BR122021013826B1 - Composição de proteína, ácido nucleico isolado e vetor de expressão recombinante - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se à melhoria das vacinas de PRRS vivos modificados que contêm as novas cepas de PRRSV Europeias de PRRSV e métodos de fabricação e utilização de tais vacinas.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a uma cepa viva atenuada de um vírus da síndrome respiratória e Reprodutiva Suína Europeia (PRRSV), os métodos para a produção de tais cepas de vacinas, com base na mesma, e os métodos para a produção de tais vacinas e o uso das mesmos na tratamento de suínos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS) é vista por muitos como a mais importante doença que afeta actualmente a indústria suinícola mundial. A síndrome foi primeiramente descrita em 1987 nos Estados Unidos da Amérca como uma "doença suína misteriosa" e se espalhou rapidamente por todo o glóbulo. Isso faz com que as perdas de reprodução graves esteja associada com aumento da mortalidade devido a infecções secundárias, e está ligada à conversão alimentar reduzida e ganho de peso médio diário. Infelizmente, o controle do vírus causador de PRRS tem provado ser difícil.

[0003] O vírus PRRS (PRRSV) é um vírus de RNA filamentado simples envolto classificado na família Arteriviridae (Cavanaugh, 1997). Ele provoca uma doença generalizada de suínos que foi descrita pela primeira vez como "doença suína misteriosa" nos Estados Unidos da América em 1987 (Hill, 1990). A doença se manifesta como uma doença respiratória em todas as faixas etárias de suínos, levando à morte em alguns suínos jovens e problemas reprodutivos graves em leitoas reprodutoras.

[0004] A transmissão do PRRSV pode, e muitas vezes, ocorre por meio de contato direto entre os suínos infectados e suscetíveis. Tam- bém pode ocorrer a transmissão através de distâncias muito curtas, por meio da via aérea ou através do sêmen. Uma vez infectado, o vírus pode permanecer no sangue de adultos durante cerca de duas semanas, e em suínos infectados por um ou dois meses ou mais. Javalis infectados podem lançar o vírus no sêmen por mais de 100 dias. Este longo período de viremia aumenta significativamente a possibili-dade de transmissão. Além disso, o vírus de PRRS pode atravessar a placenta durante o último terço do período de gestação para infectar os leitões no útero e causa o nascimento do leitão morto ou enfraquecidos.

[0005] Todos os tipos e tamanhos de rebanhos, incluindo aqueles com status de saúde elevado ou ordinário ou a partir de qualquer unidade interior ou exterior, podem ser infectados com o vírus da PRRS. Os rebanhos infectados podem sofrer perdas graves no que diz respeito a reprodutibilidade, bem como, aumento dos níveis de pneumonia pós-desmama com crescimento deficiente. A fase reprodutiva normalmente tem a duração de dois a três meses, no entanto, após o desmame os problemas, muitas vezes, tornam-se endêmicos. A doença reprodutiva é caracterizada por meio de um surto de aborto, que afeta tanto as leitoas quanto as leitoas no último período de gestação. Partos prematuros em torno de 109 e 112 dias de gestação ocorrem. O número nascimento do leitão morto ou enfraquecidos aumenta e resulta em um aumento considerável na mortalidade pré-desmame.

[0006] A fase respiratória tem sido tradicionalmente vista no berçá rio, especialmente em viveiros de fluxo contínuo. No entanto, os problemas respiratórios causados por meio do vírus PRRS também podem ser vistos no finalizador como parte do complexo de doença respiratória de suíno (CRS). Uma redução na taxa de crescimento, o aumento da percentagem dos suínos não comercializáveis, e a elevada mortalidade pós desmame pode ocorrer. Os resultados indicam níveis elevados de diagnóstico de pneumonia que associam-se com o vírus PRRS em conjunto com uma vasta variedade de outros agentes anti- microbianos geralmente vistos como agentes infecciosos secundários. Os isolados bacterianos podem incluir Streptococcus suis, Haemophilus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus suis, Mycoplasma hyopneumoniae e Pasteurella multocida, entre outros. Os agentes virais comumente envolvidos incluem vírus da gripe suína e o vírus corona respiratório de suínos. Os suínos afetados raramente respondem a níveis elevados de medicamento, e os sistemas todos dentro \ todos fora não conseguiram controlar a doença.

[0007] O vírus PRRSV existe como dois genótipos referidos como o tipo "EUA" e "EU" que compartilham cerca de 50% de homologia de sequência (Dea S et al. (2000). Arch Virol 145 : 659 a 88). Estes dois genótipos podem também ser distinguidos por meio das suas propriedades imunológicas. A maioria da informação sobre sequenciação de vários isolados baseia-se nas proteínas estruturais, designada a proteína de envelope GP5 que representa apenas cerca de 4% do genoma viral, ao etapa que apenas pouco é conhecido sobre as proteínas não estruturais (nsp). O isolamento de PRRSV e a fabricação de vacinas têm sido descritas em várias publicações (WO 92/21375, WO 93/06211, WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930).

[0008] A vacinação é o método fundamental para aliviar o fardo de PRRS como suínos que se recuperam de uma infecção PRRS que irá desenvolver uma resposta imune, que em circunstâncias normais vai protegê-los de serem infectados novamente pelo mesmo tipo de vírus. No entanto, o vírus PRRS tem a capacidade de alterar (por meio da recombinação), e, portanto, podem surgir novas cepas virais. Em tais casos, a proteção cruzada entre as cepas podem não existir e novos surtos podem ser observados em fazendas que haviam sido previa- mente infectadas. Dessa maneira, existe uma necessidade continuada de vacinas adicionais.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0009] A presente invenção está relacionada com a melhoria das vacinas de PRRSV vivos modificados de genótipo Europeu e novas cepas de PRRSV, que podem ser usadas para a fabricação de tais vacinas. Em particular, a presente invenção proporciona as cepas de vírus PRRS melhoradas que foram depositadas na coleção europeia de culturas de células (ECACC), sob os números de acesso ECACC 11012501 e 11012502 ECACC cada um depositado em 25 de janeiro de 2011, em conformidade com as disposições do Tratado de Budapeste, ou qualquer progenitura ou descendente de uma das cepas mencionadas.

[00010] Em modalidades particulares, a presente invenção descreve um Vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva suína (PRRSV) de um tipo europeu, que é da cepa depositada com a coleção europeia de culturas de células (ECACC), sob os números de acesso ECACC 11012501 ou números de acesso ECACC 11012502.

[00011] O VSRRS é caracterizado pelo fato do vírus ser atenuado por meio da passagem pelo menos 36 vezes em cultura de células de tal modo que quando o vírus modificado é administrado a um suíno ou a outro mamífero, propenso a PRRSV, deixa de causar sinais clínicos da doença PRRSV mas é capaz de induzir a uma resposta imunitária que imuniza o mamífero contra as formas patogênicas do PRRSV.

[00012] Também é contemplado um método para a preparação do PRRSV vivo atenuado depositado na Coleção Europeia de Culturas de Células (ECACC) com o número de acesso ECACC 11012502 ou um atenuada a partir de uma cepa original depositada em números de acesso ECACC 11012501, que compreendem a adaptação de um PRRSV MA crescido 104 de um tipo europeu de células de mamíferos não MA crescida104.

[00013] Um outro aspecto da presente invenção contempla uma vacina para a proteção de suínos contra a infecção por PRRSV, que compreende o PRRSV vivo atenuado depositado na Coleção Europeia de Culturas de Células (ECACC) com o número de acesso ECACC 11012502 ou atenuada a partir de uma cepa original depositada com o Número de acesso ECACC 11012501 e um veículo farmaceuticamen- te aceitável. Tal vacina pode vantajosamente compreender adicionalmente um ou mais patogênios atenuados ou inativados que não PRRSV ou material antigênico. Por exemplo, os agentes patogênicos não PRRSV podem ser selecionados a partir do vírus da pseudo-raiva, vírus da Influenza Suína, Parvovírus Suíno, vírus da Gastroenterite Transmissível, Escherichia coli, Erysipelo rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pas- teurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae e Actinobacillus pleuropneumoniae.

[00014] Em outras modalidades, a vacina pode ainda compreender uma ou mais cepas de PRRSV europeias adicionais selecionadas dentre o grupo que consiste em uma cepa de PRRSV depositada sob os Números de Acesso da cepa do vírus de Lelystad (agente Lelystad (CDI-NL-2.91), ou outras cepas tais como aquelas depositadas sob os números de acesso ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM Número de Acesso I-1140, CNCM Número de Acesso I-1387, CNCM Número de Acesso I-1388, ATCC VR 2332, VR 2385, VR 2386, VR 2429, VR 2474, and VR 2402 ; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I-1387, CNCM I-1388, or ECACC V93070108 ou mais profundamente pode ser uma cepa U.S. tal como o vírus PRRS norte americano, pT7P129A ; depósito ATCC VR-2332, depósito ATCC VR-2368 ; ATCC VR-2495 ; ATCC VR 2385, depósito ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474, e ATCC VR 2402.

[00015] É contemplado que a vacina pode compreender um veículo que é adequado para aplicação intradérmica ou intramuscular. Em algumas modalidades, a vacina está em uma forma criodessecada. Em modalidades específicas, a vacina compreende, pelo menos, cerca de 107 partículas de vírus.

[00016] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um método para a preparação de uma vacina viva atenuada para combate a PRRS, que compreende a mistura de um vírus vivo PRRSV atenuado depositado com a Coleção Europeia de Culturas de Células (ECACC) sob o número de acesso ECACC 11012502 ou atenuado a partir de uma cepa original depositada em números de acesso ECACC 11012501 com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em tais métodos, o PRRSV vivo atenuado pode, preferivelmente, compreender adicionalmente uma ou mais cepas de PRRSV europeias adicionais selecionadas a partir do grupo que consiste em uma cepa de PRRSV, depositada sob o número de acesso ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, Número de acesso CNCM I-1140, Número de acesso CNCM I-1387, e Número de Acesso CNCM I-1388.

[00017] Em algumas modalidades, o PRRSV vivo atenuado pode ainda compreender um adjuvante.

[00018] Também é contemplado um método para imunizar suínos contra síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRS), o método que compreende a etapa de administração de uma composição de vacina suína incluindo um vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína vivo misturado com um agente veículo farmacologicamente compatível, o vírus compreende vírus de PRRS 94881 repicado pelo menos 36 vezes em cultura de células para modificar o vírus de tal modo que quando o vírus modificado é administrado a um suíno ou a um outro mamífero, propenso a PRRS, ele não consegue causar si- nais clínicos da doença PRRS mas é capaz de induzir uma resposta imunitária que imuniza o mamífero contra as formas patogênicas do PRRS.

[00019] Em algumas modalidades, o método é realizado em que os suínos que não apresentam lesões do pulmão após a vacinação. Em outras modalidades, o suíno apresenta menos lesões do pulmão após a vacinação, em comparação com a vacinação com a vacina Porcilis.

[00020] Outro aspecto da presente invenção refere-se a um vírus de PRRS tendo uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 95% homológa com a sequência apresentada em qualquer SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 10.

[00021] Também é contemplado é um vírus de PRRS que compreende pelo menos uma ORF que codifica para uma proteína que é pelo menos 98% idêntica a qualquer das sequências expostas em SEQ ID NO : 2 a 9 ou SEQ ID NO : 11 a SEQ ID NO : 18.

[00022] Também contemplado é um vírus de PRRS que tem uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 10 ou um fragmento de qualquer uma das SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2, em que o fragmento codifica uma ORF selecionado a partir de o grupo que consiste em SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, ID SEQ NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, e SEQ ID NO : 18 .

[00023] A invenção também diz respeito a uma vacina de subuni- dade para a vacinação de um animal suíno, em que a vacina compreende um ou mais nucleotídeos selecionados a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo que codifica uma ORF selecionado dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, ID SEQ NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, e SEQ ID NO : 18.

[00024] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma vacina de subunidade para a vacinação de um animal suíno, em que a vacina compreende um ou mais nucleotídeos selecionados a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 ; SEQ ID NO : 21 , SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25 ; SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30, SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, e SEQ ID NO : 34.

[00025] Também está contemplada uma composição que compreende uma ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste em uma proteína possuindo a sequência de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, ID SEQ NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, e SEQ ID NO : 18.

[00026] Também contemplado é um ácido nucleico isolado que compreende uma sequência selecionada dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 ; SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25 ; SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30 ; SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34.

[00027] A presente invenção diz ainda respeito a um vetor recombi- nante de expressão e/ou de vacina que compreende esses vetores de expressão, em que os referidos vetores compreendem uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ORF de PRRSV ou mais selecionados dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 2, ID SEQ NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, ID SEQ NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, e SEQ ID NO : 18, operativamente ligada a um promotor. Em tais modalidades, o ácido nucleico que codifica para as ORFs pode preferencialmente ser selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20 ; SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 25 ; SEQ ID NO : 26, SEQ ID NO : 27, SEQ ID NO : 28, SEQ ID NO : 29, SEQ ID NO : 30 ; SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, e SEQ ID NO : 34.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS

[00028] Figura 1A : A observação clínica de pontuação de tosse no modelo de desafio respiratório usando a cepa de desafio europeu.

[00029] Figura 1B : A observação clínica de pontuação clínica total, em modelo de desafio respiratório usando uma cepa de desafio europeu.

[00030] Figura 2 : As medições de temperatura retal em modelo de desafio respiratório utilizando uma cepa de desafio europeu.

[00031] Figura 3 : As medições de ganho de peso médio diário no modelo de desafio respiratório utilizando uma cepa de desafio europeu.

[00032] Figura 4 : PRRS viremia como indicado através de PCR quantitativo em modelo de desafio respiratório usando uma cepa de desafio europeu.

[00033] Figura 5 : PRSS serologia conforme indicado por meio de ELISA no modelo de desafio respiratório, utilizando uma cepa de desafio Europeu.

[00034] Figura 6 : O exame macroscópico das lesões do pulmão em um modelo de desafio respiratório usando uma cepa de desafio euro- peu.

[00035] Figura 7A a C : As mediçõrd de Histopatologia. A Figura 7A mostra os meis de lesões do pulmão macroscópicas ; A Figura 7B mostra o controle de histopatologia de animais ; A Figura 7B mostra histopatologia de animais PRRS infectados.

[00036] Figura 8 : Mostra os resultados de RT-PCT Tempo PCR retratando a % viremia em animais vacinados com PRRS EU 94881.

[00037] Figura 9 : O processo concomitante para a produção em larga escala de PRRS UE 94881.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00038] A presente invenção proporciona os métodos de tratar ou reduzir a gravidade de infecção por vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), bem como, métodos de prevenção de infecção de VSRRS. Geralmente, o método é para o tratamento ou a redução da gravidade ou a incidência de infecção por vírus da síndro- me reprodutiva e respiratória suína (PRRSV). "Tratar ou reduzir a gravidade ou incidência de" refere-se a uma redução da severidade dos sinais clínicos, sintomas e/ou sinais patológicos normalmente associados com a infecção, até e incluindo a prevenção de quaisquer sinais ou sintomas. Os "Sinais patológicos" refere-se à evidência de infecção que é encontrada microscopicamente ou durante a necropsia (por exemplo, as lesões do pulmão).

[00039] O método geralmente inclui a etapa de administrar uma quantidade terapêutica de um antigênio de PRRSV a um suíno de uma determinada idade ou em uma faixa etária. Por exemplo, em um aspecto da presente invenção, uma quantidade terapêutica de um anti- gênio de PRRSV pode ser administrada a um leitão cerca de quantidades terapêuticas de três semanas de idade ou mais jovens, e diferente do antigênio podem ser administrados a um suíno dentre cerca de 3 semanas de idade e 4 semanas de idade. Da mesma forma, mesmo uma quantidade terapêutica diferente pode ser administrada a um suíno entre cerca de quatro semanas e 16 semanas de idade (ou qualquer idade dentro deste intervalo, por exemplo, cinco semanas a seis semanas de idade, nove semanas a 15 semanas de idade e sete semanas a 10 semanas de idade, etc) ou de suínos com mais de 16 semanas, tal como uma leitoa adulta.

[00040] Em modalidades específicas, a presente invenção refere- se, de uma cepa de PRRSV atípica atenuada e correspondentes melhoradas de vacinas atenuadas que conferem imunidade eficaz para esta cepa de PRRSV típico recentemente descoberta. A "imunidade eficaz" refere-se à capacidade de uma vacina para prevenir as infecções PRRSV suína, incluindo infecções PRRSV atípicas, que resultam em substanciais sinais clínicos da doença. Deve entender-se que os suínos imunizados podem ou não ser serologicamente positiva para PRRSV, mas os suínos não apresentam quaisquer sintomas clínicos substanciais.

[00041] Em formas preferidas, a vacina da presente invenção inclui um vírus vivo PRRS do tipo europeu que foi atenuado em virulência. O vírus atenuado resultante demonstrou ser avirulento em estudos em animais desafiados hospedeiros controlados e confere imunidade eficaz. Esta cepa particular de PRRS EU não é tão virulenta como as outras e, portanto, é uma opção atraente como uma candidata a vacina. A cepa parental PRRSV 94.881 não causa grave doença PRRSV atípica nas leitoas grávidas nem lesões do pulmão em suínos jovens. Esta cepa foi inicialmente isolada na Renânia do Norte-Vestfália, na Alemanha a partir de 3 semanas de idade dos leitões com doença respiratória grave. A cepa foi posteriormente atenuada por meio da passagem contínua de células MA 104. A cepa atenuada foi depositada pelo Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, na Alemanha, na coleção europeia de culturas de células (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, 0JG SP4, Grã-Bretanha, em 25 de janeiro 2011 e foi concedido o Número de Acesso 11012502. Este vírus atenuado é um vírus de Semente principal preferido (MSV), que foi subsequentemente passado e desenvolvido como uma vacina contra PRRSV eficaz. A cepa virulenta pai denominada 94.881 também foi depositada, de acordo com o Tratado de Budapeste por Bioscreen GmbH, Mendelstrasse 11, 48149, Muenster, Alemanha na coleção de culturas de células Europeu (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Grã- Bretanha , em 25 de janeiro 2011 e foi concedido Número de Acesso 11012501.

[00042] Em certas modalidades exemplares o vírus da vacina viva modificada foi testado com uma dose de 1 ml de suínos e de 2 ml para leitões através de injeção intramuscular e foi demonstrado ser eficaz na produção de imunidade protetora.

[00043] A passagem do vírus à atenuação foi realizada usando os métodos clássicos da virologia. Especificamente, o parental isolado PRRS 94.881 foi atenuado in vitro através de passagem contínua de células MA 104 para conseguir uma passagem máxima de 108 passagens passadas no isolamento inicial. Resumidamente, o material foi passado em cerca de 1 a 2 passagens por semana para um total de 108 passagens em frascos T-25cm2 ou T-75cm2. As culturas de células confluentes MA 104 com cerca de 12-30 ml de Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com soro fetal bovino a 6% (FBS) foram inoculados com 100 a 300 ul do vírus. As culturas foram incubadas durante 3 a 7 dias em uma câmara incubadora umidificada a 37 ° C com 4 a 6% de CO2. Uma vez que as culturas atingiram > 25% de efeito citopático (CPE), o balão foi colhido por meio da extração do so- brenadante. Uma parte do sobrenadante foi passada para um novo frasco e 2 mL da colheita foi aliquotado para armazenamento a -60 ° C a -80°C.

[00044] A pessoa qualificada, utilizando as técnicas padrão na técnica será capaz de determinar que a sequência de ácido nucleico subjacente do vírus atenuado foi depositada sob o No. de acesso ECACC 11012502. Por conseguinte, a presente invenção engloba ainda uma sequência de ácido nucleico específia para a cepa atenuada de PRRSV 94481 depositada na ECACC sob o número de acesso 11012502. De preferência, a presente invenção abproporção ainda as sequências de ácidos nucleicos de vírus PRRS que partilham pelo menos 95% de homologia de sequência com a sequência de SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 10 em que tais vírus podem provavelmente ser eficazes em conferir imunidade em animais vacinados com vírus atenuados contendo tais sequências homólogas. A sequência apresenta-da em SEQ ID NO : 1 é a sequência de comprimento completo do PRRS atenuado 94881 MSV e tem uma sequência de comprimento total de 14843 pb. O ORFS 1 a 7 foram anotados para esta sequência como segue : Número ORF CDS na SEQ ID NO : 1 Proteína Codificada ORF1a 178 a 7227 SEQ ID NO : 2 ORF1b 7209 a 11600 SEQ ID NO : 3 ORF2 11611 a 12360 SEQ ID NO : 4 ORF3 12219 a 13016 SEQ ID NO : 5 ORF4 12761 a 13312 SEQ ID NO : 6 ORF5 13309 a 13914 SEQ ID NO : 7 ORF6 13902 a 14423 SEQ ID NO : 8 ORF7 14413 a 14799 SEQ ID NO : 9

[00045] A sequência apresentada na SEQ ID NO : 10 é a sequência de comprimento completa da cepa parental de PRRSV 94881, de passagem 5 e tem uma sequência de comprimento total de 14843 pb. O ORFS 1 a 7 foram anotados para esta sequência como segue: Número ORF CDS na SEQ ID NO : 10 Proteína Codificada ORF1a 178 a 7227 SEQ ID NO : 11 ORF1b 7209 a 11600 SEQ ID NO : 12 ORF2 11611 a 12360 SEQ ID NO : 13 ORF3 12219 a 13016 SEQ ID NO : 14 ORF4 12761 a 13312 SEQ ID NO : 15 ORF5 13309 a 13914 SEQ ID NO : 16 ORF6 13902 a 14423 SEQ ID NO : 17 ORF7 14413 a 14799 SEQ ID NO : 18

[00046] Com o isolamento desta nova cepa de vírus atenuado de PRRS europeu é possível produzir as vacinas melhoradas de PRRS contendo uma cepa de PRRS mais recente que é o reflexo de cepas virulentas de PRRS encontrados actualmente no domínio. Em particular, o novo vírus de PRRS europeu atenuado pode ser utilizado para preparar as vacinas vivas modificadas (MLV). Uma vacina viva modificada é caracterizada pelo fato de conter o vírus vivo, que pode replicar-se em suínos, mas não exerce a doença clínica de PRRS. Além disso, após a administração, induz uma resposta imunológica em suínos que geralmente conduz a um grau significativo de proteção contra a infecção subsequente com o vírus de PRRS patogênica. O vírus exibindo tais características é geralmente chamado de vírus atenuado. Além disso, a presente invenção proporciona os detalhes das sequências dos BLI de ambos os pais e as cepas atenuadas de PRRSV 94881. Dessa maneira , está contemplado que a pessoa que é versada na técnica pode empregar qualquer uma das sequências de um ou mais dos ORFs mostradas na presente invenção em uma vacina de subunidade.

[00047] Como referido acima, de um modo geral, a atenuação dos vírus pode ser gerada a partir de isolados de vírus patogênicos através de repetidas passagens em em células hospedeiras adequadas que são permissivas para o vírus até que o vírus apresente as propriedades desejadas (WO 92/21375, WO 93/06211 , WO93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356, EP 0 676 467, EP 0 732 340, EP 0 835 930). De uma maneira alternativa, pode ser gerada por meio da reengenha- ria genética através da utilização de um clone infeccioso, normalmente um transcrito de comprimento completo de DNA complementar do ge- noma viral (WO 98/18933, EP 1 018 557, WO 03/062407, Nielsen et al, J. Virol 2003, 77 : 3702-371 1). Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a uma MLV contendo vírus de PRRS atenuado de genótipo europeu 94481, que é atenuado a partir de um vírus parental, que é depositado na ECACC sob o número de acesso 11012501. Uma MLV preferida contém o vírus atenuado da presente invenção que é depositado na ECACC sob o número de acesso 11012502.

[00048] Em outro aspecto, a presente invenção contempla a preparação e isolamento de um progenitura ou descendente de um vírus PPRS que foi depositada em 25 de Janeiro de 2011 na Coleção Europeia de Culturas de Células (ECACC), Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 0JG, Grã-Bretanha, sob os números de acesso ECACC 11012502 (cepa atenuada por MLV) e 11012501 (cepa parental). Por conseguinte, a presente invenção estende-se às cepas de vírus de PRRS que são derivadas a partir das cepas depositadas através de reprodução ou multiplicação de uma forma idêntica ou divergentes, nomeadamente descendentes que possuem as características essenciais das cepas depositadas. Após a propagação continuada, as cepas podem adquirir mutações a maioria das quais não irá alterar as propriedades destas cepas de uma forma significativa.

[00049] As cepas da presente invenção também pode ser adicionalmente modificadas para conferir propriedades mais desejáveis a elas. Isto pode ser conseguido por meio da propagação clássica e téc- nicas de seleção, como a propagação continuada em células hospedeiras apropriadas para alargar o fenótipo atenuado. De uma maneira alternativa, as cepas podem ser geneticamente modificadas por meio da mutação dirigida da sequência de ácido nucleico do genoma destas cepas por meio de técnicas de engenharia genética apropriadas. O genoma de PRRSV foi completa ou parcialmente sequenciado (Con- zelmann et al, 1993, Meulenberg et al, 1993a, Murtaugh et al, 1995) e codifica, além da polimerase de RNA dependente de RNA (ORF 1a e 1b), seis proteínas estruturais tal qual quatro glicoproteínas do envelope nomeados GP2 (ORF2), GP3 (ORF3), GP4 (ORF4) e GP5 (ORF5), uma membrana de proteína não glicosilada de M (ORF6) e a proteína N da nucleocapsídeo (ORF7) (Meulenberg et al. 1.995, 1996 ; van Ni- euwstadt et al, 1996). Caracterização imunológica e sequenciação de nucleotídeos de isolados de PRRSV Europeus e EUA identificou as diferenças antigênicas menores dentro cepas de PRRSV localizadas nas proteínas virais estruturais (Nelson et al, 1993 ; Wensvoort et al, 1992,.. Murtaugh et al, 1995). O PRRS 94881 MSV da presente invenção foi comparado com a cepa de vírus de referência europeia do vírus Lelystad (LV) o qual revelou homologias nucleotídicas que vão de 85,40 a 95,09 por cento nos oito diferentes genes virais e as identidades de aminoácidos de 86,39 a 97,27 por cento entre ambas as cepas de vírus . Duas deleções na ORF 1a 94881 MSV puderam ser identificadas em comparação com LV. Por exemplo, de 94881 ORF1a MSV tem 85,40% de homologia de nucleotídeos contra o vírus de Lelystad, resultando em uma identidade de aminoácidos de 86,39% ; ORF1b de 94881 MSV tem 92,12% de homologia de nucleotídeos contra o vírus de Lelystad, resultando em uma identidade de aminoácidos de 97,27% ; ORF2 de 94881 MSV tem 91,07% de homologia de nucleotídeos contra o vírus de Lelystad, resultando em uma identidade de aminoácidos de 90,76% ; ORF3 de 94881 MSV tem 90,98% de homologia de nu- cleotídeos contra o vírus de Lelystad, resultando em uma identidade de aminoácidos de 89,43% ; ORF4 de 94881 MSV tem 90,58% de homologia de nucleotídeos Vírus de Lelystad, resultando em uma identidade de aminoácidos de 87,43% ; ORF5 de 94881 MSV tem 90,43% de homologia de nucleotídeos contra o vírus de Lelystad, resultando em uma identidade de aminoácidos de 88,56% ; ORF6 de 94881 MSV tem 95,02% de homologia de nucleotídeos contra o vírus de Lelystad resultando em uma identidade de aminoácidos de 97,11% ; ORF7 de 94881 MSV tem 95,09% de homologia de nucleotídeos contra o vírus de Lelystad, resultando em uma identidade de aminoácidos de 92,97%;

[00050] Com efeito, o vírus de PRRS 94881 da presente invenção pode ser feito em um vírus quimérico, em que a estrutura principal do vírus PRRS, sob o No. de acesso ECACC 11012502 ou mesmo da cepa depositada sob o n ° de acesso ECACC 11012501 é modificada para substituir a sequência endógena de uma ou mais das ORF 1a, 1b ORF, ORF 2, ORF 3, 4 ORF, ORF 5, ORF 6 ou 7 com a ORF correspondente ORF de uma cepa diferente do vírus PRRS. Por exemplo, a diferente cepa do vírus PRRS, pode ser uma cepa europeia diferente, como cepa do vírus de Lelystad (Lelystad agente (CDI-NL-2.91), ou outras cepas, tais como as depositadas sob os números de acesso ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM Número de Acesso I-1140, CNCM Número de Acesso I-1387, CNCM Número de Acesso I-1388, ATCC VR 2332, 2385 VR, VR 2386, 2429 VR, VR 2474, e VR 2402 ; CNCM I-1102, CNCM I-1140, CNCM I1387, CNCM I-1388, ECACC V93070108, ou ou de fato pode ser uma cepa EUA, tais como vírus de PRRS norte-americana, pT7P129A ; depósito em ATCC VR-2332, Depósito em ATCC VR-2368 ; ATCC VR- 2495 ; ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474, e ATCC VR 2402.

[00051] As técnicas recombinantes para preparação de sequências modificadas são bem conhecidas por aquelas pessoas que são versadas na técnica e geralmente utilizam uma construção de comprimento total de cópias de DNA complementar (clones infecciosos) do genoma viral, que pode então ser modificada por meio dos métodos de recom- binação de DNA e a manipulação (como a mutagênese dirigida ao local, etc.) Desta forma, por exemplo, pode ser locais antigênicos modificados ou propriedades enzimáticas de proteínas virais. Os clones infecciosos de cepas do genótipo europeu e norte-americano do vírus PRRS foram relatados na literatura.

[00052] As cepas de vírus de PRRS da presente invenção são adequadas para as vacinas da presente invenção que podem ser cultivadas e colhidas por meio dos métodos conhecidos na técnica , por exemplo , por meio da propagação em células hospedeiras adequadas, tais como a cepa de célula MA símio-104, as células Vero, ou macrófagos alveolares suínos. O PRRSV cresce, preferencialmente, em macrófagos alveolares de pulmão (Wensvoort et al., 1991). Algumas linhas de célula, tais como a CL2621 e outras linhas de célula clonadas a partir da cepa de célula de rim de macaco MA-104 (Benfield et al, 1992 ; . Collins et al, 1992,.. Kim et al, 1993) também são susceptíveis ao vírus.

[00053] As vacinas que compõem qualquer uma das PRRSV cepa do vírus PRRS sob ECACC Número de Acesso 11012501, 11012501 Números de adesão ECACC 04102703, ECACC 04102702, 04102704 ECACC, CNCM Número de Acesso I-1140, CNCM Número de Acesso I-1387, e CNCM Adesão Não I-1388, bem como qualquer combinação destas cepas ou seus descendentes são, portanto, modalidades preferidas da presente invenção. Em modalidades específicas, o vírus de PRRS 94881 é cultivado em um processo em que existe em uma sementeira simultânea do vírus e as células hospedeiras em conjunto no mesmo dia em um bioreactor como mostrado na Figura 9. As características adicionais de um método de produção de vírus PRRS 94881 podem ser descritas em simultâneo arquivadas em anexo como provisório U.S. , intitulado "Um processo de escala comercial para produção de PRRSV" depositado em simultâneo com a aplicação instantânea sob número do pedido 61/444, 071. Embora este seja um método de crescimento do PRRSV 94881, deve ser entendido que o vírus pode ser propagado de acordo com qualquer método convencional conhecido por meio daqueles que são versados na técnica.

[00054] De preferência, as vacinas de acordo com a presente invenção, são as vacinas vivas modificadas que compreendem uma ou mais destas cepas vivas em um veículo apropriado, mas o vírus inati- vado também pode ser utilizado para preparar vacina morta (KV). MLV são tipicamente formuladas para permitir a administração de 101 a 107 partículas virais por dose, de preferência de 103 a 105 partículas por dose, mais preferencialmente 104 a 105 partículas por dose 4.0 a 5.0 (log10 TCID50). KV podem ser formulados com base em um título de pré-inativação de 103 a 1010 partículas virais por dose. A vacina pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma solução salina fisiológica.

[00055] Os suínos podem ser infectados por PRRSV pela via oro- nasal. Vírus nos pulmões é feita por macrófagos alveolares de pulmão e de replicação nestas células de PRRSV é completado dentro de 9 horas. O PRRSV viaja dos pulmões para os nódulos linfáticos do pulmão dentro de 12 horas e para os gânglios linfáticos periféricos, da medula óssea e baço, no prazo de 3 dias. Nesses locais, apenas algumas células coloração positiva para o antígeno viral. O vírus está presente no sangue durante, pelo menos, 21 dias e frequentemente muito mais tempo. Após 7 dias, os anticorpos para PRRSV são encontrados no sangue. A presença combinada de vírus de PRRS e anticor- pos em suínos infectados mostra que a infecção pelo vírus pode persistir durante muito tempo, embora a um nível baixo, apesar da presença de anticorpo. Durante pelo menos 7 semanas, a população de células alveolares nos pulmões é diferente dos pulmões SPF normais.

[00056] A vacina de acordo com a presente invenção pode ser apresentada na forma de uma preparação liofilizada de vírus vivo, para ser reconstituída com um solvente, para resultar em uma solução injetável. O solvente pode, por exemplo ser a água, soro fisiológico ou tampão, ou um solvente adjuvante. O solvente pode conter adjuvantes. A vacina reconstituída pode então ser injetada em um suíno, por exemplo, através de uma injeção intramuscular ou intradérmica para o pescoço. Para injeção intramuscular, um volume de 2 ml, pode ser aplicado, por meio de uma injeção intradérmica que é tipicamente de 0,2 ml. Em um outro aspecto, a presente invenção, portanto, é um produto de vacina, que compreende, em recipientes separados, uma composição seca por meio da congelação do vírus, e um solvente para reconstituição, e opcionalmente contendo ainda um folheto ou etiqueta que compreende as instruções de utilização.

[00057] A vacina de acordo com a presente invenção pode não só incluir uma ou mais das cepas acima mencionadas, mas pode incluir outros componentes ativos contra PRRS ou outras doenças virais e bacterianas, como o circovírus suíno ou o vírus da peste suína clássica. Portanto, a presente invenção também diz respeito a uma vacina, tal como descrito, caracterizad pelo fato de conter pelo menos um outro antigênio ativa contra uma doença suína que não é de PRRS. Por exemplo, esses novos antígenos podem incluir Mycoplasma hyop- neumoniae, PCV2, SIV, H. parasuis, E. rhusiopathiae, S. suis, A. suis, Leptospira sp. Parvovírus e outros semelhantes. Além disso, a vacina pode compreender certos adjuvantes farmacêuticos ou veterinários aceitáveis. A presente invenção proporciona novas composições de vacina, em particular as vacinas de vírus de PRRS, que compreende PRRSV 94881 que ainda compreende os adjuvantes que aumentam a eficácia da vacina de modo a que uma melhor resposta clíni- ca/resultado é observado com a administração da combinação do adjuvante e da vacina como em comparação com a administração da vacina sozinha. Por exemplo, as composições de vacina da presente invenção pode compreender uma vacina de vírus PRRS 94881 e um adjuvante selecionado a partir do grupo que consiste em MCP-1, α- tocoferol (por exemplo, acetato de α-tocoferol, um exemplar da versão que é vendido como Diluvac Forte ®), as frações Haemophilus sonmus carbopol, e respectivas combinações. Em algumas modalidades, a vacina de vírus de PRRS que compreende vacina de vírus 94881, que pode ser uma vacina de subunidade recombinante ou, de uma maneira alternativa, pode ser uma vacina de vírus vivo atenuado. Uma vacina viva exemplar que existe é Ingelvac ® PRRS e MLV de PRRS 94881 podem ser formuladas de um modo semelhante ao Ingelvac ® PRRS MLV.

