JP2014507151A - 新規なヨーロッパ型prrsv株 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ヨーロッパ型ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)の弱毒化生株、そのような株の製造方法、それに基づくワクチンおよびそのようなワクチンの製造方法およびブタの処置におけるその使用に関する。
ブタ繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)は、多くの人によって、現在世界中の養豚産業に影響を及ぼしている最も重要な疾患と見られている。この症候群は、1987年に米国で「ブタミステリー病」として初めて記載され、急速に世界中に広まった。この症候群は、重症の繁殖不全(reproduction loss)を引き起こし、二次感染による死亡率増加に関連し、飼料効率および平均1日増体重の低下につながる。不幸なことに、PRRSを引き起こすウイルスのコントロールは困難であることが証明されてきた。
本発明は、改良されたヨーロッパ遺伝子型改変生PRRSワクチンおよびそのようなワクチンの製造のために使用することができる新規PRRSV株に関する。特に本発明は、それぞれ2011年1月25日にブダペスト条約の条項にしたがって、European Collection of Cell Cultures(ECACC)にアクセッションナンバーECACC 11012501およびECACC 11012502で寄託された改良型PRRSウイルス株、または前記株の一つの任意の子孫または後代を提供する。
本発明は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)感染を処置するまたはその重症度を軽減する方法、およびPRRSV感染を予防する方法を提供する。一般に、その方法は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)感染を処置する、またはその重症度もしくは発生率を軽減するためのものである。「処置するまたは重症度もしくは発生率を軽減する」は、感染に通常関連する臨床徴候、症状、および/または病理学的徴候の重症度の軽減を表し、その軽減は、任意のそのような徴候または症状の予防まで(予防を含む)の範囲である。「病理学的徴候」は、肉眼または剖検で見出された感染の証拠を表す(例えば肺病変)。
例1:PRRSV呼吸器攻撃モデルの説明
上述のように、従来、EU型由来PRRSV株は、子ブタモデルで呼吸器疾患を再現することができない。高い遺伝的多様性のせいで、ヨーロッパではヨーロッパ型株に基づく新規ワクチンの需要があり、毒性ヨーロッパ型由来PRRSV株を利用する、再現性のよい呼吸器攻撃モデルが、試験の実施に必要である。以下の実施例で、本発明者らは、低継代回数ヨーロッパ型攻撃株(継代4回)を用いたブタの攻撃が確実に呼吸器症状を引き起こしたことを示す。
群1:対照群
群2:攻撃群(SD35)
群3:Porcilis(登録商標)PRRSV(SD0)をワクチン接種し、次に攻撃(SD35)。
PRRSの異種ヨーロッパ型単離株で攻撃後の肺病変に適切な軽減を提供する最小免疫用量(MID)を評価するために、約14日齢のブタ繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)感受性子ブタに三つの異なる力価レベルでブタ繁殖・呼吸障害症候群ワクチンヨーロッパ型由来単離株94881改変生ウイルス(PRRS 94881 MLV)を投与する、ワクチン接種−攻撃試験を行った。15匹の子ブタを各ワクチン接種群(群1〜3)および攻撃対照群(群4)に組み込んだ。10匹の子ブタを陰性対照群(群5)に組み込んだ。
これは、0日目(D0)に14〜16日齢の70匹の離乳したPRRS感受性子ブタで行った盲検化ランダム化デザイン試験であった。処置群の説明を下記の表2.1に示す。
攻撃後の合計肺病変スコア:群の最小値、最大値、中央値、95%信頼区間、Q範囲および合計肺病変スコアの平均のまとめは、低、中および高力価ワクチン群の合計肺病変スコアの中央値が、それぞれ0.13%、0.55%、および0.40%であり、一方、攻撃対照群の合計肺病変スコアの中央値が33.40%であったことを示した。三つのワクチン力価群についての合計肺病変スコアの中央値は、攻撃対照群よりも有意に低かった(p<0.0001)。合計肺病変スコアについてワクチン力価群の間に統計的な差はなかった(p≧0.1484)。陰性対照群の合計肺病変スコアの中央値は、0.00%であった。
・ 試験中の生物安全性が全く破られなかったこと、およびPRRSに対する子ブタの感受性が確認されたことから、試験の妥当性検証が確認され、試験が解釈に適することが確認された。
・ 攻撃対照群で実質的なPRRS臨床疾患が明白であったことから、PRRSワクチンの有効性を、より具体的にはPRRS 94881 MLVのMIDを評価するために妥当な検査室ツールとして、この攻撃モデルが検証された。
・ PRRS 94881 MLVの三つの用量レベルの全ては、肺病変の有意な軽減、ならびに攻撃後のウイルス血症、肺組織でのウイルス負荷、咳嗽、合計臨床観察スコア、発熱およびADWGの有意な減少と関連した。
・ 毒性異種ヨーロッパ型由来PRRS攻撃を受けた後に、三つの力価レベルの全てについて全体的肺病変が攻撃対照に比べて適切に減少したことに基づくと、この試験で決定されたPRRS 94881 MLVのMIDは、低力価ワクチンレベル1×102.77TCID50/mLに関連する。
臨床観察を毎日行った。血液、口腔、糞、および鼻腔スワブからの試料ならびに肺洗浄液について、PRRSVヨーロッパ型特異的プライマーを用いた定量RT−PCRを行った。
PRRSV陰性確認済みの群れ(ウイルス検査および血清検査)から選択された数の、例えば14匹の、健康な妊娠した母ブタをこの試験に使用した。母ブタは、1回目または2回目の分娩を経験し、妊娠94日目のワクチン接種/攻撃感染時に妊娠していることが確認された。母ブタを三つの処置群に分けた。第1の群は、少なくとも104.0TCID50を含有する市販のPorcilis(商標)PRRSの1回2mlを妊娠94日目に筋肉内投与することで処置した。攻撃対照群(群2)は、細胞培養培地2ml中の104.72TCID50の病原性ヨーロッパ型野外単離株(継代4回目)の鼻腔内投与を1回受けた。群3は、2011年1月25日にECACCアクセッションナンバー11012502で寄託された弱毒化PRRS株を含有するPRRS MLVを107.6TCID50含有する2mlを1回i.m.投与することでワクチン接種し、7日後に精液注入し、妊娠94日目にヨーロッパ型野外単離株(継代4回目)で攻撃した(細胞培養培地2ml中に104.72TCID50、i.n.)。
この実施例に、弱毒化94881株およびその親株94881継代5回目の完全長ゲノムヌクレオチド配列の決定を示す。これらの配列は、不明確なヌクレオチド位置を全く示さず、これは、均一なウイルス内容物が存在することを示している。94881マスター種ウイルスとヨーロッパ型参照ウイルス株であるLelystadウイルス(LV)との比較は、8個の異なるウイルス遺伝子に85.40〜95.09%の範囲のヌクレオチド相同性があり、両ウイルス株の間に86.39〜97.27%のアミノ酸同一性があることを明らかにした。LVに比べて94881 MSVのORF1aに2個の欠失を確認することができた。94881マスター種ウイルスとその親株、継代5回目との間の比較により、両者の間に合計14個のアミノ酸交換数をもたらす、26個のヌクレオチド交換が示された。
上記のように、親株(低継代回数)94881は、European Collection of Cell Cultures(ECACC)にアクセッションナンバーECACC 11012501で、94881マスター種ウイルス(MSV)はEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC)にアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託されている。親ウイルスおよびMSVの成長および培養条件をこの実施例に提供する。
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、未経産雌ブタにおけるブタ繁殖・呼吸障害症候群ワクチン用ヨーロッパ型由来単離株94881改変生ウイルス、コード19T1.U_(PRRS 94881 MLV)の最小免疫用量(MID)を評価することであった。交配の約28日前(0日目;D0)に、PRRS血清陰性未経産雌ブタに、異なる2力価レベルを投与し、妊娠約90日目(D118)に、未経産雌ブタをPRRSvの異種ヨーロッパ型単離株で攻撃し、生存産子ブタの合計数または生存産子ブタおよび20日齢での離乳子ブタのパーセンテージについて未経産雌ブタを評価してMIDを決定した。118日目(D118)の攻撃時に、攻撃対照群は、8匹の妊娠している未経産雌ブタ(群1、プラセボ)から成り、低力価群は、8匹の妊娠している未経産雌ブタ(群2、1×102.43TCID50/用量)から成り、高力価群は、8匹の妊娠している未経産雌ブタ(群3、1×103.90TCID50/用量)から成り、陰性対照群は、5匹の妊娠している未経産雌ブタ(群4、プラセボ、攻撃せず)から成った。
