혈증.
도 5: 유럽형 시험처리 스트레인을 사용한 호흡기 시험처리 모델에서의 ELISA에 의해 나타낸 PRRS 혈청학.
도 6: 유럽형 시험처리 스트레인을 사용한 호흡기 시험처리 모델에서의 폐 병변의 육안 검사.
도 7a 내지 도7c는 조직병리학적 측정값. 도 7a는 평균 육안 폐 병변을 나타낸다; 도 7b는 대조군 동물의 조직병리학을 나타낸다; 도 7b는 PRRS 감염 동물의 조직병리학을 나타낸다.
도 8: 유럽형 PRRS 94881로 백신접종된 동물에서의 바이러스혈증(%)을 나타내는 RT-실시간 PCR 결과를 나타낸다.
도 9는 유럽형 PRRS 94881의 대규모 생산을 위한 동시 공정이다.

본 발명은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 감염의 중증도의 치료 또는 감소 방법뿐만 아니라 PRRSV 감염의 예방 방법도 제공한다. 일반적으로, 이 방법은 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV) 감염의 중증도 또는 발병률을 치료하거나 감소시키기 위한 것이다. "중증도 또는 발병률의 치료 또는 감소"는 보통 감염과 연관된 임상적 징후, 증상 및/또는 병리학적 징후의 중증도 감소를 말하고, 임의의 이러한 징후 또는 증상의 예방까지 포함한다. "병리학적 징후"는 현미경으로 또는 부검시에 관찰된 감염 증거(예, 폐 병변)를 말한다.

본 발명의 방법은 일반적으로 치료량의 PRRSV 항원을 특정 연령 또는 일정 범위 연령의 돼지에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 한 양상에서, 한 치료량의 PRRSV 항원을 약 3주령 이하의 새끼 돼지에게 투여할 수 있고, 상이한 치료량의 항원을 약 3주령과 4주령 사이의 돼지에게 투여할 수 있다. 마찬가지로, 또 다른 치료량을 약 4주령과 16주령 사이의 돼지(또는 이 범위 내의 임의의 연령, 예를 들면, 5주령 내지 6주령, 9주령 내지 15주령, 7주령 내지 10주령 등) 또는 어미 돼지와 같은 16주령 이상의 돼지에게 투여할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 신규 개발된 정형 PRRSV 스트레인에 유효 면역성을 부여하는 약독화된 비정형 PRRSV 스트레인 및 상응하는 개량된 변형 생백신에 관한 것이다. "유효 면역성"은 질환의 실질적인 임상 징후를 초래하는 비정형 PRRSV 감염을 포함한 돼지 PRRSV 감염을 예방하는 백신의 능력을 말한다. 면역화 돼지는 PRRSV에 대해 혈청학적으로 양성일 수 있거나 그렇지 않을 수 있지만 돼지는 임의의 실질적인 임상 증상을 나타내지 않음은 이해되어야 한다.

바람직한 형태에서, 본 발명의 백신은 병독성이 약독화된 유럽형 PRRS 생 바이러스를 포함한다. 얻어진 약독화 바이러스는 시험처리된 숙주 동물 연구에서 비병독성이고 유효 면역성을 부여하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 특정 유럽형 PRRS 스트레인은 다른 스트레인만큼 병독성이 없고, 이에 따라 이 스트레인은 백신 후보군으로서 매력적인 옵션이다. PRRSV 94881 모 스트레인은 임신한 돼지에서 중증의 비정형 PRRS 질환을 일으키지 않으며 또한 어린 돼지에서도 중증의 폐 병변을 일으키지 않는다. 이 스트레인은 독일의 북부 라인 웨스트팔리아(North Rhine Westphalia)에서 중증의 호흡기 장애를 앓고 있는 3주령 새끼 돼지로부터 처음 분리되었다. 후속적으로 이 스트레인은 MA 104 세포에서의 연속 계대를 통해 약독화되었다. 약독화 스트레인은 독일 뮌스터 48149 멘델슈트라쎄 11에 소재하는 바이오스크린 게엠베하(Bioscreen GmbH)가 2011년 1월 25일자로 영국 SP4 0JG 윌트셔 살리스버리 포톤 다운에 소재한 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 기탁하여 수탁번호 11012502를 부여받았다. 이 약독화 바이러스는 바람직한 마스터 종균 바이러스(MSV)이며, 이 종균 바이러스는 이후 계대되어 유효한 PRRSV 백신으로서 개발되었다. 94881로 명명된 병독성 모 스트레인 또한 독일 뮌스터 48149 멘델슈트라쎄 11에 소재하는 바이오스크린 게엠베하가 부다페스트 협약에 따라 2011년 1월 25일자로 영국 SP4 0JG 윌트셔 살리스버리 포톤 다운에 소재한 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 기탁하여 수탁번호 11012501을 부여받았다.

특정 예시적인 실시형태에서, 변형된 생 바이러스 백신이 근육내 주사를 통해 새끼 돼지의 경우 1ml의 용량으로, 어미 돼지의 경우 2ml의 용량으로 시험되었고, 보호 면역성을 생성하는데 유효한 것으로 나타났다.

바이러스의 약독화를 위한 계대는 전통적인 바이러스학 방법을 사용하여 달성하였다. 구체적으로, 모 분리체 PRRS 94881을 최초 분리 후 MA 104 세포에서 최대 108회의 연속 계대를 수행하여 시험관내 약독화하였다. 간단히 설명하면, 모 분리체를 T-25㎠ 또는 T-75㎠ 플라스크에서 주당 대략 1 또는 2회 계대하여 총 108회 계대하였다. 6% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 최소 필수 배지(MEM) 약 12 내지 30mL를 이용한 MA 104 세포 단층 배양물에 100 내지 300㎕의 바이러스를 접종하였다. 배양물을 4 내지 6% CO₂를 포함한 37℃의 가습실 인큐베이터에서 3 내지 7일 동안 배양하였다. 일단 배양물의 세포 병변 효과(CPE)가 25% 이상에 도달하면 플라스크에서 상청액을 추출함으로써 수확하였다. 상청액의 일부는 새로운 플라스크에 옮기고 2mL의 수확물을 분취하여 -60℃ 내지 -80℃에서 저장하였다.

본 분야의 표준 기술을 사용하는 전문가는 ECACC에 수탁번호 11012502 하에 기탁된 본 발명의 약독화 바이러스의 주요 핵산 서열을 결정할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 ECACC에 수탁번호 11012502 하에 기탁된 약독화 PRRSV 94481에 특이적인 핵산 서열을 포함한다.

바람직하게는, 본 발명은 추가로 서열번호 1 또는 서열번호 10의 서열과 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 PRRS 바이러스 핵산 서열을 포함하고, 이와 같은 바이러스가 이러한 상동성 서열을 함유하는 약독화된 바이러스로 백신접종된 동물에게 면역성을 부여하는데 효과적일 수 있다. 서열번호 1에 나타낸 서열은 약독화 PRRS 94881 MSV의 전장 서열이고, 14843 bp의 전장 서열을 갖는다. 이 서열에 대한 ORF 1 내지 7은 다음과 같았다:

ORF 번호 서열번호 1 내의 CDS 암호화된 단백질

OFR1a 178 내지 7227 서열번호 2

ORF1b 7209 내지 11600 서열번호 3

ORF2 11611 내지 12360 서열번호 4

ORF3 12219 내지 13016 서열번호 5

ORF4 12761 내지 13312 서열번호 6

ORF5 13309 내지 13914 서열번호 7

ORF6 13902 내지 14423 서열번호 8

ORF7 14413 내지 14799 서열번호 9

서열번호 10에 나타낸 서열은 모 PRRSV 94881 계대 5의 전장 서열이며 14843 bp의 전장 서열을 갖는다. 이 서열에 대한 ORF 1 내지 7은 다음과 같았다:

ORF 번호 서열번호 10 내의 CDS 암호화된 단백질

OFR1a 178 내지 7227 서열번호 11

ORF1b 7209 내지 11600 서열번호 12

ORF2 11611 내지 12360 서열번호 13

ORF3 12219 내지 13016 서열번호 14

ORF4 12761 내지 13312 서열번호 15

ORF5 13309 내지 13914 서열번호 16

ORF6 13902 내지 14423 서열번호 17

ORF7 14413 내지 14799 서열번호 18

이러한 신규 약독화 유럽형 PRRS 바이러스 스트레인의 분리로, 본 분야에서 현재 발견된 맹독성 PRRS 스트레인을 반영하는 가장 최근의 PRRS 스트레인을 함유하는 개량된 PRRS 백신을 제조하는 것이 가능하다. 특히, 신규 약독화 유럽형 PRRS 바이러스를 사용하여 변형된 생백신(MLV)을 제조할 수 있다. 변형된 생백신은 돼지에서 복제할 수 있는 생 바이러스를 함유하지만 PRRS의 임상적 질환을 나타내지 않는다는 것을 특징으로 한다. 또한, 변형된 생백신은 돼지에게 투여시 면역 반응을 발생하고, 일반적으로 병원성 PRRS 바이러스에 의한 후속적 감염에 대해 상당한 정도의 보호를 유도한다. 이와 같은 특성을 나타내는 바이러스를 일반적으로 약독화 바이러스라고 칭한다. 추가로, 본 발명은 PRRSV 94881의 모 스트레인과 약독화 스트레인 둘 다의 ORF 서열을 상세히 제공한다. 따라서, 전문가가 아단위 백신에 본원에 제시된 OFR 서열 중 임의의 하나 이상의 서열을 사용할 수 있음이 고려되어야 한다.

앞서 주지된 바와 같이, 일반적으로, 바이러스의 약독화는, 바이러스가 목적하는 특성을 나타낼 때까지 바이러스를 허용하는 적합한 숙주 세포에서의 반복 계대에 의해 병원성 바이러스 분리체로부터 달성할 수 있다(WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930). 대안으로, 바이러스의 약독화는 감염성 클론, 정상적으로는 바이러스 게놈의 전장 상보성 DNA 전사물의 사용을 통한 유전적 재조작에 의해 달성할 수 있다(WO 98/18933, EP 1 018 557, WO 03/062407, Neilsen et al., J Virol 2003, 77:3702-3711). 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 ECACC에 수탁번호 11012501로 기탁된 모 바이러스로부터 약독화된 유럽형 유전자형 94481의 약독화 PRRS 바이러스를 함유한 MLV에 관한 것이다. 바람직한 MLV는 ECACC에 수탁번호 11012502로 기탁된 본 발명의 약독화 바이러스를 함유한다.

다른 양상에서, 본 발명은 수탁번호 ECACC 11012502(MLV의 약독화 스트레인) 및 11012501(모 스트레인) 하에 영국 SP4 0JG 윌트셔 살리스버리 포톤 다운에 소재하는 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 2011년 1월 25일에 기탁된 PRRS 바이러스의 후손 또는 자손을 제조하고 분리하는 방법을 고려한다.

따라서, 본 발명은 증식 또는 복제를 통해 기탁된 스트레인으로부터 동일형 또는 분지형으로 유도된 PRRS 바이러스 스트레인, 특히 기탁된 스트레인의 필수 특성을 보유한 자손으로 이어진다. 연속 증식시, 스트레인은 돌연변이를 획득할 수 있고, 이러한 돌연변이의 대부분은 이들 스트레인의 특성을 유의하게 변경하지 않을 것이다.

또한, 본 발명의 스트레인은 이들에 추가의 목적하는 특성이 부여되도록 추가로 변형될 수 있다. 이는 적합한 숙주 세포에서 연속적으로 증식하여 약독화 표현형을 연장하는 것과 같은 전통적인 증식 및 선별 기술에 의해 달성될 수 있다. 대안으로, 스트레인은 적합한 유전 공학 기술에 의해 이들 스트레인 게놈의 핵산 서열의 지시된 돌연변이에 의해 유전적으로 변형될 수 있다. PRRSV 게놈은 완전히 또는 부분적으로 서열분석되었고(Conzelmann et al., 1993; Meulenberg et al., 1993a, Murtaugh et al., 1995), RNA 의존 RNA 폴리머라제(ORF 1a 및 1b) 이외에 6개의 구조 단백질, 즉 GP2(ORF2), GP3(ORF3), GP4(ORF4) 및 GP5(ORF5)로 명명된 4개의 외피 당단백질, 비당화 막단백질 M(ORF6) 및 뉴클레오캡시드 단백질 N(ORF7)을 암호화한다(Meulenberg et al., 1995, 1996; van Nieuwstadt et al., 1996). 유럽형 및 미국형 스트레인의 PRRSV의 면역학적 특징 및 뉴클레오타이드 서열분석은 구조적 바이러스 단백질 내에 위치한 PRRSV의 스트레인 내에서 적은 항원성 차이를 확인하였다(Nelson et al., 1993; Wensvoort et al., 1992; Murtaugh et al., 1995). 본 발명의 PRRS 94881 MSV를 유럽형 참조 바이러스 스트레인 렐리스타드 바이러스(LV)와 비교한 결과 8개의 다른 바이러스 유전자에서 85.40 내지 95.09 퍼센트의 뉴클레오타이드 상동성이 나타났고, 두 바이러스 스트레인 사이에 86.39 내지 97.27 퍼센트의 아미노산 동일성이 나타났다. 94881 MSV의 ORF1a에서 2개의 결실은 LV와 비교하여 동일하였다. 예를 들면, 94881 MSV의 ORF1a는 렐리스타드 바이러스와 85.40% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 86.39%의 아미노산 동일성을 보이고; 94881 MSV의 ORF1b는 렐리스타드 바이러스와 92.12% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 97.27%의 아미노산 동일성을 보이며; 94881 MSV의 ORF2는 렐리스타드 바이러스와 91.07% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 90.76%의 아미노산 동일성을 보이고; 94881 MSV의 ORF3은 렐리스타드 바이러스와 90.98% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 89.43%의 아미노산 동일성을 보이며; 94881 MSV의 ORF4는 렐리스타드 바이러스와 90.58% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 87.43%의 아미노산 동일성을 보이고; 94881 MSV의 ORF5는 렐리스타드 바이러스와 90.43% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 88.56%의 아미노산 동일성을 보이며; 94881 MSV의 ORF6은 렐리스타드 바이러스와 95.02% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 97.11%의 아미노산 동일성을 보이고; 94881 MSV의 ORF7은 렐리스타드 바이러스와 95.09% 뉴클레오타이드 상동성을 나타내어 결국 92.97%의 아미노산 동일성을 보였다.

실제로, 본 발명의 PRRS 94881 바이러스는 ECACC 수탁번호 11012502로 기탁된 PRRS 바이러스 또는 ECACC 수탁번호 11012501로 기탁된 모 스트레인의 골격에서 ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 또는 ORF7중 하나 이상의 내인성 서열을 PRRS 바이러스의 다른 스트레인의 상응하는 ORF로 치환시킴으로써 변형된 키메라 바이러스로 제조할 수 있다. 예를 들면, PRRS 바이러스의 다른 스트레인은 렐리스타드 바이러스 스트레인(Lelystad Agent (CDI-NL-2.91))과 같은 다른 유럽형 스트레인 또는 수탁번호 ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM 수탁번호 I-1140, CNCM 수탁번호 I-1387, CNCM 수탁번호 I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 및 VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 또는 ECACC V938070108과 같은 다른 스트레인일 수 있거나, 북미 PRRS 바이러스, pT7P129A; ATCC VR-2332, ATCC VR-2386, ATCC VR-2495, ATCC VR 2385, ATCC VR2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 및 ATCC VR 2402와 같은 미국형 스트레인일 수 있다.

변형된 서열을 제조하는 재조합 기술은 본 분야의 전문가에게 잘 알려져 있으며, 일반적으로 바이러스 게놈의 전장 상보적 DNA 복제물(감염성 클론)을 작제하고, 이어서, 이것을 DNA 재조합 및 조작 방법(예, 부위-지시 돌연변이 등)에 의해 변형시킬 수 있다. 이러한 방식으로, 예를 들면, 바이러스 단백질의 항원성 부위 및 효소 특성들이 변형될 수 있다. 유럽형 및 북미형 유전자형의 PRRS 바이러스 스트레인의 감염성 클론은 문헌에 공개되어 있다.

본 발명의 백신에 적합한 본 발명의 PRRS 바이러스 스트레인은 본 분야에 공지된 방법, 예를 들면, 원숭이 세포주 MA-104, 베로 세포 또는 돼지 폐포 대식세포와 같은 적합한 숙주 세포에서 증식시킴으로써 성장시켜 수확할 수 있다. PRRSV는 우선적으로 폐포 대식세포에서 성장한다(Wensvoort et al., 1991). 또한, CL2621 및 원숭이 신장 세포주 MA-104로부터 클로닝된 다른 세포주(Benfield et al., 1992; Collins et al., 1992; Kim et al., 1993)와 같은 소수의 세포주가 바이러스에 대해 민감성이다.

따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태는 ECACC 수탁번호 11012501, ECACC 수탁번호 04102703, ECACC 수탁번호 04102702, ECACC 수탁번호 04102704, CNCM 수탁번호 I-1140, CNCM 수탁번호 I-1387 및 CNCM 수탁번호 I-1388의 PRRSV 스트레인 중 임의의 하나뿐만 아니라 이들 스트레인 또는 자손들의 임의의 배합을 포함하는 백신이다.

특정 실시형태에서, 도 9에 도시된 바와 같이 PRRS 바이러스 94881와 숙주 세포를 함께 같은 날에 생물반응기에 동시 식종하는 공정에서 PRRS 바이러스 94881을 성장시킨다. PRRS 바이러스 94881의 제조 방법에 대한 추가적인 특징은 본원과 동시에 출원된 미국 임시 특허 출원(출원 번호: 61/444,071; 발명의 명칭: "A Commercial scale process for production of PRRSV")에 기술된 바와 같을 수 있다. 이것은 PRRSV 94881을 성장시키는 한 방법이지만, 본 분야의 전문가에게 알려진 임의의 통상적인 방법에 따라 이 바이러스를 증식시킬 수 있음은 이해되어야 한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 백신은 적합한 담체 중에 살아있는 이들 스트레인 중 하나 이상을 포함하는 변형된 생백신이지만, 또한 불활성화 바이러스를 사용하여 사균 백신(KV)도 제조할 수 있다. MLV는 전형적으로 용량당 10¹ 내지 10⁷ 바이러스 입자, 바람직하게는 용량당 10³ 내지 10⁵ 바이러스 입자, 더 바람직하게는 10⁴ 내지 10⁵ 바이러스 입자(4.0 내지 5.0 log₁₀ TCID₅₀)의 투여를 허용하도록 제형화된다. KV는 용량당 10³ 내지 10¹⁰ 바이러스 입자의 불활성화전 역가를 기초로 하여 제형화될 수 있다. 백신은 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 생리학적 염용액을 포함할 수 있다.

돼지는 구비강 경로를 통해 PRRSV로 감염될 수 있다. 폐내 바이러스는 폐포 대식세포에 의해 함입되고, 이들 세포 내에서 PRRSV의 복제가 9시간 내에 완성된다. PRRSV는 폐에서 폐 림프절로 12시간 내에 이동하고, 말초 림프절, 골수 및 비장으로 3일 내에 이동한다. 이들 부위에서, 불과 소수의 세포가 바이러스 항원에 대해 양성으로 염색된다. 바이러스는 적어도 21일 동안 혈액에 존재하고, 흔히 보다 장기간 존재한다. 7일 후, PRRSV에 대한 항체가 혈액에서 발견된다. PRRS 감염 돼지에 바이러스와 항체가 혼재하는 것은 바이러스 감염이 항체의 존재에도 불구하고 비록 낮은 수준이긴 하지만 장기간 지속할 수 있음을 보여준다. 최소 7주 동안 폐내 폐포 세포군은 정상적인 SPF 폐와 다르다.

본 발명에 따른 백신은 용매와 재구성되어 주사용액을 제공하는 생바이러스의 동결건조 제제의 형태로 제공될 수 있다. 용매는 예를 들면, 물, 생리식염수 또는 완충액 또는 보조 용매일 수 있다. 용매는 보조제를 함유할 수 있다. 이어서, 재구성된 백신은 예를 들면, 목에 근육내 또는 피내 주사로서 돼지에게 주사할 수 있다. 근육내 주사의 경우, 2ml의 용적이 투여될 수 있고, 피내 주사의 경우 전형적으로는 0.2ml이다. 따라서, 추가의 양상에서, 본 발명은 별도의 용기에 바이러스의 동결건조 조성물과 재구성용 용매를 포함하고 임의로 사용지침을 포함한 설명서 또는 라벨을 추가로 함유하는 백신 제품이다.

본 발명에 따른 백신은 상기된 스트레인 중 하나 이상을 포함할 수 있을 뿐만 아니라 추가로 PRRS 또는 다른 돼지 바이러스성 또는 세균성 질환(예, 돼지 써코바이러스 또는 돼지 열병 바이러스)에 대해 활성인 성분을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 추가로 PRRS가 아닌 돼지 질환에 대해 활성인 하나 이상의 추가의 항원을 함유함을 특징으로 하는 상기된 백신에 관한 것이다. 예를 들면, 이러한 추가의 항원은 마이코플라스마 하이오뉴모니애, PCV2, SIV, 에이치. 파라수이스, 이. 루시오파티애, 에스. 수이스, 에이. 수이스, 렙토스피라 종 파르보바이러스 등을 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명의 백신은 약제학적으로 또는 수의학적으로 허용되는 특정 보조제를 포함할 수 있다. 본 발명은 백신 단독으로 투여한 것에 비하여 백신과 보조제의 조합물을 투여하여 보다 양호한 임상 반응/결과를 유도하도록 백신의 효능을 증강시키는 항원보강제를 추가로 포함하는 신규한 백신 조성물, 특히 PRRSV 94881을 포함하는 PRRS 바이러스 백신을 제공한다. 예를 들면, 본 발명의 백신 조성물은 PRRSV 94881 바이러스 백신 및 MCP-1, α-토코페롤(예를 들면, α-토코페롤 아세테이트, 이의 견본품이 Diluvac Forte®으로서 시판됨), 헤모필러스 솜누스 분액, 카르보폴 및 이들의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 보조제를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, PRRSV 94881 바이러스 백신을 포함하는 바이러스 백신은 재조합 아단위 백신일 수 있거나 대안으로 생약독화 바이러스 백신일 수 있다. 시중의 생백신 예는 Ingelvac® PRRS MLV이고, PRRSV 94881은 Ingelvac® PRRS MLV와 유사한 방식으로 제형화될 수 있다.

상기에 추가하여, 본 발명의 면역원성 조성물은 다른 성분이 보조제 또는 기본적인 바이러스 백신을 저해하지 않는 한 다른 성분을 함유할 수 있다. 이러한 다른 성분으로는 예를 들면, 결합제, 착색제, 건조제, 방부제, 습윤제, 안정화제, 부형제, 부착제, 가소제, 점착부여제, 증점제, 패치 물질, 연고 기제, 케라틴 제거제, 염기성 물질, 흡수 촉진제, 지방산, 지방산 에스테르, 고급 알코올, 계면활성제, 물 및 완충제가 포함된다. 바람직한 다른 성분은 완충제, 연고 기제, 지방산, 방부제, 염기성 물질 또는 계면활성제를 포함한다.

본 발명에 사용되는 보조제의 함량 또는 양은 다양할 수 있으며, 예를 들면, 사용되는 PRRS 바이러스 백신의 특성 및 용량 형태를 고려하여 결정할 수 있다. 보조제는 예를 들면, 1 내지 100 중량%를 포함할 수 있다. 본 발명의 PRRSV 94881-기반 조성물은 보조제 성분과 바이러스 백신 성분을 혼합하거나 단독으로 또는 이들을 여러 다른 성분과 함께 혼합함으로써 제조한다. 조성물은 바이러스 백신과 보조제가 하나의 제형으로 제공되거나, 대안으로 바이러스 백신과 보조제가, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 별개 제형으로 제공되는 것일 수 있다.

따라서, 본 발명의 면역원성 조성물의 보조제 성분은 유기체에게 투여시 바이러스 백신과 별도로 투여될 수 있다. 대안으로, 본 발명에 따른 보조제는 바이러스 백신과 함께 단일 백신 조성물로 투여될 수 있다. 바이러스 백신은 임의의 바이러스 백신일 수 있다. 보다 특정적인 실시형태는 PRRSV 94881을 포함한 PRRS 바이러스 백신의 사용을 고려한다. 추가로, 이러한 백신은 Ingelvac® PRRS MLV 및/또는 Porcilis® PRRS와 같은 다른 백신과 병용할 수 있다. 이것은 단지 하나의 예시적인 PRRS 바이러스 병용 백신이며 다른 이러한 병용 백신들은 용이하게 제조할 수 있다.

본원에 기술된 면역원성 조성물은 PRRS 바이러스에 대한 항체 반응의 제조를 유도하는데 특히 유리하다. 백신의 투여는 바람직하게는 PRRSV 감염과 연관이 있는 하나 이상의 임상 증상, 예를 들면, 폐 병변, 식욕부진증, 피부 변색, 기면, 호흡기 징후, 미이라변성 새끼 돼지, 기침, 설사 및 이들의 합병증을 경감시킬 것이다.

따라서, 본 발명 조성물은 이환 동물에서의 임상 결과를 PRRS 바이러스 백신의 단독 투여에 의한 임상 결과에 비하여 특히 증강시킨다. 특정 실시형태에서, 상기 보조제와 병용하여 면역원성 조성물을 투여받지 못한 동물과 비교하는 경우, 증강된 임상 결과는 적어도 50%까지 폐 병변률(%)의 감소이다. 다른 실시형태에서, 상기 보조제와 병용하여 면역원성 조성물을 투여받지 못한 동물과 비교하는 경우, 증강된 임상 결과는 적어도 45%까지 동물의 바이러스혈증 감소이다.

따라서, 한 양상에서, 본 발명은 바이러스 백신을 MCP-1, 헤모필러스 솜누스 분액, 카르바폴 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 보조제와 혼합함을 포함하여 증강된 개량 백신, 보다 특히 PRRS 바이러스 개량 백신에 관한 것이다. 본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 백신 조성물은 제형 분야에 알려진 임의의 방법으로 제형화할 수 있고, 예를 들면, 액제, 현탁제, 연고, 산제, 로션, W/O 에멀젼, O/W 에멀젼, 에멀젼, 크림, 습포제, 패치 및 겔로 제형화될 수 있고, 바람직하게는 약제로서 사용한다. 따라서, 본 발명의 다른 양상에 따르면, 상기 백신 조성물을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 본 발명에 따른 백신 조성물은 경피 투여되는 경우 항체 생성을 유의적으로 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 백신 조성물은 경피 제제로서 제공될 수 있다.

또한, 상기된 바와 같이, 본 발명에서 바이러스와 보조제는 유기체에게 단일 백신 조성물로서 함께 투여할 수 있거나, 백신의 항원성 PRRS 바이러스 성분과 보조제를 별도로 구별되는 제제로서 투여할 수 있으며, 그 결과로서 보조제는 PRRS 바이러스 백신에 반응하여 유기체에서 생성된 항체의 양이 PRRS 바이러스 백신을 단독 투여한 경우에 비하여 유의적으로 증가할 수 있는 양식으로 작용한다.

보조제와 PRRS 바이러스 백신이 유기체에게 투여될 때, 동물의 임상 결과는 증강된다.

본 분야에 통상의 지식을 가진자는 예를 들면, 항원성 물질의 종류 및 특성, 유기체의 종, 연령, 체중, 질환의 중중도, 질환의 종류, 투여 시간 및 투여 방법을 고려하고 추가로 유기체 내에서 항원성 물질에 대해 생성된 항체의 양을 지수로서 사용하여 유효량의 보조제 및 면역학적 유효량의 PRRS 바이러스 백신을 용이하게 결정할 수 있다.

PRRS 바이러스 백신, 보조제 또는 이들의 혼합물은 예를 들면 동물의 상태 및 질환의 특성에 따라 선택된 임의의 적합한 방법으로 유기체에게 투여할 수 있다. 이와 같은 방법의 예로는 피하 투여, 경피 투여(예, 피하 주사, 근육내 주사, 피내 주사 및 패치), 비내 투여, 경구 투여, 점막 투여(예, 직장 투여, 질내 투여 및 각막 투여)가 포함된다. 이들 중에서도 근육내 투여가 바람직하다.

전문가들은, PRRSV MLV의 예시적인 치료 용량은 약 2 밀리리터(2 mL)이다. 전문가는 동물의 품종, 크기 및 기타 신체적 인자뿐만 아니라 PRRSV MLV의 특정 제형 및 투여 경로에 기초하여 다양할 수 있음을 인지할 것이다. 바람직하게는, PRRSV MLV는 단일 용량으로 투여되지만; 추가 용량이 유용할 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 전문가는 용량 및 용량의 횟수가 대상체 돼지의 연령 및 신체 상태뿐만 아니라 해당 산업에서의 통상적인 다른 고려사항 및 PRRSV MLV가 투여되는 특정 조건에 의해 영향을 받을 수 있음을 인지할 것이다.

특정 다른 실시형태에서, 백신은 둘 이상의 PRRS 바이러스를 포함하는 다가 백신일 수 있으며, 여기서, PRRS 바이러스 중 하나 이상은 ECACC 수탁번호 11012502로 기탁된 약독화 94881 바이러스이다. 다른 PRRS 바이러스는 수탁번호 렐리스타드 바이러스 스트레인(Lelystad Agent (CDI-NL-2.91))으로 기탁된 PRRSV 스트레인 또는 수탁번호 ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM 수탁번호 I-1140, CNCM 수탁번호 I-1387, CNCM 수탁번호 I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 및 VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 또는 ECACC V93070108로 기탁된 것과 같은 다른 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상일 수 있거나, 실제로 북미 PRRS 바이러스, pT7P129A; ATCC VR 2332, ATCC VR 2368, ATCC VR 2495, ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 및 ATCC VR 2402와 같은 미국형 스트레인일 수 있다.

PRRS 바이러스를 기본으로 한 백신은 새끼 돼지와 어미 돼지 둘 다에 백신접종하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 한 양상에서, 특정 용량 요법은 돼지의 연령과 투여를 위해 선택된 항원을 기반으로 선택한다. 이는 임의의 연령의 돼지도 가장 효과적인 용량을 접종받는 것을 허용할 것이다. 바람직한 방법에서, PRRSV 94881 MLV의 치료량을 약 2주령 ± 5일된 새끼 돼지에게 투여한다. 선택된 양은 돼지의 연령에 따라 다양할 것이다. 대안으로, 상이한 치료량의 이러한 MLV는 약 3주령 이상인 돼지 또는 새끼 돼지에게 투여하고, 이러한 양은 또한 투여받는 돼지의 투여 연령이 높아짐에 따라 변할 수 있다. 따라서, 약 4주령, 6주령, 8주령, 10주령, 12주령, 14주령, 16주령의 돼지, 새끼 돼지 또는 어미 돼지는 모두 상이한 양을 투여받을 것이다. 사용될 치료 용량은 사육장에 맞춰 최적화된 용량이며, 전형적으로는 감염성 돼지의 맹독성 이종 PRRSV 시험처리에 대한 보호를 기준으로 최소 면역화 용량을 정하는 임상 연구를 통해 결정한다. 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 PRRSV MLV는 근육내로 투여하는 것이 바람직하지만; 본 분야에 잘 알려져 있고 사용되고 있는 피내, 비내, 경구, 피하 등과 같은 다른 투여 방법들이 사용될 수 있다.

전문가는 백신접종 방법이 PRRSV에 대한 돼지의 백신접종에 적절한 시점 및 용량을 결정하는 것을 포함할 수 있음을 잘 알고 있다. 일반적으로 이러한 방법은 돼지의 연령, 건강상태, 선천면역수준 및 능동면역수준으로 이루어진 그룹중에서 선택되는 한 가지 이상의 변수를 결정하고 이들 변수를 고려한 표준 용량 수준을 조정하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 선천면역수준과 능동면역수준은 연령 및 건강 상태가 비슷한 돼지 집단의 평균 수준으로 이루어진 표준치를 참고하여 결정한다. 특히 바람직한 방법으로, 모든 변수는 최적의 용량 수준과 투여 시점을 결정하기 전에 고려한다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명은 또한 ECACC 수탁번호 11012502로 기탁된 약독화 94881 바이러스 및 ECACC 수탁번호 11012501로 기탁된 모 맹독성 94881 바이러스의 특정 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 예를 들면, ECACC 수탁번호 11012502로 기탁된 약독화 94881 바이러스의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9 각각의 ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 및 ORF7 단백질 서열을 암호화하는 서열번호 1의 서열을 갖는다. ECACC 수탁번호 11012501로 기탁된 모 맹독성 94881 바이러스의 완전한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18 각각의 ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 및 ORF7 단백질 서열을 암호화하는 서열번호 10의 서열을 갖는다.

PRRSV 94881 백신은 어떠한 통상적인 방식으로도 투여할 수 있으며 일부 바람직한 방법에서 투여는 근육내이다. 투여된 PRRSV 백신은 Ingelvac®과 같이 단일 용량으로 PRRSV 감염의 중증 또는 발생을 치료 또는 완화시키는 효과를 제공하는 것이 바람직하지만, 만일 다른 항원 또는 혼합 또는 다가 백신이 선택된 경우, 이들은 초기 투여 후 1회 이상의 추가 접종을 포함할 수 있는 통상적인 방식으로 투여될 수 있음은 이해되어야 한다. 본 분야의 전문가는 선택된 PRRSV 백신 및 항원이 투여될 동물의 연령 범위를 기준으로 적절한 용량 수준을 결정할 수 있다.

아래 기술된 특정 실시예에서, 새끼 돼지에서 호흡기 질환을 재생적으로 발생할 수 있는 PRRSV의 신규 유럽형 스트레인을 새끼 돼지와 어미 돼지에 시험처리하였다. 역사적으로, 유럽형-유도된 PRRSV 스트레인은 새끼 돼지 모델에서 호흡기 질환을 재생할 수 없기 때문에 호흡기 시험처리 모델은 비유럽형 스트레인에 의한 감염에 의존하였다. 고도의 유전적 다양성 때문에 유럽에서는 유럽형 스트레인을 기본으로 한 새로운 백신이 요구되고 있다. 추가의 실시예에서, 새끼 돼지/어미 돼지 시험처리 모델에서 생식장애를 발생한 스트레인을 동물에 시험처리하였다. ECACC 수탁번호 11012502로 기탁된 약독화 94881 바이러스 또는 이 스트레인 또는 ECACC 수탁번호 11012501로 기탁된 모 스트레인으로부터 제조된 임의의 바이러스를 기본으로 한 MLV 백신의 효능은 이러한 스트레인이 또한 PRRS 바이러스-유도된 호흡 부전 또는 생식 장애의 다른 모델에 효과적이기 때문에 다양한 시험처리 모델을 사용하여 확인할 수 있음을 발견하였다.

실시예

실시예 1: PRRSV 호흡기 시험처리 모델에 대한 설명

앞서 언급한 바와 같이, 역사적으로 유럽형 PRRSV 스트레인은 새끼 돼지 모델에서 호흡기 질환을 재생할 수 없다. 고도의 유전적 다양성으로 인해 유럽에서는 유럽형 스트레인을 기본으로 한 새로운 백신을 요구하고 있고 맹독성 유럽형 PRRSV 스트레인을 이용한 양호하고 재생적인 호흡기 시험처리 모델이 연구 수행을 위해 필요하다. 아래 실시예에서, 본 발명자들은 저계대 유럽형 시험처리 스트레인(계대 4)에 의한 돼지의 시험처리가 호흡기 증상을 확실하게 발생하였음을 보여준다.

본 연구에서는 연구배정시 3주령, 시험처리시 약 10주령된 세 그룹의 동물 12마리를 사용하였다:

그룹 1: 대조군

그룹 2: 시험처리군(SD 35)

그룹 3: 포실리스®PRRSV로 백신접종(SD 0)되고 이후 시험처리된 군(SD 35).

56일간 수행된 본 연구에서 각 그룹의 6마리는 시험처리 후 10일 경과하여 부검하여 측정하였고 남은 모든 동물은 시험처리 후 21일 경과하여 부검하여 측정하였다. 매일 검사한 매개변수로는 직장 온도, 호흡기 및 다른 임상 징후가 포함되었다. 추가로 검사한 변수로는 체중, 사망률, 바이러스혈증, 혈청전환 및 폐의 병리조직검사가 포함되었다.

연구 7일째에 돼지 집단을 각 그룹에 배정하였다. 연구 0일에 그룹 3을 포실리스®PRRSV로 백신접종하였다. 연구 35일째에 그룹 2 및 그룹 3에 유럽형 시험처리 스트레인을 시험처리하였다. 45일째에 각 그룹으로부터 6마리를 안락사시켰다. 남은 동물은 56일째에 안락사시켰다.

도 1a는 동물 및 주당 평균 점수로서 기침 측정값을 보여준다. 시험처리 단독군(그룹 2) 및 포실리스군(그룹 3)에서 시험처리 후 기침 증가가 있는 것으로 나타났다. 도 1b는 호흡곤란, 기침, 비루 및 눈곱 및 행위로부터 취합된 임상 총점을 보여준다. 이들 데이터는 시험처리군 및 포실리스군에서 시험처리 후 임상 총점의 전체 증가가 있었음을 나타냈다. 동물의 직장 온도를 시험처리 전후에 모니터링하였고 시험처리 후에 시험처리군 및 포실리스군에서 직장 온도의 증가가 있었다(SD>35 그룹 1-2 p≤0.001; 그룹 1 내지 3 p≤0.001)(도 2).

평균 1일 체중(ADW)의 측정 결과(도 3), 시험처리 후 일차 및 이차 부검까지 ADW가 시험처리군(SD35-44 p≤0.001 및 SD35-56 p≤0.01) 및 포실리스 백신접종군(SD35-44 p≤0.05 및 SD35-56 p≤0.05)에서 유의적으로 적은 것으로 나타났다.

바이러스혈증을 PCR(도 4) 및 ELISA(도 5)을 이용하여 모니터링하였다. PCR 결과, 그룹 1의 대조군 모든 동물에서 음성으로 나타났다. 그룹 2의 모든 동물은 시험처리 후 PRRSV에 대해 양성으로 나타났고, 그룹 3의 모든 동물은 백신접종 후 PRRSV에 대해 양성으로 나타났다. ELISA 결과는 그룹 1의 모든 동물이 음성이었고, 그룹 2의 모든 동물이 시험처리 후 PRRSV AB에 대해 양성이었으며, 그룹 3의 모든 동물이 백신접종 후 PRRSV AB에 대해 양성이었음을 보였다.

또한, 폐의 육안 검사를 수행하여(도 6) 폐의 갈색반점 면적 및 경화 면적에 대해 평가하였다. 대조군과 비교하여 시험처리군 및 포실리스군(그룹 1-2 p≤0.001; 그룹 1 내지 3 p≤0.05)에서 유의적인 육안 변화가 관찰되었다. 또한, 조직병리 검사 데이터는 백신접종의 효능을 나타냈다(도 7a 내지 7c). 폐 병변 평균 점수는 대조군에 비하여 시험처리군 및 포실리스군에서 유의적으로 더 높았다(그룹 1-2 p≤0.001; 그룹 1 내지 3 p≤0.001). 감염 후 10일 경과하여 육안 병변이 더 심해졌다.

요약하면, 시험처리군 및 포실리스 백신접종군에서 시험처리 후 기침, 임상 총점 및 직장 온도가 증가하였다. 체중은 음성 대조군에 비하여 시험처리군 및 포실리스군이 유의적으로 더 적었다(p<0.05). 포실리스군의 모든 동물은 백신접종 후 PRRS 바이러스 및 항체에 대해 양성을 나타냈다. 시험처리 대조군의 모든 동물은 시험처리 후 PRRS 바이러스 및 항체에 대해 양성을 나타냈다. 폐의 육안 및 조직 분석 결과, 음성 대조군에 비하여 시험처리군 및 포실리스군에서 중증의 육안 및 현미경적 폐 병변이 나타났다.

따라서, 본 연구으로부터 사용된 유럽형 시험처리 스트레인이 음성 대조군과 비교했을 때 유의적인(p<0.05) 질환(발열, 기침, 체중감소 및 중증의 육안 및 현미경적 폐 병변)을 유도한다는 것이 검증되었다.

또한, 유럽형 시험처리 스트레인은 돼지 시험처리 모델에서 일관되고 재생적인 PRRSV-특이적 호흡기 질환을 증명하였고, 이에 따라 장래의 효능 연구에 시험처리 바이러스로서 사용하는데 적합하다. 포실리스 PRRS는 본 연구의 매개변수 내에서 유럽형 시험처리 스트레인에 대한 효능의 결여를 보여준다.

실시예 2: 이종 유럽형 PRRS 분리체로 시험처리 후 감염성 2주령 새끼 돼지에서 약독화 PRRS 바이러스 94881의 면역화 최소 용량에 대한 평가

백신접종-시험처리 연구를 수행하여 돼지 생식기 호흡기 증후군 백신 유럽형 분리체 94881의 면역화 최소 용량(MID)를 평가하고 변형된 생바이러스(PRRS 94881 MLV)를 세가지 다른 역가 수준에서 약 14일령의 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS) 감염성 새끼 돼지에게 투여하여 PRRS의 이종 유럽형 분리체의 시험처리에 따른 폐 병변의 연관된 감소를 제공하였다. 15마리의 새끼 돼지가 각각의 면역접종군(그룹 1 내지 3)뿐만 아니라 시험처리 대조군(그룹 4)에 포함되었다. 10마리의 새끼 돼지가 음성 대조군(그룹 5)에 포함되었다.