[00058] Para além do referido, as composições imunogênicas da presente invenção podem conter outros componentes desde que os outros componentes que não interfiram com os adjuvantes ou o vírus da vacina subjacente. Esses outros ingredientes incluem, por exemplo, ligantes, corantes, dessecantes, anti-sépticos, agentes molhantes, estabilizadores, excipientes, adesivos, plastificantes, agentes de pegajo- sidade, espessantes, materiais de patch, bases para unguentos, removedores de queratina, substâncias básicas, os promotores de absorção, ácidos graxos, gordurosos éster de ácido, álcoois superiores, agentes tensoativos, a água, e agentes tampão. Os outros ingredientes Preferidos incluem agentes tampão, bases para unguentos, ácidos graxos, anti-sépticos, substâncias básicas, ou tensoativos.

[00059] A quantidade de conteúdo ou de os adjuvantes utilizados na presente invenção pode variar e pode ser determinada tendo em consideração, por exemplo, as propriedades da vacina de vírus PRRS, a ser utilizado, e a forma de dosagem. O adjuvante pode compreender, por exemplo, 1 a 100% em peso. As composições à base de 94881 PRRSV da presente invenção são produzidas por meio da mistura conjunta do componente adjuvante e o componente de vacina de vírus, quer isoladamente quer com vários outros ingredientes. As composições podem ser de tal modo que a vacina de vírus e o adjuvante são apresentados como uma formulação ou, em alternativa, o adjuvante e a vacina são apresentados em formulações distintas que podem ser administradas simultaneamente ou sequencialmente.

[00060] O componente de adjuvante das composições imunogêni- cas da presente invenção pode assim ser administrado separadamente a partir da vacina de vírus da administração para os organismos. De uma maneira alternativa, o adjuvante de acordo com a presente invenção, juntamente com o vírus da vacina, pode ser administrado como uma única composição de vacina. A vacina de vírus pode ser qualquer vacina de vírus. Mais modalidades específicas contemplam a utilização de uma vacina de vírus PRRS que compreende PRRSV 94881. Além disso, uma tal vacina pode ser combinada com outras vacinas, tais como Ingelvac ® PRRS MLV e/ou Porcilis ®. Isto é apenas um exemplo vírus de PRRS combinação de vacinas e outras vacinas tais combinações podem ser prontamente preparadas.

[00061] As composições imunogênicas descritas na presente invenção são particularmente vantajosas na indução da produção de uma resposta de anticorpos contra o vírus de PRRS. A administração das vacinas de preferência produzirá uma redução da gravidade de um ou mais sintomas clínicos, tais como as lesões do pulmão, anorexia, descolorações da pele, letargia, sinais respiratórios, leitões cadáveres dissecados, tosse, diarreia e combinações dos mesmos, que estão associadas com a infecção por PRRSV.

[00062] As composições, dessa maneira , aumentam particularmente o resultado clínico em um animal doente, em comparação com o resultado da administração de vacinas de vírus de PRRS sozinho. Em modalidades específicas, o resultado clínico avançado é uma redução da percentagem de lesões do pulmão por pelo menos 50% , quando comparados com os animais que não recebem a composição imuno- gênica, em combinação com o referido adjuvante. Em outras modalidades, a melhorar o resultado clínico é uma redução da viremia em animais por pelo menos 45% , quando comparados com os animais que não recebem a composição imunogênica, em combinação com o referido adjuvante.

[00063] Dessa maneira, em um aspecto, a presente invenção refere-se a uma vacina melhorada, mais especificamente e melhor vacina de vírus de PRRS, em que o melhoramento compreende a mistura com a vacina de vírus de um adjuvante selecionado a partir do grupo que consiste em MCP-1, Haemophilus frações sonmus, carbapol e suas combinações. A composição da vacina da presente invenção pode compreender ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00064] As composições de vacina da presente invenção podem ser formuladas por meio de qualquer método conhecido na técnica de formulação, por exemplo, em preparações líquidas, suspensões, pomadas, pós, loções, emulsões A/O, emulsões O/W, emulsões, cremes , cataplasmas, patches e géis e são preferencialmente usadas como medicamentos. Dessa maneira , de acordo com um outro aspecto da presente invenção, é proporcionada uma composição farmacêutica que compreende a composição de vacina acima. A composição de vacina de acordo com a presente invenção, quando administrada por via dérmica, pode induzir a produção de anticorpos significativamente. Por conseguinte, em uma outra modalidade preferida da presente inven- ção, a composição de vacina pode ser fornecida como uma preparação transdérmica.

[00065] Além disso, conforme descrito acima, o vírus e o adjuvante na presente invenção, pode ser administrado a um organismo, em conjunto como uma única composição de vacina, ou como uma preparação de adjuvante separado e distinto do componente do vírus PRRS antigê- nica da vacina, em que os atos de adjuvantes de uma forma tal que a quantidade de um anticorpo produzido no organismo em resposta à vacina de vírus PRRS, pode ser significativamente aumentada, em comparação com a administração da vacina de vírus PRRS sozinho.

[00066] Quando o adjuvante e a vacina de vírus PRRS, são administrados a um organismo, o comportamento clínico do animal é aumentado. A quantidade eficaz do adjuvante e a quantidade imunologi- camente eficaz da vacina de vírus PRRS, pode ser prontamente determinada por uma pessoa com conhecimentos correntes na técnica tomando em consideração, por exemplo, o tipo e as propriedades da substância antigênica, as espécies de organismos , idade, peso corporal, gravidade das doenças, do tipo de doenças, o tempo de administração, e do método de administração e ainda mais utilizando a quan-tidade de um anticorpo produzido contra a substância antigênica do organismo como um índice.

[00067] A vacina de vírus de PRRS, o adjuvante, ou combinações dos mesmos podem ser administrados a organismos, por qualquer método adequado selecionado, dependendo, por exemplo, sob a condição de animais e propriedades de doenças. Exemplos de tais métodos incluem a administração intraperitoneal, a administração por via dérmica, por exemplo, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intradérmica, e patches, administração nasal, administração oral, a administração mucosal (por exemplo, administração retal, administração vaginal e administração da córnea). Entre elas, é preferível a ad- ministração intramuscular.

[00068] Uma dose terapêutica exemplar de PRRSV MLV é de cerca de dois mililitros (2 ml). Os especialistas na matéria irão reconhecer que a quantidade de dosagem pode ser variado em função da raça, tamanho, e outros fatores físicos do sujeito individual, assim como, a formulação específica de PRRSV MLV e a via de administração. De preferência, o PRRSV MLV é administrado em uma dose única, no entanto, as doses adicionais podem ser úteis. Novamente, o especialista na técnica irá reconhecer por meio da presente invenção, que a dosagem e o número de doses é influenciada pela idade e condição física do sujeito suíno, assim como, outras considerações comuns para a indústria e as condições específicas sob as quais o PRRSV MLV é administrada.

[00069] Em certas outras modalidades, a vacina pode ser uma vacina multivalente que compreende dois ou mais vírus PRRS em que pelo menos um dos vírus de PRRS é o vírus atenuado 94881 depositado sob o No. de Acesso ECACC 11012502. Os outros vírus PRRS podem ser um ou mais selecionados dentre o grupo que consiste em vírus da cepa de PRRSV Lelystad (agente Lelystad (CDI-NL-2.91), ou outras cepas, tais como as depositadas sob os números de acesso ECACC 04102703, ECACC 04102702, ECACC 04102704, CNCM Número de Acesso I-1140, CNCM Número de Acesso I-1387, CNCM Número de Acesso I-1388, ATCC VR 2332, 2385 VR, VR 2386, 2429 VR, VR 2474, e VR 2402 ; CNCM I-1102, CNCM I- 1140, CNCM I1387, CNCM I-1388, ECACC V93070108, ou ou de fato pode ser uma cepa EUA, tais como vírus de PRRS norte-americana, pT7P129A ; depósito em ATCC VR-2332, ATCC VR-2368 Depósito ; ATCC VR-2495, ATCC VR 2385, ATCC VR 2386, ATCC VR 2429, ATCC VR 2474, e ATCC VR 2402.

[00070] As vacinas baseadas em vírus PRRS podem ser utilizadas para vacinar os leitões e leitões. Em um aspecto da presente invenção, um regime especial, a dose é selecionada com base na idade do suíno e antigênio selecionado para a administração. Isto irá permitir que os suínos de qualquer idade venham a receber a dose mais eficaz. Em um método preferido, uma quantidade terapêutica de PRRSV 94.881 MLV é administrada a um suíno ou um leitão que é cerca de duas semanas de idade ± 5 dias de idade. A quantidade selecionada irá variar dependendo da idade do suíno. De uma maneira alternativa, uma quantidade terapêutica diferente de tal MLV é administrada a um suíno ou leitão que é mais velho do que cerca de 3 semanas, e esta quantidade também mudará como o suíno recebendo essa administração ou se torna mais velho. Dessa maneira , os suínos cerca de quatro semanas de idade, seis semanas de idade, oito semanas de idade, 10 semanas de idade, 12 semanas de idade, 14 semanas de idade, 16 semanas de idade, a dourada, ou uma leitoa todos receberão quantidades diferentes. A dose terapêutica a ser utilizada será otimizada no campo e geralmente é, determinada em estudos clínicos nos quais a dose imunizante mínima é definida com base na proteção contra um desafio PRRSV heteróloga virulento em suínos suscetíveis. De preferência, o PRRSV MLV produzido de acordo com os métodos descritos na presente invenção é administrado via intramuscular, no entanto, outros métodos de administração, tais como intradérmica, intranasal, intra-retiniano, oral, subcutânea, e semelhantes, que são bem conhecidos e utilizados na técnica podem ser usados.

[00071] A pessoa versada na técnica vai reconhecer que os métodos de vacinação podem envolver a determinação do tempo e da dosagem adequada para a vacinação de um suíno contra o PRRSV. Tais métodos geralmente compreendem as etapas de determinar, pelo menos, uma variável selecionado dentre o grupo que consiste em idade, estado de saúde, o nível de imunidade inata e nível de imunidade ati- va, do suíno, e ajustar um nível de dosagem padrão de explicar estas variáveis. Geralmente, o nível de imunidade inata e imunidade ativa nível será determinado por referência a um padrão composto de níveis médios a partir de uma população de suínos da mesma idade e estado de saúde. Num método particularmente preferido, todas as variáveis são consideradas antes de se determinar o nível de dosagem óptimo e momento da administração.

[00072] Em modalidades preferidas, a presente invenção refere-se também a ácidos nucleicos isolados que codificam sequências de leitura aberta específicas de vírus atenuado 94881 depositada sob o No. de acesso ECACC 11012502 e a mãe virulenta do vírus 94881 depositada sob o No. de Acesso ECACC 11012501. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos completa do vírus atenuado 94881 depositada sob o No. de Acesso ECACC 11012502 tem uma sequência de SEQ ID NO : 1, que codifica ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 sequências de proteína da ID SEQ NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, ID SEQ NO : 8, e SEQ ID NO : 9, de uma maneira respectiva. A sequência de nucleotídeos completa da mãe virulenta do vírus 94881 depositada sob o No. de Acesso ECACC 11012501 tem uma sequência de SEQ ID NO : 10, que codifica ORF1a, ORF1b, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 sequências de proteína de SEQ ID NO : 11, SEQ ID NO : 12, SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 17, e SEQ ID NO : 18, de uma maneira respectiva.

[00073] A vacina de PRRSV 94881 pode ser administrada em qualquer forma convencional e, em alguns métodos preferidos para a administração é por via intramuscular. É preferido que a vacina administrada PRRSV proporciona os benefícios de tratar ou reduzir a gravidade ou incidência de infecção por PRRSV, após uma única dose, como com Ingelvac, no entanto, se os outros antigênios ou combinação ou vacinas multivalentes são selecionados, deve ser entendido ® que eles podem ser administrados na sua forma convencional, que pode incluir uma ou mais doses de reforço, após a administração inicial. As pessoas que são versadas na técnica serão capazes de determinar os níveis de dosagem adequados com base na vacina VSRRS selecionado e da faixa etária do animal ao qual o antigênio vai ser administrado.

[00074] Nos exemplos específicos apresentados na presente abaixo e suínos foram desafiados com uma nova cepa derivada europeia de PRRSV, que era capaz de produzir reprodutivelmente a doença respiratória em leitões. Historicamente, as cepas de PRRSV Europeia derivadas têm sido incapazes de reproduzir a doença respiratória em modelo de leitão e modelos de desafios respiratórias, portanto, contou com a infecção por cepas não europeias. Devido à elevada diversidade genética, há uma demanda na Europa para uma nova vacina com base em uma cepa europeia. Em outros exemplos, os animais foram desafiados com uma cepa que produziu falha reprodutiva em lei- tões/novos modelos de desafio de leitões. Verificou-se que a eficácia das vacinas vivas modificadas baseadas em vírus atenuados 94881 depositada sob o n ° de acesso ECACC 11012502 ou qualquer vírus preparado a partir desta cepa, ou a partir da cepa parental depositado no acesso ECACC 11012501 n pode ser demonstrado utilizando uma variedade de modelos de desafio porque esta cepa é também eficaz em outros modelos de insuficiência respiratória ou reprodutiva induzida por vírus de PRRS.

EXEMPLOS Exemplo 1 : Descrição de modelo de desafio respiratório PRRSV

[00075] Como mencionado acima, as cepas de PRRSV, historicamente, derivadas da Europa são incapazes de reproduzir a doença respiratória no modelo de leitão. Por causa da grande diversidade ge- nética existe uma procura na Europa para uma nova vacina baseada em uma cepa europeia e um bom modelo de desafio reprodutível respiratório, utilizando uma cepa virulenta de VSRRS europeu derivado é necessário para a realização dos estudos. No exemplo a seguir, os inventores mostram que o desafio de suínos com baixa cepa de desafio europeu passagem (passagem 4) produzido de forma confiável em sintomas respiratórios.

[00076] Neste estudo, três grupos com 12 animais, 3 semanas de idade na alocação e aproximadamente 10 semanas de idade Foram utilizados no desafio :

[00077] Grupo 1 : Grupo de controle

[00078] Grupo 2 : Grupo de desafio (SD 35)

[00079] Grupo 3 : Vacinados com PRRSV Porcilis ® SD (0) e em seguida desafiados (SD 35).

[00080] O estudo foi conduzido durante um período de 56 dias a necropsia de 6 animais de cada grupo foi medida 10 dias após o desafio ; necropsia de todas as restantes animais 21 dias após o desafio. Diário parâmetros investigados foram : temperatura retal, respiratória e outros sinais clínicos. Outras variáveis estudadas foram : peso corporal, a mortalidade, a viremia, a soroconversão, patológicos e exame histológico dos pulmões.

[00081] No dia -7 estudo os grupos de suínos foram alocados para cada grupo. No dia 0 do estudo, Grupo 3 foi vacinado com Porcilis ® PRRSV. No estudo de 35 dias o grupo 2 e do grupo 3 foram inoculados com uma cepa de desafio Europeia. No dia 45 6 animais de cada grupo foram submetidos à eutanásia. Os demais animais foram sacrificados no dia 56.

[00082] A Figura 1A mostra as medições de tosse como um meio- pontuação por animal e semana. Verificou-se que houve um aumento da tosse depois da provocação tanto no desafio sozinho (Grupo 2) e o grupo Porcilis (Grupo 3). A Figura 1B mostra a pontuação total clínica que foi tomada a partir de dispneia, tosse, corrimento nasal e ocular e comportamento. Estes dados mostram que houve um aumento global de pontuação clínica total após desafio no desafio e grupo Porcilis. A temperatura retal dos animais foi monitorizada antes e depois do desafio e mostra que houve um aumento na temperatura retal do desafio e grupo Porcilis após o desafio (DP > 35 1-2 grupo p < 0,001 ; grupo 1 a 3 p < 0,001) (Figura 2).

[00083] A medição de peso médio diário (Figura 3) mostrou que após o desafio até a primeira e até a segunda necropsia do ADW foi significativamente menor no desafio (SD35-44 p < 0,001 e SD35-56 p < 0,01) e no grupo Porcilis vacinado (SD35-44 p < 0,05 e SD35-56 p < 0,05).

[00084] A viremia foi monitorizada por meio de PCR (Figura 4) e ensaios de ELISA (Figura 5). PCR mostraram que no Grupo 1 : todos os animais do grupo de controle permaneceram negativos. No Grupo 2 : todos os animais foram positivos para PRRSV, após o desafio ; no Grupo 3 : todos os animalls foram positivos para PRRSV, após a vacinação. ELISA revelou : que no Grupo 1 : todos os animais mantiveram-se negativos, no Grupo 2 : todos os animais foram positivos para PRRSV AB após o desafio no Grupo 3 : todos os animais foram positivos para PRRSV AB após a vacinação.

[00085] O exame macroscópico dos pulmões foi também realizado (Figura 6), quando os pulmões foram avaliados por áreas manchadas de castanho e áreas de consolidação : Em comparação com o grupo de controle as alterações macroscópicas significativas podem ser observadas na altura do desafio e grupo Porcilis (grupo 1 - 2 p < 0,001 ; grupo 1 a 3 p < 0,05). No exame histopatológico, os dados também mostraram eficácia da vacinação (Figura 7A através 7C). A pontuação de lesão do pulmão foi significativamente maior no grupo de desafio e Porcilis em comparação com o grupo de controle (grupo 1-2 p < 0,001 ; grupo 1 a 3 p < 0,001). As lesões microscópicas foram mais fortes 10 dias após a infecção.

[00086] Em sumário, a tosse, o total de pontuações clínicas e temperatura retal aumentou após o desafio nos controles de desafio e Grupos Porcilis vacinados. O peso corporal foi significativamente (p < 0,05) menor nos controles de desafio e grupo Porcilis em comparação com o grupo de controle negativo. Todos os animais do grupo de Por- cilis eram positivos para o vírus de PRRS e anticorpos após a vacinação. Todos os animais a partir dos controles de desafio foram positivos para o vírus de PRRS e anticorpos após o desafio. A análise macroscópica e histológica dos pulmões apresentavam lesões do pulmão macroscópicas e microscópicas graves nos controles de desafio e grupo Porcilis em comparação com o grupo de controle negativo.

[00087] Este estudo, dessa maneira , confirmou que a cepa de desafio europeu utilizada não induziu a doença significativa (p < 0,05) quando comparado com o grupo de controle negativo : febre, tosse, peso reduzido e as lesões do pulmão graves macroscópicas e microscópicas.

[00088] Além disso, a cepa de desafio Europeia demonstrou com sucesso a doença respiratória específica de PRRSV consistente e reprodutível no modelo de desafio de suíno e, por conseguinte, é adequado para uso como um vírus de desafio em futuros estudos de eficácia. Porcilis PRRS mostra uma falta de eficiência contra a cepa de desafio europeu dentro dos parâmetros deste estudo.

Exemplo 2 : Avaliação da dose imunizante mínima de vírus de PRRS atenuados Susceptíveis 94881 em 2 semanas de idade após infecção de leitões com isolados PRRS europeus heterólogos.

[00089] Um estudo de desafio da vacinação foi realizado para avaliar a dose mínima imunizante (MID) e vacina da Síndrome Respirató- ria e Reprodutiva Suína Europeia derivada do isolado 94.881, de vírus vivo modificado (MLV PRRSV 94.881) em três diferentes níveis de titulação, leitões sensíveis administrados com a síndrome respiratória e Reprodutiva Suína (PRRS), que eram, aproximadamente, 14 dias de idade, para proporcionar a redução relevante em lesões do pulmão a seguir ao desafio com uma heterólogo isolado europeu de PRRS. Quinze leitões foram incluídos em cada um dos grupos vacinados (Grupos 1 a 3), bem como no grupo de controle exposto (Grupo 4). Dez leitões foram incluídos no grupo de controle negativo (Grupo 5).

[00090] Os grupos de vacina e os grupos de controle de desafio foram monitorados por meio de uma série de parâmetros, incluindo : pós-desafio, a avaliação pós-vacinação, Sorologia PRRS, viremia pós- vacinação, observações clínicas pós-desafio, o ganho de peso médio diário clínico viremia (GPD), a temperatura retal e detecção de vírus PRRS nos pulmões. Um grupo de controle negativo (Grupo 5), que não foi desafiado, também foi incluído no estudo para fins de validação do estudo, demonstrando que a biossegurança não foi violado ao longo da duração do estudo.

[00091] O controle de desafio e os grupos de controle negativo foram PRRS negativos até ao dia do desafio (D28) e do grupo de controle PRRS negativo permaneceu negativo para o período restante do estudo (D38), validando assim o estudo.

[00092] O Desafio foi em 4 semanas pós-vacinação. Neste momento, apenas 2 animais no grupo da vacina DE baixa titulação, um animal no grupo de vacina de titulação média e 3 animais no grupo da vacina de elevada titulação foram PRRS positivos qPCR no soro.

[00093] O grupo de controle do desafio exibiu lesões do pulmão significativas típicas de PRRS pós-desafio. Depois do desafio, os grupos de vacina de baixo, médio e elevada titulação tinha pontuações totais médios de 0,13% , 0,55% e 0,40% , de uma maneira respectiva, das lesões do pulmão, enquanto que o grupo de controle exposto tiveram uma pontuação total média da lesão do pulmão de 33,40% . O total de Pontuações de lesão do pulmão para os três grupos de titulação de vacinas foram significativamente menores que o grupo de controle do desafio (p < 0,0001). Não houve diferenças estatísticas entre os grupos de titulação da vacina (p > 0,1484) para o total de Pontuações de lesão do pulmão. O grupo de controle negativo teve um total médiao da pontuação de lesão do pulmão de 0,00%.

[00094] Em estudo Dias 31, 35 e 38 do período pós-desafio, os três grupos de titulação de vacinas tinham significativamente menos viremia do que o grupo de controle do desafio (p < 0,0093). Não houve diferenças estatísticas entre os grupos de titulação de vacinas para viremia pós-desafio, exceto em D35, quando o grupo da vacina de elevada titulação exibiram significativamente menor viremia que o grupo da vacina de titulação média (p = 0,0442). Os leitões de controle negativo foram negativos para viremia em D31, D35 e D38.

[00095] Clinicamente, a gravidade (p < 0,0082) e a frequência (p < 0,0268) de tosse foi menos intensa nos três grupos de titulação de vacinas do que o grupo de controle do desafio durante o período pós- desafio, dia 29 ao Dia 38. A febre foi mais proeminente no grupo de controle do desafio que nos três grupos de titulação de vacinas pós- desafio. GMD foi significativamente maior para os três grupos de titulação da vacina em comparação com o grupo de controle do desafio (p < 0,0027).

[00096] O MID de PRRS 94.881 MLV conforme determinado neste estudo está associada com o baixo nível de vacina título de 1 x 102,77 TCID50/mL, com base em uma redução relevante em lesões do pulmão graves para os três níveis de titulação, em comparação com os controles de desafio depois de receber um desafio heterólogo PRRS europeu derivado virulento. Quando os parâmetros secundários foram examinados, todos os três níveis de titulação de vacinas foram associados com eficácia e sem distinções claras entre os grupos de titulação eram evidentes.

Design Geral de Estudo:

[00097] Este foi um estudo de design cego randomizado realizado em 70 leitões desmamados suscetíveis a PRRS, 14 a 16 dias de idade no dia 0 (D0). Uma descrição de grupos de tratamento é mostrada na Tabela 2.1 a seguir : Tabela 2.1 Grupos de Tratamento

[00098] Oitenta e três leitões preencheram os critérios de inclusão do estudo, dos quais os primeiros 70 números numéricos foram aleatoriamente designados para um dos cinco grupos em D-3 por meio de um biostatistician. Os leitões foram distribuídos por 15 grupos de Grupos 1 a 4 e dez leitões do Grupo 5. Todos os 83 leitões foram PRRS soronegativos.

[00099] Os leitões foram observados a partir de D-1 e D26 para avaliações clínicas pós-vacinação e observações serão registradas no formulário de registro de Avaliação Clínica.

[000100] Sorologia : sangue venoso foi coletado a partir de leitões em D0, D7, D14, D21, D28. Coleções das amostras foram gravadas. As amostras de sangue foram centrifugadas e o soro foi colhido de cada um dos tubos, dividido e transferido para tubos adequadamente etiquetados. Um conjunto de amostras de soro foi mantido a 2 a 8 ° C, e o outro conjunto de amostras de soro foram mantidas a -70 ± 10 ° C. O conjunto de amostras de soro coletadas nos dias 0, 7, 14, 21, 28 e 38 e manteve a 2 a 8 ° C foram testados para anticorpos de PRRS. Os resultados foram relatados como negativo (Proporção ELISA de < 0,4 S/P) ou positivo (ELISA > proporção de 0,4 S/P).

[000101] Viremia de PRRS : o conjunto de amostras de soro coletadas nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 31, 35 e 38 e manteve a -70 ± 10 ° C foram testados para o RNA PRRSV por qPCR (Anexo 1, Anexo 7). Os resultados foram relatados como n.d. (Não detectado), positivo (PRRSV UE detectado, mas não quantificável, GE/mL (genoma equivalente) = < 3,3 log) ou um valor reportado (log GE/mL). Para fins estatísticos, "não foi detectado" foi atribuído um valor de 0 log GE/mL e um valor "positivo" foi atribuído um valor de 3,0 log GE/mL.

[000102] Ganho de Peso Médio Diário (GPMD) : Cada suíno foi pesado em uma balança calibrada e pesos individuais foram registrados. O ganho médio diário foi determinado a partir do D0 a D28 e da D28 a D38.

[000103] Observações clínicas pós-desafio : Leitões foram observados pelo investigador do estudo ou designados para os sinais clínicos da doença a partir de D27 a D38 e foram registrados no formulário de registro da observação clínica. As observações incluíram respiração, comportamento e tosse com base no sistema de pontuação de observação clínica, como mostrado abaixo na Tabela 2.2 Tabela 2.2 Sistema de Pontuação de Observação clínica

[000104] Uma pontuação total da observação clínica diária para cada leitão foi determinada por meio da soma da sua respiração por dia, o comportamento e as contagens para a tosse.

[000105] As temperaturas retais foram coletadas a partir de D27 a D38.

[000106] Pontuação Total da Lesão Do pulmão : Todos os leitões que morreram antes de D38 e os demais leitões que foram sacrificados em D38 foram necropsiados. Cada conjunto de pulmões foram examinados para qualquer patologia do pulmão grave e determinação da % da patologia para cada lóbulo do pulmão. Se patologias de outros órgãos, foram observadas, estas foram descritas e bem anotadas.

[000107] qPCR do pulmão para PRRSV : Para cada par de pulmões, duas amostras dos lóbulos apicais esquerdo e direito, os lóbulos cardíacos direito e esquerdo, os lóbulos diafragmáticos esquerdos e direitos e o lóbulo intermediário, foram mantidos. Para um conjunto de amostras de pulmão, todas as três amostras a partir do lado esquerdo foram combinadas em um recipiente, enquanto que todas as três amostras a partir do lado direito e do pulmão da amostra do lóbulo In-termediário foram combinadas em um outro recipiente. Cada recipiente foi cheio com uma quantidade suficiente de solução de formalina a 10% . Para outro conjunto de amostras de pulmão, todas as três amostras de pulmão a partir do lado esquerdo foram combinadas em um Whirlpak ®, enquanto que todas as três amostras a partir do lado direito e a amostra do lóbulo do pulmão Intermediário foram combinados em outro Whirlpak ®.

[000108] As amostras de tecido de pulmão congeladas foram mantidas a -70 ± 10°C até a análise posterior. Para cada leitão, todas as amostras foram homogeneizadas do pulmão esquerdo e testadas como uma única amostra combinada, e todos os tecidos do pulmão direito e do lóbulo do pulmão intermediário da amostra foram homogeneizados e testados como uma única amostra combinada. Os resultados foram relatados como n.d. (Não detectado), positivo (PRRSV UE detectado, mas não quantificável, GE/mL (genoma equivalente) = < 3,3 log) ou um valor de teste (log GE/mL) para amostras do pulmão esquerdo e direito. Para fins de análise para cada leitão, a média da amostra de pulmão resultados qPCR esquerda e direita foram anotados. Para fins estatísticos, "não foi detectado" foi atribuído um valor de 0 log GE/mL e um valor "positivo" foi atribuído um valor de 3,0 log GE/mL.

RESULTADOS

[000109] Pontuação Total da Lesão Do pulmão Pós-Desafio: Um sumário do grupo mínimo, médiao, intervalo máximo de confiança de 95% , intervalo Q e média para o total de Pontuações de lesão do pulmão mostrou que os grupos de vacina de baixa, média e elevada titulação teve média do pulmão total pontuação da lesão de 0,13% , 0,55% e 0,40% , de uma maneira respectiva, enquanto que o grupo de controle exposto tiveram uma pontuação total média da lesão do pulmão de 33,40% . O total de Pontuações de lesão do pulmão para os três grupos de titulação de vacinas foram significativamente menores que o grupo de controle do desafio (p < 0,0001). Não houve diferenças estatísticas entre os grupos de titulação da vacina (p > 0,1484) para o total de Pontuações de lesão do pulmão. O grupo de controle negativo teve um total média da pontuação de lesão do pulmão de 0,00%.

[000110] Para um dos animais (grupo da vacina de elevada titulação), pneumonia intersticial supurativa histologicamente leve com pleurite fibrinopurulento abundante foi notada. Vias aéreas e alvéolos eram relativamente banais, exceto para os neutrófilos dispersos. O tecido do pulmão foi IHC negativo para M. hyo, PCV2, PRRSV e SIV an- tígenos. As lesões do pulmão eram consistentes com a serosite geralmente associada com agentes bacterianos (Aditivo 12 ; Adesão 2009030254). Várias culturas bacterianas puras de tecido do pulmão foram isoladas e identificadas como Bordetella bronchiseptica e Staphylococcus coagulase negativo. Embora dois tipos de bactérias foram isoladas de tecidos de pulmão, este leitão não foi removido do grupo 3 da pontuação total média da lesão do pulmão.

[000111] Dois dos 10 leitões de controle negativo exibiram lesões do pulmão muito menores (n ° 1767, de 0,55% ; No. 1789, de 0,61%). Estas lesões foram consideradas insignificantes e não indicativo de PRRS. Dois dos 10 leitões de controle negativo exibiram lesões do pulmão muito menores (n ° 1767, de 0,55% ; No. 1789, de 0,61%). Estas lesões foram consideradas insignificantes e não indicativas de PRRS.

[000112] Viremia PRRS pós-Desafio : Os resultados individuais de viremia PRRS pós-desafio (D31-D38) foram tabulados e foi constatado que todos os leitões foram virêmicos pós-desafio nos três grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio. Em todos os três pontos de tempo após o desafio, os três grupos de título de vacina apresentaram significativamente menos do que a viremia grupo de controle exposto (p < 0,0093). Não houve diferenças entre os grupos de vacina para a titulação de viremia pós-desafio exceto em D35, quando o grupo da vacina de elevada titulação exibiram uma viremia médio menor do que o grupo da vacina de titulação média (p = 0,0442). Os leitões de controle negativo foram negativos para viremia em D31, D35 e D38. Área sob a curva (AUC) representa a quantidade ea duração da carga viral e é uma boa ferramenta de avaliação para examinar viremia. Diferenças significativas foram também detectados entre os três grupos de vacina de titulação e o grupo de controle exposto em relação à AUC tanto para D38, D28 (p < 0,0162), e D31 a D38 (p < 0,0001). Não foram detectadas diferenças entre os grupos de titulação de vacinas em relação a AUC (p > 0,3669) nos dois intervalos de tempo.

[000113] A frequência da viremia do grupo de leitões positivos também foi resumida por D31 a D28 e é mostrada na Tabela 2.3. Uma vez que todas as vacinas e os leitões de controle de desafio foram viremia positiva de pós-desafio, as frequências de viremia de leitões positivos foi de 100% para cada grupo em cada ponto de tempo. Dessa maneira, nenhuma das análises foi conduzida na frequência de pós-desafio para a viremia. Tabela 2.3 Sumário do Grupo de Frequência de leitões positivos virê- micos - D31 a D38

* Grupo 1 = Baixa titulação de PRRS 94.881 MLV, Grupo 2 = Média titulação PRRS 94.881 MLV ; Grupo 5 = grupo de controle negativo ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS MLV ; Grupo 4 = grupo de controle do desafio

[000114] Resultados qPCR do Pulmão : Resultados de isolação individuais de vírus do pulmão pós-desafio foram resumidos como foi a frequência de resultados positivos da amostra qPCR do pulmão (p- valores) para as diferenças entre os grupos. Os tecidos do pulmão de leitões em todos os três grupos de titulação da vacina e o grupo de controle foram qPCR de desafio positivo para PRRSV pós-desafio. Não houve diferenças significativas detectadas entre grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio (p = 1,0000). Uma vez que todos os leitões de titulação da vacina foram qPCR positivo para PRRSV, nenhum teste foi realizado entre grupos de titulação da vacina.

[000115] Ainda não foram detectadas as diferenças entre os grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio para a frequência dos tecidos do pulmão positivos qPCR, as diferenças foram evidentes para a carga viral nos tecidos do pulmão. Com efeito, os grupos de vacina de baixo, médio e elevada titulação teve valores da média de qPCR do pulmão de 6,88, 6,80 e 6,81 log 10 da GE/ml, de uma maneira respectiva, enquanto que o grupo de controle tinha um valor de desafio qPCR pulmão média de 8,13 log10 da GE/mL. As diferenças entre os grupos de vacina e de titulação do grupo de controle exposto foram significativas (p < 0,0001). Por outro lado, não foram detectadas diferenças entre os grupos de titulação de vacinas para valores mé- diaos qPCR do pulmão (p > 0,7379).

[000116] Observação Clínica de Pontuações pós-desafio : respiração e comportamento anormal não foram graves pós-desafio, como evidenciado pela média da pontuação máxima clínica de 0 (uma pontuação de 0 representado respiração normal ou o comportamento normal) para todos os cinco grupos. Além disso, não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio tanto para a respiração e comportamento anormais (p > 0,0996).