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、交配前に異なる2力価レベル(群2、低力価;群3、高力価)でPRRS血清陰性未経産雌ブタに投与されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ワクチン用ヨーロッパ型由来単離株94881改変生ウイルス、コード19T1.U_(PRRS 94881 MLV)が、妊娠約90日目に未経産雌ブタをブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSv)の異種ヨーロッパ型単離株で攻撃後に、高いパーセンテージの生存産子ブタおよび21日齢での離乳子ブタを提供する、最小免疫用量(MID)を評価することであった。この目的を満たす主要基準は、一方または両方のワクチン群が、攻撃対照群(群1)よりも関連的に高いパーセンテージまたは数の生存産子ブタおよび20日齢(DOF+20)での離乳子ブタを示さなければならないことであった。
試験担当検査員および被指名人は、群1〜4に割り当てられた未経産雌ブタに関して盲検化されていた。試験担当検査員および被指名人の盲検化を維持するために、データを収集していない人物が、D0に、割当て済み未経産雌ブタにIVPおよびCPを投与した。検査室の職員は、彼らのそれぞれの職務を行う間、各未経産雌ブタが受けた処置に関して盲検化されていた。
治験動物薬(IVP)および対照薬(CP)
D8〜D21に各未経産雌ブタの飼料中にMatrix(商標)(6.8mL; Alternogest; Intervet/Schering Plough Animal Health)を投与して発情周期を同期化した。
投薬の正当化
各IVPを、割り当てられた未経産雌ブタに2.0mL用量として投与してPRRS 94881 MLVのMIDを評価した。群1および4に割り当てられた未経産雌ブタに2.0mL用量のCPを投与した。
D0に、試験データを収集していない人物が、各IVPまたはCPをそれぞれの該当する未経産雌ブタの右頸部領域に無菌3.0mLルアーロック注射器および無菌18g×1インチ(2.54cm)針を使用してIM投与した。用法を下の表6.8に示す。
IVP、CPおよび攻撃材料を投与する職員は、安全予防措置に忠実であり、特定の試験サイトに概要を述べたような身体保護具を着用した。
被験動物の詳細
この試験に登録された全ての未経産雌ブタはPRRS ELISA陰性、未交配であり、観察による判定でワクチン接種時に健康であった。
群1の未経産雌ブタ5匹(5、15、34、35および52番)、群2の未経産雌ブタ2匹(77および94番)、群3の未経産雌ブタ3匹(2、25、および30番)および群4の未経産雌ブタ1匹(20番)は、発情を表さなかったので、続いて交配されなかった。これらの未経産雌ブタをD47までに試験から除去した。
動物の収容
試験が完了するまで、低IVP力価の未経産雌ブタをVRI-CambridgeのCB棟の部屋1および2に収容し、高IVP力価の未経産雌ブタを部屋3および4に収容した。攻撃対照群および陰性対照群に割り当てられた未経産雌ブタを、D−1〜D85までVRI-Risdalの1匹部屋に収容した。D85に、攻撃対照群および陰性対照群の残りの未経産雌ブタをVRI-Cambridgeに移した。残りの試験の間、攻撃対照未経産雌ブタ16匹をCB棟の部屋5〜8に収容し、陰性対照未経産雌ブタ8匹をCA棟部屋12に収容した。D85以降、各部屋は、1列あたり4個の分娩クレートを2列備える同一のレイアウトであった。各クレートに未経産雌ブタ1匹およびその後代を入れた。各クレートは約5フィート×7フィートの大きさであり、床から一段高くなっており、側方に金属棒のパネルおよび床板用にプラスチック製メッシュを備える。隣接するクレートの間で鼻同士が接触することはなかった。各クレートの床を少なくとも1日1回洗浄して、排泄物および廃棄物を除去した。各部屋は別々の暖房および換気を有し、部屋同士の空気の交差汚染を予防した。この試験に使用する前に各部屋を清掃および消毒した。動物の世話をするスタッフは、各部屋に入る前にシャワーを浴び、清潔な衣服を着用した。
PRRS 94881 MLVのMIDを判定するために、低力価群(群2)および高力価群(群3)をD118に攻撃し、繁殖成績および攻撃後の離乳子ブタを評価した。この目的を満たす主要基準は、一方または両方のワクチン群が、攻撃対照群(群1)よりも統計的に高いパーセンテージまたは数の生存産子ブタおよび20日齢(DOF+20)での離乳子ブタを示さなければならないということであった。
どの解析にも陰性対照群(群4)は含まれなかった。陰性対照群は、残りの3群が攻撃された時点で元の未経産雌ブタがPRRS陰性であったことを実証するために、試験に組み込んだ。さらに、野外PRRSvを導入した可能性または攻撃群からの偶発的な交差汚染を除外するために、試験の完了まで陰性対照群はPRRS陰性のままでなければならなかった。
統計的評価のための主要有効性変数は、出生時の未経産雌ブタ1匹あたりの生存子ブタ(平均数およびパーセンテージ)およびDOF+20での一腹あたりの生存子ブタ(平均数およびパーセンテージ)であった。
試験の間、各未経産雌ブタについて分娩データを記録した。各未経産雌ブタについての分娩日(DOF)を、最初の子ブタが生まれた日と定義した。分娩時に、各子ブタを、下の表6.10に挙げた5種類の一つに分類した。出生時に生存していた子ブタを、健康な生存子ブタ、虚弱生存子ブタまたは圧死子ブタ(圧迫による死亡は、下記の剖検で確認した)として出生時に観察評価を行った任意の子ブタとして定義した。試験担当検査員または被指名人が観察を行い、観察を分娩/出産経過記録フォームに記録した。
DOF+1〜DOF+20に、下の表6.11に概要したような疾患の臨床徴候について子ブタを観察した。試験担当検査員または被指名人が観察を行い、臨床観察記録フォームに観察を記録した。
ワクチン群と攻撃対照群との間で解析された他のパラメーターには、ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定、未経産雌ブタのPRRS血清検査結果、未経産雌ブタのウイルス血症、未経産雌ブタの臨床観察、子ブタのウイルス血症、一腹あたりの合計子ブタ、一腹あたりの健康な生存子ブタ、一腹あたりの虚弱生存子ブタ、一腹あたりのミイラ、一腹あたりの死産、一腹あたりの圧死した子ブタ、子ブタの臨床観察、および子ブタ平均1日増体重(ADWG)が含まれた。
ワクチン接種後の毎日の判定のために、試験担当検査員または被指名人が、D−1〜D21に1日1回、およびD22〜115に1週間に少なくとも3回、全ての未経産雌ブタを観察した。観察を1日判定記録フォームに記録した。
購入前ならびにD0、D7、D14、D21、D56、D84、D118、D125、D132、DOF0、DOF+7、DOF+13およびDOF+20に未経産雌ブタから静脈全血を採取した。分娩/流産(DOF0)の時点での未経産雌ブタからの採血は、分娩/流産直後に行うか、または分娩/流産後の8時間までに完了した。
D116〜DOF+20に疾患の臨床徴候について未経産雌ブタを観察した。試験担当検査員または被指名人が観察を行った。上の表6.11に概要した臨床観察採点システムに基づいて、呼吸、行動および咳嗽について未経産雌ブタを毎日観察した。
DOF0、DOF+7、DOF+13およびDOF+20に、または子ブタの死亡を発見したときに、子ブタから静脈全血を採取した。新生子ブタからは、初乳前の採血が好ましかったが、必須ではなかった。初乳前の血液を採取できなかった場合、分娩から12時間以内の周産期血液が許容できた。最初の吸乳前に採取されなかった試料は「周産期」としてラベルを貼り、初乳前試料と別に保存した。
試験担当検査員または被指名人が、DOF0およびDOF+20に、または子ブタの死亡が発見された日に、個別の子ブタを体重測定した。DOF0での個別の体重を分娩/出産経過記録フォームに記録し、DOF0後の体重を体重記録フォームに記録した。
分娩時に死亡していた、またはDOF+20前に瀕死であった全ての子ブタを試験担当検査員が剖検した。剖検の結果および診断を剖検記録フォームに記録した。2個の肺試料を剖検された各子ブタから採取した。1個の試料を独立したWhirlpak(登録商標)容器に入れ、別の試料を、十分な体積の10%ホルマリンを満たした適切な容器に入れた。試料の採取を剖検記録フォームに記録した。
この試験の間に、IVPに起因する有害事象は報告されなかった。有害事象に関するさらなる情報については、12.6節のワクチン接種後の未経産雌ブタの判定を参照されたい。
実験単位
この試験において、非ワクチン接種群へのPRRSv生ワクチンの伝染を避けるために、処置群を別々の部屋に収容しなければならなかった。したがって、部屋が実験単位であった。しかし、この解析のために、「部屋」および「処置」の交絡効果によるバイアスの可能性を無視し、未経産雌ブタおよびそれに対応する同腹仔を実験単位として解析した。
検定に的確な未経産雌ブタ107匹のプールから94匹のPRRS血清陰性未経産雌ブタをD0の前に4群の一つに無作為に割り当てた。群1〜3は、それぞれ28匹の未経産雌ブタから成った。群4は、10匹の未経産雌ブタから成った。群1について、農場管理者は、発送前に45番および55番を健康上の理由から除外し、それぞれ2匹の余分の未経産雌ブタ15番および18番と交換した。群3について、農場管理者は、発送前に未経産雌ブタ44番を健康上の理由から除外し、余分の未経産雌ブタ25と交換した。
統計解析およびデータのまとめは、林学博士Martin Vanselow(Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de)が行った。
主要変数
分娩/流産時(DOF+0)の生存子ブタの比率
20日齢(DOF+20)での生存子ブタの比率
補助変数
ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定
未経産雌ブタのPRRS血清検査
未経産雌ブタのウイルス血症
未経産雌ブタの臨床観察