백신군과 시험처리 대조군을 시험처리 후 바이러스혈증, 백신접종 후 임상 평가, PRRS 혈청검사, 백신접종 후 바이러스혈증, 시험처리 후 임상 관찰, 평균 1일 체중 증가(ADWG), 직장 온도 및 폐내 PRRS 바이러스 검출을 포함한 많은 매개변수에 대해 모니터링하였다. 시험처리되지 않은 음성 대조군(그룹 5)이 또한 연구 기간 내내 생물방역이 위반되지 않았음을 증명하는 연구 평가 목적상 본 연구에 포함되었다.

시험처리 대조군 및 음성 대조군은 시험처리 당일(D28)까지 PRRS 음성을 나타냈고 음성 대조군은 연구 잔여일(D38) 동안 PRRS 음성을 나타냈음으로 본 연구의 타당성은 인증되었다.

시험처리는 백신접종 후 4주 지나 수행하였다. 이 시점에서 저역가 백신군의 2마리 동물, 중역가 백신군에서 1마리 동물 및 고역가 백신군의 3마리 동물이 혈청에서 PRRS qPCR 양성을 나타냈다.

시험처리 대조군은 시험처리 후 PRRS의 전형적인 폐 병변이 상당히 높게 나타났다. 시험처리 후 저역가 백신군, 중역가 백신군 및 고역가 백신군은 각각 0.13%, 0.55% 및 0.40%의 폐 병변 중앙 총점를 나타냈고, 반면에 시험처리 대조군은 33.40%의 폐 병변 중앙 총점을 나타냈다. 세 가지 역가 백신군의 폐 병변 중앙 총점은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 낮았다(p<0.0001). 역가 백신군간에 폐 병변 총점에 대한 통계적 차이는 없었다(p≥0.1484). 음성 대조군은 0.00%의 폐 병변 중앙 총점을 나타냈다.

시험처리 후 기간의 연구 31일째, 35일째 및 38일째에, 세 가지 역가 백신군은 시험처리군보다 유의적으로 더 낮은 바이러스혈증을 나타냈다(p≤0.0093). D35에 고역가 백신군이 중역가 백신군보다 유의적으로 더 낮은 바이러스혈증을 나타낸 것(p=0.0442)을 제외하고 시험처리 후 바이러스혈증에 대한 역가 백신군간의 통계적 차이는 없었다. 음성 대조군 새끼 돼지는 D31, D35 및 D38에 바이러스혈증이 음성이었다.

임상적으로, 기침의 중증도(p≤0.0082) 및 빈도(p≤0.0268)는 D29 내지 D38의 시험처리 후 기간 동안에 시험처리 대조군보다 세 가지 역가 백신군에서 덜 심각하였다. 발열은 시험처리 후 세 가지 역가 백신군에서보다 시험처리 대조군에 더 심했다. ADWG는 시험처리 대조군에 비하여 세 가지 역가 백신군에서 유의적으로 더 많았다(p≤0.0027).

본 연구에서 결정된 PRRS 94881 MLV의 MID는 맹독성 이종 유럽형 PRRS 시험처리 후 시험처리 대조군과 비교하여 세 가지 모든 역가 수준에서의 육안적 폐 병변 감소를 기준으로 1 x 10^2.77 TCID₅₀/mL의 저역가 백신 수준과 연관이 있다. 이차 매개변수들을 검사하였을 때 세 가지 모든 백신 역가 수준은 효능과 연관이 있었고 역가군간에 뚜렷한 차이가 없음은 명백하였다.

일반적인 연구 설계:

이것은 0일째(D0)에 14 내지 16일령인 PRRS 감염성 이유 새끼 돼지 70마리를 대상으로 실시된 맹검 무작위 설계 연구였다. 처리군에 대한 설명은 아래 표 2.1에 제시된다:

[표 2.1]

새끼 돼지 83마리는 연구 선정 기준을 충족하였다. 이중 1번부터 70번까지 생물통계학자가 D3에 5개 그룹중 한 그룹에 무작위로 배정하였다. 그룹 1 내지 4에는 각 그룹당 15마리의 새끼 돼지를 할당하고 그룹 5에는 10마리를 할당하였다. 새끼 돼지 83마리 모두는 PRRS 혈청음성으로 나타났다.

새끼 돼지에 백신접종 후 임상 평가를 위해 D1부터 D26까지 관찰하였고 임상 평가 기록서에 소견을 기입하였다.

혈청검사: 정맥 전혈을 새끼 돼지로부터 D0, D7, D14, D21, D28에 채취하였다. 샘플 채혈을 기록하였다. 혈액 샘플을 원심분리하고 각 튜브에서 혈청을 수집하고 적절히 표지된 튜브로 분배하였다. 혈청 샘플 한 세트는 2 내지 8℃에 보관하였고 나머지 혈청 샘플 세트는 -70±10℃에 보관하였다. 0, 7, 14, 21, 28 및 38일째에 채취하고 2 내지 8℃에 보관한 혈청 샘플 세트를 PRRS 항체에 대해 검사하였다. 결과는 음성(ELISA S/P 비율 <0.4) 또는 양성(ELISA S/P 비율 ≥0.4)으로 보고되었다.

PRRS 바이러스혈증: 0, 7, 14, 21, 28 및 38일째에 채취하고 2 내지 8℃에 보관한 혈청 샘플 세트를 qPCR로 PRRSv RNA에 대해 검사하였다(부록 1, 별첨 7). 결과는 n.d.(미검출), 양성(EU PRRSv 검출되었으나 정량가능하지 않음, GE/mL(게놈 균등물) = < 3.3 log) 또는 보고치(log GE/mL)로 보고하였다. 통계 목적상 "미검출"은 0 log Ge/ml 값으로 정하고 "양성"값은 3.0 log GE/mL 값으로 정했다.

평균 1일 체중 증가(ADWG): 각 돼지의 체중을 등급계량화 스케일로 재고 개개의 체중을 기록하였다. 평균 1일 체중 증가는 D0에서 D28까지의 증가 및 D28에서 D38까지의 증가를 결정하였다.

시험처리 후 임상 관찰: 연구원 또는 피지명자가 D27 내지 D38에 질환의 임상 징후에 대해 새끼 돼지를 관찰하고 임상 관찰 기록서에 기록하였다. 관찰 항목은 아래 표 2.2에 제시된 바와 같이 임상 관찰 점수 체계를 기초로 하는 호흡, 행동 및 기침을 포함하였다.

[표 2.2]

1일 호흡, 행동 및 기침 점수를 합산하여 각 새끼 돼지의 1일 임상 관찰 총점을 결정하였다.

D27 내지 D38의 기간에 직장 온도를 수집하였다.

폐 병변 총점: D38 이전에 사망한 모든 새끼 돼지 및 D38에 안락사시킨 나머지 새끼 돼지를 부검하였다. 각 세트의 폐를 전체 폐 병리에 대해 검사하고 각 폐엽의 병리율(%)을 결정하였다. 다른 장기에서 병리가 주목되는 경우 이들 또한 기록하고 고려하였다.

PRRSV에 대한 폐 qPCR: 각 세트의 폐에 대해, 좌우정단엽, 좌우심장엽, 좌우횡격막엽 및 중간엽으로부터 2개 샘플을 채취하였다. 한 세트의 폐 샘플에 대해, 좌측의 모든 세개 샘플을 한 용기에서 배합하였고, 우측의 모든 세개 샘플 및 중간 폐엽 샘플은 다른 용기에서 배합하였다. 각 용기에는 충분량의 10% 포르말린액을 충진하였다. 다른 세트의 폐 샘플에 대해, 좌측의 모든 세개 폐 샘플을 한개의 Whirlpak®에서 배합하고, 우측의 모든 세개 샘플과 중간 폐엽 샘플을 다른 Whirlpak®에서 배합하였다.

동결된 폐 조직 샘플은 추가 분석시까지 -70±10℃에 보관하였다. 각 새끼 돼지에 대해, 모든 좌측 폐 샘플을 균질화하고 단일 배합 샘플로서 검사하였고, 모든 우측 폐 조직과 중간 폐엽 샘플을 균질화하고 단일 배합 샘플로서 검사하였다. 좌우 폐 샘플에 대한 결과는 n.d.(미검출), 양성(EU PRRSv 검출되었으나 정량할 수 없음, GE/mL(게놈 균등물) = < 3.3 log) 또는 검사치(log GE/mL)로 보고하였다. 각 새끼 돼지에 대한 분석 목적상, 좌우 폐 샘플 qPCR의 평균을 기록하였다. 통계 목적상 "미검출"은 0 log Ge/ml 값으로 정하고 "양성"값은 3.0 log GE/mL 값으로 정했다.

결과

시험처리 후 폐 병변 총점: 폐 병변 총점의 최저, 최고, 중앙, 95% 신뢰구간, Q 범위 및 평균을 요약해 볼 때 저역가, 중역가 및 고역가 백신군은 각각 0.13%, 0.55% 및 0.40%의 폐 병변 중앙 총점으로 나타난 한편, 시험처리 대조군은 33.40%의 폐 병변 중앙 총점으로 나타났다. 세 가지 역가 백신군의 폐 병변 중앙 총점은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 낮았다(p<0.0001). 역가 백신군간에 폐 병변 총점에 대한 통계적 차이는 없었다(p≥0.1484). 음성 대조군은 0.00%의 폐 병변 중앙 총점을 나타냈다.

동물(고역가 백신군) 중 한 마리의 경우 과다섬유화 늑막염을 동반한 조직학적으로 경미한 화농성 간질성 폐렴이 주목되었다. 산발적인 호중구를 제외하고 기도 및 폐포는 비교적 이상 소견을 보이지 않았다. 폐 조직은 M. hyo, PCV2, PRRSv 및 SIV 항원에 대해 IHC 음성을 나타냈다. 폐 병변은 일반적으로 세균성 병균과 연관된 장막염과 일치하였다(부록 12: 등록번호 2009030254). 폐 조직으로부터 수종의 순수한 세균 배양물을 분리하였고 보르데텔라 브론키셉티카 및 응고효소 음성 스태필로코커스(Staphylococcus)로 동정되었다. 비록 2종의 세균이 폐 조직으로부터 분리되었지만, 이 새끼 돼지는 그룹 3 폐 병변 총점 분석으로부터 배제되었다.

10마리의 음성 대조군 새끼 돼지 중 2마리는 아주 적은 폐 병변을 나타냈다(1767번 0.55%; 1789번 0.61번). 이들 병변은 비유의적인 것으로 고려되었고 PRRS를 나타내지 않았다. 10마리의 음성 대조군 새끼 돼지 중 2마리는 아주 적은 폐 병변을 나타냈다(1767번 0.55%; 1789번 0.61번). 이들 병변은 비유의적인 것으로 고려되었고 PRRS를 나타내지 않았다.

시험처리 후 PRRS 바이러스혈증: 시험처리 후 개개의 PRRS 바이러스혈증 결과(D31-D38)을 표로 만들었으며 세 가지 역가 백신군 및 시험처리 대조군의 모든 새끼 돼지는 시험처리 후 바이러스혈증을 나타난 것으로 밝혀졌다. 시험처리 후 모든 3번의 시점에서, 세 가지 역가 백신군은 시험처리 대조군보다 유의적으로 적은 바이러스혈증을 나타냈다(p≤0.0093). 고역가 백신군이 중역가 백신군보다 낮은 평균 바이러스혈증을 나타낸(p=0.0442) D35를 제외하고 역가 백신군간에 시험처리 후 바이러스혈증의 차이는 없었다. 음성 대조군 새끼 돼지는 D31, D35 및 D38에 바이러스혈증에 대해 음성을 나타냈다. 곡선하면적(AUC)은 바이러스 농도의 양 및 지속기간 둘 다를 나타내며 바이러스혈증을 검사하는데 양호한 평가 도구이다. 또한, D28 내지 D38(p≤0.0162)와 D31 내지 D38(p<0.0001) 모두에서 세 가지 역가 백신군과 시험처리 대조군간에 AUC의 유의적인 차이가 검출되었다. 양 시간차에서 역가 백신군간에 AUC의 차이는 검출되지 않았다(p≥0.3669).

D31 내지 D38 동안에 바이러스혈증 양성 새끼 돼지의 그룹별 빈도를 요약하였고 표 2.3에 제시되어 있다. 모든 백신 새끼 돼지 및 시험처리 대조군 새끼 돼지는 시험처리 후 바이러스혈증 양성을 나타냈기 때문에, 바이러스혈증 양성 새끼 돼지의 빈도는 각 시점의 각 그룹에서 100%였다. 따라서, 바이러스혈증에 대한 시험처리 후 빈도에 대해서는 분석을 수행하지 않았다.

[표 2.3]

폐 qPCR 결과: 시험처리 후 개개의 폐 바이러스 분리 결과를 그룹간 차이에 대해 qPCR 양성 폐 샘플 시험 결과(p값)의 빈도로 요약하였다. 세 가지 모든 역가 백신군과 시험처리 대조군의 새끼 돼지로부터 분리된 폐 조직은 시험처리 후 PRRSv에 대해 qPCR 양성으로 나타났다. 역가 백신군과 시험처리 대조군간에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(p=1.0000). 모든 역가 백신군은 PRRSv에 대해 qPCR 양성으로 나타났기 때문에 역가 백신군간에 검사를 수행하지 않았다.

비록 역가 백신군과 시험처리 대조군사이에 qPCR 양성 폐 조직의 빈도 차이가 검출되지 않았지만, 폐 조직내 바이러스 농도는 명백한 차이가 있었다. 실제로, 저역가, 중역가 및 고역가 백신군은 각각 6.88, 6.80 및 6.81 log₁₀ GE/mL의 폐 qPCR 중앙값을 나타낸 한편, 시험처리 대조군은 8.13 log₁₀ GE/mL의 폐 qPCR 중앙값을 나타냈다. 역가 백신군과 시험처리 대조군간의 차이는 유의적이었다(p≤0.0001). 역으로, 중앙값 폐 qPCRdp 대한 역가 백신군간에 차이는 검출되지 않았다(p≥0.7379).

시험처리 후 임상 관찰 점수: 모든 5개 그룹에서 중앙 최고 임상 점수 0(점수 0은 정상 호흡 또는 정상 행동을 나타낸다)으로 증명되는 바와 같이 비정상 호흡 및 행동은 시험처리 후 심하지 않았다. 또한, 역가 백신군과 시험처리 대조군간에 비정상 호흡 및 행동 모두에서 유의적인 차이가 검출되지 않았다(p≥0.0996).

세 가지 모든 역가 백신군 및 시험처리 대조군에서 기침이 주목되었으나 시험처리 대조군에서 더 심했다. 세 가지 역가 백신군의 경우, 각 그룹은 미약한 기침 또는 간헐적 기침에 해당하는 기침 최고 점수 1 및 기침 중앙 최고 점수 0을 나타냈다. 대조적으로, 시험처리 대조군은 격하거나 심하고 반복적인 기침에 해당하는 기침 최고 점수 2 및 기침 중앙 최고 점수 1을 나타냈다. 세 가지 역가 백신군은 시험처리 대조군보다 유의적으로 덜 심한 기침을 나타냈다(p≤0.0082). 음성 대조군에서는 기침이 나타나지 않았다.

세 가지 모든 역가 백신군은 최고 총점 1 및 중앙 최고 점수 0을 나타냈다. 대조적으로, 시험처리 대조군은 최고 총점 4 및 중앙 최고 점수 1을 나타냈다. 세 가지 백신군은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 낮은 임상 최고 총점을 나타냈다(p≤0.0047). 음성 대조군은 임상 최고 총점 0 및 임상 중앙 최고 총점 0을 나타냈다.

D29 내지 D38중 적어도 한 날 이상 동안에 비정상 호흡 또는 행동의 빈도는 모든 군에서 낮았다. 실제로, D29 내지 D38에서 저역가 및 중역가 백신군은 비정상 호흡을 나타내지 않았다. 고역가 백신군은 15마리 새끼 돼지 중 한 마리(7%)가 비정상 호흡을 나타냈고, 시험처리 대조군은 14마리 새끼 돼지 중 3마리(21%)가 비정상 호흡을 나타냈다. 비정상 행동은 어떠한 역가 백신군에서도 나타나지 않은 반면, 시험처리 대조군은 14마리 새끼 돼지 중 2마리(14%)가 시험처리 후 하루 이상 동안 비정상 행동을 나타냈다. 시험처리 후 하루 이상 동안에 비정상 호흡 또는 행동의 빈도에서 역가 백신군과 시험처리 대조군간에 유의적 차이가 검출되지 않았다(p≥0.0996). 비정상 호흡 또는 행동은 음성 대조군에서 나타나지 않았다.

기침 빈도는 세 가지 역가 백신군에 비하여 시험처리 대조군에서 훨씬 더 높았다. 실제로, 저역가, 중역가 및 고역가 백신군은 시험처리 후 하루 이상 동안에 기침 빈도가 각각 14%, 13% 및 27%였다. 대조적으로, 시험처리 대조군은 시험처리 후 하루 이상 동안에 기침 빈도가 71%였다. 세 가지 역가 백신군은 시험처리 대조군보다 기침 빈도가 유의적으로 더 낮았다(p≤0.0268).

임상 총점 >0으로 나타나는 시험처리 후 임의 임상 징후 빈도는 세 가지 역가 백신군에서 보다 시험처리 대조군에서 더 높았다. 기침 빈도와 유사하게, 시험처리 후 하루 이상 동안에 임의 임상 징후 빈도는 저역가, 중역가 및 고역가 백신군의 경우 각각 14%, 13% 및 33%였고, 이에 반해 시험처리 대조군은 새끼 돼지의 79%가 시험처리 후 한 가지 이상의 임상 징후를 나타냈다. 세 가지 백신군은 시험처리 대조군보다 시험처리 후 임의 임상 징후 빈도가 유의적으로 더 낮았다(p≤0.0253). 동일한 기간에 음성 대조군에서 임상 징후가 나타나지 않았다.

D29 내지 D38에서 비정상 호흡 또는 행동의 평균 점수는 모든 군에서 낮았다. 실제로, 저역가 및 고역가 백신군의 호흡 평균 점수는 0.00(정상)이었고, 고역가 백신군의 호흡 평균 점수는 0.01이었으며, 시험처리 대조군의 호흡 평균 점수는 0.03이었다. 세 가지 역가 백신군의 행동 평균 점수는 0.00이었고, 시험처리 대조군의 행동 평균 점수는 0.01이었다. 호흡 및 행동 평균 점수의 경우, 역가 백신군과 시험처리 대조군간에 유의적 차이는 검출되지 않았다(p≥0.0996). 음성 대조군의 호흡 및 행동 평균 점수는 0.00이었다.

시험처리 대조군은 세 가지 역가 백신군보다 더 높은 기침 평균 점수를 나타냈다. 실제로, 저역가, 중역가 및 고역가 백신군의 기침 평균 점수는 각각 0.01, 0.01 및 0.04였다. 대조적으로, 시험처리 대조군의 기침 평균 점수는 0.28이었다. 세 가지 역가 백신군은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 낮은 기침 평균 점수를 나타냈다(p≤0.0077).

평균 총점은 세 가지 역가 백신군보다 시험처리 대조군에서 더 높았다. 기침 평균 점수와 유사하게, 시험처리 후 평균 총점은 저역가, 중역가 및 고역가 백신군의 경우 각각 0.01, 0.01 및 0.04였고, 반면에, 시험처리 대조군의 평균 총점은 0.32였다. 세 가지 백신군은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 낮은 평균 총점을 나타냈다(p≤0.0025).

시험처리 후 직장 온도: 저역가, 중역가 및 고역가 백신군의 최고 그룹 평균 직장 온도는 각각 40.20℃(D33), 40.33℃(D35) 및 40.20℃(D37)로 나타났다. D29 내지 D38사이에 시험처리 대조군 및 음성 대조군의 최고 그룹 평균 직장 온도는 각각 40.51℃(D33) 및 39.95℃(D33)으로 나타났다.

저역가 백신군은 시험처리 대조군보다 D29(39.47℃ 대 39.90℃), D31(39.85℃ 대 40.20℃), D35(39.80℃ 대 40.22℃) 및 D38(39.86℃ 대 40.32℃)에 유의적으로 더 낮은 직장 온도를 나타낸 한편, 저역가 백신군은 시험처리 대조군보다 D30(40.08℃ 대 39.58℃; p=0.0003)에 유의적으로 더 높은 직장 온도를 나타냈다. D32-D34 및 D36-D37에 저역가 백신군과 시험처리 대조군사이에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(p≥0.0545).

중역가 백신군은 시험처리 대조군보다 D31(39.62℃ 대 40.20℃), D33(40.15℃ 대 40.51℃) 및 D38(39.58℃ 대 40.32℃)에 유의적으로 더 낮은 직장 온도를 나타냈다(p≤0.0227). D29-D30, D32 및 D34-D37에 중역가 백신군과 시험처리 대조군사이에 유의적 차이는 검출되지 않았다(p≥0.0580).

고역가 백신군은 시험처리 대조군보다 D33(40.12℃ 대 40.51℃), D35(39.79℃ 대 40.22℃) 및 D38(39.55℃ 대 40.32℃)에 유의적으로 더 낮은 직장 온도를 나타낸 한편(p≤0.0147), 고역가 백신군은 시험처리 대조군보다 D32(40.31℃ 대 39.90℃; p=0.0063)에 유의적으로 더 높은 직장 온도를 나타냈다. D29-D31, D34 및 D36-D37에 고역가 백신군과 시험처리 대조군사이에 유의적 차이는 검출되지 않았다(p≥0.0708).

시험처리 후 세 가지 역가 백신군은 시험처리 대조군에 비하여 발열 빈도가 더 낮았다. 역가 백신군들은 발열 빈도가 전체적으로 낮고 비슷하였다.

평균 1일 체중 증가(ADWG): 저역가, 중역가 및 고역가 백신군은 D0 내지 D28에 각각 0.4, 0.3 및 0.4 kg/일의 최소 제곱 평균 ADWG를 나타냈다. 같은 기간 동안에 시험처리 대조군은 0.3 kg/일의 최소 제곱 평균 ADWG를 나타냈다. D0 내지 D28에 저역가 백신군은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 높은 최소 제곱 평균 ADWG를 나타낸 한편(p=0.0292), 역가 백신군과 시험처리 대조군간에(p≥0.1262) 또는 역가 백신군간에(p≥0.1293) 최소 제곱 평균 ADWG의 유의적 차이가 검출되지 않았다. 같은 기간 동안에, 음성 대조군은 0.5 kg/일의 평균 ADWG를 나타냈다.

D28 내지 D38에 저역가, 중역가 및 고역가 백신군의 최소 제곱 평균 ADWG는 각각 0.5, 0.5 및 0.4 kg/일이었다. 같은 기간 동안에 시험처리 대조군의 최소 제곱 평균 ADWG는 0.3 kg/일이었다. 세 가지 역가 백신군은 시험처리 후 시험처리 대조군을 유의적으로 능가하였다(p≤0.0027). 같은 기간 동안에, 음성 대조군은 0.6 kg/일의 평균 ADWG를 나타냈다.

백신접종 후 임상 평가: 저역가 백신군에서 한 마리 새끼 돼지(1735)가 D0 내지 D10에 여윈 상태로 나타났다. 또한, D6 이후로 16일 동안 한 마리 새끼 돼지가 여윈 상태로 나타났고 2일간 기침과 9일간 우울증을 보였으며 D21에 좋지 않은 건강때문에 동물 보호 차원에서 안락사시켰다. 새끼 돼지 1727은 10.8%의 폐 병변 총점을 나타냈다. 이 수치는 시험처리전에 결정되었기 때문에 시험처리 후 총 폐 병변 분석에 포함시키지 않았다. 또한, 폐의 전복방 영역에서 적색/자주색 폐경화 영역이 관찰되었고, 간은 핏기가 없었으며, 신장은 신우에서 다수의 적색/자주색 영역을 나타냈다. 병리사는 에너지소실 및 이에 따른 지방분해의 경우에서 흔히 관찰되는 것으로 간의 중간엽에서 지방침윤을 주목하였다. 간, 신장 및 폐의 절편에서 다른 병변은 관찰되지 않았다. 폐 조직은 PCR에서 EU PRRS 양성으로 나타났다. 통상적인 세균 배양에서 성장은 검출되지 않았다.

중역가 백신군에서, 한 마리 새끼 돼지가 좋지 않은 건강때문에 처리전 D0에 연구에서 배제되었고 다른 새끼 돼지로 대체되었다. 두 마리 새끼 돼지는 D12 이후 각각 1일간 및 3일간 기침 증세를 나타냈다. 네 마리 새끼 돼지는 D2, D3 또는 D2와 D3 모두에서 여윈 상태로 나타났다.

고역가 백신군에서, 한 마리 새끼 돼지(1728)은 D7 내지 D26에 한쪽 다리의 파행 또는 파행과 종창을 나타냈다. 한 마리 새끼 돼지가 백신접종 후 18일 경과하여 6일간 야윈 상태로 나타났고, 1일간 기침과 4일간 거친 헤어 코트를 나타냈다. 다른 새끼 돼지는 D2에 야윈 상태로 나타났다. 두 마리 새끼 돼지는 D9에서부터 각각 2일간 및 하루간 기침을 하였다. 한 마리 새끼 돼지는 1일간(D14) 설사 증상을 나타냈다.

시험처리 대조군에서, 여섯 마리 새끼 돼지가 1 내지 6일의 누적 기간 동안에 주기적인 기침 증상을 나타냈는데, D7에 첫번째 새끼 돼지가 기침을 시작하였고 D21에 세 마리 새끼 돼지가 기침을 하였다. 두 마리 새끼 돼지는 각각 2일간 및 11일간 야윈 상태로 나타났고 이들 새끼 돼지 중 한 마리는 D1에 나타났다. 이들 두 마리 새끼 돼지 중 두 번째 새끼 돼지는 또한 4일간 우울증과 거친 헤어 코트를 나타냈고, 1일간 다리가 허약했으며, D15에 사망하였다. 이 새끼 돼지의 부검에서 폐 병변은 관찰되지 않았고(폐 병변 점수 0%), 위장내 섭취물과 복부지방은 없었으며, 사망원인은 기아로 진단되었다. 폐 병변 점수는 시험처리전에 결정되었기 때문에, 이것은 시험처리 후 폐 병변 분석에서 제외되었다.

D1 내지 D26의 적어도 하루 이상 동안에 임의의 이상 임상 평가에 대한 그룹별 검사 결과(p값)를 요약하였다. 역가 백신군과 시험처리 대조군간에 유의적인 차이는 검출되지 않았고(p≥0.0502) 역가 백신군간에도 유의적인 차이가 검출되지 않았다(p≥3898). 음성 대조군의 어떠한 새끼 돼지도 D1 내지 D26에 이상 임상 평가를 나타내지 않았다.

PRRS 혈청검사: 각 새끼 돼지의 PRRS ELISA 혈청검사 결과를 요약하였다. 음성 대조군의 새끼 돼지들은 연구 기간 내내 PRRS 혈청음성으로 나타났다. 세 가지 역가 혈청군에서 백신접종 후 14일까지 혈청전환을 관찰할 수 있었고; 반면에, 시험처리 대조군은 시험처리 후까지 PRRS 혈청음성으로 나타냈다. 시험처리 후 10일 경과하여(D38) 저역가 및 고역가 백신군 및 시험처리 대조군의 모든 새끼 돼지들은 PRRS 혈청양성으로 나타난 한편, 중역가 백신군의 15마리 새끼 돼지 중 14마리가 PRRS 혈청양성으로 나타냈다.

그룹간에 PRRS ELISA 양성 혈청검사 결과(p값)의 차이를 결정하였다. 세 가지 역가 백신군은 D14, D21 및 D28에 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 높은 PRRS ELISA 양성 새끼 돼지 빈도를 나타냈다(p<0.0001). D38에 세 가지 역가 백신군과 시험처리 대조군사이에 유의적인 차이는 검출되지 않았고(p=1.0000 또는 실시된 검사 없음) 또한 어떠한 시점에서도 세 가지 역가 백신군사이에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(p=1.0000 또는 실시된 검사 없음).

백신접종 후 PRRS 바이러스혈증: 백신접종 후 개개의 PRRS 바이러스혈증 결과를 결정하였다. 통계 목적상 "미검출" 결과는 0 log GE/mL로 정했고 "양성"값은 3.0 log GE/mL로 정했다. 모든 군은 D0에서 PRRS 바이러스혈증 음성으로 나타났다. 바이러스혈증 군(qPCR)-백신접종 후 D7 내지 D28 역가(log₁₀ GE/mL) 데이터를 평가하였다. 세 가지 역가 백신군의 새끼 돼지들은 D7에 최고 평균 바이러스혈증에 도달하였고, 이후 세 가지 모든 군의 역가 수준은 시험처리전에(SD28) 서서히 감소하였다. 대조적으로, 시험처리 대조군 및 음성 대조군은 시험처리전 연구 기간 동안에 바이러스혈증에 대해 음성으로 나타났다. D7, D14, D21 및 D28 qPCR 결과로서 그룹별 검사 결과(p값)으로부터 세 가지 모든 역가 백신군은 D7-D28에 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 높은 qPCR 중앙값을 나타냈음을 알 수 있었다(p≤0.0159). 중역가 백신군은 저역가 백신군보다 유의적으로 더 높은 qPCR 중앙값을 나타냈고(p=0.0193); 한편, 백신군간에 시험처리전에 pPCR 중앙값의 차이는 검출되지 않았다(p≥0.0594).

백신접종 후 4주 경과하여 바이러스 혈증 빈도는 세 가지 역가 백신군에서 낮았다.

이들 연구 결과에 기초하여 다음의 결론을 내릴 수 있다:

● 연구 동안에 차단방역의 어떠한 붕괴도 발생하지 않았고 PRRS에 대한 새끼 돼지의 감염성을 검증한 것으로 연구 타당성 인증 및 이의 해석 적합성이 확증되었다.

● 실질적인 PRRS 임상 질환이 시험처리 대조군에 명백하였고, 이에 따라 이 시험처리 모델은 PRRS 백신 효능 및 보다 특정적으로는 PRRS 94881 MLV의 MID를 평가하는데 적절한 실험 도구로 인증되었다.

● PRRS 94881 MLV의 세 가지 모든 용량 수준은 폐 병변의 유의적 감소뿐만 아니라 시험처리 후 바이러혈증, 폐 조직내 바이러스 농도, 임상 관찰 총점, 발열 및 ADWG의 유의적 감소와 연관이 있었다.

● 본 연구에서 결정된 PRRS 94881 MLV의 MID는 맹독성 이종 유럽형 PRRS 시험처리를 받은 후 시험처리 대조군에 비하여 세 가지 모든 역가 수준에서의 육안적 폐 병변 감소를 기초로 하여 1 x 10^2.77 TCID₅₀/mL의 저역가 백신 수준와 연관이 있다.

결과의 추가 서술

임상 관찰은 매일 수행하였다. 혈액샘플, 구강면봉샘플, 대변면봉샘플, 비강면봉샘플 및 폐세척액샘플에 대해 PRRSV 유럽형 특정 프라이머를 사용하여 정량 RT-PCR을 수행하였다.

이들 연구 데이터로부터 소수 파행 새끼 돼지를 제외하고 나머지 새끼 돼지들은 건강한 것으로 나타났다. 사망 후 부검에서 한 두 마리가 약간 확장된 서혜부 림프절의 징후를 보인 것을 제외하고 이상 징후는 없었다. 중요한 것은 백신접종군에서 폐 병변이 관찰되지 않았다는 점이다.

도 8은 ECACC 수탁번호 11012502로 기탁된 약독화 PRRS 바이러스 스트레인을 함유한 조성물로 백신접종된 군에 비하여 센티넬군의 바이러스혈증 동물 비율을 보여준다. 본 도면은 백신접종 동물로부터 센티넬 동물로의 백신 스트레인 전파를 보여준다. 정량 RT-PCR에 의해 검출된 최고 PRRS 바이러스혈증(SD21)을 기준으로, 바이러스 농도는 백신접종 동물(평균 바이러스 농도 4.014 GE/ml)에서 보다 센티넬 감염 돼지(평균 바이러스 농도 3.347 GE/ml)에서 78.47% 더 낮다. PRRS 자연 어미 돼지가 이들의 백신접종된 새끼 돼지와 합사된 사육실에서, 8마리 중 단지 3마리 어미 돼지만 RT-PCR에 의해 혈중 PRRSV 양성으로 검사되었고, 이것은 천연 성체 동물에 대한 제한적이고 비효과적인 PRRS MLV 백신 노출을 증명하였다. 본 연구에서 백신 바이러스 94881 MLV는 배변에서 주로 분비되었다. 실제로, 배변에서 바이러스를 백신접종 후 1일 내지 21일 동안에 검출할 수 있었다. 백신접종 후 5일째에 백신접종 동물의 약 30%가 배변에 바이러스를 분비하였다. 비강분비물에서 PRRS 바이러스는 검출되지 않았으며 단지 소수의 동물(백신접종 후 5일째에 56마리 샘플 동물중 2마리)에서만 구강 분비물에서 분비되었다.

실시예 3: 실시예로서 포실리스® PRRS를 사용한 백신 효능 검사에 사용하기 위한 재료 및 방법의 예

검증된 PRRSV 음성 사육장(바이러스학적으로 및 혈청학적으로 검사)으로부터 특정 수, 예를 들면 14마리의 건강한 임신한 돼지를 본 연구에 사용하였다. 어미 돼지는 일차 또는 이차 출산을 경험하였고 임신 94일째인 백신접종/시험처리 감염 시점에 임신을 확인하였다. 어미 돼지를 세개 처리 그룹으로 분리하였다. 그룹 1은 임신 94일째에 최소 10^4.0TCID₅₀을 함유한 포실리스^TM PRRS 상용 용량 2 ml를 근육내 투여로 처리하였다. 시험처리 대조군(그룹 2)에는 병원성 유럽형 현장 분리체(계대 4)의 2 ml 세포 배양 배지 중의 10^4.72TCID₅₀ 용량을 비내 투여하였다. 그룹 3은 2011년 1월 25일에 ECACC 수탁번호 11012502로 기탁된 약독화 PRRS 스트레인 함유된 10^7.6TCID₅₀ PRRS MLV를 함유한 2 ml 용량을 수정전에 근육내로 접종하고 임신 94일째에 유럽형 현장 분리체(계대 4)(2 ml 세포 배양 배지 중의 10^4.72TCID₅₀)를 비내로 시험처리하였다.

그룹 1의 동물을 분만 후 5일까지 모니터링하였다. 그룹 2 및 3의 동물은 분만 후 28일까지 모니터링하였다.

동물 단계: 모든 어미 돼지를 백신접종 1주일 전에 사육장에 적응시켰다. 연구원이 매일 어미 돼지와 새끼 돼지의 일반 건강 상태를 관찰하였다. 사망하거나 안락사한 모든 동물은 사후 검사 및 후속적으로 실험실 분석을 받았다.

임신은 초음파검사로 확인하였다. PCR 및 ELISA 분석을 위해 어미 돼지의 혈청을 연구 0일, 7일, 14일 및 분만시에 채취하였다. 낙태와 연관된 어떠한 재료도 실험실 연구가 실시되었다.

모든 사산 새끼 돼지는 통상적인 육안 병리 검사를 받았다. 사산 새끼 돼지 및 어미 돼지의 모든 폐엽에서 폐 조직 샘플을 채취하였다. PCR 검사를 위해 샘플은 -70℃에 보관하였다. 출생 당일에 각 새끼 돼지에서 초유전 혈액 2 ml를 채취하였다. 혈청을 제조하고 분획을 -70℃에 보관하였다. 혈청은 바이러스혈증을 검사하여 태반감염을 평가하는데 사용하였다. 5일까지 생존한 그룹 1의 모든 새끼 돼지는 5일령에서 안락사시켰다.

임상 및 생식능 매개변수: 다음의 기준은 연구 대상이 될 수 있는 예시적인 기준이다(우선 순위로 기술함): 한배당 출생새끼 돼지 수, 한배당 사산새끼 돼지 수 및 한배당 미이라변성 태아 수 및 5일령 또는 28일령의 생존 새끼 돼지 수. 초유전 혈청을 사용하여 바이러스혈증 출생새끼 돼지 수를 결정하였다. 어미 돼지/새끼 돼지로부터 PCR 양성 혈액 및 조직 샘플의 빈도를 연구하여 역학 및 감염경로를 평가하였다.

현장 샘플: 본 연구에서 검사된 현장 샘플은 통상적인 PRRSV 진단법에 따라 여러 여러 유럽 국가로부터 채취되었고 혈액, 혈청 및 다양한 기관 재료, 대부분 폐 및 림프절로 구성되었다. 샘플은 RNA 제조하기 최대 3일전에 -20℃에 보관하였고 잔여 샘플은 장기간 보관을 위해 -70℃로 옮겼다. RNA 및 RT-PCR 산물은 -20℃에 보관하였다.

세포 배양: MA104 세포(클론 CL2621)를 10% FCS 및 항생물질이 보충된 MEM(둘베코, 독일)에서 성장시켰다.

돼지 폐포 대식세포를 웬스부트 등에 의해 공개된 방법(Wensvoort, G. et al., Vet. Quat. 1991, 13:121-130)을 사용하여 수확하고 다음과 같이 변형시켰다: 각 폐엽에 PBS 50-100 ml를 주입하고 3 내지 5분간 마사지하였다. 이어서, 폐엽으로부터 유액을 빼내고 가제 필터에 통과시켰다. 세척액이 투명할 때까지 위 과정을 반복하였다. 합친 세척액을 실온에서 500 g로 15분간 원심분리하였다. 펠렛을 PBS에서 세척하고 50% RPMI 1640(Biochrom), 40% FCS 및 10% DMSO중의 1 x 10⁷ 세포의 분획을 -196℃로 동결하였다. 추후 사용하기 위해 PAM을 10% FCS와 항생물질이 보충된 RPMI 1640 배지에서 배양하였다.

세포 배양에서 바이러스 분리를 위한 기관 재료의 제조: 약 0.5 cm³의 조직 재료를 멸균 PBS 1.8 ml중에 강 균질기 블렛 한개를 함유한 튜브로 옮겼다. 기관 재료가 균질화될 때까지 튜브를 10분간 진탕시켰다. 실온하에 450 g로 2분간 원심분리하여 세포 조각을 펠렛화하였다. 상청액은 0.45 mu.m 기공 멸균 필터에 통과시키고 -70℃에 저장하였다. 24웰 미세역가 평판을 사용하여 30 ㎕의 분획을 50% 증식 세포 배양 단층에 접종하였다.

RNA 분리: 제조사의 권장사항에 따라 RNeasy Mini 키트(Qiagen)로 기관 재료 약 100 mg에서 RNA를 추출하였고 QTAamp Viral RNA Mini 키트(Qiagen)로 혈청, 혈장, 세포 배양 상청액 및 백신 용액 각 140 ㎕에서 RNA를 추출하였다. 마지막으로 제조사의 권장사항에 따라 65 ㎕ 완충액에 RNA를 용출하였다.

바이러스의 플라크 정제: 10 cm 세포배양 접시에 Ma104 세포를 식종한 후 48시간 경과하여 100% 증식 단층에 10^-1 내지 10^-4의 10배 희석액으로서 각각의 바이러스로 감염시켰다. 세포를 바이러스 희석액과 함께 1시간 배양한 다음 바이러스 희석액은 제거하고 세포를 5% 메틸셀룰로즈(Sigma)가 함유된 Ma104 배지 30 ml로 덮었다. 5 내지 7일 후 플라크를 픽업하고 24웰 평판내 Ma104 단층으로 옮겼다. 약 50% CPE에서 평판으로부터 바이러스를 수확하고 추가 분석에 적용하였다.

면역형광 분석: -20℃에서 빙냉 아세톤:메탄올(1:1)을 사용하여 15분간 세포를 고정하고 이후 기건시켰다. PBS중에 환원 후 세포를 PBS중에 1:1000 희석된 PRRSV 특이 모노클로날 항체 SDOW17(Rural Technologies Inc., USA)와 함께 1시간 배양하였다. PBS로 3회 세척 후 세포를 염소 항-마우스 FITC 결합된 이차 항체(Dianova, Hamburg, Germany)(PBS중에 1:150)와 함께 1시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척 후 세포를 글리세린:PBS 용액(1:1)으로 덮고 면역형광 현미경에 적용하였다.

진단 nRT-PCR: 진단 RT-nPCR을 수행하여 샘플에서 PRRSV-EU 바이러스 존재를 점검할 수 있다.