[000117] A tosse foi observada em todos os três grupos de titulação de vacinas e o controle de desafio, mas foi mais grave no grupo de controle do desafio. Para os três grupos de titulação de vacinas, cada grupo tinha uma pontuação máxima de tosse de 1, o que representou tosse suave ou intermitente e pontuação média maxima de tosse de 0. Por outro lado, o grupo de controle de desafio teve uma pontuação máxima de tosse de 2, o que representou, tosse repetitiva duras ou grave, e uma média de pontuação máxima de uma tosse. Os três grupos de titulação de vacinas teve tosse significativamente menos grave do que o grupo de controle do desafio (p < 0,0082). Tosse não foi observada no grupo de controle negativo.

[000118] Todos os três grupos de titulação de vacinas teve pontuação total máxima de 1 e média pontuações máximas de zero. Por outro lado, o grupo de controle de desafio teve uma pontuação total máxima de 4 e uma pontuação máxima média de 1. Os três grupos de vacina tinha um total de pontuação clínico máximo do que o grupo de controle do desafio (p < 0,0047). Novamente, o grupo de controle negativo teve uma pontuação clínica máxima total de zero e uma pontuação média total máxima clínica de zero.

[000119] A frequência de respiração anormal ou comportamento por pelo menos um dia de D29 a D38 foi baixa para todos os grupos. Na verdade, nenhuma respiração anormal foi observada em grupos de titulação de baixa e média vacina a partir de D29 a D38. O grupo da vacina tinha um elevada titulação de 15 (7%) e os leitões do grupo de controle exposto tiveram 3 de 14 (21%) de leitões com respiração anormal. O comportamento anormal não foi notado em qualquer grupa titulação da vacina, ao etapa que 2 de 14 (14%) de leitões de controle exposto exibiram um comportamento anormal por pelo menos um dia pós-desafio. Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio para a frequência da respiração anormal ou comportamento por pelo menos um dia após o desafio (p > 0,0996). Respiração anormal ou comportamento não foi observado no grupo de controle negativo.

[000120] A frequência de tosse foi muito mais elevada no controle de desafio do que nos três grupos de título de vacina. Na ação, a frequência de tosse durante pelo menos um dia pós-desafio foi de 14% , 13% e 27% para os grupos de vacina de titulação de baixa, média e alta, de uma maneira respectiva. Por outro lado, a frequência de tosse durante pelo menos um dia pós-desafio para o grupo de controle ex- posto foi de 71% . Os três grupos de titulação de vacinas tinham signi-ficativamente menor frequência de tosse que o grupo de controle do desafio (p < 0,0268).

[000121] A frequência de qualquer sinal clínico de pós-desafio, como representado por meio de uma pontuação clínica total > 0, foi mais elevada no grupo de controle exposto do que nos três grupos de título de vacina. Semelhante à frequência da tosse, a frequência de qualquer sinal clínico, pelo menos, um desafio pós dias foi de 14% , 13% e 33% para os grupos de vacina de titulação baixa, média e elevada, de uma maneira respectiva, enquanto que 79% dos leitões em o grupo de controle teve um desafio menos um sinal clínico de pós-desafio. Os três grupos de vacina tiveram significativamente menor frequência de qualquer sinal clínico pós-desafio que o grupo de controle do desafio (p < 0,0253). Nenhum dos sinais clínicos foram observados no grupo de controle negativo durante esse mesmo período de tempo.

[000122] As pontuações médias para respiração anormal ou comportamento de D29 a D38 foram baixas para todos os grupos. De fato, as pontuações médias de respiração para os grupos de titulação de baixa e média vacina foram 0,00 (normal), a vacina de elevada titulação teve uma pontuação média de 0,01 respiração e o controle de desafio teve uma pontuação média de 0,03 respiração. A pontuação média para o comportamento foi de 0,00 para os três grupos de titulação da vacina, enquanto o controle de desafio teve uma pontuação média de 0,01 comportamento. Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio para a respiração e comportamento das Pontuações médias (p > 0,0996). Respiração e comportamento das Pontuações médias para o grupo de controle negativo foram 0,00.

[000123] O grupo de controle do desafio teve uma pontuação tosse média maior do que os três grupos de titulação da vacina. Na ação, as pontuações médias para a tosse foram de 0,01, 0,01 e 0,04 para os grupos de vacina de baixa, média e elevada titulação, de uma maneira respectiva. Por outro lado, a pontuação média tosse para o grupo de controle foi de 0,28 desafio. Os três grupos de titulação de vacinas tiveram Pontuações tosse médios significativamente mais baixos do que o grupo de controle do desafio (p < 0,0077).

[000124] A média da pontuação total foi maior no grupo de controle exposto do que nos três grupos de título de vacina. Similar às Pontuações médias de tosse, o total após o desafio de Pontuações médias foram de 0,01, 0,01 e 0,04 para a baixa, média e grupos de vacina elevada titulação, de uma maneira respectiva, enquanto a média da pontuação total para o grupo de controle foi de 0,32 desafio. Os três grupos de vacinas tinham significativamente Pontuações médias totais mais baixas do que o grupo de controle do desafio (p < 0,0025).

[000125] As temperaturas retais pós-desafio : O grupo de média máxima da temperatura retal para os grupos de vacina baixo, médio e elevado de titulação entre D29 a D38 foram 40,20°C (D33), 40,33°C (D35) e 40,20 ° C (D37), de uma maneira respectiva. O grupo de média máxima da temperatura retal para o grupo de controle do desafio e o grupo de controle negativo entre D29 e D38 foram 40,51°C (D33) e 39,95°C (D33), de uma maneira respectiva.

[000126] O grupo da vacina de baixa titulação teve temperatura retal significativamente mais baixa do que o grupo de controle em desafio D29 (39,47 vs 39,90 ° C), D31 (39,85 vs 40,20 ° C), D35 (39,80 vs 40,22 ° C) e D38 (39,86 vs 40,32 ° C) (p < 0,0317), enquanto que a vacina teve um baixa titulação de temperatura retal significativamente maior do que o grupo de controle exposto em D30 (40,08 vs 39,58 ° C, p = 0,0003). Não foram detectadas diferenças significativas entre o grupo de baixa vacina título e o grupo de controle do desafio em D32D34 e D36-D37 (p > 0,0545).

[000127] O grupo da vacina de titulação média teve temperatura retal significativamente mais baixa do que o grupo de controle do desafio em D31 (39,62 vs 40,20 ° C), D33 (40,15 vs 40,51 ° C) e D38 (39,58 vs 40,32 ° C) (p < 0,0227). Não foram detectadas diferenças significativas entre o grupo da vacina de titulação média e o grupo de controle do desafio em D29, D30, D32 e D34-D37 (p > 0,0580).

[000128] O grupo de vacina de elevada titulação tinha uma temperatura significativamente mais baixa do que a do grupo retal de controle exposto no D33 (40,12 vs 40,51 ° C), D35 (39,79 vs 40,22 ° C) e D38 (39,55 vs 40,32 ° C) (p < 0,0147), enquanto que o grupo da vacina tinha um elevada titulação de temperatura retal significativamente maior do que o grupo de controle exposto em D32 (40,31 vs 39,90 ° C, p = 0,0063). Não foram detectadas diferenças significativas entre o grupo da vacina de elevada titulação do grupo de controle de desafio em D29, D31, D34 e D36-37 (p > 0,0708).

[000129] Houve menos frequência da pirexia nos três grupos de título de vacina pós-desafio em relação com o grupo de controle de desafio. A frequência de febre foi baixa em geral e semelhante entre os grupos de titulação da vacina.

[000130] Média de ganho de peso diário (GPMD) : O meio mínimo quadrado GPMD de D0 a D28 para os grupos de vacina de titulação baixa, média e alta foi de 0,4, 0,3 e 0,4 kg/dia, de uma maneira respectiva. O meio mínimo quadrado GPMD durante este mesmo período de tempo para o grupo de controle do desafio foi de 0,3 kg/dia. O grupo da vacina de baixa titulação teve um número significativamente maior de meios mínimos quadrados GPMD que o grupo de controle do desafio a partir de D0 a D28 (p = 0,0292), enquanto que não foram detectadas outras diferenças significativas entre os grupos de titulação de vacinas e o grupo de controle de desafio (p > 0,1262), ou entre grupos de titulação da vacina (p > 0,1293), por meios mínimos quadrados GPMD. Durante este mesmo período de tempo, o grupo de controle negativo teve o meio GPMD de 0,5 kg/dia.

[000131] O meio mínimo quadrado GPMD de D28 a D38 para os grupos de vacina de titulação baixa, média e alta foram de 0,5, 0,5 e 0,4 kg/dia, de uma maneira respectiva. O meio mínimo quadrado GPMD durante este mesmo período de tempo para o grupo de controle do desafio foi de 0,3 kg/dia. Os três grupos de titulação da vacina significativamente fora ganharan o grupo de controle do desafio pós- desafio (p < 0,0027). Durante este mesmo período de tempo, o grupo de controle negativo teve um Meio GMD de 0,6 kg/dia.

[000132] As avaliações clínicas pós-vacinais : No grupo da vacina de baixa titulação , um leitão (1735) foi observado tão fino a partir de D0 a D10. Além disso, um leitão de início em D6 foi observado tão fino por 16 dias, apresentou tosse por 2 dias e depressão durante 9 dias, e foi sacrificado em D21 por razões de bem-estar do animal, devido a problemas de saúde. O Leitão 1727 teve uma pontuação de lesão do pulmão total de 10,8% . Uma vez que este valor foi determinado pré- desafio, não foi incluído na análise pós-desafio total da lesão do pulmão. Além disso, áreas de consolidação vermelho/roxo nas áreas cra- nioventral dos pulmões foram observadas, o fígado estava pálido e rins teve várias áreas vermelhas/roxas na pelve renal. O patologista observou infiltração gordurosa em lóbulos centrais no fígado, comu- mente visto em casos de balanço energético negativo e consequente lipólise. Nenhuma outra lesão nas secções de rim, fígado e pulmão foram observadas. O tecido do pulmão foi positivo para PRRS UE por meio de PCR. Nenhum crescimento foi detectado por meio da cultura bacteriana de rotina.

[000133] No grupo da vacina de titulação média, um leitão foi excluído do estudo sobre D0 antes do tratamento devido a problemas de saúde e foi substituído por outro leitão. Dois leitões exibiram tosse por um e três dias, de uma maneira respectiva, a partir da D12. Quatro leitões foram observados quanto finos em D2, D3 ou ambos D2 e D3.

[000134] No grupo da vacina de elevada titulação, um leitão (1728) apresentou claudicação ou manqueira e inchaço em uma perna de D7 a D26. A partir de 18 dias após a vacinação, um leitão foi observado tão fino por 6 dias, e exibiu tosse por um dia e pêlos arrepiados por 4 dias. Outro leitão foi observado tão fino em D2. Dois leitões exibiram tosse por dois dias e um dia, de uma maneira respectiva, com início em D9. Um leitão exibiu diarréia por um dia (D14).

[000135] No grupo de controle exposto, seis leitões exibiram tosse periódica para um cumulativo de um a seis dias, a começar com um primeiro dos leitões no D7 e terminando com três leitões em D21. Dois leitões foram observados tão finos para dois e 11 dias, de uma maneira respectiva, a partir em D1 para um destes leitões. O segundo destes dois leitões também exibiu depressão e pêlos arrepiados por 4 dias, fraco nas pernas por um dia e foi encontrado morto na D15. Na necropsia para este leitão não houve lesões do pulmão (pontuação de lesão do pulmão de 0%), observou, sem alimentação no estômago e nenhuma gordura abdominal, e fome diagnosticada como a causa da morte. Uma vez que esta pontuação de lesão do pulmão foi determinada pré-desafio, não foi incluído na análise de lesão do pulmão pós- desafio.

[000136] Os resultados do teste de grupos (valores de p) foram resumidos para qualquer avaliação clínica anormal por pelo menos um dia em D1 a D26. Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos de titulação de vacinas e grupo de controle de desafio (p > 0,0502), nem entre os grupos de titulação da vacina (p > 0,3898). Nenhum dos leitões do grupo de controle negativo apresentou uma avaliação clínica anormal de D-1 a D26.

[000137] Sorologia PRRS : Os resultados da sorologia lde eitão PRRS ELISA individuais foram resumidos. Os leitões do grupo de controle negativo permaneceram PRRS soronegativa ao longo do estudo. A seroconversão podia ser observada nos três grupos de título de vacina aos 14 dias pós-vacinação, enquanto que o grupo de controle de desafio permaneceu PRRS seronegativo até de pós-desafio. Dez dias após o desafio (D38) todos os leitões nos grupos de vacina de baixa e elevada titulação e o grupo de controle do desafio foram PRRS soro- positivos, enquanto 14 dos 15 leitões nos grupos de vacina de titulação médio foram PRRS soropositivos.

[000138] Os resultados do teste de ELISA PRRS de sorologia positiva (valores de p) foram determinados por meio das diferenças entre os grupos. Os três grupos de titulação de vacinas tinham significativamente maiores frequências de PRRS ELISA dos leitões positivos do que o grupo de controle do desafio em D14, D21 e D28 (p < 0,0001). Não foram detectadas diferenças significativas entre os três grupos de titulação de vacinas e controle de desafio em D38 (p = 1,0000 ou nenhum teste realizado), nem entre os três grupos de titulação de vacinas em qualquer ponto do tempo (p = 1,0000 ou nenhum teste realizado).

[000139] Viremia PRRS pós-vacinal : Os resultados de viremia Individuais PRRS pós-vacinação foram determinados. Para efeitos estatísticos, um resultado "não detectado" foi atribuído um valor de 0 log GE/mL e um valor "positivo" foi atribuído um valor de 3,0 log GE/mL. Todos os grupos foram PRRS viremia negativa em D0. O grupo de viremia de dados de título pós-vacinação (qPCR) - D7 a D28 (log GE/mL) foi avaliado. Os leitões dos três grupos de título de vacina atingiram um pico de viremia significativo no D7, após o que os níveis de titulação para os três grupos declinou lentamente antes do desafio (SD28). Por outro lado, o grupo de controle do desafio e o grupo de controle negativo permaneceu negativo para a viremia durante a fase de pré-desafio do estudo. A partir dos resultados do teste de grupos (valores de p) para D7, D14, D21 e D28 resultados qPCR foi visto que todos os três grupos de titulação de vacinas apresentaram valores de média qPCR significativamente mais elevado do que o grupo de controle do desafio para D7-D28 (p < 0,0159). O grupo de titulação de vacina médio teve um valor médio qPCR significativamente maior do que o grupo da vacina de baixa titulação (p = 0,0193), caso contrário, não foram detectadas diferenças para valores médiaos qPCR entre grupos de vacina pré-desafio (p > 0,0594).

[000140] Quatro semanas após a vacinação, a frequência de viremia foi baixa nos três grupos de titulação da vacina.

[000141] As seguintes conclusões podem ser feitas com base nestes resultados do estudo:

[000142] • A ausência de qualquer quebra de biossegurança durante o estudo e a confirmação da susceptibilidade do leitão para PRRS confirmou a validação do estudo e sua adequação para a interpretação

[000143] • A doença clínica PRRS substancial foi evidente no grupo de controle, desafio, validando este modelo de desafio como uma ferramenta de laboratório adequada para avaliar a eficácia da vacina PRRS e, mais especificamente, o MID de PRRS 94.881 MLV

[000144] • Todos os três níveis de doses de PRRS 94.881 MLV fo ram associados com uma redução significativa nas lesões do pulmão, bem como uma redução significativa da viremia pós-desafio, a carga viral em tecidos do pulmão, tosse, pontuação total de observação clínica, pirexia e GDPA.

[000145] • A MID de PRRS 94.881 MLV conforme determinada neste estudo está associada com o baixo nível de titulação da vacina de 1 x 102,77 TCID50/mL, com base em uma redução relevante em lesões do pulmão graves para os três níveis de titulação, em comparação com controles do desafio após receberem um desafio de PRRS europeu derivado heterólogo virulento.

Representação adicional de resultados

[000146] As observações clínicas foram tomadas todos os dias. RT- PCR Quantitativa foi realizada utilizando os iniciadores específicos de PRRSV europeias para amostras de sangue forma oral, fecal, nasal e haste, bem como a lavagens do pulmão.

[000147] A partir desses estudos os dados mostraram que os leitões mostraram a saúde normal, exceto por alguns suínos que eram coxos. Post-mortem não houve anormalidades na necropsia, exceto que o animal 1-2 mostrou sinais de notas linfáticos inguinais ligeiramente aumentados. Mais importante, verificou-se que não havia lesões do pulmão observadas com o grupo vacinado.

[000148] A Figura 8 mostra a percentagem de animais no grupo virê- mico sentinela em comparação com o grupo vacinado com uma composição que contém a cepa atenuada do vírus PRRS depositados na ECACC No. de Acesso 11012502. Esta Figura mostra a propagação da cepa de vacina a partir de animais vacinados para sentinelas. No pico da viremia PRRS (SD21), como detectado por RT-PCR quantitativa, a carga viral foi 78,47% menor em suínos infectados sentinela (carga viral média de 3,347 GE/ml) do que em animais vacinados (carga viral média de 4,014 GE/ml). Na sala onde os PRRS de leitões ingênuos foram misturados com seus filhos vacinados, apenas 3 de 8 leitões foram testados de forma positivao para PRRSV no sangue por RT-PCR confirmando assim PRRS limitados e ineficazes na exposição da vacina MLV para animais adultos ingênuos. A vacina de vírus de 94.881 MLV foi excretada essencialmente nas fezes deste estudo. De fato, nas fezes, o vírus pode ser detectado a partir de um dia a 21 dias após a vacinação. Aos cinco dias após a vacinação, quase 30% dos animais vacinados excretaram o vírus nas fezes. O vírus PRRS não foi detectado em secreções nasais e, em apenas alguns animais em secreções via oral (2 dos 56 animais amostrados a 5 dias após a vacinação).

Exemplo 3 : Materiais e Métodos exemplares para uso em testes de eficácia da vacina usando Porcilis ® PRRS como um exemplo.

[000149] Um número selecionado, por exemplo, catorze leitões gestantes saudáveis a partir de um rebanho PRRSV negativo confirmado (teste virológico e sorológico) foram utilizados neste estudo. As leitoas enfrentaram o primeiro ou segundo parto e foram confirmadas de estarem grávidas no momento do desafio de vacinação/infecção no dia 94 de gestação. As leitoas foram divididos em três grupos de tratamento. O primeiro grupo foi tratado com uma dose comercial de PRRS ™ de 2 ml, contendo, pelo menos, 104.0TCID50 via intramuscular no dia 94 de gestação Porcilis. O grupo de controle exposto (grupo 2) receberam uma dose de 104,72 TCID50 em 2 ml de meio de cultura de células do campo Europeia do isolado patogênico (passagem 4) por via intranasal. O grupo 3 foi vacinado com uma dose de 2 ml contendo 107.6TCID50 im PRRS MLV contendo cepa PRRS atenuada depositada no ECACC Número de Acesso 11012502 em 25 de janeiro de 2011, sete dias antes da inseminação e foi desafiado com o campo isolado europeu (passagem 4) (104,72 TCID50 em 2 ml de meio de cultura de células in) no dia 94 de gestação.

[000150] Os animais do grupo 1 foram monitorados até o dia 5 pós- parto. Os animais do grupo 2 e 3 foram monitorados até o dia 28 pós parto.

[000151] Fase Animal : Todos os leitões estavam acostumadas com as facilidades animais uma semana antes da vacinação. As leitoaslei- toas e os leitões foram observados durante o seu estado de saúde geral pelo investigador em uma base diária. Cada animal que morreu ou foi sacrificado foi submetido a exame post-mortem e análise laboratorial subsequente.

[000152] A gravidez foi confirmada com exame ultra-sonográfico. O soro de leitões foi obtido em estudo dias 0, 7, 14 e no parto por meio de investigações PCR e ELISA. Qualquer material que estava associado com aborto foi submetido a exames laboratoriais.

[000153] A patologia de rotina bruta foi realizada em todos os leitões que nasceram mortos. As amostras de tecido do pulmão de todos os lóbulos do pulmão foram coletadas a partir de leitões deadborn e de cadáveres dissecados. As amostras para o teste de PCR foram armazenadas a -70°C. 2 ml de sangue precolostral de cada leitão foi coletado no dia do nascimento. O soro foi preparado e as alíquotas foram armazenadas a -70°C. O soro foi utilizado para testar a viremia para avaliar a infecção transplacentária. Todos os leitões do grupo 1 que sobreviveram até ao dia 5, foram sacrificados aos 5 dias de idade.

[000154] Parâmetros de desempenho clínico e Reprodutivo : Os seguintes critérios são critérios exemplares que podem ser investigados (ordem de prioridade) : número de leitões nascidos vivos por ninhada, número de leitões natimortos por ninhada, número de fetos cadáveres dissecados por ninhada e número de leitões sobreviventes até ao dia 5 ou 28 de idade, de uma maneira respectiva. O número de leitões nascidos viremia foi determinada usando soro pré-colostral. A frequência de PCR positivo de sangue e as amostras de tecidos a partir de leitões e/ou leitões foi investigada para avaliar a epidemiologia e o curso da infecção.

[000155] As amostras de campo : As amostras de campo investigadas neste estudo foram retiradas de rotina de diagnóstico de PRRSV e consistiram emsangue, soro e materiais orgânicos diversos, principalmente os pulmões e gânglios linfáticos, a partir de diferentes países europeus. As amostras foram armazenadas a -20°C durante um máximo de 3 dias antes da preparação de RNA e do material residual foi subsequentemente transferido para -70°C durante o armazenamento a longo prazo. Produtos de RNA e RT-PCR foram armazenados a -20°C.

[000156] A cultura celular : células MA104 CL2621 (clone) foram cul- tivadas em meio MEM (Dulbecco, Alemanha) suplementado com FCS a 10% e antibióticos.

[000157] Os macrófagos alveolares suínos foram colhidos utilizando um método descrito por Wensvoort et al. (Wensvoort, G. et al Vet. Quat 1991, 13 : 121 a 130) e modificado como se segue : cada lóbulo do pulmão foi infundido com 50 a 100 ml de PBS e, subsequentemente, massageado durante 3 a 5 min. Em seguida, o fluido foi resgatado a partir do lóbulo e passado através de um filtro de olhar. Este procedimento foi repetido até que o fluido de lavagem estava claro. O fluido de lavagem reunido foi centrifugado a 500 g durante 15 min à temperatura ambiente. O sedimento foi lavado em PBS e aliquotas de 1x107 células em 50% RPMI 1640 (Biochrom), 40% de FCS e 10% de DMSO foram congeladas a -196 ° C. Para a utilização posterior dos PAMs foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS e antibióticos.

[000158] Preparação de material de Órgãos para isolamento do vírus em cultura de células : Cerca de 0,5 cm3 de material tecido foi transferido para um tubo contendo um homogeneizador de aço ballet em 1,8 ml de PBS estéril. Os tubos foram agitados durante 10 minutos até que o material do órgão foi homogeneizado. Os detritos de célula foram sedimentados por centrifugação durante 2 min a 450 g e à temperatura ambiente. O sobrenadante foi passado através de um filtro de poro estéril de 0,45 um e armazenadas a -70 ° C. As alíquotas de 30 ul foram utilizadas para inocular uma cultura em monocamada de células semi- confluentes usando as placas de microtitulação de 24 cavidades.

[000159] Isolamento de RNA : RNA a partir de material orgânico foi extraído com o Kit Mini RNeasy e a partir de soro, plasma, o sobrena- dante da cultura celular e uma solução de vacina com o mini kit RNA Viral QTAamp (ambos Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante, utilizando aproximadamente 100 mg material orgânico e 140 ul de material fluido, de uma maneira respectiva, para cada preparação. O RNA foi finalmente eluída em 65 ul de tampão, tal como recomendado pelo fabricante.

[000160] Placa de Purificação de Vírus : as monocamadas confluentes de células MA104 de cultura de células em pratos de 10 cm, 48 horas antes da semeadas foram infectadas com o vírus respectivo dez vezes em diluições de 10-1 a 10-4. As células foram incubadas durante 1 hora com as diluições de vírus que foram então removidas, e as células foram cobertas com 30 ml de MA104 meio contendo 5% de metilcelulose (Sigma). As placas foram colhidas após 5 a 7 dias e foram transferidas para MA104 monocamadas em placas de 24 cavidades. O vírus a partir destas placas foi colhido a cerca de 50% de CPE, e foi submetido a análise posterior.

[000161] Ensaio de Imunofluorescência : As células foram fixadas à temperatura de -20°C durante 15 min, utilizando acetona gelada : metanol (1 : 1) e secos ao ar em seguida. Após rehidratação em PBS, as células foram incubadas com o anticorpo monoclonal específico de PRRSV SDOW17 (Rural Technologies Inc., EUA), diluída a 1 : 1000 em PBS durante 1 hora. Após 3 lavagens com PBS, as células foram incubadas com anticorpos de cabra anti-ratinho secundário conjugado com FITC anticorpo (Dianova, Hamburgo, Alemanha) (1 : 150 em PBS) durante uma hora. Após três lavagens finais com PBS, as células foram cobertas com glicerina : uma solução de PBS (1 : 1) e submetido a microscopia de imunofluorescência.

[000162] Diagnóstico nRT-PCR : um diagnóstico de RT-nPCR pode ser realizado para verificar as amostras quanto à presença de vírus PRRSV UE.

[000163] Um exemplo de RT-nPCR de diagnóstico pode ser realizado com o Kit de um tubo Titan (Roche Molecular Biochemicals) como se segue : [5 ul de preparação de RNA total a 1 * tampão RT-PCR, 0,4 mM de dNTPs, 20 pmol de iniciadores PLS e PLR, 5 mM de ditiotreitol, MgCl2 a 1 mM, 2,5-5 U de RNasin (Promega Ltd), 1-2,5 L da mistura enzimática, ajustado para um volume final de 25 ul com água destilada tratada com DEPC]. Condições cíclicas de rotina podem ser utilizados : 45 ° C durante 1 hora, 94 ° C. durante 2 min, e 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 45 seg e 68 ° C durante 45 segundos, o etapa final de alongamento a 68 ° C durante 5 min. A reação de inclusão de RCP foi realizada com a Taq Qiagen (Qiagen AG) como se segue : [ 1 ul do produto de RT-PCR, 1 * tampão de PCR, 10 pi da solução Q, MgCl2 a 3,5 mM, dNTPs a 0,3 mM, 20 pmol de cada UE 7-ns e UE-7-n-como iniciadores, 2,5 U de Taq polimerase, ajustado para um volume final de 50 ul com água destilada ]. As condições de amplificação foram as seguintes : 7 ciclos com 94°C durante 1 min, 58°C durante 1 min e 72°C durante 1 min, seguido de 30 ciclos com 94°C durante 1 min e 70°C. durante 1,5 min (sem etapa de recozimento), etapa final de alongamento a 70 ° C durante 5 min.

[000164] Sequenciação do Nucleotídeo : A sequenciação de nucleo- tídeos pode ser realizada sobre os produtos de PCR aninhados que tinham sido gerados com iniciadores que continham uma marca M13, quer de maneira direta a partir da reação de PCR, ou a partir de produtos de PCR que foram excisados a partir de géis de agarose e purificado com o JETsorb kit de extracção em gel (Genomed). A sequenci- ação foi realizada utilizando o sequenciador automático de DNA LICOR Analisador GENE READIR 4200 ® (LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., EUA). As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos podem ser analisadas com AlignIR ®, vs1.1 (LI-COR Inc., Lincoln, Nebr., EUA) e o DNASIS.RTM. 2.6 pacote de software (Hitachi Software Genetic Systems Inc., San Francisco, EUA). Exemplo 4 : Determinação da sequência do genoma de comprimento total de PRRSV 94881

[000165] O presente exemplo mostra a determinação das sequências de nucleotídeos de comprimento toal do genoma da cepa 94881 atenuado e sua cepa parental 94881, de passagem 5. Estas sequências não mostraram qualquer posição de nucleotídeo clara o que indica a presença de um conteúdo viral homogêneo. A comparação do Vírus de Semente Principal 94881 com a cepa europeia de Referência do Vírus do Vírus de Lelystad (LV) revelou as homologias nucleotídi- cas que vão de 85,40 a 95,09 por cento nos oito diferentes genes virais e as identidades de aminoácidos de 86,39 a 97,27 por cento entre ambas as cepas de vírus. Duas deleções na ORF 1a 94881 MSV puderam ser identificadas em comparação com LV. A comparação entre o Vírus da Semente Principal 94881 e sua cepa parental, de passagem 5, mostrou 26 trocas de nucleotídeos entre ambos resultando em um número total de 14 trocas de aminoácidos.

[000166] Para a determinação da sequência de comprimento completo do genoma do Vírus da Semente Principal 94881 e um número total de uma transcrição reversa, 17 PCRs externas e 58 PCR internas foi realizada, resultando em 40 produtos de PCR que foram utilizados para a sequenciação. Em caso de 94881, de passagem 5, uma transcriptase reversa, de 17 PCRs externas e 67 PCRs internas foram realizados, resultando em 40 produtos de PCR, também, utilizado para a sequenciação.

[000167] As análises de alinhamento de sobreposição de sequência resultou em uma sequência de comprimento total de 14.843 nucleotí- deos por ambos os vírus isolados que compreende as tabelas de leitura aberta completa (ORF) 1a a 7, cada um. Além disso, 177 nucleotí- deos da região não traduzida 5 '(5'NTR) e 43 nucleotídeos da região 3' não traduzida (3'NTR) pode ser determinada, cada uma. Em comparação com o vírus de referência isolado europeu de PRRSV Lelystad (LV) (GenBank Número de acesso M96262) 44 nucleotídeos da 5'NTR e 83 nucleotídeos da 3'NTR não pode ser determinado como essas regiões foram utilizados iniciadores para as regiões de recozimento.

[000168] As reações de sequenciamento resultaram para ambas as cepas de vírus em uma sequência de nucleotídeos clara sem oscilações ou qualquer outra indicação de uma sequência mista. Após a tradução em aminoácidos das sequências de aminoácidos claras, sem qualquer aminoácido questionável estavam disponíveis para comparação de sequências de 94.881 MSV com o LV e com a pressão da cepa parental 94,881 de passagem 5. Os alinhamentos e as comparações de sequências de nucleotídeos entre 94.881 MSV e vírus Lelystad foram realizados e mostraram que não houve diferenças significativas no nível de nucleotídeos e aminoácidos. Os alinhamentos também foram realizados entre 94.881 MSV e sua cepa parental, a passagem 5.

[000169] A comparação de sequências com LV resultou em homolo- gia de nucleotídeos de 85,40 a 95,09 por cento nos oito diferentes genes virais e identidades de aminoácidos de 86,39 a 97,27 por cento entre as duas cepas de vírus. Duas deleções na ORF 1a do MSV 94881 podem ser identificadas em relação ao VE. Uma deleção de 138 nucleo- tídeos está localizada na posição 2154-2292 do VE e os resultados em falta em 46 aminoácidos. Na posição 2686-2688 um novo tripleto é eliminado, resultando no aminoácido fenilalanina em falta. Um arranjo de todas as homologias e identidades de nucleotídeos de aminoácidos entre LV e ambas as cepas 94881 é mostrada na Tabela 4.1. Tabela 4.1 : Arranjo de comparações de sequências de nucleotídeos e aminoácidos do Vírus da Semente Principal 94881 para o Vírus de Referência Europeia do Vírus Lelystad

NTR : região não traduzida * = Apenas 177 nucleotídeos foram comparados entre Vírus Lelystad e 94.881 MSV. Os restantes 44 nucleotídeos, localizados a montante, não foram determinados.

[000170] = ** O isolado 94881 MSV mostra duas deleções na ORF 1a, um com 138 nucleotídeos e um com três nucleotídeos, de uma maneira respectiva. As sequências de nucleotídeos e aminoácidos completos do vírus de Referência LV foram utilizados para os cálculos de homologia e identidade, as deleções são avaliadas a partir dos desvios. O comprimento do gene viral correspondente do LV é de 7191nucleotídeos e 2396 aminoácidos da poliproteína correspondente, os cálculos de homologia e identidade genética de aminoácidos referem-se aos números dos 7191 nucleotídeos e 2396 aminoácidos, de uma maneira respectiva.

[000171] = *** Apenas 44 nucleotídeos foram comparados entre o Vírus Lelystad e 94.881 MSV. Os restantes 83 nucleotídeos, localizados a jusante, não foram determinados

[000172] A comparação de sequências das sequências de nucleotí- deos de comprimento completo de Vírus da Semente Principal 94881 e 94881 cepa progenitora, de passagem 5, revelou um número total de 26 trocas de nucleotídeos entre ambos. As trocas de nucleotídeos foram distribuídas como segue : 15 na ORF 1a, 1b 4 na ORF, 2 na ORF 2, nenhum no ORF 3, 1 na ORF 4, 3 na ORF 5, 1 em 6 e a ORF nenhum no ORF 7. Estas trocas nucleotídicas resultaram em um número total de 14 trocas de aminoácidos que foram distribuídos como segue : 8 na poliproteína 1a, 1 na poliproteína 1b, uma glicoproteína no 2, nenhum na glicoproteína 3, uma glicoproteína no 4, 2 na glicoproteína 5 e 1 na proteína de matriz. Ambas as amostras apresentaram as mesmas exclusões em relação ao Vírus Lelystad em ORF 1a. Um arranjo de todas as trocas de nucleotídeos e as trocas resultantes de aminoá- cidos, incluindo as posições dos genes e das proteínas dos frascos correspondentes são mostradas em detalhe na tabela 4.2.

Exemplo 5 - Cultura de vírus depositados e MSV

[000173] Como observado acima, 94881 PARENT (passagem baixa) é depositada na coleção de culturas de células europeias (ECACC), sob os números de acesso ECACC 11012501, Vírus da Semente Principal 94881 (MSV) é depositado na coleção de culturas de células europeias (ECACC), sob Números de acesso ECACC 11012502. As condições de crescimento e cultura para o vírus parental e MSV são fornecidas no presente exemplo.