子ブタのウイルス血症
繁殖成績
子ブタの臨床観察
子ブタの平均1日増体重(ADWG)
非攻撃の陰性対照群(群4)を統計検定から除外した。低力価群および高力価群(それぞれ群2および3)を攻撃対照群(群1)と比較した。群間の全ての検定は、差に関する両側検定として計画した。全ての検定の場合、P≦0.05の場合のみ差を統計的に有意と見なした。生存産子ブタのパーセンテージまたは数およびDOF+20での離乳子ブタのパーセンテージまたは数が、攻撃された対照群よりも一方または両方のワクチン群の方が有意に高値であった場合、有効性が実証された。
ワクチン接種後の未経産雌ブタの臨床判定
試験1日目と21日目との間、および試験1日目と113日目との間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群との差をFisherの直接確率検定により検定した。
試験日116とDOF+20の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群との間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
試験日7、14、21、56、84、118、125、132(分娩前)ならびにDOF+0、DOF+7、DOF+13およびDOF+20でのELISAの「陽性」結果の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群との間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
ウイルス血症のデータは、各調査日に別々に評価した(分娩前の試験日7、14、21、56、84、118、125、132ならびにDOF+0、DOF+7、DOF+13およびDOF+20)。qPCRデータの定性的評価のために、分析結果「不検出」(「n.d.」)および「陰性」を「陰性」と分類し、分析結果「陽性」および測定値を「陽性」と分類した。定量的評価のために、「不検出」(「n.d.」)および「陰性」をlog10GE/mL値0.0に置き換え、「陽性」を3.0に置き換えた。Wilcoxon Mann-Whitney検定を使用した攻撃対照群(群1)と処置群2および3との間の比較のために、定量PCRのデータ(PRRSウイルス負荷[log10GE/mL])を使用した。qPCRの「陽性」結果の度数分布表を作成した。攻撃対照群とワクチン群の間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
未経産雌ブタの合計数あたりの、生存、健康、虚弱、死産、死亡子ブタおよびDOF+20での生存子ブタの絶対頻度を決定し、群間比較のための単一値として使用した。未経産雌ブタ1匹あたりの生存、健康、虚弱、死産および死亡子ブタの相対頻度を、分娩時の子ブタの合計数に対して計算し、群間比較のための単一値として使用した。DOF+20での一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージを、分娩時の生存子ブタ数から圧死子ブタ数を差し引いた数に関して計算した。攻撃対照群とワクチン群との間の差をWilcoxon Mann-Whitney検定により検定した。
ウイルス血症のデータは、各調査日(DOF+0、DOF+7、DOF+13およびDOF+20)について別々に評価した。qPCRデータの定性的評価のために、分析結果「不検出」(「n.d.」)および「陰性」を「陰性」と分類し、分析結果「陽性」および測定値を「陽性」と分類した。一腹あたりの「陽性」子ブタのパーセンテージを計算し、Wilcoxon Mann-Whitney検定による群間比較のための単一値として使用した。定量的評価のために、「不検出」(「n.d.」)および「陰性」をlog10GE/mL値0.0に置き換え、「陽性」を3.0に置き換えた。一腹あたりのqPCR値の中央値を計算し、Wilcoxon Mann-Whitney検定による群間比較のための単一値として使用した。要約統計量のために、個別のqPCRデータを使用した。肺試料中のウイルス負荷は、記述的評価のみを行った。
DOF+0からDOF+20の間の期間について個別の平均1日増体重(ADWG)を計算した。処置群間の差は、分散分析(ANOVA)に続くt検定により検定した。群の最小二乗平均および95%信頼区間を伴う最小二乗平均間の差をANOVAから得た。DOF+20およびADWGについての解析を、共変量としてDOF+0の体重で繰り返した。未経産雌ブタ1匹あたりの子ブタの体重データを記述的にまとめた。
試験日DOF+1からDOF+20の間に少なくとも一つの陽性結果を有する、一腹あたりの子ブタのパーセンテージを計算し、Wilcoxon Mann-Whitney検定による群間比較のための単一値として使用した。完全無作為デザイン構造を仮定してデータを解析した。
未経産雌ブタの繁殖成績
分娩時の一腹あたりの生存子ブタの平均パーセンテージ(健康+虚弱+圧死)は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ54.4%、75.1%、72.3%、および93.0%であった。低力価および高力価群は、分娩時に一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に高値であった(P≦0.0455)。分娩時の一腹あたりの生存子ブタの平均数は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ6.5、8.3、8.6および10.8であった。分娩時の一腹あたりの生存子ブタの数について群間に有意差は検出されなかった(P≧0.1039)。
これらのスコアは、離乳時(20日齢)の生存子ブタの数を強調している。DOF+20での一腹あたりの生存子ブタの群内パーセンテージおよび数のまとめを上の表6.12および6.13に示す。
全ての未経産雌ブタは、D0でPRRSv RNAについてqPCR陰性であった。全ての攻撃対照未経産雌ブタおよび陰性対照未経産雌ブタは、攻撃日(D118)以前にPRRSv RNAについてqPCR陰性のままであった。陰性対照群は、DOF+7に「陽性」であった未経産雌ブタ108番を除き、試験の残余期間にqPCR陰性のままであった。未経産雌ブタ108番は、qPCR検査によりPRRSv RNAについて他の時点で陰性であった。
D116〜DOF+20に、攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照未経産雌ブタのそれぞれ25%、25%、38%および60%が、D116〜DOF+20の少なくとも1日間に臨床疾患を示した。D116〜DOF+20に臨床疾患陽性の未経産雌ブタの頻度について、ワクチン群と攻撃対照群との間に有意差は検出されなかった(P≧0.7043)。
全ての未経産雌ブタは、D0およびD7にPRRS血清陰性であった。全ての攻撃対照未経産雌ブタおよび陰性対照未経産雌ブタは、攻撃日(D118)以前はPRRS血清陰性のままであり;一方、陰性対照群は、試験の残りの期間(DOF+20)にPRRS血清陰性のままであった。
D1〜21にどの群からも異常な判定は検出されなかったので、検定を行わなかった。D1〜D113に、攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照未経産雌ブタのそれぞれ4%、4%、0%および10%は、D1〜D113の少なくとも1日間に異常な判定を示した。D1〜D113に、ワクチン群と攻撃対照群との間に異常判定について有意差は検出されなかった(P=1.0000)。
DOF+1〜DOF+20の少なくとも1日間に臨床疾患について陽性(臨床観察スコア>0)の、一腹あたりの子ブタの平均パーセンテージは、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ91.6%、32.5%、33.4%および3.2%であった。低力価群および高力価群は、DOF+1〜DOF+20の少なくとも1日間に臨床疾患陽性の、一腹あたりの子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に低かった(p≦0.0001)。
攻撃対照、低力価、高力価および陰性対照群について、それぞれ一腹あたり平均86.3%、58.1%、55.0%および0%の子ブタが、DOF0にPRRSv RNAについてqPCR陽性であった。DOF0に、低力価および高力価群は、PRRSv RNAついて一腹あたりのqPCR陽性の子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも統計的に低値であった(P≦0.0381)。DOF+7にも、低力価群および高力価群は、PRRSv RNAについてqPCR陽性の、一腹あたりの子ブタのパーセンテージが攻撃対照群よりも有意に低値であった(P≦0.0293)。DOF+13に、低力価群だけが一腹あたりのqPCR陽性子ブタのパーセンテージが有意に低値であり(P=0.0216);一方、一腹あたりのqPCR陽性子ブタのパーセンテージについて、高力価群および攻撃対照で有意差は検出されなかった(P=0.0860)。DOF+20に群間で有意差は検出されなかった(P≧0.0614)。
DOF0にLS平均体重について群間で差は検出されなかった(P≧0.2972)。DOF0の体重を共変量として解析の因子に含めた場合も含めない場合も、両方のワクチン群は、DOF+20に最小二乗平均体重が攻撃対照群よりも高値であった(P<0.0028)。