예시적으로 Titan One Tube 키트(Roche Molecular Biochemicals)로 진단 RT-nPCR을 다음과 같이 수행할 수 있다: [5 ㎕ 총 RNA 제제, 1^*RT-PCR 완충액, 0.4 mM dNTP, 20 pmol의 프라이머 PLS 및 PLR, 5 mM 디티오쓰레이톨, 1 mM MgCl₂, 2.5-5 U RNasin(Promega Ltd), 1-2.5 U 효소 혼합물에 아쿠아 데스트를 첨가하여 50 ㎕의 최종 용량으로 만든다]. 다음과 같은 통상적인 주기 조건을 사용할 수 있다: 45℃에서 1시간, 94℃에서 2분 및 94℃에서 30초, 58℃에서 45초와 68℃에서 45초의 30회, 68℃에서 5분간의 최종 연장 단계. Qiagen Taq(Qiagen AG)로 네스티드 PCR 반응을 다음과 같이 수행하였다:[1 ㎕ RT-PCR 산물, 1^*PCR 완충액, 10 ㎕ Q-용액, 3.5 mM MgCl₂, 0.3 mM dNTP, 20 pmol 각각의 EU-7-n-s 및 EU-7-n-as 프라이머, 2.5 U Taq 폴리머라제에 아쿠아 데스트를 첨가하여 50 ㎕의 최종 용량으로 만든다]. 주기 조건은 다음과 같다: 94℃에서 1분, 58℃에서 1분과 72℃에서 1분의 7회에 이어서 94℃에서 1분과 70℃에서 1.5분의 30회(어닐링 단계 없음), 70℃에서 5분의 최종 연장 단계.

뉴클레오타이드 서열분석: 뉴클레오타이드 서열분석은 M13 태그를 함유한 프라이머로 생성한 네스티드 PCR 산물에서 PCR 반응으로부터 직접 수행할 수 있거나 아가로즈 겔에서 절개하여 JETsorb 겔 추출 키트(Genomed)로 정제한 PCR 산물로부터 수행할 수 있다. 서열분석은 자동서열분석기 LI-COR DNA 분석기 GENE READIR 4200®(LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., USA). 뉴클레오타이드와 추정 아미노산 서열은 AlignIR®, vs1.1(LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., USA) 및 DNASIS. RTM. 2.6 소프트웨어 패키지(Hitachi Software Genetic Systems Inc., San Francisco, USA)로 분석할 수 있다.

실시예 4: 전장 게놈 서열 PRRSV 94881의 결정

본 실시예는 약독화 94881 스트레인 및 이의 모 스트레인 94881(계대 5)의 전장 게놈 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 실례를 보여준다. 이들 서열은 동종 바이러스 정보의 존재를 의문시하는 어떠한 불명료한 뉴클레오타이드 위치도 나타내지 않았다. 94881 마스터 종균 바이러스와 유럽형 참조 바이러스 스트레인 렐리스타드 바이러스(LV)의 비교에서 8개 상이한 바이러스 유전자에서 85.40 내지 95.09%의 뉴클레오타이드 상동성과 양 바이러스 스트레인간에서 86.39 내지 97.27%의 아미노산 동일성이 나타났다. 94881 MSV의 ORF 1a에서 LV와 비교하여 두번의 결실을 동정할 수 있었다. 94881 마스터 종균 바이러스와 이의 모 스트레인(계대 5)간의 비교에서 양 바이러스간에 26개의 뉴클레오타이드 치환 및 이의 결과로 총 14개의 아미노산 치환이 나타났다.

94881 마스터 종균 바이러스의 전장 게놈 서열의 결정을 위해, 역전사 1회, 외부 PCR 17회 및 내부 PCR 58회를 수행하였고, 그 결과 40개의 PCR 산물을 수득하여 서열분석에 사용하였다. 94881(계대 5)의 경우에, 역전사 1회, 외부 PCR 17회 및 내부 PCR 67회를 수행하여 40개의 PCR 산물을 수득하고 마찬가지로 서열분석에 사용하였다.

중복 서열 배열 분석 결과 완전한 오픈 리딩 프레임(ORF) 1a 내지 7을 각각 포함하는 양 바이러스 분리체에 대한 14843개 뉴클레오타이드의 전장 서열을 얻었다. 추가로, 5'-비번역 영역(5'NTR)의 177개 뉴클레오타이드와 3'-비번역 영역(3'NTR)의 43개 뉴클레오타이드를 각각 결정할 수 있었다. 유럽형 PRRSV 참조 바이러스 분리체 렐리스타드(LV)(GenBank 수탁번호 M96262)와 비교하여 5'NTR의 44개 뉴클레오타이드와 3'NTR의 83개 뉴클레오타이드는 이들 영역이 프라이머 어닐링 영역으로 사용되었기 때문에 결정할 수 없었다.

양 바이러스에 대한 서열분석 반응으로 어떠한 워블 또는 복합서열에 대한 어떠한 다른 징후도 없이 명백한 뉴클레오타이드 서열을 얻었다. 아미노산으로의 번역에 따른 명백한 아미노산 서열은 의문시되는 어떠한 아미노산도 없었으며 94881 MSV와 LV 및 모 스트레인 94881(계대 5)의 서열 비교를 하는데 이용할 수 있었다. 94881 MSV와 렐리스타드 바이러스간에 뉴클레오타이드 서열을 배열하고 비교하였고 그 결과 뉴클레오타이드와 아미노산 수준에서 실질적인 차이가 있는 것으로 나타났다. 또한, 94881 MSV와 이의 모 스트레인(계대 5)사이에 배열을 수행하였다.

LV와의 서열 비교 결과, 8개의 상이한 바이러스 유전자에서 85.40 내지 95.09%의 뉴클레오타이드 상동성 및 양 바이러스 스트레인사이에서 86.39 내지 97.27%의 아미노산 동일성이 나타났다. LV와 비교하여 94881 MSV의 ORF 1a에서 두번의 결실을 동정할 수 있다. LV의 2154 내지 2292 위치에 138개 뉴클레오타이드의 첫번째 결실이 나타나고 그 결과 46개의 아미노산이 누락되어 있다. 2686 내지 2688 위치에 하나의 세개 염기 코돈이 결실되어 아미노산 페닐알라닌이 누락되어 있다. LV와 양 94881 스트레인사이의 모든 뉴클레오타이드 상동성 및 아미노산 동일성의 배열이 표 4.1에 제시되어 있다.

[표 4.1]

94881 마스터 종균 바이러스와 94881 모 스트레인(계대 5)의 전장 뉴클레오타이드 서열을 비교한 결과 두 서열사이에 총 26개의 뉴클레오타이드 치환이 나타났다. 뉴클레오타이드 치환은 다음과 같이 분포되어 있었다: ORF 1a에 15개, ORF 1b에 4개, ORF 2에 2개, ORF 3에 없음, ORF4에 1개, ORF 5에 3개, ORF 6에 1개 및 ORF 7에 없음. 이들 뉴클레오타이드 치환은 총 14개의 아미노산 치환으로 나타났으며 다음과 같이 분포되어 있었다: 폴리단백질 1a에 8개, 폴리단백질 1b에 1개, 폴리단백질 2에 1개, 폴리단백질 3에 없음, 폴리단백질 4에 1개, 폴리단백질 5에 2개 및 매트릭스 단백질에 1개. 양 스트레인은 렐리스타드 바이러스와 비교하여 ORF 1a에서 동일한 결실을 나타냈다. 바이러스 유전자 및 상응하는 단백질에서의 위치를 포함하여 모든 뉴클레오타이드 치환 및 생성된 아미노산 치환의 배열이 표 4.2에 상세히 제시되어 있다.

실시예 5 - 기탁된 바이러스 및 MSV의 배양

상기된 바와 같이, 모(저계대) 94881은 수탁번호 ECACC 11012501로 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 기탁되어 있고 94881 마스터 종균 바이러스(MSV)는 수탁번호 ECACC 11012502로 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 기탁되어 있다. 모 바이러스 및 MSV를 위한 성장 및 배양 조건은 본 실시예에서 제공된다.

모 94881: 이것은 PRRSV 1형인 유전자형의 바이러스이며 엄밀하게는 유럽형 유전자형 PRRSV이다. 이 바이러스는 돼지 숙주를 갖는다. 11012501로 기탁된 모 바이러스는 5.81 Log₁₀ TCID₅₀/mL의 역가로 기탁되었다. 바이러스 증식을 위한 숙주 세포는 MA104 세포이다. 이들 세포는 6% 조사된 소 태아 혈청 및 3.7 g/L 중탄산나트륨이 보충된 최소 필수 배지(MEM)에서 37±1℃로 배양한다. T-플라스크(75 cm²)에 세포를 2 x 10⁴ 내지 2 x 10⁵ 세포/cm²의 밀도로 식종하고 계대전에 100% 단층 증식(포화)까지 3 내지 7일간 배양한다. 바이러스 성장을 위해, T-플라스크의 세포에 바이러스를 0.001 내지 0.01의 MOI로 첨가한다. 전형적으로 세포 식종 후 1 내지 3일 경과하여 감염 세포의 포화율은 약 80 내지 100%이다. 감염 세포는 감염 후 3 내지 10일 동안 37±1℃에서 배양하고, 그런 다음 바이러스를 수확한다. 수확은 감염 후 3 내지 10일 경과하여 단층 세포에 약 80 내지 100% 세포 병변 효과(CPE)가 나타날 때 수행한다. 감염 MA104 조직 배양물의 상청액(80 내지 100% CPE를 갖는 배양물로부터의 소모된 배지+PRRSV)을 수확하고 이것은 증식된 바이러스를 함유한다. 이 상청액은 사용시까지 수개월동안 -70℃/-80℃에 보관할 수 있다. Spearman과 Kaeber 계산법으로 바이러스의 TCID₅₀을 평가하여 샘플의 log₁₀ TCID₅₀/mL을 결정한다.

백신(고계대) 94881 마스터 종균 바이러스(MSV): 이것은 PRRSV 1형인 유전자형의 바이러스이며 엄밀하게는 유럽형 유전자형 PRRSV이다. 이 바이러스는 돼지 숙주를 갖는다. 11012502로 기탁된 MSV는 6.43 Log₁₀ TCID₅₀/mL의 역가로 기탁되었다. MSV의 증식을 위한 숙주 세포는 MA104 세포이다. 이들 세포는 10% 조사된 소 태아 혈청 및 1.4 g/L 중탄산나트륨이 보충된 최소 필수 배지(MEM)에서 36±2℃로 배양한다. T-플라스크(75 내지 150 cm²) 또는 850 cm² 회전병에 세포를 2 x 10⁴ 내지 2 x 10⁵ 세포/cm²의 밀도로 식종하고 계대전에 100% 단층 증식(포화)까지 3 내지 7일간 배양한다. 바이러스 성장을 위해, T-플라스크 또는 회전병의 세포에 바이러스를 0.001-0.01의 MOI로 첨가한다. 전형적으로 세포 식종 후 1 내지 3일 경과하여 감염 세포의 포화율은 약 80 내지 100%이다. 감염 세포는 감염 후 3 내지 14일 동안 36±2℃에서 배양하고, 그런 다음 바이러스를 수확한다. 수확은 감염 후 3 내지 14일 경과하여 단층 세포에 약 80 내지 100% 세포 병변 효과(CPE)가 나타날 때 수행한다. 감염된 MA104 조직 배양물의 상청액(80 내지 100% CPE를 갖는 배양물로부터의 소모된 배지+PRRSV)을 수확하고 이것은 증식된 바이러스를 함유한다. 이 상청액은 사용시까지 2 내지 8℃에서 5-10일간, -70℃에서 수개월동안 보관할 수 있다. Reed와 Muench 계산법으로 MSV의 TCID₅₀을 평가하여 샘플의 log₁₀ TCID₅₀/mL을 결정한다.

[표 4.2]

실시예 6: PRRS 94881 MLV 어미 돼지 MID 연구

요약

본 백신접종-시험처리 연구의 목적은 어미 돼지에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 백신 유럽형 분리체 94881, 변형된 생 바이러스, 코드 19T1.U_(PRRS 94881 MLV)의 최소면역용량(MID)를 평가하는데 있다. 두 가지 상이한 역가 수준을 출산 약 28일전(0일; D0)에 PRRS 혈청음성 어미 돼지에 투여하였고, 어미 돼지를 임신 약 90일째(D118)에 PRRSv의 이종 유럽형 분리체로 시험처리하였으며, 어미 돼지를 출생새끼 돼지 총수 또는 출생새끼 돼지 비율 및 20일령의 수유새끼 돼지에 대해 평가하여 MID를 결정하였다. 118일째(D118)의 시험처리 시점에서, 시험처리 대조군은 임신한 돼지 8마리(그룹 1, 위약)로 구성되었고, 저역가군은 임신돼지 8마리(그룹 2, 1 x 10^2.43TCID₅₀/용량)로 구성되었으며, 고역가군은 임신한 돼지 8마리(그룹 3, 1 x 10^3.90TCID₅₀/용량)으로 구성되었고, 음성 대조군은 임신한 돼지 5마리(그룹 4, 위약, 시험처리되지 않음)으로 구성되었다.

저역가군과 고역가군은 둘 다 시험처리 대조군과 비교하여 분만시 한배당 출생새끼 돼지의 비율이 더 높았고(p≤0.0455) 이유시 한배당 출생새끼 돼지의 비율 및 수가 더 높았다(p≤0.0203).

보조적인 효능 매개변수의 양상에서, 고용량군은 시험처리 대조군과 비교하여 분만시 한배당 건강 새끼 돼지의 비율 및 수가 더 높았고(p≤0.0211), 허약한 미이라변성 태아의 비율 및 수가 더 낮았으며(p≤0.0090), qPCR 양성 어미 돼지의 비율이 더 낮았고 D125, DOF 0 및 DOF+13에 시험처리 후 어미 돼지의 바이러스 농도가 더 낮았으며(p≤0.0155), qPCR 양성 어미 돼지당 새끼 돼지의 비율이 더 낮았고 DOF0에 바이러스 부하된 새끼 돼지의 비율이 더 낮았으며(p≤0.0030), 임상 질환을 앓고 있는 어미 돼지당 새끼 돼지의 비율이 더 낮았고(p<0.0001), DOF+20에 새끼 돼지의 체중 및 ADWG가 더 높았다(p<0.0013).

저용량군은 시험처리 대조군과 비교하여 분만시 어미 돼지당 건강 새끼 돼지의 비율이 더 높았고(p=0.0138), 미이라변성 태아의 비율 및 수가 더 낮았으며(p≤0.0190), qPCR 양성 어미 돼지의 비율이 더 낮았고 D125, D132, DOF 0 및 DOF+13에 시험처리 후 어미 돼지의 바이러스 농도가 더 낮았으며(p≤0.0290), DOF0에서 qPCR 양성 어미 돼지당 새끼 돼지의 비율(%)이 더 낮았으며(P=0.0381), 임상 질환을 앓고 있는 어미 돼지당 새끼 돼지의 비율이 더 낮았고(p<0.0001), DOF+20 에 새끼 돼지의 체중 및 ADWG가 더 높았다(p<0.0028).

결론적으로, 본 연구의 목적은 충족되었고 본 연구의 데이터를 기초로 어미 돼지에 대한 PRRS 94881 MLV의 MID는 1 x 10^2.43TCID₅₀/2 mL로 설정된다. 추가로, 본 연구로부터 어미 돼지에 대한 면역지속기간(DOI)는 약 4개월로 설정된다.

본 연구의 목적(들)

본 면역접종-시험처리 연구의 목적은 어미 돼지에서 돼지 생식기 호흡기 증후군 백신 유럽형 분리체 94881, 변형된 생 바이러스, 코드 19T1.U_(PRRS 94881 MLV)의 최소면역용량(MID)를 평가하는데 있다. 임신 약 90일째에 어미 돼지에 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSv)의 이종 유럽형 분리체를 시험처리한 후, 두 가지 상이한 역가 수준(그룹 2, 저역가; 그룹 3, 고역가)을 출산전에 PRRS 혈청음성 어미 돼지에 투여하여 출생새끼 돼지 및 20일령의 수유새끼 돼지 비율을 더 높였다. 이 목적을 충족하는 주요 기준은 한쪽 또는 양쪽 백신군이 시험처리 대조군(그룹 1)과 비교하여 출생새끼 돼지 및 20일령(DOF+20)의 수유새끼 돼지에서 상대적으로 더 높은 비율 또는 수가 증명되어야 한다는 것이다.

백신군과 시험처리 대조군간에 분석된 다른 매개변수로는 백신접종 후 어미 돼지 임상 평가, 어미 돼지 PRRS 혈청검사, 어미 돼지 바이러스혈증, 어미 돼지 임상 관찰, 새끼 돼지 바이러스혈증, 한배당 총 새끼 돼지, 한배당 건강한 생존 새끼 돼지, 한배당 허약한 생존 새끼 돼지, 한배당 미이라변성 태아, 한배당 사산새끼 돼지, 한배당 압사한 새끼 돼지, 새끼 돼지 임상 관찰 및 새끼 돼지 평균 1일 체중 증가(ADWG)가 포함되었다. 이들 매개변수는 보조적인 매개변수로서 분석하였고 본 연구 목적을 충족하기 위한 주요 매개변수로서 역할을 하는 것은 아니다.

사건의 스케쥴

[표 6.1]

[표 6.2]

연구 설계

[표 6.3]

맹검 기준

연구원 및 피지명자에게 그룹 1-4로 분류된 어미 돼지에 대한 정보가 차단되었다. 연구원 및 피지명자들에게 정보를 계속 차단하기 위해, 데이터를 수집하지 않은 자가 IVP 및 CP를 분류된 어미 돼지에 DO에 투여하였다. 실험실 직원들은 개개인의 업무를 수행하면서도 각 어미 돼지에게 적용된 처치에 대해 정보는 차단되었다.

재료

연구용 수의 생성물(IVP) 및 대조군 생성물(CP)

[표 6.4]

[표 6.6]

시험처리 물질

[표 6.7]

추가 처리

D8 내지 D21에 발정주기를 맞추기 위해서 각 어미 돼지의 사료에 매트릭스^TM(6.8 mL; Alternogest; Intervet/Schering Plough Animal Health)를 투입하였다.

출산때 어미 돼지에 옥시토신(VetTek)를 투여하여 분만을 촉진하였으나 분만 유도를 위해 투여하지는 않았다. 분만시 모든 생존 새끼 돼지에 출생 직후 철결핍성빈혈을 예방하기 위하여 우측 넓적다리에 1.0 mL 철(Phoenix 또는 Durvet)을 근육내로 주사하였다. 추가로, 모든 생존 새끼 돼지에 출생 직후 설사예방제로서 젠타마이신(SparHawk laboratories Inc)를 투여하였다. 모든 처리는 생물학적 및 약제학적 처리 기록서에 기재하였다.

처리

용량 설정근거

분류된 어미 돼지에 각 IVP를 2.0 ml 용량으로 투여하여 PRRS 94881 MLV의 MID를 평가하였다. 2.0 mL 용량의 CP를 그룹 1 및 4로 분류된 어미 돼지에 투여하였다.

투약 요법

연구 데이터를 수집하지 않은 자가 D0에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 18g x 1 인치(2.54 cm) 바늘을 사용하여 각 어미 돼지의 우측 경부에 각 IVP 또는 CP를 근육내 주사하였다. 투여 요법은 아래 표 6.8에 기재되어 있다.

[표 6.8]

연구원을 위한 방법 및 예방조치

IVP, CP 및 시험처리 물질을 투여하는 연구원들은 안전예방조치를 충실히 지켰으며 특정 연구실에 맞춘 개인용 보호장비를 착용하였다.

동물 정보

연구용 동물에 대한 세부사항

[표 6.9]

선정/배제 기준

본 연구에 등록된 모든 어미 돼지들은 PRRS ELISA 음성이었고, 비교배 상태였으며, 백신접종 시점에서의 관찰 결과 건강하였다.

어미 돼지의 선정 후 배제

5마리-그룹 1 어미 돼지(5, 15, 34, 35 및 52번), 2마리-그룹 2 어미 돼지(77 및 94번), 3마리-그룹 3 어미 돼지(2, 25 및 30번) 및 1마리-그룹 4(20번)는 발정을 표출하지 않았고 이후 교배되지 않았다. 이들 어미 돼지는 D47까지 연구에서 배제되었다.

2마리-그룹 1 어미 돼지(109 및 110번), 9마리-그룹 2 어미 돼지(56, 59, 60, 69, 73, 75, 76, 78 및 103번), 4마리-그룹3 어미 돼지(22, 28, 51 및 53번) 및 1마리-그룹 4 어미 돼지(21번)은 파행, 불임 또는 때늦은 교배로 인해 D89까지 연구에서 배제되었다.

연구 프로토콜은 만일 그룹 1 내지 3에서 그룹당 17마리 이상의 임신한 돼지가 시험처리전에 연구에 참여하고 있는 경우 그룹 1 내지 3의 그룹당 16마리의 임신한 돼지를 남기고 여분의 어미 돼지는 연구에서 무작위로 배제할 것을 기술하였다. 5마리-그룹 1 어미 돼지(3, 8, 39, 90 및 101번), 1마리-그룹 2 어미 돼지(70번) 및 5마리-그룹 3(42, 80, 86, 91 및 105번)이 D104까지 비연구자의 기분 또는 선택에 의해 무작위로 배제되었고, 이에 따라 그룹 1 내지 3에서 각 그룹의 크기는 16마리 어미 돼지로 줄어들었다.

공간의 제약으로 인해, 연구원은 그룹 4의 크기를 8마리에서 5마리로 줄일 것을 요청하였다. 통계전문가가 연구에서 배제하기 위해 3마리 어미 돼지(10, 24 및 29번)을 무작위로 선정하고 D109에 배제하였다.

동물 관리 및 수용시설

동물 수용시설

D-1 내지 연구 마감시까지 VRI-캠브릿지의 빌딩 CB의 사육실 1 및 2에 IVP 저역가 어미 돼지를, 사육실 3 및 4에 IVP 고역가 어미 돼지를 수용하였다. 시험처리 대조군 및 음성 대조군으로 분류된 어미 돼지는 D-1 내지 D85에 VRI-Risdal의 단일 사육실에 수용하였다. D85에 시험처리 대조군 및 음성 대조군에서 남은 새끼 돼지들을 VRI-캠브릿지로 옮겼다. 연구의 잔여 기간 동안 16마리-시험처리 대조군 새끼 돼지는 빌딩 CB의 사육실 5-8에 수용하였고 8마리-음성 대조군 새끼 돼지는 빌딩 CA의 사율실 12에 수용하였다. D85 이후로, 각 사육실에는 동일하게 한줄에 4개의 분만틀이 2줄로 배치되었다. 각 분만틀에는 한 마리의 어미 돼지와 새끼 돼지들이 유치되었다. 각 분만틀은 크기가 약 5 피트 x 7 피트였고, 측면에 금속봉 판넬과 바닥에 플라스틱망으로 되어 바닥으로부터 들려있었다. 인접한 분만틀간에는 안면이 마주되도록 접해있지 않았다. 각 분만틀의 바닥은 매일 1회 이상 청소하여 배설물과 오물을 제거하였다. 각 사육실은 별도의 온열 및 통풍 시설을 갖춰 사육실간의 공기오염을 방지하였다. 각 사육실은 연구에 사용하기에 앞서 청결하게 소독하였다. 동물 사육사들은 각 사육실에 입장할 때는 사전에 샤워를 하고 청결복으로 갈아 입었다.

PRRSv는 에어로졸화를 포함한 다양한 기전을 통해 돼지간에 쉽게 전파된다는 것은 과학계에서 잘 알려져 있음에 따라 본 연구에서 처리 그룹을 격리할 필요가 있었다. 이것은 질환을 발생하는 능력을 보유하지 않으면서 맹독성 야생형 PRRS의 특징을 모사하는 약독화 바이러스 입자를 포함한 생물학적 제품으로서 맹독성 생 PRRS 백신을 포함한다. 차단방역을 유지하고 백신접종 동물들이 비백신접종되고 PRRSv 천연적 음성 대조동물을 우연히 교차오염시키지 않았음을 보장하는 적절한 방법들을 실행할 준비가 되어 있었다.

시설내 각 사육실은 충분한 공기 순환과 난방을 위해 팬과 히터를 갖추고 있다. 각 사육실의 통풍 시스템은 동일하지만 독립적이어서, 사육실간에 공기가 공유되지 않는다. 고형 사료는 무해충 낭에 저장하였다. 물은 동물시설내에 마련한 우물에서 자유롭게 공급되었다. 어미 돼지에게는 이들의 크기, 연령 및 상태에 맞게 상업적으로 제조되었고 약품처리되지 않은 임산 또는 수유 배급량(Heart of Iowa Cooperative, Roland, IA)이 급식되었다.

어미 돼지는 연구원의 판정에 따라 연구 개시전에 건강 및 영양 상태가 양호하였다. 연구 동안에 2마리 어미 돼지에서 경미한 파행이 관찰되었고 1마리 어미 돼지의 좌측 경부에서 종창이 관찰되었다. 연구원은 이들 모두를 격리 수용된 어미 돼지 집단에서 흔히 발생되는 비특이적 상태로 판단하였다. 연구원은 본 연구 기간 동안에 어떠한 동물에 대해서도 부수적인 처리가 필요치 않은 것으로 결정내렸다.

그룹 1 내지 3으로 배정된 모든 어미 돼지 및 새끼 돼지는 안락사 후 상업적인 화장에 의해 처리하였다. 그룹 4로 배정된 어미 돼지는 안락사 후 랜더링에 의해 처리하였다. 그룹 4의 새끼 돼지는 안락사시키지 않았지만 다른 BIVI 프로젝트로 이관하였다. 본 연구에 등록된 동물의 사체는 절대 사람의 식품으로 유용되지 않았다.

효능 평가

PRRS 94881 MLV의 MID를 평가하기 위해, 저역가군(그룹 2) 및 고역가군(그룹 3)을 D118에 시험처리하고, 생식능 및 시험처리 후 이유 새끼 돼지를 평가하였다. 이 목적을 충족하기 위한 주요 기준은 한쪽 또는 양쪽 백신군이 시험처리 대조군(그룹 1)에 비하여 만족스러울정도로 더 높은 비율 또는 수의 출생새끼 돼지 및 20일령(DOF+20) 이유 새끼 돼지를 입증해야한다는 것이다.

백신군과 시험처리 대조군사이에 효능을 증명하기 위해 분석된 다른 매개변수로는 백신접종 후 어미 돼지 임상 평가, 어미 돼지 PRRS 혈청검사, 어미 돼지 바이러스혈증, 시험처리 후 어미 돼지 임상 관찰, 분만시 새끼 돼지 바이러스혈증, 한배당 새끼 돼지 총수, 한배당 건강한 생존 새끼 돼지, 한배당 허약한 생존 새끼 돼지, 한배당 미이라변성 태아, 한배당 사산새끼 돼지, 한배당 압사한 새끼 돼지, 새끼 돼지 임상 관찰 및 새끼 돼지 ADWG가 포함되었다.

유효 시험 기준

음성 대조군(그룹 4)는 어떠한 분석에도 포함되지 않았다. 음성 대조군은 공급된 어미 돼지가 다른 세 가지 그룹의 시험처리 시점에서 PRRS 음성이었음을 증명하기 위해 본 연구에 포함되었다. 게다가, 음성 대조군은 연구 종료시까지 현장 PRRSv의 가능한 유입 또는 시험처리군으로부터의 우연한 교차오염을 배제하기 위하여 PRRS 음성을 유지해야 했다.

구매전 및 D0의 혈청 샘플은 모두 PRRS 항체에 대해 음성이 요구되었다. 시험처리일까지 그룹 1 및 4로부터 채취된 혈청 샘플 및 연구 종료시까지 그룹 4로부터 채취된 혈청 샘플은 연구의 유효성을 위해 PRRS 항체가 존재하지 않아야 했다.

주요 결과 매개변수

통계학적 평가를 위한 주요 효능 변수는 출산시 어미 돼지당 출생새끼 돼지 수(평균 수 또는 비율) 및 DOF+20에서 한배당 출생새끼 돼지(평균 수 또는 비율)이었다.

9.2.1 출산시 어미 돼지당 출생새끼 돼지 비율

연구 기간에 각 어미 돼지에 대한 분만 데이터를 기록하였다. 각 어미 돼지의 분만일(DOF)는 첫번째 새끼 돼지가 출산되는 날로 정의하였다. 분만시점에 각 새끼 돼지는 아래 표 6.10에 기재된 5 가지 범주중 하나로 분류하였다. 출산시 생존 새끼 돼지는 건강한 생존 새끼 돼지, 허약한 생존 새끼 돼지 또는 압사한 새끼 돼지(압사 원인은 아래에 기술된 바와 같이 부검에서 확인되었다)으로서 출생시 관찰등급을 지정받은 임의의 새끼 돼지로서 정의하였다. 관찰은 연구원 또는 피지명자에 의해 수행되었고 분만/한배 프로세싱 기록 양식에 기재하였다.

[표 6.10]

DOF+20에서의 한배당 생존 새끼 돼지

DOF+1 내지 DOF+20에서 아래 표 6.11에 제시된 바와 같이 질환의 임상 징후에 대해 새끼 돼지를 관찰하였다. 관찰은 연구원 또는 피지명자에 의해 수행되었고 임상 관찰 양식에 기록되었다.

[표 6.11]

통계전문가가 SAS 프로그램을 이용하여 호흡, 행동 및 기침 점수를 합산하여 1일 임상 관찰 총점을 결정하였다. DOF+20에 0 내지 8의 임상점수를 받은 새끼 돼지는 DOF+20에 생존으로 평가되었다.

보조 매개변수

백신군과 시험처리 대조군사이에 분석된 다른 매개변수로는 백신접종 후 어미 돼지 임상 평가, 어미 돼지 PRRS 혈청검사, 어미 돼지 바이러스혈증, 어미 돼지 임상 관찰, 새끼 돼지 바이러스혈증, 한배당 총 새끼 돼지, 한배당 건강한 생존 새끼 돼지, 한배당 허약한 생존 새끼 돼지, 한배당 미이라변성 태아, 한배당 사산새끼 돼지, 한배당 압사한 새끼 돼지, 새끼 돼지 임상 관찰 및 새끼 돼지 평균 1일 체중 증가(ADWG)가 포함되었다.

어미 돼지 1일 평가

연구원 또는 피지명자는 D-1 내지 D21에 매일 1회 및 D22 내지 D115에 주 3회이상 모든 어미 돼지를 관찰하여 백신접종 후 1일 평가를 실시하였다. 소견은 1일 평가 양식에 기록하였다.

어미 돼지 PRRS 혈청검사

구입전, D0, D7, D14, D21, D56, D84, D118, D125, D132, DOF 0, DOF+7, DOF+13 및 DOF+20에 어미 돼지로부터 정맥 전혈을 채취하였다. 분만/유산 시점(DOF 0)에 어미 돼지로부터의 채혈은 분만/유산이 완료된 직후 또는 분만/유산 후 8시간까지 실시하였다.

요컨데, 각 어미 돼지로부터 적당한 크기의 혈청분리튜브(SST)로 약 10 mL의 혈액을 채취하였다. 샘플 채취는 샘플 채취 양식에 기록하였다. SST내 혈액은 실온에서 응고하도록 두었다. 평일에 채취된 혈액 샘플은 채혈 당일에 BIVI-Ames로 운반하였다. 주말에 채취된 혈액 샘플은 채혈 당일에 VRI 직원에 의해 처리되었다. VIR에서 혈청 샘플은 2 내지 8℃에 보관하였다. BIVI-Ames 또는 VRI에서 혈액 샘플은 원심분리하여 혈청을 수확하고 적당한 튜브로 옮겼다. 각 튜브에 어미 돼지의 ID 번호, 연구번호, 채혈일, 연구일 및 샘플종류를 표시하였다. VRI에 있는 혈청 샘플은 가장 빠른 편한 시각에 BIVI-Ames로 운반하였다. 작성된 샘플 운송 양식이 배송물에 포함되었다. BIVI-Ames에서, 혈청 샘플 한조를 2 내지 8℃에 보관하였고 다른 세트의 혈청 샘플은 -70±10℃에 저장하였다.

BIVI-Ames는 2 내지 8℃에 보관된 어미 돼지 혈청 샘플 세트를 PRRS 항체에 대해 검사하였다. 결과는 음성(ELISA S/P 비율이 0.4 미만) 또는 양성(ELISA S/P 비율이 0.4 이상)으로 기록되었다.

시험처리 후 어미 돼지 임상 관찰

D116 내지 DOF+20에 어미 돼지를 질환의 임상 징후에 대해 관찰하였다. 관찰은 연구원 또는 피지명자에 의해 실시되었다. 어미 돼지는 상기 표 6.11에 제시된 임상 관찰 점수체계를 기준으로 호흡, 행동 및 기침이 매일 관찰되었다.

새끼 돼지 PRRS 바이러스혈증

DOF 0, DOF+7, DOF+13 및 DOF+20에 새끼 돼지로부터 정맥 전혈을 채취하였거나 새끼 돼지가 사망하였을 때도 채취하였다. 신생 새끼 돼지의 경우 초유전 채혈이 바람직하지만 의무적인 것은 아니다. 만일 초유전에 채혈할 수 없는 경우, 분만 후 12시간내의 주산기 혈액도 가능하다. 최초 흡유전에 채취되지 않은 샘플을 "주산기"로 표시하였고 초유전 샘플과 별도로 보관하였다.

요컨데, 개개의 생존 새끼 돼지로부터 적당한 크기의 혈청 분리 튜브(SST)로 약 2.0 내지 2.5 mL의 혈액을 채취하였다. 안락사직전인 DOF+20에 개개의 새끼 돼지로부터 최소 5.0 mL의 혈액을 채취하였다. 채혈은 개개의 미이라변성 태아 또는 사산새끼 돼지에게도 이루어 졌고, 만일 사망 태아로부터 채혈할 수 없는 경우 흉부 또는 복부 유액을 채취하였다. 샘플 채취는 샘플 채취 양식에 기록하였다.

새끼 돼지 평균 1일 체중 증가

DOF 0 및 DOF+20에 각 새끼 돼지의 체중을 쟀고 연구원 또는 피지명자가 새끼 돼지가 사망한 것으로 발견한 날에도 그 새끼 돼지의 체중을 쟀다. DOF 0에서의 각 체중은 분만/한배 프로세싱 기록 양식에 기재하였고 DOF 0 이후의 체중은 체중 기록 양식에 기재하였다.

폐 조직내 PRRS 바이러스 정량

분만시에 사망하였거나 DOF+20에 사망한 모든 새끼 돼지는 연구원에 의해 부검되었다. 부검 및 진단 결과는 부검보고서에 기록하였다. 각각의 부검 새끼 돼지로부터 2개의 폐 샘플을 채취하였다. 샘플 한개는 분리된 Whirlpak® 용기에 넣었고 다른 샘플은 충분량의 10% 포르말린이 충진된 적당한 용기에 넣었다. 샘플 채취는 부검보고서에 기록하였다.

Whirlpak® 및 포르말린 용기에 동물번호, 연구번호, 샘플채취일, 연구일, 샘플종류 및 샘플 채취부위(좌측, 우측 또는 양측)를 적당히 표시하였다. BIVI-Ames로 운반되기까지 Whirlpak®의 샘플은 -70±10℃에 저장하였고 10% 포르말린의 샘플은 실온에 저장하였다. 작성된 샘플 운송 기록 양식이 각 샘플배송물에 포함되었다. BIVI-Ames로부터 독일로 운반될 때까지 BIVI-Ames에서는 Whirlpak®의 샘플을 -70±10℃에 보관하였고, 포르말린 고정 샘플은 BIVI-Ames에서 실온에 보관하였다.

연구가 종료된 후, Whirlpak®의 동결건조 조직 샘플을 상기한 바와 같이 운반하고 시험하였다.

포르말린 고정된 조직 샘플은 파라핀 블록에 포매하기 위해 수집 1주내에 ISU VDL에 제출하였다. 파라핀 블록내 조직은 BIVI로 반송하였고 가능한 차후 시험을 위해 현재 BIVI-Ames에서 실온 보관중에 있다. 이들 샘플을 계속 보존할 것인지 처분할 것인지의 여부는 연구 보고서가 완성된 후 Study Sponsor and Monitor에 의해 결정될 것이다.

유해 사건

연구 기간에 IVP로 인한 유해 사건은 전혀 보고되지 않았다. 유해 사건에 대한 추가 정보는 백신접종 후 어미 돼지 평가, 섹션 12.6을 참조할 수 있다.

통계 방법

실험 단위

본 연구에서 처리군은 비백신접종군으로의 생 PRRSv 백신의 전파를 방지하기 위해 격리된 사육실에 수용해야 했다. 따라서, 사육실은 실험 단위였다. 그러나, 본 분석의 목적상 교락 "사육실" 및 "처리" 효과로 발생할 수 있는 편의는 무시하였고 어미 돼지와 이의 한배 새끼 돼지를 실험 단위로서 분석하였다.

무작위선정

107마리의 피검적격 어미 돼지 집단중에서 94마리의 PRRS 혈청음성 어미 돼지를 D0전에 4 그룹중 한 그룹에 무작위로 배정하였다. 그룹 1 내지 3 각각은 28마리의 어미 돼지로 구성되었다. 그룹 4는 10마리의 어미 돼지로 구성되었다. 그룹 1의 경우, 45번과 55번은 건강상 이유로 운송전에 농장 지배인에 의해 배제되었고 두 마리 여분 어미 돼지 15번과 18번으로 각각 교체되었다. 그룹 3에서도, 어미 돼지 44번이 건강상 이유로 운송전에 농장 지배인에 의해 배제되었고 여분 어미 돼지 25번으로 교체되었다.

시험처리 시점에 공간 제약으로 인해, 그룹 1 내지 3을 그룹당 16마리 어미 돼지로 제한하였고 그룹 5는 5-8마리의 어미 돼지로 제한하였다. 그룹 1 내지 3의 경우 D85에 그룹당 16마리 어미 돼지를 무작위로 선정하여 연구에 참여시켰다. 그룹 4는 D85에 8마리 어미 돼지로 구성되었기 때문에, 추가로 감축하지 않았다. 이후, 연구원이 그룹 4에서 8마리 어미 돼지를 4마리 어미 돼지로 감축할 것을 요청하였다. D109에 그룹 5에서 5마리 어미 돼지를 무작위로 선정하여 연구에 참여시켰다.

모든 무작위선정 절차는 생물통계전문가에 의해 수행되었다.

분석

통계분석 및 데이터요약은 Dr. rer. hort. Martin Vanselow (Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0)511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de)에 의해 수행되었다.

통계분석의 주 목적은 2개의 PRRS 94881 MLV 백신군(그룹 2 및 3)과 비백신접종된 시험처리 대조군(그룹 1)을 비교하는데 있었다. 모든 데이터는 관리 및 평가를 위해 SAS로 전송되었다. 데이터는 연구 스폰서로부터 검증된 SAS 데이터 세트의 형태로 입력되었다. 연구로부터 철회된 경우들은 배제일까지 각각의 분석 매개변수를 위해 고려되었다. 모든 데이터는 변수 유형을 기준으로 서술적으로 요약되었다(n, 최소치, 최고치, 평균값, 중앙값, 표준편차, 사분범위, 빈도분포, 신뢰구간). 통계분석은 SAS 소프트웨어 버젼 8.2(SAS, 2001, Cary, North Carolina, USA: SAS Institute, Inc.)를 사용하여 실시하였다.

연구의 통계학적 평가를 위한 변수:

주요변수

분만/유산시(DOF+0) 생존 새끼 돼지의 비율

20일령(DOF+20) 생존 새끼 돼지의 비율

보조변수

백신접종 후 어미 돼지 임상 평가

어미 돼지 PRRS 혈청검사

어미 돼지 바이러스혈증

어미 돼지 임상 관찰

새끼 돼지 바이러스혈증

생식능

새끼 돼지 임상 관찰

새끼 돼지 평균 1일 체중 증가(ADWG)

시험 가설 및 추정:

통계검정에서 비시험처리 음성 대조군(그룹 4)는 배제하였다. 저역가군 및 고역가군(각각 그룹 2 및 3)을 시험처리 대조군(그룹 1)과 비교하였다. 그룹간 모든 검정은 차이에 대한 양측검정으로 설계되었다. 모든 검정의 경우에서 차이는 p≤0.05인 경우만 통계상 유의적인 것으로 판정되었다. 효능은 출생새끼 돼지의 비율 또는 수 및 DOF+20에서의 이유 새끼 돼지의 비율 또는 수에 있어서 한쪽 또는 양쪽 백신군이 시험처리 대조군에 비하여 유의적으로 더 높은 경우 인정되었다.