[000174] Parente 94881 : Este é um vírus de um genótipo, que é um tipo de PRRSV, como tal, é um genótipo europeu de PRRSV. O vírus tem uma série de suíno. O vírus progenitor depositado em 11012501 foi depositado com um título de 5,81 log10 TCID50/mL. As células hospedeiras para a propagação de vírus são células MA 104. Estas células são cultivadas em um Meio Essencial Mínimo (MEM), com 3,7 g/L de bicarbonato de sódio contendo 6% de soro fetal bovino irradiado a 37 ± 1 ° C. As células foram semeadas em frascos T (75 cm2), com uma densidade de revestimento de 2 x 104-2 x 105 células/cm2 e cultivadas durante 3 a 7 dias, até 100% confluentes antes da passagem. Para o crescimento do vírus, o vírus é adicionado às células a um MOI de 0,001 a 0,01 em frascos-T. As células são infectadas a uma confluência de cerca de 80 a 100% , tipicamente 1 a 3 dias após a plantação de células. As células infectadas são cultivadas a 37 ° C ± 1 ° C, durante 3 a 10 dias após a infecção e, em seguida, o vírus é colhido. A colheita é realizada quando a monocamada de células exibem cerca de 80-100% de efeito citopático (CPE) em 3-10 dias após a infecção. O sobrenadante das culturas de tecido infectadas MA104 (gasto media + de PRRSV a partir de uma cultura com 80 a 100% CPE) é colhida e que contém o vírus foi propagado. Este sobrenadante pode ser armazenado a -70°C/-80°C durante vários meses, até à utilização. O vírus é avaliado para TCID50 com Spearman e cálculo Kaerber para determinar log10 TCID50/mL de amostra.

[000175] Vacinas (alta passagem) do Vírus da Semente Principal 94.881 (MSV) : Este é um vírus de genótipo que é PRRSV tipo 1, como tal, é um PRRSV genótipo europeu. O vírus tem uma série de suíno. O MSV depositado em 11012502 foram depositados com um título de 6,43 log10 TCID50/mL. As células hospedeiras utilizadas para a propagação do MSV são células MA 104. Estas células são cultivadas em um Meio Essencial Mínimo (MEM), com 1,4 g/L de bicarbonato de sódio e contendo 10% de soro fetal bovino irradiado a 36 ± 2 ° C. As células foram semeadas em frascos T-(75 a 150 cm2) ou frascos rolantes de 850 cm2, com uma densidade de plantação de 1 x 104 a 1 x 105 células/cm2 e cultivadas durante 3 a 7 dias, até 100% confluentes antes da passagem. Para o crescimento do vírus, o vírus é adicionado às células a um MOI de 0,001 a 0,01 em frascos-T e garrafas de rolo. As células são infectadas a uma confluência de cerca de 80 a 100% , tipicamente 1 a 3 dias após a plantação de células. As células infectadas são cultivadas a 36 ± 2°C, durante 3 a 14 dias após a infecção e, em seguida, o vírus é colhido. A colheita é realizada quando a mono- camada de células exibem cerca de 80 a 100% de efeito citopático (CPE) em 3-14 dias após a infecção. O sobrenadante das culturas de tecido infectadas MA104 (media + PRRS do gasto de uma cultura com 80 a 100% CPE) é colhida e que contém o vírus foi propagado. Este sobrenadante pode ser armazenado a 2 a 8°C durante 5-10 dias, a - 70°C durante vários meses, até à utilização. O MSV é avaliado para TCID50 com cálculo Reed e Muench para determinar log10 TCID50/mL de amostra. Tabela 4.2 : Arranjo de comparação de sequências de nucleotídeos e aminoácidos do vírus semente principal 94.881 para cepa Parental 94.881

Exemplo 6 : PRRS 94.881 MLV do estudo MID da leitoa Sumário

[000176] O objetivo deste estudo de desafio da vacinação foi avaliar a dose mínima imunizante (MID) e Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína da Vacina Europeia derivada do isolado 94.881, vírus vivo Modificado, Código 19T1.U_ (PRRS 94.881 MLV) em leitões Dois níveis de titulação diferentes foram administrados a leitões soronegati- vas PRRSV aproximadamente 28 dias de pré-reprodução (Dia 0, D0), as leitoas foram desafiadas com uma heteróloga de isolado europeu de PRRSV em aproximadamente 90 dias de gestação (D118) e as lei- toas foram avaliadas o número total de leitões ou porcentagens de leitões nascidos vivos e leitões desmamados aos 20 dias de idade nascidos vivos para determinar o MID. No momento do desafio no dia 118 (D118), o grupo de controle de desafio consistiu em oito leitões grávidas (grupo 1, tratados com placebo), o grupo de baixa titulação consistiu em oito leitões grávidas (Grupo 2, 1 x 102,43 TCID50/dose), os grupo de elevada titulação consistiram em oito leitões grávidas (Grupo 3, 1 x 103,90 TCID50/dose), e o grupo de controle negativo consistiu em 5 leitoas grávidas (Grupo 4, Placebo, não desafiado).

[000177] Ambos os grupos de elevada titulação e de baixa titulação foram associados com maiores porcentagens de leitões vivos por litro no parto (P < 0,0455) e porcentagens mais elevadas e número de leitões vivos por litro ao desmame (P < 0,0203) em comparação com o grupo de controle de desafio.

[000178] No que diz respeito aos parâmetros de eficácia de apoio, o grupo de alta dose foi associado com uma maior percentagem e número de leitões saudáveis por leitão no parto (P < 0,0211), uma menor percentagem e número de fraco e mumificado fetos (P < 0,0090) , um menor percentual de leitões positivos qPCR e menor carga viral em leitões pós-desafio em D125, DOF DOF 0 e 13 (P < 0,0155), uma me- nor percentagem de leitões por leitão qPCR positiva e inferior leitão carga viral no DOF 0 (P < 0,0030), uma menor percentagem de leitões por leitão com doença clínica (P < 0,0001), e maiores pesos corporais de leitões em DOF 20 e GMD (P < 0,0013), em comparação com o grupo de controle do desafio.

[000179] O grupo de baixa dose foi associado com uma maior per-centagem de leitões saudáveis por leitão no parto (P = 0,0138), uma menor percentagem e número de mumificado fetos (P < 0,0190), uma menor percentagem de qPCR de leitões positivos e menor viral carga em leitões pós-desafio em D125, D132, DOF DOF 0 e 13 (P < 0,0290), uma menor percentagem de leitões por qPCR leitão positivo no DOF 0 (P = 0,0381), uma menor percentagem de leitões por leitão com doença clínica (P < 0,0001) e maior peso dos leitões em DOF 20 e GMD (P < 0,0028), em comparação com o grupo de controle do desafio.

[000180] Em conclusão, o objetivo do estudo foi cumprido e os dados deste estudo estabelece o MID de PRRS 94.881 MLV em leitões como 1 x 102,43 TCID50/2 mL. Além disso, este estudo estabelece duração da imunidade (DOI) em leitões de cerca de 4 meses.

OBJETIVO(S)/PROPÓSITO DO ESTUDO

[000181] O objetivo deste estudo de desafio de vacinação foi avaliar a dose mínima imunizante (MID) e Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína da Vacina Europeia derivado do isolado 94.881, Vírus vivo Modificado, Código 19T1.U_ (PRRS 94.881 MLV), em dois diferentes níveis de titulação (Grupo 2, baixa titulação, Grupo 3, elevada titulação), administradas a leitões PRRS soronegativos pré-melhoramento para proporcionar maiores porcentagens de viver leitões nascidos e desmamados aos 21 dias de idade, seguindo desafio de leitões com um isolado heteróloga Europeu e vírus da Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína+ (PRRSV) em aproximadamente 90 dias de gestação. Os principais critérios para satisfazer esse objetivo foram que um ou ambos os grupos de vacina devem demonstrar relevantemente maior porcentagem ou o número de leitões nascidos vivos e leitões desmamados aos 20 dias de idade (DOF +20), em comparação com o grupo de controle do desafio (Grupo 1).

[000182] Outros parâmetros analisados entre os grupos vacinados e o grupo de controle do desafio incluíram as avaliações clínicas pós- vacinação em leitões, sorologia PRRS em leitão, viremia de leitão, ob-servações clínicas em leitões, viremia em leitão, o total de leitões por ninhada, leitões vivos saudáveis por ninhada, leitões vivos fracos por ninhada, cadáveres dissecados por ninhada, natimortos por ninhada, leitões esmagados/de mortalidade por ninhada, observações clínicas em leitão e ganho de peso médio diário (GPMD). Estes parâmetros foram analisados como parâmetros de apoio e não servem como parâmetros primários para satisfazer o objetivo do estudo. PROGRAMAÇÃO DE CASOS

* DOF = Dia do parto Tabela 6.2 Calendário de Casos DO Leitão

DESENHO DO ESTUDO Tabela 6.3 Estudo de projeto

CRITÉRIOS DE CEGUEIRA

[000183] O investigador do estudo e os designados estavam cegos em relação a leitões atribuídas aos grupos de 1 a 4. Para manter a cegueira do investigador do estudo e designados, uma pessoa não coletou os dados administrados aos IVPs e CP para leitões atribuídas em D0. O pessoal do laboratório foi cegado para o tratamento com cada fêmea recebida durante a realização de suas respectivas tarefas.

MATERIAIS

[000184] Produtos veterinários de Investigação (IVP) e do produto de controle (CP) Tabela 6.4 Produtos veterinários de Investigação (IVPs)

Tabela 6.6 Controle de Produto (CP)

MATERIAL DO DESAFIO Tabela 6.7 material do Desafio

TRATAMENTOS ADICIONAIS

[000185] Matrix ™ (6,8 mL ; Alternogest ; Intervet/Schering Plough Animal Helath) foi administrado na alimentação de cada leitoa de D8 a D21 para sincronizar os ciclos de estro.

[000186] A ocitocina (VetTek) foi administrada no parto para ajudar leitões com parto, mas não para o início do parto. No parto, todos os leitões vivos receberam 1,0 mL de injeção de ferro (Phoenix ou Dur- vet), IM, na parte traseira do animal direita para a prevenção da anemia por meio da deficiência de ferro logo após o nascimento. Além disso, todos os leitões vivos receberam gentamicina (Sparhawk Laboratories Inc) como vasculhar preventiva logo após o nascimento. Todos os tratamentos foram registrados no formulário de registro de Tratamento Biológico e Farmacêutico.

TRATAMENTOS JUSTIFICAÇÃO DA DOSAGEM

[000187] Cada IVP foi administrado como uma dose de 2,0 mL para leitões designadas para avaliar o MID de PRRS 94.881 MLV. Uma dose de 2,0 mL da CP foi administrada a leitões atribuídos a grupos 1 e 4.

REGIME POSOLÓGICO

[000188] Em D0, cada IVP ou CP foi administrado a cada leitão IM respectivo na região do pescoço para a direita usando uma seringa estéril de 3,0 mL de Luer-lock e agulha estéril de 18g x 1 polegada (2,54 cm) por uma pessoa que não a coleta os dados do estudo . O regime de dosagem é mostrado abaixo na Tabela 6.8. Tabela 6.8 regime posológico

MÉTODOS E PRECAUÇÕES PARA O PESSOAL DE ESTUDO

[000189] O Pessoal de administração IVPs, a CP e material de desafio respeitou as precauções de segurança e usou os equipamentos de proteção individual, conforme descrito para o local de estudo específico. INFORMAÇÃO ANIMAL REQUISITOS DE ANIMAIS DE ESTUDO Tabela 6.9 Informações do animal

CRITÉRIOS DE IN CLUSÃO/EXCLUSÃO

[000190] Todos as leitoas incluídas neste estudo foram PRRS ELISA negativo, não de raça e eram saudáveis no momento da vacinação, conforme determinado pela observação.

REMOÇÃO PÓS-INCLUSÃO DE LEITÕES

[000191] Cinco (5) - Grupo 1 de leitões (n ° s 5, 15, 34, 35 e 52), dois (2) - Grupo 2 de leitões (n ° s 77 e 94), três (3) - Grupo 3 de leitões (N ° s 2, 25 e 30) e uma (1) - Grupo 4 de leitões (No. 20) não mostraram estro e, subsequentemente, não foram criados. Estas matrizes foram removidas a partir do estudo de D47.

[000192] Dois (2) - Grupo 1 de leitões (n ° s 109 e 110), nove (9) - Grupo 2 de leitões (n ° s 56, 59, 60, 69, 73, 75, 76, 78 e 103), quatro (4) - Grupo 3 de leitões (n ° s 22, 28, 51 e 53) e um (1) - Grupo 4 de leitões (n ° 21) foram retiradas do estudo por D89 devido a claudicação, não está grávida, ou no final de criação.

[000193] O protocolo do estudo afirmou que, se > 16 leitoas grávidas por grupo para grupos de 1 a 3 ainda estavam em estudo antes do desafio, as leitoas extras seriam selecionadas aleatoriamente para a remoção do estudo, deixando, dessa maneira , 16 leitoas grávidas por grupo para Grupos 1 a 3. Cinco (5) - Grupo 1 de leitões (n ° s 3, 8, 39, 90 e 101), uma (1) - Grupo 2 de leitões (n ° 70) e cinco (5) - Grupo 3 de leitões (n ° s 42, 80 , 86, 91 e 105) foram retirados do estudo com base em pelo D104 randomizações pelo estatístico ou selecção por pessoa não estudo, a redução do tamanho do grupo de 16 leitões para os Grupos 1 a 3.

[000194] Devido às limitações de espaço, o investigador do estudo solicitado que o tamanho do grupo 4 foireduzido de oito (8) a cinco (5). 3 (três) leitões aleotariamente selcionadas (n ° s 10, 24 e 29) para a remoção do estudo, que foram retirados no D109.

GESTÃO E ALOJAMENTO DO ANIMAL Alojamento dos Animais

[000195] As leitoas de baixa titulação PIV foram alojadas nas salas 1 e 2, e as leitoas de elevada titulação PIV foram alojadas nas salas 3 e 4, no Edifício CB na VRI-Cambridge a partir de D-1 para estudar a conclusão. As leitoas atribuídas ao controle de desafio e grupos de controle negativos foram alojados em um sala individual em VRI-Risdal de D-1 a D85. No D85, as leitoas remanescentes no controle de desafio e grupos de controle negativos foram transferidos para VRI- Cambridge. Dezesseis (16) - leitões no controle de desafio foram alojados no edifício CB, salas 5-8 e oito (8) leitões no controle negativo foram alojados no edifício CA, Sala 12, para o restante do estudo. De D85 em diante, cada sala foi idêntico no layout com duas linhas de quatro gaiolas de parto por linha. Cada engradado realizou uma fêmea e sua prole. Cada caixa foi de aproximadamente 5 pés x 7 metros de tamanho, foi elevado do chão, painéis de haste de metal para os lados e de plástico de malha para pavimentação. Não houve contato nariz com nariz entre caixas adjacentes. O chão de cada caixa era lavado pelo menos uma vez por dia para remover excrementos e resíduos. Cada sala tinha calor e ventilação separado, evitando a contaminação cruzada de ar entre as salas. Cada sala foi limpo e desinfectado antes de ser utilizado para este estudo. Os funcionários dos Serviços de animal tiveram as roupas limpas e lavadas antes de entrar em cada sala.

[000196] O isolamento do grupo de Tratamento foi necessário neste estudo, uma vez que é bem conhecido na comunidade científica que PRRSV rapidamente se espalha de um suíno para através de vários mecanismos, incluindo aerossóis. Isto inclui avirulentos vacinas de PRRS vivos como esses produtos biológicos incluem partículas de vírus atenuados que imitam as características de PRRS de tipo selvagem virulenta sem a capacidade de causar a doença. Métodos apropriados estavam no local para garantir que a biossegurança fosse mantida e que os animais vacinados não acidentalmente contaminas- sem os animais não vacinados, PRRSV ingênuos do controle negativo.

[000197] Todos as salas do estabelecimento tem ventiladores e aquecedores para ajudar na circulação de ar suficiente e aquecimento. O sistema de ventilação é separado ainda idêntico para cada sala, para que o ar não é compartilhado entre as salas. Alimentação do sólido foi armazenada em sacos, livres de vermes. A água foi fornecida ad libitum a partir de um cavidade situada no biotério. As leitoas foram alimentadas com uma comercialmente preparada, a gestação não medicamentosos ou ração de lactação (Heart of Iowa Cooperativa, Roland, IA) apropriado para o seu tamanho, idade e condição.

[000198] As leitoas estavam em bom estado de saúde e estado nutricional antes do início do estudo, conforme determinado pelo investigador do estudo. Durante o estudo, duas leitoas foram observadas com claudicação leve e uma fêmea foi observada com um inchaço na região do pescoço do lado esquerdo. O investigador do estudo considerou todas estas sejam as condições não específicas que ocorrem geralmente em grupos de leitões alojadas em confinamento. O investigador do estudo determinou que os tratamentos concomitantes não foram necessários para os animais durante o estudo.

[000199] Todos os leitões e seus suínos atribuídos a grupos 1 a 3 foram eliminados por meio da incineração comercial após a eutanásia. Leitões atribuídos ao Grupo 4 foram eliminados, tornando depois a eutanásia. Grupo 4 de leitões não foi sacrificado e descartado, mas foi atribuído a outro projeto BIVI. Não há produtos alimentares de animais incluídos no estudo que entraram na cadeia alimentar humana.

AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA

[000200] Para avaliar o MID de PRRS 94.881 MLV, grupo de baixa titulação (Grupo 2) e do grupo de elevada titulação (Grupo 3) foram desafiados em D118 e desempenho reprodutivo e leitões desmamadas após o desafio foram avaliadas. Os principais critérios para satis- fazer esse objetivo foram que um ou ambos os grupos de vacina devem demonstrar estatisticamente maior percentagem ou número de leitões nascidos vivos e leitões desmamadas aos 20 dias de idade (DOF +20), em comparação com o grupo de controle do desafio (Grupo 1).

[000201] Outros parâmetros analisados para apoiar a eficácia entre os grupos vacinados e o grupo de controle do desafio incluiu as avaliações clínicas leitão pós vacinação, sorologia PRRS do leitão, viremia do leitão, observações clínicas pós-desafio do leitão, viremia do leitão no parto, número de leitões por ninhada , leitõess vivos por ninhada saudáveis, leitões vivos por ninhada fracos, cadáveres dissecados por ninhada, natimortos por ninhada, leitões esmagados/mortalidades por ninhada, observações clínicas de leitão e leitão GPMD.

CRITÉRIOS PARA UM TESTE VÁLIDO

[000202] O grupo de controle negativo (Grupo 4) não foi incluído em todas as análises. O grupo de controle negativo foi incluído no estudo para demonstrar que a fonte de leitões foi PRRS negativo no momento em que os outros três grupos foram desafiados. Além disso, o grupo de controle negativo teve que permanecer PRRS negativo até a conclusão do estudo para excluir uma possível introdução de um PRRSV campo ou contaminação cruzada acidental de grupos desafiados.

[000203] As amostras de soro pré-compra e D0 foram todas obrigadas a presença de anticorpos contra PRRS. As amostras de soro coletadas de Grupos 1 e 4 até o dia do desafio e do Grupo 4, até a conclusão do estudo tiveram que ser livre de anticorpos PRRS para o estudo seja válido.

PARÂMETROS DE RESULTADOS PRIMÁRIOS

[000204] As variáveis primárias de eficácia para a avaliação estatística foram leitões vivos por leitão ao nascimento (número ou a porcentagem média) e leitões vivos por litro ao DOF 20 (média de número e porcentagem).

9.2.1 Percentual de leitões vivos no nascimento por leitão

[000205] A data de parto foi registrada para cada fêmea durante o estudo. O dia do parto (DOF) para cada fêmea foi definida como o dia em que o primeiro leitão nasceu. No momento do parto, cada leitão foi classificado em uma das cinco categorias listadas abaixo na Tabela 6.10. Um leitão vivo ao nascer foi definido como qualquer leitão que recebeu uma classificação de observação no nascimento como leitão são ao vivo, leitão vivo fraco ou leitão esmagado/mortalidade (morte devido ao esmagamento foi confirmada na necropsia, conforme descrito abaixo). As observações foram realizadas pelo investigador do estudo ou uma pessoa designada e foram registrados no formulário de parição do Registro de processamento/Litter. Tabela 6.10 Categorias de Resultado da Ninhada

Leitões vivos por litro ao DOF +20

[000206] Os leitões foram observados com sinais clínicos da doença, conforme descrito na Tabela 6.11 do DOF 1 a DOF +20. As observações foram realizadas pelo investigador do estudo ou designados e foram registrados no formulário de registro de observações clínicas. Tabela 6.11 Sistema de Pontuação de Observação Clínica

[000207] Um total de pontos de observação clínica diária foi determi- nado como um somatório de respiração, comportamento e tosse pon-tuação pelo estatístico utilizando o programa SAS. Qualquer leitão re-cebeu uma pontuação clínica de zero a oito no DOF 20 foi avaliada como vivo em DOF +20.

PARÂMETROS FAVORÁVEIS

[000208] Outros parâmetros analisados entre os grupos vacinados e o grupo de controle do desafio incluíram as avaliações clínicas de leitão pós vacinação, sorologia de leitão PRRS, viremia de leitão, observações clínicas de leitão, viremia de leitão, o total de leitões por ninhada, leitões vivos saudáveis por ninhada, leitões vivos fracos por ninhada, cadáveres dissecados por ninhada, natimortos por ninhada, leitões esmagados/mortalidades por ninhada, observações clínicas de leitão e ganho de peso médio diário do leitão (GPMD).

As avaliações diárias dos leitões

[000209] Todas os leitões foram observados uma vez por dia a partir de D-1 para D21 e D22 a partir de 115, no mínimo, três vezes por semana para avaliações diárias pós-vacinação pelo investigador do estudo ou designados. As observações foram registradas no formulário de registro de Avaliação Diariamente.

Sorologia PRRS de leitão

[000210] O sangue venoso foi coletado de leitões antes da compra e no D0, D7, D14, D21, D56, D84, D118, D125, D132, DOF 0, DOF 7, 13 e DOF DOF +20. As coletas de sangue de leitões no momento do par- to/aborto (DOF 0) foram realizadas imediatamente após o parto/aborto foram concluídas ou até 8 horas pós-amamentação/aborto.

[000211] Em sumário, cerca de 10 mL de sangue foi coletado de cada fêmea em um tubo separador apropriado tamanho Soro (s) (SST). As coletas foram registradas no formulário de registro de coleta da amostra. Sangue em SST foi deixado coagular à temperatura ambiente. As amostras de sangue coletadas durante a semana foram entre- gues BIVI-Ames, no dia da coleta. As amostras de sangue coletadas nos fins de semana foram processadas por pessoal VRI no dia da coleta. As amostras de soro na VRI foram realizadas entre 2 a 8 ° C. Em qualquer BIVI-Ames ou VRI, amostras de sangue foram centrifugadas e o soro foi recolhido, dividido e transferido para os tubos apropriados. Cada tubo foi marcada com o número de ID da leitoa, o número do estudo, a data da colheita, no dia do estudo e o tipo de amostra. As amostras de soro na VRI foram entregues BIVI-Ames, no menor espaço de tempo conveniente. Um Modelo de formulário registro de entrega concluída foi incluído com cada embarque. Em BIVI-Ames, uma série de amostras de soro foram mantidos a 2 a 8 ° C e o outro conjunto de amostras de soro foram mantidas a -70 ± 10 ° C.

[000212] O conjunto de amostras de soro de leitões realizadas em 2 a 8 ° C foram testadas por BIVI-Ames para detecção de anticorpos de PRRS. Os resultados foram relatados como negativo (Proporção ELISA de < 0,4 S/P) ou positivo (ELISA S/P proporção > 0,4).

Observações clínicas pós-desafio dos leitões

[000213] As leitoas foram observadas com os sinais clínicos de doença em D116 para DOF +20. As observações foram realizadas pelo investigador do estudo ou designados. As leitoas foram observadoas todos os dias para a respiração, o comportamento e tosse com base no sistema de pontuação descrito acima na observação clínica na Tabela 6.11.

Viremia PRRS de leitão

[000214] O sangue venoso foi coletado de leitão em DOF 0, DOF 7, 13 e DOF DOF +20, ou quando um leitão foi encontrado morto. A coleta de sangue pré-colostral foi preferida de leitões recém-nascidos, mas não era obrigatória. Se o sangue pré-colostral não poderia ser coletado, o sangue peri-natal dentro de 12 horas do parto era permitido. As amostras não recolhidas antes da primeira mamada foram rotuladas como "Peri-natal" e mantidas separadamente a partir de amostras pré- colostral.

[000215] Em sumário, cerca de 2,0 a 2,5 mL de sangue foi coletado de cada leitão vivo em um tubo separador apropriado tamanho Soro (s) (SST). Um mínimo de 5,0 mL de sangue foi coletado de cada leitão no DOF 20 pouco antes da eutanásia. O sangue foi coletado de cada cadáver dissecado ou natimorto ou se o sangue não poderia ser recolhidos a partir de um feto morto, foi coletado líquido torácica ou abdominal. As coletas foram registrados no formulário de registro coleta da amostra.

Média de ganho de peso diário do leitão

[000216] Os leitões individuais foram pesados no DOF DOF 0 e 20, ou no dia em que um leitão foi encontrado morto pelo investigador do estudo ou designados. Pesos individuais em DOF 0 foram registrados nos formulários de registro de Processo de parto/Litter e peso corporal após DOF 0 foram registrados no formulário de registro do peso corporal.

Quantificação do vírus PRRS no tecido do pulmão

[000217] Todos os leitões mortos no momento do parto ou mortos antes DOF 20 foram necropsiados pelo investigador do estudo. Os resultados de necropsia e um diagnóstico foram registrados no formulário de Relatório de Necropsia. Duas amostras de pulmão foram coletadas de cada leitão necropsiados. Uma amostra foi colocada em uma Whirlpak ® recipiente separado e outra amostra foi colocada dentro de um recipiente adequado cheio com um volume suficiente de formalina a 10% . As coletas foram registradas no formulário de Relatório de Necropsia.

[000218] Whirlpaks ® e os recipientes em formalina foram apropria-damente marcados com o número de animais, o número de estudo, a data de amostragem, o dia do estudo, se o tipo de amostra e as amos- tras foram a partir do lado esquerdo, o lado direito, ou ambos. Amostras em Whirlpaks ® foram armazenadas a -70 ± 10 ° C e as amostras em formalina a 10% foram armazenadas à temperatura ambiente até ser entregue ao BIVI-Ames. Um Modelo de formulário registro de entrega concluída foi incluído com cada entrega de amostras. Em BIVI- Ames, amostras em Whirlpaks ® foram armazenadas a -70 ± 10°C até enviado de BIVI-Ames para a Alemanha, e as amostras fixadas em formalina foram armazenadas a BIVI-Ames, à temperatura ambiente.

[000219] Após o estudo ter sido completado, as amostras de tecido congeladas em Whirlpaks ® foram enviadas e testadas como descrito acima.

[000220] As amostras de tecido formalina fixos foram submetidas a ISU VDL dentro de uma semana da coleta para inclusão em blocos de parafina). Os tecidos em blocos de parafina foram devolvidos para BI- VI e estão atualmente detidos por BIVI-Ames à temperatura ambiente para possíveis testes futuros. A decisão de se manter essas amostras ou descartá-las será feito pelo patrocinador do estudo e monitoramento após o relatório do estudo ter sido concluído.

CASOS ADVERSOS

[000221] Nenhum dos casos adversos atribuídos às IVPs foram relatados durante este estudo. Para mais informações sobre os casos adversos, consulte a Seção 12.6, Avaliações de Leitão pós-vacinal.

MÉTODOS ESTATÍSTICOS UNIDADE EXPERIMENTAL

[000222] Os grupos de tratamento tiveram que ser alojados em salas separadas neste estudo para evitar a transmissão da vacina contra PRRSV ao vivo para grupos não vacinados. Portanto, a sala foi a unidade experimental. No entanto, para os fins da presente análise, o possível viés devido ao confundimento do "sala" e os efeitos de "tratamento" foram ignorados, e leitão e sua ninhada correspondente fo- ram analisados como unidade experimental.

RANDOMIZAÇÃO

[000223] Noventa e quatro (94) Leitões PRRS soronegativas de um conjunto de 107 leitões elegíveis de teste foram randomizadas para um de quatro grupos antes de D0. Grupos 1 a 3 cada consistiu em 28 leitões. O grupo 4 consistiu em 10 leitões. Para o Grupo 1, n ° s 45 e 55 foram excluídos pelo gerente da fazenda antes do embarque por motivos de saúde e foram substituídos por duas leitoas extras, n ° s 15 e 18, de uma maneira respectiva. Para o Grupo 3, dourada n ° 44 foi excluída pelo gerente da fazenda antes do embarque por motivos de saúde e foi substituído por dourado adicional No. 25.

[000224] Devido a limitações de espaço no momento do desafio, grupos 1 a 3 foram restritos a 16 leitões por grupo e grupo 5 foi restrito a 5 a 8 leitões. No D85, 16 leitões por grupo foram selecionados aleatoriamente para permanecer no estudo para os Grupos 1 a 3. Desde Grupo 4 consistiu em 8 leitões em D85, este grupo não foi ainda mais reduzida por randomização. Em seguida, o investigador do estudo pediu que o Grupo 4 fosse reduzido de 8 para 5 leitões primíparas. Na D109, 5 leitões foram selecionadas aleatoriamente para permanecer no estudo para o Grupo 4.

[000225] Todas as randomizações dos procedimentos foram realizadas por meio de um biostatistician.

ANÁLISE

[000226] As análises estatísticas e sumários de dados foram conduzidas pelo Dr. rer. classe etária. Martin Vanselow, Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Alemanha, +49 (0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de.

[000227] O principal objetivo da análise estatística foi a comparação de dois grupos de PRRS 94.881 das vacinas MLV (Grupos 2 e 3) a um grupo de controle não vacinado desafiado (Grupo 1). Todos os dados foram importados para o SAS para a gestão e avaliação. Os dados foram recebidos do patrocinador do estudo sob a forma de conjuntos de dados verificados SAS. Os casos que haviam sido retirados do estudo foram considerados para o respectivo parâmetro de análise até a data de exclusão. Todos os dados foram resumidos de forma descritiva (n, mínimo, máximo, média, média, desvio padrão, intervalo inter- quartil, ou distribuições de frequência, intervalo de confiança), com base no tipo da variável. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SAS versão 8.2 (SAS, 2001, Cary, Carolina do Norte, EUA : SAS Institute Inc.).

[000228] As variáveis para a avaliação estatística do estudo :

[000229] As variáveis primárias

[000230] As proporções de leitões vivos no parto/aborto (DOF 0)

[000231] As proporções de leitões vivos aos 20 dias de idade (DOF 20)

[000232] As variáveis de apoio

[000233] As avaliações clínicas pós-vacinação dos leitões

[000234] Sorologia PRRS de leitão

[000235] Viremia do leitão

[000236] Observações clínicas do leitão

[000237] Viremia de leitão

[000238] O desempenho reprodutivo

[000239] Observações clínicas de leitão

[000240] Ganho de peso médio diário do leitão (GPMD)

[000241] Hipótese a ser testada e suposições feitas :

[000242] O grupo de controle negativo incontestado (grupo 4) foi excluído dos testes estatísticos. Os grupos de elevada titulação (grupos 2 e 3, de uma maneira respectiva) de baixa titulação e foram comparados com o grupo de controle exposto (Grupo 1). Todos os testes entre os grupos foram concebidos como testes de dois lados sobre as diferenças. No caso de todos os testes, as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas somente se P < 0,05. A eficácia foi demonstrada se a percentagem ou número de leitões nascidos vivos e da percentagem ou número de leitões desmamados aos DOF 20 foram significativamente maiores para um ou ambos os grupos de vacina em comparação com o grupo de controle desafiado. Detalhes sobre manipulações de dados e avaliação :

A avaliação clínica da Leitão pós vacinação

[000243] As tabelas de frequência de animais com pelo menos um resultado positivo entre os dias de estudo 1 e 21 e entre os dias de estudo 1 e 113 foram gerados. As diferenças entre o controle de desafio e grupos de vacinas foram testadas pelo teste exato de Fisher.

Observações clínicas dos leitões pós-desafio

[000244] As tabelas de frequência de animais com pelo menos um resultado positivo entre o estudo de 116 dias e DOF 20 foram gerados. As diferenças entre o grupo de controle do desafio e grupos de vacinas foram testadas pelo teste exato de Fisher.

A sorologia de leitões

[000245] As tabelas de frequência de "positivos" os resultados de ELISA em dias de estudo 7, 14, 21, 56, 84, 118, 125, 132 (pré-parto) e DOF DOF 0, 7, 13 e DOF DOF +20 foram gerados. As diferenças entre o controle de desafio e grupos de vacinas foram testadas pelo teste exato de Fisher.

A viremia de leitoas

[000246] Os dados de Viremia foram avaliados para cada dia de in-vestigação em separado (pré-parto dias de estudo 7, 14, 21, 56, 84, 118, 125, 132 e DOF 0, DOF 7, 13 e DOF DOF +20). Para a avaliação qualitativa dos dados qPCR os resultados analíticos 'não detectados' ('nd') e 'negativos' foram classificados como "negativo" e os resultados analíticos 'positivos' e um valor medido foram classificados como "posi- tivos". Para a avaliação quantitativa "não detectada '(' nd ') e ' negativo ' foram substituídos por uma GE/mL valor de 0,0 log10 e" positiva "foi substituído pelo 3.0. Os dados de PCR quantitativa (carga viral PRRS [ log10 da GE/ml ]) foram utilizados para comparações entre o controle de desafio (grupo 1) e os grupos de tratamento 2 e 3, utilizando o teste de Mann-Whitney Wilcoxon. As tabelas de frequência de resultados de qPCR "positivos" foram gerados. As diferenças entre o grupo de controle do desafio e grupos de vacinas foram testadas pelo teste exato de Fisher.

Desempenho reprodutivo

[000247] As frequências absolutas por leitão do número total, saudáveis , fracos, leitões vivos, natimortos, mortos e vivos no DOF 20 foram determinadas e usadas como valores únicos para as comparações entre os grupos. As frequências relativas por leitão de vivos saudáveis, leitões fracos, natimortos, e mortos foram calculados em relação ao número total de leitões no parto e usados como valores únicos para as comparações entre os grupos. A porcentagem de leitões vivos por litro ao DOF 20 foi calculado em relação ao número de leitões vivos no parto número menos de mortalidade e leitões esmagados. As diferenças entre o grupo de controle e os grupos de vacina de desafio foram testados pelo teste de Mann-Whitney Wilcoxon.

A viremia de leitões

[000248] Os dados de Viremia foram avaliados para cada dia de in-vestigação em separado (DOF 0, DOF 7, 13 e DOF DOF +20). Para a avaliação qualitativa dos dados qPCR os resultados analíticos 'não detectada' ('nd') e 'negativo' foram classificados como "negativo" e os resultados analíticos 'positivo' e um valor medido foram classificados como "positiva". As porcentagens de leitões 'positivos' por ninhada foram calculadas e usadas como valores individuais para as comparações entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney, Wilcoxon. Para a avaliação quantitativa "não detectada '(' nd ') e' negativo 'foram substi-tuídos por uma GE/mL valor de 0,0 log10 e" positiva "foi substituído pelo 3.0. Os valores médiaos qPCR por ninhada foram calculados e usados como valores individuais para as comparações entre os grupos pelo teste de Mann-Whitney, Wilcoxon. Para as estatísticas sumárias foram utilizados os dados de qPCR individuais. As cargas virais em amostras de pulmão foram avaliados apenas descritiva.