分娩時に死産、ミイラまたは圧死と収載された胎子は、8匹を除き正しく分類されたことが剖検で確認された。2匹の攻撃対照胎子が死産と収載されたが(40−S1、66−S1)、剖検の結果から、拡張した肺が明らかとなり、それらの胎子が出生時に生存していたことが示された。2匹の攻撃対照胎子が圧死と収載されたが(1−C1、79−C2)、剖検の結果から、両方の胎子について拡張していない肺が明らかとなり、それらの胎子が呼吸していなかったことを示していた。低力価の胎子1匹が死産として収載されたが(85−S2)、剖検の結果から、拡張した肺が明らかとなり、その子ブタが出生時に生存していたことが示された。3匹の高力価子ブタが圧死と収載されたが(36−C1、36−C2、65−C1)、剖検の結果から、どの胎子も拡張していない肺が明らかとなり、それらの胎子が呼吸していなかったことが示された。分娩時に不正確に収載された胎子が少数であったことから、未経産雌ブタの成績解析に変更を加えなかった。
剖検された胎子および死亡子ブタの肺qPCRの結果の平均は、攻撃対照、低力価、高力価、および陰性対照群についてそれぞれ4.68、4.09、3.55および0.0log10GE/mLであった。これらのデータに関して統計解析は行わなかった。
試験の目的を達成するために、以下の4群のPRRS感受性未経産雌ブタをD0での試験デザインに組み込んだ:対照薬を投与された攻撃対照群(群1);1×102.43TCID50のPRRS 94881 MLVを投与された低力価ワクチン群(IVP1、群2);1×103.90TCID50のPRRS 94881 MLVを投与された高力価ワクチン群(IVP2、群3);および同じく対照薬を投与された陰性対照群(群4)。交配(D0)の約28日前に、2.0mL用量のIMとして各処置を施した。
元の未経産雌ブタがPRRSvを有さないことおよび外来PRRSvの曝露または処置群と対照群の間の交差汚染が試験の間に起こらなかったことを確認するために、陰性対照群(群4)を試験デザインに組み込んだ。陰性対照の未経産雌ブタは試験全体でPRRS抗体陰性であった。加えて、この群の未経産雌ブタおよびその後代もまた、DOF+7の108番を除いて全ての被験時点でPRRSvウイルス血症(qPCR)陰性であった。未経産雌ブタ108番は、DOF+7に「陽性」であったが、他の全ての時点でqPCR陰性であり、その子ブタも同様にPRRSv RNA陰性であった。この結果は、PRRSv感染が原因でなく、試料の汚染によるエラーと見なされた。これらの結果は、陰性対照群が試験の間じゅうPRRS無感染のままであったことを裏付けており、この試験の結果を検証するものである。
十分で再現性のあるPRRS臨床疾患を誘導するPRRSv毒性EU型由来株を伴う攻撃モデルが、検査室の設定でPRRSワクチンの有効性を適切に評価するために必要である。ヨーロッパ型PRRS単離株190136(1×106.30TCID50/6mL)を接種後に、攻撃対照群は、出生時に一腹あたりわずか54.4%の生存子ブタ(陰性対照群では93.0%)、一腹あたりそれぞれ17.5%および28.1%の死産およびミイラ(陰性対照群ではそれぞれ7.0%および0.0%)を示し、一腹あたり91.6%の子ブタが、DOF+1〜DOF+20に少なくとも一日間(陰性対照群では一腹あたり3.2%の子ブタ)が臨床疾患を示し、20日齢で一腹あたり平均2.9匹の子ブタ(陰性対照群では平均10.8匹)が生存しており、一腹あたり86.3%の子ブタが出生時にウイルス血症(陰性対照群では0%)であった。これらの結果は、重症のPRRS特異的臨床疾患が、ワクチン未接種の攻撃対照群の未経産雌ブタおよびその後代に誘導されたことを強調しており、したがって、PRRSワクチンの有効性を、より具体的には未経産雌ブタでのPRRS 94881 MLVのMIDを評価するために妥当な臨床検査室ツールとしてこの攻撃モデルの妥当性を検証している。
未経産雌ブタでのPRRS 94881 MLVのMIDの決定は、出生時に一腹あたりの生存子ブタのパーセンテージまたは数が攻撃対照群よりも高く、攻撃後の20日齢で一腹あたりの生存子ブタの数のパーセンテージが高い、最低力価のワクチンを投与されたワクチン群に基づいた。
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、14±3日齢の感受性子ブタにワクチン候補ブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株94881改変生ウイルス(PRRS 94881 MLV)を投与してから2週間後に、免疫の開始(OOI)を判定することであった。ワクチン接種の2週間後のOOIを満足する主要有効性基準は、ワクチン接種群(群1)が、攻撃後の肺病変について、ワクチン未接種の攻撃対照群(群2)との有意差(p≦0.05)を示したかどうかであった。二次パラメーターには、ワクチン接種後の臨床判定、攻撃後の臨床観察、直腸温度、平均1日増体重、PRRS抗体の判定および血清試料中のウイルス血症、ならびに剖検で採取された肺試料中のPRRSウイルスの定量が含まれた。
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、ワクチン候補であるブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株94881改変生ウイルス(PRRS 94881 MLV)を14±3日齢の感受性子ブタに投与した2週間後に免疫開始(OOI)を判定することであった。ワクチン接種の2週間後のOOIを満足すべき主要有効性基準は、攻撃後の肺病変の軽減について、ワクチン接種群(群1)がワクチン接種なしの攻撃対照群(群2)との有意差(p≦0.05)を示したかどうかであった。
試験担当検査員および被指名人は、試験の生存期にわたり、割り当てられた処置群に関して盲検化されていた。この盲検化を維持するために、ブタの判定(すなわち臨床判定、臨床観察または剖検)に関与しなかった人物が、無作為化を行い、割り当てられたIVP処置およびCP処置をD0に施した。BIVI検査室の職員は、それぞれの職務を行う間、各ブタが受けた処置に関して盲検化されていた。
治験動物薬(IVP)および対照薬(CP)
投薬の正当化
ワクチン接種の2週間後にPRRS 94881 MLVのOOIを評価するために、IVPを1.0mL用量として、割り当てられたブタに投与した。CPを1.0mL用量として、プラセボワクチンとして群2および3に投与した。
D0に無菌3.0mLルアーロック注射器および無菌20g×1インチ(2.54cm)または18g×3/4インチ(1.91cm)針を使用して、試験データを収集していない人物が、割り当てられたブタの右頸部領域にIVPまたはCPをIM投与した。用法を下の表7.6に示す。
試験動物の詳細
この試験に登録された全ての子ブタはPRRS ELISA陰性であり、観察によって判定されたように、ワクチン接種時に健康であった。
ブタは試験から除外されなかった。
動物の収容
試験の期間中、子ブタをVeterinary Resources, Inc.(VRI)(Cambridge, IA)に収容した。均一であるが別々の部屋で群1、2および3を収容して生物安全性を確保した。子ブタを各室内の複数のペン(5匹/ペン)中に収容した。群1を部屋5の4個のペンに収容し、群2を部屋6の4個のペンに収容し、群3を部屋4の2個のペンに収容した。ペンは、プラスチック小割り板の床張りを備える、一段高いスタンド上のプラスチック製タブから成った。各ペンには、プラスチック製6穴給餌器およびニップル式給水器(nipple waterer)が入っていた。各隔離室は他の部屋と同じ構造であり、全てがバイオハザードレベル2(BL2)に準拠し、ヘパフィルター処理、サーモスタット調節の温度コントロールを備える人工換気であった。
ワクチン接種の2週間後にPRRS 94881 MLVのOOIを判定するために、D14に群1および2を攻撃し、攻撃後の肺病変を評価した。群1(PRRS 94881 MLVの最小免疫用量)が攻撃後に攻撃対照群(群2)よりも有意に減少した(p≦0.05)肺病状を示した場合、ワクチン接種の2週間後にOOIが達成されたことになる。
購入前およびD0の血清試料は、全て、PRRS抗体陰性の必要があった。
統計的評価のための主要有効性変数は、試験のD24での合計肺病変スコアであった。
24日目にデータおよび試料を採取および記録した後に、全ての被験ブタをVRI SOP PRC1027(追補1、添付8)にしたがって安楽死させた。VRI SOP PRC 1028にしたがって各ブタを剖検した。被指名人が胸腔を露出させ、心臓および肺を取り出した。試験担当検査員が肺の各セットを検査し、認められたあらゆる肉眼的病状を記載し、各肺葉の病状%を決定した。観察結果およびデータを剖検報告記録フォームに記録した。EPフォームを使用することによって合計肺病変スコアを各ブタについて決定した。
群1と群2の間で解析されるべき他のパラメーターには、ワクチン接種後の臨床判定、PRRS血清検査結果、ワクチン接種後のウイルス血症、攻撃後の臨床観察、ADWG、直腸温度および攻撃後の肺ウイルス定量が含まれた。これらのパラメーターは、補助パラメーターとして解析され、試験の目的を満たすための主パラメーターとして役立たなかった。
試験担当検査員または被指名人が、表7.1に要約された日にワクチン接種後の臨床判定について全てのブタを観察した。観察は、臨床判定記録フォームに記録した。
静脈全血を表3に要約された日に採取した。簡潔には、血液約2〜5mLを各子ブタから適切な大きさの血清セパレーターチューブ(SST)内に採取した。試料の採取は、試料採取記録フォームに記録した。SST中の血液を室温で凝固させた。血液試料を採取日にBIVI-Amesに配達し、検体配達記録フォームに記入した。血液試料をBIVI-Amesが遠心沈殿し、血清を回収し、分割し、適切なチューブに移した。各チューブに子ブタのID番号、試験番号、採取日、試験日および試料の種類を記載したラベルを付けた。BIVI-Amesで、1セットの血清試料を2〜8℃で保存し、他のセットの血清試料を−70±10℃で保存した。