데이터 처리 및 평가에 대한 세부사항:

백신접종 후 어미 돼지의 임상 평가

연구일 1과 21사이 및 연구일 1과 113사이에 적어도 한번의 양성 소견을 나타낸 동물의 빈도표를 작성하였다. 시험처리군과 백신군사이의 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

시험처리 후 어미 돼지의 임상 관찰

연구일 116과 DOF+20사이에 적어도 한번의 양성 소견을 나타낸 동물의 빈도표를 작성하였다. 시험처리 대조군과 백신군사이의 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

어미 돼지의 혈청검사

연구일 7, 14, 21, 56, 84, 118, 125, 132(분만전) 및 DOF+0, DOF+7, DOF+13 및 DOF+20에서의 양성 ELISA 결과의 빈도표를 작성하였다. 시험처리 대조군과 백신군사이의 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

어미 돼지의 바이러스혈증

각 연구일(분만전 연구일 7, 14, 21, 56, 84, 118, 125, 132, DOF+0, DOF+7, DOF+13 및 DOF+20)에 독립적으로 바이러스혈증 데이터를 평가하였다. qPCR 데이터의 정석평가를 위해, 분석 결과 '미검출(n.d.)' 및 '음성'은 '음성'으로 분류하였고, 분석 결과 '양성' 및 측정값은 '양성'으로 분류하였다. 정량평가를 위해 '미검출'(n.d.)과 '음성'은 0.0의 log₁₀ GE/mL 값으로, '양성'은 3.0의 log₁₀ GE/mL 값으로 대신하였다. 정량 PCR 데이터(PRRS 바이러스 농도[log₁₀GE/mL])는 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법을 사용하여 시험처리과(그룹 1)과 처리군 2 및 3을 비교하는데 사용하였다. '양성' qPCR 결과의 빈도표를 작성하였다. 시험처리 대조군과 백신군간의 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

생식능

어미 돼지당 DOF+20에서의 새끼 돼지총수, 생존 새끼 돼지, 건강새끼 돼지, 허약새끼 돼지, 사산새끼 돼지, 사망 새끼 돼지 및 생존 새끼 돼지의 절대 빈도를 결정하고 그룹간의 비교를 위한 단일값으로 사용하였다. 어미 돼지당 생존 새끼 돼지, 건강새끼 돼지, 허약새끼 돼지, 사산새끼 돼지 및 사망 새끼 돼지의 상대 빈도를 분만시 새끼 돼지 총수와 상대적으로 계산하고 그룹간 비교를 위한 단일값으로 사용하였다. DOF+20에서의 한배당 생존 새끼 돼지의 비율을 분만시 생존 새끼 돼지의 수-압사한 새끼 돼지의 수와 상대적으로 계산하였다. 시험처리 대조군과 백신군간의 차이는 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 검정하였다.

새끼 돼지의 바이러스혈증

각 연구일(DOF+0, DOF+7, DOF+13 및 DOF+20)에 바이러스혈증 데이터를 독립적으로 평가하였다. qPCR 데이터의 정석평가를 위해, 분석 결과 '미검출(n.d.)' 및 '음성'은 '음성'으로 분류하였고, 분석 결과 '양성' 및 측정값은 '양성'으로 분류하였다. 한배당 '양성' 새끼 돼지의 비율을 계산하고 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 그룹간 비교를 위해 단일값으로 사용하였다. 정량평가를 위해 '미검출'(n.d.)과 '음성'은 0.0의 log₁₀ GE/mL 값으로, '양성'은 3.0의 log₁₀ GE/mL 값으로 대신하였다. 한배당 중앙 qPCR 값을 계산하고 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 그룹간 비교를 위한 단일값으로 사용하였다. 요약통계를 위해 각각의 qPCR 데이터를 사용하였다. 폐 샘플내 바이러스 농도는 단지 서술적으로만 평가하였다.

새끼 돼지의 체중 및 평균 1일 체중 증가

DOF+0 내지 DOF+20의 기간동안에 개별적인 평균 1일 체중 증가(ADWG)를 계산하였다. 처리군간의 차이는 분산분석(ANOVA) 및 후속으로 t-검정법으로 검정하였다. ANOVA로부터 그룹의 부화차순 및 신뢰구간 95%의 부화차순간 차이를 얻었다. DOF+20 및 ADWG에 대한 분석을 공변량으로서 DOF+0에서의 체중으로 반복하였다. 어미 돼지당 새끼 돼지의 체중 데이터는 서술적으로 요약하였다.

새끼 돼지의 임상 관찰

연구일 DOF+1과 DOF+20사이에 적어도 한번의 양성 소견을 나타내는 한배당 새끼 돼지의 비율을 계산하고 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 그룹간 비교를 위한 단일값으로 사용하였다. 데이터는 완전무작위설계구조를 가정하여 분석하였다.

결과

어미 돼지생식능

분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 평균비(건강한+허약한+압사한 새끼 돼지)는 시험처리군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 54.4%, 75.1%, 72.3% 및 93%로 나타났다. 저역군과 고역가군은 시험처리 대조군에 비하여 분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 비율이 유의적으로 더 높았다(p≤0.0455). 분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 평균수는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 6.5, 8.3, 8.6 및 10.8로 나타났다. 분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 수에 있어서 그룹간 유의적인 차이는 검출되지 않았다(p≥0.1039).

한배당 건강한 생존 새끼 돼지의 평균비는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 41.4%, 65.8%, 67.9% 및 93%로 나타났다. 저역가군과 고역가군은 시험처리 대조군에 비하여 분만시 한배당 건강한 생존 새끼 돼지의 비율이 유의적으로 더 높았다(p≥0.0138). 분만시 한배당 건강한 생존 새끼 돼지의 평균수는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 4.9, 7.2, 8.1 및 10.8로 나타났다. 고역가군은 분만시 한배당 건강한 생존 새끼 돼지에서 유의적으로 더 높은 수를 나타낸 한편(p=0.0211), 저역가군은 시험처리 대조군과 비교하여 차이가 검출되지 않았다(p=0.0640).

분만시 한배당 허약한 생존 새끼 돼지의 평균비는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 7.4%, 7.1%, 0.4% 및 0.0%로 나타났다. 분만시 한배당 허약한 생존 새끼 돼지의 평균수는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 0.9, 0.8, 0.1 및 0.0으로 나타났다. 고역가군은 시험처리 대조군에 비하여 한배당 허약한 생존 새끼 돼지의 비율 및 수에서 유의적으로 더 낮았다(p≤0.0090). 대조적으로, 저역가군과 시험처리 대조군사이에서 분만시 허약한 생존 새끼 돼지의 비율 또는 수는 차이가 검출되지 않았다(p≥0.8569).

분만시 한배당 미이라변성 태아의 평균비는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 28.1%, 14.1%, 8.7% 및 0.0%로 나타났다. 분만시 한배당 미이라변성 태아의 평균수는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 3.1, 1.6, 0.9 및 0.0으로 나타났다. 저역가군과 고역가군 모두는 시험처리 대조군에 비하여 한배당 미이라변성 태아의 비율 및 수에서 유의적으로 더 낮았다(p≤0.0190).

분만시 한배당 사산새끼 돼지 또는 압사한 사망 새끼 돼지의 비율 또는 수에서 두 백신군과 시험처리 대조군간에 유의적인 차이가 검출되지 않았다(p≥0.1681).

DOF에서의 그룹별 생식능 결과(한배당 새끼 돼지% 및 한배당 새끼 돼지수)가 아래 표 6.12 및 6.13에 요약되어 있다.

[표 6.12]

[표 6.13]

DOF+20에서의 생존 새끼 돼지

이들 점수는 이유시(20일령) 생존 새끼 돼지의 수를 나타낸다. DOF+20에서의 한배당 생존 새끼 돼지의 그룹별 비율 및 수는 상기 표 6.12 및 6.13에 요약되어 있다.

이유시(DOF+20) 한배당 생존 새끼 돼지의 평균비는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 43.6%, 73.8%, 83.8% 및 100.0%로 나타났다. 이유시 한배당 생존 새끼 돼지의 평균수는 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 경우 각각 2.9, 6.2, 6.9 및 10.8로 나타났다. 저역가군과 고역가군 모두는 시험처리 대조군에 비하여 이유시(DOF+20) 한배당 생존 새끼 돼지의 비율 및 수가 유의적으로 더 높았다(p≤0.0203).

어미 돼지 qPCR 바이러스혈증

모든 어미 돼지는 D0에서 PRRSv RNA에 대해 qPCR 음성으로 나타났다. 모든 시험처리 대조군 및 음성 대조군 어미 돼지는 시험처리 당일(D118)을 포함한 날까지 PRRSv RNA에 대해 qPCR 음성을 유지하였다. 음성 대조군은 DOF+7에 "양성"으로 나타난 어미 돼지 108번을 제외하고 연구 잔여일 동안 qPCR 음성을 유지하였다. 어미 돼지 108번은 qPCR 검정에서 PRRSv RNA에 대해 다른 시점에서 음성으로 나타났다.

백신접종 후 D7에서 저역가 어미 돼지의 50%와 고역가 어미 돼지의 36%는 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타냈다(p≤0.0007). D14 내지 D56에, 저역가 어미 돼지의 단지 4%만이 qPCR 양성을 유지한 한편, 고역가 어미 돼지는 4%까지가 이 관찰기간 동안에 간헐적으로 qPCR 양성을 나타냈다. D14 내지 D56에서 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성인 어미 돼지의 비율이 백신군과 시험처리 대조군사이에 차이가 검출되지 않았다(p=1.0000 또는 검정이 수행되지 않음). 모든 백신접종 모균은 D84 및 D118에(시험처리일) PRRSv RNA에 대해 qPCR 음성을 나타냈다.

시험처리 후 D125, DOF 0 및 DOF+13에서 저역가군 및 고역가군은 시험처리 대조군에 비하여 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타내는 어미 돼지의 비율이 통계상 더 낮았다(p≤0.0155). D132에서 저역가군은 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타내는 어미 돼지의 비율이 유의적으로 더 낮은 한편(p=0.0290), 고역가군과 시험처리 대조군간에는 통계상 차이가 검출되지 않았다(p=0.1556). DOF+7 및 DOF+20에서 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타내는 어미 돼지의 비율은 백신군과 시험처리 대조군사이에 유의적인 차이가 검출되지 않았다.

D7 내지 DOF+20에서 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타내는 어미 돼지의 그룹별 비율이 아래 표 6.14 및 6.15에 요약되어 있다.

[표 6.14]

[표 6.15]

D7에 양 백신군은 시험처리 대조군에 비하여 중앙 바이러스 농도가 유의적으로 더 높았다(P≤0.0007). D14 내지 D56에서 백신군과 시험처리 대조군은 바이러스 농도에서 차이가 검출되지 않았다(P=1.0000). 모든 백신접종 어미 돼지는 D84 및 D118(시험처리일)에서 바이러스 농도가 0이었다.

시험처리 후 D125, DOF 0 및 DOF+13에서 저역가군과 고역가군은 시험처리 대조군에 비하여 중앙 바이러스 농도가 통계상 더 낮았다(P≤0.0155). D132에 저역가군은 유의적으로 더 낮은 중앙 바이러스 농도(P=0.0230)를 나타낸 한편, 고역가군과 시험처리 대조군간에는 통계상 차이가 검출되지 않았다(각각 0.94 및 1.97 log₁₀GE/mL; P=0.1144). DOF+7 및 DOF+20에 바이러스 농도는 백신군과 시험처리 대조군사이에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(P≥0.1719)

D7 내지 DOF+20에서의 그룹별 평균 어미 돼지 qPCR GE/mL 결과가 아래 표 6.16 및 6.17에 요약되어 있다.

[표 6.16]

[표 6.17]

시험처리 후 어미 돼지 임상 관찰 점수

시험처리 대조군의 25%, 저역가군의 25%, 고역가군의 38% 및 음성 대조군의 60%는 D116 내지 DOF+20중 적어도 한 날에서 임상 질환을 나타냈다. D116 내지 DOF+20에서 임상 질환에 대해 양성인 어미 돼지의 빈도는 백신군과 시험처리 대조군간에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(P≥0.7043).

D116 내지 DOF+20중 적어도 한 날에서 임상 질환에 대해 양성인(>0의 임상 관찰점수) 어미 돼지의 그룹별 비율이 아래 표 6.18에 요약되어 있다.

[표 6.18]

어미 돼지 PRRS ELISA 혈청검사

모든 어미 돼지는 D0 및 D7에서 PRRS 혈청음성을 나타냈다. 모든 시험처리 대조군 및 음성 대조군 어미 돼지는 시험처리당일(D118)을 포함하여 이 날까지 PRRS 혈청음성을 유지한 한편, 음성 대조군은 연구 잔여일 동안(DOF+20) PRRS 혈청음성을 유지하였다.

D14에 저역가 어미 돼지의 18% 및 고역가 어미 돼지의 21%는 PRRS 혈청양성을 나타냈다. 고역가군은 D14에서 PRRS 혈청양성 어미 돼지의 비율이 유의적으로 더 높은 한편(P=0.0232), 저역가군과 시험처리 대조군간에는 차이가 검출되지 않았다(P=0.0515). 이들 비율은 D56에서 저역가군의 경우 65%의 최고값에, 고역가군의 경우 60%의 최고값에 도달하였다(P<0.0001). 시험처리일(D118)에 저역가 어미 돼지의 56% 및 고역가 어미 돼지의 50%는 PRRS 혈청양성을 나타냈다(P≤0.0024). D125에서는 시험처리 대조군 어미 돼지의 6%, 저역가 어미 돼지의 88% 및 고역가 어미 돼지의 100%가 PRRS 혈청양성을 나타냈으며, 백신군과 시험처리 대조군간의 차이는 유의적이었다(P<0.0001). D125 이후, 모든 잔여 시험처리 대조군 어미 돼지, 저역가 어미 돼지 및 고역가 어미 돼지는 연구 잔여일 동안 PRRS 혈청양성을 나타냈다(검정이 수행되지 않음).

D14 내지 DOF+20에서의 그룹별 PRRS ELISA 혈청검사 결과는 아래 표 6.19 및 6.20에 요약되어 있다.

[표 6.19]

[표 6.20]

백신접종 후 어미 돼지 평가

D1 내지 D21에서 어떠한 그룹에서도 이상 평가는 검출되지 않았고 검정이 수행되지 않았다. D1 내지 D113의 적어도 한 날에서, 시험처리 대조군 어미 돼지의 4%, 저역가 어미 돼지의 4%, 고역가 어미 돼지의 0% 및 음성 대조군 어미 돼지의 10%가 이상 평가를 나타냈다. D1 내지 D113에서 백신군과 시험처리 대조군간에 이상 평가의 유의적 차이는 검출되지 않았다(P=1.0000).

개별적으로, 109번(시험처리 대조군)은 D85에서 우측 뒷다리의 파행을 나타냈고, 12번(저역가군)은 D78 내지 D89에서 좌측 경부에서 종창을 나타냈으며, 21번(음성 대조군)은 D81 내지 D83에서 파행을 나타냈다.

D1 내지 D21중 적어도 한 날 및 D1 내지 D113중 적어도 한 날 동안 이상 평가를 나타낸 어미 돼지의 그룹별 비율이 아래 표 6.21에 요약되어 있다.

[표 6.21]

새끼 돼지 임상 관찰 점수

DOF+1 내지 DOF+20중 적어도 한 날 동안 임상 질환에 대해 양성을 나타내는(>0의 임상 관찰 점수) 한배당 새끼 돼지의 평균비가 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군은 각각 91.6%, 32.5%, 33.4% 및 3.2%였다. 저역가군 및 고역가군은 대조군에 비하여 DOF+1 내지 DOF+20중 적어도 한 날 동안 임상 질환에 대해 양성을 나타내는 한배당 새끼 돼지의 평균비가 유의적으로 더 낮았다(P≤0.0001).

DOF+1 내지 DOF+20중 적어도 한 날 동안 임상 질환에 대해 양성을 나타내는(>0의 임상 관찰 점수) 한배당 새끼 돼지의 그룹별 평균비는 아래 표 6.22에 요약되어 있다.

[표 6.22]

새끼 돼지 혈청/체액 qPCR 결과

DOF 0에서 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군은 각각 한배당 새끼 돼지의 평균 86.3%, 58.1%, 55.0% 및 0%가 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타냈다. 저역가군 및 고역가군은 DOF 0에서 시험처리 대조군에 비하여 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타내는 한배당 새끼 돼지의 비율이 통계상 더 낮았다(P≤0.0381). DOF+7에서도, 저역가군 및 고역가군은 시험처리 대조군에 비하여 PRRSv RNA에 대해 qPCR 양성을 나타내는 한배당 새끼 돼지의 비율이 통계상 더 낮았다(P≤0.0293). DOF+13에서 저역가군만이 pPCR 양성을 나타내는 한배당 새끼 돼지의 비율이 유의적으로 더 낮은 한편(P=0.0216), 고역가군과 시험처리 대조군사이에서는 pPCR 양성을 나타내는 한배당 새끼 돼지의 비율에서 유의적 차이가 검출되지 않았다(P=0.0860). DOF+20에서는 그룹간에 유의적 차이가 검출되지 않았다(P≥0.0614).

한배당 혈청/체액 qPCR PRRSv 양성 새끼 돼지의 그룹별 비율이 아래 표 6.23에 요약되어 있다.

[표 6.23]

고역가군은 DOF 0에서 시험처리 대조군에 비하여 유의적으로 더 낮은 중앙 qPCR 결과를 나타낸 한편(P=0.0030), 저역가군과 시험처리 대조군간에는 차이가 검출되지 않았다(P=0.0620). DOF+7, DOF+13 및 DOF+20에서, 두 백신군은 시험처리 대조군에 비하여 유의적으로 더 낮은 qPCR 중앙값을 나타냈다(P≤0.0122).

어미 돼지당 그룹별 새끼 돼지 혈청/체액 qPCR GE/mL 결과가 아래 표 6.24에 요약되어 있다.

[표 6.24]

새끼 돼지 ADWG

DOF 0에서 그룹간에 LS 평균 체중의 차이는 검출되지 않았다(P≥0.2972). 두 백신군은 DOF+20에서 시험처리 대조군에 비하여 더 높은 최소 제곱 평균 체중을 나타냈고(P<0.0028), 분석에서 DOF 0 체중을 공변량으로 적용하거나 적용하지 않았다.

시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군은 DOF 0 내지 DOF+20에서의 평균 ADWG가 각각 0.1 kg/일, 0.2 kg/일, 0.2 kg/일 및 0.2 kg/일이었다. 두 백신군은 시험처리 대조군에 비하여 ADWG가 유의적으로 더 높았고(P<0.0028), 분석에서 DOF 0 체중을 공변량으로 적용하거나 적용하지 않았다.

그룹별 DOF 0 및 DOF+20 새끼 돼지 체중 및 DOF 0 내지 DOF+20 ADWG(kg/일)이 아래 표 6.25 및 6.26에 요약되어 있다.

[표 6.25]

[표 6.26]

새끼 돼지 부검 관찰 및 진단

분만시 사산새끼 돼지, 미이라변성 태아 또는 압사한 새끼 돼지로 기록된 태아는 부검에서 8마리 태아를 제외하고 정확히 분류된 것으로 확인되었다. 2마리 시험처리 대조군 태아는 압사한 새끼 돼지(1-C1, 79-C2)으로 기록되었으나, 두 태아의 부검 결과 폐가 팽창하지 않은 것으로 드러났고 이는 태아가 호흡하지 않았음을 가리킨다. 한 마리 저역가 태아는 사산새끼 돼지(85-S2)로 기록되었으나 부검 결과 폐가 팽창한 것으로 나타났고 이는 새끼 돼지가 출생시 생존해 있었음을 가리킨다. 3마리 고역가 새끼 돼지는 압사한 새끼 돼지(36-C1, 36-C2, 65-C1)으로 기록되었으나 부검 결과 두 태아에서 폐가 팽창하지 않은 것으로 나타났고 이는 태아가 호흡하지 않았음을 가리킨다. 분만시 부정확하게 기록된 태아의 적은 수로 인해, 어미 돼지능 분석에 변화가 없었다.

한 마리 시험처리 대조군 새끼 돼지 102-428은 사망하였고 이후 채혈하고 부검으로 확인하였다.

새끼 돼지 폐 qPCR 결과

부검된 태아 및 사망 새끼 돼지로부터 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 평균 폐 qPCR 결과는 각각 4.68, 4.09, 3.55 및 0.0 log₁₀GE/mL로 나타났다. 이들 데이터에 대한 통계분석은 실시하지 않았다.

그룹별 폐 PRRSv qPCR 결과(log₁₀GE/mL)가 아래 표 6.27에 요약되어 있다.

[표 6.27]

논의/결론

연구 목적을 달성하기 위해, PRRS 감염성 어미 돼지의 4개 그룹이 D0에서 연구 설계에 포함되었다: 대조 물질이 투여된 시험처리 대조군(그룹 1); 1 x 10^2.43TCID₅₀의 PRRS 94881 MLV가 투여된 저역가 백신군(IVP 1번, 그룹 2); 1 x 10^3.90TCID₅₀의 PRRS 94881 MLV가 투여된 저역가 백신군(IVP 2번, 그룹 3); 및 대조 물질이 또한 투여된 음성 대조군(그룹 4). 각 처리는 교배(D0) 약 28일전에 2.0 mL 용량으로 근육내 투여되었다.

PRRS 94881 MLV의 최소면역용량을 결정하기 위하여, 두 백신 역가군 및 시험처리 대조군을 D118(임신 약 90일)에 PRRSv의 이종 유럽형 분리체(분리체 190136)로 시험처리하고 출생시(분말일, DOF) 한배당 생존 새끼 돼지의 비율 및 수 및 출생 후 21일째(DOF+21)에 한배당 생존 새끼 돼지의 비율 및 수를 평가하였다.

연구 타당성 검증(음성 대조군 4)

공급된 어미 돼지가 PRRSv에 감염되지 않았고 외부 PRRSv 노출 또는 처리군과 대조군사이에 교차감염이 연구 기간에 발생하지 않았음을 보장하기 위하여, 음성 대조군(그룹 4)가 연구 설계에 포함되었다. 음성 대조군 어미 돼지는 연구 기간내내 PRRS 항체가 음성으로 나타났다. 추가로, 이 그룹의 어미 돼지와 이의 새끼 돼지는 DOF+7에서 108번을 제외하고 모든 검정 시점에서 PRRSv 바이러스혈증(qPCR)이 음성으로 나타났다. 어미 돼지 108번은 DOF+7에서 양성을 나타낸 한편 모든 다른 시점에서는 qPCR 음성이었고 이의 새끼 돼지들 또한 PRRSv RNA가 음성으로 나타났다. 이 결과는 PRRSv 감염 때문이 아니라 샘플 감염으로 인해 오류로 고려되었다. 이들 결과는 음성 대조군이 연구 기간 동안에 PRRS로부터 계속 무감염 상태를 유지하였음을 지지하며 본 임상의 타당성을 검증한다.

PRRSv 생식 시험처리 모델(시험처리 대조군 1)의 타당성 검증

충분하게 재현가능한 PRRS 임상 질환을 유도하는 PRRSv의 맹독성 유럽형 스트레인을 포함한 시험처리 모델이 실험세팅에서 PRRS 백신 효능을 적절히 평가하는데 필요하다. 유럽형 PRRS 분리체 190136(1 x 10^6.30TCID₅₀/6mL)의 접종 후 시험처리 대조군은 출생시 한배당 생존 새끼 돼지 불과 54.4%(음성 대조군의 경우 93.0%), 한배당 사산새끼 돼지 17.5% 및 미이라변성 태아 28.1%(음성 대조군의 경우 각각 7.0% 및 0.0%) 을 나타냈고, DOF+1 내지 DOF+20중 적어도 한 날동안 한배당 새끼 돼지 91.6%가 임상질환을 나타냈으며(음성 대조군의 경우 한배당 새끼 돼지 3.2%), 출생 후 20일에서 한배당 생존 새끼 돼지가 평균 2.9마리였고(음성 대조군의 경우 평균 10.8마리), 출생시 바이러스혈증을 나타내는 한배당 새끼 돼지가 86.3%이었다(음성 대조군의 경우 0%). 이들 결과는 중증의 PRRS-특이적 임상 질환이 비백신접종된 시험처리 대조군의 어미 돼지 및 이의 새끼 돼지에서 유도되었음을 가리키며 이에 따라 시험처리 모델을 PRRS 백신 효능 및 보다 특정적으로는 어미 돼지에 대한 PRRS 94881 MLV의 MID를 평가하는데 적절한 임상 실험 도구로서 검증하였다.

어미 돼지에 대한 PRRS 94881 MLV의 최소면역용량 결정(저역가 및 고역가 백신용량; 그룹 2 및 3)

어미 돼지에 대한 PRRS 94881 MLV의 MID 결정은 시험처리 대조군에 비하여 출생시 한배당 생존 새끼 돼지의 보다 높은 비율 또는 수 및 시험처리 후 20일령의 한배당 생존 새끼 돼지의 보다 높은 비율 또는 수를 유도하는 최저 역가의 백신이 접종된 백신군을 기초로 이루어졌다.

분만시 한배당 생존 새끼 돼지(비율 또는 수)은 PRRS 94881 MLV의 MID를 결정하는 두 가지 핵심 기준중 하나로서 선택되었다. 첫번째 핵심 기준은 임신한 돼지 및 어미 돼지의 PRRSv 감염이 전형적으로 분만시 생존 새끼 돼지의 낮은 수와 함께 사산새끼 돼지 및 미이라변성 태아를 유도한다는 사실에 근거하였다. 출생시 한배당 생존 새끼 돼지는 분만시 건강한 생존 새끼 돼지, 허약한 생존 새끼 돼지와 압사한 새끼 돼지의 총수로서 정의되었다. 압사한 것으로 기록된 새끼 돼지는 부검 소견에서 이들 새끼 돼지가 출생시 생존해 있거나 이후 외상으로 곧 사망하였기 때문에 "생존" 범주에 포함되었다. 저역가군과 고역가군 모두는 시험처리 대조군에 비하여 분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 비율이 유의적으로 더 높게 나타났으며(P≤0.0455), 이에 따라 백신 효능에 대한 이 기준은 충족되었다. 비록 분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 평균수에 있어서 저역가 및 고역가 백신군과 시험처리 대조군사이에 유의적 차이가 검출되지 않았지만(P≥0.1857), 저역가군과 고역가군은 시험처리 대조군(한배당 평균 6.5마리 새끼 돼지)에 비하여 분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 평균수가 상당히 더 높게 나타났으며(각각 한배당 평균 8.3 및 8.6 마리 새끼 돼지), 이에 따라 유익한 백신 처리 효과가 시험처리 후 이들 동물에서 관찰되었음을 추가로 증명하거나 지지한다.

생후 20일째의 한배당 생존 새끼 돼지(비율 또는 수)은 어미 돼지의 PRRS 면역성이 새끼 돼지의 자궁내 감염 및 어미 돼지로부터 생존 새끼 돼지로의 바이러스 확산에 영향을 미치기 때문에 PRRS 94881 MLV의 MID를 결정하는 두 번째 기준이었다. 자궁내에서 PRRS로 감염되었거나 어미 돼지로부터의 확산을 통해 분만 후 맹독성 PRRS와 함께 출생 또는 감염된 새끼 돼지는 보통 PRRS로 이어져 이유전에 사망한다. 본 연구에서, 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군은 생후 20일째에 한배당 생존 새끼 돼지의 비율이 각각 43.6%, 73.8%, 83.8% 및 100%로 나타났다(P≤0.0203). 유사하게, 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군은 생후 20일째에 한배당 생존 새끼 돼지의 수가 각각 2.9, 6.2, 6.9 및 10.8로 나타났다(P≤0.0063). 두 백신군은 이유시 생존 새끼 돼지의 비율 및 수가 유의적으로 더 높게 나타났고(P≤0.0203), 이에 따라 본 연구 목적의 이 기준은 충족되었다.

분만 데이터의 추가 분석으로 PRRSv 시험처리 후 백신 효능을 지지하는 더 많은 정보가 밝혀졌으며, 특히 고역가군의 경우 그러했다. 고역가군은 시험처리 대조군과 비교하여 생후 건강한 새끼 돼지에서 통계상 더 높은 비율 및 더 높은 평균수를 나타낸 한편(P≤0.0211) 허약하고 미이라변성 태아에서는 유의적으로 더 낮은 비율 및 평균수를 나타냈다(P≤0.0090). 이들 데이터는 고 백신 용량이 맹독성이고 이종인 PRRSv 시험처리 스트레인에 대해 방어 면역성을 유도하였음을 지지한다. 저역가군 또한 한배당 건강한 생존 새끼 돼지의 보다 높은 비율(P=0.0138) 및 미이라변성 태아의 유의적으로 더 낮은 비율 및 평균수(P≤0.0190)로부터 명백한 바와 같이 분만시 백신 효능을 나타냈다. 대조적으로, 분만시 사산태아 또는 압사한 태아의 비율 또는 수에 있어서 그룹간 차이는 없는 것으로 검출되었다(P≥0.1681).

시험처리 후 7일째에(D125), 저역가군 및 고역가군은 시험처리 대조군과 비교하여 qPRC 검정에서 PRRSv RNA가 양성으로 나타나는 어미 돼지의 비율이 유의적으로 더 낮았을 뿐만 아니라 양 그룹에 대한 바이러스 농도도 유의적으로 더 낮았다(P≤0.0001). 이들 데이터는 두 백신 용량 수준이 시험처리 후 어미 돼지에 적절한 면역성을 유도하여 바이러스 복제를 유의적으로 낮추었음을 추가로 지지한다. 유사하게, 저역가군 및 고역가군은 DOF 0 및 DOF+13에 pPCR 양성인 어미 돼지의 비율이 유의적으로 더 낮았을 뿐만 아니라 이들 연구일에서 양 그룹에 대한 바이러스 농도도 더 낮았다(P≤0.0155). 저역가군은 D132에서 qPCR 양성인 어미 돼지의 비율 및 바이러스 농도가 유의적으로 더 낮은 한편(P≤0.0290) 이들 변수에 있어서 고역가군과 시험처리 대조군간에 통계상 차이는 검출되지 않았다(P≥0.1144). DOF+7 및 DOF+20에 qPCR 양성인 어미 돼지의 비율 및 바이러스 농도에서 백신군과 시험처리 대조군간에 통계상 차이는 검출되지 않았다(P≥0.1719).

전형적으로, PRRSv는 암컷 돼지에서 유산 이외에 다른 임상 질환을 발생하지 않는다. 본 연구에서, 시험처리 대조군 어미 돼지의 25%, 저역가 모든의 25%, 고역가 어미 돼지의 38% 및 음성 대조군 어미 돼지의 60%는 시험처리 후 적어도 하루 동안 임상 질환을 나타냈다(임상 관찰 점수를 >0 받음). D116 내지 DOF+20중 적어도 한 날 동안 임상 질환을 앓고 있는 어미 돼지의 비율에서 백신군과 시험처리 대조군간에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(P≥0.7043). 몇 가지 유형의 임상 질환을 나타낸 모균은 발정기간에 이러한 질환을 앓았고 시험처리 후 즉시 없어졌다. 임상 질환을 나타낸 음성 대조군 모균의 고비율(60%) 및 본 연구에서 임상 질환은 모든 그룹에서 분만시점에 주로 나타났다는 사실은 임상 질환이 PRRS 질환이라기 보다는 분만과 연관된 생리변화에 의한 것임을 지지한다.

본 연구의 모든 어미 돼지는 D0에서 PRRS ESISA 혈청음성으로 나타났으며, 이에 따라 연구에 등록한 피검동물에 선정 기준이 확증되었다. 마찬가지로, 모든 어미 돼지는 D7에 PRRS ELISA 혈청음성으로 나타났다. 백신접종된 어미 돼지는 D14에 PRRS ELISA 혈청양성 결과를 나타내기 시작하였고 저용량군 및 고용량군은 D56에 각각 65% 및 60%의 최고의 혈청전환율을 나타냈다(P<0.0001). 대조적으로, 시험처리 대조군은 시험처리 후 7일까지(D125) PRRS ELISA 혈청음성을 유지하였다. D132부터 연구종료시까지, 모든 저역가 어미 돼지, 고역가 어미 돼지 및 시험처리 대조군 어미 돼지는 PRRS ELISA 혈청양성으로 나타났다. 백신접종 후 바이러스혈증 양성 어미 돼지의 비율은 저역가군 및 고역가군에서 각각 50% 및 36%로 나타난 바와 같이 두 백신군에 D7에서 최고치로 나타났다(P≤0.0007). 바이러스혈증은 D14에 저역가군 및 고역가군에서 각각 4%(28마리 중 1마리, 64번) 및 0%(28마리 중 0마리)로 급속히 떨어졌다(P=1.0000 또는 검정이 수행되지 않음). 바이러스혈증은 D21에 저역가군(28마리 중 1마리, 56번) 및 고역가군(28마리 중 1마리, 91번)의 경우 4%로 유지되었다. D56에서 26마리 저역가 어미 돼지 중 한 마리(4%, 89번) 및 25마리 고역가 어미 돼지(4%, 66번)중 한 마리가 바이러스혈증 양성을 나타냈다. 모든 어미 돼지는 D84 및 D118에서 바이러스혈증이 음성으로 나타났다.

D1 내지 D113중 적어도 한 날 동안 이상 임상 평가와 함께 백신접종 후 그룹당 어미 돼지의 비율에 있어서 두 백신 역가군과 시험처리 대조군간에 유의적인 차이가 검출되지 않았다(P=1.0000). 개별적으로, 단지 3마리 어미 돼지가 이 기간 동안에 임의의 이상 평가를 나타냈다. 2마리 어미 돼지는 파행을 나타냈고(한 마리는 시험처리 대조군 어미 돼지가고 다른 한 마리는 음성 대조군 어미 돼지가다) 한 마리 저역가 어미 돼지는 좌측경부에 종창을 나타냈다. 백신을 우측경부에 투여한 이후로 이 백신과 연관된 부작용은 전혀 관찰되지 않았다.

DOF에서의 새끼 돼지 PRRS 바이러스혈증 결과는 새끼 돼지의 태반횡단 감염을 예방하는데 필요한 어미 돼지에서의 예방량에 대해 추가 정보를 제공하였다. DOF에서 저역가군 및 고역가군의 경우 각각 어미 돼지당 평균 58.1% 및 55.0%의 새끼 돼지가 qPCR 양성으로 나타났다. 대조적으로, 시험처리 대조군에서 어미 돼지당 평균 86.3%의 새끼 돼지가 혈청/체액에서 qPCR 양성으로 나타났으며, 이는 두 백신군보다 유의적으로 더 높았다(P≤0.0381). DOF 0에서 새끼 돼지의 바이러스 농도를 검사하였을 때, 고역가 새끼 돼지는 시험처리 대조군 새끼 돼지에 비하여 유의적으로 더 낮은 바이러스 농도를 나타낸 한편(P=0.0030), 저역가 새끼 돼지와 시험처리 대조군 새끼 돼지간에 바이러스 농도의 차이는 검출되지 않았다(P=0.0620). 바이러스혈증이 양성인 어미 돼지당 새끼 돼지의 비율에서 유의적인 감소(P≤0.05)는 EU PRRS 94881 MLV의 어느 한 용량으로 면역화되었을 때 백신접종 어미 돼지로부터 새끼 돼지로의 맹독성 PRRSv의 수직 전파 감소를 가리킨다. 추가로, 고역가군은 DOF에서 어미 돼지당 qPCR 새끼 돼지 중앙값이 3.00 log₁₀GE/mL로 나타난 한편, 시험처리 대조군은 혈청/체액에서 6.40 log₁₀GE/mL의 어미 돼지당 qPCR 새끼 돼지 중앙값을 나타냈다(P=0.0030). DOF에서의 새끼 돼지 바이러스 농도에서 저용량군과 시험처리 대조군간에 유의적인 차이는 검출되지 않았다(P=0.0620). 이 데이터는 고용량의 PRRS 94881 MLV가 암컷 돼지에 투여되었을 때의 효능을 추가로 지지한다.

저역가군 및 고역가군은 DOF+1 내지 DOF+20중 적어도 한 날 동안 임상 질환을 앓고 있는 한배당 새끼 돼지(임상 관찰 점수가 >0)의 평균 비율이 각각 32.5% 및 33.4%로 나타났다. 이들 결과는 동일한 매개변수에서 한배당 새끼 돼지의 평균 비율이 91.6%로 나타난 시험처리 대조군(P≤0.0001)보다 유의적으로 더 낮았으며, 이것은 두 용량 수준의 백신 효능을 지지한다.

DOF 0에서의 새끼 돼지 평균 체중은 그룹간에 유의적인 차이가 검출되지 않은 한편(P≥0.2972), 두 백신군은 DOF+20에서 유의적으로 더 높은 체중을, DOF 0 내지 DOF+20에서 유의적으로 더 높은 ADWG를 나타냈다(P≤0.0028). 또 다시 이들 결과는 PRRS 94881 MLV의 양 용량의 효능을 지지한다.

부검 결과는 분만시 거의 모든 태아의 정확한 분류를 확증하였다. 실제로 사산 새끼 돼지나 압사한 새끼 돼지로 기록된 태아 및 분만시 실제로 압사한 새끼 돼지나 사산새끼 돼지로 기록된 태아는 분만시 정확하게 분류된 태아의 총수에 비해 극히 소수이기 때문에, 어미 돼지능이 분석되기 전에 이에 이루어진 변화는 없었다. 한 마리의 시험처리 대조군 새끼 돼지는 사망하였고 이후 채혈하였다. 이러한 상황은 시험처리 대조군의 많은 새끼 돼지 수에 비하여 불과 한 마리 새끼 돼지에서 발생된 것이어서 이 새끼 돼지를 분석에서 배제하지는 않았다.

시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 새끼 돼지 중에서 사망태아 각각 141마리, 79마리, 75마리 및 4마리로부터 폐 샘플을 채취하였다. 시험처리 대조군, 저역가군, 고역가군 및 음성 대조군의 평균 qPCR 폐 값은 각각 4.68, 4.10, 3.55 및 0.00 log₁₀GE/mL로 결정되었다. 생후 20일째에 생존한 새끼 돼지는 부검하지 않았기 때문에 이들 데이터에 대해 분석은 수행하지 않았으나, 이들 결과는 어미 돼지가 맹독성 94881 PRRSv로 시험처리되었을 때 PRRS 94881 MLV로 백신접종된 어미 돼지가 새끼 돼지의 폐에서 더 낮은 바이러스 농도를 유도하였음을 가리킨다.

결론적으로, 본 연구의 결과로부터, 시험처리 대조군에 비하여 두 백신군에서 분만시 한배당 생존 새끼 돼지의 유의적으로 더 높은 비율(P≤0.0455) 및 이유시 한배당 새끼 돼지의 더 높은 비율 및 수(P≤0.0203)가 증명되었다. 따라서, 연구 목적은 충족되었고 본 연구의 데이터는 어미 돼지에 대한 PRRS 94881 MLV의 MID를 1 x 10^2.43TCID₅₀/2 mL로 설정한다. 이들 결과는 백신접종 후 118일 경과하여 달성하였고 추가로 어미 돼지에서의 면역지속기간(DOI)을 약 4개월로 설정한다.

보조 데이터를 검사하였을 때 PRRS 94881 MLV의 고용량(1 x 10^3.90TCID₅₀/2 mL)은 분만시 어미 돼지당 건강한 새끼 돼지의 보다 높은 비율 및 수(P≤0.0211), 허약하고 미이라변성 태아의 보다 낮은 비율 및 수(P≤0.0090), D125, DOF 0 및 DOF+13에서 시험처리 후 qPCR 양성 어미 돼지의 보다 낮은 비율 및 어미 돼지의 보다 낮은 바이러스 농도(P≤0.0155), DOF 0에서 qPCR 양성인 어미 돼지당 새끼 돼지의 보다 낮은 비율 및 보다 낮은 새끼 돼지 바이러스 농도(P≤0.0030), 임상 질환을 앓고 있는 어미 돼지당 새끼 돼지의 보다 낮은 비율(P<0.0001) 및 DOF+20에서 보다 높은 새끼 돼지 체중 및 ADWG(P<0.0013)와 상관성이 있었다.

저용량군은 분만시 어미 돼지당 건강한 새끼 돼지의 보다 높은 비율(P=0.0138), 미이라변성 태아의 보다 낮은 비율 및 수(P≤0.0190), D125, D132, DOF 0 및 DOF+13에서 시험처리 후 qPCR 양성 어미 돼지의 보다 낮은 비율 및 어미 돼지의 보다 낮은 바이러스 농도(P≤0.0290), DOF 0에서 qPCR 양성인 어미 돼지당 새끼 돼지의 보다 낮은 비율(P=0.0381), 임상 질환을 앓고 있는 어미 돼지당 새끼 돼지의 보다 낮은 비율(P<0.0001) 및 DOF+20에서 보다 높은 새끼 돼지 체중 및 ADWG(P<0.0028)와 상관성이 있었다.

실시예 7 PRRS 94881 MLV 접종 후 2주째에 PRRS의 이종 유럽형 분리체로 시험처리한 후 감염성 새끼 돼지에서의 면역발생에 대한 평가

이 백신접종-시험처리 연구의 목적은 14±3일령의 감염성 새끼 돼지에 백신 후보 돼지 생식기 호흡기 증후군 유럽형 분리체 94881 변형된 생백신(PRRS 94881 MLV)를 투여한 후 2주 경과하여 면역발생(OOI)을 평가하는데 있었다. 백신접종 후 2주째의 OOI를 충족하는 일차적인 효능 기준은 백신접종군(그룹 1)이 비백신접종된 시험처리 대조군(그룹 2)에 비하여 시험처리 후 폐 병변에서 유의적인 차이를(p≤0.05) 증명했는지의 여부였다. 이차적인 매개변수로는 백신접종 후 임상 평가, 시험처리 후 임상 관찰, 직장 온도, 평균 1일 체중 증가, 혈청 샘플중의 PRRS 항체 및 바이러스혈증의 평가 및 부검에서 채취된 폐 샘플중의 PRRS 바이러스의 정량이 포함되었다.