Peso Corporal e Ganho de Peso Médio Diário de leitões

[000249] Os ganhos de peso médio diário individuais (GPMD) foram calculados para os períodos de tempo entre DOF +0 e DOF +20. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testados por análise de variância (ANOVA) e teste-t subsequente. Médias dos quadrados mínimos dos grupos e as diferenças entre médias dos quadrados mínimos com intervalos de confiança de 95% foram obtidos a partir da análise de variância. A análise para DOF +20 e GMD foi repetida com peso no DOF +0 como covariável. Os dados de peso de leitões por leitão foram resumidos de forma descritiva. Observações clínicas de leitões

[000250] A percentagem de leitões por ninhada, com pelo menos um resultado positivo entre os dias de estudo DOF +1 e DOF +20 foram calculadas e utilizadas como valores individuais para as comparações entre os grupos por meio dos dados de Testee Wilcoxon Mann Whitney foram analisados assumindo estrutura do projeto completamente aleatória.

RESULTADOS DESEMPENHO REPRODUTIVO DO LEITÃO

[000251] Os percentuais médios de leitões vivos por litro no parto (saudável + fraco +/mortalidade esmagado) foram 54,4% , 75,1% , 72,3% e 93,0% para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e o grupo de controle negativo, de uma maneira respectiva. Os grupos de elevada titulação de baixa titulação e tinham significati-vamente maior percentual de leitões vivos por litro no parto em compa-ração com o grupo de controle do desafio (P < 0,0455). Número de leitões vivos por ninhada significa no parto foram de 6,5, 8,3, 8,6 e 10,8 para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos para o número de leitões vivos por litro no parto (P > 0,1039).

[000252] As percentagens médias de saudáveis leitões vivos por ninhada foram 41,4% , 65,8% , 67,9% e 93,0% para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Os grupos de elevada titulação de baixa titulação tinham significativamente maiores porcentagens de saudáveis leitões vivos por litro no parto em comparação com o grupo de controle do desafio (P < 0,0138). O número de leitões saudáveis vivos por ninhada significa que no parto foram de 4,9, 7,2, 8,1 e 10,8 para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. O grupo de elevada titulação teve um número significativamente maior de saudáveis leitões vivos por litro no parto (P = 0,0211), enquanto que não foi detectada diferença para o grupo de baixa titulação, em comparação com o grupo de controle do desafio (P = 0,0640).

[000253] A média percentual de leitões fracos vivos por litro no parto foram de 7,4% , 7,1% , 0,4% e 0,0% para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. O número de meios de leitões fracos vivos por ni-nhada no parto foram de 0,9, 0,8, 0,1 e 0,0 para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. O grupo de elevada titulação teve significativa-mente menor porcentagem e número de leitões fracos vivos por litro no parto em comparação com o grupo de controle do desafio (P < 0,0090). Por outro lado, não foram detectadas diferenças entre o grupo de de baixa titulação e o grupo de controle do desafio para a percentagem ou número de leitões vivos fracos no parto (P > 0,8569).

[000254] A média de porcentagem de cadáveres dissecados por litro no parto foram 28,1% , 14,1% , 8,7% e 0,0% para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. O número de meio de cadáveres dissecados por ninhada no parto foram de 3,1, 1,6, 0,9 e 0,0 para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Ambos os grupos de elevada titulação e de baixa titulação tiveram significativamente percentuais mais baixos e números de cadáveres dissecados por litro no parto em comparação com o grupo de controle do desafio (P < 0,0190).

[000255] Não foram detectadas diferenças significativas entre os dois grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio para a percentagem ou número de natimortos ou mortalidades/esmagados de leitões por litro no parto (P > 0,1681).

[000256] Um sumário dos resultados de desempenho reprodutivo do grupo (% leitões por ninhada e o número de leitões por ninhada) sobre o DOF é mostrado abaixo nas Tabelas 6,12 e 6,13. Tabela 6.12 Sumário dos resultados do Grupo de desempenho reprodutivo (% leitões por ninhada) no DOF

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo Tabela 6.13 : Sumário dos Reprodutivos Resultados de Desempenho do Grupo (n ° de leitões por ninhada) no DOF

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, 4 = grupo de controle negativo Grupo

LEITÕES VIVOS EM DOF +20

[000257] Estes resultados destacam o número de leitões vivos ao desmame (20 dias de idade). Um sumário do percentual grupo e número de leitões vivos por ninhada em DOF 20 é mostrado acima nas tabelas 6.12 e 6.13.

[000258] Os percentuais médios de leitões vivos por litro ao desmame (DOF 20) foram 43,6% , 73,8% , 83,8% e 100,0% para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. O número de meios de leitões vivos por ninhada ao desmame foram de 2,9, 6,2, 6,9 e 10,8 para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Ambos os grupos de elevada titulação e de baixa titulação tiveram percentagens significativamente mais elevadas e número de leitões vivos por litro ao desmame (DOF 20), em comparação com o grupo de controle do de- safio (P < 0,0203).

VIREMIA qPCR DE LEITÃO

[000259] Todos os leitões foram qPCR negativo para o RNA PRRSV em D0. Todo o controle de desafio e leitões de controle negativo permaneceu qPCR negativo para o RNA PRRSV até e incluindo o dia do desafio (D118). O grupo de controle negativo permaneceu qPCR negativo para o resto do estudo, com exceção da leitão número 108, que foi "positivo" na DOF 7. Leitão número 108 foi negativo em outros momentos de RNA PRRSV por testes qPCR.

[000260] Pós-vacinação, 50% e 36% dos leitões de baixa titulação e de elevada titulação, de uma maneira respectiva, foram qPCR positivo para RNA PRRSV (P < 0,0007) em D7. Em D14 a D56, apenas 4% das leitoas de baixa titulação permaneceu qPCR positivo enquanto até 4% de leitões de elevada titulação foram qPCR positiva intermitente durante este período de observação. Não foram detectadas diferenças entre os grupos vacinados e o grupo de controle do desafio em D14 a D56 para o percentual de leitões qPCR positivo para RNA PRRSV (P = 1,0000 ou nenhum teste realizado). Todos os leitões foram vacinados qPCR negativo para o RNA PRRSV em D84 e D118 (dia do desafio).

[000261] Depois do desafio, o de baixa titulação e grupos superiores tinham estatisticamente menores percentuais de leitões qPCR positivo para RNA PRRSV em comparação com o grupo de controle do desafio nos dias de 125, DOF 0, e DOF +13 (P < 0,0155). Na D132, o grupo de baixa titulação teve um percentual significativamente menor de leitões qPCR positivo para RNA PRRSV (P = 0,0290), enquanto que não foi detectada nenhuma diferença estatística entre o grupo de elevada titulação e o grupo de controle do desafio (P = 0,1556). Não foram de-tectadas diferenças significativas entre os dois grupos de vacinas e o grupo de controle do desafio no DOF DOF 7 e 20 para o percentual de leitões qPCR positivo para RNA PRRSV (P > 0,1719).

[000262] O sumário da percentagem grupo de leitões qPCR positivo para RNA de PRRSV do D7 ao DOF 20 é mostrado abaixo nas tabelas 6.14 e 6.15. Tabela 6.14 Sumário do Grupo Percentagem de leitões qPCR positivo para RNA PRRSV de D7 para D132

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRSV 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação PRRS94881 grupo MLV ; Grupo 4 = grupo de controle negativo, na = Não aplicável, nenhum teste realizado Tabela 6.15 : Sumário do Grupo Percentagem de leitões qPCR positivo para RNA PRRSV do DOF 0 a DOF +20 Dia de estudo Grupo* N % 95% CI Total P

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRSV 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRSV 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

[000263] Os dois grupos de vacinas tinham cargas virais médios sig-nificativamente mais elevadas em comparação com o grupo de controle do desafio em D7 (P < 0,0007). Não foram detectadas diferenças entre os grupos vacinados e o grupo de controle do desafio em D14 a D56 para a carga viral (P = 1,0000). Todos os leitões vacinados tinham zero de carga viral em D84 e D118 (dia do desafio).

[000264] Depois do desafio, os grupos de baixa e de elevada titulação tiveram estatisticamente menor média de cargas virais em comparação com o grupo de controle do desafio em D125, DOF 0, e DOF +13 (P < 0,0155). Na D132, o grupo de baixa titulação tinha uma carga viral média significativamente mais baixa (P = 0,0230), enquanto que não foi detectada nenhuma diferença estatística entre o grupo de elevada titulação e o grupo de controle do desafio (0,94 e 1,97 log10 GE/mL, de uma maneira respectiva, P = 0,1144). Não foram detecta- das diferenças significativas para a carga viral entre os grupos vacinados e o grupo de controle do desafio em DOF DOF 7 e 20 (P > 0,1719).

[000265] Um sumário do grupo de meios de leitões qPCR GE/mL de resultados a partir do D7 ao DOF 20 é mostrado a seguir nas Tabelas 6.16 e 6.17. Tabela 6.16 : Sumário dos Resultados do Grupo de leitão qPCR (log10 GE/mL) de D7 para D132

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo Tabela 6.17 : Sumário dos Resultados do Grupo leitão qPCR (log10 GE/mL) De DOF 0 a DOF +20

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

PONTUAÇÕES DE OBSERVAÇÕES CLÍNICAS DE LEITÕES APÓS O DESAFIO

[000266] A partir em D116 para DOF 20, 25% , 25% , 38% e 60% do controle de desafio, de baixa titulação, de elevada titulação e leitões jovens de controle negativo, de uma maneira respectiva, exibiram doença clínica durante pelo menos um dia a partir em D116 para DOF + 20. Não foram detectadas diferenças significativas entre os dois grupos de vacinas e o grupo de controle do desafio para a frequência de leitões positivos para a doença clínica em D116 para DOF +20 (P > 0,7043).

[000267] Um sumário do percentual grupo de leitões positivos para a doença clínica (pontuação clínico de observação > 0) para pelo menos um dia em D116 para DOF 20 é mostrada na Tabela 6.18. Tabela 6.18 : Sumário das percentual grupo de leitões positivos para a doença clínica (pontuação clínica de observação > 0) para pelo menos um dia em D116 para DOF +20

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

SOROLOGIA PRRS DE ELISA DE LEITÃO

[000268] Todos os leitões foram PRRS soronegativos em D0 e D7. Todo o controle de desafio e leitões jovens de controle negativo permaneceram seronegativos PRRS até e incluindo o dia do desafio (D118), enquanto o grupo de controle negativo permaneceu seronega- tivo para o PRRS o período restante do estudo (DOF +20).

[000269] Em D14, 18% e 21% dos leitões de baixa titulação e elevada titulação, de uma maneira respectiva, foram PRRS soropositivos. O grupo de elevada titulação teve uma porcentagem significativamente maior de Leitões PRRS soropositivos em D14 (P = 0,0232), enquanto que não foi detectada diferença para o grupo de baixa titulação, em comparação com o grupo de controle do desafio (p = 0,0515). Estas percentagens atingiram grupo elevações de 65% e 60% para os grupos de alto titulação de baixa titulação e, de uma maneira respectiva, em D56 (P < 0,0001). No dia do desafio (D118), 56% e 50% de leitões de baixa titulação e de elevada titulação eram soropositivos PRRS (P < 0,0024). Em D125, 6% , 88% e 100% do controle de desafio, os leitões de baixa titulação e de elevada titulação, de uma maneira respectiva, eram soroposi- tivos PRRS, e a diferença entre os grupos vacinados e o grupo de controle exposto foram significativas (P < 0,0001). Depois D125, todo o controle de desafio restante, os leitões de baixa titulação e de elevada titula- ção foram PRRS soropositivos para o restante do estudo (sem teste rea-lizado).

[000270] Um sumário dos resultados de ELISA de PRRS do grupo de serologia em D14 em DOF +20 é mostrado abaixo nas tabelas 6.19 e 6.20. Tabela 6.19 : Sumário dos Resultados do Grupo de sorologia de leitão PRRS ELISA do D14 ao Dia 132

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 4 = grupo de controle negativo. n.d. = Não aplicável, nenhum teste realizado Tabela 6.20 Sumário dos Resultados do Grupo de sorologia de leitão PRRS ELISA do DOF DOF 0 a 20

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRSV 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRSV 94881 grupo MLV ; Grupo 4 = grupo de controle negativo. ** No teste realizado em amostra de Leitão número 106. n.d. = Não aplicável, nenhum teste realizado

AVALIAÇÃO DO LEITÃO PÓS-VACINAL

[000271] Nenhuma das avaliações anormais em D1 a 21 foram detectadas em nenhum grupo e nenhum teste foi realizado. Em D1 a D113, 4% , 4% , 0% e 10% do controle de desafio, de baixa titulação, de elevada titulação e leitões jovens de controle negativo, de uma maneira respectiva, exibiram uma avaliação anormal por pelo menos um dia em D1 a D113. Não foram detectadas diferenças significativas entre os dois grupos de vacinas e o grupo de controle do desafio para avaliações anormais em D1 para D113 (P = 1,0000).

[000272] Individualmente, No. 109 (grupo de controle do desafio) apresentaram claudicação da perna traseira direita na D85, n ° 12 (grupo de baixa titulação) apresentou um edema na região cervical esquerda do D78 a D89, e n ° 21 (negativo grupo de controle) apresenta- ram claudicação de D81 a D83.

[000273] O sumário da percentagem do grupo de leitões que exibiram uma avaliação anormal por pelo menos um dia em D1 a D21 e D1 a partir em D113 é mostrado abaixo na Tabela 6.21. Tabela 6.21 Sumário do Grupo de Avaliações anormais por pelo menos um dia em D1 para D113

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

PONTUAÇÕES DE OBSERVAÇÕES CLÍNICAS DE LEITÕES

[000274] A média percentual de leitões por ninhada positivos para a doença clínica (pontuação clínica de observação > 0) para pelo menos um dia de DOF para uma DOF 20 foram 91,6% , 32,5% , 33,4% e 3,2% para o desafio controle, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Grupos de baixa e elevada titulação tinham significativamente percentuais mais baixos de leitões por ninhada positivo para a doença clínica por pelo menos um dia de DOF para uma DOF +20 em comparação com o grupo de controle do desafio (p < 0,0001).

[000275] Um sumário do percentual grupo de leitões por ninhada que foram positivos para a doença clínica (pontuação clínico de observação > 0) para pelo menos um dia de DOF para uma DOF 20 é mostrado na Tabela 6.22. Tabela 6.22 : Sumário das percentual grupo de leitões por ninhada po-sitivos para a doença clínica (pontuação clínico de observação > 0) para pelo menos um dia de DOF+1 para DOF +20

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

RESULTADOS qPCR DE FLUIDOS DE SORO/CORPORAIS DE LEITÕES

[000276] Uma média de 86,3% , 58,1% , 55,0% e 0% de leitões por ninhada para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação e grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva, foram qPCR positivo para RNA PRRSV em DOF 0. Os grupos de baixa titulação e e de levada titulação tiveram estatisticamente menor porcentagem de leitões por qPCR ninhada positivo para RNA PRRSV em comparação com o grupo de controle do desafio em DOF 0 (P < 0,0381). Em DOF +7, novamente os grupos de elevada titulação e de baixa titulação tiveram significativamente percentuais mais baixos de leitões por qPCR ninhada positivo para RNA PRRSV em comparação com o grupo de controle do desafio (P < 0,0293). Em DOF 13, apenas o grupo de baixa titulação teve um percentual significativamente menor de leitões por ninhada qPCR positivo (P = 0,0216), enquanto não foram detectadas diferenças significativas para o grupo de elevada titulação e o controle de desafio para o percentual de leitões por qPCR positiva (P = 0,0860). Não foram detectadas diferenças significativas entre os dois grupos em DOF +20 (P > 0,0614).

[000277] O sumário da percentagem grupo de fluido corporal/de soro qPCR PRRSV em leitões positivos por leitão jovem é mostrado abaixo na Tabela 6.23. Tabela 6.23 : Um sumário do Grupo Percentagem de Fluidos de so- ro/corporal de leitões qPCR PRRSV soropositivos por leitão

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

[000278] O grupo de elevada titulação teve um resultado significati-vamente menor de média qPCR em comparação com o grupo de controle do desafio em DOF 0 (P = 0,0030), enquanto que não foi detectada nenhuma diferença entre o grupo de de baixa titulação e grupo de controle de desafio (P = 0,0620). Em DOF 7, 13 e DOF DOF 20, ambos os grupos de vacina apresentaram valores médios de qPCR significativamente menores em comparação com o grupo de controle do desafio (p < 0,0122).

[000279] Um sumário dos leitões grupo de fluido de soro/corporal qPCR GE/mL resultados por leitão jovem é mostrado abaixo na Tabela 6.24. Tabela 6.24 : Sumário dos resultados do Grupo Leitão do Fluido de soro/corporal qPCR (log10 GE/mL) por leitão (valores de P para as diferenças entre os grupos com base em valores médios qPCR)

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

LEITÃO GPMD

[000280] Não foram detectadas diferenças entre os grupos para Média LS do peso corporal sobre DOF 0 (P > 0,2972). Ambos os grupos de vacina apresentaram maiores pesos corporais mínimos quadrados médios em comparação com o grupo de controle exposto em DOF 20 (P < 0,0028), com ou sem DOF 0 pesos corporais, calculados como covariável na análise.

[000281] A média dos GDPA DOF 0 a DOF 20 foram 0,1 kg/dia e 0,2 kg/dia, de 0,2 kg/dia e 0,2 kg/dia, para o controle de desafio, de baixa titulação, de elevada titulação, e os grupos de controle negativo, de uma maneira respectiva. Ambos os grupos de vacina apresentaram significativamente maior GDPA comparado com o grupo de controle exposto (P < 0,0028), com ou sem DOF 0 pesos corporais, calculados como covariável na análise.

[000282] Um sumário de grupo DOF 0 e DOF +20 leitões DOF pesos corporais e DOF DOF 0 a 20 GDPA (kg/dia), é mostrado abaixo nas tabelas 6,25 e 6,26. Tabela 6.25 : Sumário do Grupo DOF 0 e DOF 20 de pesos corporais de Leitão e DOF 0 a DOF +20 GPMD (kg/dia)

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo Tabela 6.26 : Sumário do grupo de pesos corporais do meio LS do DOF 0 a DOF 20 GPMD (kg/dia) - Resultados de teste (valores de P) sobre as diferenças entre os grupos

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 4 = grupo de controle negativo. ** Peso no DOF 0 foi utilizado como covariável

OBSERVAÇÕES E DIAGNÓSTICOS DE NECROPSIA DE LEITÃO

[000283] Os fetos que foram listados como natimortos, cadáveres dissecados ou esmagados no parto foram confirmados na necropsia como corretamente classificados com excepção de 8 de fetos. Dois desafio controle de fetos foram listados como natimortos (40-S1, 66- S1), mas os resultados de necropsia revelaram os pulmões inflados indicando que eles estavam vivos no momento do nascimento. Dois desafios de controle de fetos foram listados como esmagado (1-C1, C2-79), mas os resultados de necropsia revelaram os pulmões não inflacionados para ambos fetos, indicando que eles não respiraram. Um baixo feta titulação foi listado como um natimorto (85-S2), mas os resultados de necropsia revelaram os pulmões inflados indicando que o leitão estava vivo no momento do nascimento. Três leitões de elevada titulação foram listados como esmagado (36-C1, C2-36, 65-C1), mas os resultados de necropsia revelaram os pulmões não inflaciona- dos para ambos fetos, indicando que eles não respiraram. devido ao baixo número de fetos listado incorretamente no momento do parto, não foram feitas alterações para análises de desempenho dos leitões.

[000284] Um desafio de controle do leitão 102 a 428 morreu posteriormente à coleta de sangue, o que foi confirmado pela necropsia.

RESULTADOS qPCR DO PULMÃO DO LEITÃO

[000285] Dos fetos e leitões mortos foram necropsiados e os resultados médios qPCR do pulmão foram 4,68, 4,09, 3,55 e 0,0 log10 GE/mL para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Nenhuma das análises estatísticas foram realizadas sobre estes dados.

[000286] Um sumário dos resultados do grupo de pulmão de PRRSV (log10 qPCR GE/mL), é mostrado abaixo na Tabela 6.27. Tabela 6.27 : Sumário do Grupo de Resultados do pulmão do Leitão PRRSV qPCR (log10 GE/mL)

* Grupo 1 = grupo de controle do desafio, Grupo 2 = Baixa titulação de PRRS 94881 grupo MLV ; Grupo 3 = elevada titulação de PRRS 94881 grupo MLV, Grupo 4 = grupo de controle negativo

DISCUSSÃO/CONCLUSÃO

[000287] Para alcançar o objetivo do estudo, quatro grupos de Leitões PRRS suscetíveis foram incluídos no projeto de estudo em D0 : um grupo de controle que recebeu desafio produto de controle (Grupo 1), um grupo da vacina de baixa titulação que recebeu 1 x 102,43 TCID50 de PRRS 94.881 MLV (IVP No. 1, Grupo 2), um grupo da vacina de elevada titulação que recebeu 1 x 103,90 TCID50 de PRRS 94.881 MLV (IVP No. 2, Grupo 3) e um grupo de controle negativo (Grupo 4), que também receberam o controle produto. Cada tratamento foi administrado como uma dose de 2,0 mL IM em cerca de 28 dias antes da reprodução (D0).

[000288] Para determinar a dose imunizante mínima de PRRS 94.881 MLV, os dois grupos de título de vacina, o grupo de controle exposto foi desafiado em D118 (cerca de 90 dias de gestação) com um heterólogo isolado europeu de PRRSV (isolado 190136) e avaliado pós- desafio para porcentagem e número de leitões vivos por litro ao nascimento (dia do parto, DOF) e porcentagem e número de leitões vivos por ninhada aos 21 dias de idade (DOF 21). Validação do estudo (grupo de controle negativo 4)

[000289] Para garantir que os leitões de origem estavam livres de PRRSV e que nenhuma exposição PRRSV estranha ou contaminação cruzada entre os grupos de tratamento e controle ocorreu durante o estudo, um grupo de controle negativo (Grupo 4) foi incluído no projeto de estudo. Os leitões jovens de controle negativo eram negativos para anticorpos de PRRS durante todo o estudo. Além disso, este grupo de leitões e seus descendentes também foram negativos para PRRSV viremia (qPCR) em todos os pontos temporais testados, com excepção dos n ° 108 em DOF 7. O leitão número 108 foi "positivo" na DOF +7, enquanto qPCR negativo em todos os outros momentos e seus leitões foram negativos para RNA PRRSV bem. Este resultado foi considerado um erro, devido à contaminação da amostra e não devido a uma infecção de VSRRS. Estes resultados confirmam que o grupo de controle negativo permaneceu livres de infecção PRRS durante o estudo e validou os resultados deste estudo.

Validação do modelo de desafio reprodutivo de PRRSV (Desafio de Grupo de Controle 1)

[000290] Um modelo de desafio envolvendo uma cepa virulenta da UE derivado de PRRSV que induz PRRS suficiente e doença clínica PRRS reprodutível é necessário avaliar adequadamente a eficácia da vacina em um ambiente de laboratório. Após a inoculação com PRRS europeus isolados 190.136 (1 x 106,30 TCID50/6mL), o grupo de controle apresentou desafio apenas 54,4% leitões vivos por litro ao nascimento (93,0% para o grupo de controle negativo), 17,5% e 28,1% por litro de natimortos e cadáveres dissecados, de uma maneira respectiva (7,0% e 0,0% , de uma maneira respectiva, para o grupo de controle negativo), 91,6% de leitões por ninhada, exibiram doença clínica durante pelo menos um dia a partir de uma DOF a DOF 20 (3,2% leitões por ninhada para o controle negativo grupo), uma média de 2,9 leitões vivos por ninhada aos 20 dias de idade (média de 10,8 para o grupo de controle negativo), e 86,3% dos leitões por virêmicos litro ao nasci-mento (0% para o grupo de controle negativo). Esses resultados evi-denciam que a doença clínica específica de PRRS grave foi induzida no, grupo de controle não vacinado desafio de leitões e seus descendentes, validando este modelo desafio como uma ferramenta de laboratório clínico adequado para avaliar a eficácia da vacina PRRS e, mais especificamente, o MID de PRRS 94881 MLV em leitões.

Determinação da dose mínima de imunização de PRRS em leitões jovens 94.881 MLV (doses de vacina de baixa titulação e elevada titulação ; Grupos 2-3)

[000291] Determinação do MID de PRRS 94.881 MLV em leitões foi baseada no grupo da vacina que recebeu a menor titulação de vacina, que resultou em percentagens superiores ou número de leitões vivos por litro ao nascimento e os maiores percentuais de número de leitões vivos por ninhada aos 20 dias de idade pós-desafio em relação com o grupo de controle de desafio.

[000292] Os leitões vivos por ninhada (seja por cento ou número) no parto foi selecionado como um dos dois principais critérios para determinar o MID de PRRS 94.881 MLV. O primeiro critério fundamental foi baseado no fato de que a infecção pelo PRRSV em leitões e leitoas grávidas normalmente resulta em natimortos e cadáveres dissecados, com baixo número de leitões vivos no parto. Os leitões vivos por litro ao nascimento foram definidas como a soma de leitões fracos saudáveis ao vivo, ao vivo e esmagado-mortalidade no parto. Leitões listados como esmagado ou mortalidade foram incluídos na categoria "ao vivo", porque os achados de necropsia confirmaram esses leitões estavam vivos no momento do nascimento e morreu pouco depois devido a trauma. Ambos os grupos de elevada titulação e de baixa titulação apresentaram as maiores porcentagens de leitões vivos por litro no parto em comparação com o desafio de controle (P < 0,0455), as- sim este critério para a eficácia da vacina foi cumprido. Embora não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos de vacina de baixa e alta titulação e o grupo de controle do desafio no que diz respeito ao número médio de leitões vivos por litro no parto (P > 0,1857), os grupos de elevada titulação e de baixa titulação exibiram consideravelmente maior média do número de leitões vivos por litro no parto (média de 8,3 e 8,6 leitões por ninhada, de uma maneira respectiva) em relação ao grupo de controle do desafio (média de 6,5 leitões por ninhada), dessa maneira , fornecendo mais evidências e apoio que um efeito benéfico do tratamento vacina foi observada nestes animais pós-desafio.

[000293] Os leitões vivos por ninhada (seja por cento ou número) aos 20 dias de idade, foi o segundo critério para determinar a MID de PRRS 94.881 MLV porque a imunidade leitão PRRS irá influenciar na infecção no útero de leitões e derramamento de vírus de leitoas em leitões vivos . Os leitões infectados com PRRS no útero e nasceram leitões vivos ou infectados com PRRS virulentas pós-parto via derramamento da leitoa geralmente morreram antes do desmame secundário a PRRS. Neste estudo, o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação e grupo de controle negativo apresentaram 43,6% , 73,8% , 83,8% e 100% de leitões vivos por ninhada, de uma maneira respectiva, aos 20 dias de idade (P < 0,0203). Da mesma forma, o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação e grupos de controle negativos tiveram um número médio de 2,9, 6,2, 6,9 e 10,8 leitões por ninhada, de uma maneira respectiva, aos 20 dias de idade (P < 0,0063). Ambos os grupos de vacina teve significativamente maior porcentagem e número de leitões vivos ao desmame (P < 0,0203), assim este critério do objetivo do estudo foi cumprido.

[000294] As análises dos dados de parto revelaram mais informação que suporta a eficácia da vacina seguindo o desafio PRRSV, especi- almente no que diz respeito ao grupo de elevada titulação. O grupo de elevada titulação exibiu estatisticamente uma percentagem mais elevada e um número maior média de leitões saudáveis ao nascer (P < 0,0211), enquanto exibindo percentagens significativamente mais baixas e média do número de fraco e fetos mumificado (P < 0,0090), em comparação com o controle de desafio grupo. Estes suporte de dados que a dose elevada vacina induziu imunidade protetora contra uma cepa de desafio virulenta PRRSV e heterólogos. O grupo de baixa titulação também exibiu a eficácia da vacina no parto, como é evidente por uma maior percentagem de leitões saudáveis ao vivo por ninhada (P = 0,0138) e percentagens significativamente mais baixas e média do número de fetos cadáveres dissecados (P < 0,0190). Por outro lado, não foram detectadas diferenças entre os grupos para a percentagem ou número de fetos natimortos ou esmagados/mortalidade no parto (P > 0,1681).

[000295] Sete dias após o desafio (D125), os grupos de elevada titulação e de baixa titulação tiveram significativamente percentuais mais baixos de leitões positivos para RNA PRRSV por qPCR de testes, assim como a carga viral significativamente mais baixos para ambos os grupos, em comparação com o grupo de controle do desafio (P < 0,0001). Estes dados ainda mais o apoio que ambos os níveis de dose da vacina induziu imunidade adequada em leitões para reduzir significativamente a replicação viral após desafio. Da mesma forma, os grupos de baixa e elevada titulação tinha significativamente percentagens mais baixas de leitões qPCR positivos em DOF DOF 0 e 13, assim como a carga viral mais baixa em ambos os grupos em estudo nos dias de hoje (P < 0,0155). O grupo de baixa titulação teve significativamente menor percentual de leitões qPCR de carga viral positiva e inferior em D132 (P < 0,0290), enquanto não foram detectadas diferenças estatísticas entre o elevada titulação e o grupo de controle do desafio para o mesmo conjunto de parâmetros (P > 0,1144) . Não foram detec-tadas diferenças estatísticas entre os dois grupos de vacinas e grupo de controle do desafio para o percentual de leitões qPCR de carga positiva ou viral no DOF 7 e DOF 20 (P > 0,1719).

[000296] Normalmente PRRSV não induz a doença clínica em leitões e leitões, que não o aborto. Neste estudo, 25% , 25% , 38% e 60% do controle de desafio, de baixa titulação, de elevada titulação e leitões jovens de controle negativo, de uma maneira respectiva, exibiram doença clínica (recebido uma nota de observação clínica > 0) para pelo menos um dia pós-desafio . Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos vacinados e o grupo de controle do desafio com relação ao percentual de leitões com doença clínica por pelo menos um dia em D116 para DOF +20 (P > 0,7043). Leitões que apresentaram algum tipo de doença clínica fizeram-no peri-parto e não imediatamente após o desafio. O alto percentual de leitões controle negativo (60%) que apresentaram doença clínica eo fato de que a doença clínica foi observado, principalmente na época do parto para todos os grupos neste estudo sustenta que a doença clínica não foi atribuída à doença PRRS, mas sim a alterações fisiológicas associada com o parto.

[000297] Todos os leitões no estudo foram soronegativos no ELISA PRRS em D0 , dessa maneira proporcionando confirmação um dos critérios de inclusão para os animais de teste entrar no estudo. Da mesma forma, todos os leitões foram soronegativos no ELISA PRRS D7. Os leitões jovens vacinados começaram a exibir os resultados de ELISA de PRRS soropositivos em D14 e os grupos de dose baixa e elevada exibiram sua maior taxa de seroconversão de 65% e 60% , de uma maneira respectiva, em D56 (P < 0,0001). Por outro lado, o grupo de controle permaneceu desafio PRRS ELISA soronegativa até sete dias pós-desafio (D125). Em D132 a estudar conclusão, todos de baixa titulação e elevada titulação e leitões de controle de desafio foram PRRS ELISA soropositivos. A percentagem de leitões positivos viremia de pós-vacinação no D7 pico para ambos os grupos de vacina, tal como evidenciado por 50% e 36% para os grupos de baixa e elevada titulação, de uma maneira respectiva (P < 0,0007). A viremia rapidamente caiu para 4% (1 de 28, N ° 64), e 0% (0 28) para os grupos de elevada titulação de baixa titulação e, de uma maneira respectiva, em D14 (P = 1,0000 ou nenhum teste realizado). Viremia se manteve em 4% para baixa titulação (um de 28, No. 56) e os grupos de elevada titulação (um de 28, No. 91) em D21. No D56, um de 26 (4% , No. 89) leitões de baixa titulação e um dos 25 (4% , No. 66) leitões elevada titulação foram positivos para viremia. Todos os leitões foram negativos para a viremia em D84 e D118.

[000298] Não foram detectadas diferenças significativas entre os dois grupos de titulação da vacina e o grupo de controle do desafio com relação ao percentual de leitões por grupo pós-vacinação com uma avaliação clínica anormal por pelo menos um dia em D1 para D113 (P = 1,0000). Individualmente, apenas três leitões apresentaram quaisquer avaliações anormais durante este período de tempo. Duas leitoas apresentaram claudicação (um controle de desafio fêmea e um controle negativo fêmea) e uma baixa titulação de leitoa exibiu inchaço na região do pescoço esquerdo. Desde que a vacina foi administrada na região cervical direita, nenhum caso adverso associado com esta vacina foi anotado.

[000299] Os resultados de viremia de leitão PRRS no DOF deu mais conhecimento para o nível de proteção em leitões na prevenção da infecção cruzada placentária de leitões. No DOF, uma média de 58,1% e 55,0% de leitões por leitão nos grupos de elevada titulação, de uma maneira respectiva de baixa titulação e, qPCR foram positivos. Inver-samente, uma média de 86,3% leitões por leitões no grupo de controle exposto foram qPCR no soro positivo em fluidos/corpo, o que foi signi- ficativamente mais elevado do que ambos os grupos de vacina (P < 0,0381). Quando o leitão de carga viral no DOF 0 foi examinado, os leitões de elevada titulação tinham carga viral significativamente menor em comparação a desafiar leitões de controle (P = 0,0030), enquanto nenhuma diferença foi detectada para a carga viral entre baixa titulação e leitões de controle de desafio (P = 0,0620) . As reduções significativas (P < 0,05) no percentual de leitões por leitão positivo para viremia indicam redução da transmissão vertical do PRRSV virulenta de dourada vacinados para fora da primavera, quando imunizados com a dose de PRRS UE 94881 MLV. Além disso, o grupo de elevada titulação tinha um valor médio por leitão de qPCR de leitão de 3,00 log10 da GE/ml no raso, enquanto que o grupo de controle exposto tinha um valor médio por leitão qPCR leitões de 6,40 log10 da GE/mL em so- ro/fluidos corporais (P = 0,0030). Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre o grupo de dose baixa e o grupo de controle do desafio para leitão carga viral no DOF (P = 0,0620). Estes dados apoiam ainda a eficácia da dose mais elevada de PRRS 94.881 MLV quando administrada a leitões jovens e leitoas.

[000300] Os grupos de elevada titulação e de baixa titulação exibiram o meio de 32,5% e 33,4% , de uma maneira respectiva, para os leitões por ninhada com doença clínica (pontuação clínico de observação > 0) para pelo menos um dia de DOF para uma DOF +20. Estes resultados foram significativamente inferiores aos do grupo de controle exposto, que exibiu uma média de 91,6% leitões por ninhada para o mesmo parâmetro (P < 0,0001), apoiando ainda mais a eficácia da vacina para ambos os níveis de dose.