0、7、14、17、21および24日目に採取された他のセットの血清試料は、試験の生存相が完了するまでBIVI-Amesで−70±10℃で保存された。
表7.1に要約した日に、疾患の臨床徴候について子ブタを観察した。観察は、試験担当検査員または被指名人が行い、それを臨床観察記録フォームに記録した。下の表7.8に要約した臨床観察採点システムに基づいて、呼吸、行動および咳嗽について毎日子ブタを観察した。
個別の体重を表3に要約した日に収集した。試験担当検査員または被指名人が較正済みの秤で各ブタを秤量した。結果をkg単位で体重記録フォームに記録した。D0〜D14の、およびD14〜D24の平均1日増体重を決定した。
表6.1に要約された日に試験担当検査員または被指名人が直腸温度を収集した。直腸温度を℃単位で臨床観察記録フォームに記録した。
肺の各セットについて、左および右尖葉、左および右心葉、左および右横隔葉ならびに中間葉からの2試料を確保した。各肺試料は、約1インチ(2.54cm)×1インチ(2.54cm)であった。肺試料の1セットについて、左側からの3試料全てを1個の容器中で一緒にし、一方で右側からの3試料全ておよび肺中間葉試料を別の容器中で一緒にした。各容器に十分な量の10%ホルマリン溶液を満たした。他のセットの肺試料について、左側からの3個の肺試料全てを1個のWhirlpak(登録商標)中で一緒にし、一方で右側からの3試料全ておよび肺中間葉試料を別のWhirlpak(登録商標)中で一緒にした。全ての容器およびWhirlpaks(登録商標)に、動物番号、試験番号、試料採取日、試験日、試料の種類および試料が左側または右側からかを記載したラベルを適切に付けた。Whirlpak(登録商標)中の肺試料をBIVI-Amesに輸送するまでドライアイス上で保存し、一方、ホルマリン中の試料を室温で保存した。試料の採取を剖検報告記録フォームに記録した。ホルマリン固定肺組織試料およびWhirlpak(登録商標)肺試料をBIVI-Amesに配達した。記入した検体配達記録フォームを各発送物に添付した。
この試験の間に、有害事象は報告されなかった。
実験単位
この試験において、非ワクチン接種群へのPRRSvの伝染を避けるために、処置群を別々の部屋に収容しなければならなかった。したがって、部屋が実験単位であった。しかし、この解析のために、「部屋」および「処置」の交絡効果によるバイアスの可能性を無視し、子ブタを実験単位として使用した。
50匹の子ブタを体重によりブロック化した(n=5匹/ブロック)。Excelの乱数関数を使用して、各ブタに乱数を割り当てた。各体重ブロック内で、割り当てられた乱数の昇順にブタを順位付けした。次に、処置群をこの番号順にブタに割り当てた:最も小さい乱数から二つを群1に割り当て、次の二つの番号を群2に割り当て、最大の番号を群3に割り当てた。群1および2は、それぞれ20匹の豚を含み、群3は10匹の豚を含んだ。
統計解析およびデータのまとめは、林学博士Martin Vanselow(Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de.)が行った。
剖検日(D24)の合計肺病変スコアは、ブタ流行性肺炎(Porcine Enzootic Pneumonia)ワクチン(不活化)研究書草稿に推奨された重み付け式にしたがって計算された肺波及のパーセンテージとして測定した。この式は、7個の肺葉それぞれの相対重量を考慮に入れる。典型的な病変を有する肺葉領域の判定されたパーセンテージに、肺葉毎に該当する係数を乗じ、合計重み付き肺病変スコアを得る。肺葉毎の係数を表7.9に示す。
D1とD12の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。処置群の間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
陽性のELISA結果の度数分布表を作成した。処置群の間の差をFisherの直接確立検定により検定した。
ウイルス血症のデータは、各調査日に別々に評価した。追加的に、ウイルス負荷について、D14からD24の間(AUC D14−D24)およびD17からD24の間(AUC D17−D24)の個別の反応曲線下面積を解析した。
D15からD24の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
個別の1日増体重を、D0からD14の間およびD14からD24の間の期間について計算した。各調査日について、および各期間について、記述統計量を計算した。処置群間の差は、分散分析およびそれに続くt検定を用いて検定した。群の最小二乗平均および95%信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
本来の温度データに関する処置群間の差は、分散分析およびそれに続くt検定を用いて検定した。群の最小二乗平均および95%信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
Wilcoxon Mann-Whitney検定による処置群間の比較のために、D24に採取された肺からの定量PCRデータ(PRRSウイルス負荷[log10GE/mL])を使用した。左および右肺qPCRの結果の平均(log10GE/mL)を、評価のために使用した。計算前に、分析結果「不検出」を0.0log10GE/mLに置き換え、「陽性」を3.0に置き換えた。
合計肺病変スコア
群内の肺病変スコアの合計および関連するp値のまとめを下の表7.10に示す。
qPCRデータにより血清中から検出されたPRRSv RNAのまとめを下の表7.11に示す。
D24の剖検時に採取された肺組織からの個別のPRRSv qPCRの結果を追補1、表30に示す。qPCRデータにより肺組織中から検出されたPRRSv RNAのまとめを、下の表7.12に示し、剖検時にqPCR陽性であった動物の頻度のまとめを、下の表7.13に示す。
攻撃後期間(D15〜D24)に少なくとも一つの陽性臨床判定スコアを有した子ブタの頻度を下の表7.14に示す。
D0、D14およびD24での体重ならびにD0〜D14およびD14〜D24のADWGのまとめを下の表7.17に示す。
直腸温度のまとめを下の表7.19および7.20に示す。PRRS 94881 MLVワクチン接種群および攻撃対照群についての直腸温度のLS平均および統計解析のまとめを下の表7.21および7.22に示す。
D1〜D12に少なくとも一つの陽性判定を受けた子ブタのパーセンテージのまとめを下の表7.23に示す。
陽性PRRS抗体力価を有する子ブタの頻度のまとめを下の表7.24に示す。
試験の目的を達成するために、D0に以下の3群を試験デザインに組み込んだ:1×103.82TCID50のPRRS 94881 MLVを投与されたワクチン群(群1);対照薬を投与された攻撃対照群(群2)および同様に対照薬を投与された陰性対照群(群3)。
元の子ブタがPRRSvを有さないこと、および試験の間に外来PRRSvの曝露も、処置群および対照群の間で交差汚染も起こらなかったことを確認するために、陰性対照群(群3)を試験デザインに組み込んだ。陰性対照群の子ブタは、試験全体にわたりPRRSv(ウイルス血症;qPCR)およびPRRS抗体について陰性であり、したがってこの試験を検証していた。
十分なPRRS臨床疾患を誘導する攻撃モデルが、検査室の状況でPRRSワクチンの免疫開始を適切に評価するために必要である。前述の方法によりヨーロッパ型PRRS単離株205817を接種後に、攻撃対照群は、D19、D20、D23およびD24に≧40.50℃の平均直腸温度(同日に陰性対照群は≦39.68℃)を示し、D14〜D24に陰性対照群についての0.34kg/日という平均ADWGに比べて、0.15kg/日という平均ADWG、異常行動、咳嗽、および肺病変スコアの中央値55.2%(陰性対照群は0.00%)を示した。これらの結果は、攻撃ウイルスの力価がターゲット用量よりもわずかに低かったにしても、攻撃対照群で重症のPRRS特異的臨床疾患が誘導されたことを強調しており、したがって、PRRSワクチンの有効性を、より具体的にはPRRS 94881 MLVのOOIを評価するために適切な臨床検査室ツールとして、この攻撃モデルの妥当性を検証している。
ワクチン接種の2週間後のPRRS 94881 MLVについての免疫開始(OOI)の判定は、ワクチン群が攻撃後の肺病変に攻撃対照群よりも有意な軽減を示していること(p≦0.05)に基づいた。
接種後の子ブタから、D0にPRRS 94881 MLVワクチン接種または対照薬に関係する異常な臨床判定は観察されなかった。攻撃対照子ブタ1匹が、D9から右前肢尾側のただれを示したが、それは、対照薬の投与に関連しないと思われた。
攻撃後の肺病変、臨床徴候、血中および肺中のウイルス複製の有意な減少(p≦0.05)ならびに成長能力の改善が、約14日齢の子ブタにPRRS 94881 MLVを1×103.82TCID50/mL単回ワクチン接種後の2週間のOOI樹立を裏付けている。
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、ワクチン候補であるブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株94881改変生ウイルス(PRRS 94881 MLV)を14±3日齢のPRRS血清陰性ブタに投与後26週間という免疫持続期間(DOI)を評価することであった。ワクチン接種後26週間というDOIを満足する主要有効性基準は、PRRS 94881 MLVワクチン接種群(群1)における攻撃後の肺病変スコア(肉眼または組織学的)の、攻撃対照群(群2)に比べた有意な減少(p<0.05)であった。