새끼 돼지들은 그룹 1(1 x 10^3.82TCID₅₀/mL을 함유한 PRRS 94881 MLV 및 시험처리됨; n=20), 그룹 2(위약 백신 및 시험처리됨; n=20) 또는 그룹 3(위약 백신 및 미시험처리됨; n=10)에 무작위로 배정되었다. 새끼 돼지는 올림바닥으로 된 플라스틱 돼지실에 수용하였다(n=5/돼지실). 각 처리군은 에어로졸화를 포함한 역학적 경로를 통한 PRRSv의 전파를 방지하기 위하여 다른 돼지실에 수용하였다.

본 연구에 배정된 모든 동물은 본 연구를 이수하였다. 본 연구 동안에 보고된 이상반응은 없었다. D24에서의 폐 병변 평균 점수는 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 경우 27.4%, 시험처리 대조군의 경우 54.8%로 나타났다. PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 폐 병변 평균 점수는 시험처리 대조군보다 유의적으로 낮았고(p=0.0002), 이에 따라 일차적인 효능 변수는 충족되었으며 OOI가 단일 백신접종 후 2주째에 형성되었다. 시험처리 대조군에 비하여 유의적으로 더 높은 비율의 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지가 D14, D17 및 D21에 양성 PRRS-항체 역가를 나타냈다(p≤0.0012). 시험처리 후 D17-D24 기간에 바이러스혈증의 평균 AUC에 있어서 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지(50.72 log₁₀GE/mL)는 시험처리 대조군(54.61 log₁₀GE/mL)에 비하여 유의적으로 더 낮았다(p=0.0039). PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지(0%)는 시험처리 후 기면 징후를 보이지 않은데 비해, 시험처리 대조군 돼지는 45%가 기면 징후를 나타냈다(p=0.0012). PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 연구의 시험처리 후 기간(SD14-SD24) 동안 시험처리 대조군에 비하여 보다 높은 체중 증가를 나타냈다(각각, 0.3 kg 및 0.1 kg; p=0.0003).

백신접종 동물에서 시험처리 후 폐 병변, 임상징후, 혈액 및 폐내 바이러스복제의 유의적인(p≤0.05) 감소뿐만 아니라 성장능의 향상은 시험처리가 백신접종 후 2주째에 수행되었을 때 맹독성 PRRSv에 대한 백신 효능을 증명한다. 따라서, 이것은 PRRS 94881 MLV의 백신접종 후 최소 2주의 면역발생의 증명을 지지한다.

연구목적

백신접종-시험처리 연구의 목적은 14±3일령의 감염성 새끼 돼지에 백신 후보 돼지 생식기 호흡기 증후군 유럽형 분리체 94881 변형된 생 바이러스(PRRS 94881 MLV)를 투여한 후 2주 경과하여 면역발생(OOI)을 평가하는데 있었다. 백신접종 후 2주째의 OOI를 충족하는 일차적인 효능 기준은 백신접종군(그룹 1)이 비백신접종된 시험처리 대조군(그룹 2)에 비하여 시험처리 후 폐 병변에서 유의적인 차이를(p≤0.05) 증명했는지의 여부였다.

백신군과 시험처리 대조군사이에 분석된 이차적인 효능 매개변수로는 백신접종 후 임상 평가, PRRS 혈청검사, 시험처리 후 PRRS 바이러스혈증, 시험처리 후 임상 관찰, 평균 1일 체중 증가(ADWG), 직장 온도 및 폐내 PRRSv 정량이 포함되었다.

임상기간 내내 공급 돼지 무리가 PRRSv으로부터 무감염 상태였고 이 임상 동안에 차단방역이 붕괴되지 않았음을 증명하기 위하여 백신접종 또는 시험처리되지 않은 음성 대조군(그룹 3)이 본 연구에 포함되었다.

사건의 스케쥴

[표 7.1]

연구 설계

[표 7.2]

맹검 기준

연구 기간 내내 연구원 및 피지명자에게 등록된 처리군에 대한 정보가 차단되었다. 이러한 맹검을 유지하기 위하여, 돼지의 평가(즉, 임상 평가, 임상 관찰 또는 부검)에 참여하지 않은 자가 임의지정을 수행하고 D0에 예정된 IVP 및 VP 처리를 투여하였다. BIVI 실험실 직원들은 각 돼지에 투여된 처리에 대해 어떠한 정보를 갖지 못한 상태에서 개별적인 업무를 수행하였다.

재료

연구용 수의 생성물(IVP) 및 대조군 생성물(CP)

[표 7.3]

[표 7.4]

시험처리 물질

[표 7.5]

처리

용량 설정근거

분류된 어미 돼지에 IVP를 1.0 ml 용량으로 투여하여 백신접종한 후 2주째에 PRRS 94881 MLV의 OOI를 평가하였다. 1.0 mL 용량의 CP를 그룹 2 및 3에 위약 백신으로서 투여하였다.

투약 요법

연구 데이터를 수집하지 않은 자가 D0에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1 인치(2.54 cm) 바늘 또는 18g x 3/4 인치(1.91 cm)을 사용하여 지정된 어미 돼지의 우측 경부에 IVP 또는 CP를 근육내 주사하였다. 투여 요법은 아래 표 7.6에 기재되어 있다.

[표 7.6]

동물 정보

연구용 동물에 대한 세부사항

[표 7.7]

선정/배제 기준

본 연구에 등록된 모든 새끼 돼지들은 PRRS ELISA 음성이었고 백신접종 시점에서의 관찰 결과 건강하였다.

어미 돼지의 선정 후 배제

본 연구로부터 배제된 돼지는 없었다.

동물 관리 및 수용시설

동물 수용시설

연구 기간에 새끼 돼지는 Veterinary Resources, Inc. (VRI)(Cambridge, IA)에 수용하였다. 그룹 1, 2 및 3은 차단방역을 보장하기 위하여 일정하지만 분리된 사육실에 수용하였다. 새끼 돼지들은 각 사육실내의 복수개의 우리에 수용되었다(5마리/우리). 그룹 1은 사육실 5의 우리 4개에 수용되었고, 그룹 2는 사육실 6의 우리 4개에 수용되었으며, 그룹 3은 사육실 4의 우리 2개에 수용되었다. 우리는 접이식 플라스틱 마루위에 스탠드로 세운 플라스틱 통으로 되어 있다. 각 우리에는 플라스틱 6개구 급식기와 니플 급수기가 구비되었다. 분리된 각 사육실은 구조가 모두 동일하였고 생물재해등급2(BL2)에 준한 설비로 헤파필터로 공조되고 항온 조절과 함께 기계적으로 환풍된다.

처리군별 분리는 PRRSv가 에어로졸화를 포함한 다양한 기전을 통해 돼지간에 쉽게 퍼진다는 것은 과학계에서 잘 알려져 있기 때문에 본 연구에서 필요하였다. 이것은 비맹독성 생 PRRS 백신이 질환을 유발하는 능력은 없지만 맹독성 야생형 PRRs의 특징을 모사하는 약독화 바이러스 입자를 포함하기 때문에 이러한 생물학적 제품을 포함한다. 차단방역이 유지되었고 백신접종 동물들이 비백신접종되었고 PRRSv 선천적 음성 대조동물을 우연히 교차오염시키지 않았음을 보장하는 적절한 방법들을 실행할 준비가 되어 있었다. 시험시설 직원은 본 연구를 위한 사육실을 사용하기 전에 각 사육실을 적절하게 청소하고 방역하는데 필요한 적절한 조치를 취하였다.

시설내 각 사육실은 충분한 공기 순환과 난방을 위해 팬과 히터를 갖추고 있다. 각 사육실의 통풍 시스템은 동일하지만 독립적이어서, 사육실간에 공기가 공유되지 않는다.

고형 사료는 무해충 낭에 저장하였다. 급수는 자유롭게 이루어졌다. 새끼 돼지에게는 해당 지역에 허용되는 축산업 실무지침에 따라 이들의 크기, 연령 및 상태에 맞게 임의로 티아물린(35 gm/ton) 및 클로르테트라사이클린(400 gm/tom)의 약물처리된 상업적 배급량으로 급식되었다.

어미 돼지는 연구원의 판정에 따라 연구 개시전에 건강 및 영양 상태가 양호하였다.

연구 기간에 특정 동물에서 약간 수척한 몸상태, 털이 거친 외모, 부어오른 관절 및 다양한 정도의 파행이 관찰되었다. 연구원은 이들 모두를 격리 수용된 어미 돼지 집단에서 흔히 발생되는 비특이적 상태로 판단하였다. 또한, 특정 돼지에서 시험처리 후 기침, 졸음, 가쁜호흡, 호흡장애 및 경미 내지 중간 정도의 무기력이 관찰되었고 이러한 징후는 병인에 있어서 다양할 수 있지만 폐렴과 연관된 전형적인 임상징후로 판단되었다. 연구원은 본 연구 기간 동안에 어떠한 동물에 대해서도 부수적인 처리가 필요치 않은 것으로 결정내렸다.

본 연구에 등록된 모든 돼지는 D24에 안락사 및 부검한 후 상업적인 화장에 의해 처리하였다. 본 연구에 등록된 동물의 사체는 절대 사람의 식품으로 유용되지 않았다.

효능 평가

백신접종 후 2주째에 PRRS 94881 MLV의 OOI를 평가하기 위하여, D14에 그룹 1 및 2를 시험처리하였고, 시험처리 후 폐 병변을 평가하였다. 만일 그룹 1(PRRS 94881 MLV의 최소면역용량)이 시험처리 대조군(그룹 2)에 비하여 유의적으로 감소된(p≤0.05) 시험처리 후 폐병리를 증명하였다면 백신접종 후 2주째의 OOI는 달성된 것이다.

백신군과 시험처리 대조군사이에 효능을 증명하기 위해 분석된 이차적인 매개변수로는 백신접종 후 임상 평가, 시험처리 후 임상 관찰, 직장 온도, 체중 및 평균 1일 체중 증가(ADWG), 혈청 샘플중의 PRRS 항체 및 바이러스혈증의 평가 및 부검에 의해 채취된 폐 샘플중의 PRRS 바이러스의 정량이 포함되었다.

공급된 돼지 무리가 PRRS에 감염되지 않았고 연구 기간 내내 차단방역이 유지되었음을 증명하기 위하여 본 연구에 시험처리되지 않은 음성 대조군(그룹 3)이 포함되었다.

유효 시험 기준

구매전 및 D0 혈청 샘플은 모두 PRRS 항체가 음성이어야 했다.

그룹 2 및 3으로부터 시험처리일까지 채취된 혈청 샘플 및 그룹 3으로부터 연구 종료시까지 채취된 혈청 샘플은 연구의 타당성을 위해 PRRS 항체가 없어야 했다.

주요 효능 매개변수

통계학적 평가를 위한 주요 효능 변수는 연구 D24에서의 폐 병변 총점이었다.

폐 병변 총점

데이터 및 샘플을 채취 및 기록한 후 24일에 모든 연구 돼지는 VRI SOP PRC1027(부록 1, 첨부 8)에 따라 안락사시켰다. 각 돼지는 VRI SOP PRC 1028에 따라 부검하였다. 흉강은 피지명자에 의해 처리되었고 심장과 폐는 제거되었다. 연구원은 폐의 각 세트를 검사하고 주지된 모든 육안병리를 기술하였으며 각 폐엽의 병리율(%)을 결정하였다. 소견 및 데이터는 부검 보고서 양식에 기록하였다. EP 식을 이용하여 각 돼지의 폐 병변 총점을 결정하였다.

보조적 매개변수

그룹 1과 그룹 2사이에 분석될 다른 매개변수로는 백신접종 후 임상 평가, PRRS 혈청검사, 백신접종 후 바이러스혈증, 시험처리 후 임상 관찰, ADWG, 직장 온도 및 시험처리 후 폐 바이러스 정량이 포함되었다. 이들 변수는 보조적 매개변수로서 분석되었으며 연구 목적을 충족하기 위한 주요 변수로 역할을 하는 것은 아니었다.

임상 평가

연구원 및 피지명자는 백신접종 후 임상 평가를 위해 모든 돼지를 표 7.1에 기재된 날짜에서 관찰하였다. 소견은 임상 평가 기록양식에 작성하였다.

PRRS 혈청검사

표 3에 기재된 날짜에 정맥 전혈을 채취하였다. 간단히 설명하면, 각 새끼 돼지로부터 약 2-5 mL의 혈액을 적당한 크기의 혈청 분리튜브(SST)로 채혈하였다. 샘플 채취결과는 샘플 채취 기록양식에 기재하였다. SST내 혈액은 실온에서 응고하도록 두었다. 혈액 샘플은 채혈 당일에 BIVI-Ames로 운반하고 샘플 운송 기록 양식을 작성하였다. BIVI-Ames 또는 VRI에서 혈액 샘플을 원심분리하여 혈청을 수확하고 분배하여 적당한 튜브로 옮겼다. 각 튜브에 새끼 돼지의 ID 번호, 연구번호, 채혈일, 연구일 및 샘플종류를 표시하였다. BIVI-Ames에서, 혈청 샘플 한조를 2 내지 8℃에 보관하였고 다른 세트의 혈청 샘플은 -70±10℃에 저장하였다.

BIVI-Ames는 0, 7, 14, 17, 21 및 24일에 채취되어 2 내지 8℃에 보관된 혈청 샘플을 PRRS 항체에 대해 검사하였다. 결과는 음성(ELISA S/P 비율이 0.4 미만) 또는 양성(ELISA S/P 비율이 0.4 이상)으로 기록하였다.

PRRS 바이러스혈증

다른 세트의 혈청 샘플을 0, 7, 14, 17, 21 및 24일에 채취하고 BIVI-Ames에서 연구 기간이 종료될 때까지 -70±10℃에 저장하였다.

작성된 샘플 운송 기록 양식이 운송물에 포함되었다. 바이오스크린은 혈청 샘플을 qPCR하여 PRRSv RNA를 검정하였다. 결과는 게놈 균등물/mL(log₁₀ GE/mL)로 보고되었다.

시험처리 후 임상 관찰

표 7.1에 기재된 날짜에 새끼 돼지의 임상 질환 징후를 관찰하였다. 관찰은 연구원 또는 피지명자에 의해 수행되어 임상 관찰 기록 양식에 기재되었다. 지정 날짜에 새끼 돼지에 의한 호흡, 행동 및 기침이 아래 표 7.8에 기재된 임상 관찰 점수체계를 기준으로 관찰되었다.

[표 7.8]

평균 1일 체중 증가(ADWG)

표 3에 기재된 날짜에 개별적인 체중을 수집하였다. 각 돼지의 체중은 연구원 또는 피지명자가 등급계량화 스케일로 쟀다. 결과는 체중 기록 양식에 kg으로 기재하였다. 평균 1일 체중 증가는 D0 내지 D14 및 D14 내지 D24에 결정하였다.

직장 온도

표 6.1에 기재된 날짜에 연구원 또는 피지명자가 직장 온도를 수집하였다. 직장 온도는 임상 관찰 기록 양식에 ℃로 기재하였다.

폐 조직내 PRRS 바이러스 정량

각 세트의 폐에 대해, 좌우정단엽, 좌우심장엽, 좌우횡격막엽 및 중간엽으로부터 2개 샘플을 채취하였다. 각각의 폐 샘플은 약 1인치(2.54 cm) x 1인치(2.54 cm) 였다. 한 세트의 폐 샘플에 대해, 좌측의 모든 세개 샘플을 한 용기에서 배합하였고, 우측의 모든 세개 샘플 및 중간 폐엽 샘플은 다른 용기에서 배합하였다. 각 용기에는 충분량의 10% 포르말린액을 충진하였다. 다른 세트의 폐 샘플에 대해, 좌측의 모든 세개 폐 샘플을 한개의 Whirlpak®에서 배합하고, 우측의 모든 세개 샘플과 중간 폐엽 샘플을 다른 Whirlpak®에서 배합하였다. 모든 용기 및 Whirlpak®에 동물번호, 연구번호, 샘플채취일, 연구일, 샘플종류 및 샘플 채취부위(좌측 또는 우측)를 적당히 표시하였다. BIVI-Ames로 운반되기까지 Whirlpak®의 폐 샘플은 드라이아이스에 저장하였고 10% 포르말린의 샘플은 실온에 저장하였다. 샘플 채취는 부검 보고 기록 양식에 기재하였다. 포르말린 고정 폐 조직 샘플 및 Whirlpak® 폐 샘플은 BIVI-Ames로 이전되었다. 작성된 샘플 운송 기록 양식이 각 샘플배송물에 포함되었다.

작성된 샘플 운송 기록 양식이 운송물에 포함되었다. 바이오스크린은 폐 샘플을 qPCR하여 PRRSv RNA를 검정하였다(부록 1, 첨부 7). 좌측 폐 조직을 균질화하고 검정하였다. 우측 폐 조직과 중간 폐엽 샘플을 균질화하고 검정하였다. 결과는 좌우 폐 샘플에 대한 게놈 균등물/mL(log₁₀ GE/mL)로 보고되었다.

유해 사건

연구 기간에 유해 사건은 전혀 보고되지 않았다.

통계 방법

실험 단위

본 연구에서 처리군은 비백신접종군으로의 PRRSv의 전파를 방지하기 위해 격리된 사육실에 수용해야 했다. 따라서, 사육실은 실험 단위였다. 그러나, 본 분석의 목적상 교락 "사육실" 및 "처리" 효과로 발생할 수 있는 편의는 무시하였고 새끼 돼지를 실험 단위로서 분석하였다.

무작위선정

50마리 새끼 돼지를 체중별로 블록화하였다(n=5 새끼 돼지/블록). 엑셀의 난수함수를 이용하여 각 돼지에 난수를 지정하였다. 각 체중 블록내에서 지정된 난수의 오름 순서로 돼지의 순위를 정했다. 그런 다음, 이러한 순서의 돼지에 처리군을 배정하였다: 2개의 최저 난수는 그룹에 배정하였고, 그 다음 2개의 수는 그룹 2에 배정하였으며, 남은 최고의 수는 그룹 3에 배정하였다. 그룹 1 및 2는 각각 20마리로 구성되었고 그룹 3은 10마리로 구성되었다.

분석

통계분석 및 데이터요약은 Dr. rer. hort. Martin Vanselow (Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0)511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de)에 의해 수행되었다.

데이터는 완전임의설계구조를 가정하여 분석되었다. 통계분석은 SAS 소프트웨어 버젼 8.2(SAS, 2001, Cary, North Carolina, USA: SAS Institute, Inc.)를 사용하여 실시하였다. 차이에 대한 모든 검정은 α=5%의 양쪽검정으로 설계되었다.

폐 병변 총점

폐 병변 총점은 부검 당일(D24)에 논문 돼지 국지유행성 폐렴 백신(불활성화)에 추천된 가중식에 따라 계산된 폐연관률로서 측정되었다. 이 공식은 7개 폐엽 각각의 상대 중량을 계산에 포함시킨다. 전형적인 병변을 갖는 폐엽 영역의 평가율과 폐엽당 개별 인수를 곱하여 폐 병변 중량총점을 산출하였다. 각 폐엽의 인수는 표 7.9에 제시되어 있다.

[표 7.9]

Wilcoxon Mann-Whitney 검정법을 사용하여 처리군간 차이를 비교하였다.

백신접종 후 임상 평가

D1과 D12사이에 적어도 한번의 양성 소견을 갖는 동물의 빈도표를 작성하였다. 처리군간 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

PRRS 혈청검사

양성 ELISA 결과의 빈도표를 작성하였다. 처리군간 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

PRRS 바이러스혈증

바이러스혈증 데이터를 연구 날짜별로 독립적으로 평가하였다. 또한, 바이러스 농도를 위해, D14와 D24사이의 개별 반응 곡선하면적(AUC D14-D24) 및 D17과 D24사이의 개별 반응 곡선하면적(AUC D17-D24)을 분석하였다.

Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 처리군간 비교를 위해 정량 PCR 데이터(PRRS 바이러스 농도 [log₁₀GE/mL])을 사용하였다. 계산전에 분석결과 '미검출'(n.d.)은 0.0의 log₁₀GE/mL 값으로, '양성'은 3.0의 log₁₀GE/mL 값으로 대신하였다. 처리군간의 차이는 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 검정하였다.

시험처리 후 임상 관찰

D15와 D24사이에 적어도 한번의 양성 소견을 나타낸 동물의 빈도표를 작성하였다. 처리군간의 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

D15 내지 D24에서 동물당 호흡, 행동 및 기침의 최고 점수와 평균 점수 및 이들 세 가지의 합산 최고 점수와 평균 점수를 통계학적 평가를 사용하였다. 처리군간의 차이는 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 검정하였다.

체중 및 평균 1일 체중 증가

D0과 D14사이의 기간 및 D14와 D24사이의 기간에서 개별적 1일 체중 증가를 계산하였다. 각 연구일 및 각 기간의 기술통계치를 계산하였다. 처리군간의 차이는 분산분석으로 검정하고 후속으로 t-검정법으로 검정하였다. 그룹의 최소 제곱 평균 및 95% 신뢰구간의 최소제곱간간 차이는 분산분석으로 계산하였다.

직장 온도

최초 온도 데이터에서 처리군간 차이는 분산분석으로 검정하고 후속으로 t-검정법으로 검정하였다. 그룹의 최소 제곱 평균 및 95% 신뢰구간의 최소제곱간간 차이는 분산분석으로 계산하였다.

폐 조직내 PRRS 바이러스 정량

Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 처리군간 비교를 위해 D24에 채취된 폐의 정량 PCR 데이터(PRRS 바이러스 농도 [log₁₀GE/mL])을 사용하였다. 좌우 폐 qPCR 결과의 평균(log₁₀GE/mL)을 평가에 사용하였다. 계산전에 분석결과 '미검출'(n.d.)은 0.0의 log₁₀GE/mL 값으로, '양성'은 3.0의 log₁₀GE/mL 값으로 대신하였다.

양성 qPCR 결과의 빈도표를 작성하였다. 처리군간 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

결과

폐 병변 총점

그룹별 폐 병변 총점 및 관련 p-값이 아래 표 7.10에 요약되어 있다.

[표 7.10]

PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 새끼 돼지 D24 폐 병변 총점은 각각 27.368% 및 54.841%로 나타났다. PRRS-백신접종 돼지의 병변 점수는 시험처리 대조군의 평균 병변 점수보다 유의적으로 더 낮았다(p=0.0002).

PRRS 바이러스혈증

qPCR 데이터로서 혈청중 PRRSv RNA 검출 결과가 아래 표 7.11에 요약되어 있다.

[표 7.11]

D0에서는 어떠한 새끼 돼지도 혈청중 PRRSv RNA가 검출되지 않았다. PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 D7 및 D14에서 각각 3.17 및 3.30 log₁₀GE/mL의 평균값을 나타냈다. 이들 값은 같은 양일에서의 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 높았는데(p<0.0001), 그 이유는 시험처리 대조군은 D17까지 PRRSv RNA가 전혀 검출되지 않았기 때문이었다. D17에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균값은 각각 6.78 및 8.00 log₁₀GE/mL이었다. 시험처리 대조군의 D17 값은 PRRS 94881 MLV-백신접종 새끼 돼지보다 유의적으로 더 높았다(p<0.0001). D21 및 D24에서 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 평균값은 각각 7.51 및 7.26 log₁₀GE/mL로 나타났고, 이에 비해 같은 날 시험처리 대조군은 각각 7.88 및 7.34 log₁₀GE/mL로 나타났다. D21 또는 D24에서 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지간의 유의적 차이는 없었다(p≥0.0565). 본 연구 기간에 어떠한 음성 대조군 돼지로부터도 혈청에서 PRRSv RNA가 검출되지 않았다.

PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지와 시험처리 대조군 돼지는 AUC 14-24에서 차이가 없다(각각 65.84와 66.61; p=0.4945). PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 시험처리 대조군에 비하여 D17-D24에서 유의적으로 더 낮은 AUC를 나타냈다(각각 50.72와 54.61; p=0.0039).

폐 조직내 PRRS 바이러스 정량

D24의 부검에서 채취된 폐 조직의 개별적인 PRRSv qPCR 결과는 부록 1, 표 30에 기술되어 있다. qPCR 데이터로 폐 조직에서 검출된 PRRSv RNA는 아래 표 7.12에 요약되어 있고 부검에서 qPCR 양성인 동물의 빈도가 아래 표 7.13에 요약되어 있다.

[표 7.12]

[표 7.13]

PRRSv RNA는 두 PRRS 94881 MLV-백신접종군의 모든 새끼 돼지 및 시험처리 대조군의 모든 새끼 돼지의 폐 조직에서 검출되었다. 이들 그룹간에 차이는 없었다. 어떠한 음성 대조군새끼 돼지의 폐 조직에서도 PRRSv RNA는 검출되지 않았다.

시험처리 후 임상 관찰

시험처리 후 기간(D15-D24)에 적어도 한번의 양성 임상 평가 점수를 갖는 새끼 돼지의 빈도가 아래 표 7.14에 기술되어 있다.

[표 7.14]

이상 호흡이 PRRS 94881 MLV-백신접종군(10%) 및 시험처리 대조군(30%) 둘 다에서 관찰되었으나 이들 값은 유의적으로 차이가 있지 않았다(p=0.2351).

이상 행동은 시험처리 대조군(45%)에서만 관찰되었고 PRRS 94881 MLV-백신접종군(0%)에서는 관찰되지 않았다. PRRS 94881 MLV-백신접종군은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 낮은 이상 행동을 발생하였다(p=0.0012).

기침은 PRRS 94881 MLV-백신접종군(30%) 및 시험처리 대조군(55%) 모두에서 관찰되었다. 이들 값은 유의적으로 차이가 있지 않았다(p=0.2003).

PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군은 >0의 임상총점을 갖는 새끼 돼지의 비율이 각각 30% 및 65%로 나타났다. 이들 값은 유의적으로 차이가 있지 않았다(p=0.0562).

음성 대조군에서 임상징후는 시험처리 후 어떠한 시점에서도 관찰되지 않았다.

시험처리 후 기간(D15 내지 D24)의 그룹별 최고 임상 관찰 점수가 아래 표 7.15에 요약되어 있다.

[표 7.15]

이상 호흡은 시험처리 투여 후 PRRS 94881 MLV 백신접종군 및 시험처리 대조군 모두에서 각각 최고 점수 1(헐떡이는/가쁜 호흡) 및 2(호흡장애)로 관찰되었다. 이들 호흡 점수간에 유의적인 차이는 없었다(p=0.1872). 양 그룹의 중앙 최고 호흡 점수는 0이었다.

이상 행동은 시험처리 후 기간 동안에 PRRS 94881 MLV-백신접종군에서 관찰되지 않았다(최고 점수 = 0). 대조적으로, 시험처리 대조군은 비록 중앙 행동 점수가 0이긴 하였으나 최고 행동 점수가 1(경미 내지 중간 정도의 무기력; p=0.0012)로 나타났다. PRRS 94881 MLV-백신접종군의 최고 점수는 시험처리 대조군의 점수보다 유의적으로 더 낮았다(p=0.0012). 양 그룹의 중앙 최고 행동 점수는 0이었다.

기침은 시험처리 후 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군에 모두에서 관찰되었다. PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 최고 점수는 각각 1(가벼운 또는 간헐적 기침) 및 2(거친 또는 심한 반복 기침)이었고 중앙 점수는 각각 0 및 1이었다. 이들 그룹간에 유의적인 차이는 없었다(p=0.1129). PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 중앙 최고 기침 점수는 각각 0 및 1이었다.

PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 최고 총점은 각각 1 및 4이었고 중앙 총점은 각각 0 및 1이었다. PRRS 94881 MLV-백신접종군의 최고 점수는 시험처리 대조군의 점수보다 유의적으로 더 낮았다(p=0.0072). PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 중앙 총점은 각각 0 및 1이었다.

D15 내지 D24의 연구 기간에 비시험처리 음성 대조군에서 임상징후는 관찰되지 않았다. 이 그룹은 각 매개변수에 대한 최고 점수가 0이었다.

시험처리 후 기간 동안(D15 내지 D24)의 그룹별 평균 임상 관찰 점수가 아래 표 7.16에 요약되어 있다.

[표 7.16]

평균 임상 관찰 점수는 최고 임상 점수와 양상이 유사하였고, PRRS 94881 MLV-백신접종군과 시험처리 대조군사이에서 유의적인 차이는 평균 행동 점수(p=0.0012) 및 평균 총점(p=0.0103)에서만 관찰되었다.

PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 호흡 점수는 각각 0.002 및 0.07로 나타났다. PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 행동 점수는 각각 0.00 및 0.12이었다. PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 기침 점수는 각각 0.07 및 0.17이었다. PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 총점은 각각 0.08 및 0.35로 나타났다.

D15 내지 D24의 연구 기간에 비시험처리 음성 대조군에서는 임상징후가 관찰되지 않았다. 이 그룹 각각의 매개변수에 대한 평균 점수는 0이었다.

체중 및 평균 1일 체중 증가

D0, D14 및 D24에서의 체중 및 D0 내지 D14 및 D14 내지 D24동안의 ADWG가 아래 표 7.17에 요약되어 있다.

[표 7.17]

D0에서 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 체중은 각각 4.1 및 4.2 kg이었다. D14까지 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 체중은 각각 7.6 및 7.4 kg이었다. D24에서 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 체중은 각각 10.3 및 8.9 kg이었다. 백신접종 기간(D0 내지 D14)에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 평균 1일 체중 증가(ADWG)는 각각 0.26 및 0.15 kg/일로 나타났다. D0-D14 및 D14-D24에서 음성 대조군의 ADWG는 각각 0.23 및 0.34 kg/일로 나타났다.

D0, D14 및 D28에서 음성 대조군 새끼 돼지의 평균 체중은 각각 4.1, 7.2 및 10.6 kg이었다.

PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 체중 및 ADWG의 LS 평균 및 통계분석이 아래 표 7.18에 요약되어 있다.

[표 7.18]

0일째에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 LS 평균 체중은 각각 4.14 및 4.17 kg이었다. 차이는 -0.03 kg으로 유의적 차이는 아니었다(p=0.8743). D14에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 LS 평균 체중은 각각 7.64 및 7.39 kg이었다. 차이는 0.25 kg으로 마찬가지로 유의적 차이는 아니었다(p=0.4297). D24에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 LS 평균 체중은 각각 10.26 및 8.87 kg이었다. 차이는 1.39 kg이며 백신접종군이 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 컸다(p=0.0063).

백신접종 기간(D0-D14)에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 LS 평균 ADWG는 각각 0.25 및 0.23 kg/일이었다. 이들 값은 유의적으로 차이가 있는 것은 아니었다(p=0.1889). 시험처리 후 기간(D14-D24)에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 LS 평균 ADWG는 각각 0.26 및 0.15 kg/일이었다. PRRS 94881 MLV-백신접종군의 ADWG는 시험처리 대조군의 ADWG보다 유의적으로 더 컸다(p=0.0003).

직장 온도

직장 온도가 아래 표 7.19 및 7.20에 요약되어 있다. PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 직장 온도의 LS 평균 및 통계분석이 아래 표 7.21 및 7.22에 요약되어 있다.

[표 7.19]

[표 7.20]

[표 7.21]

[표 7.22]

시험처리전날 PRRS 94881 MLV-백신접종 새끼 돼지의 평균 및 LS 평균 직장 온도는 39.77℃이었고, 시험처리 후에는 39.69℃(D15) 내지 40.68℃(D16)이었다. 시험처리전날 시험처리 대조군의 평균 및 LS 평균 직장 온도는 39.39℃였고 시험처리 후(D20)에는 39.77℃(D16) 내지 40.61℃(D20)이었다. 시험처리 투여전(D13 및 D14) 및 시험처리 후 D16에 시험처리 대조군의 최소 제곱 평균 직장 온도는 PRRS 94881 MLV-백신접종 새끼 돼지에 비해 유의적으로 더 낮았다(p<0.0001). 본 연구에서 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지와 시험처리 대조군간에 직장 온도의 다른 유의적인 차이는 없었다(p≥0.0528). 음성 대조군의 평균 및 LS 평균 직장 온도는 연구 기간 내내 ≤39.68℃로 유지되었다.

백신접종 후 임상 평가

D1 내지 D12에서 적어도 한번의 양성 평가를 나타내는 새끼 돼지의 비율이 아래 표 7.23에 요약되어 있다.

[표 7.23]

백신접종 기간 D1 내지 D12에서 PRRS 94881 MLV-백신접종군 또는 음성 대조군의 새끼 돼지는 어떠한 임상 평가 소견도 나타내지 않았다. 시험처리 대조군의 새끼 돼지 110의 경우 D9부터 우측 앞다리 후위에 상처가 관찰되었다. 이 변수에서 PRRS 94881 MLV-백신접종 새끼 돼지와 시험처리 대조군간에 유의적 차이는 없었다(p=1.0000).

PRRS 혈청검사

양성 PRRS-항체 역가를 나타내는 새끼 돼지의 빈도가 아래 표 7.24에 요약되어 있다.

[표 7.24]

모든 처리군의 모든 새끼 돼지는 D0 및 D7에서 PRRS-항체 음성이었다. D14까지 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 85%가 양성 PRRS 항체 역가를 나타냈다. 이 수는 D17에 95%로 증가하였고 D21 및 D24 모두에서 100%가 되었다. 시험처리 대조군의 돼지는 이들중 55%가 양성 역가를 나타낸 D21까지(시험처리 투여 후 7일) 양성 PRRS-항체 역가를 발생하지 않았다. 이 값은 D24까지 95%로 증가하였다. D14, D17 및 D21에 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 시험처리 대조군에 비하여 양성 PRRS 항체 역가를 나타내는 돼지의 비율이 유의적으로 더 높았다(p≤0.0012). 본 연구 기간에 음성 대조군의 돼지는 PRRS 항체 역가를 발생하지 않았다.

논의/결론

연구 목적을 달성하기 위하여, 세개 그룹이 D0에서 연구 설계에 포함되었다: 1 x 10^3.82TCID₅₀의 PRRS 94881 MLV가 투여된 백신군(그룹 1); 대조군 생성물이 투여된 시험처리 대조군(그룹 2); 및 마찬가지로 대조군 생성물이 투여된 음성 대조군(그룹 3).

20마리의 건강한 PRRS 감염성 및 혈청음성 새끼 돼지에 생후 약 14일에 1 ml의 PRRS 94881 MLV를 근육내 접종하였다. 30마리(시험처리 대조군의 20마리 새끼 돼지 및 음성 대조군의 10마리 새끼 돼지) PRRS 감염성 및 혈청음성 새끼 돼지에 생후 약 14일에 1 ml의 대조군 생성물을 근육내 접종하였다.

PRRS 94881 MLV에 의한 2주후 면역발생이 달성되었는지를 결정하기 위하여, 백신접종 후 14일 경과하여 백신군 및 시험처리 대조군을 PRRSv의 이종 유럽형 분리체(분리체 205817)로 시험처리하고, 시험처리 후 연관된 폐 병변 감소를 평가하였다.

연구 타당성 검증(음성 대조군 3)

공급된 새끼 돼지가 PRRSv에 감염되지 않았고 외부 PRRSv 노출 또는 처리군과 대조군사이에 교차감염이 연구 기간에 발생하지 않았음을 보장하기 위하여, 음성 대조군(그룹 3)이 연구 설계에 포함되었다. 음성 대조군의 새끼 돼지는 연구 기간내내 PRRSv(바이러스혈증; qPCR)뿐만 아니라 PRRS 항체가 음성으로 나타났으며, 이에 따라 본 임상의 타당성은 검증되었다.

시험처리 모델의 타당성 검증(시험처리 대조군 2)

실험실 세팅시 PRRS 백신의 면역발생을 적절히 평가하기 위해 충분한 PRRS 임상 질환을 유도하는 시험처리 모델이 필요하다. 앞서 기술된 방법에 따라 유럽형 PRRS 분리체 205817로 접종한 이후로 시험처리 대조군은 D19, D20, D23 및 D24에 40.50℃ 이상의 평균 직장 온도(같은 날 음성 대조군은 39.68℃ 이하), D14 내지 D24에서 음성 대조군의 경우 0.34 kg/일의 평균 ADWG와 비교하여 0.15 kg/일의 평균 ADWG, 55.2%의 이상행동, 기침 및 중앙 폐 병변 점수(음성 대조군의 경우 0.00%)를 나타냈다. 이들 결과는 비록 시험처리 바이러스 역가가 목표 용량보다 약간 적을지라도 중증의 PRRS-특이적 임상 질환이 시험처리 대조군에서 유도되었음을 가리키며, 이에 따라 이 시험처리 모델은 PRRS 백신 효능 및 보다 특정적으로는 PRRS 94881 MLV의 OOI를 평가하는데 적절한 임상 실험 도구로서 타당성이 검증된 것이다.

PRRS 94881 MLV의 2주 면역발생의 결정(그룹 1)

백신접종 후 2주째에 PRRS 94881 MLV에 의한 면역발생(OOI)의 결정은 백신군이 시험처리 대조군에 비하여 시험처리 후 폐 병변의 유의적인(p≤0.05) 감소를 나타내는 근거에 기초하였다.

폐 병변은 돼지의 PRRS 호흡기 시험처리 모델내에서 새로운 백신을 평가할 때 가장 임상적으로 연관이 있고 확실한 효능 증거를 제공하는 매개변수이기 때문에 2주 OOI를 결정하는 주요 매개변수로 선정되었다. 폐 병변 발생은 돼지에서 나타나는 PRRS 호흡기 질환의 특징중 하나이다. 폐 병변은 이차적인 PRRSv 질환 특징인 후속적인 징후, 예를 들면 임상 징후, 발열, ADWG의 감소 등을 흔히 동반한다.

PRRS 94881 MLV-백신접종군은, 55.2%의 폐 병변 중앙 총점을 나타낸 시험처리 대조군에 비하여 27.6%의 폐 병변 중앙 총점으로 입증되는 바와 같이(p=0.0002), 시험처리 후 총 폐병리의 유의적인 감소를 나타냈다. 따라서, 1 x 10^3.82TCID₅₀의 용량에서 PRRS 94881 MLV의 2주 OOI는 주요 매개변수로서 시험처리 후 폐 병변의 유의적인 감소를 근거로 설정되었다. 이 결과는 1 x10^4.5TCID₅₀/용량의 최소면역용량보다 약간 적은 백신 용량으로 달성되었다.

시험처리 후 바이러스혈증은 바이러스에 노출된 숙주 동물에서 일어나는 바이러스 복제 및 생존력의 수준을 대표하기 때문에 가장 중요한 이차 매개변수로 선택되었다. 바이러스혈증의 유의적인(p≤0.05) 감소는 숙주내에서 PRRS 발병을 제한하는데 적절한 면역성을 유도하는 PRRS 백신에 부합한다. 시험처리 후 3일째(D17)에, PRRS 94881 MLV-백신접종군은 시험처리 대조군과 비교하여 중앙 바이러스혈증(qPCR)의 유의적인 감소와 관련이 있었다(6.72 GE/mL 대 8.18 GE/mL; p≤0.0001). 그룹간에 시험처리 후 바이러혈증을 추가로 평가하기 위하여, 시험처리 후 특정 기간에서의 바이러스 농도의 양을 곡선하면적 또는 AUC로서 계산하였다. PRRS 94881 MLV-백신접종군은 D17 내지 D24에서 49.52 GE/mL/일의 중앙 AUC 값을 나타낸 반면, 시험처리 대조군은 54.35 GE/mL/일의 중앙 AUC 값을 나타냈다. 중앙 AUC 값은 D17 내지 D24에서 시험처리 대조군에 비하여 백신군에서 유의적으로 더 낮았다(p=0.0039). 바이러스혈증을 시험처리 후 3일째에 또는 시험처리 후 기간 내내 검정해 보더라도, PRRS의 맹독성 이종 유럽형 스트레인으로 시험처리하기 2주전에 투여된 PRRS 94881 MLV는 시험처리 접종 후 바이러스혈증을 유의적으로 감소시켰다(p≤0.05).

시험처리 후 PRRS 바이러스혈증의 감소와 연관된 폐 조직내 바이러스 농도의 유의적인(p≤0.05) 감소 또한 PRRS 백신의 면역성 양상에서 대단히 중요하다. 폐 조직내 바이러스 농도의 감소는 숙주내에서 바이러스 안정성, 복제 및 생존력의 감소과 연관이 있을 수 있으며 이차적으로 다른 돼지로의 PRRSv의 확산 감소를 유도할 수 있다. 본 연구에서, PRRS 94881 MLV-백신접종군의 폐 조직은 시험처리 후 10일째에 7.46 log₁₀GE/mL의 중앙 폐 qPCR 결과를 나타낸 반면, 시험처리 대조군은 7.88 log₁₀GE/mL의 중앙 폐 qPCR 결과를 나타냈다. 백신군과 시험처리 대조군간의 차이는 유의적이었으며(p=0.0101), 이에 따라 2주의 OOI를 지지한다.