[000301] Não houve diferença significativa entre os grupos para leitão de meio de peso corporal em DOF 0 (P > 0,2972), enquanto os dois grupos de vacinas tinham significativamente maiores pesos sobre DOF 20 e GPMD do DOF 0 a DOF 20 (P < 0,0028). Uma vez mais, estes resultados confirmam a eficácia de ambas as doses de PRRS 94.881 MLV.

[000302] Os resultados de necropsia confirmaram a classificação correta de quase todos fetos no parto. Devido ao número muito pequeno de fetos que foram listados como esmagado que eram realmente natimortos e natimortos que foram realmente esmagados no parto, em comparação com o número total de fetos corretamente categorizadas no parto, não foram feitas alterações para os dados de desempenho dos leitões que foram analisados. Um controle de desafio de leitão morreu posteriormente à coleta de sangue. Uma vez que esta situação envolveu somente um leitão em relação ao grande número total de leitões no grupo de controle exposto, este leitão não foi removido a partir das análises.

[000303] As amostras de pulmão foram coletadas a partir de 141, 79, 75 e 4 fetos mortos/leitões a partir do controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação, e os grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Um valor de pulmão de média qPCR de 4,68, 4,10, 3,55 e 0,00 log10 GE/mL foi determinada para o controle de desafio, de baixa titulação e elevada titulação e grupos de controle negativos, de uma maneira respectiva. Nenhuma das análises foram conduzidas nestes dados uma vez que os leitões vivos ao fim de 20 dias de idade não foram autopsiados, mas estes resultados indicam que leitões jovens vacinados com PRRS 94.881 MLV resultou na carga viral mais baixa nos pulmões dos leitões, quando os animais foram desafiados com uma VSRRS virulento.

[000304] Em conclusão, os resultados deste estudo demonstraram significativamente percentuais mais elevados de leitões vivos por litro no parto (P < 0,0455) e porcentagens mais elevadas e número de leitões por litro ao desmame (P < 0,0203) para ambos os grupos de vacina em comparação com o grupo de controle de desafio. Dessa manei- ra , o objetivo do estudo foi cumprido e os dados deste estudo estabelece o MID de PRRS 94.881 MLV em leitões como 1 x 102,43 TCID50/2 mL. Estes resultados foram obtidos 118 dias após a vacinação, que além estabelece duração da imunidade (DOI) em leitões de cerca de 4 meses.

[000305] Quando os dados de apoio foram examinados, a alta dose de PRRS 94.881 MLV (1 x 103,90 TCID50/2 mL) foi associado com uma maior percentagem e número de leitões saudáveis por leitão no parto (P < 0,0211), percentual menor e número de fetos fracos e mumificados (P < 0,0090), uma menor percentagem de qPCR de leitões positivos e carga viral menor em leitões pós-desafio em D125, DOF DOF 0 e 13 (P < 0,0155), uma menor percentagem de leitões por leitão qPCR carga viral positiva e inferior leitão no DOF 0 (P < 0,0030), uma menor percentagem de leitões por leitão com doença clínica (P < 0,0001), e maiores pesos corporais de leitões na DOF 20 e GMD (P < 0,0013).

[000306] O grupo de baixa dose foi associado com uma maior per-centagem de leitões saudáveis por leitão no parto (P = 0,0138), uma menor percentagem e número de fetos mumificados (P < 0,0190), uma menor percentagem de qPCR leitões positivas e menor viral carga em leitões pós-desafio em D125, D132, DOF DOF 0 e 13 (P < 0,0290), uma menor percentagem de leitões por qPCR de leitão positivo no DOF 0 (P = 0,0381), uma menor percentagem de leitões por leitão com clínica doença (P < 0,0001) e maior peso dos leitões em DOF 20 e GMD (P < 0,0028).

Exemplo 7 - Avaliação do início de imunidade PRRS 94.881 MLV em leitões sensíveis seguindo ao desafio com uma heterólogo isolado eu-ropeu de PRRS com duas semanas pós-vacinação

[000307] O objetivo deste estudo de desafio da vacinação era avaliar o início da imunidade (OOI), duas semanas após a administração da vacina candidata e Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, isolado europeu derivado 94.881, de vírus vivo modificado (MLV PRRS 94881) a 14 ± 3 dias de idade leitões sensíveis. O critério de eficácia primário para satisfazer uma OOI de 2 semanas após a vacinação era se o grupo vacinado (Grupo 1) mostraram uma diferença significativa (p < 0,05) para lesões do pulmão pós-desafio em relação ao grupo de controle exposto não vacinado (Grupo 2). Os parâmetros secundários incluíram a avaliação clínica após a vacinação, as observações clínicas após o desafio, temperatura retal, ganho de peso médio diário, avaliação de anticorpos PRRS e viremia em amostras de soro e de quantificação do vírus da PRRS em amostras de pulmão coletadas na necropsia.

[000308] Os leitões foram aleatoriamente designados para o Grupo 1 (PRRS 94.881 vacina MLV contendo 1 x 103,82 TCID50/mL e desafio n = 20), Grupo 2 (vacina placebo e desafio n = 20) e Grupo 3 (vacina placebo e não desafiados, n = 10). Os leitões foram alojados em baias de plástico com pisos elevados (n = 5/pen). Cada grupo de tratamento foi alojado em uma sala diferente para evitar a transmissão de PRRSV por vias mecânicas, incluindo aerossóis.

[000309] Todos os animais atribuídos a este estudo completaram o estudo. Não foram relatados casos adversos durante o estudo. As Pontuações de lesão do pulmão da média de D24 foram de 27,4% e 54,8% para os Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva. A pontuação de lesão do pulmão média dos Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 foi significativamente menor do que os controles de desafio (p = 0,0002) e, portanto, a variável de eficácia primária foi cumprido eo OOI foi estabelecida em duas semanas após uma única vacinação. Uma proporção significativamente maior de Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 apresentaram titulação PRRS-anticorpos positivos em D14, D17 e D21 em relação aos controles de desafio (p < 0,0012). A AUC média de viremia foi significativamente menor para Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 em relação ao desafiar controles para D17-D24 (50,72 e 54,61 log10 GE/mL, de uma maneira respectiva, p = 0,0039) após o desafio. Os suínos vacinados PRRS-MLV 94.881 não exibiram sinais de letargia (0%) após o desafio em comparação com 45% dos suínos de controle exposto (p = 0,0012). Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 tiveram maiores ganhos de peso durante a fase de pós- desafio (SD14-SD24) do estudo em relação aos controles de desafio (0,3 e 0,1 kg, de uma maneira respectiva, p = 0,0003).

[000310] A redução significativa (p < 0,05) das lesões do pulmão, os sinais clínicos, a replicação do vírus no sangue e nos pulmões pós- desafio, bem como a melhoria dos desempenhos de crescimento nos animais vacinados demonstrar a eficácia da vacina contra PRRSV vi-rulento quando o desafio é realizado duas semanas após a vacinação. Por conseguinte, apoiá-se a manifestação de um início de imunidade de pelo menos 2 semanas após a vacinação com PRRS 94.881 MLV.

Objetivos/efeitos de estudo

[000311] O objetivo deste desafio de estudo de vacinação era avaliar o início da imunidade (OOI), duas semanas após a administração da vacina candidata e Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, isolado europeu derivado 94.881, de vírus vivo modificado (MLV PRRS 94881) a 14 ± 3 dias de idade leitões sensíveis. O critério de eficácia primário para satisfazer uma OOI de 2 semanas após a vacinação era se o grupo vacinado (Grupo 1) mostraram uma diferença significativa (p < 0,05) diminuídos em lesões do pulmão pós-desafio em relação ao, o grupo de controle exposto não vacinado (Grupo 2).

[000312] Os parâmetros secundários de eficácia analisados entre o grupo vacinado e o grupo de controle do desafio incluiram as avaliações clínicas pós-vacinação, sorologia PRRS, viremia PRRS pós- desafio, observações clínicas pós-desafio, o ganho de peso médio diá- rio (GPMD), temperatura retal e quantificação de pulmão PRRSV.

[000313] Um grupo de controle negativo (Grupo 3), que não foi vacinado ou desafiado, foi incluído no estudo para demonstrar a manada estava livre fonte de infecção de VSRRS em todo o período de teste, e que não foi violada a biossegurança durante este ensaio. Agenda de Casos Tabela 7.1 Calendário de Casos

Desenho do Estud Tabela 7.2 Estudo o de projeto

Critérios de Cegueira

[000314] O investigador do estudo e os designados foram cegos para os grupos de tratamento designados durante a fase do estudo em vida. Para manter essa cegueira, um indivíduo que não participou nas avaliações dos suínos (isto é, as avaliações clínicas, observações clínicas ou necrópsias) realizou a randomização e administrou o IVP atribuído e tratamentos de PB sobre o D0. O pessoal de laboratório Bivi foi cegado para o tratamento de cada suíno recebido durante a realização de suas respectivas tarefas. Materiais Produto Veterinário de Investigação (IVP) e Produto de Controle (CP) Tabela 7.3 IVP

Tabela 7.4 CP

Material de Desafio Tabela 7.5 Material de Desafio

Tratamentos Justificação da Dosagem

[000315] O PIV foi administrado como uma dose de 1,0 mL aos suínos designados para avaliar OOI de PRRS 94.881 MLV às 2 semanas pós-vacinação. O PC foi administrado como uma dose de 1,0 ml para os grupos 2 e 3, como uma vacina de placebo.

[000316] O regime de dosagem

[000317] IVP ou CP foi administrado a um suíno atribuindo IM na re- gião direita do pescoço em D0 usando uma seringa estéril de 3,0 mL de Luer-lock e estéril 20g x 1 polegada (2,54 cm) ou agulha de 18g x % polegadas (1,91 cm) por uma pessoa que não a coleta de dados do estudo. O regime de dosagem é mostrado abaixo na Tabela 7.6. Tabela 7.6 regime posológico

Informações animal Detalhes de estudo dos Animais Tabela 7.7 Informações do animal

CRITÉRIOS DE NCLUSÃO/EXCLUSÃO

[000318] Todos os leitões incluídos neste estudo foram PRRS ELISA negativo e eram saudáveis no momento da vacinação, conforme de-terminado pela observação.

CRITÉRIOS DE REMOÇÃO DE PÓS-INCLUSÃO

[000319] Nenhum dos suínos foram retirados do estudo.

GESTÃO E ALOJAMENTO DO ANIMAL

[000320] Alojamento dos Animais

[000321] Os leitões foram alojados em Veterinary Resources, Inc. (VRI) em Cambridge, IA para o período de duração do estudo. Grupos 1, 2 e 3 foram alojados em uniformidade, mas separados ems alas para garantir a biossegurança. Os leitões foram alojados em várias baias (5 leitões/baia) dentro de cada sala. O Grupo 1 foi instalado em quatro baias na sala 5, o Grupo 2 foi alojado em quatro baias na sala 6 e Grupo 3 foi alojado em duas baias na sala 4. As baias consistiram em banheiras de plástico sobre pedestais com piso ripado de plástico. Cada baia continha um alimentador de 6 buracos de plástico e um bebe- dourode bico. Cada sala de isolamento foi construída de forma idêntica a outra e todas são de nível de risco biológico 2 (BL2) cumprido, hepa- filtrado, em ventilação mecânica com termostato de controle de temperatura regulada.

[000322] O tratamento do grupo de isolamento foi necessário neste estudo, uma vez que é bem conhecido na comunidade científica que PRRSV rapidamente se espalha de um suíno para através de vários mecanismos, incluindo aerossóis. Isto inclui vacinas avirulentss de PRRS vivos como esses produtos biológicos incluem partículas de vírus atenuados que imitam as características de PRRS de tipo selvagem virulenta sem a capacidade de causar a doença. Os métodos apropriados estavam no local para garantir que a biossegurança fosse mantida e que os animais vacinados não acidentalmente contaminassem os animais não vacinados com PRRSV ingênuos do controle negativo. As medidas adequadas foram tomadas pela equipe do laboratório de ensaio ao limpar e desinfectar cada sala antes de seu uso para este estudo de forma adequada.

[000323] Cada sala do estabelecimento tem ventiladores e aquecedores para ajudar na circulação de ar suficiente e aquecimento. O sis- tema de ventilação é separado ainda idêntico para cada sala, para que o ar não seja compartilhado entre as salas.

[000324] Os alimentos sólidos foram armazenados em sacos livre de vermes. A água foi fornecida ad libitum. Os leitões foram alimentados com uma ração comercial (Métricas Lean infantil, Purina Mills, St. Louis, MO) medicado com tiamulina (35 g/ton) e clortetraciclina (400 g/ton) ad libitum apropriado para o seu tamanho, idade e condição, de acordo às práticas de criação de animais aceitáveis para a região.

[000325] Os suínos estavam em bom estado de saúde e estado nutricional antes do início do estudo, conforme determinado pelo investigador do estudo.

[000326] Durante o estudo, os animais selecionados foram observados com perda leve de condição corporal, a aparência de cabelos bruto, inchaço nas articulações e vários graus de claudicação. O investigador do estudo considerou todas estas sejam as condições não específicas que ocorrem geralmente em grupos de suínos alojados em confinamento. Tosse, espirros, respiração rápida, dispnéia e leve a moderada letargia também foram observados em determinados suínos após o desafio e foram considerados sinais clínicos típicos associados com pneumonia, embora não específico para a etiologia. O investigador do estudo determinou que os tratamentos concomitantes não foram necessários para os animais durante o estudo.

[000327] Todos os suínos atribuídos a este estudo foram eliminados por meio da incineração comercial após a eutanásia e necropsia em D24. Não há produtos alimentares de animais incluídos no estudo entrou na cadeia alimentar humana. Avaliação da eficácia

[000328] Para avaliar a OOI de PRRS 94.881 MLV em duas semanas após a vacinação, Grupos 1 e 2 foram desafiados em D14 e lesões do pulmão pós-desafio foram avaliadas. Uma OOI de 2 semanas após a vacinação foi conseguida se o Grupo 1 (dose imunizante mínima de PRRS 94.881 MLV) demonstraram uma redução significativa (p < 0,05) patologia do pulmão de pós-desafio em relação com o grupo de controle exposto (Grupo 2).

[000329] Os parâmetros secundários de eficácia analisados entre o grupo vacinado e o grupo de controle do desafio incluíram as avaliações clínicas após a vacinação, observações clínicas após o desafio, temperatura retal, peso corporal e ganho de peso médio diário (GPMD), a avaliação de anticorpos PRRS e viremia no soro amostras e quantificação do vírus da PRRS em amostras de pulmão coletadas na necropsia.

[000330] Um grupo de controle negativo (Grupo 3), o qual não foi de-safiado, foi incluído no estudo para demonstrar a manada estava livre fonte de infecção de PRRS e que biossegurança foi mantida ao longo do estudo. CRITÉRIOS PARA UM TESTE VÁLIDO

[000331] As amostras de soro pré-compra e D0 foram todos obrigadas a serem negativas para os anticorpos contra PRRS.

[000332] As amostras de soro coletadas de Grupos 2 e 3 até o dia do desafio e do Grupo 3, até a conclusão do estudo tiveram que ser livre de PRRS anticorpos para que o estudo fosse válido.

[000333] PARÂMETROS DE RESULTADO PRIMÁRIO

[000334] A variável de eficácia primária para avaliação estatística foi Pontuações de lesão total do pulmão em D24 do estudo. Pontuações Totais de lesão do pulmão

[000335] No dia 24, depois foram recolhidos dados e amostras e gra-vadas, todos os suínos do estudo foram sacrificados após VRI SOP PRC1027 (Anexo 1, Anexo 8). Cada suíno foi necropsiado, de acordo com VRI SOP PRC 1028 A cavidade torácica foi exposta por uma pessoa designada e o coração e os pulmões foram retirados. O investigador do estudo examinou cada par de pulmões, descreveu qualquer patologia grave observou e determinou a patologia % para cada lóbulo do pulmão. As observações e os dados foram registrados no formulário de Reporta-gem de Recorde de necropsia . A pontuação total da lesão do pulmão foi determinada para cada suíno usando a fórmula EP. PARÂMETROS FAVORÁVEIS

[000336] Outros parâmetros a serem analisados entre o Grupo 1 e o grupo 2 incluíram as avaliações clínicas pós-vacinação, Sorologia PRRS, viremia pós-vacinação, observações clínicas pós-desafio, GPMD, temperatura retal e pulmão vírus quantificação após o desafio. Estes parâmetros foram analisados como parâmetros de apoio e não servem como parâmetros primários para satisfazer o objetivo do estudo. AVALIAÇÃO CLÍNICA

[000337] Todos os animais foram observados nos dias descritos na Tabela 7,1 por avaliações clínicas pós-vacinação pelo investigador do estudo ou designados. As observações foram registradas no formulário de registro de Avaliação Clínica. SOROLOGIA PRRS

[000338] O sangue venoso foi recolhido nos dias delineados na Tabela 3. Resumidamente, cerca de 2 a 5 mL de sangue foi coletado de cada leitão em um tubo separador de soro de tamanho adequado (SST). As coletas foram registradas no formulário de registro coleta da amostra. Sangue em SST foi deixado coagular à temperatura ambiente. Amostras de sangue foram entregues para BIVI-Ames, no dia da coleta de amostras e formulário de registro de entrega foi concluído. As amostrasde sangue foram centrifugadas por BIVI-Ames e o soro foi colhido, dividido e transferido para os tubos apropriados. Cada tubo foi marcado com o número de leitões de identificação, o número do estudo, a data da colheita, no dia do estudo e o tipo de amostra. Em BIVI- Ames, uma série de amostras de soro foi realizada a 2 a 8 ° C e o ou- tro conjunto de amostras de soro foi mantida a -70 ± 10 ° C.

[000339] As amostras de soro coletadas dias 0, 7, 14, 17, 21 e 24 e mantidos a 2 a 8 ° C foram testadas por BIVI-Ames para detecção de an-ticorpos de PRRS. Os resultados foram relatados como negativo (Pro-porção ELISA de < 0,4 S/P) ou positivo (ELISA > proporção de 0,4 S/P). Viremia PRRS

[000340] O outro conjunto de amostras de soro colhidas nos dias 0, 7, 14, 17, 21 e 24 e mantidas a -70 ± 10 ° C em BIVI-Ames até a fase do estudo em vida foi completado.

[000341] Um Modelo de formulário registro de entrega concluída foi incluído com a expedição. As amostras de soro testadas em BIOSCREEN de RNA PRRSV por qPCR. Os resultados foram relatados como genoma equivalente/mL (log da GE/mL). Observações clínicas pós-desafio

[000342] Os leitões foram observados com sinais clínicos da doença nos dias descritos na Tabela 7.1. As observações foram realizadas pelo investigador do estudo ou designados e foram registrados no formulário de registro da observação clínica. Os leitões foram observados diaria-mente para a respiração, o comportamento e tosse com base no sistema de pontuação de observação clínica descrito abaixo na Tabela 7.8. Tabela 7.8 Sistema de Pontuação de Observação Clínica

Ganho de Peso Médio Diário (GPMD)

[000343] Os pesos corporais individuais foram recolhidos nos dias deli-neados na Tabela 3. Cada suíno foi pesado em uma balança calibrada pelo investigador do estudo ou designados. Os resultados foram apre- sentados em kg no formulário de registro do peso corporal. Ganho de peso médio diário foi determinado a partir do D0 a D14 e da D14 a D24. Temperatura retal

[000344] As temperaturas retais foram recolhidas pelo investigador do estudo ou designadas nos dias descritos na Tabela 6.1. A temperatura retal foi registrada em ° C no formulário de registro da observação clínica. Quantificação do vírus PRRS no tecido do pulmão

[000345] Para cada conjunto de pulmões, foram mantidas duas amostras dos lóbulos esquerdo e direito apicais, os lóbulos cardíacos direito e esquerdo, os lóbulos diafragmáticos esquerdo e direito e o lóbulo intermediário,. Cada uma das amostras de pulmão foi de cerca de 1 polegada (2,54 cm) x 1 polegada (2,54 cm). Para um conjunto de amostras de pulmão, todas as três amostras a partir do lado esquerdo foram combinadas em um recipiente, enquanto que todas as três amostras a partir do lado direito e do pulmão da amostra do lóbulo In-termediário foram combinadas em um outro recipiente. Cada recipiente foi cheio com uma quantidade suficiente de solução de formalina a 10% . Para outro conjunto de amostras de pulmão, todas as três amostras de pulmão a partir do lado esquerdo foram combinadas em um Whirlpak ®, enquanto que todas as três amostras a partir do lado direito e do pulmão da amostra do lóbulo Intermediário foram combinadas em outro Whirlpak ®. Todos os recipientes e Whirlpaks ® foram devidamente rotulados com o número do animal, número estudo, data da colheita, dia de estudo, tipo de amostra e se as amostras são do lado esquerdo ou direito. As amostras do pulmão, em Whirlpaks ® foram armazenadas em gelo seco, até transportados para BIVI-Ames, enquanto as amostras em formalina foram armazenadas à temperatura ambiente. As coletas foram registradas no formulário de Recorde de Reportagem de Necropsia. As amostras de tecido do pulmão fixadas em formol e as amostras de pulmão Whirlpak ® foram transferidas para BIVI-Ames. Um Modelo de formulário de registro de entrega concluída foi incluído com cada embarque.

[000346] Um Modelo de formulário de registro de entrega concluída foi incluído com a expedição. As amostras de pulmão testadas em BIOSCREEN de RNA PRRSV por qPCR (Anexo 1, Anexo 7). Os tecidos do pulmão esquerdo foram homogeneizados e testados. Os tecidos do pulmão esquerdo e amostras do lóbulo do pulmão intermediário foram homogeneizados e testados. Os resultados foram relatados como equivalente do genoma (log da GE/mL) para as amostras de pulmão esquerdo e direito. CASOS ADVERSOS

[000347] Não foram relatados casos adversos durante o estudo. MÉTODOS ESTATÍSTICOS UNIDADE EXPERIMENTAL

[000348] Os grupos de tratamento tiveram que ser alojados em salas separadas neste estudo para evitar a transmissão do PRRSV a grupos não vacinados. Portanto, a sala foi a unidade experimental. No entanto, para os fins da presente análise, o possível viés devido ao confun- dimento "sala" e efeitos "tratamento" foram ignorados, e leitão foi utilizado como unidade experimental. RANDOMIZAÇÃO

[000349] 50 (cinquenta) leitões foram bloqueados por peso (n = 5 leitões/bloco). Cada suíno foi atribuído um número aleatório com a função de números aleatórios no Excel. Dentro de cada bloco de peso, os suínos foram classificados em ordem numérica crescente do número aleatório atribuído. Os grupos de tratamento foram então atribuídos aos suínos nesta ordem numérica : os dois menores números aleatórios foram atribuídos ao Grupo 1, os próximos dois números foram atribuídos ao Grupo 2 e o maior número foi atribuído ao Grupo 3. Gru- pos 1 e 2 cada um continha 20 suínos e Grupo 3 continha 10 suínos. ANÁLISE

[000350] As análises estatísticas e sumários de dados foram conduzidas pelo Dr. rer. classe etária. Martin Vanselow, Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Alemanha, +49 (0) 511 606 777 650, m.vanselow@t-online.de.

[000351] Os dados foram analisados assumindo uma estrutura de design completamente aleatória. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SAS versão 8.2 (SAS, Cary, EUA/North Carolina, SAS Institute Inc. Todos os testes sobre diferenças foram concebidos como dois lados testes em α = 5%. Pontuações Totais de lesão do pulmão

[000352] A pontuação da lesão do pulmão total no dia da necropsia (D24) foi medida como a percentagem do envolvimento do pulmão calculado segundo a fórmula de ponderação recomendada no projeto de monografia Suína vacina contra pneumonia enzoótica (inativada). Esta fórmula tem em conta o peso relativo de cada um dos sete lóbulos do pulmão. A porcentagem de área avaliada do lóbulo do pulmão com lesões típicas foi multiplicada pelo respectivo fator por meio do lóbulo do pulmão dando o total ponderado das pontuações de lesões do pulmão. Os fatores para os respectivos lóbulos do pulmão são apresentados na Tabela 7.9. Tabela 7.9 Elementos de Pontuações de cálculo da lesão do pulmão

[000353] Os grupos de tratamento foram comparados as diferenças por meio do teste Mann-Whitney, Wilcoxon. Avaliação clínica pós-vacinação

[000354] Tabelas de frequência de animais com pelo menos um resultado positivo entre D1 e D12 foram geradas. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher. Sorologia PRRS

[000355] As tabelas de frequência de resultados positivos ELISA foram gerados. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher. Viremia de PRRS

[000356] Os dados viremia foram avaliados separadamente para cada dia de investigação. Além disso, para a carga viral foram analisadas as áreas sob as curvas de resposta individuais entre D14 e D24 (AUC D14-D24) e entre D17 e D24 (AUC D17-D24).

[000357] Os dados de PCR quantitativo (carga viral PRRS [log10 GE/ml]) foram utilizados para comparações entre os grupos de tratamento pelo teste de Mann-Whitney, Wilcoxon. Antes dos cálculos do resultado analítico 'não detectado' foi substituído por um GE/mL valor log10 de 0,0 e "positivo" foi substituído por 3,0. Os grupos de tratamento foram testados em diferenças utilizando o teste de Mann- Whitney Wilcoxon. Observações clínicas pós-desafio

[000358] As tabelas de frequência de animais com pelo menos um resultado positivo entre D15 e D24 foram geradas. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher.

[000359] As pontuações máximas e as contagens médias por animal provenientes em D15 a D24 para a respiração, o comportamento, a tosse e para todos os três somados (total) foram usadas para a avaliação estatística. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste de Mann-Whitney Wilcoxon. Peso corporal e ganho de peso médio diário

[000360] O ganho de peso diário individuais foram calculados para os períodos de tempo entre D0 e D14 e entre D14 e D24. Para cada dia de investigação e para cada período de tempo foram calculadas as estatísticas descritivas. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas usando a análise de variância e teste t subsequente. As médias dos quadrados mínimos dos grupos e as diferenças entre as médias dos quadrados mínimos com intervalos de confiança de 95% foram calculadas a partir da análise de variância. Temperatura retal

[000361] As diferenças entre os grupos de tratamento com relação aos dados de temperatura originais foram testadas pela análise de variância e teste t subsequente. As médias dos quadrados mínimos dos grupos e as diferenças entre as médias dos quadrados mínimos com intervalos de confiança de 95% foram calculadas a partir da análise de variância. A quantificação do vírus PRRS em tecidos do pulmão

[000362] Os dados da PCR quantitativa (PRRS carga viral [ log10 GE/ml ]) de pulmões coletados no D24 foram utilizados para comparações entre os grupos de tratamento pelo teste de Mann-Whitney, Wilcoxon. As médias (log10 da GE/mL) dos resultados de qPCR pulmão esquerdo e direito foram usadas para a avaliação. Antes os cálculos o resultado analítico "não detectado" foi substituído por log10 GE/mL de 0,0 e "positiva" foi substituído por 3.0.

[000363] As tabelas de frequência de resultados positivos qPCR foram geradas. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher.

RESULTADOS Total de Pontuações de lesão do pulmão

[000364] Um sumário do total do grupo Pontuações de lesão do pulmão e os associados p valor é mostrado na Tabela 7.10. Tabela 7.10 Total de Pontuações de lesão do pulmão (%)

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NI = Não incluído na análise estatística.

[000365] A média de leitão D24 no total de Pontuações de lesão do pulmão foi 27,368% e 54,841% para o grupo vacinado por PRRS MLV 94,881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva. A pontuação de lesão para os suínos PRRS vacinados foi significativamente menor do que a pontuação média de lesão para os controles de desafio (p = 0,0002). Viremia PRRS

[000366] O sumário do RNA PRRSV detectado no soro por dados qPCR é mostrado abaixo na Tabela 7.11. Tabela 7.11 PRRSV RNA detectado por qPCR em Soro (log10 GE/mL) por dia

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NI = Não incluído na análise estatística. AUC = Área sob a curva, GE/ml por dia

[000367] RNA PRRSV não foi detectado no soro de todos os leitões no D0. Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 tinham valores médios de 3,17 e 3,30 log10 GE/mL em D7 e D14, de uma maneira respectiva. Os valores foram significativamente maiores do que os controles de desafio em ambos os dias (p < 0,0001), como controles de desafio não tinha qualquer RNA PRRSV detectado até D17. Naquele dia, os valores médios foram de 6,78 e 8,00 log10 GE/mL para PRRS 94.881 leitões vacinados com MLV e os controles de desafio, de uma maneira respectiva. O valor D17 para os controles de desafio foi significativamente maior do que os de leitões vacinados com PRRS-MLV 94.881 s (p < 0,0001). Valores para Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 significa em D21 e D24 foram 7,51 e 7,26 log10 GE/mL em D21 e D24, de uma maneira respectiva, em comparação com 7,88 e 7,34 log10 GE/mL para controles de desafio nos mesmos dias. Não houve diferenças significativas entre Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 em D21 ou 24 (p > 0,0565). Nenhum RNA PRRSV foi detectado no soro de um suíno de controle negativo, durante este estudo.

[000368] Não houve diferenças entre a AUC 14-24 para Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 e os controles de desafio suínos (65,84 e 66,61, de uma maneira respectiva, p = 0,4945). Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 tiveram uma AUC significativamente menor para D17-D24 em relação aos controles de desafio (50,72 e 54,61, de uma maneira respectiva, p = 0,0039). A quantificação do vírus PRRS em tecidos do pulmão

[000369] Os resultados de PRRSV qPCR individuais de tecidos do pulmão coletados na necropsia em D24 são apresentados no Adendo 1, Tabela 30. Um sumário do RNA PRRSV detectado em tecidos do pulmão por dados qPCR é mostrado a seguir apresentados na Tabela 7,12, e um sumário da frequência de animais com qPCR positivo na necropsia é mostrado abaixo na Tabela 7.13. Tabela 7.12 Isolamento dos vírus do pulmão, qPCR (média log10 GE/mL) em Necropsia (D24)

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NA = Não se aplica devido à falta de variabilidade. NI = Não incluído na análise estatística. Tabela 7.13 Frequência de animais com Possível PRRSV RNA rPCA a partir de tecidos do pulmão coletados em Necropsia (D24)

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NA = Não se aplica devido à falta de variabilidade. NI = Não incluído na análise estatística.

[000370] RNA PRRSV foi detectado nos tecidos do pulmão de todos os leitões tanto no grupo vacinado com PRRS-MLV 94881 e todos os leitões no grupo de controle exposto. Não houve diferença entre os grupos. RNA PRRSV não foi detectado nas amostras de pulmão de leitões de nenhum controle negativo. Observações clínicas pós-desafio

[000371] A frequência de leitões com pelo menos um pontuação de avaliação clínica positiva no período pós-desafio (D15-D24) é mostrada na Tabela 7.14. Tabela 7.14 Frequência de leitões com um Posto de Observação Positiva do Desafio Clínico (D15-D24)

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NI = Não incluído na análise estatística.

[000372] A respiração alterada foi observada em ambos os grupos vacinados com PRRS - MLV 94881 (10%) e no grupo de controle exposto (30%), no entanto, estes valores não foram significativamente diferentes (p = 0,2351).

[000373] O comportamento anormal só foi observado no grupo de controle exposto (45%), e não no grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 (0%). Um grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 teve uma incidência significativamente menor de comportamento anormal que os controles (desafio p = 0,0012).

[000374] A tosse foi observada em ambos os grupos vacinados com PRRS - MLV 94881 (30%) e no grupo de controle exposto (55%). Estes valores não foram significativamente diferentes (p = 0,2003).

[000375] O percentual de leitões com Pontuações totais clínicos > 0 foram de 30% e 65% para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. Estes valores não foram significativamente diferentes (p = 0,0562).

[000376] Não foram observados sinais clínicos no grupo de controle negativo, em qualquer momento após o desafio.

[000377] Um sumário das pontuações máximas de observação clínica do grupo para o período pós-desafio (D15 por D24) é mostrado na Tabela 7.15. Tabela 7.15 Pós-desafio Máximo de pontuações clínicas, D15 através de D24

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NI = Não incluído na análise estatística.

[000378] A respiração anormal foi observada tanto no grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o controle de desafio após a administração do desafio, com pontuação máxima de 1 (respiração ofegan- te/rápida) e 2 (dispnéia), de uma maneira respectiva. Não houve diferença significativa entre as pontuações de respiração (p = 0,1872). A média da pontuação máxima de respiração é 0 para ambos os grupos.

[000379] Nenhum comportamento anormal foi observado no grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 no período pós-desafio (pontuação máxima = 0). Em contraste, o grupo de controle do desafio teve uma pontuação máxima de comportamento de 1 (leve a moderada letargia, p = 0,0012), embora a pontuação média para este grupo é 0. A pontuação máxima para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 foi signi-ficativamente menor do que a pontuação para o grupo de controle do desafio (p = 0,0012). A media das pontuações máximas de comporta-mento foi de 0 para ambos os grupos.

[000380] A tosse foi observada em ambos os grupos vacinados com PRRS - MLV 94881 e no grupo de controle exposto após o desafio. As pontuações máximas foram de 1 (tosse suave ou intermitente) e 2 (, tosse repetitiva severa ou grave), e as pontuações médias foram de 0 e 1, para PRRS 94.881 controles de desafio MLV-vacinados e, de uma maneira respectiva. Não houve diferenças significativas entre os grupos (p = 0,1129). A média da pontuação máxima de respiração foi de 0 e 1 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva.

[000381] Máximo de Pontuações totais foram de 1 e 4, e médias das Pontuações totais foram de 0 e 1 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. A pontuação máxima para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 foi significativamente menor do que a pontuação para o grupo de controle do desafio (p = 0,0072). Médias das pontuações totais foram de 0 e 1 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva.

[000382] Não foram observados sinais clínicos em D15 por D24 no grupo de controle negativo não desafiados durante este estudo. Esse grupo tinha uma pontuação máxima de 0 para cada parâmetro.

[000383] Um sumário do grupo de Pontuações médias de observação clínica para o período pós-desafio (D15 por D24) é mostrado na Tabela 7.16. Tabela 7.16 Pontuações clínicas da média Pós-Desafio, D15 através de D24

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NI = Não incluído na análise estatística

[000384] As pontuações médias de observação clínica seguiram um padrão semelhante a pontuação máxima clínica com diferenças signi-ficativas apenas observadas entre o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio para pontuação média de comportamento (p = 0,0012) e a média de pontuação total (p = 0,0103).

[000385] As medias das pontuações de respiração foram 0,02 e 0,07 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. As médias das pontuações de comportamento foram 0,00 e 0,12 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. As médias das pontuações de tosse foram 0,07 e 0,17 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. As médias das pontuações totais foram de 0,08 e 0,35 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva.