このワクチン接種−攻撃試験の目的は、14±3日齢のPRRS血清陰性ブタに投与されたブタ繁殖・呼吸障害症候群ヨーロッパ型由来単離株94881改変生ウイルス、コード19S1.U(PRRS 94881 MLV)の、ワクチン接種の26週間後時点でのPPRSの異種ヨーロッパ型単離株を用いた毒性攻撃に対する免疫持続期間(DOI)を評価することであった。ワクチン接種の26週間後のDOIを満たすための主要有効性基準は、攻撃対照群(群2)に比べた、PRRS 94881 MLVワクチン接種群(群1)での攻撃後肺病変スコア(肉眼的または組織学的)の有意な減少(p<0.05)であった。
これは、0日目(D0)に14±3日齢の離乳したPRRS血清陰性ブタ56匹で行った盲検化ワクチン接種−攻撃有効性試験であった。この試験のまとめを表8.2に提供する。
試験担当検査員および被指名人は、試験の生存期にわたり、割り当てられた処置群に関して盲検化されていた。この盲検化を維持するために、BIVIのモニターが無作為化を行い、ブタの判定(すなわち臨床判定、臨床観察または剖検)に参加しなかった人物が、D0に、割り当てられたIVP処置およびCP処置を施した。BIVI検査室の職員は、彼らそれぞれの職務を行う間、各ブタが受けた処置に関して盲検化されていた。
治験動物薬(IVP)および対照薬(CP)
投薬の正当化
IVPは、割り当てられたブタに1.0mL用量として投与し、ワクチン接種の26週間後のPRRS 94881 MLVのDOIを評価した。CPは、群2および3にプラセボワクチンとして1.0mL用量を投与した。
D0に無菌3.0mLルアーロック注射器および無菌20g×1インチ(2.54cm)針を使用して、試験データを収集していない人物が、割り当てられたブタの右頸部領域にIVPまたはCPをIM投与した。用法を下の表8.6に示す。
数匹の豚が、細菌感染に続いて、試験の早期に死亡して見つかったという事実が原因で、調査員および試験モニターは、全ての被験動物に以下の追加的な付随処置の施行について合意した(15.10節):
20日目:Mu-Se(登録商標)(ビタミンE/セレン、Intervet/Schering Plough Animal Health, USA)、0.1mLを右大腿にIM、
21日目:EXCEDE(登録商標)(セフチオフル、Pfizer Animal Health, USA)、0.5mLを左大腿に、
35日目:EXCEDE(登録商標)(セフチオフル、Pfizer Animal Health, USA)、1.0mLを右大腿に、
42日目:EXCEDE(登録商標)(セフチオフル、Pfizer Animal Health, USA)、1.0mLを左大腿に、
47日目:BAYTRIL 100(登録商標)(エンロフロキサシン、Bayer Animal Health, USA)、1.5mLを左頸部にSC。
動物試験の詳細
観察によって判定されたように、この試験に登録された全ての子ブタは、PRRS ELISA陰性(ELISA S/P比<0.4)であり、ワクチン接種時(D0)に健康であった。
ブタは試験から除外されなかった。3匹のブタが攻撃施行前に死亡して見出された。これらの3匹のブタに関するさらなる結果を12.8節に示す。
試験の期間中、ブタをVeterinary Resources, Inc.(VRI)(Cambridge, IA)に収容した。ブタを複数のペン(11または12匹/ペン)の各部屋内に収容し、均一であるが別々の部屋でワクチン接種動物(群1)および対照動物(群2および3)を収容して生物安全性を確保した。PRRS 94881 MLVブタをD78まで部屋CB8に、次にD105までCC1に、次に残りの試験期間はCC3に収容した。攻撃対照ブタは、試験全体にわたり部屋CC2内に収容した。陰性対照ブタは、D73まで部屋CB6に、次に残りの試験期間はCB7に収容した。動物用ペンは、プラスチック小割り板の床張りを備えて一段高くなっており、齢に適切な給餌器およびニップル式カップ式給水器(nipple cup drinker)を備えていた。各隔離室は他の部屋と同一の構造であり、全てがバイオハザードレベル2(BL2)に準拠し、ヘパフィルター処理され、サーモスタット調節の温度コントロールを備える人工換気であった。
ワクチン接種の26週間後でのPRRS 94881 MLVのDOIを判定するために、PRRS 94881 MLV群および攻撃対照群をD179(DPC0)に攻撃し、攻撃後の肺病変を10日後(DPC10)に評価した。PRRS 94881 MLV群が攻撃対照群よりも攻撃後の肺病状(肉眼または組織学的)が有意に軽減したならば(p≦0.05)、ワクチン接種後26週間というDOIが達成された。
全てのブタは購入前スクリーニングおよびD0にPRRS ELISA陰性(ELISA S/P比<0.4)である必要があった。攻撃対照ブタは、攻撃までPRRS抗体陰性の必要があり、陰性対照群は、試験全体にわたりPRRS抗体陰性の必要があった。
一次有効性転帰変数は、試験のD189(DPC10)での肺病変(肉眼的および組織学的病変)であった。
D189に、試料およびデータを収集および記録した後に、全ての残りの被験ブタをVRI SOP PRC1027(15.1節)にしたがって安楽死させた。各ブタを、VRI SOP PRC1028(15.1節)にしたがって剖検した。被指名人が各ブタの胸腔を露出させ、心臓および肺を取り出した。試験担当検査員が肺の各セットを検査し、あらゆる肉眼的病状も記載し、各肺葉について病変のパーセンテージを決定した。観察結果およびデータを剖検報告記録フォームに記録した。
肺の各セットについて、左および右尖葉、左および右心葉、左および右横隔葉および中間葉からの2試料を確保した。各肺試料は、約1インチ(2.54cm)×1インチ(2.54cm)であった。肺試料の1セットについて、左側からの3試料全てを1個の容器中で一緒にし、一方で右側からの3試料全ておよび肺中間葉試料を別の容器中で一緒にした。各容器に十分な量の10%ホルマリン溶液を満たした。もう一方のセットの肺試料について、左側からの3個の肺試料全てを1個のWhirlpak(登録商標)中で一緒にし、一方、右側からの3試料全ておよび肺中間葉試料を別のWhirlpak(登録商標)中で一緒にした。全ての容器およびWhirlpaks(登録商標)に、動物番号、試験番号、試料採取日、試験日、試料の種類および試料が左側または右側からかを記載したラベルを適切に付けた。ホルマリン中の肺試料を室温で保存し、一方、Whirlpak(登録商標)中の肺試料をBIVI-Amesに輸送するまでドライアイス上で保存した。試料の採取を剖検報告フォームに記録した。ホルマリン固定肺組織試料およびWhirlpak(登録商標)肺試料をBIVI-Amesに配達した。記入した検体配達記録フォームを各発送物に添付した。
二次変数には、ワクチン接種後および攻撃後のウイルス血症、攻撃後の臨床観察、攻撃後の直腸温度、平均1日増体重(ADWG)、肺PRRSvの定量、ワクチン接種後の臨床判定、ならびにPRRS血清検査結果が含まれた。
購入前ならびに0、7、14、21、28、56、84、112、140、168、179(DPC0)、182(DPC3)、186(DPC7)、および189(DPC10)日目に静脈全血を採取した。簡潔には、血液約2〜5mLを各ブタから適切な大きさの血清セパレーターチューブ(SST)中に採取した。試料の採取を、試料採取記録フォームに記録した。SST中の血液を室温で凝固させた。血液試料を採取日にBIVI-Amesに配達し、検体配達記録フォームに記入した。BIVI-Amesは血液試料を遠心沈殿し、血清を回収し、分割し、適切なチューブに移した。各チューブにブタのID番号、試験番号、採取日、試験日および試料の種類を記載したラベルを付けた。BIVI-Amesで、1セットの血清試料を2〜8℃に保ち、他方のセットの血清試料を−70±10℃に保った。
D178(DPC−1)〜D189(DPC10)に疾患の臨床徴候についてブタを観察した。試験担当検査員または被指名人が観察を行い、臨床観察記録フォームに記録した。下の表8.9にまとめた臨床観察採点システムに基づいて、呼吸、行動および咳嗽についてブタを毎日観察した。
試験担当検査員または被指名人がD178(DPC−1)〜D189(DPC10)に直腸温度を収集した。直腸温度を℃単位で臨床観察記録フォームに記録した。
D0、D179(DPC0)およびD188(DPC9)に個別の体重を収集した。試験担当検査員または被指名人が較正済みの秤で各ブタを秤量した。結果をkg単位で体重記録フォームに記録した。D179(DPC0)〜D188(DPC9)の平均1日増体重を決定した。
9.3.1節に収載した住所に発送するまで、Whirlpaks(登録商標)中の肺組織試料をBIVI-Amesで−70±10℃で保存した。記入された検体配達記録フォームを発送物に添付した。bioScreenがqPCR(15.1節)によりPRRSv RNAについて肺試料を検査した。左肺組織を均質化して検査した。右肺組織および肺中間葉試料を均質化し、検査した。結果を左および右肺試料についてのゲノム当量(log10GE/mL)として報告した。統計学者がSASプログラムを使用して右および左GE/mL値の幾何平均力価を各ブタについて計算する。
試験担当検査員または被指名人が、ワクチン接種後の臨床判定について全てのブタを観察した。D−1〜D21は毎日、次にD22〜D177は1週間に少なくとも3回、観察を行った。臨床判定記録フォームに観察結果を記録した。