시험처리 후 새끼 돼지의 임상 징후에서 중증도 및 빈도의 뚜렷한 감소는 또한 PRRS 94881 MLV의 PRRS 백신 효능 및 2주 OOI의 설정을 지지한다. 충분한 중증도 및 빈도의 이상 호흡은 시험처리 후 양 그룹에서 관찰되지 않았고 차이도 전혀 검출되지 않았다(p≥0.1394). 대조적으로, 기침의 중증도 및 빈도는 그룹간에 거의 동일하였고 차이는 전혀 검출되지 않았다(p≥0.0835). 시험처리 후 이상 행동(기면)의 중중도 및 빈도에서 그룹간 차이가 검출되었다. PRRS 94881 MLV-백신접종 새끼 돼지 20중 0마리(0%) 및 시험처리 대조군 새끼 돼지 20마리 중 9마리(45%)가 시험처리 후 적어도 한 날 동안 이상 행성을 나타냈다(p=0.0012). 유사하게, PRRS 94881 MLV-백신접종군은 시험처리 대조군에 비하여 보다 낮은 시험처리 후 이상임상 최고점수 및 이상임상 평균을 나타냈다(p=0.0012). 임상총점(호흡, 행동 및 기침 점수의 합계)는 D15 내지 D24의 최고점수와 평균 점수를 분석하였을 때 그룹간에 유의적으로 차이가 있었다. 총점에 미치는 이상 행동 점수의 영향으로 인해, PRRS 94881 MLV-백신접종군은 시험처리 대조군에 비하여 유의적으로 더 낮은 최고총점 및 평균총점을 나타냈다(p≤0.0103). 이상 행동의 중증도 및 빈도에서 그룹간 차이는 추가로 백신접종 후 2주의 OOI를 지지한다.

시험처리 전에 PRRS 94881 MLV-백신접종군은 시험처리 대조군에 비하여 D13(39.77℃ 대 39.39℃; p<0.0001) 및 D14(39.76℃ 대 39.37℃; p<0.0001) 약간 더 높은 평균 직장 온도를 나타냈다. 비록 시험처리 전에 그룹간에 유의적인(p≤0.05) 차이가 검출되었지만, 이들 차이는 생물학적으로 연관성이 없다. 시험처리 후에, 그룹간의 평균 직장 온도에서 유의적인(p≤0.05) 차이가 검출된 유일한 날은 D16(시험처리 후 2일째)이었다. D16, 백신접종군 및 시험처리 대조군은 각각 40.68℃ 및 39.77℃의 평균 직장 온도를 나타냈고 그룹간 차이는 유의적이었다(p<0.0001). 시험처리 후 4-5일째에 두 그룹의 평균 직장 온도는 40℃이상으로 상승하였고 연구 종료시까지 40℃ 이상을 유지하였다.

시험처리 대조군에서 PRRS로 인해 유의적인 이상 행동, 바이러스혈증, 폐병리 및 폐 조직내 바이러스 농도의 존재는 두 그룹간에 시험처리 후 ADWG의 유의적인(p≤0.05) 차이를 유도하였다. 본 연구에서, 백신접종군과 시험처리 대조군은 D14 내지 D24에서 각각 0.3 kg/일 및 0.1 kg/일의 평균 ADWG를 나타냈고 그룹간 차이는 유의적이었다(p=0.0003). 두 그룹간에 시험처리 후 ADWG의 유의적인(p≤0.05) 차이는 추가로 백신접종 후 2주의 OOI의 설정을 지지한다.

본 연구에서 검정된 백신접종 후 매개변수

D0에서의 접종 후 새끼 돼지에서 PRRS 94881 MLV 백신접종 또는 대조군 생성물과 연관된 이상 임상 평가는 관찰되지 않았다. 한 마리 시험처리 대조군 새끼 돼지가 D9 이후에, 대조군 생성물의 투여와는 무관한 것으로 보이는, 우측 앞다리 후위에 상처를 보였다.

모든 새끼 돼지는 D0의 PRRS ELISA 혈청검성에서 음성으로 나타났으며, 이 결과는 모든 새끼 돼지가 연구에 등록될 당시 PRRS 음성이어야 하는 선정 기준을 충족하였음을 확인해 준다. PRRS 94881 MLV가 접종되어 D14까지 PRRS 혈청-전환된 새끼 돼지의 대부분 및 모든 PRRS-백신접종 새끼 돼지는 시험처리 후 7일(D21)까지 혈청양을 나타냈다. 대조적으로, 시험처리 대조군은 이 그룹이 PRRS 혈청전환을 증명하기 시작할 때인 시험처리 후 7일까지 혈청음성을 유지하였다. 음성 대조군은 연구 기간 내내 PRRS 혈청음성을 나타냈다.

백신접종 후 7 및 14일째에, PRRS 94881 MLV-백신접종군은 각각 3.17 및 3.30 log₁₀GE/mL의 평균 qPCR 결과를 나타냈다. 이들 결과는 백신접종 후 2주내에 PRRS 94881 MLV의 1 x 10^3.82 TCID₅₀의 용량이, 백신접종 후 2주째에 이미 방어면역을 형성하는데 흔히 요구되는, MLV의 충분한 복제를 유도하였음을 가리킨다. 대조적으로, 시험처리 대조군 및 음성 대조군은 D0 내지 D14에 PRRSv 바이러스혈증이 음성이었다.

결론

시험처리 후 폐 병변, 임상징후, 혈액 및 폐내 바이러스 복제의 유의적인 감소(p≤0.05)뿐만 아니라 성장능의 향상은 생후 약 14일된 새끼 돼지에게 1 x 103.82 TCID50/mL의 PRRS 94881 MLV 1회용량으로 백신접종한 결과로 2주 OOI의 설정을 지지한다.

실시예 8 감염성 2주령 돼지에 백신접종 후 26주째에 PRRS의 이종 유럽형 분리체로 시험처리한 후 PRRS 94881 MLV의 면역기간 평가

본 백신접종-시험처리 연구의 목적은 14±3 일령의 PRRS 혈청음성 돼지에 백신 후보 돼지 생식기 호흡기 증후군 유럽형 분리체 94881 변형된 생 바이러스(PRRS 94881 MLV)를 투여한 후 26주의 면역지속시간(DOI)를 평가하는데 있었다. 백신접종 후 26주의 DOI를 충족하는 주요 효능 기준은 시험처리 후 폐 병변 점수(육안적 또는 조직학적)에서 시험처리 대조군(그룹 2)과 비교하여 PRRS 94881 MLV 백신접종군(그룹 1)의 유의적인 감소(p≤0.05)이었다.

0일에(D0), 백신접종군으로 배정된 22마리 돼지에 1.0 mL의 PRRS 94881 MLV(1 x 10^4.27TCID₅₀, 그룹 1)을 근육내 투여하였고, 시험처리 대조군으로 배정된 22마리 돼지에 1.0 mL의 대조군 생성물(PRRS 94881 MLV가 없는 위약, 그룹 2)을 근육내 투여하였으며, 음성 대조군으로 배정된 12마리 돼지에 1.0 mL의 대조군 생성물, 그룹 3)을 근육내 투여하였다. D179에(시험처리 후 경과일[DPC] 0) 그룹 1 및 2를 유럽형 PRRSV의 맹독성 스트레인으로 시험처리하였고 시험처리 후 10일간 임상징후, 평균 1일 체중 증가 및 바이러스혈증을 모니터링하였다. D189(DPC 10)에 돼지를 부검하고 육안적 및 조직학적 폐 병변 및 폐 바이러스 농도를 결정하였다.

D189(DPC 10)에 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지 및 시험처리 대조군의 육안적 폐 병변 중앙점수는 각각 0.1% 및 13.8%였다(p<0.0001). DPC 10에 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지 및 시험처리 대조군의 조직학적 폐 병변 중앙점수는 각각 6.0 및 19.5였다(p<0.0001). PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 시험처리 대조군에 비하여 시험처리 후 3, 7 및 10일째에 유의적으로 더 낮은 혈청 바이러스 농도를 나타냈다(p≤0.0001). DPC 0 내지 DPC 10 및 DPC 3 내지 DPC 10 동안에 바이러스혈증에 대한 시험처리 후 곡선하면적(AUC) 분석 결과는 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지(각각, 일당 15.54 및 8.88 log₁₀GE/ml)이 시험처리 대조군(각각, 일당 44.77 및 36.43 log₁₀GE/mL, p<0.0001)보다 유의적으로 더 낮았다. 부검에서 채취된 폐 조직의 중앙 qPCR 값은 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 경우 3.69 log₁₀GE/mL이었고, 시험처리 대조군의 경우 6.25 log₁₀GE/mlL이었다(p<0.0001). 시험처리 후 임상징후의 유의적 차이는 없었다(p≥0.4878).

육안적 및 조직학적 폐 병변, 부검시 채취된 폐 조직내 바이러스 농도 및 시험처리 후 바이러스혈증에서 시험처리 대조군에 비하여 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 유의적 감소(p≤0.05)는 백신접종 후 26주째에 시험처리했을 때 맹독성 PRRSv에 대한 백신효능을 지지하였다. 본 연구의 결과는 생후 2주째에 PRRS 94881 MLV로 백신접종된 돼지에서 백신접종 후 26주 면역지속기간을 설정한다. 이들 결과는, 본 연구용 수의 생성물의 최소면역용량(1 x 10^4.5TCID₅₀/mL)보다 약간 적은 1 x 10^4.27TCID₅₀/mL의 백신용량으로 달성되었다.

연구 목적

본 백신접종-시험처리 연구의 목적은 14±3 일령의 PRRS 혈청음성 돼지에 백신 후보 돼지 생식기 호흡기 증후군 유럽형 분리체 94881 변형된 생 바이러스(PRRS 94881 MLV)를 투여한 후 26주째에 면역지속시간(DOI)를 평가하는데 있었다. 백신접종 후 26주의 DOI를 충족하는 주요 효능 기준은 시험처리 후 폐 병변 점수(육안적 또는 조직학적)에서 시험처리 대조군(그룹 2)과 비교하여 PRRS 94881 MLV 백신접종군(그룹 1)의 유의적인 감소(p≤0.05)이었다.

이차적인 효능 매개변수로는 백신접종 후 및 시험처리 후 바이러스혈증, 백신접종 후 임상 평가, PRRS 혈청검사, 시험처리 후 임상 관찰, 평균 1일 체중 증가(ADWG), 직장 온도 및 폐 PRRSv 정량이 포함되었다. 시험처리 후 바이러스혈증은 객관적이고 정량가능한 매개변수이기 때문에 가장 중요한 보조적인 매개변수로 고려되었다. 직장 온도 및 임상 관찰 또한 DOI 정의 과정에서 보조적인 것으로 고려되었다. 마지막으로, 성장능, 혈청검사 및 폐내 바이러스 검출이 연구 목적을 충족함에 있어서 주요 매개변수에 대한 보조적인 매개변수로 사용되었다.

사건의 스케쥴

[표 8.1]

연구 설계

본 연구는 생후 14±3일된 56마리 PRRS 혈청음성 이유 돼지로 연구일 0(D0)에 실시된 백신접종-시험처리 효능 맹검 연구이다. 본 연구의 요약이 아래 표 8.2에 기술되어 있다.

[표 8.2]

맹검 기준

연구 기간 내내 연구원 및 피지명자에게 등록된 처리군에 대한 정보가 차단되었다. 이러한 맹검을 유지하기 위하여, 돼지의 평가(즉, 임상 평가, 임상 관찰 또는 부검)에 참여하지 않은 자가 임의지정을 수행하고 D0에 예정된 IVP 및 VP 처리를 투여하였다. BIVI 실험실 직원들은 각 돼지에 투여된 처리에 대해 어떠한 정보를 갖지 못한 상태에서 개별적인 업무를 수행하였다.

재료

연구용 수의 생성물(IVP) 및 대조군 생성물(CP)

[표 8.3]

[표 8.4]

시험처리 물질

[표 8.5]

처리

용량 설정근거

분류된 어미 돼지에 IVP를 1.0 ml 용량으로 투여하여 백신접종 후 26주째에 PRRS 94881 MLV의 DOI를 평가하였다. 1.0 mL 용량의 CP를 그룹 2 및 3에 위약 백신으로서 투여하였다.

투약 요법

연구 데이터를 수집하지 않은 자가 D0에 멸균 3.0 mL 루어-락 주사기 및 멸균 20g x 1 인치(2.54 cm) 바늘을 사용하여 지정된 어미 돼지의 우측 경부에 IVP 또는 CP를 근육내 주사하였다. 투여 요법은 아래 표 6.8에 기재되어 있다.

[표 8.6]

병행 처리

몇 마리 돼지가 연구 초기에 사망한 후 세균 감염이 발생되어 연구원 및 연구모니터요원은 모든 연구 동물에 후속적인 추가 조치로서 병행 처리의 투여에 동의하였다(섹션 15.10):

연구일 20: 우측 넓적다리에 Mu-Se^®(비타민 E/셀레늄, Intervet/Schering Plough Animal Health, USA), 0.1 mL IM

연구일 21: 좌측 넓적다리에 EXCEDE^®(Ceftiofur, Pfizer Animal Health, USA), 0.5 mL

연구일 35: 우측 넓적다리에 EXCEDE^®(Ceftiofur, Pfizer Animal Health, USA), 1.0 mL

연구일 42일: 좌측 넓적다리에 EXCEDE^®(Ceftiofur, Pfizer Animal Health, USA), 1.0 mL

연구일 47일: 좌측경부에 BAYTRIL 100^®(Enrofloxacin, Bayer Animal Health, USA), 1.5 mL SC.

비타민 E/셀레늄은 멀베리심병의 예방을 위해 투여하였고 항생물질 처리는 세균 감염의 치료/예방을 위해 투여되었다.

동물 정보

연구용 동물에 대한 세부사항

[표 8.7]

선정/배제 기준

본 연구에 등록된 모든 돼지들은 PRRS ELISA 음성(<0.4의 ELISA S/P비율)이었고 백신접종 시점(D0)에서의 관찰 결과 건강하였다.

선정 후 배제 기준

본 연구로부터 배제된 돼지는 없었다. 3마리 돼지가 시험처리 투여전에 사망하였다. 이들 세 마리 돼지에 대한 추가적인 결과는 섹션 12.8에 기술되어 있다.

동물 관리 및 수용시설

연구 기간에 돼지는 Veterinary Resources, Inc. (VRI)(Cambridge, IA)에 수용하였다. 돼지들을 각 사육실내 복수개의 우리에 수용하면서(11 또는 12마리/우리), 차단방역을 보장하기 위하여 백신접종 돼지(그룹 1) 및 대조군 돼지(그룹 2 및 3)를 일정하지만 분리된 사육실에 수용하였다. PRRS 94881 MLV 돼지는 D78까지 사육실 CB8에, D105까지 사육실 CC1에, 이후 연구 잔여 기간 동안에 사육실 CC3에 수용하였다. 시험처리 대조군 돼지는 연구 기간 내내 사육실 CC2에 수용하였다. 음성 대조군 돼지는 D73까지 사육실 CB6에, 이후 연구 잔연 기간 동안에 사육실 CB7에 수용하였다. 우리는 접이식 플라스틱 마루위에 스탠드로 세운 플라스틱 통으로 되어 있다. 각 우리에는 플라스틱 6개구 급식기와 니플 급수기가 구비되었다. 분리된 각 사육실은 구조가 모두 동일하였고 생물재해등급2(BL2)에 준한 설비로 헤파필터로 공조되고 항온 조절과 함께 기계적으로 환풍된다.

처리군별 분리는 PRRSv가 에어로졸화를 포함한 다양한 기전을 통해 돼지간에 쉽게 퍼진다는 것은 과학계에서 잘 알려져 있기 때문에 본 연구에서 필요하였다. 생물학적 물질에는 질환을 유발하는 능력은 없지만 맹독성 야생형 PRRs의 특징을 모사하는 약독화 바이러스 입자가 포함되기 때문에 이러한 분리에는 맹독성 생 PRRS 백신이 포함된다. 차단방역이 유지되었고 백신접종 동물들이 비백신접종되었고 PRRSv 선천적 음성 대조동물을 우연히 교차오염시키지 않았음을 보장하는 적절한 방법들을 실행할 준비가 되어 있었다.

시험시설 직원은 본 연구를 위한 사육실을 사용하기 전에 각 사육실을 적절하게 청소하고 방역하는데 필요한 적절한 조치를 취하였다.

시설내 각 사육실은 충분한 공기 순환과 난방을 위해 팬과 히터를 갖추고 있다. 각 사육실의 통풍 시스템은 동일하지만 독립적이어서, 사육실간에 공기가 공유되지 않는다.

사료는 무해충 낭에 저장하였다. 급식과 급수는 자유롭게 이루어졌다. 도착 후 D5까지 돼지에 Lean Metrics Infant Medicated 사료(Purina Mills LLC, St. Louis, MO)를 급식하였고 D5 이후에는 Lean Metrics Senior Medicated 사료(Purina Mills LLC, St. Louis, MO)로 교체하였다. D82에 Lean Metrics Complete CE85, T40(Purina Mills LLC, St. Louis, MO)로 다시 교체하고 연구 잔여 기간 동안 이 사료를 급식하였다. 연구 기간 내내, 제공된 사료는 해당 지역에 허용되는 축산업 실무지침에 따라 돼지의 크기, 연령 및 상태에 적당한 것이었다.

돼지는 연구원의 판정에 따라 연구 개시전에 건강 및 영양 상태가 양호하였다. 연구 기간에 특정 동물에서 약간 수척한 몸상태, 털이 거친 외모, 부어오른 관절 및 다양한 정도의 파행이 관찰되었다. 연구원은 이들 모든 상태들을 집단 수용되어 사육되는 돼지의 전형으로 판단하였다. 이들 상태는 일시적 또는 간헐적인 것으로 고려하고 치료하지 않았다.

효능 평가

백신접종 후 26주째에 PRRS 94881 MLV의 DOI를 평가하기 위하여, D197(DPC 0)에 PRRS 94881 MLV 및 시험처리 대조군을 시험처리하였고, 10일 후(DPC 10)에 시험처리 후 폐 병변을 평가하였다. 만일 PRRS 94881 MLV 그룹이 시험처리 대조군에 비하여 유의적으로 감소된(p≤0.05) 시험처리 후 폐병리(육안적 또는 조직학적)를 증명하였다면 백신접종 후 26주의 DOI는 달성된 것이다.

백신군과 시험처리 대조군간에 분석된 이차적인 매개변수로는 백신접종 후 및 시험처리 후 바이러스혈증, 시험처리 후 임상 관찰, 시험처리 후 직장 온도, 백신접종 후 임상 평가, 평균 1일 체중 증가(ADWG) 및 PRRS 혈청검사가 포함되었다. 시험처리 후 바이러스혈증은 객관적이고 정량가능한 매개변수이기 때문에 가장 중요한 보조적인 매개변수로 고려되었다. 직장 온도 및 임상 관찰 또한 DOI 정의 과정에서 보조적인 것으로 고려되었다. 마지막으로, 성장능, 혈청검사 및 폐내 바이러스 검출이 연구 목적을 충족함에 있어서 주요 매개변수에 대한 보조적인 매개변수로 사용되었다.

타당성 검정 기준

모든 돼지는 구매전 선별시 및 D0에서 PRRS ELISA 음성(<0.4의 ELISA S/P 비율)이어야 했다. 시험처리 대조군은 시험처리까지 PRRS 항체가 음성이어야 했고 음성 대조군은 연구 내내 PRRS 항체가 음성이어야 했다.

주요 효능 결과 매개변수

주요 효능 결과 변수는 연구 D189(DPC 10)에서의 폐병리(육안적 및 조직학적 병변)이었다.

육안적 폐 병변 점수

D189에, 샘플 및 데이터를 수집 및 기록한 후, 모든 잔여 연구 돼지는 VRI SOP PRC1027(섹션 15.1)에 따라 안락사시켰다. 각 돼지는 VRI SOP PRC 1028(섹션 15.1)에 따라 부검하였다. 각 돼지의 흉강은 피지명자에 의해 처리되었고 심장과 폐는 제거되었다. 연구원은 폐의 각 세트를 검사하고, 모든 육안병리를 기술하였으며, 각 폐엽의 병리율(%)을 결정하였다. 소견 및 데이터는 부검 보고서 기록 양식에 기재하였다.

조직학적 폐 병변 점수

각 세트의 폐에 대해, 좌우정단엽, 좌우심장엽, 좌우횡격막엽 및 중간엽으로부터 2개 샘플을 채취하였다. 각각의 폐 샘플은 약 1인치(2.54 cm) x 1인치(2.54 cm) 였다. 한 세트의 폐 샘플에 대해, 좌측의 모든 세개 샘플을 한 용기에서 배합하였고, 우측의 모든 세개 샘플 및 중간 폐엽 샘플은 다른 용기에서 배합하였다. 각 용기에는 충분량의 10% 포르말린액을 충진하였다. 다른 세트의 폐 샘플에 대해, 좌측의 모든 세개 폐 샘플을 한개의 Whirlpak®에서 배합하고, 우측의 모든 세개 샘플과 중간 폐엽 샘플을 다른 Whirlpak®에서 배합하였다. 모든 용기 및 Whirlpak®에 동물번호, 연구번호, 샘플채취일, 연구일, 샘플종류 및 샘플 채취부위(좌측 또는 우측)를 적당히 표시하였다. BIVI-Ames로 운반되기까지 Whirlpak®의 폐 샘플은 드라이아이스에 저장하였고 포르말린의 샘플은 실온에 저장하였다. 샘플 채취는 부검 보고 기록 양식에 기재하였다. 포르말린 고정 폐 조직 샘플 및 Whirlpak® 폐 샘플은 BIVI-Ames로 이전되었다. 작성된 샘플 운송 기록 양식이 각 샘플배송물에 포함되었다.

BIVI-Ames는 포르말린 고정된 폐 조직 샘플을 아이오아주립대 Veterianry Diagnostic Laboratory(ISU VDL)에 제출할 때까지 실온에서 보관하였다. ISU VDL 직원은 부검 1주일내에 ISU VDL 절차에 따라 폐 샘플을 처리하였다. 각 돼지에 대해 7개 절편을 함유하는 1개의 슬라이드를 만들었다(각 슬라이드당 7개 폐엽). 개개의 H&E 슬라이드는 고유 식별 코드로 분류하였다. ISU VDL은 연구번호, 식별코드 및 관련된 돼지조직을 포함한 컴퓨터 기록을 제공하였다.

연구 슬라이드를 조직병리에 대해 판독하는 날에 매일 1회씩, ISU VDL 병리사(K. Schwartz)는 우선적으로 EU PRRS 양성 및 음성 대조군 슬라이드를 판독하였다. 그런 후 병리사는 H&E 염색된 폐 슬라이드를 폐세포 비대 및 과형성, 단핵세포의 중격침윤, 괴사파편, 염증세포의 폐포내 축적 및 염증세포의 혈관주위 축적을 판독하였다. 결과는 엑셀 스프레드쉬트에 기록하였다. 폐 조직병리 점수체계가 아래 표 8.8에 기술되어 있다.

[표 8.8]

모든 슬라이드의 판독이 종료되면 슬라이드는 Sponsor Representative로 반송하고 최종 보고서를 작성하여 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. (St. Joseph, MO)에 보관하였다.

이차적 매개변수

이차적 매개변수로서 백신접종 후 및 시험처리 후 바이러스혈증, 시험처리 후 임상 관찰, 시험처리 후 직장 온도, 평균 1일 체중 증가(ADWG), 폐 PRRSv 정량, 백신접종 후 임상 평가 및 PRRS 혈청검사가 포함되었다.

혈청 PRRS qPCR

구매전 및 연구일 0, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 168, 179(DPC 0), 182(DPC 3), 186(DPC 7) 및 189(DPC 10)에 정맥 전혈을 채취하였다. 간단히 설명하면, 각 돼지로부터 적당한 크기의 혈청분리튜브(SST)로 약 2-5 mL의 혈액을 채취하였다. 샘플 채취는 샘플 채취 기록 양식에 기재하였다. SST내 혈액은 실온에서 응고하도록 두었다. 혈액 샘플은 채혈 당일에 BIVI-Ames로 운반하고 샘플 운반 기록 양식을 작성하였다. BIVI-Ames에서 혈액 샘플은 원심분리하여 혈청을 수확하고 나우어 적당한 튜브로 옮겼다. 각 튜브에 어미 돼지의 ID 번호, 연구번호, 채혈일, 연구일 및 샘플종류를 표시하였다. BIVI-Ames에서, 혈청 샘플 한조를 2 내지 8℃에 보관하였고 다른 세트의 혈청 샘플은 -70±10℃에 저장하였다.

시험처리 후 임상 관찰

D178(DPC-1) 내지 D189(DPC 10)에 돼지의 임상 질환 징후를 관찰하였다. 관찰은 연구원 또는 피지명자에 의해 수행되어 임상 관찰 기록 양식에 기재되었다. 지정 날짜에 돼지에 의한 호흡, 행동 및 기침이 아래 표 8.9에 기재된 임상 관찰 점수체계를 기준으로 관찰되었다.

[표 8.9]

직장 온도

D178(DPC-1) 내지 D189(DPC 10)에 연구원 또는 피지명자가 직장 온도를 수집하였다. 직장 온도는 임상 관찰 기록 양식에 ℃ 단위로 기록하였다.

체중 및 평균 1일 체중 증가

D0, D179(DPC 0) 및 D188(DPC 9)에 각 돼지의 체중을 수집하였다. 각 돼지의 체중은 연구원 또는 피지명자가 등급계량화 스케일로 쟀다. 결과는 체중 기록 양식에 kg으로 기재하였다. 평균 1일 체중 증가는 D179(DPC 0) 내지 D188(DPC 9)에 결정하였다.

폐 PRRS qPCR

Whirlpaks®내 폐 조직 샘플은 섹션 9.3.1에 수록된 주소로 운반될 때까지 BIVI-Ames에서 -70±10℃에서 보관하였다. 작성된 샘플 운송 기록 양식이 운송물에 포함되었다. 바이오스크린은 폐 샘플을 qPCR하여 PRRSv RNA를 검정하였다(섹션 15.1). 좌측 폐 조직을 균질화하고 검정하였다. 우측 폐 조직과 중간 폐엽 샘플을 균질화하고 검정하였다. 결과는 좌우 폐 샘플에 대한 게놈 균등물/mL(log₁₀ GE/mL)로 보고되었다. 통계전문가는 SAS 프로그램을 이용하여 각 돼지에 대한 좌우 GE/mL 값의 기하평균 역가를 계산할 수 있다.

백신접종 후 임상 평가

연구원 또는 피지명자는 백신접종 후 임상 평가를 위해 모든 돼지를 관찰하였다. 관찰은 D-1부터 D21까지 매일 실시하였고 이후 D22부터 D177까지 주 3회 이상 실시하였다. 소견은 임상 평가 기록 양식에 기재하였다.

PRRS 혈청검사

구매전 및 연구일 0, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 168, 179(DPC 0), 182(DPC 3), 186(DPC 7) 및 189(DPC 10)에 채취되어 2 내지 8℃에 보관된 혈청 샘플을 BIVI-Ames가 PRRS 항체에 대해 검정하였다(섹션 15.1). 결과는 음성(ELISA S/P 비가 <0.4) 또는 양성(ELISA S/P 비가 ≥0.4)으로 보고되었다.

유해 사건

연구 기간에 PRRS 94881 MLV로 인한 유해 사건은 전혀 보고되지 않았다.

통계 방법

실험 단위

본 연구에서 처리군은 비백신접종군으로의 PRRSv의 전파를 방지하기 위해 격리된 사육실에 수용했다. 따라서, 사육실은 실험 단위였다. 그러나, 분석의 목적상 교락 "사육실" 및 "처리" 효과로 발생할 수 있는 편의는 무시하였고 돼지를 통계단위로 사용하였다.

무작위선정

56마리 돼지를 세개 그룹중 하나에 무작위로 배정하였다. 무작위선정은 BIVI가 수행하였다. 반출시점에 140번 및 143번(시험처리 대조군)뿐만 아니라 168번(PRRS 94881 MLV 그룹)을 추려냈다. 선정기준을 충족한 여유분 5마리로부터 140번, 143번 및 168번을 무작위로 선정하여 178번, 177번 및 179번으로 각각 대체하였다.

분석

통계분석 및 데이터요약은 Dr. rer. hort. Martin Vanselow (Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0)511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de)에 의해 수행되었다. 데이터는 완전임의설계구조를 가정하여 분석되었다. 통계분석은 SAS 소프트웨어 버젼 8.2 이상(SAS, 2001, Cary, North Carolina, USA: SAS Institute, Inc.)를 사용하여 실시하였다. PRRS 94881 MLV 돼지 179 및 시험처리 대조군 돼지 124 및 161은 시험처리전에 사망하여 시험처리 후 분석에서 배제하였다. 차이에 대한 모든 검정은 α=5%의 양쪽검정으로 설계되었다. 통계전문가의 보고서가 섹션 15.9에 기재되어 있다.

육안적 폐 병변 점수

각 돼지의 육안적 폐 병변 점수는 아래 표 8.10에 기재된 인수를 특정 폐엽의 병리율(%)을 곱하여 계산하였다. 계산은 SAS 프로그램을 이용하여 수행하였다.

[표 8.10]

Wilcoxon Mann-Whitney 검정법을 사용하여 처리군간 차이를 비교하였다.

조직학적 폐 병변 점수

폐 샘플의 개별적인 조직학적 점수를 엽 및 동물마다 누적 합산하였다. 이 총점을 동물마다 검사한 엽의 수로 나누었다. 결과를 처리군간 비교를 위한 단일값으로 사용하였다. 처리군간 차이는 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법을 사용하여 검정하였다.

폐 PRRS qPCR

D189에 채취된 폐로부터의 정량 PCR 데이터(PRRS 바이러스 농도[log₁₀GE/mL])를 Wilcoxon Mann-Whitney 검정에 의한 처리군간 비교에 사용하였다. 좌우 폐 qPCR 결과의 평균(log₁₀GE/mL)을 평가를 위해 사용하였다. 계산전에 분석 결과 '미검출'은 0.0의 log₁₀GE/mL로 치환하고 '양성'은 3.0으로 치환하였다.

양성 qPCR 결과의 빈도표를 작성하였다. 처리군간 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

혈청 PRRS qPCR

각각의 연구일에 대한 바이러스혈증 데이터를 독립적으로 평가하였다. 추가로, 바이러스 농도를 위해 D179와 D189(AUC 0-10) 및 D182와 D189(AUC 3 내지 10)사이의 개별적인 반응곡선하면적을 분석하였다.

정량 PCR 데이터(PRRS 바이러스 농도[log₁₀GE/mL])를 Wilcoxon Mann-Whitney 검정에 의한 처리군간 비교에 사용하였다. 계산전에 분석 결과 '미검출'은 0.0의 log₁₀GE/mL로 치환하고 '양성'은 3.0으로 치환하였다. 처리군간 차이는 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 검정하였다.

양성 qPCR 결과의 빈도표를 작성하였다. 처리군간 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

시험처리 후 임상 관찰

D180과 D189사이에 적어도 한번의 양성 소견을 갖는 동물의 빈도표를 작성하였다. 총점은 호흡점수 + 행동점수 + 기침점수의 합계이다. 계산은 SAS 프로그램을 사용하여 수행하였다. 처리군간 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

D180 내지 D189 기간에 호흡, 행동, 기침 및 세 가지 모두에 대한 동물당 최고 점수와 평균 점수를 통계평가에 사용하였다. 처리군간 차이는 Wilcoxon Mann-Whitney 검정법으로 검정하였다.

체중 및 평균 1일 체중 증가

D179 내지 D188의 기간에 대한 개별적인 1일 체증 증가를 계산하였다. 각각의 연구일 및 이 기간에 대한 기술통계를 계산하였다. 처리군간의 차이는 분산분석(ANOVA) 및 후속으로 t-검정법으로 검정하였다. 그룹의 최소 제곱 평균 및 95% 신뢰구간의 최소제곱간간 차이는 분산분석으로 계산하였다.

직장 온도

최초 온도 데이터에서 처리군간 차이는 분산분석으로 검정하고 후속으로 t-검정법으로 검정하였다. 그룹의 최소 제곱 평균 및 95% 신뢰구간의 최소제곱간간 차이는 분산분석으로 계산하였다.

백신접종 후 임상 평가

D1 내지 D21의 기간에 적어도 한번의 양성 소견을 보인 동물의 빈도표를 작성하였다. 처리군간의 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

PRRS 혈청검사

각 시점에서의 양성 ELISA 결과의 빈도표를 작성하였다. 처리군간 차이는 피셔의 정확검정법으로 검정하였다.

결과

육안적 폐 병변 점수

D189(DPC 10)에 PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군의 육안적 폐 병변 중앙점수는 각각 0.1% 및 13.8%였다. PRRS-백신접종군의 육안적 폐 병변 중앙점수는 시험처리 대조군의 육안적 폐 병변 중앙점수보다 유의적으로 더 낮았다(p<0.0001). 음성 대조군의 육안적 폐 병변 중앙점수는 0.0%이었다.

123번(시험처리 대조군)은 확산 늑막염 및 유착으로 인해 D189에 폐 병변 점수를 정할 수가 없었다. 이 돼지의 부검 후 폐 조직으로부터 모락셀라 이슬로엔시스(Moraxella osloensis), 스타필로코커스 와메리(Staphylococcus wameri), 스타필로코커스 하이이쿠스(Staphyloccous hyicus) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas sp .)이 분리되었다.

그룹별 육안적 폐 병변 점수 및 연관된 p-값이 아래 표 8.11에 요약되어 있다.

[표 8.11]

조직학적 폐 병변 점수

PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지 및 시험처리 대조군의 조직학적 폐 병변 중앙점수는 각각 6.0 및 19.5였다. PRRS-백신접종군의 조직학적 폐 병변 중앙점수는 시험처리 대조군의 조직학적 폐 병변 중앙점수보다 유의적으로 더 낮았다(p<0.0001). 음성 대조군의 조직학적 폐 병변 중앙점수는 9.0이었다.

그룹별 조직학적 폐 병변 점수 및 연관된 p-값이 아래 표 8.12에 요약되어 있다.

[표 8.12]

폐 PRRS qPCR

PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지 및 시험처리 대조군의 폐 조직으로부터의 qPCR 폐 중앙값은 각각 3.69 및 6.25 log₁₀GE/mL이었다. PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 qPCR 중앙값은 시험처리 대조군의 qPCR 중앙값보다 유의적으로 더 낮았다(p<0.0001). PRRSv RNA는 어떠한 음성 대조군 돼지의 폐 조직에서도 검출되지 않았다.

그룹별 폐 qPCR 값 및 검정 결과(p-값)이 아래 표 8.13에 요약되어 있다.

[표 8.13]

PRRSv RNA는 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 90% 및 시험처리 대조군 돼지의 100%의 폐 조직에서 검출되었다. 백신접종군과 시험처리 대조군간의 통계적 차이는 없었다(p=0.4878).

돼지의 부검에서 PRRS qPCR 양성 폐 조직의 그룹별 빈도가 아래 표 8.14에 요약되어 있다.

[표 8.14]

혈청 PRRS qPCR

D0에서 PRRSv RNA는 어떠한 돼지의 혈청에서도 검출되지 않았다. 백신접종 후 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 D7, D14, D21, D28, D56, D84, D112, D140 및 D168에 각각 3.00, 0, 0, 3.00, 0, 0, 0, 0 및 0 log₁₀GE/mL을 나타냈다. 이들 값은, 비록 시험처리 대조군에서 D182(DPC 3)까지 PRRSv RNA가 검출되지 않았더라도, D7, D14, D21 및 D28에서 시험처리 대조군에 비해 유의적으로 더 높았다(p≤0.0013).

D179(DPC 0)에서 PRRSv RNA는 어떠한 돼지의 혈청에서도 검출되지 않았다. 시험처리 후 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 D182(DPC 3), D186(DPC 7) 및 D189(DPC 10)에서 각각 4.44, 0 및 0 log₁₀GE/mL의 중앙값을 나타낸 반면, 시험처리 대조군은 같은 날에 각각 5.88, 5.30 및 4.24 log₁₀GE/mL를 나타냈다. 시험처리 후 모든 날에서 시험처리 대조군의 중앙값은 PRRS 94881 MLV 그룹보다 더 높았다(p≤0.0001).

연구 기간에 어떠한 음성 대조군 돼지의 혈청에서도 PRRSv RNA가 검출되지 않았다.

PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 AUC 중앙값은 DPC 0 내지 DPC 10의 기간에서 일당 15.54 log₁₀GE/mL이었고 DPC 3 내지 DPC 10의 기간에서 일당 8.88 log₁₀GE/mL이었다. 대조적으로, 시험처리 대조군의 AUC 중앙값은 DPC 0 내지 DP 10의 기간에서 일당 44.77 log₁₀GE/mL이었고 DPC 3 내지 DPC 10의 기간에서 일당 36.43 log₁₀GE/mL이었다. 양 기간 동안에 PRRS MLV 그룹의 중앙값은 시험처리 대조군의 중앙값보다 유의적으로 더 낮았다(p<0.0001).

혈청 PRRS qPCR 데이터가 아래 표 8.15 및 8.16에 요약되어 있다.

[표 8.15]

[표 8.16]

백신접종 후 D7, D14, D21 및 D28에 PRRS 94881 MLV 그룹은 시험처리 대조군에 비하여 qPCR 양성 돼지의 비율이 유의적으로 더 높았다(p≤0.0013). D56에서 qPCR 양성 돼지의 비율은 그룹간에 유의적 차이가 검출되지 않았다(p=0.1069).

D182(DPC 3)에서 PRRS 94881 MLV 및 시험처리 대조군의 모든 돼지(100%)은 qPCR 양성으로 나타났다(검정이 수행되지 않음). D186(DPC 7) 및 D189(DPC 10)에서, PRRS MLV 그룹은 시험처리 대조군에 비하여 qPCR 양성 돼지의 비율이 유의적으로 더 낮았다(<0.0001).

qPCR 양성 데이터의 그룹별 비율이 아래 표 8.17 및 8.18에 요약되어 있다.

[표 8.17]

[표 8.18]

시험처리 후 임상 관찰

시험처리 후 D185(DPC 6)에서 어떠한 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지에서도 이상호흡이 관찰되지 않은 한편, 시험처리 대조군의 경우에는 한 마리(149번)가 관찰되었으며 이것은 점수 "1"을 증명한다. 시험처리 후 적어도 한 날 동안에 이상호흡을 증명한 돼지의 비율에서 그룹간 차이는 검출되지 않았다(p=0.4878).

시험처리 후에 어떠한 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지 또는 시험처리 대조군 돼지에서도 이상행동 또는 기침은 관찰되지 않았다.

PRRS 94881 MLV-백신접종군 및 시험처리 대조군은 시험처리 후 적어도 한 날동안 >0의 임상 총점을 갖는 돼지의 비율이 각각 0% 및 5%였다. 이들 값은 유의적 차이가 있는 것이 아니다(p=0.4878).

D179 내지 D189의 기간에 음성 대조군에서 임상징후는 관찰되지 않았다.

시험처리 후 기간 동안에 적어도 한번의 양성 임상 관찰 점수를 갖는 돼지의 그룹별 빈도가 아래 표 8.19에 요약되어 있다.

[표 8.19]

시험처리 후 호흡 최고점수 또는 최고 총점에서 그룹간 차이는 없었다(p=0.4878).

시험처리 후 기간(DPC 1 내지 DPC 10)에서의 그룹별 임상 관찰 최고 점수가 아래 표 8.20에 요약되어 있다.

[표 8.20]

임상 관찰 평균 점수는 양성 임상 점수를 갖는 돼지의 비율과 유사한 양성을 밟았다. PRRS 94881 MLV-백신접종군과 시험처리 대조군사이에 유의적인 차이는 없었다(p≥0.4878).

시험처리 후 기간(DPC 1 내지 DPC 10)에서의 그룹별 평균 임상 관찰 점수가 아래 표 8.21에 요약되어 있다.

[표 8.21]

체중 및 평균 1일 체중 증가

그룹간에 유의적인 차이는 없었다(p=0.2389). D179(DPC 0)에서 PRRS 94881 MLV 그룹과 시험처리 대조군의 평균 및 LS 평균 체중은 각각 134.6 및 128.2 kg이었다. 이러한 차이는 유의적인 차이가 아니다(p=0.1090). D188(DPC 9)에서 PRRS 94881 MLV 그룹과 시험처리 대조군의 평균 및 LS 평균 체중은 각각 138.3 및 130.3 kg이었다. D188에서 백신접종군의 체중은 시험처리 대조군보다 유의적으로 더 무거웠다(p=0.0455).

시험처리 기간(DPC 0 내지 DPC 9)에 PRRS 94881 MLV 그룹 및 시험처리 대조군의 LS 평균 ADWG는 각각 0.4 및 0.2 kg/일이었다. 이들 값의 차이는 유의적인 것은 아니었다(p=0.1041).

음성 대조군 돼지는 D0, D179 및 D188에 평균 체중이 각각 2.7, 117.2 및 120.0 kg이었다. D179 내지 D188에서 음성 대조군의 ADWG는 0.5 kg/일이었다.