[000386] Não foram observados sinais clínicos em D15 por D24 nos controles negativos não desafiados durante este estudo. Este grupo teve uma pontuação média de 0 para cada parâmetro. Peso corporal e ganho de peso médio diário

[000387] Um sumário dos pesos corporais em D0, D14 e D24 e GPMD para D0 a D14 e D14 a D24 são apresentados na Tabela 7.17. Tabela 7.17 Peso corporal e ganho de peso médio diário (kg e kg/d)

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado.

[000388] Os pesos médios em D0 foram 4,1 e 4,2 kg para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. Por D14, as médias de peso corporal foram 7,6 e 7,4 kg para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. No D24, as médias do peso corporal foram de 10,3 e 8,9 kg para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. Ganho de peso médio diário (GPMD) para o período de vacinação (D0 a D14) foi de 0,25 e 0,23 kg/dia para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. ADWGs para o período de desafio (D14 a D24) foram 0,26 e 0,15 kg/dia para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. ADWGs para os controles negativos foram 0,23 e 0,34 kg/dia para os D0-D14 e D14-D24, de maneira respectiva.

[000389] Os leitões de controle negativo apresentaram peso médio do corpo de 4,1, 7,2 e 10,6 kg em D0, D14 e D28, de uma maneira respectiva.

[000390] Um sumário da média e LS análise estatística dos pesos corporais e GDPA para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle exposto é mostrado abaixo na Tabela 7.18. Tabela 7.18 Meio de peso corporal LS e Média de ganho de peso diá- ria (kg)

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado.

[000391] Dia 0 Média LSs do peso corporal foram 4,14 e 4,17 kg para os PRRS leitões vacinados com MLV 94.881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. A diferença foi de -0,03 kg, o que não foi significativamente diferente (p = 0,8743). No D14, Média LSs do peso corporal foram 7,64 e 7,39 kg para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. A diferença foi de 0,25 kg, o que também não foi significativamente diferente (p = 0,4297). No D24, Média LSs dos pesos corporais foram 10,26 e 8,87 para o grupo de 94.881 MLV-PRRS vacinados e o grupo de controle exposto, de uma maneira respectiva. A diferença neste dia foi de 1,39 kg, o peso no grupo vacinado era significativamente superior à do grupo de controle exposto (p = 0,0063).

[000392] Média LSs de ADWGs para o período de vacinação (D0D14) foram de 0,25 e 0,23 kg/dia para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. Estes valores não foram significativamente diferentes (p = 0,1889). Média LSs de ADWGs durante o período pós-desafio (D14D24) foram de 0,26 e 0,15 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. O GPD para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 foi significativamente maior do que o GPD para o grupo de controle exposto (p = 0,0003). Temperatura retal

[000393] O sumário da temperatura retal é mostrado abaixo nas tabelas 7.19 e 7.20. Um sumário da média e LS análise estatística da temperatura retal para a grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle exposto é mostrado abaixo nas Tabelas 7,21 e 7,22. Tabela 7.19 temperatura retal (° C) Dia 13-22

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. Tabela 7.20 Temperatura retal (° C) Dias 23 - 24

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratado com placebo e não desafiados Tabela 7.21 Média LS da temperatura retal (° C) Dia 13 ao Dia 20

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratado com placebo e não desafiados Tabela 7.22 Média LS da temperatura retal (° C) Dia 21 ao Dia 24

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MI D, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratado com placebo e não desafiados

[000394] A média e Média LS da temperatura retal dos leitões vacinados com PRRS-MLV 94.881 eram 39,77 ° C, no dia antes do desafio, e variou de 39,69 ° C (D15) a 40,68 ° C (D16) após o desafio. A média e a média LS da temperatura retal para os controles de desafio eram de 39,39 ° C, no dia antes do desafio e variou de 39,77 ° C (D16) a 40,61 ° C (D20) após o desafio. As médias dos quadrados mínimos temperatura retal foi significativamente menor para o desafio controla comparação com PPRS 94.881 leitões vacinados com MLV antes da administração desafio (D13 e D14) e no D16 após o desafio (p < 0,0001). Não houve outras diferenças significativas na temperatura retal entre Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 e os controles de desafio neste estudo (p > 0,0528). A média e a média LS de temperaturas retais para os controles negativos permaneceram < 39,68 ° C durante todo o estudo. Avaliação clínica pós-vacinação

[000395] Um sumário da percentagem de leitões com, pelo menos, um balanço positivo em D1 a D12 é mostrado abaixo na Tabela 7.23. Tabela 7.23 Percentual de leitões com pelo menos uma avaliação clí nica positiva em D1-D12

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NI = Não incluído na análise estatística.

[000396] Não há leitões tanto no grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 ou os controles negativos tiveram avaliação clínica durante o período de vacinação D-1 a D12. Leitão 110 no grupo de controle do desafio foi observada com uma ferida atrás da perna direita na frente início D9. Não houve diferença significativa entre 94.881 PRRS-MLV leitões vacinados e os controles de desafio para este parâmetro (p = 1,0000). Sorologia PRRS

[000397] Um sumário da frequência de leitões com titulação de anticorpos PRRS positivos, é mostrado na Tabela 7.24. Tabela 7.24 Frequência de leitões com titulação de anticorpos PRRS positivos por Dia

1 Grupo 1 = PRRS 94.881 vacina MLV em MID, desafiado, Grupo 2 = tratados com placebo, desafiado, Grupo 3 = tratados com placebo, não contestado. NA = Não aplicável, nenhuma análise conduzida. NI = Não incluído na análise estatística.

[000398] Todos os leitões em todos os grupos de tratamento foram anticorpo negativo PRRS em D0 e D7. Ao D14, 85% dos suínos vacinados com PRRS 94.881 MLV tinham titulação de anticorpos PRRS positivos. Este número aumentou para 95% , em D17 e foi 100% em ambos D21 e D24. Sem suínos no grupo de controle exposto desenvolveram titulação de anticorpos de PRRS-positivos até D21 (7 dias após a administração do desafio), quando 55% dos suínos tinham titulação positivos. Este valor aumentou para 95% , em D24. No D14, D17 e D21, os suínos Vacinados com PRRS 94.881 MLV tiveram uma proporção significativamente maior de suínos com titulação de anticorpos PRRS positivos em comparação com o grupo de controle do desafio (p < 0,0012). Nnehum dos suínos no grupo de controle negativo desenvolveram titulação de anticorpos de PRRS durante este estudo.

DISCUSSÃO/CONCLUSÃO

[000399] Para alcançar o objetivo do estudo, três grupos foram incluídos no projeto de estudo em D0 : um grupo que recebeu a vacina 1 x 103,82 TCID50 de PRRS 94.881 MLV (Grupo 1), um grupo de controle que recebeu desafio produto de controle (Grupo 2) e um grupo de controle negativo (Grupo 3), que também recebeu o produto controle.

[000400] 20 (vinte) Leitões saudáveis, suscetíveis a PRRS e sorone- gativos IM foram inoculados com 1 ml de PRRS 94.881 MLV em cerca de 14 dias de idade. Trinta (20 leitões - grupo de controle do desafio e 10 leitões - grupo de controle negativo) Leitões PRRS suscetíveis e soronegativos IM foram inoculados com 1 ml de produto de controle em cerca de 14 dias de idade.

[000401] Para determinar se um início de imunidade de 2 semanas para o PRRS 94.881 MLV foi alcançado, o grupo vacinado e o grupo de controle foram desafiados com o desafio 14 dias após a vacinação com uma heterólogo isolado europeu de PRRSV (isolado 205817) e avaliaram o pós- desafio para a redução relevante nas lesões do pulmão. Validação do estudo (grupo de controle negativo 3)

[000402] Para garantir que os leitões de origem estavam livres de PRRSV e que nenhuma exposição PRRSV estranho ou contaminação cruzada entre os grupos de tratamento e controle ocorreu durante o estudo, um grupo de controle negativo (Grupo 3) foi incluído no projeto de estudo. Os leitões do grupo de controle negativo foram negativos para PRRSV (viremia ; qPCR), bem como para detecção de anticorpos de PRRS durante todo o estudo, validando dessa maneira , este ensaio. Validação do modelo Desafio (Desafio do Grupo de Controle 2)

[000403] Um modelo de desafio que induz a doença clínica suficiente de PRRS é necessário avaliar adequadamente o início da vacina PRRS da imunidade em um ambiente de laboratório. Após a inoculação com isolado de PRRS europeus 205817, por meio do método descrito anteriormente, o grupo de controle exibiu um desafio significativo da temperatura retal > 40,50 ° C em D19, D20 e D23 D24 (< 39,68 ° C no mesmo dia, o grupo de controle negativo), um significativo GDPA de 0,15 kg/dia, em comparação com uma média de 0,34 GPD kg/dia no grupo de controle negativo a partir em D14 a D24, comportamento anormal, tosse, e uma pontuação de lesão média do pulmão de 55,2% (0,00% ; grupo de controle negativo). Esses resultados evidenciam que a doença clínica específica do PRRS grave foi induzida no grupo de controle exposto, embora a titulação do vírus de desafio foi ligeiramente menor do que a dose alvo, validando assim este modelo de desafio, como uma ferramenta de laboratório clínico adequada para avaliar a eficácia da vacina PRRS e mais especificamente , o OOI de PRRS 94.881 MLV. Determinação de duas semanas início da imunidade de PRRS 94.881 MLV (Grupo 1)

[000404] A determinação de uma início da imunidade (SOI) para PRRSV 94.881 MLV de 2 semanas após a vacinação foi baseada no grupo da vacina, exibindo uma (p < 0,05) redução significativa no pulmão após o desafio lesões comparado com o grupo de controle de desafio.

[000405] As lesões do pulmão foram selecionadas como o principal parâmetro para a determinação de duas semanas de OOI porque este parâmetro fornece a evidência mais clinicamente relevante e convincente de eficácia na avaliação de uma nova vacina dentro do modelo de desafio respiratório PRRS em suínos. O desenvolvimento de lesões de pulmão é uma das marcas de doença respiratória PRRS em suínos. As lesões do pulmão são frequentemente acompanhadas por manifestações subsequentes de características secundárias, tais como a doença de PRRSV de sinais clínicos, pirexia, diminuição GDPA, etc

[000406] O grupo Vacinado com MLV PRRS 94.881 apresentou uma redução significativa na patologia do pulmão bruto pós-desafio, como evidenciado pela média total de pontuação da lesão do pulmão de 27,6% em comparação com o grupo de controle exposto, que apresentaram uma pontuação total média da lesão do pulmão 55,2% (p = 0,0002). Dessa maneira , um OOI de 2 semanas para o PRRS 94.881 MLV com uma dosagem de 1 x 103,82 TCID50 foi estabelecido com base no parâmetro primário de uma redução significativa nas lesões do pulmão pós-desafio. Este resultado foi alcançado com uma dose de vacina, ligeiramente menor do que a dose imunizante mínima de 1 x 104,5 TCID50/dose.

[000407] A viremia pós-desafio foi escolhida como o parâmetro secundário mais importante, pois representa o nível de replicação viral e persistência que ocorre dentro do animal hospedeiro após a exposição. Uma redução significante (p < 0,05) em que a viremia corresponde com uma vacina de PRRS que induz a imunidade adequada para limitar PRRS patogênese dentro do hospedeiro. Aos 3 dias após o de- safio (D17), o grupo vacinado com PRRS -MLV 94881 foi associada com uma redução significativa da viremia média (qPCR), em comparação com o grupo de controle exposto (6,72 GE/mL vs 8,18 GE/ml, p < 0,0001) . Para avaliar ainda mais a viremia pós-desafio entre os grupos, foi calculada a quantidade da carga viral ao longo de um período específico de tempo após o estímulo, tal como representado como "área sob a curva" ou AUC. O grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 teve um valor médio de AUC D17 a D24 de 49,52 GE/mL/dia, enquanto o grupo de controle do desafio teve um valor médio de AUC 54,35 GE/ml/dia. O valor médio foi significativamente inferior da AUC para o grupo da vacina em comparação com o grupo de controle exposto a partir em D17 a D24 (p = 0,0039). Se a viremia foi examinado três dias após o desafio ou ao longo do período de pós-desafio, PRRS 94.881 MLV administrada duas semanas antes do desafio com uma cepa virulenta de PRRS europeu heterólogo de forma significativa (p < 0,05) reduziu a viremia após a inoculação desafio.

[000408] Em associação com uma redução de PRRS viremia pós- desafio, uma redução significativa (p < 0,05) na carga viral no tecido do pulmão também seria de grande importância sob o ponto de vista da imunidade vacina PRRS. Uma redução da carga viral no tecido do pulmão talvez associados com a estabilidade reduzida viral, replicação e persistência no interior do hospedeiro e, secundariamente, podem levar à diminuição da excreção de PRRSV para outros animais. Neste estudo, os tecidos do pulmão de PRRS-MLV 94881 grupo vacinado tinha uma média resultado qPCR pulmão de 7,46 log10 da GE/ml 10 dias após o desafio (D24), enquanto o grupo de controle exposto teve um resultado médio de qPCR de pulmão de 7,88 log10 da GE/mL. A diferença entre o grupo vacinado e o grupo de controle exposto foi significativa (p = 0,0101), apoiando assim ainda uma OOI de 2 semanas.

[000409] A redução acentuada gravidade e frequência dos sinais clí- nicos pós-desafio em leitões também seria favorável à PRRS a eficácia da vacina e estabelecimento de um OOI de 2 semanas para PRRS 94.881 MLV. Respiração anormal de gravidade e frequência suficiente, não foi observado em ambos os grupos após o desafio e não foram detectadas diferenças (p > 0,1394). Por outro lado, a severidade ea frequência de tosse foi mais ou menos igual entre os grupos e não houve diferença (p > 0,0835). Foram detectadas diferenças entre os grupos para a gravidade e frequência de um comportamento anormal (letargia) pós-desafio. Zero de 20 (0%) e 9 de 20 (45%), 94,881 PRRS- Vacinados com MLV e os leitões de controle de desafio, de uma maneira respectiva, exibiram um comportamento anormal por pelo menos um dia pós-desafio (p = 0,0012). Da mesma forma, o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 exibiu pontuações clínicas anormais máximas mais baixas e média clínica anormal pós-desafio em relação com o grupo de controle exposto (p = 0,0012). As pontuações clínicas totais (Pontuações da soma de respiração, comportamento e tosse) foram significativamente diferentes entre os grupos quando foram analisadas em relação à pontuação máxima e Pontuações médias em D15 a D24. Devido à influência das pontuações de comportamento anormal na pontuação total, o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 teve uma pontuação significativamente menor máximo total e menor média dA pontuação total em comparação com o grupo de controle do desafio (p < 0,0103). As diferenças entre os grupos para a gravidade e frequência dos comportamentos anormais apoiam mais uma OOI de duas semanas após a vacinação.

[000410] Pré-desafio, o grupo vacinado com MLV PRRS 94881 tinha um pouco maior média temperatura retal em comparação com o grupo de controle do desafio em D13 (39,77 ° C versus 39,39 ° C, de uma maneira respectiva, p < 0,0001) e D14 (39,76 ° C vs 39,37 ° C, de uma maneira respectiva, p < 0,0001). Embora não tenham sido detectadas diferenças significativas (p < 0,05) entre os grupos pré-desafio, essas diferenças não eram biologicamente relevantes. Pós-desafio, o único dia em que foi detectada uma diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos para a temperatura retal média foi em D16 (2 dias pós-desafio). No D16, os grupos de controle vacinados e de desafio tiveram uma média da temperatura retal de 40,68 ° C e 39,77 ° C, de uma maneira respectiva, ea diferença entre os grupos foi significativa (p < 0,0001). A temperatura de 4 a 5 dias após o desafio significativo retal elevada acima de 40 ° C e manteve-se acima de 40 ° C até ao final do estudo para os dois grupos.

[000411] A presença significativa de comportamento anormal, viremia, patologia do pulmão e carga viral no tecido do pulmão devido à PRRS do grupo de controle de desafio resultou em significativa (p < 0,05) entre os grupos para GDPA pós-desafio. Neste estudo, os grupos de controle vacinados e de desafio tiveram uma média GDPA em D14 a D24 de 0,3 kg/dia e 0,1 kg/dia, de uma maneira respectiva, e a diferença entre os dois grupos foi significativa (p = 0,0003). Uma diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos para GPMD pós-desafio suporta ainda o estabelecimento de um OOI de duas semanas após a vacinação. Parâmetros Pós-Vacinação examinados neste estudo

[000412] Não há avaliações clínicas anormais relacionadas com va-cinação com PRRS 94.881 MLV ou produto de controle foram observados em leitões após a inoculação em D0. Um controle de desafio de leitão apresentou uma ferida atrás da perna direita na frente início D9, que parecia não estar associado com a administração do produto controle.

[000413] Todos os leitões foram PRRS ELISA de sorologia negativa em D0, confirmando, dessa maneira , que todos os leitões conheceram o critério de inclusão de ser PRRS negativos quando na entrada no estudo. A maioria dos leitões que receberam PRRS 94.881 MLV PRRS soro-convertido por D14 e todos os leitões PRRS vacinados eram soropositivos por 7 dias após o desafio (D21). Por outro lado, o controle permaneceram seronegativos desafio até 7 dias após o desafio, quando este grupo começou a demonstrar PRRS seroconversão. O grupo de controle negativo permaneceu PRRS seronegativos ao longo de todo o estudo.

[000414] Aos 7 e 14 dias pós-vacinação, o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 apresentaram resultados médios qPCR de 3,17 e 3,30, log10 GE/mL, de uma maneira respectiva. Estes resultados evidenciam que, dentro de duas semanas após a vacinação, em uma dose de 1 x 103,82 TCID50 de PRRS 94.881 MLV induzida replicação suficiente do MLV que é frequentemente necessário para aumentar a imunidade de proteção já em 2 semanas após a vacinação.

[000415] Por outro lado, o grupo de controle de desafio e o grupo de controle negativo foram negativos para PRRSV viremia de D0 a D14. Conclusão

[000416] A redução significativa (p < 0,05) das lesões do pulmão, os sinais clínicos, a replicação do vírus no sangue e nos pulmões pós- desafio, bem como a melhoria dos desempenhos de crescimento apoiar o estabelecimento de duas semanas a seguir à vacinação OOI com uma única dose de PRRS 94.881 MLV a 1 x 103,82 TCID50/mL em leitões em cerca de 14 dias de idade. Exemplo 8 Avaliação da duração da imunidade de PRRS 94.881 MLV em suscetíveis suínos de duas semanas de idade após desafio com um isolado heterólogo europeu de PRRS em 26 semanas pós- vacinação

[000417] O objetivo deste desafio de estudo de vacinação foi avaliar a duração da imunidade (DOI) 26 semanas após a administração da vacina candidata e Síndrome Respiratória e Reprodutiva Suína, isola- do 94 881 derivado europeu de vírus vivo modificado (MLV PRRS 94881) a 14 ± 3 dias de idade de PRRS suínos seronegativos. O critério de eficácia primário para satisfazer um DOI de 26 semanas pós- vacinação foi uma redução significativa (p < 0,05) das pontuações das lesões do pulmão bruta (ou histológico) após o desafio no grupo vacinado 94.881 MLV PRRS (Grupo 1) comparado com o desafio grupo de controle (Grupo 2).

[000418] No dia 0 (D0), 22 suínos atribuídos ao grupo vacinado receberam 1,0 mL IM de PRRS 94.881 MLV (1 x 104,27 TCID50) IM (Grupo 1), 22 suínos atribuídos ao grupo de controle do desafio receberam 1,0 mL IM de produto de controle (produto combinadas com placebo sem PRRS 94.881 MLV, Grupo 2) e 12 animais atribuídos ao grupo de controle negativo também receberam 1,0 ml de MI de produto de controle (Grupo 3). Grupos 1 e 2 foram desafiados em D179 (dia pós-desafio { DPC } 0) com uma cepa virulenta de PRRSV Europeu e suínos foram monitorados 10 dias pós-desafio para os sinais clínicos, ganho de peso médio diário e viremia. Os animais foram necropsiados no D189 (DPC 10) e lesões macroscópicas e histológicas do pulmão, e carga viral do pulmão.

[000419] As médias das pontuações de lesão do pulmão bruto em D189 (DPC 10) foram de 0,1% e 13,8% para Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva (p < 0,0001). Pontuações de lesão do pulmão histológicas média em DPC 10 foram 6,0 e 19,5 para Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva (p < 0,0001). Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 tinham uma carga viral no soro significativamente menos 3, 7 e 10 dias pós-desafio em comparação com controles de desafio (p < 0,0001). A área de pós- desafio sob a curva (AUC) para a análise da viremia 0 DPC 10 DPC para DPC e 10 DPC para 3 também foram significativamente menores para suínos vacinados com PRRS-MLV 94.881 (15,54 e 8,88 log10 da GE/mL por dia, de uma maneira respectiva) em comparação com o grupo de controle exposto (44,77 e 36,43 log10 da GE/mL por dia, de uma maneira respectiva, p < 0,0001). Os valores médios para qPCR tecidos do pulmão coletados na necropsia foram 3,69 e 6,25 log10 GE/mL para suínos Vacinados com MLV PRRS 94.881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva (p < 0,0001). Não houve diferenças significativas nos sinais clínicos pós-desafio (p > 0,4878).

[000420] Uma redução significativa (p < 0,05) de lesões macroscópicas e histológicas do pulmão, a carga viral em tecidos do pulmão coletadas na necropsia e viremia pós-desafio para suínos Vacinados com MLV PRRS 94.881 em relação ao desafio de controla da eficácia da vacina apoiada contra PRRSV virulenta quando desafiado 26 semanas pós-vacinação. Os resultados deste estudo estabelecem uma semana duração da imunidade após a vacinação, em suínos vacinados com PRRS 94.881 MLV às 2 semanas de idade de 26 anos. Estes resultados foram obtidos com uma dose de vacina de 1 x 104,27 TCID50/mL, que era ligeiramente inferior à dose imunizante mínima (1 x 104,5 TCID50/mL) para este produto veterinário investigacional. OBJETIVO(S)/PROPÓSITO DO ESTUDO

[000421] O objetivo deste estudo de desafio da vacinação foi avaliar a duração da imunidade (DOI) de síndrome respiratória e reprodutiva em Suínos, isolado europeu derivado 94.881, Vírus vivo Modificado, Código 19S1.U (PRRS 94.881 MLV) administrada a suínos PRRS so- ronegativos, 14 ± 3 dias de idade contra um desafio virulento com um heteróloga isolado europeu de PRRS em 26 semanas pós-vacinação. O critério primário de eficácia para satisfazer uma DOI de 26 semanas pós-vacinação houve uma redução significativa (p < 0,05) nas pontuações de lesões do pulmão (bruto ou histológico) pós-desafio no grupo vacinar 94.881 MLV PRRS (Grupo 1) em comparação com o desafio grupo de controle (Grupo 2)

[000422] Os parâmetros secundários de eficácia incluíram pós- vacinação e viremia pós-desafio, avaliações clínicas após a vacinação, Sorologia PRRS, pós-desafio observações clínicas, ganho de peso médio diário (GPMD), temperatura retal e pulmão PRRSV quantificação. A viremia pós-desafio foi considerado ser o parâmetro secundário mais importante, uma vez que é um parâmetro objetivo e quantificável. A temperatura retal e as observações clínicas foram então consideradas de apoio no processo de definição do DOI. Por fim, o crescimento, a sorologia e detecção de vírus nos pulmões foram utilizados como parâmetros de apoio para com os parâmetros primários em satisfazer o objetivo do estudo. Agenda de Casos Tabela 8.1 Calendário de Casos

Desenho do Es tudo

[000423] Este foi um estudo cego do desafio de vacinação da eficácia realizada em 56 suínos desmamados, PRRS soronegativos, 14 ± 3 dias de idade no dia 0 (D0). Um sumário do estudo é apresentado na Tabela 8.2. Tabela 8.2 Estudo de projeto

Critérios de cegueira

[000424] O investigador do estudo e designados foram cegos para os grupos de tratamento designados durante a fase do estudo em vida. Para manter essa cegueira, o monitor BIVI realizou a randomiza- ção e um indivíduo que não participou nas avaliações dos suínos (ou seja, as avaliações clínicas, observações clínicas ou necrópsias) administrou o IVP atribuído e tratamentos de PB sobre o D0. O pessoal de laboratório Bivi foi cegado para o tratamento de cada suíno recebeu durante a realização de suas respectivas tarefas. Materiais Produto Veterinário de Investigação (IVP) e Controle do Produto Tabela 8.3 IVP

Tabela 8.4 CP

Materiais de Desafio Tabela 8.5 Material de desafio

Tratamentos Justificação da Dosagem

[000425] O PIV foi administrado como uma dose de 1,0 mL aos suínos designados para avaliar DOI de PRRS 94.881 MLV com 26 semanas pós-vacinação. O PC foi administrado como uma dose de 1,0 ml para os grupos 2 e 3, como uma vacina de placebo. O regime de dosagem

[000426] IVP ou IVP CP ou CP foi administrado a um suíno atribuído na região direita do pescoço IM em D0 usando uma seringa estéril de 3,0 ml Luer-lock e estéril 20 gx 1 polegada (2,54 cm) de agulha por uma pessoa na coleta de dados do estudo. O regime de dosagem é mostrada abaixo na Tabela 8.6 Tabela 8.6 regime posológico

Tratamentos concomitantes

[000427] Devido ao fato de que vários animais foram encontrados mortos no início do estudo subsequente a infecções bacterianas, o investigador e Monitor de Estudo fizeram um acordo em relação a administração dos seguintes tratamentos concomitantes adicional a todos os animais do estudo (Seção 15.10) :

[000428] Dia 20 : Mu-SE ® (vitamina E/Selênio, Intervet/Schering Plough Animal Health, EUA), 0,1 mL IM na parte traseira direita

[000429] Dia 21 : EXCEDE ® (ceftiofur, Pfizer Animal Health, EUA), 0,5 mL na parte traseira do animal esquerda

[000430] Dia 35 : EXCEDE ® (ceftiofur, Pfizer Animal Health, EUA), 1,0 mL na parte traseira do animal direita.

[000431] Dia 42 : EXCEDE ® (ceftiofur, Pfizer Animal Health, EUA), 1,0 mL na parte traseira do animal esquerda.

[000432] Dia 47 : BAYTRIL 100 ® (enrofloxacina, Bayer Animal Health, EUA), 1,5 mL de SC no lado esquerdo do pescoço

[000433] A vitamina E/selênio foi administrada para a prevenção de doenças cardíacas amora e os tratamentos foram administrados com antibióticos para o tratamento/prevenção de infecções bacterianas. INFORMAÇÃO DO ANIMAL Detalhes de estudos em animais Tabela 8.7 Informações do animal

CRITÉRIOS DE INCLUSÃO/EXCLUSÃO

[000434] Todos os suínos incluídos neste estudo foram PRRS ELISA negativo (Proporção ELISA de < 0,4 S/P) e eram saudáveis no momento da vacinação (D0), conforme determinado pela observação. CRITÉRIOS DE PÓS-INCLUSÃO DE REMOÇÃO

[000435] Nenhum dos suínos foram retirados do estudo. Três suínos foram encontrados mortos antes da administração desafio. Outros re-sultados sobre esses três suínos são apresentados na Seção 12.8. GESTÃO E ALOJAMENTO DE ANIMAL

[000436] Os porcos foram alojados em Veterinary Resources, Inc. (VRI) em Cambridge, IA para o período de duração do estudo. Os animais foram alojados em várias baias (11 ou 12 suínos/baia) dentro de cada sala, com vacinação (Grupo 1) e controle (Grupos 2 e 3) alojados em salas uniformes, mas separado para garantir a biosseguran- ça. PRRS 94.881 MLV suínos foram alojados em salas CB8 até D78, em seguida, em CC1 até D105 e, em seguida CC3 para o resto do estudo. Os suínos de controle de desafio foram alojados em CC2 sala durante todo o estudo. Suínos de controle negativo foram alojados em salas CB6 até D73 e CB7 em seguida para o resto do estudo. Currais foram elevados, com piso ripado plástico, com idade comedouros e bebedouros adequados copo de mamilo. Cada sala de isolamento foi construída de forma idêntica a outra e todos estavam no mesmo nível de risco biológico 2 (BL2) cumpridos, hepafiltrado, em ventilação mecânica com termostato de controle de temperatura regulada.

[000437] O tratamento do grupo isolamento foi necessário neste estudo, uma vez que é bem conhecido na comunidade científica que PRRSV rapidamente se espalha de um suíno para através de vários mecanismos, incluindo aerossóis. Isto inclui avirulentos vacinas de PRRS vivos como esses produtos biológicos incluem partículas de vírus atenuados que imitam as características de PRRS de tipo selvagem virulenta sem a capacidade de causar a doença. Métodos apropriados estavam no local para garantir que a biossegurança fosse mantida e que os animais vacinados não acidentalmente contaminassem os animais não vacinados com PRRSV ingênuos do controle negativo.

[000438] As medidas adequadas foram tomadas pela equipe do laboratório de ensaio limpando e desinfectando cada sala antes de seu uso para este estudo de forma adequada.

[000439] Todas as salas do estabelecimento tinham ventiladores e aquecedores para ajudar na circulação de ar suficiente e aquecimento. O sistema de ventilação foi separado ainda idêntico para cada sala, para que o ar não fosse compartilhado entre as salas.

[000440] A alimentação foi armazenada em sacos, livre de vermes. Alimentação e água estavam disponíveis ad libitum. Os suínos foram alimentados com alimento medicamentoso métrico estéril infantil (Puri- na Mills LLC, St. Louis, MO) desde a chegada ao D5, quando eles foram transferidos para o alimento medicamentoso métrico estéril Senior (Purina Mills LLC, St. Louis, MO). Em D64 os suínos foram transferidos para alimento medicamentoso métrico estéril complete 85 (Purina Mills LLC, St. Louis, MO), e em D82 eles foram transferidos para Métricas Lean completos CE85, T40 (Purina Mills LLC, St. Louis, MO), que eles foram alimentados durante o período restante do estudo. Ao longo do estudo, os conteúdos fornecidos eram adequados para o tamanho, idade e condição dos suínos, de acordo com as práticas de criação de animais aceitáveis para a região.

[000441] Os porcos estavam em bom estado de saúde e estado nutricional antes do início do estudo, conforme determinado pelo investigador do estudo. Durante o estudo, os animais selecionados foram observados com outras condições, incluindo magreza, tosse, inchaço, pêlos arrepiados, depressão, abcessos, e má condição corporal. O investigador do estudo considerou todas estas condições para ser típico do grupo alojado de crescimento/amadurecimento de suínos. Essas condições foram con-sideradas transitória ou inconsequente e não foram tratadas. AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA

[000442] Para avaliar o DOI de PRRS 94.881 MLV em 26 semanas após a vacinação dos grupos com PRRS 94.881 MLV o controle e desafio foram desafiados em D179 (DPC 0) e lesões do pulmão pós-desafio, foram avaliados 10 dias mais tarde (DPC 10). A DOI de 26 semanas pós- vacinação foi alcançado se PRRS 94881 grupo MLV tinha diminuído sig-nificativamente (p < 0,05), patologia do pulmão (bruto ou histológico) pós- desafio em comparação com o grupo de controle do desafio.

[000443] Os parâmetros secundários de eficácia analisados entre o grupo vacinado e o grupo de controle incluiu o desafio pós-vacinação e viremia pós-desafio, observações clínicas pós-desafio, temperatura retal pós-desafio, avaliações clínicas pós-vacinação, o ganho de peso médio diário (GPMD) e sorologia PRRS. A viremia pós-desafio foi considerada ser o parâmetro secundário mais importante, uma vez que é um parâmetro objetivo e quantificável. A temperatura retal e as observações clínicas foram então consideradas de apoio no processo de definição do DOI. Por fim, o crescimento, a sorologia e detecção de vírus nos pulmões foram utilizadas como parâmetros de apoio para com os parâmetros primários em satisfazer o objetivo do estudo. Critérios para um teste válido

[000444] Todos os suínos eram obrigados a ser PRRS ELISA negativo (Proporção ELISA de < 0,4 S/P) na triagem pré-compra e em D0. Suínos de controle de desafio eram obrigados a presença de anticorpos contra PRRS até desafiar e o grupo de controle negativo foi obrigado a presença de anticorpos contra PRRS durante o estudo. PARÂMETROS DE RESULTADO PRIMÁRIO

[000445] O desfecho primário de eficácia foi a patologia do pulmão (lesões macroscópicas e histológicas) em D189 (DPC 10) do estudo. Pontuações de lesão do pulmão bruta

[000446] Em D189, após amostras e os dados foram coletados e re-gistrados, todos os suínos de estudo restantes foram sacrificados após VRI SOP PRC1027 (Seção 15.1). Cada suíno foi necropsiado, de acordo com VRI SOP PRC 1028 (Seção 15.1). A cavidade torácica de cada leitão foi exposta por uma pessoa designada e o coração e os pulmões foram retirados. O investigador do estudo examinou cada par de pulmões, descreveu qualquer patologia grave e determinou a percentagem de patologia para cada lóbulo do pulmão. As observações e os dados foram registrados no formulário de Recorde de Reportagem de Necropsia. Pontuações de lesão de pulmão histológico

[000447] Para cada conjunto de pulmões, foram mantidas duas amostras dos lóbulos esquerdo e direito apicais, os lóbulos cardíacos direita e esquerda, os lóbulos diafragmáticos esquerda e direita e o lóbulo intermediário. Cada uma das amostras de pulmão foi de cerca de 1 polegada (2,54 cm) x 1 polegada (2,54 cm). Para um conjunto de amostras de pulmão, todas as três amostras a partir do lado esquerdo foram combinados em um recipiente, enquanto que todas as três amostras a partir do lado direito e do pulmão da amostra do lóbulo In-termediário foram combinados em um outro recipiente. Cada recipiente foi cheio com uma quantidade suficiente de solução de formalina a 10% . Para outro conjunto de amostras de pulmão, todas as três amostras de pulmão a partir do lado esquerdo foram combinados em um Whirlpak ®, enquanto que todas as três amostras a partir do lado direito e do pulmão da amostra do lóbulo Intermediário foram combinados em outro Whirlpak ®. Todos os recipientes e Whirlpaks ® foram devidamente rotulados com o número do animal, número estudo, data da colheita, dia de estudo, tipo de amostra e se as amostras eram do lado esquerdo ou direito. As amostras do pulmão em formalina, foram armazenados à temperatura ambiente, enquanto as amostras de pulmão em Whirlpaks ® foram armazenadas sobre gelo seco até transportados para BIVI-Ames. As coletas foram registrados no formulário de Recorde de Reportagem de Necropsia. Amostras de tecido do pulmão fixados em formol e amostras de pulmão Whirlpak ® foram transferidos para BIVI-Ames. Um Modelo de formulário registro de entrega concluída foi incluído com cada embarque.