購入前ならびに0、7、14、21、28、56、84、112、140、168、179(DPC0)、182(DPC3)、186(DPC7)、および189日目(DPC10)に採取され、2〜8℃に保存された血清試料をBIVI−AmesがPRRS抗体について検査した(15.1節)。結果を陰性(ELISA S/P比<0.4)または陽性(ELISA S/P比≧0.4)として報告した。
この試験でPRRS 94881 MLVに起因する有害事象は認められなかった。
実験単位
非ワクチン接種群へのPRRSvの伝染を避けるために、この試験において、処置群を別々の部屋に収容した。したがって、部屋が実験単位であった。しかし、解析のために、「部屋」および「処置」の交絡効果によるバイアスの可能性を無視し、ブタを実験単位として使用した。
56匹のブタを3群の一つに無作為に割り当てた。BIVIが無作為化を行った。発送時に140および143番(攻撃対照群)、ならびに168番(PRRS 94881 MLV群)を間引いた。組み込み基準を満たす5匹の余分なブタのプールから178番を無作為に選択して140番と置き換え、177番を無作為に選択して143番と置き換え、179番を無作為に選択して168番と置き換えた。
統計解析およびデータのまとめは、林学博士Martin Vanselow(Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Germany, +49(0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de)が行った。完全に無作為計画構造を仮定してデータを解析した。統計解析は、SASソフトウェア・リリース8.2以上(SAS, 2001, Cary, USA/North Carolina, SAS Institute Inc.)を使用して行った。PRRS 94881 MLVブタ179番ならびに攻撃対照ブタ124および161番は、攻撃前に死亡したので、攻撃後の解析から除外した。差に関する全ての検定を、α=5%での両側検定として計画した。統計学者の報告を15.9節に示す。
下の表8.10に示された係数に特異的肺葉についての病状%を乗じたものを使用して、各ブタについての肉眼的肺病変スコアを計算した。SASプログラムを使用して計算を行った。
肺試料の個別の組織学的スコアを肺葉および動物あたりで累積させた。この合計スコアを動物1匹あたりの被験肺葉数で除算した。処置群間の比較のために、結果を単一値として使用した。Wilcoxon Mann-Whitney検定を用いて、差について処置群を検定した。
Wilcoxon Mann-Whitney検定により処置群間で比較するために、D189に採取された肺からの定量PCRデータ(PRRSウイルス負荷[log10GE/mL])を使用した。左および右肺のqPCR結果の平均(log10GE/mL)を評価のために使用した。計算前に、分析結果「不検出」を0.0log10GE/mLに置き換え、「陽性」を3.0に置き換えた。
検査日毎に別々にウイルス血症のデータを評価した。追加的に、ウイルス負荷について、D179からD189の間(AUC0−10)およびD182からD189の間(AUC3−10)の個別応答の曲線下面積を解析した。
D180からD189の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。合計スコアは、呼吸スコア+行動スコア+咳嗽スコアの総和であった。SASプログラムを使用して計算を行った。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
D179〜D188の期間について個別の1日増体重を計算した。各検査日および期間について、記述的統計量を計算した。分散分析およびそれに続くt検定を用いて、処置群間の差を検定した。群の最小二乗平均および95%信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
本来の温度データに関する処置群間の差は、分散分析およびそれに続くt検定を用いて検定した。群の最小二乗平均および95%信頼区間を伴う最小二乗平均間の差を、分散分析から計算した。
D1からD21の間に少なくとも一つの陽性結果を有する動物の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
各時点についての陽性のELISA結果の度数分布表を作成した。処置群間の差をFisherの直接確率検定により検定した。
肉眼的肺病変スコア
D189(DPC10)の肉眼的肺病変スコアの中央値は、PRRS 94881 MLVワクチン接種群および攻撃対照についてそれぞれ0.1%および13.8%であった。PRRSワクチン接種ブタについての肉眼的肺病変スコアの中央値は、攻撃対照の肉眼的肺病変スコアの中央値よりも有意に低値であった(p<0.0001)。陰性対照群についての肉眼的肺病変スコアの中央値は、0.0%であった。
組織学的肺病変スコアの中央値は、PRRS 94881 MLVワクチン接種群および攻撃対照についてそれぞれ6.0および19.5であった。PRRSワクチン接種群についての組織学的肺病変スコアの中央値は、攻撃対照についての組織学的肺病変スコアの中央値よりも有意に低値であった(p<0.0001)。陰性対照群についての組織学的肺病変スコアの中央値は、9.0であった。
肺組織からの肺qPCR値の中央値は、PRRS 94881 MLVワクチン接種ブタおよび攻撃対照について、それぞれ3.69および6.25log10GE/mLであった。PRRS 94881 MLVワクチン接種ブタについてのqPCR値の中央値は、攻撃対照についてのqPCR値の中央値よりも有意に低値であった(p<0.0001)。どの陰性対照ブタの肺試料からもPRRSv RNAは検出されなかった。
PRRSv RNAは、D0にどのブタの血清からも不検出であった。ワクチン接種後、D7、D14、D21、D28、D56、D84、D112、D140およびD168にPRRS 94881 MLVワクチン接種ブタは、中央値がそれぞれ3.00、0、0、3.00、0、0、0、0および0log10GE/mLであった。攻撃対照はD182(DPC3)までPRRSv RNAが全く検出されなかったので、これらの中央値は、D7、D14、D21およびD28に攻撃対照よりも有意に高値であった(p≦0.0013)。
D185(DPC6)にスコア「1」を示した攻撃対照ブタ(149番)1匹に比べて、攻撃後のどのPRRS 94881 MLVワクチン接種ブタからも異常呼吸は観察されなかった。攻撃後に少なくとも1日間異常呼吸を示したブタのパーセンテージについて、群間で差は検出されなかった(p=0.4878)。
群間差は有意でなかった(p=0.2389)。D179(DPC0)に、平均およびLS平均体重は、PRRS 94881 MLV群および攻撃対照群についてそれぞれ134.6および128.2kgであった。差に有意差はなかった(p=0.1090)。D188(DPC9)に、平均およびLS平均体重は、PRRS 94881 MLV群および攻撃対照群についてそれぞれ138.3および130.3kgであった。ワクチン接種群についての体重は、D188に攻撃対照群よりも有意に高値であった(p=0.0455)。
PRRS 94881 MLV群についての平均直腸温度は、攻撃日(D179)に39.3℃であり、攻撃後、平均は39.1℃(D189、DPC10)〜39.8℃(D181、DPC2)の範囲であった。攻撃対照群についての平均直腸温度は、攻撃日に39.1℃であり、攻撃後、平均は39.1℃(D183、DPC4)〜39.9℃(D182、DPC3)の範囲であった。陰性対照群についての平均直腸温度は、同じ期間にわたり≦39.3℃のままであった。
22匹中4匹(18%)のPRRS 94881 MLVブタ、22匹中8匹(36%)の攻撃対照ブタ、および12匹中2匹(17%)の陰性対照ブタが、D1〜D21の少なくとも1日間、異常な臨床判定を示した。このパラメーターについて群間に有意差はなかった(p=0.3102)。
全てのブタは、D0およびD7にPRRS ELISA陰性であった。D14までに、PRRS 94881 MLVワクチン接種ブタの90%は、PRRS ELISA力価が陽性であった。この数はD21に95%に増加し、D28、D56、D84、D112、D140およびD168にそれぞれ100%、100%、100%、90%、100%および95%であった。この試験のワクチン接種期間およびD14〜D168に、どの攻撃対照ブタもPRRS抗体力価を生成せず、攻撃対照よりも有意に高いパーセンテージのPRRS 94881 MLVワクチン接種ブタがPRRS抗体力価陽性であった(p<0.0001)。
試験の目的を果たすために、健康な、PRRS感受性で血清陰性のブタ22匹に、約14日齢時点でPRRS 94881 MLV 1mLをIM接種した。PRRS感受性で血清陰性のブタ34匹(攻撃対照群22匹および陰性対照群12匹)に約14日齢時点で対照薬1mLをIM接種した。
陰性対照群のブタは試験にわたりPRRSv(ウイルス血症;qPCR)陰性のままであった。陰性対照群のブタ2匹(116および120番)はD112にELISA力価が陽性であり、一方、この群についての他の全てのELISA結果は陰性であった。これらのブタまたは全体としてこの群からウイルス血症が検出されなかったこと、同様に全ての他の血清試料がELISA陰性であったことを考慮して、D112でのこれらのブタ2匹についての結果は、おそらく原因が突き止められない検査室エラーによる偽陽性と見なされた。したがって、これは妥当な試験であった。妥当な試験の確立とは無関係に、陰性対照群は、組織学的肺病変スコアの中央値がD189に9.0であり、これは、肉眼的病変スコアの中央値0.0%と対照的であった。これらのデータは、普通のブタ畜産条件で長期間収容されたブタが、特定の病原体とは無関係の取るに足らない小さな肺病変を発生することを強調している。