D0, D179(DPC 0) 및 D188(DPC 9)에서 그룹별 평균 체중 및 DPC 0 내지 DPC 9에서의 ADWG가 아래 표 8.22에 요약되어 있다. PRRS 94881 MLV 그룹 및 시험처리 대조군의 체중 및 ADWG의 LS평균 및 통계분석이 아래 표 8.23에 요약되어 있다.

[표 8.22]

[표 8.23]

직장 온도

시험처리일(D179)에 PRRS 94881 MLV 그룹의 평균 직장 온도는 39.3℃였고, 시험처리 후에는 평균 39.1℃(D189, DPC 10) 내지 39.8(D181, DPC 2)였다. 시험처리 대조군의 평균 직장 온도는 시험처리일에 39.1℃였고, 시험처리 후에는 평균 39.1℃(D183, DPC 4) 내지 39.9(D182, DPC 3)였다. 음성 대조군의 평균 직장 온도는 동일한 기간 내내 39.3℃ 이하를 유지하였다.

그룹별 직장 온도가 아래 표 8.24에 요약되어 있다.

[표 8.24]

DPC 0(p=0.0281), DPC 2(p=0.0095), DPC 4(p=0.0034) 및 DPC 5(p<0.0001)에서 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 시험처리 대조군에 비하여 최소 제곱 평균 직장 온도가 유의적으로 더 높았다. DPC8(p=0.0183) 및 DPC 10(p=0.0001)에서 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 시험처리 대조군에 비하여 최소 제곱 평균 직장 온도가 유의적으로 더 낮았다. 시험처리 후 잔여 기간에 그룹간 유의적 차이는 검출되지 않았다(p≥0.0642). 직장 온도의 그룹별 LS 평균 및 통계분석이 아래 표 8.25에 요약되어 있다.

[표 8.25]

PRRS 94881 MLV 백신접종 돼지 21마리 중 3마리(14%) 및 시험처리 대조군 20마리 중 5마리(25%)는 시험처리 후 적어도 한 날동안 직장 온도가 40.5℃ 이상이었다. 시험처리 후 적어도 한 날 동안 40.5℃ 이상의 직장 온도를 나타낸 돼지의 비율에서 그룹간 차이는 관찰되지 않았다(p=0.4537). 시험처리 후 적어도 한 날 동안 발열(40.5℃ 이상)을 보인 돼지의 그룹별 비율이 아래 표 8.26에 요약되어 있다.

[표 8.26]

백신접종 후 임상 평가

PRRS 94881 MLV 돼지 22마리 중 4마리(18%), 시험처리 대조군 돼지 22마리 중 8마리(36%) 및 음성 대조군 돼지 12마리 중 2마리(17%)는 D1 내지 D21의 기간중 적어도 한 날동안 이상 임상 평가를 나타냈다. 이 매개변수에 대해 그룹간 유의적 차이는 없었다(p=0.3102).

D1 내지 D21의 기간에 적어도 한 번의 이상 임상 평가를 보인 돼지의 그룹별 비율이 아래 표 8.27에 요약되어 있다.

[표 8.27]

종합해보면 7마리 PRRS 94881 MLV 돼지는 D1 내지 D177중 적어도 한 날동안 이상 임상 평가를 나타냈다.

돼지 121번은 D61 내지 D146의 기간에 둥근 종창을, D147 내지 D167의 기간에 막 팽창, D168에 둥근 종창, D169-172의 기간에 막 팽창 및 173 내지 177의 기간에 둥근 종창을 나타냈다. 돼지 141번은 D4-D10에 수척해 보였고, D4-D6에 우울증을 나타냈으며, D5에 거친 털을 보였다. 돼지 144번은 D26에 기침을 하였다. 돼지 146번은 D82에 흉골 부위에서 종창을 보였다. 돼지 147번은 D84-D86의 기간에 다리가 허약하였고 D84에 떨기 시작하였다. 돼지 154번은 D4-D6에 수척해 보였다. 돼지 179번은 D2-D5에 수척해 보였고, D5에 거친 털이 나타났으며, D6에 사망하였다. 시험처리 대조군의 13마리 돼지는 D1 내지 D177중 적어도 한 날 동안 이상 임상 평가를 나타냈다: 돼지 124번은 D20에 떨림 증상을 보였고 D21에 사망하였다. 돼지 134번은 D46-D68의 기간에 막 팽창을, D69-D143의 기간에 둥근 종창을, D144에 제대탈장을, D145 내지 D177의 기간에 둥근 종창을 나타냈다. 돼지 137번은 D108 내지 D143의 기간에 막 팽창을 보였다. 돼지 138번은 D115 내지 D143의 기간에 막 팽창을 보였다. 돼지 148번은 D16 내지 D20의 기간에 기면 또는 다리 팽창을 나타냈고 D35에 기침을 하였다. 돼지 149번은 D5 내지 D9 및 D12의 기간에 수척해 보였고 D12 내지 D15에 거친 털을 나타냈다. 돼지 150번은 D4-D9 및 D13의 기간에 수척해 보였고, D10-D12에 위독한 상태를 나타냈으며, D11에 우울증을 보였다. 돼지 161번은 D4-D9에 수척해 보였고, D9에 거친 털과 중추신경계징후를 나타냈으며, D10에 사망하였다. 돼지 167번은 D117-D143의 기간에 막 팽창을 나타냈다. 돼지 170번은 D4-D7에 수척해 보였고 D7에 우울증을 나타냈다. 돼지 172번은 D120 내지 D143의 기간에 상처 또는 곁발굽 팽창을 나타냈다. 돼지 177번은 D19에 우울증을, D156 내지 D159의 기간에 경부 종창을 나타냈다. 돼지 178번은 D5, D17-D20 및 D28-D36의 기간에 우울증을 나타냈고, D15-D47의 기간에 기면 및/또는 다리 팽창을 보였으며, D16-D18에 수척해 보였고, D39-D47에 다리에 결림증이 나타났다. 음성 대조군의 6마리 돼지는 D1 내지 D177중 적어도 한 날 동안에 이상 임상 평가를 나타냈다. 돼지 120번은 D5-7 및 D12에 기침을 하였다. 돼지 126번은 D2-18에 수척해 보였고, D4-D5, D10 및 D17-D19에 우울증을 나타냈으며, D5에 거친 털을 보였고, D18-D22에 호흡곤란을 나타냈다. 돼지 132번은 D49-D56에 농양을 보였다. 돼지 145번은 D37-D43 및 D46 내지 D74에 막 팽창을, D75-D83 및 D85 내지 D87에 막 상처를 보였다. 돼지 151번은 D78-D83 및 D85에 기면 및/또는 다리 팽창을 보였다. 돼지 155번은 D69-D77에 농양을 보였다.

시험처리 전에 세 마리가 사망하였다. 돼지 179번(PRRS 94881 MLV, D6): 부검 결과 최소 병변들이 발견되었다(수척하고 위독한 상태). 실험실 검정에서는 경미한 대식세포성 간질성 폐렴이 밝혀졌다. 면역조직화학 결과 PRRS에 음성이었다. 장 샘플은 자가분해되었으나 중증의 괴사 또는 중증의 염증 증거를 보이지는 않았다. 평활한 에스케리키아 콜라이 및 엔테로코커스 종이 분리되었다(섹션 15.9). 돼지 124번(시험처리군, D21): 부검에서 육안적 병변은 동정되지 않았다. 실험실 검정에서 화농성 혈관주위염과 함께 중중의 화농성 내지 화농육아종성 뇌염이 발견되었다. 뚜렷한 폐 및 간 울혈이 또한 발견되었다. 진단 결과 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis) 연관된 뇌염이었다. 돼지 161번(시험처리 대조군, D10): 부검 결과 최소 병변들이 발견되었다(수척하고 위독한 상태). 폐 조직에서 보르데텔라 브로키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 알파 용혈 스트렙토코커스 및 스타필로코커스 아우리쿨라리스(Staphylococcus auricularis)가 분리되었다.

PRRS 혈청검사

모든 돼지는 D0 및 D7에 PRRS ELISA 음성이었다. D14까지 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지의 90%가 양성 PRRS ELISA 역가를 나타냈다. 이 수는 D21에 95%로 증가하였고 D28, D56, D84, D112, D140 및 D168에 각각 100%, 100%, 100%, 90%, 100% 및 95%였다. 시험처리 대조군 돼지는 본 연구의 백신접종 기간에 PRRS 항체 역가를 발생하지 못했고, D14 내지 D168의 기간에 시험처리 대조군에 비해 유의적으로 더 높은 비율의 PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지가 양성 PRRS 항체 역가를 나타냈다(p<0.0001).

연구의 시험처리 단계 동안에 양성 PRRS ELISA 역가를 나타낸 PRRS 94881 MLV-백신

접종 돼지의 비율은 DPC 0, DPC 3, DPC 7 및 DPC 10에 각각 95%, 95%, 100% 및 100%였다. 대조적으로, 시험처리 대조군 돼지는 30%가 역가를 나타냈을 때인 DPC 7까지 PRRS 항체 역가를 발생하지 못했다. 이는 DPC 10에 80%로 증가하였다. PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 연구의 시험처리 기간 내내 양성 PRRS 항체 역가를 나타낸 동물의 비율이 더 높았다(p≤0.0478).

음성 대조군의 돼지는 D112에 두 마리를 제외하고 연구 내내 PRRS ELISA 혈청음성이었다. 116번 및 120번은 D112에 PRRS ELISA 혈청양성이었다.

시험처리 전에 양성 PRRS-항체 역가를 나타낸 돼지의 그룹별 비율이 아래 표 8.28에 요약되어 있다. 연구의 시험처리 부분으로부터의 데이터가 아래 표 8.29에 기재되어 있다.

[표 8.28]

[표 8.29]

논의/결론

연구 목적을 달성하기 위하여, 22마리의 건강한 PRRS 감염성 및 혈청음성 돼지에 생후 약 14일째에 1 mL의 PRRS 94881 MLV를 근육내로 접종하였다. 34마리(시험처리 대조군의 22마리 및 음성 대조군의 12마리)의 PRRS 감염성 및 혈청음성 돼지에 생후 약 14일째에 1 mL의 대조군 생성물을 근육내로 접종하였다.

연구 및 시험처리 모델의 타당성검증

음성 대조군의 돼지는 연구 내내 PRRSv(바이러스혈증; qPCR) 음성으로 유지되었다. 음성 대조군의 두 마리 돼지(116번 및 120번)은 D112에 양성 ELISA 역가를 나타낸 한편, 이 그룹의 다른 모든 ELISA 결과는 음성이었다. 이들 돼지 또는 이 그룹에서 전체적으로 바이러스혈증이 검출되지 않았고 마찬가지로 모든 다른 혈청 샘플이 ELISA 음성이었음을 고려해 볼때, D112에서의 위 두 마리에 대한 결과는 가능한 원인이 불명료한 실험실 오류에 의해 발생할 수 있는 위양성으로 판단되었다. 따라서, 본 연구는 타당성 있는 연구이다. 타당성 연구의 확립과 무관하게, 음성 대조군은 0.0%의 육안적 병변 중앙 점수와 대조적으로 D189에서 9.0%의 조직학적 폐 병변 중앙점수를 나타냈다. 이들 데이터는 정상적인 양돈 조건하에 연장된 기간 동안 수용된 돼지들이 중요하지 않으며 특정 병원체와 무관한 약간의 폐 병변을 발생함을 가리킨다.

앞에서 기술한 방법에 의해 유럽형 PRRS 분리체 205817을 접종한 결과로 시험처리 대조군은 DPC 0 내지 DPC 9의 기간에 0.2 kg/일의 평균 ADWG(음성 대조군의 경우 0.5 kg/일의 평균 ADWG), 13.8%의 육안적 폐 병변 중앙점수(음성 대조군의 경우 0.0%), 19.5의 조직학적 폐 병변 중앙점수(음성 대조군의 경우 9.0) 및 폐 조직내 PRRSv RNA의 검출에서 6.25 log₁₀GE/mL의 중앙값(음성 대조군의 경우 0.0 log₁₀GE/mL의 중앙값)을 나타냈다. 이들 결과는 PRRS-특이적 임상 질환이 시험처리 대조군에서 유도되었음을 가리키며, 따라서 이 시험처리 모델을 PRRS 백신 효능 및 보다 특정적으로는 PRRS 94881 MLV의 26주 면역지속기간을 평가하는데 적합한 임상 실험 도구로서 타당함을 검증한다.

PRRS 94881 MLV의 26주 면역지속기간의 결정

PRRS 94881 MLV의 백신접종 후 26주 DOI의 결정은 시험처리 대조군과 비교하여 시험처리 후 폐 병변(육안적 또는 조직학적)의 유의적인 감소(p≤0.05)를 나타내는 백신군에 근거하였다.

육안적 및 조직학적 폐 병변은 돼지의 PRRS 호흡기 시험처리 모델내에서 새로운 백신을 평가할 때 가장 임상적으로 연관이 있고 확실한 효능 증거를 제공하는 매개변수이기 때문에 2주 DOI를 결정하는 주요 매개변수로 선정되었다. 폐 병변 발생은 돼지에서 나타나는 PRRS 호흡기 질환의 특징중 하나이며, 이차적인 PRRSv 질환 특징인 후속적인 징후, 예를 들면 임상 징후, 발열, ADWG의 감소 등의 원인으로 고려될 수 있다.

PRRS 94881 MLV 그룹은, 13.8%의 육안적 폐 병변 중앙점수를 나타낸 시험처리 대조군에 비하여, 0.1%의 육안적 폐 병변 중앙점수에 의해 입증되는 바와 같이 시험처리 후 육안적 폐 병리의 유의적인 감소를 나타냈다(p<0.0001). 또한, PRRS 94881 MLV 그룹은, 19.5의 조직학적 폐 병변 중앙점수를 나타낸 시험처리 대조군에 비하여, 6.0의 조직학적 폐 병변 중앙점수에 의해 입증되는 바와 같이 조직학적 폐 병변 점수의 유의적인 감소를 나타냈다(p<0.0001). 따라서, 1 x 10^4.27TCID₅₀의 용량에서 PRRS 94881 MLV의 26주 DOI는 일차적인 매개변수로서 시험처리 후 폐 병변의 유의적 감소를 근거로 설정되었다. 이 결과는 1 x 10^4.5TCID₅₀/mL의 목표최소면역용량보다 약간 더 적은 백신 용량으로 달성되었다. 한 마리 시험처리 대조군 돼지(123번)은 세균 감염으로 인한 확산 늑막염 및 유착때문에 육안적 폐 병변 점수를 정할 수 없었지만 조직학적 폐 병변 점수는 정하였다. 시험처리 대조군의 육안적 폐 병변 점수 분석으로 이 돼지를 배제했더라도 본 연구의 결과에 영향을 미치는 것은 없었다.

시험처리 후 바이러스혈증은 바이러스에 노출된 숙주 동물에서 일어나는 바이러스 복제 및 생존력의 수준을 대표하기 때문에 가장 중요한 이차 매개변수로 선택되었다. 바이러스혈증의 유의적인(p≤0.05) 감소는 숙주내에서 PRRS 발병을 제한하는데 적절한 면역성을 유도하는 PRRS 백신에 부합한다. 시험처리 후 3, 7 및 10일에, PRRS 94881 MLV-백신접종군은 시험처리 대조군과 비교하여 바이러스혈증(qPCR)의 유의적인 감소를 증명하였다(p<0.0001). 그룹간에 시험처리 후 바이러혈증을 추가로 평가하기 위하여, 시험처리 후 특정 기간에서의 바이러스 농도의 양을 곡선하면적 또는 AUC로서 계산하였다. PRRS 94881 MLV-백신접종군은 DPC 0 내지 DPC 10에서 15.54 log₁₀GE/mL/일의 중앙 AUC 값을 나타낸 반면, 시험처리 대조군은 44.77 log₁₀GE/mL/일의 중앙 AUC 값을 나타냈다(p<0.0001). 추가로, PRRS 94881 MLV-백신접종군은 DPC 3 내지 DPC 10의 기간에 중앙 AUC 값이 8.88 log₁₀GE/mL/일이었고, 반면에 시험처리 대조군은 같은 기간에 중앙 AUC 값이 36.43 log₁₀GE/mL/일이었다(p<0.0001). 바이러스혈증을 시험처리 후 특정 시점에 또는 시험처리 후 기간 내내 검정해 보더라도, PRRS의 맹독성 이종 유럽형 스트레인으로 시험처리하기 26주전에 투여된 PRRS 94881 MLV는 시험처리 접종 후 바이러스혈증을 유의적으로 감소시켰다(p≤0.05).

시험처리 후 PRRS 바이러스혈증의 감소와 연관된 폐 조직내 바이러스 농도의 유의적인(p≤0.05) 감소 또한 PRRS 백신의 면역성 양상에서 대단히 중요하다. 폐 조직내 바이러스 농도의 감소는 숙주내에서 바이러스 안정성, 복제 및 생존력의 감소과 연관이 있을 수 있으며 이차적으로 다른 돼지로의 PRRSv의 확산 감소를 유도할 수 있다. 본 연구에서, PRRS 94881 MLV 그룹의 폐 조직은 시험처리 후 10일째(DPC 10)에 3.69 log₁₀GE/mL의 중앙 폐 qPCR 결과를 나타낸 반면, 시험처리 대조군은 6.25 log₁₀GE/mL의 중앙 폐 qPCR 결과를 나타냈다. 백신군과 시험처리 대조군간의 차이는 유의적이었으며(p<0.0001), 이에 따라 26주의 면역지속기간을 지지한다.

시험처리 후 새끼 돼지의 임상 징후에서 중증도 및 빈도의 뚜렷한 감소는 또한 PRRS 94881 MLV의 PRRS 백신 효능 및 26주 DOI의 설정을 지지한다. 단지 한 마리 돼지만 시험처리 후에 임상 징후를 나타냈다: 돼지 149번(시험처리 대조군)은 D185에 호흡기 점수가 "1"(헐떡거림/가쁜호흡)이었다. PRRS 94881 MLV-백신접종군의 어떠한 돼지도 본 연구의 시험처리 후 단계 동안에 임상 징후를 나타내지 않았고 백신접종군과 시험처리 대조군간의 통계상 차이는 없었다(p=0.4878 또는 검정을 실시하지 않음). 시험처리 후 임상 징후는 본 연구에서 DOI를 평가하기에 충분히 강하지 않았다.

그룹간 발열은 시험처리 후 다양하였다. PRRS 94881 MLV-백신접종 돼지는 시험처리 대조군 돼지에 비하여 DPC 8 및 DPC 10의 2일간에 유의적으로 더 낮은 LS 평균 직장 온도(p≤0.0183) 및 DPC 0, DPC 2, DPC 4 및 DPC 5의 4일간에 더 높은 LS 평균 직장 온도(p≤0.0281)를 나타냈다. 한편, 시험처리 후 그룹간 유의적인 차이는 검출되지 않았다(p≥0.0642). 비록 그룹간 통계적 차이가 시험처리 후에 검출되었지만, 모든 그룹에서 평균 직장 온도가 ≤39.9℃(시험처리 대조군, D182)로 유지되었음을 고려할 때 이들 차이는 생물학적으로 의미가 있는 것은 아니었다. 시험처리 후 적어도 한 날 동안 발열을 나타낸 돼지의 비율에 있어서 그룹간 차이는 검출되지 않았다(p=0.4537).

시험처리 대조군에서 PRRS로 인한 유의적인 바이러스혈증, 폐병리 및 폐 조직내 바이러스 농도의 존재는 DPC 9에 그룹간 체중의 유의적(p≤0.05) 차이를 유도하였다. 본 연구에서, 백신접종군 및 시험처리 대조군은 DPC 9에 LS 평균 체중이 각각 138.3 kg 및 130.3 kg이었다(p=0.0455). 백신접종군 및 시험처리 대조군은 DPC 0 내지 DPC 9의 기간에 LS 평균 ADWG가 각각 0.4 kg/일 및 0.2 kg/일이었다. 이 차이는 통계상 유의적인 것은 아니다(p=0.1041).

본 연구에서 검사된 백신접종 후 매개변수

세 마리 돼지가 본 연구의 백신접종 단계에서 사망하였다. 돼지 179번(PRRS 94881 MLV-백신접종군)은 평활한 에스케리키아 콜라이 및 엔테로코커스 종의 감염 원인으로 D6에 사망하였다. 돼지 161번(시험처리 대조군)은 보르데텔라 브로키셉티카, 알파 용혈 스트렙토코커스 및 스타필로코커스 아우리쿨라리스의 감염 원인으로 D10에 사망하였다. 돼지 124번(시험처리 대조군)은 뇌염을 유도하는 스트렙토코커스 수이스의 감염 원으로 D21에 사망하였다. 추가의 사망을 통제하고 방지하기 위하여, 돼지를 주사용 비타민 및 항생제로 대량 처리하였다. 처리 후 더 이상의 사망은 발생하지 않았다. 양 처리군에서 사망이 발생하였기 때문에 IVP 자체가 감염과 연관이 없었다는 것을 가정할 수 있다. 아마도, 돼지들은 이러한 감염이 잠복한 연구 시설에 수용되었다. 이들 돼지에 대한 데이터는 활용가능할 때 포함되었다. 이들 돼지의 육안적 및 조직학적 폐 병변 점수는 이들 돼지가 시험처리 투여 전에 사망하였기 때문에 폐 병변 분석으로부터 제외하였다. 백신접종 후부터 시험처리까지의 연장 기간 동안에 한 마리 PRRS 94881 MLV 돼지 및 두 마리 시험처리 대조군 돼지의 유실이 연구 결과에 영향을 주는 것은 아니었다.

PRRS 94881 MLV 백신접종 또는 대조군 생성물과 연관된 이상 임상 평가는 D0에서의 접종 후 돼지에서 관찰되지 않았다. PRRS 94881 MLV-백신접종군의 7마리 돼지가 백신접종 후 이상 평가를 나타낸 한편, 시험처리 대조군 돼지는 13마리가 이상 평가를 나타냈다. 세균 감염으로 사망한 세 마리 돼지를 제외하고, 이들 이상 평가는 여러 시간대에서의 쇠약, 기침, 종창, 거친 헤어 코트, 우울증, 농양 및 빈약한 건강상태을 포함하였고, 이러한 증세들은 일정 기간 이상으로 지속되지는 않았다. 본 발명자의 견해에 따르면, 이러한 소견은 양 실험물질의 투여와 무관하였고 시간이 흐르면서 집단 수용 상황에서 성장하는 돼지에서 전형적으로 발견되는 것이다.

모든 돼지는 D0에 PRRS ELISA 혈청음성이었고, 이것은 모든 돼지가 연구 등록시 PRRS 혈청음성이어야 하는 선정 기준을 충족하였음을 입증한다. PRRS 94881 MLV를 투여받은 돼지의 대다수(90%)는 D14까지 PRRS로 혈청전환되었고 모든 PRRS 백신접종 돼지는 D28까지 혈성양성을 나타냈다. 대조적으로, 시험처리 대조군은 PRRS 혈청전환을 증명하기 시작했을 때인 시험처리 후 7일까지 혈청음성으로 나타났다. 앞서 언급한 바와 같이, 두 마리 음성 대조군 돼지에서 D112에 PRRS ELISA 혈청양성으로 나타났으나 이는 아마도 불명료한 실험실 오류가 원인일 수 있는 우발적 소견으로 고려되었다.

백신접종 후 7, 14, 21 및 28일째에 PRRS 94881 MLV-백신접종군은 중앙 qPCR 결과가 각각 3.00, 0, 0 및 3.00 log₁₀GE/mL이었다. 이들 결과는 백신접종 후 4주내에 PRRS 94881 MLV의 1 x 10^4.27TCID₅₀ 용량이 백신접종 후 4주째에 이미 방어면역을 발생하는데 흔히 요구되는 MLV의 충분한 복제를 유도하였음을 가리킨다. 대조적으로, 시험처리 대조군은 시험처리 후 3일까지 PRRS 바이러스혈증이 음성으로 나타났다.

결론

부검에서의 육안적 및 조직학적 폐 병변, 부검에서의 폐 조직내 바이러스 농도 및 시험처리 후 바이러스혈증에 있어서 시험처리 대조군에 비하여 PRRS 94881 MLV 그룹의 유의적인 감소(p≤0.05)는 생후 2주째에 백신접종되고 백신접종 후 26주째에 시험처리되었을 때 맹독성 PRRSv에 대한 백신 효능을 증명하였다. 따라서, 본 연구의 결과는 PRRS 94881 MLV의 백신접종 후 26주 면역지속기간의 증명을 지지한다. 이들 결과는 최소면역용량(1 x 10^4.5 TCID₅₀/mL)보다 약간 더 적은 1 x 10^4.27 TCID₅₀/mL의 백신 용량으로 달성되었다.

PRRSV 94881 약독화 스트레인 및 모 스트레인의 서열은 다음과 같다:

서열번호 1: 94881의 PRRS 마스터 종균 바이러스의 전장 뉴클레오타이드 서열

서열번호 2: 뉴클레오타이드 178..7227사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 1a

서열번호 3: 뉴클레오타이드 7209..11600사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 1b

서열번호 4: 뉴클레오타이드 11611..12360사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 2

서열번호 5: 뉴클레오타이드 12219..13016사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 3

서열번호 6: 뉴클레오타이드 12761..13312사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 4

서열번호 7: 뉴클레오타이드 13309..13914사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 5

서열번호 8: 뉴클레오타이드 13902..14423사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 6

서열번호 9: 뉴클레오타이드 14413..14799사이의 서열번호 1의 서열에 의해 암호화된 94881 MSV의 ORF 7

서열번호 10: 모 PRRS 스트레인 94881의 전장 뉴클레오타이드 서열

서열번호 11: 뉴클레오타이드 178..7227사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 1a

서열번호 12: 뉴클레오타이드 7209..11600사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 1b

서열번호 13: 뉴클레오타이드 11611..12360사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 2

서열번호 14: 뉴클레오타이드 12219..13016사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 3

서열번호 15: 뉴클레오타이드 12761..13312사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 4

서열번호 16: 뉴클레오타이드 13309..13914사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 5

서열번호 17: 뉴클레오타이드 13902..14423사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 6

서열번호 18: 뉴클레오타이드 14413..14799사이의 서열번호 10의 서열에 의해 암호화된 모 PRRSV 스트레인 94881의 ORF 7

서열번호 19: 약독화 PRRSV 94881 ORF1A를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 20: 약독화 PRRSV 94881 ORF1B를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 21: 약독화 PRRSV 94881 ORF2를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 22: 약독화 PRRSV 94881 ORF3을 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 23: 약독화 PRRSV 94881 ORF4를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 24: 약독화 PRRSV 94881 ORF5를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 25: 약독화 PRRSV 94881 ORF6를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 26: 약독화 PRRSV 94881 ORF7를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 27: 모 PRRSV 94881 ORF1a를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 28: 모 PRRSV 94881 ORF1b를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 29: 모 PRRSV 94881 ORF2를 암호화하는 뉴클레오타이드

서열번호 30: 모 PRRSV 94881 ORF3을 암호화하는 뉴클레오타이드

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유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC) ECACC11012501 20110125 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC) ECACC11012502 20110125