ワクチン接種後26週間という、PRRS 94881 MLVについてのDOIの判定は、ワクチン群が、攻撃対照群よりも攻撃後肺病変(肉眼的または組織学的)の有意な軽減(p≦0.05)を示していることに基づいた。
3匹のブタが、この試験のワクチン接種期の間に死亡して発見された。ブタ179番(PRRS 94881 MLVワクチン接種)は、スムース型Escherichia coliおよびEnterococcus spp.感染に関連してD6に死亡して発見された。ブタ161番(攻撃対照群)は、Bordetella bronchiseptica、α溶血性StreptococcusおよびStaphylococcus auricularis感染に関連してD10に死亡して発見された。ブタ124番(攻撃対照群)は、髄膜脳炎につながるStreptococcus suis感染に関連してD21に死亡して発見された。それ以上の死亡をコントロールおよび予防するために、注射用ビタミンおよび抗生物質でブタを集団処置した。処置後に、それ以上死亡は発生しなかった。両方の処置群に死亡が起こったので、IVP自体は感染に関連しなかったと仮定することができる。おそらく、ブタが、これらの感染症の住みかとなる研究施設に到着したのであろう。入手可能な場合、これらのブタについてのデータを収録した。これらのブタが攻撃施行前に死亡したので、これらのブタからの肉眼的および組織学的肺病変スコアを肺病変の解析から除外した。ワクチン接種から攻撃までの長期間に、PRRS 94881 MLVブタ1匹および攻撃対照ブタ2匹が欠如したことは、試験の結果に影響しなかった。
2週齢でワクチン接種し、ワクチン接種の26週間後に攻撃したとき、PRRS 94881 MLV群について、剖検での肉眼的および組織学的肺病変、剖検での肺組織中のウイルス負荷、ならびに攻撃後のウイルス血症が攻撃対照群に比べて有意に減少したこと(p≦0.05)により、毒性PRRSvに対するワクチンの有効性が実証された。したがって、この試験の結果は、PRRS 94881 MLVをワクチン接種後に26週間という免疫持続期間が実証されたことを裏付けている。これらの結果は、ワクチン用量1×104.27TCID50/mLで達成され、これは、最小免疫用量(1×104.5TCID50/mL)よりもわずかに低値であった。
配列番号1 PRRSマスター種ウイルス94881の完全長ヌクレオチド配列
Claims (26)
- European Collection of Cell Cultures(ECACC)にアクセッションナンバーECACC 11012501またはアクセッションナンバーECACC 11012502で寄託された株の、ヨーロッパ型ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(PRRSV)。
- 細胞培養で少なくとも36回継代することによってウイルスが弱毒化されることにより、PRRSVに易感染性のブタまたは他の哺乳動物にその改変ウイルスが投与されたときに、それがPRRSV疾患の臨床徴候を引き起こすことなく、その哺乳動物に病原型PRRSVに対する免疫をつける免疫応答を誘導することができる、請求項1記載のPRRSV。
- MA104で成長させたヨーロッパ型PRRSVを非MA104哺乳動物細胞に順応させることを含む、請求項1記載の弱毒化生PRRSVの調製方法。
- 請求項1記載の弱毒化生PRRSVおよび薬学的に許容されうる担体を含む、ブタをPRRSV感染から防御するためのワクチン。
- さらに、一つもしくは複数の非PRRSV性の弱毒化病原体もしくは不活化病原体またはその抗原性物質を含む、請求項4記載のワクチン。
- 非PRRSV性の病原体が、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、大腸菌、エリシペロ・ルシオパチエ、ボルデテラ・ブロンチセプチカ、サルモネラ・コレラスイス、ヘモフィルス・パラスイス、パスツレラ・ムルトシダ、ストレプトコッカス・スイス、ミコプラスマ・ヒオニューモニアエおよびアクチノバチルス・プルーロニューモニアエより選択される、請求項5記載のワクチン。
- さらに、アクセッションナンバーLelystadウイルス株(Lelystad感染病原体(CDI-NL-2.91)で寄託されたPRRSV株、またはアクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCMアクセッションナンバーI-1140、CNCMアクセッションナンバーI-1387、CNCMアクセッションナンバーI-1388、ATCC VR2332、VR2385、VR2386、VR2429、VR2474、およびVR2402;CNCM I-1102、CNCM I-1140、CNCM I-1387、CNCM I-1388、もしくはECACC V93070108で寄託された株などの他の株から成る群より選択される一つまたは複数の追加的なヨーロッパ型PRRSV株、あるいは北米型PRRSウイルス、pT7P129A;ATCC寄託株VR-2332、ATCC寄託株VR-2368;ATCC VR-2495;ATCC VR 2385、ATCC VR 2386、ATCC VR 2429、ATCC VR 2474、およびATCC VR 2402などのUS型株を含む、請求項4記載のワクチン。
- 皮内または筋肉内適用に適した担体を含む、請求項4記載のワクチン。
- 凍結乾燥形態である、請求項4記載のワクチン。
- 少なくとも約107個のウイルス粒子を含む、請求項4記載のワクチン。
- 請求項1記載の弱毒化生PRRSVを薬学的に許容されうる担体と混合することを含む、PRRSと闘うための弱毒化生ワクチンの調製方法。
- 弱毒化生PRRSVが、さらに、アクセッションナンバーECACC 04102703、ECACC 04102702、ECACC 04102704、CNCMアクセッションナンバーI-1140、CNCMアクセッションナンバーI-1387、およびCNCMアクセッションナンバーI-1388で寄託されたPRRSV株から成る群より選択される一つまたは複数の追加的なヨーロッパ型PRRSV株を含む、請求項11記載の方法。
- 弱毒化生RRSVが、さらにアジュバントを含む、請求項11記載の方法。
- 薬理学的に適合性の担体薬剤と混合されたブタ繁殖・呼吸障害症候群生ウイルスを含むワクチン組成物をブタに投与する工程を含む、ブタにブタ繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)に対する免疫をつける方法であって、該ウイルスが、ウイルスを改変するために細胞培養で少なくとも36回継代されたPRRS 94881ウイルスを含むことにより、PRRS易発性のブタまたは他の哺乳動物に改変ウイルスが投与されたときに、それがPRRS疾患の臨床徴候を引き起こすのではなく、その哺乳動物に病原型PRRSに対する免疫をつける免疫応答を誘導することができる、方法。
- ブタが、ワクチン接種後に肺病変を示さない、請求項14記載の方法。
- ブタが、ワクチン接種後に、Porcilisワクチンを用いたワクチン接種よりも少ない肺病変を示す、請求項14記載の方法。
- 配列番号1または配列番号10のいずれかに示される配列と少なくとも95%相同なヌクレオチド配列を有するPRRSウイルス。
- 配列番号2〜9または配列番号11〜配列番号18に示される任意の配列と少なくとも98%同一のタンパク質をコードする、少なくとも1個のORFを含む、PRRSウイルス。
- 配列番号1もしくは配列番号10のヌクレオチド配列または配列番号1もしくは配列番号2のいずれかのフラグメントを有するPRRSウイルスであって、該フラグメントが、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18から成る群より選択されるORFをコードする、PRRSウイルス。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18から成る群より選択されるORFをコードするヌクレオチドから成る群より選択される一つまたは複数のヌクレオチドを含む、ブタ動物をワクチン接種するためのサブユニットワクチン。
- 配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;および配列番号34から成る群より選択される一つまたは複数のヌクレオチドを含む、ブタ動物をワクチン接種するためのサブユニットワクチン。
- 配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18の配列を有するタンパク質から成る群より選択される一つまたは複数のタンパク質を含む組成物。
- 配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;および配列番号34から成る群より選択される配列を含む、単離された核酸。
- プロモーターに作動可能に連結された、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、および配列番号18から成る群より選択される、PPRSVの一つまたは複数のORFをコードする核酸配列を含む、リコンビナント発現ベクター。
- ORFをコードする核酸が、配列番号19;配列番号20;配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;および配列番号34から成る群より選択される、請求項24記載のリコンビナント発現ベクター。
- 請求項24または25のいずれか記載のリコンビナント発現ベクターを含むワクチン。
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