SEQUENCE LISTING <110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA GMBH <120> NOVEL EUROPEAN PRRSV STRAIN <130> 10-0137 <150> US 61/444,074 <151> 2011-02-17 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 14843 <212> DNA <213> Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <400> 1 tttgtgtacc ttggaggcgt gggtacagcc ctgccccacc ctttggtccc tgttctagcc 60 cgacaagtac ccttctctct cggggcgagc gcgccgcctg ctgctccctt gcggcgggaa 120 ggacctcccg agtatttccg gagagcacct gctttacggg atctccgccc tttaaccatg 180 tctgggatgt tctcccggtg catgtgcacc ccggctgccc gggtattttg gaacgccggc 240 caagtctatt gcacacggtg tctcagtgca cggtctcttc tctctccaga acttcaggac 300 acggacctcg gtgcagttgg cttgtttcac aagcctaaag acaagctcca ttggaaagtt 360 cccattggta tcccccaggt ggaatgttct ccatctgggt gttgctggct gtcaaccatt 420 tttcctttag cgcgcatgac ctccggcaat cacaacttcc ttcaacgact cgtgaaggtt 480 gctgatgtat tgtaccgtga cggttgctta acccctagac acctccgtga actccaagtt 540 tacgagcgtg gttgcaattg gtatccgatt acggggcctg tgcctgggat ggctgtgtac 600 gcgaactcca tgcacgtgtc cgaccaaccg 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<213> Artificial Sequence <220> <223> ORF 5 OF PARENTAL PRRSV STRAIN 94881 ENCODED BY SEQUENCE OF SEQ ID NO:10 BETWEEN NUCLEOTIDES 13309..13914 <400> 16 Met Lys Cys Ser Cys Lys Leu Gly His Phe Leu Thr Pro His Ser Cys 1 5 10 15 Phe Trp Trp Leu Phe Leu Leu Cys Thr Gly Leu Ser Trp Ser Phe Val 20 25 30 Asp Gly Asn Asp Asn Ser Ser Thr Ser Gln Tyr Ile Tyr Asn Leu Thr 35 40 45 Ile Cys Glu Leu Asn Gly Thr Glu Trp Leu Ser Gly His Phe Asp Trp 50 55 60 Ala Val Glu Thr Phe Val Leu Tyr Pro Val Ala Thr His Ile Ile Ser 65 70 75 80 Leu Gly Phe Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Ala Leu Gly Leu Gly 85 90 95 Ala Val Ser Ala Thr Gly Phe Ile Gly Glu Arg Tyr Val Leu Ser Ser 100 105 110 Met Tyr Gly Val Cys Ala Phe Ala Ala Leu Val Cys Phe Val Ile Arg 115 120 125 Ala Ala Lys Asn Cys Met Ala Cys Arg Tyr Ala Arg Thr Arg Phe Thr 130 135 140 Asn Phe Ile Val Asp Asp Arg Gly Arg Ile His Arg Trp Lys Ser Ser 145 150 155 160 Ile Val Val Glu Lys Leu Gly Lys Ala Glu Val Gly Gly Asp Leu Val 165 170 175 Asn Ile Lys His Val 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170 <210> 18 <211> 128 <212> PRT <213> Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <400> 18 Met Ala Gly Lys Asn Gln Ser Gln Lys Lys Arg Arg Asn Ala Ala Pro 1 5 10 15 Met Gly Lys Gly Gln Pro Val Asn Gln Leu Cys Gln Leu Leu Gly Thr 20 25 30 Met Ile Lys Ser Gln Arg Gln Gln Ser Arg Gly Gly Gln Ala Lys Lys 35 40 45 Lys Lys Pro Glu Lys Pro His Phe Pro Leu Ala Ala Glu Asp Asp Ile 50 55 60 Arg His His Leu Thr Gln Ala Glu Arg Ser Leu Cys Leu Gln Ser Ile 65 70 75 80 Gln Thr Ala Phe Asn Gln Gly Ala Gly Thr Ala Ser Leu Ser Ser Ser 85 90 95 Gly Lys Val Ser Phe Gln Val Glu Phe Met Leu Pro Val Ala His Thr 100 105 110 Val Arg Leu Ile Arg Val Thr Ser Thr Ser Ala Ser Gln Gly Ala Asn 115 120 125 <210> 19 <211> 7050 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding attenuated PRRSV 94881 ORF1A <400> 19 atgtctggga tgttctcccg gtgcatgtgc accccggctg cccgggtatt ttggaacgcc 60 ggccaagtct attgcacacg gtgtctcagt gcacggtctc ttctctctcc agaacttcag 120 gacacggacc tcggtgcagt tggcttgttt cacaagccta aagacaagct ccattggaaa 180 gttcccattg gtatccccca ggtggaatgt tctccatctg ggtgttgctg gctgtcaacc 240 atttttcctt tagcgcgcat gacctccggc aatcacaact tccttcaacg actcgtgaag 300 gttgctgatg tattgtaccg tgacggttgc ttaaccccta gacacctccg tgaactccaa 360 gtttacgagc gtggttgcaa ttggtatccg attacggggc ctgtgcctgg gatggctgtg 420 tacgcgaact ccatgcacgt gtccgaccaa ccgttccctg gtgccactca tgtgttaaca 480 aattcccctt tgcctcaacg ggcttgtcgg cagccgttct gtccgttcga agaggcccat 540 tctagcatat acaggtggga aaaatttgta atttttatgg attcctcctc cgacggtcga 600 tctcgcatga tgtggactcc ggaatccgat gactccacgg ctttggaagt tctgccgccc 660 gagctagaac accaggtcaa ggtccttgtt cggagctttc ccgcccatca ccttgtcgac 720 cttgccgatt gggagctcac tgagtcccct gataacggtt tttccttcag cacgtcacat 780 ccttgcggct accttgttcg ggacccggct gtatccgaag gcaagtgttg gctttcctgc 840 tttttgagcc agtcagccga agtgctcagt cgcgaggcgc atctggctac cgcctatggt 900 taccaaacca agtggggtgt gcctggcaag tacatccagc gcagacttca agttcacggt 960 ctccgtgctg tggtcgaccc tgatggtccc attcacgttg aagcattgtc ttgcccccag 1020 tcttggatca ggcacttgac cctgaatgat gatgtcaccc cgggattcgt tcgcctaatg 1080 tctcttcgca ttgtgccgaa cacagagcct accacacacc ggatctttcg ttttggagtg 1140 cacaagtggt atggtgccgc cggcaaacgg gcccgtggca agcgtgccgc caaaagtgag 1200 aaagactcgg cttccaccct caaggttgcc cgaccgactt ccaccagtgg aatcgtcacc 1260 tactccccac ctgcggacgg gtcttgtggt tggcatgccc ttgccgccat actgaaccgg 1320 atgattaata atgacttcac gtcccctctg cctcggtaca acaggccgga ggacgattgg 1380 gcttctgatg gtgaccttgc tcaggccatt caatgtttgc aactacctgc cgccatagct 1440 cggaaccgcg cctgccctaa cgccaaatac ctcataaaac tcaacggagt tcattgggag 1500 gtagaggtga ggcctggaat ggctcctcgc tccctctctc gtgagtgcgt tgttggcgtc 1560 tgctctgaag gctgtgtcgc gtcgccttac ccggaggacg ggttgcctaa acgtgcactt 1620 gaggccctgg cgtctgctta tagactgcct tcagactgtg tttgtgatgg tattattgac 1680 ttccttgcca atccacctcc ccaggagttc tggactcttg acaaaatgtt gacttccccg 1740 tcaccggagc agtccggctt ctctagtctg tataaattgt tgttagagat cttgccgcag 1800 aaatgcggat ccacagaagg ggaattcatc tatactgttg agaggatgtt gaaggattgt 1860 ccgagctcca aacaggccat ggccctcctt gcaaaaatta aggtcccatc ctcaaaggcc 1920 ccatccgtga ctctgaacga gtgcttcccc acggatgttc cagtcaactc tgagttaata 1980 tcttgggaag agcccaaaga ccctggcgct gctgttgtcc tatgtccatc ggatgcaaaa 2040 gaatctaagg aaacagcccc tgaagaagct caagcgagaa accgtaaggt ccttcaccct 2100 gtggtcctta ccgaggaact tagcgagcaa caggtgcagg tggttgaggg tgatcaggat 2160 atgccactgg atttgacttg gccaacctta accgctacgg cgacccctgt tagagggccg 2220 gtaccggaca atttgagctc tggcattggt gcccagcccg ctaccgttca agaactcatt 2280 ctggcgaggc ctgcaccccg tcttgttgag cgctgtggca cggagtcgaa cggcagcagt 2340 tcatttctgg atttgcctga cgtgcagacc tcggaccagc ctttagacct gtccctggcc 2400 gcgtggcctg taagggctac cgcgtctgac cccggttgga tccacggtag gcgtgagcct 2460 gtctttgtga agcctcgagg tgttttctct gatggcgagt cggcccttca gttcggagag 2520 ctttccgaag ccagttctgt cgtcgatgac cggacaaaag aagctccggt ggttgacgcc 2580 cccatcgatt tgacaacttc gaacgagacg ctctctgggt ctgacccctt tgaattcgcc 2640 aaattcaggc gcccgcgttt ctccgcgcaa gctttaatcg accgaggtgg tccgcttgcc 2700 gatgttcatg caaagataaa gagtcgggta tatgaacaat gccttcaagc ttgtgaacct 2760 ggtagtcgtg cgaccccagc caccaagaag tggctcgaca aaatgtggga cagggtggac 2820 atgaaaactt ggcgctgcac ctcgcagttc caagctggtc acattcttga gtccctcaaa 2880 ttcctccctg acatgattca agacacaccg cctcctgttc ccaggaagaa ccgagctggt 2940 gacagtgccg gcctgaagca actggtggcg cagtgggata ggaaatcgag tgtgacaccc 3000 cccacaaaac cggttggacc ggtgcttgac caggccgtcc ctctgcctat ggacatccag 3060 caaggagatg ccatctccgc tgacaagcca ccccattcgc aaaacccttc tagtcaagta 3120 gatgtgggtg gaggttggaa aagttttatg ctctccggca cccgtttcgc ggggtccgtt 3180 agtcagcgcc ttacgacatg ggtttttgag gttctctccc atctcccagc ttttatgctc 3240 acacttttct cgccacgggg ctctatggct ccaggtgatt ggctgtttgc aggtgctgtt 3300 ctacttgctc tcctgctctg ccgttcttac ccaatactcg gatgccttcc cttattgggt 3360 gtcttttctg gttctgtgcg gtgtgttcgt ttgggtgttt ttggttcttg gatggctttt 3420 gctgtatttt tattctcgac tccacccgac ccagtcggtt cttcttgtga ccacgattcg 3480 ccggagtgtc atgctgagct tttggctctt gagcagcgcc aactttggga acctgtgcgc 3540 agccttgtgg tcgggccatc gggcctctta tgcgtcattc ttggcaagtt actcggtggg 3600 tcacgttgtc tctggtttgt tctcctacgt atatgcatgc tcgcagattt ggcaatttct 3660 cttatttatg tggtgtccca agggcgttgt cacaagtgtt ggggaaagtg tataaggacg 3720 gctcctgcag aagtggccct taatgtgttt cctttttcgc gcgccacccg ctcatctctt 3780 gtgtccttgt gtgatcggtt ccaagcgcca aaaggagttg accccgtgca cttggcgaca 3840 ggctggcgcg ggtgctggtg tggtgagagc cctattcatc aatcacacca aaaaccgata 3900 gcttatgcca acttggatga aaagaagata tccgcccaga cggtgattgc tgtcccgtat 3960 gatcctagtc aggccattaa atgcctgaaa gttttgcagg caggaggggc tattgtggac 4020 cagcctacgc ccgaggtcgt ccgtgtgtct gagattccct tctcggcccc attttttccg 4080 aaggtcccag tcaacccaga ctgcagggtt gtggtagatt cggacacttt tgtggctgcg 4140 gtccgctgcg gttattcgac agcacaactg gtccttggtc ggggcaactt tgccaagcta 4200 aatcagaccc ccctcaggaa ctctgtcccc accaaaacaa ctggtggggc ctcatacacc 4260 cttgccgtgg cccaggtatc tgtgtggact cttgttcatt tcatcctcgg cctttggtta 4320 acgtcacctc aagtgtgtgg tcgagggacc tctgacccgt ggtgttcgaa ccctttttcg 4380 tatcctactt atggccccgg agttgtgtgt tcctctcgac tctgcgtgtc tgccgacgga 4440 gttaccctgc cattgttctc agccgttgcc catctttccg gtagagaggt ggggattttt 4500 attttggtgc ttgcctcctt gggcgcttta gcccaccgct tggctcttaa ggcagacatg 4560 tcaatggtct ttttggcgtt ttgtgcttac gcctggccca tgagctcctg gttaatttgc 4620 ttctttccta tgctcttgag gtgggtaacc cttcatcctc tcactatgct ttgggtgcac 4680 tcatttttgg tgttttgcct accagctgcc ggcgttctct cgctgggaat aaccggtctt 4740 ctttgggcag ttggccgttt cacccaggtt gccggaatta tcacacctta tgacatccac 4800 cagtatacct ccggaccacg tggtgcagct gctgtagcaa cggctccaga aggtacttac 4860 atggcggccg ttcggagagc cgctttgact ggacggactt tgatcttcac accatctgca 4920 gtcggatccc ttcttgaagg tgctttcaga actcaaaagc cctgccttaa caccgtgaat 4980 gtcgtaggct cttcccttgg ttctggagga gttttcacca ttgatggcag aagagtcatc 5040 gtcactgcca cccatgtgtt gaatggtaac acagccaggg tcactggtga ttcctacaac 5100 cgcatgcaca cgttcaatac taatggtgat tatgcctggt cccatgctga tgactggcaa 5160 ggcgttgccc ctatggttaa gatcgctaag gggtatcgcg gtcgtgccta ctggcaaacg 5220 tcaaccggag tcgaacctgg catcatgggg gaaggattcg ccttctgttt cactaactgt 5280 ggcgactcag ggtcacctgt catttcagaa gctggtgacc ttattggagt ccataccggt 5340 tcaaacaaac tcggttctgg tcttgtgaca acccctgaag gggagacctg ctccatcaag 5400 gaaactaggc tctctgacct ttctagacat tttgcaggtc caagcgtccc tcttggggac 5460 attaagttga gcccagccat catccctgat gtgacaacta ttccgagtga cttggcatcg 5520 ctccttgctt ctgtccccgt gatggaaggt ggcctctcaa ctgtccagct tttgtgcgtc 5580 tttttccttc tctggcgcat gatgggccat gcctggacac ccattgttgc cgtaggcttc 5640 tttttgctga atgaaattct cccagcagtc ttggtccgag ctgtgttctc ttttgcactc 5700 tttgtacttg catgggccac cccctggtcg gcacaagtgt tgatgattag actcctcacg 5760 gcggctctca accgcaacag gttgtccctg gcgttctacg cattcggagg tgtcgttggc 5820 ctggccacag aaatcgggac ttttgctggt ggatggcctg aactgtccca agccctctcg 5880 acatactgct tcctgcccag gttccttgct gtgactagtt atgtccccac catcatcatc 5940 ggtgggctcc atgccctcgg cgtaattttg tggttattca aataccgatg cctccacaac 6000 atgctggttg gtgatgggag tttctcaagc gctttcttcc tacggtattt tgctgagggt 6060 aatcttagga aaggcgtgtc gcagtcctgt ggcatgaata acgaatccct gacagctgct 6120 ttggcttgca agttgtcgca agctgacctt gattttttgt ccagtttaac gaacttcaag 6180 tgctttgtgt ccgcttcaaa catgaaaaat gcagctggcc aatacatcga ggcggcgtat 6240 gctagagctc tgcgtcagga gctggcctcc ttggttcagg ttgacaagat gaaaggagta 6300 ttggccaagc tcgaggcttt cgctgagacg gccactccgt cacttgacac aggggacgtg 6360 attgttctgc ttgggcaaca cccccatgga tccatcctcg acattaatgt ggggggtgaa 6420 aggaaaactg tgtctgtgca agaaacacga tgcctgggtg gttccaaatt cagtgtctgc 6480 actgtcgtgt ccaacacgcc cgtggatacc ttgaccggta tcccacttca gacgccaacc 6540 ccactttttg aaaatggccc gcgccatcgc agcgaggacg acgacctcaa agttgagaga 6600 atgaaaaaac actgtgtatc cctcggcttc cacaaaatca atggtaaagt ttactgcaaa 6660 atttgggaca agtctaacgg cgacaccttt tacacggatg attcccgata cactcaagac 6720 catgcttttc aggacaggtc aaccgactat agagacaggg attatgaagg tgtacagacc 6780 gccccccaac agggattcga tccaaagtcc gaagcccctg ttggcactgt tgtaatcggt 6840 ggcattacgt ataacaggca tctggtcaaa ggtaaggagg tcctagttcc caaacctgac 6900 aactgccttg aagctgccag actgtccctt gagcaagctc ttgctgggat gggccaaact 6960 tgtgacctta cagctaccga agtggagaaa ctaaagcgca tcattagtca actccaaggt 7020 ctgaccactg aacaggcttt aaactgctag 7050 <210> 20 <211> 4392 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding attenuated PRRSV 94881 ORF1B <400> 20 acaggcttta aactgctagc cgccagcggc ttgacccgct gtggccgcgg cggcctagtt 60 gtaactgaaa cggcggtaaa aatcgtaaaa taccacagca gaactttcac cttaggctct 120 ttagacctaa aagtcacctc cgaggtggag gtgaagaaat caactgagca ggggcacgct 180 gtcgtggcga acttatgttc cggtgtcgtc ttgatgaggc ctcacccacc gtcccttgtt 240 gacgttctcc tcaaacccgg acttgacaca acacccggca ttcaaccagg gcatggggcc 300 gggaatatgg gcgtgaacgg ttctatttgg gattttgaaa ctgcacccac aaaggtagaa 360 ctagagttgt ccaagcaaat aatccaagca tgtgaagtca ggcgcgggga cgcccctaac 420 ctccaactcc cctacaagct ttatcctgtc aggggggacc ccgagcggcg taaaggtcgc 480 cttgtcaaca ctaggtttgg agatttacct tacaaaactc cccaagacac caagtccgca 540 attcatgcgg cttgttgcct gcatcccaat ggggtcctcg tgtctgatgg caaatccacg 600 ctgggtacca ctcttcaaca tggtttcgag ctttatgtcc ccactgtacc ttatagtgtc 660 atggaatacc ttgattcacg ccctgacacc ccttttatgt gtactaaaca tggcacttcc 720 aaggctgctg cagaggacct ccaaaaatat gacctatcca ctcaagggtt tgtcttgcct 780 ggggtcctac gcctagtgcg caggttcatc tttagccatg ttggtaaggc gccaccactg 840 ttccttccat caacctaccc tgccaagaac tccatggcag gggtcaatgg ccagaggttc 900 ccaacaaagg atgtccagag catacctgaa attgatgaaa tgtgcgcccg tgccgtcaag 960 gaaaattggc agactgtgac accttgcacc ctcaaaaaac agtactgttc caaacctaaa 1020 actagaacca tcctaggtac caacaacttc atagccttgg ctcacaggtc agcactcagt 1080 ggtgtcaccc aggcgttcat gaagaaggcc tggaagtccc caattgcctt ggggaaaaac 1140 aagtttaagg aattgcattg cactgtcgcc ggcagatgcc ttgaggctga cctggcttcc 1200 tgcgatcgca gcacccccgc cattgtgagg tggtttgttg ccaacctcct gtatgaactt 1260 gcaggatgtg aagagtactt gcctagctac gtgctcaact gttgccatga ccttgtggca 1320 acgcaggatg gcgctttcac aaaacgcggt ggcctgtcgt ccggggaccc cgtcaccagt 1380 gtgtccaaca ccgtctactc actgataatt tacgcccagc acatggtgct ttcggccttg 1440 aagatgggtc atgaaattgg tctcaagttc cttgaggaac agctcaaatt tgaggacctt 1500 cttgaaatcc agcccatgtt agtgtattct gatgacctcg tcttgtatgc ggaaagaccc 1560 acttttccca actaccattg gtgggtcgag catcttgacc tgatgttggg ctttaaaacg 1620 gacccaaaga aaactgtcat aactgataaa cccagttttc tcggctgcag aattgaagca 1680 ggacggcagt tagtccccaa tcgcgaccgt attctggctg ctcttgcata tcatatgaag 1740 gcgcagaacg cctcagagta ttatgcgtcc gctgccgcaa ttctgatgga ttcgtgtgct 1800 tgcattgacc atgaccccga gtggtatgag gatcttatct gcggcatcgc ccggtgtgct 1860 cgccaggacg gttaccgttt tccaggcccg gcatttttca tgtccatgtg ggagaagctg 1920 aaaagtcata atgaagggaa gaaatgccgt cactgcggca tctgcgacgc caaagccgac 1980 tatgcgtccg cctgtggact tgatttgtgt ttgttccatt cacactttca tcaacactgc 2040 ccagtcactc tgagctgtgg ccaccatgcc ggttcaaagg aatgttcgca gtgtcagtca 2100 cctgtcgggg ctggcaaatc cccccttgac gctgtgctga aacaaatccc gtacaaacct 2160 cctcgtacca ttatcatgaa ggtggacaac aaaacaacga cccttgaccc gggaagatat 2220 cagtcccgtc gaggtcttgt tgcagtcaaa agaggtattg caggtaatga ggttgatctt 2280 tctgatggag actaccaagt ggtgcctctt ttgccgactt gcaaagacat aaacatggtg 2340 aaggtggctt gcaacgtact actcagcaag tttatagtag ggccgccagg ttccggaaaa 2400 accacctggc tactgaacca agtccaggac gatgatgtca tttacacacc tactcatcag 2460 acaatgtttg acatagtcag tgctcttaaa gtttgcaggt attccatccc aggagcctca 2520 ggactccctt ttccaccacc tgccaggtcc gggccgtggg ttaggctcat cgccagcgga 2580 catgtccctg gccgagtgtc atatctcgat gaggcaggat attgcaatca tctagacatt 2640 ctaaggctgc tttccaaaac accccttgtg tgtttgggtg accttcagca acttcacccg 2700 gtcggctttg attcctattg ttatgtgttc gatcagatgc ctcagaagca gctgaccacc 2760 atttatagat ttggccctaa catctgtgca gccatccagc cttgttacag ggagaaactt 2820 gaatccaagg ccaggaacac cagagtggtt ttcaccaccc ggcctgtggc ctttggtcag 2880 gtcctgacac cgtaccacaa agatcgtacc ggctctgcaa taactataga ttcatcccag 2940 ggggcgacct tcgacattgt gacattgcat ctaccatcgc caaagtccct aaacaaatcc 3000 cgagcacttg tagccatcac tcgggcaaga catgggttgt tcatttatga ccctcatgac 3060 caactccagg agtttttcaa cttaaccccc gagcgcactg attgtaacct tgcgttcagc 3120 cgtggggatg agctggttgt tttgaatgtg gataatgcgg tcacaactgt agcgaaggcc 3180 ctagagacag gttcaccccg atttcgagta tcggacccga ggtgcaagtc tctcttagcc 3240 gcttgttcgg ccagtctaga agggagctgc atgccactac cacaagtagc acataacctg 3300 gggttttact tttccccgga cagcccagct tttgcacccc tgccaaaaga gctggcgcca 3360 cattggccag tggtcaccca ccagaataat cgagcgtggc ctgatcgact tgtcgctagt 3420 atgcgcccaa ttgatgcccg ctacagcaag ccaatggtcg gtgcagggta tgtggtcggg 3480 ccatccattt ttcttggcac tcctggtgtg gtgtcatact atctcacatt atacatcggg 3540 ggcgagcctc aggccctgcc agaaacactc gtttcaacag gacgtatagc cacagattgt 3600 cgggaatatc tcgacgcggc tgaggaagag gcagcgagag aacttcccca cgcatttatt 3660 ggcgatgtca aaggcactac gatcgggggg tgtcaccaca ttacatcgaa atacctacct 3720 aggtccctgc ctaaagactc tgttgctgtg gttggggtga gttcgcccgg tagggctgct 3780 aaagccgtgt gcactctcac cgatgtgtac ctccccgaac tccgaccata tttgcaaccg 3840 gagacggcat caaaatgctg gaaacttaaa ctggatttca gggatgttcg actgatggtc 3900 tggaaaggcg ccacagccta tttccagttg gaagggctga catggtcagc gctgcccgat 3960 tatgctaggt tcattcagct acccaaggat gccgttgtgt acatcgatcc gtgtataggg 4020 ccggcaacag ccaatcgcaa ggttgtgcga accacagact ggcgggccga cctggcagtg 4080 acaccgtatg attacggtgc tcaggtcatt ttgacaacag cctggttcga ggaccttggg 4140 ccgcagtgga agattttggg gttgcagcct ttcagacgaa catttggctt tgagaacact 4200 gaagattggg caattctcgc acgccgtatg aatgacggca aagattacac tgactataat 4260 tggcattgtg tacgagaacg cccacacgca atttacgggc gcgcccgtga ccatacgtat 4320 cattttgccc ttggcactga actgcaagta gagctgggca gaccccggct gcctcctgag 4380 caagtgccgt ga 4392 <210> 21 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding attenuated PRRSV 94881 ORF2 <400> 21 atgcaatggg tttactgtgg agtaaaatca gtcagttgtt cgtggatgcc ttcactgagt 60 tccttgttag tgtggttgac attgtcatct ttctcgccat attgtttggg ttcactgttg 120 caggctggtt attggtcttc cttctcagag tggtttgctc cgcgtttctc cgttcgcgct 180 ctgccattca ctcttccgaa ctatcgaagg tcctatgagg gcttgctacc caactgcaga 240 ccggatgtcc cacaattcgc agttaagcac ccgttgggta tactttggca tatgcgagtc 300 tcccacctaa ttgacgaaat ggtctctcgc cgcatttacc ggaccatgga acattcgggt 360 caagcggcct ggaagcaggt tgttagtgaa gccactctca caaaactgtc aaggcttgac 420 gtagtcactc atttccaaca cctggccgca gtggaggctg attcttgccg cttccttagc 480 tcacgactcg cgatgctgaa aaaccttgcc gttggcaatg tgagcctgga gtacaacact 540 actttggacc gcgttgagct catctttccc acaccaggta cgaggcccaa gttgaccgat 600 tttaggcaat ggcttatcag cgtgcacgct tccatcttct cctctgtggc ttcgtctgtt 660 accttgttca cagtgctttg gcttcgaatt ccagctctac gctatgtttt tggtttccat 720 tggcccacgg caacacatca ttcgaactaa 750 <210> 22 <211> 798 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding attenuated PRRSV 94881 ORF3 <400> 22 atggcttatc agcgtgcacg cttccatctt ctcctctgtg gcttcgtctg ttaccttgtt 60 cacagtgctt tggcttcgaa ttccagctct acgctatgtt tttggtttcc attggcccac 120 ggcaacacat cattcgaact aactatcaat tacactatat gtaagccatg ccctaccagt 180 caagctgccc aacaaagact cgagcctggc cgtaacgtgt ggtgcaaaat agggcacgac 240 aggtgtgagg aacgtgacca tgatgagttg tcaatgtcca ttccgtccgg gtacgacaac 300 ctcaaacttg agggttatta tgcttggctg gcttttttgt ccttttccta cgcggcccaa 360 ttccatccgg agctgttcgg aataggaaac gtgtcgcgcg tctttgtgga taagcgacac 420 cagttcattt gcgccgagca tgatggacaa aattcaacca tatctgccag acacaacatc 480 tccgcgtcgt atgcggtgta ttaccatcat caaatagacg ggggcaattg gtttcatttg 540 gaatggctgc gaccattctt ttcctcctgg ctggtgctca acatctcatg gtttctgagg 600 cgttcgcctg caagccctgc ttctcgacgc atctatcaga tattaagacc aacacgaccg 660 cggctgccgg tttcatggtc cttcagaaca tcaattgttt ccaatctcac agggcctcaa 720 cagcgcaagg taccactccc ctcaggaggt cgtcccaatg tcgtgaagcc gtcggcattc 780 cccagtacat cacgataa 798 <210> 23 <211> 552 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding attenuated PRRSV 94881 ORF4 <400> 23 atggctgcga ccattctttt cctcctggct ggtgctcaac atctcatggt ttctgaggcg 60 ttcgcctgca agccctgctt ctcgacgcat ctatcagata ttaagaccaa cacgaccgcg 120 gctgccggtt tcatggtcct tcagaacatc aattgtttcc aatctcacag ggcctcaaca 180 gcgcaaggta ccactcccct caggaggtcg tcccaatgtc gtgaagccgt cggcattccc 240 cagtacatca cgataacggc taatgtgacc gatgaatcgt atttgtacaa cgcggacttg 300 ctgatgcttt ccgcgtgcct tttctacgcc tcggaaatga gcgagaaagg cttcaaagtc 360 atctttggga atatttctgg cgttgtttcc gcttgtgtta atttcacaga ttatgtggcc 420 catgtgaccc aacacactca gcagcaccat ttggtaattg atcacattcg gttactacac 480 ttcttgacac cgtctacgat gaggtgggct acaaccattg cttgtttgct tgccattctt 540 ttggcggtat ga 552 <210> 24 <211> 606 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding attenuated PRRSV 94881 ORF5 <400> 24 atgaaatgtt cttgcaagtt ggggcatttc ttgactcctc actcttgctt ctggtggctt 60 tttttgctgt gtaccggctt gtcttggtcc tttgtcgatg gcaacgacga cagctcgaca 120 tcccaataca tatataattt gacgatatgc gagctgaatg ggaccgaatg gttgtccggt 180 cattttgatt gggcagtcga aacctttgtg ctttacccag ttgccactca tatcatttca 240 ctgggttttc tcacaacaag ccatttcctt gatgcgctcg gtctcggcgc tgtgtccgcc 300 acaggattca ttggcgagcg gtatgtactt agcagcatgt acggcgtttg cgccttcgcg 360 gcgttcgtat gttttgtcat ccgtgctgct aaaaattgca tggcttgccg ctatgcccgc 420 acccggttta 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<220> <223> Nucleotide encoding attenuated PRRSV 94881 ORF7 <400> 26 atggccggta agaaccagag ccagaagaaa agaagaaatg cagctccgat ggggaaaggc 60 cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtacaatga taaagtccca gcgccagcaa 120 tctaggggag gacaggccaa aaagaagaag cctgagaagc cacattttcc cctagctgct 180 gaagatgaca ttcggcacca tctcacccag gccgaacgtt ccctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagcgg gaaggtcagt 300 ttccaggttg agttcatgct gccggttgct catacagtgc gcctgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcagggtgc aaattaattt gacagtcagg tgaatggccg cgattgacgt 420 gtggcctcta a 431 <210> 27 <211> 7083 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding parental PRRSV 94881 ORF1a <400> 27 atgtctggga tgttctcccg gtgcatgtgc accccggctg cccgggtatt ttggaacgcc 60 ggccaagtct attgcacacg gtgtctcagt gcacggtctc ttctctctcc agaacttcag 120 gacacggacc tcggtgcagt tggcttgttt cacaagccta aagacaagct ccattggaaa 180 gttcccattg gtatccccca ggtggaatgt tctccatctg ggtgttgctg gctgtcaacc 240 atttttcctt tagcgcgcat gacctccggc aatcacaact tccttcaacg actcgtgaag 300 gttgctgacg tattgtaccg tgacggttgc ttaaccccta gacacctccg tgaactccaa 360 gtttacgagc gtggttgcaa ttggtatccg attacggggc ctgtgcctgg gatggctgtg 420 tacgcgaact ccatgcacgt gtccgaccaa ccgttccctg gtgccactca tgtgttaaca 480 aattcccctt tgcctcaacg ggcttgtcgg cagccgttct gtccgttcga agaggcccat 540 tctagcatat acaggtggga aaaatttgta atttttatgg attcctcctc cgacggtcga 600 tctcgcatga tgtggactcc ggaatccgat gactccacgg ctttggaagt tctgccgccc 660 gagctagaac accaggtcaa ggtccttgtt cggagctttc ccgcccatca ccttgtcgac 720 cttgccgatt gggagctcac tgagtcccct gagaacggtt tttccttcag cacgtcacat 780 ccttgcggct accttgttcg ggacccggct gtatccgaag gcaagtgttg gctttcctgc 840 tttttgagcc agtcagccga agtgctcagt cgcgaggcgc atctggctac cgcctatggt 900 taccaaacca agtggggtgt gcctggcaag tacatccagc gcagacttca agttcacggt 960 ctccgtgctg tggtcgaccc tgatggtccc attcacgttg aagcattgtc ttgcccccag 1020 tcttggatca ggcacttgac cctgaatgat gatgtcaccc cgggattcgt tcgcctaatg 1080 tctcttcgca ttgtgccgaa cacagagcct accacacacc ggatctttcg ttttggagtg 1140 cacaagtggt atggtgccgc cggcaaacgg gcccgtggca agcgtgccgc caaaagtgag 1200 aaagactcgg cttccaccct caaggttgcc cgaccgactt ccaccagtgg aatcgtcacc 1260 tactccccac ctgcggacgg gtcttgtggt tggcatgccc ttgccgccat actgaaccgg 1320 atgattaata atgacttcac gtcccctctg cctcggtaca acaggccgga ggacgattgg 1380 gcttctgatg gtgaccttgc tcaggccatt caatgtttgc aactacctgc cgccatagct 1440 cggaaccgcg cctgccctaa cgccaaatac ctcgtaaaac tcaacggagt tcattgggag 1500 gtagaggtga ggcctggaat ggctcctcgc tccctctctc gtgagtgcgt tgttggcgtc 1560 tgctctgaag gctgtgtcgc gtcgccttac ccggaggacg ggttgcctaa acgtgcactt 1620 gaggccctgg cgtctgctta tagactgcct tcagactgtg tttgtgatgg tattattgac 1680 ttccttgcca atccacctcc ccaggagttc tggactcttg acaaaatgtt gacttccccg 1740 tcaccggagc agtccggctt ctctagtctg tataaattgt tgttagaggt cttgccgcag 1800 aaatgcggat ccacagaagg ggaattcatc tatactgttg agaggatgtt gaaggattgt 1860 ccgagctcca aacaggccat ggccctcctt gcaaaaatta aggtcccatc ctcaaaggcc 1920 ccatccgtga ctctgaacga gtgcttcccc acggatgttc cagtcaactc tgagttaata 1980 tcttgggaag agcccaaaga ccctggcgct gctgttgtcc tatgtccatc ggatgcaaaa 2040 gaatctaagg aaacagcccc tgaagaagct caagcgagaa accgtaaggt cctccaccct 2100 gtggtcctta ccgaggaact tagcgagcaa caggtgcagg tggttgaggg tgatcaggat 2160 atgccactgg atttgacttg gccaacctta accgctacgg cgacccctgt tagagggccg 2220 gtaccggaca atttgagctc tggcattggt gcccagcccg ctaccgttca agaactcatt 2280 ctggcgaggc ctgcaccccg tcttgttgag cgctgtggca cggagtcgaa cggcagcagt 2340 tcatttctgg atttgcctga cgtgcagacc tcggaccagc ctttagacct gtccctggcc 2400 gcgtggcctg taagggctac cgcgtctgac cccggttgga tccacggtag gcgtgagcct 2460 gtctttgtga agcctcgagg tgttttctct gatggcgagt cggcccttca gttcggagag 2520 ctttccgaag ccagttctgt cgtcgatgac cggacaaaag aagctccggt ggttgacgcc 2580 cccatcgatt tgacaacttc gaacgagacg ctctctgggt ctgacccctt tgaattcgcc 2640 aaattcaggc gcccgcgttt ctccgcgcaa gctttaatcg accgaggtgg tccgcttgcc 2700 gatgttcatg caaagataaa gagtcgggta tatgaacaat gccttcaagc ttgtgaacct 2760 ggtagtcgtg cgaccccagc caccaagaag tggctcgaca aaatgtggga cagggtggac 2820 atgaaaactt ggcgctgcac ctcgcagttc caagctggtc acattcttga gtccctcaaa 2880 ttcctccctg acatgattca agacacaccg cctcctgttc ccaggaagaa ccgagctggt 2940 gacagtgccg gcctgaagca actggtggcg cagtgggata ggaaattgag tgtgacaccc 3000 cccacaaaac cggttggacc ggtgcttgac cagaccgtcc ctctgcctat ggacatccag 3060 caagaagatg ccatctccgc tgacaagcca ccccattcgc aaaacccttc tagtcaagta 3120 gatgtgggtg gaggttggaa aagttttatg ctctccggca cccgtttcgc ggggtccgtt 3180 agtcagcgcc ttacgacatg ggtttttgag gttctctccc atctcccagc ttttatgctc 3240 acacttttct cgccacgggg ctctatggct ccaggtgatt ggctgtttgc aggtgctgtt 3300 ctacttgctc tcctgctctg ccgttcttac ccaatactcg gatgccttcc cttattgggt 3360 gtcttttctg gttctgtgcg gtgtgttcgt ttgggtgttt ttggttcttg gatggctttt 3420 gctgtatttt tattctcgac tccacccgac ccagtcggtt cttcttgtga ccacgattcg 3480 ccggagtgtc atgctgagct tttggctctt gagcagcgcc aactttggga acctgtgcgc 3540 agccttgtgg tcgggccatc gggcctctta tgcgtcattc ttggcaagtt actcggtggg 3600 tcacgttgtc tctggtttgt tctcctacgt 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catctttccg gtagagaggt ggggattttt 4500 attttggtgc ttgcctcctt gggcgcttta gcccaccgct tggctcttaa ggcagacatg 4560 tcaatggtct ttttggcgtt ttgtgcttac gcctggccca tgagctcctg gttaatttgc 4620 ttctttccta tgctcttgag gtgggtaacc cttcatcctc tcactatgct ttgggtgcac 4680 tcatttttgg tgttttgcct accagctgcc ggcgttctct cgctgggaat aaccggtctt 4740 ctttgggcag ttggccgttt cacccaggtt gccggaatta tcacacctta tgacatccac 4800 cagtatacct ccggaccacg tggtgcagct gctgtagcaa cggctccaga aggtacttac 4860 atggcggccg ttcggagagc cgctttgact ggacggactt tgatcttcac accatctgca 4920 gtcggatccc ttcttgaagg tgctttcaga actcaaaagc cctgccttaa caccgtgaat 4980 gtcgtaggct cttcccttgg ttctggagga gttttcacca ttgatggcag aagagtcatc 5040 gtcactgcca cccatgtgtt gaatggtaac acagccaggg tcactggtga ttcctacaac 5100 cgcatgcaca cgttcaatac taatggtgat tatgcctggt cccatgctga tgactggcaa 5160 ggcgttgccc ctatggttaa gatcgctaag gggtatcgcg gtcgtgccta ctggcaaacg 5220 tcaaccggag tcgaacctgg catcatgggg gaaggattcg ccttctgttt cactaactgt 5280 ggcgactcag ggtcacctgt catttcagaa 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ttgattcacg ccctgacacc ccttttatgt gtactaaaca tggcacttcc 720 aaggctgctg cagaggacct ccaaaaatat gacctatcca ctcaagggtt tgtcttgcct 780 ggggtcctac gcctagtgcg caggttcatc tttagccatg ttggtaaggc gccaccactg 840 ttccttccat caacctaccc tgccaagaac tccatggcag gggtcaatgg ccagaggttc 900 ccaacaaagg atgtccagag catacctgaa attgatgaaa tgtgcgcccg tgccgtcaag 960 gaaaattggc agactgtgac accttgcacc ctcaaaaaac agtactgttc caaacctaaa 1020 actagaacca tcctaggtac caacaacttc atagccttgg ctcacaggtc agcactcagt 1080 ggtgtcaccc aggcgttcat gaagaaggcc tggaagtccc caattgcctt ggggaaaaac 1140 aagtttaagg aattgcattg cactgtcgcc ggcagatgcc ttgaggctga cctggcttcc 1200 tgcgatcgca gcacccccgc cattgtgagg tggtttgttg ccaacctcct gtatgaactt 1260 gcaggatgtg aagagtactt gcctagctac gtgctcaact gttgccatga ccttgtggca 1320 acgcaggatg gcgctttcac aaaacgcggt ggcctgtcgt ccggggaccc cgtcaccagt 1380 gtgtccaaca ccgtctactc actgataatt tacgcccagc acatggtgct ttcggccttg 1440 aagatgggtc atgaaattgg tctcaagttc cttgaggaac agctcaaatt tgaggacctt 1500 cttgaaatcc agcccatgtt 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atttcgagta tcggacccga ggtgcaagtc tctcttagcc 3240 gcttgttcgg ccagtctaga agggagctgc atgccactac cacaagtagc acataacctg 3300 gggttttact tttccccgga cagcccagct tttgcacccc tgccaaaaga gctggcgcca 3360 cattggccag tggtcaccca ccagaataat cgagcgtggc ctgatcgact tgtcgctagt 3420 atgcgcccaa ttgatgcccg ctacagcaag ccaatggtcg gtgcagggta tgtggtcggg 3480 ccatccattt ttcttggcac tcctggtgtg gtgtcatact atctcacatt atacatcggg 3540 ggcgagcctc aggccctgcc agaaacactc gtttcaacag gacgtatagc cacagattgt 3600 cgggaatatc tcgacgcggc tgaggaagag gcagcgagag aacttcccca cgcatttatt 3660 ggcgatgtca aaggcactac ggtcgggggg tgtcaccaca ttacatcgaa atacctacct 3720 aggtccctgc ctaaagactc tgttgctgtg gttggggtga gttcgcccgg tagggctgct 3780 aaagccgtgt gcactctcac cgatgtgtac ctccccgaac tccgaccata tttgcaaccg 3840 gagacggcat caaaatgctg gaaacttaaa ctggatttca gggatgttcg actgatggtc 3900 tggaaaggcg ccacagccta tttccagttg gaagggctga catggtcagc gctgcccgat 3960 tatgctaggt tcattcagct acccaaggat gccgttgtgt acatcgatcc gtgtataggg 4020 ccggcaacag ccaatcgcaa ggttgtgcga accacagact ggcgggccga cctggcagtg 4080 acaccgtatg attacggtgc tcaggtcatt ttgacaacag cctggttcga ggaccttggg 4140 ccgcagtgga agattttggg gttgcagcct ttcagacgaa catttggctt tgagaacact 4200 gaagattggg caattctcgc acgccgtatg aatgacggca aagattacac tgactataat 4260 tggcattgtg tacgagaacg cccacacgca atttacgggc gcgcccgtga ccatacgtat 4320 cattttgccc ttggcactga actgcaagta gagctgggca gaccccggct gcctcctgag 4380 caagtgccgt ga 4392 <210> 29 <211> 750 <212> DNA <213> Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <400> 29 atgcaatggg ttcactgtgg agtaaaatca gtcagttgtt cgtggatgcc ttcactgagt 60 tccttgttag tgtggttgac attgtcatct ttctcgccat attgtttggg ttcactgttg 120 caggctggtt attggtcttc cttctcagag tggtttgctc cgcgtttctc cgttcgcgct 180 ctgccattca ctctcccgaa ctatcgaagg tcctatgagg gcttgctacc caactgcaga 240 ccggatgtcc cacaattcgc agttaagcac ccgttgggta tactttggca tatgcgagtc 300 tcccacctaa ttgacgaaat ggtctctcgc cgcatttacc ggaccatgga acattcgggt 360 caagcggcct ggaagcaggt tgttagtgaa gccactctca caaaactgtc aaggcttgac 420 gtagtcactc atttccaaca cctggccgca gtggaggctg attcttgccg cttccttagc 480 tcacgactcg cgatgctgaa aaaccttgcc gttggcaatg tgagcctgga gtacaacact 540 actttggacc gcgttgagct catctttccc acaccaggta cgaggcccaa gttgaccgat 600 tttaggcaat ggcttatcag cgtgcacgct tccatcttct cctctgtggc ttcgtctgtt 660 accttgttca cagtgctttg gcttcgaatt ccagctctac gctatgtttt tggtttccat 720 tggcccacgg caacacatca ttcgaactaa 750 <210> 30 <211> 798 <212> DNA <213> Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <400> 30 atggcttatc agcgtgcacg cttccatctt ctcctctgtg gcttcgtctg ttaccttgtt 60 cacagtgctt tggcttcgaa ttccagctct acgctatgtt tttggtttcc attggcccac 120 ggcaacacat cattcgaact aactatcaat tacactatat gtaagccatg ccctaccagt 180 caagctgccc aacaaagact cgagcctggc cgtaacgtgt ggtgcaaaat agggcacgac 240 aggtgtgagg aacgtgacca tgatgagttg tcaatgtcca ttccgtccgg gtacgacaac 300 ctcaaacttg agggttatta tgcttggctg gcttttttgt ccttttccta cgcggcccaa 360 ttccatccgg agctgttcgg aataggaaac gtgtcgcgcg tctttgtgga taagcgacac 420 cagttcattt gcgccgagca tgatggacaa aattcaacca tatctgccag acacaacatc 480 tccgcgtcgt atgcggtgta ttaccatcat caaatagacg ggggcaattg gtttcatttg 540 gaatggctgc gaccattctt ttcctcctgg ctggtgctca acatctcatg gtttctgagg 600 cgttcgcctg caagccctgc ttctcgacgc atctatcaga tattaagacc aacacgaccg 660 cggctgccgg tttcatggtc cttcagaaca tcaattgttt ccaatctcac agggcctcaa 720 cagcgcaagg taccactccc ctcaggaggt cgtcccaatg tcgtgaagcc gtcggcattc 780 cccagtacat cacgataa 798 <210> 31 <211> 552 <212> DNA <213> Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <400> 31 atggctgcga ccattctttt cctcctggct ggtgctcaac atctcatggt ttctgaggcg 60 ttcgcctgca agccctgctt ctcgacgcat ctatcagata ttaagaccaa cacgaccgcg 120 gctgccggtt tcatggtcct tcagaacatc aattgtttcc aatctcacag ggcctcaaca 180 gcgcaaggta ccactcccct caggaggtcg tcccaatgtc gtgaagccgt cggcattccc 240 cagtacatca cgataacggc taatgtgacc gatgaatcgt atttgtacaa cgcggacttg 300 ctgatgcttt ccgcgtgcct tttctacgcc tcggaaatga gcgagaaagg cttcaaagtc 360 atctttggga atatttctgg cgttgtttcc gcttgtgtta atttcacaga ttatgtggcc 420 catgtgaccc aacacactca gcagcaccat ttggtaattg atcacattcg gttactacac 480 ttcttgacac cgtctacgat gaggtgggct acaaccattg cttgtttgtt tgccattctt 540 ttggcggtat ga 552 <210> 32 <211> 606 <212> DNA <213> Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <400> 32 atgaaatgtt cttgcaagtt ggggcatttc ttgactcctc actcttgctt ctggtggctt 60 tttttgctgt gtaccggctt gtcttggtcc tttgtcgatg gcaacgacaa cagctcgaca 120 tcccaataca tatataattt gacgatatgc gagctgaatg ggaccgaatg gttgtccggt 180 cattttgatt gggcagtcga aacctttgtg ctttacccag ttgccactca tatcatttca 240 ctgggttttc tcacaacaag ccatttcctt gatgcgctcg gtctcggcgc tgtgtccgcc 300 acaggattca ttggcgagcg gtatgtactt agcagcatgt acggcgtttg cgccttcgcg 360 gcgctcgtat gttttgtcat ccgtgctgct aaaaattgca tggcttgccg ctatgcccgc 420 acccggttta ccaacttcat cgtggacgac cggggaagaa tccatcgatg gaagtcttca 480 atagtggtgg agaaattggg caaagctgaa gtcggtggtg accttgtcaa cattaagcat 540 gttgtcctcg aaggggttaa agctcaaccc ttgacgagga cttcggctga gcaatgggaa 600 gcctag 606 <210> 33 <211> 522 <212> DNA <213> PRRSV 94881 ORF6 Nucleotide <400> 33 atgggaagcc tagacgactt ttgcaacgat cccaccgccg cacaaaaact cgtgctggcc 60 tttagcatca catatacacc cataatgata tacgccctta aggtgtcacg cggccgactc 120 ctggggctgt tgcacatctt gatatttctg aattgttcct ttacttttgg gtacatgaca 180 tatgtgcatt ttcaatccac caaccgtgtc gcactcactc tgggggctgt agtcgccctt 240 ttgtggggtg tttacagcct cacagagtca tggaagttca tcacttccag atgcagattg 300 tgttgcctag gccggcgata cattctggcc cctgcccatc acgtagaaag tgctgcaggc 360 ctccattcaa tcccagcgtc tggtaaccga gcatacgctg tgagaaagcc cggactaaca 420 tcagtgaacg gcactctagt acctgggctt cggagcctcg tgctgggcgg caaacgagct 480 gttaaacgag gagtggttaa cctcgtcaag tatggccggt aa 522 <210> 34 <211> 387 <212> DNA <213> Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus <400> 34 atggccggta agaaccagag ccagaagaaa agaagaaatg cagctccgat ggggaaaggc 60 cagccagtca atcaactgtg ccagttgctg ggtacaatga taaagtccca gcgccagcaa 120 tctaggggag gacaggccaa aaagaagaag cctgagaagc cacattttcc cctagctgct 180 gaagatgaca ttcggcacca tctcacccag gccgaacgtt ccctctgctt gcaatcgatc 240 cagacggctt tcaatcaagg cgcaggaact gcgtcgcttt catccagcgg gaaggtcagt 300 ttccaggttg agttcatgct gccggttgct catacagtgc gcctgattcg cgtgacttct 360 acatccgcca gtcagggtgc aaattaa 387

Claims (26)

1. 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐스(ECACC)에 수탁번호 ECACC 11012501 또는 수탁번호 ECACC 11012502 하에 기탁된 스트레인인 유럽형의 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV).
2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 세포 배양에서 36회 이상 계대함으로써 약독화되고, 이때, 상기 변형된 바이러스가 PRRSV에 감염되기 쉬운 돼지 또는 다른 포유동물에게 투여되는 경우에 PRRSV 질환의 임상 징후를 일으키는데 실패하지만 PRRSV의 병원성 형태에 대해 포유동물을 면역화하는 면역 반응을 유도할 수 있도록 세포 배양에서 36회 이상 계대함으로써 약독화되는, PRRSV.
3. MA 104-성장된 유럽형 PRRSV를 비-MA 104 포유동물 세포에 적응시킴(adaptating)을 포함하는, 제1항에 따른 생 약독화 PRRSV를 제조하는 방법.
4. 제1항에 따른 생 약독화 PRRSV 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, PRRSV 감염에 대한 돼지의 보호용 백신.
5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 비-PRRSV 약독화 또는 불활성화 병원체 또는 이의 항원성 물질을 추가로 포함하는, 백신.
6. 제5항에 있어서, 상기 비-PRRSV 병원체가 슈도라비스(Pseudorabies) 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 돼지 파르보바이러스(parvovirus), 전염성 위장염 바이러스, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 에리시펠로 루시오파티애(Erysipelo rhusiopathiae), 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica), 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella cholerasuis), 헤모필러스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 파스튜렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 스트렙토코커스 수이스(Streptococcus suis), 마이코플라스마 하이오뉴모니애(Mycoplasma hyopneumoniae) 및 액티노바실러스 플류로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae)로부터 선택되는, 백신.
7. 제4항에 있어서, 수탁번호 렐리스타드 바이러스 스트레인으로 기탁된 PRRSV 스트레인(Lelystad Agent (CDI-NL-2.91)) 또는 수탁번호 ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM 수탁번호 I-1140, CNCM 수탁번호 I-1387, CNCM 수탁번호 I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474 및 VR 2402; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388 또는 ECACC V93070108 하에 기탁된 것과 같은 다른 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가 유럽형 PRRSV 스트레인, 또는 북미형 PRRS 바이러스, pT7P129A; ATCC 수탁번호 VR-2332, ATCC 수탁번호 VR-2368, ATCC VR-2495, ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474 및 ATCC VR 2402와 같은 미국형 스트레인을 추가로 포함하는, 백신.
8. 제4항에 있어서, 피내(intradermal) 또는 근육내 투여에 적합한 담체를 포함하는, 백신.
9. 제4항에 있어서, 동결-건조 형태인, 백신.
10. 제4항에 있어서, 상기 백신이 약 107개 이상의 바이러스 입자를 포함하는, 백신.
11. 제1항에 따른 생 약독화 PRRSV를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함을 포함하는, PRRS 퇴치용 생 약독화 백신의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 생 약독화 PRRSV가 수탁번호 ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM 수탁번호 I-1140, CNCM 수탁번호 I-1387 및 CNCM 수탁번호 I-1388 하에 기탁된 PRRSV 스트레인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 유럽형 PRRSV 스트레인을 추가로 포함하는, 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 생 약독화 PRRSV가 항원보강제를 추가로 포함하는, 방법.
14. 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)에 대해 돼지를 면역화하는 방법으로서,
    상기 방법은, 돼지에게 약물학적으로 혼화가능한 담체 제제와 혼합된 생 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스를 포함하는 백신 조성물을 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 바이러스는 세포 배양에서 36회 이상 계대된 PRRS 94881 바이러스를 포함하며, 상기 계대는 상기 바이러스를 변형하기 위한 것이고, 상기 변형은, 변형된 바이러스가 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)에 감염되기 쉬운 돼지 또는 다른 포유동물에 투여되는 경우에, PRRS 질환의 임상 징후를 일으키는데 실패하지만 PRRSV의 병원성 형태에 대하여 포유동물을 면역화하는 면역 반응을 유도할 수 있도록 상기 바이러스를 변형하는 것인,
    돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)에 대해 돼지를 면역화하는 방법.
15. 제14항에 있어서, 상기 돼지가 백신접종 후 폐 병변을 나타내지 않는, 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 돼지가 포실리스(Porcilis) 백신의 백신접종과 비교하여 백신접종 후 보다 적은 폐 병변을 나타내는, 방법.
17. 서열번호 1 또는 서열번호 10에 나타낸 서열과 95% 이상 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 갖는, PRRS 바이러스.
18. 서열번호 2 내지 서열번호 9 또는 서열번호 11 내지 서열번호 18에 나타낸 서열들 중 어느 하나와 98% 이상 동일한 단백질을 암호화하는 하나 이상의 ORF를 포함하는, PRRS 바이러스.
19. 서열번호 1 또는 서열번호 10, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 단편(여기서, 상기 단편은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 ORF를 암호화한다)의 뉴클레오타이드 서열을 갖는, PRRS 바이러스.
20. 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 ORF를 암호화하는 뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는, 돼지 동물의 백신접종용 아단위 백신.
21. 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는, 돼지 동물의 백신접종용 아단위 백신.
22. 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18의 서열을 갖는 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함하는 조성물.
23. 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 그룹중에서 선택된 서열을 포함하는 분리된 핵산.
24. 프로모터에 작동적으로 연결된 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 PRRSV ORF를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터.
25. 제24항에 있어서, 상기 ORF를 암호화하는 상기 핵산이 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32, 서열번호 33 및 서열번호 34로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 재조합 발현 벡터.
26. 제24항 또는 25항의 재조합 발현 벡터를 포함하는, 백신.

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