[000448] As amostras de tecido do pulmão fixada em formalina foram realizadas por BIVI-Ames à temperatura ambiente até serem submetias a Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU VDL) por BIVI-Ames. As amostras do pulmão foram tratadas e processadas por meio do pessoal de laboratório ISU VDL acordo com ISU VDL pro-cedimentos uma semana após a necropsia. Um único deslize foi gerado para cada suíno contendo sete seções (um de cada de todos os setes lóbulos do pulmão). Cada lâmina H & E foi identificada com um código de identificação único. ISU VDL forneceu um registro de computador contendo o número de estudo, códigos de identificação e de tecidos de suínos associados.

[000449] Uma vez por dia, nos dias em que os slides do estudo foram lidos para histopatologia, uma VDL patologista ISU (K. Schwartz), primeiro leia as PRRS UE lâminas de controle positivo e negativo. Posteriormente, o patologista leu as lâminas de pulmão coradas em H & E para a hipertrofia e hiperplasia pneumocítica, infiltração de células mononuclea- res do septo, restos necróticos, acumulação intra-alveolar de células in-flamatórias e de acumulação perivascular de células inflamatórias. Os resultados foram registrados em uma planilha do Excel. O sistema de pontuação de histopatologia do pulmão é mostrado abaixo na Tabela 8.8. Tabela 8.8 Sistema de Pontuação de Histopatologia do pulmão

[000450] Após a conclusão da leitura de todos os slides, as lâminas foram devolvidas ao representante do patrocinador e ficará arquivada no Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc., St. Joseph, MO após a conclusão do relatório final. Parâmetros secundários

[000451] As variáveis secundárias incluíram pós-vacinação e viremia pós-desafio, pós-desafio de observações clínicas, temperatura retal pós-desafio, ganho de peso médio diário (GPMD), pulmão de quantificação de PRRSV, avaliação clínica pós-vacinação, e sorologia PRRS. Soro PRRS Qpcr

[000452] O sangue venoso foi coletado no pré-compra e nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 168, 179 (DPC 0), 182 (DPC 3), 186 (DPC 7), e 189 (10 DPC). Resumidamente, cerca de 2 a 5 mL de sangue foi coletado de cada suíno em um tubo separador de soro de tamanho adequado (SST). As coletas foram registradas no formulário de registro de coleta da amostra. Sangue em SST foi deixado coagular à temperatura ambiente. Amostras de sangue foram entregues para BI- VI-Ames, no dia da coleta de amostras e o formulário de registro de entrega foi concluído. As amostras de sangue foram centrifugadas por BIVI-Ames e o soro foi recolhido, dividido e transferido para os tubos apropriados. Cada tubo foi marcado com o número de ID do suíno, o número do estudo, a data da colheita, no dia do estudo e o tipo de amostra. Em BIVI-Ames, uma série de amostras de soro foi realizada a 2 a 8°C e o outro conjunto de amostras de soro foi mantida a -70 ± 10°C. Observações clínicas pós-desafio

[000453] Os animais foram observados quanto aos sinais clínicos de doença do D178 (DPC -1) a D189 (DPC 10). As observações foram realizadas pelo investigador do estudo ou designados e foram registrados no formulário de registro da observação clínica. Os suínos fo- ram observados diariamente para a respiração, o comportamento e tosse com base no sistema de pontuação de observação clínica descrito abaixo na Tabela 8.9. Tabela 8.9 Sistema de Pontuação de Observação Clínica

Temperatura retal

[000454] As temperaturas retais foram recolhidas pelo investigador do estudo ou designados em D178 (DPC -1) a D189 (DPC 10). As temperaturas retais foram registradas em °C unidades no formulário de registro da observação clínica. Peso corporal e ganho de peso médio diário

[000455] Os pesos individuais foram coletadas no D0, D179 (DPC 0) e D188 (DPC 9). Cada suíno foi pesado em uma balança calibrada pelo investigador do estudo ou designados. Os resultados foram registrados em unidades kg no formulário de registro do peso corporal. O ganho de peso diário médio foi determinado a partir da D179 (DPC 0) a D188 (DPC 9). Pulmão PRRS qPCR

[000456] As amostras de tecido do pulmão em Whirlpaks ® foram mantidas a -70 ± 10°C em BIVI-Ames até enviado para endereço indicado na Seção 9.3.1. Um Modelo de formulário registro de entrega concluída foi incluído com a expedição. BIOSCREEN testaram amostras de pulmão de RNA PRRSV por qPCR (Seção 15.1). Tecidos do pulmão esquerdo foram homogeneizados e testados. Os tecidos do pulmão esquerdo e amostras lóbulo do pulmão intermediários foram homogeneizados e testados. Os resultados foram relatados como ge- noma equivalente (log10 da GE/mL) para as amostras de pulmão esquerdo e direito. A média geométrica da titulação de valores GE/mL direita e esquerda serão calculados para cada suíno pelo estatístico utilizando o programa SAS. Avaliação Clínica Pós-Vacinação

[000457] Todos os animais foram observados por avaliações clínicas pós-vacinação pelo investigador do estudo ou designados. As observações foram realizadas diariamente a partir de D-1 e D21 e, em seguida, pelo menos, três vezes por semana a partir de D22 D177. As observações foram registradas no formulário de registro de Avaliação Clínica. Sorologia PRRS

[000458] As amostras de soro coletadas no pré-compra e nos dias 0, 7, 14, 21, 28, 56, 84, 112, 140, 168, 179 (DPC 0), 182 (DPC 3), 186 (DPC 7) e 189 (DPC 10) e realizada entre 2 a 8 ° C foram testadas por BIVI-Ames para detecção de anticorpos PRRS (Seção 15.1). Os resultados foram relatados como negativo (Proporção ELISA de < 0,4 S/P) ou positivo (ELISA > proporção de 0,4 S/P). CASOS ADVERSOS

[000459] Nenhum dos casos adversos atribuídos a PRRS 94.881 MLV foram observados neste estudo. MÉTODOS ESTATÍSTICOS UNIDADE EXPERIMENTAL

[000460] Os grupos de tratamento foram alojados em salas separadas neste estudo para evitar a transmissão do PRRSV a grupos não vacinados. Portanto, a sala foi a unidade experimental. No entanto, para fins de análises, um possível viés devido ao confundimento "sala" e efeitos "tratamento" foram ignorados, e suíno foi usado como a unidade estatística. RANDOMIZAÇÃO

[000461] Cinquenta e seis (56) suínos foram aleatoriamente designados para um dos três grupos. A randomização foi realizada pelo BI- VI. No momento da transferência Nos 140 e 143 (grupo de controle de desafio), bem como N ° 168 (94881 PRRS grupo MLV), foram sacrifi-cadas. Número 178 foi selecionado aleatoriamente para substituir No. 140, No. 177 foi selecionado aleatoriamente para substituir o 143, e n ° 179 foi selecionado aleatoriamente para substituir No. 168 de um pool de cinco suínos extras que atenderam aos critérios de inclusão. ANÁLISE

[000462] As análises estatísticas e sumários de dados foram conduzidos pelo Dr. rer. classe etária. Martin Vanselow, Biometrie & Statistik, Zum Siemenshop 21, 30539 Hannover, Alemanha, +49 (0) 511 606 777 650, m.vanselow @ t-online.de. Os dados foram analisados assumindo uma estrutura de design completamente aleatória. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SAS versão 8.2 ou superior (SAS, 2001, Cary, EUA/North Carolina, SAS Institute Inc.). PRRS 94.881 MLV suíno 179 e suínos controle de desafio 124 e 161 morreram antes do desafio e foram excluídos da análise pós-desafio. Todos os testes sobre diferenças foram concebidos como testes de dois lados em α = 5% . O relatório do estatístico é apresentado na Seção 15.9. Pontuações brutas de lesão do pulmão

[000463] A pontuação de lesão do pulmão grave para cada suíno foi calculada utilizando os fatores apresentados na Tabela 8.10, multiplicado pela patologia % de um lóbulo do pulmão específico. Os cálculos foram realizados utilizando o programa SAS. Tabela 8.10 Elementos de cálculo das pontuações brutas de lesão do pulmão

[000464] Os grupos de tratamento foram comparados nas diferenças por meio do teste Mann-Whitney, Wilcoxon. Pontuações de lesão de pulmão histológicas

[000465] As Pontuações histológicas individuais das amostras de pulmão foram acumuladas por lóbulo e animal. Esta pontuação total foi dividida pelo número de lóbulos examinados por animal. Os resultados foram utilizados como valores únicos para a comparação entre os grupos de tratamento. Os grupos de tratamento foram testados em diferenças utilizando o teste de Mann-Whitney Wilcoxon. Pulmão PRRS qPCR

[000466] Os dados da PCR quantitativa (PRRS carga viral [log10 GE/ml]) de pulmões coletados em D189 foram utilizados para comparações entre os grupos de tratamento pelo teste de Mann-Whitney, Wilcoxon. A média (log10 da GE/mL) dos resultados de qPCR pulmão esquerdo e direito foram usados para a avaliação. Antes os cálculos o resultado analítico "não detectado" ter sido substituído por log10 GE/mL de 0,0 e "positiva" foi substituído por 3.0.

[000467] As tabelas de frequência de resultados positivos qPCR foram geradas. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher. Soro PRRS qPCR

[000468] Os dados de viremia foram avaliados separadamente para cada dia de investigação. Além disso, para a carga viral foram analisadas as áreas sob as curvas de resposta individuais entre D179 e D189 (AUC 0-10) e entre D182 e D189 (AUC 3-10).

[000469] Os dados de PCR quantitativo (carga viral PRRS [log10 GE/ml]) foram utilizados para comparações entre os grupos de tratamento pelo teste de Mann-Whitney, Wilcoxon. Antes de os cálculos do resultado analítico 'não detectado' foi substituído por um GE/mL valor log10 de 0,0 e "positivo" foi substituído por 3,0. Os grupos de tratamento foram testados em diferenças utilizando o teste de Mann- Whitney Wilcoxon.

[000470] As tabelas de frequência de resultados positivos qPCR foram geradas. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher. Observações clínicas pós-desafio

[000471] As tabelas de frequência de animais com pelo menos um resultado positivo entre D180 e D189 foram gerados. As pontuações totais foram a soma de pontuação respiração + pontuação de comportamento + tosse. Os cálculos foram realizados utilizando o programa SAS. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher.

[000472] As contagens máximas e as contagens médias por animal em D180 a D189 para a respiração, o comportamento, a tosse e para todos os três somados (total) foram usadas para a avaliação estatística. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste de Mann-Whitney Wilcoxon. Peso corporal e ganho de peso médio diário

[000473] Os ganhos de peso diário individuais foram calculados para o período de tempo entre a D179 a D188. Para cada dia de investigação e para o período de tempo foram calculadas estatísticas descritivas. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas usando a análise de variância e teste t subsequente. As médias dos quadrados mínimos dos grupos e as diferenças entre médias dos quadrados mínimos com intervalos de confiança de 95% foram calculados a partir da análise de variância. Temperatura retal

[000474] As diferenças entre os grupos de tratamento com relação aos dados de temperatura originais foram testadas pela análise de variância e teste t subsequente. As médias dos quadrados mínimos dos grupos e as diferenças entre as médias dos quadrados mínimos com intervalos de confiança de 95% foram calculados a partir da análise de variância. Avaliação clínica pós-vacinação

[000475] Estas tabelas de frequência de animais com, pelo menos, um resultado positivo entre D1 e D21 foram gerados. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher. Sorologia PRRS

[000476] As tabelas de frequência de resultados positivos ELISA foram geradas para cada momento. As diferenças entre os grupos de tratamento foram testadas pelo teste exato de Fisher. RESULTADOS Pontuações brutas de lesão do pulmão

[000477] As médias das pontuações brutas de lesão do pulmão em D189 (DPC 10) foram de 0,1% e 13,8% para os grupos vacinados com MLV PRRS 94881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva. A média dA pontuação de lesão do pulmão grave para suínos vacinados com PRRS foi significativamente menor do que a média dA pontuação de lesão do pulmão grave para os controles de desafio (p < 0,0001). A média dA pontuação de lesão do pulmão grave para o grupo de controle negativo foi de 0,0%.

[000478] 123 (grupo de controle do desafio) não poderia ser marcado por lesões do pulmão em D189, devido à pleurite de difusos e aderências. Moraxella osloensis, Staphylococcus wRNAeri, Staphyloccous hyicus e espécies de Pseudomonas foram isoladas de tecidos do pulmão pós necropsia deste suíno.

[000479] Um sumário dos resultados brutos de lesão do pulmão do grupo e o valor p associado é mostrado abaixo na Tabela 8.11. Tabela 8.11 Sumário das Pontuações Brutas do Grupo de lesão do pulmão (%) em D189

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2no. 123 não foi marcado, devido à pleurite difusos e aderências devido a infecções bacte- rianas. 3One PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise. NI = Não incluído na análise estatística Pontuações de lesão do pulmão histológicas

[000480] As médias das pontuações de lesão do pulmão histológicas foram 6,0 e 19,5 para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva. A média histológica pontuação de lesão do pulmão para o grupo PRRS vacinados foi signi-ficativamente menor do que a média histológica pontuação de lesão do pulmão para os controles de desafio (p < 0,0001). A média histológica pontuação de lesão do pulmão para o grupo de controle negativo foi de 9,0.

[000481] Um sumário dos resultados histológicos grupo lesão do pulmão e o valor p associado é mostrado abaixo na Tabela 8.12. Tabela 8.12 Sumário das pontuações histológicas do Grupo de lesão do pulmão

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2Uma PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise NI = Não incluído na análise estatística Pulmão PRRS qPCR

[000482] Os valores da média do pulmão de qPCRos de tecidos do pulmão foram 3,69 e 6,25 log10 GE/mL para suínos Vacinados com MLV PRRS 94.881 e os controles de desafio, de uma maneira respectiva. O valor médio para qPCR Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 foi significativamente menor do que o valor médio para qPCR controles de desafio (p < 0,0001). Nenhum RNA PRRSV foi detectado em amostras de pulmão de quaisquer suínos de controle negativo.

[000483] Um sumário dos valores do grupo do pulmão qPCR e resultado do teste (valor p) está abaixo na tabela 8.13. Tabela 8.13 Sumário do Grupo do Pulmão qPCR (média log10 GE/mL)

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2Uma PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise. NI = Não incluído na análise estatística

[000484] RNA PRRSV foi detectado em tecidos do pulmão de 90% e 100% dos suínos de PRRS 94881 e suínos de controle expostos aos vacinados com MLV, de uma maneira respectiva. Não houve diferença estatística entre o grupo vacinado e os controles de desafio (p = 0,4878).

[000485] O sumário da frequência grupo de tecidos do pulmão PRRS qPCR positivos de suínos no momento da necropsia é mostrado abaixo na Tabela 8.14. Tabela 8.14 Grupo Frequência de tecidos do pulmão PRRSV qPCR positivos

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2 Um PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise. NI = Não incluído na análise estatística Soro PRRS qPCR

[000486] RNA PRRSV não foi detectado no soro de todos os suínos no dia 0. Pós-vacinação, Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 apresentaram valores médios de 3,00, 0, 0, 3,00, 0, 0, 0, 0 e 0 log10 GE/mL em D7, D14, D21, D28, D56, D84, D112, D140 e D168, de uma maneira respectiva. Os valores foram significativamente maiores do que os controles de desafio em D7, D14, D21 e D28 (p < 0,0013), como controles de desafio não tinham qualquer RNA PRRSV detectado até D182 (DPC 3).

[000487] RNA PRRSV não foi detectado no soro de todos os suínos no D179 (DPC 0). Depois do desafio, de Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 teve valores da média de 4,44, 0, e 0 log10 da GE/mL no D182 DPC (3), D186 (DPC 7) e D189 (DPC 10), de uma maneira respectiva, em comparação com 5,88, 5,30 e 4,24 log10 GE/mL para controles de desafio nos mesmos dias. Os valores da média para os controles de desafio foram superiores a 94881 grupo MLV PRRS em todos os dias após o desafio (p < 0,0001).

[000488] No RNA PRRSV foi detectado no soro de um suíno de controle negativo, durante este estudo.

[000489] Os valores de AUC médios para os Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 foram 15,54 e 8,88 log10 da GE/mL por dia a partir de 0 DPC para DPC 10 DPC e de 3 a 10 DPC, de uma maneira respectiva. Em contraste, os valores médios de AUC para os controles de desafio foram 44,77 e 36,43 log10 da GE/mL por dia a partir de 0 DPC para DPC 10 DPC e de 3 a 10 DPC, de uma maneira respectiva. Os valores médios para o grupo MLV PRRS foram significativamente menores do que os valores médios para os controles de desafio para ambos os períodos (p < 0,0001).

[000490] Sumário de dados de qPCR de PRRS no soro são mostrados abaixo nas tabelas 8.15 e 8.16. Tabela 8.15 Sumário de Resultados de soro PRRS qPCR (log10 GE/mL) a partir de D0 a D168

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. NI = Não incluído na análise estatística Tabela 8.16 Sumário de resultados de soro PRRS qPCR (log10 da GE/mL) a partir em D179 a D189

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. NI = Não incluído na análise estatística. AUC = Área sob a curva ; log10 da GE/mL por dia

[000491] Pós-vacinação, o grupo 94881 MLV PRRS tinha significati-vamente maiores proporções de suínos positivos qPCR em D7, D14, D21 e D28 em comparação com o grupo de controle do desafio. (p < 0,0013). Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os grupos em D56 para a proporção de qPCR suínos positivos (p = 0,1069).

[000492] Em D182 (DPC 3), 100% dos suínos em PRRS 94.881 MLV e nos grupos de controle de desafio foram qPCR positivo (sem teste realizado). Em D186 (DPC 7) e D189 (DPC 10), o grupo de MLV PRRS apresentaram significativamente menor proporção de suínos positivos qPCR em comparação com o grupo de controle exposto (< 0,0001).

[000493] Sumários de proporções grupo de dados positivos qPCR são mostrados a seguir nas Tabelas 8.17 e 8.18. Tabela 8.17 Sumário de proporção do Grupo dos resultados pós vaci nação de soro qPCR positivo

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. n.d. = Nenhum teste realizado ; NI = Não está incluído na análise estatística Tabela 8.18 Sumário de proporção Grupo de resultados do soro qPCR positivo pós-desafio

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. n.d. = Nenhum teste realizado ; NI = Não está incluído na análise estatística Observações clínicas pós-desafio

[000494] A respiração anormal não foi observada em nenhum dos Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 após o desafio, em comparação com um - suíno controle de desafio (n ° 149), que demonstrou uma pontuação de "1" na D185 (DPC 6). Não houve diferença entre os grupos para o percentual de suínos, que demonstrou respiração anormal durante pelo menos um dia após o desafio (p = 0,4878).

[000495] O comportamento anormal e tosse não foram observados pós-desafio em qualquer Suíno vacinado com MLV PRRS 94881 ou em suínos de controle de desafio.

[000496] As percentagens de suínos com um total de pontuações clínicas > 0 para pelo menos um dia após o desafio foram de 0% e 5% para o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. Estes valores não foram significativamente diferentes (p = 0,4878).

[000497] Nenhum dos sinais clínicos foram observados no grupo de controle negativo da D179 a D189.

[000498] Um sumário das frequências do grupo de suínos com pelo menos uma pontuação de observação clínica positiva durante o período pós-desafio são apresentados abaixo na Tabela 8.19. Tabela 8.19 Sumário das Frequências do grupo de suínos com pelo menos uma pontuação positiva de Observação Clínica pós-desafio

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2Uma PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise. NI = Não incluído na análise estatística ; NA = teste não se aplica devido à falta de variabilidade

[000499] Não houve diferença entre os grupos para as pontuações de respiração máxima ou pontuaçã máxima total pós-desafio (p = 0,4878).

[000500] Um sumário dos resultados máximos de observação clínica do grupo para o período pós-desafio (DPC 1 através DPC 10) é mostrada a seguir na Tabela 8.20. Tabela 8.20 Sumário do grupo de pontuações Máximas clínicas Pós- desafio

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2 Um PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise. NI = Não incluído na análise estatística

[000501] A média das pontuações de observação clínica seguiu um padrão semelhante à porcentagem de suínos com pontuações clínicas positivas. Não houve diferenças significativas entre o grupo vacinado com MLV PRRS 94881 e grupo de controle de desafio (p > 0,4878).

[000502] Um sumário do grupo da média de Pontuações da observação clínica para o período pós-desafio (DPC 1 a DPC 10) é mostrada na Tabela 8.21. Tabela 8.21 Sumário do Grupo da média de pontuações clínicas Pós- Desafio

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2 PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise. NI = Não incluído na análise estatística Peso corporal e ganho de peso médio diário

[000503] A diferença entre os grupos não foi significativa (p = 0,2389). Na D179 (DPC 0), média e Média LS do peso corporal foram 134,6 e 128,2 kg para o grupo 94881 MLV PRRS e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. A diferença não foi significativamente diferente (p = 0,1090). Em D188 (DPC 9), a média e Média LS dos pesos corporais foram 138,3 e 130,3 kg para o grupo de 94.881 MLV PRRS e o grupo de controle exposto, de uma maneira respectiva. O peso corporal para o grupo vacinado era significativamente superior à do grupo de controle exposto em D188 (p = 0,0455).

[000504] Média LS ADWGs para o período de desafio (DPC DPC de 0 a 9) foram de 0,4 e 0,2 kg/dia para o PRRS 94881 grupo MLV e o grupo de controle do desafio, de uma maneira respectiva. Estes valores não foram significativamente diferentes (p = 0,1041).

[000505] Os suínos de controle negativo apresentaram peso médio do corpo de 2,7, 117,2 e 120,0 kg em D0, D179 e D188, de uma maneira respectiva. O GPD para o grupo de controle negativo a partir em D179 a D188 foi de 0,5 kg/d.

[000506] Um sumário da média de grupo de pesos corporais no D0, D179 (DPC 0) e D188 (DPC 9) e GDPA de DPC para DPC 0 9 são mostrados abaixo na Tabela 8.22. Um sumário da média e LS análise estatística dos pesos corporais e GDPA para o grupo 94881 MLV PRRS e o grupo de controle exposto é mostrado abaixo na Tabela 8.23. Tabela 8.22 Sumário do Grupo de peso corporal e ganho de peso médio diário (kg e kg/d)

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo Tabela 8.23 Sumário de Média LS do Grupo peso corporal e ganho de peso diário (kg e kg/d)

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo Temperatura retal

[000507] A média da temperatura retal para a 94881 grupo MLV PRRS foi de 39,3°C no dia do desafio (D179) e meios variou entre 39,1 ° C (D189, DPC 10) a 39,8 ° C (D181, DPC 2) após o desafio. A média da temperatura retal para o grupo de controle exposto foi de 39,1 ° C no dia do desafio, e meios variou entre 39,1 ° C (D183, DPC 4) a 39,9 ° C (D182, DPC 3) após o desafio. A temperatura média retal para o grupo de controle negativo permaneceu < 39,3 ° C ao longo do mesmo período de tempo.

[000508] Um sumário das temperaturas rectais grupo é mostrado abaixo na Tabela 8.24. Tabela 8.24 Sumário do Grupo de temperatura retal (° C) Dias D179 (DPC 0) através em D189 (DPC 10)

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2 PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise.

[000509] As temperaturas retais de meio quadrado foram significati-vamente maiores para Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 contra a desafiar os controles na DPC 0 (p = 0,0281), DPC 2 (p = 0,0095), DPC 4 (p = 0,0034) e DPC 5 (p < 0,0001). As temperaturas retais de meio quadrado foram significativamente menores para Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 em relação ao desafiar controles DPC 8 (p = 0,0183) e na DPC 10 (p = 0,0001). Não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos para os restantes dias pós-desafio (p > 0,0642). Um sumário da média de grupo LS e análise estatística da temperatura retal é mostrado abaixo na Tabela 8.25. Tabela 8.25 Sumário de Grupo LS da temperatura retal (° C) D179 (DPC 0) média através D189 (DPC 10)

1 Grupo 1 = Vacina M LV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo

[000510] Três dos 21 (14%) PRRS 94.881 MLV suínos vacinados e 5 de 20 (25%) controles de desafio tinha uma temperatura retal > 40,5 ° C durante pelo menos um dia após o desafio. Não houve diferença entre os grupos para a proporção de animais que apresentaram uma temperatura retal > 40,5 ° C durante pelo menos um dia após o desafio (p = 0,4537). Um sumário do grupo proporção de leitões com a pirexia (> 40,5 ° C) durante pelo menos um dia pós-desafio são apresentados abaixo na Tabela 8.26. Tabela 8.26 Sumário de proporção do Grupo de pirexia (> 40,5 ° C) durante pelo menos um dia após o desafio

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. 2 PRRS 94.881 MLV suíno e dois suínos do controle de desafio morreram pré-desafio e não foram incluídos na análise. NI = Não incluído na análise estatística Avaliação clínica pós-vacinação

[000511] Quatro dos 22 (18%) PRRS 94.881 MLV suínos, 8 de 22 (36%) animais controles de desafio e 2 de 12 (17%) animais controles negativos apresentaram uma avaliação clínica anormal por pelo me- nos um dia em D1 a D21 . Não houve diferença significativa entre os grupos para este parâmetro (p = 0,3102).

[000512] O sumário da percentagem grupo de suínos com pelo menos uma avaliação clínica anormal em D1 através de D21 é mostrado abaixo na Tabela 8.27. Tabela 8.27 Sumário do Grupo de Percentagem dos Suínos com pelo menos uma avaliação clínica anormal D1-D21

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. NI = Não incluído na análise estatística

[000513] No geral, 7 PRRS 94.881 MLV suínos exibiu uma avaliação clínica anormal por pelo menos um dia entre D1 a D177 :

[000514] Suíno 121 exibiu inchaço na barriga em D61 a D146, um revestimento inchado em D147 aD167, inchaço na barriga em D168, um revestimento inchado em D169 a 172 e , inchaço na barriga em 173 a 177. Suíno 141 era magro em D4 a D10, estava deprimido em D4 a D6 e pêlo áspero em D5. Suíno 144 apresentou tosse em D26. Suíno 146 exibiu inchaço no esterno em D82. Suíno 147 era fraco nas pernas em D84 a D86 e estava tremendo em D84. Suíno 154 era magro em D4 a D6. Suíno 179 era magro em D2 a D5, exibiu pêlo áspero em D5 e foi encontrado morto em D6. Treze suínos no grupo de controle de desafio exibiram uma avaliação clínica anormal por pelo menos um dia em D1 a D177 : Suíno 124 apresentou agitação e tremores em D20 e foi encontrado morto em D21. Suíno 134 exibiu um revestimento inchado em D46 a D68, inchaço na barriga de D69-D143, uma hérnia umbilical em D144 e D145 inchaço na barriga em D177. Suíno 137 exibiu um revestimento inchado em D108, D143. Suíno 138 exibiu um revestimento inchado em D115, D143. Suíno 148 apresentou clau- dicação ou uma perna inchada em D16 a 20 e tosse em D35. Suíno 149 era magro em D5 a D9 e no D12, e exibiu pêlo áspero em D12 a D15. Suíno 150 era magro em D4 a D9 e em D13, apresentou perda de condição corporal em D10 a D12, e estava deprimido em D11. Suíno 161 era magro em D4 a D9, exibiu pêlo áspero e sinais do sistema nervoso central em D9 e foi encontrado morto em D10. Suíno 167 exibiu um revestimento inchado em D117, D143. Suíno 170 era magro em D4 a D7 e exibiu depressão em D7. Suíno 172 exibiu uma ferida ou uma garra de orvalho inchado em D120, D143. Suíno 177 apresen- toudepressão em D19 e inchaço no pescoço em D156, D159. Suíno 178 apresentaram depressão em D5, a partir em D17 a 20, e em D28 a D36, era coxo e/ou teve inchaço da perna em D15 a D47, era fina em D16 a D18, e foi duro nas pernas em D39 a D47. Seis suínos no controle negativo exibiram uma avaliação clínica anormal por pelo menos um dia em D1 a D177. Suíno 120 exibiu tosse em D5 a 7 e em D12. Suíno 126 era magro em D2 a 18, exibiu a depressão em D4 aD5, em D10 e D17 a D19, pêlo áspero em D5 e respiração forçada em D18 a D22. Suíno 132 exibiu um abcesso em D49 a D56. Suíno 145 exibiu um revestimento inchado em D37 a D43 e D46 a D74 a partir de, e uma ferida na bainha em D75, D83 e D85 a D87. Suíno 151 exibiu o ato de coxear e/ou a partir de uma perna inchada em D78 a D83 e no D85. Suíno 155 exibiu um abscesso em D69 a D77.

[000515] Três mortalidade ocorreu antes de desafiar. Suíno 179 (PRRS 94.881 MLV, D6) : A necrópsia revelou as lesões mínimas (condição de corpo pobre, leve). Testes de laboratório mostraram pneumonia intersticial macrofágica suave. Imunohistoquímica foi negativa para PRRS. Amostras intestinais foram autolisadas, mas não mostram evidências de necrose grave ou inflamação grave. Lisos Escherichia coli e Enterococcus spp foram isoladas (Seção 15.9). Suíno 124 (controle de desafio, D21) : Alterações macroscópicas não foram iden- tificadas na necropsia. Os testes de laboratório revelaram supurativa grave a meningoencefalite piogranulomatosa com perivasculite supu- rativa. Marcado do pulmão e congestão hepática também foram evidentes. O diagnóstico foi de Streptococcus suis associado meningoen- cefalite. Suíno 161 (controle de desafio, D10) : A necrópsia revelou lesões mínimas (condição de corpo pobre, leve). Bordetella bronchi- septica, Streptococcus e Staphylococcus alfa hemolítica auricularis foram isoladas a partir de tecidos do pulmão. Sorologia PRRS

[000516] Todos os suínos eram ELISA PRRS negativo em D0 e D7. Ao D14, 90% de Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 teve PRRS positivos titulação ELISA. Este número aumentou para 95% , em D21 e foi 100% , 100% , 100% , 90% , 100% e 95% , em D28, D56, D84, D112, D140 e D168, de uma maneira respectiva. Nenhum dos suínos de controle desenvolveram desafio PRRS titulação de anticorpos durante a fase de vacinação do presente estudo, a partir em D14 e D168 através de uma percentagem significativamente mais elevada de PRRS-MLV 94881 suínos vacinados tinham titulação de anticorpos PRRS positivos em comparação com os controles de desafio (p < 0,0001).

[000517] Durante a fase de desafio do estudo, as percentagens de PRRS 94881 suínos com PRRS positivos titulação de ELISA foram 95% , 95% , 100% e 100% em DPC 0, 3 DPC, DPC e 7 DPC10 MLV- vacinados, de uma maneira respectiva . Em contraste, os suínos de controle exposto não desenvolveram titulação de anticorpos de PRRS DPC até 7, quando 30% tinham titulação. Esta aumentou para 80% em 10 DPC. Os Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 apresentaram maior porcentagem de animais com titulação de anticorpos PRRS positivos durante toda a fase desafio do estudo (p < 0,0478).

[000518] Os suínos no grupo de controle negativo foram PRRS ELI- SA soronegativos ao longo do estudo, com exceção de dois suínos em D112. Os números 116 e 120 eram soropositivos PRRS ELISA em D112.

[000519] Um sumário das percentagens do grupo de suínos com titulação de anticorpos de PRRS-positivas antes de desafio é mostrado abaixo na Tabela 8.28. Os dados da porção de desafio do estudo são apresentados abaixo na Tabela 8.29. Tabela 8.27 Sumário do Grupo de Frequência de suínos com titulação de anticorpo PRRS Positivo por dia, dias 0 a 168

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. NI = Não incluído na análise estatística. NA = Não aplicável, nenhuma análise realizada Tabela 8.29 Sumário do Grupo de Frequência de suínos com Titulação de anticorpo PRRS positivo por dia, DPC 0 a DPC 10

1 Grupo 1 = Vacina MLV PRRS 94881, Grupo 2 = grupo de controle do desafio, Grupo 3 = grupo de controle negativo. NI = Não incluído na análise estatística.

DISCUSSÃO/CONCLUSÃO

[000520] Para alcançar o objetivo do estudo, vinte e dois (22), PRRS suínos sensíveis e soronegativos saudáveis IM foram inoculados com 1 mL de PRRS 94.881 MLV em cerca de 14 dias de idade. Trinta e quatro (22 suínos - grupo de controle do desafio e 12 suínos - grupo de controle negativo) PRRS suínos sensíveis e soronegativos IM foram inoculados com 1 mL do produto de controle em cerca de 14 dias de idade. A validação do estudo e modelo de desafio

[000521] Os suínos no grupo de controle negativo permaneceu negativo para PRRSV (viremia ; qPCR) ao longo do estudo. Dois suínos (N ° s 116 e 120) no grupo de controle negativo tinham titulação positiva de ELISA em D112, enquanto todos os outros resultados de ELISA para esse grupo foram negativos. Considerando que não foi detectada viremia em tais suínos ou no grupo como um todo, de igual modo, todas as outras amostras de soro foram ELISA negativo, os resultados para estes dois suínos D112 foram considerados falsos positivos pos- sivelmente devido a um erro de laboratório irrenunciável. Dessa maneira , este foi um estudo válido. Relação com o estabelecimento de um estudo válido, o grupo de controle negativo teve uma pontuação média histológico da lesão do pulmão de 9,0 em D189, em contraste com a média dA pontuação bruto lesão de 0,0% . Estes dados evidenciam que os suínos alojados sob condições de criação de suínos normais por um período prolongado de tempo desenvolvem lesões do pulmão pequenas que são irrelevantes e não relacionados com agentes patogênicos específicos.

[000522] Após a inoculação com isolado PRRS europeus 205817, por meio do método descrito anteriormente, o grupo de controle exibiu uma GDPA desafio significativo na DPC para DPC 0 9 de 0,2 kg/dia (GPD uma média de 0,5 kg/dia no grupo de controle negativo) , uma média da pontuação da lesão do pulmão bruta de 13,8% (0,0% para o grupo de controle negativo), uma média pontuação histológica da lesão do pulmão de 19,5 (9,0 para o grupo de controle negativo) e um valor médio de 6,25 log10 da GE/mL para a detecção de RNA de PRRSV no tecido do pulmão (média de 0,0 log10 da GE/mL para o grupo de controle negativo). Estes resultados evidenciam que a doença clínica específica do PRRS foram induzidos no grupo de controle exposto, validando assim este modelo de desafio como um instrumento de laboratório clínico adequado para avaliar a eficácia da vacina PRRS e, mais especificamente, 26 semanas de duração da imunidade PRRS 94.881 MLV. A determinação da 26 semana duração da imunidade de PRRS 94.881 MLV

[000523] Determinação do DOI para PRRS 94.881 MLV de 26 semanas pós-vacinação foi baseada no grupo da vacina exibindo uma redução significativa (p < 0,05) em lesões do pulmão pós-desafio (bruto ou histológico) em comparação com o grupo de controle do desafio.

[000524] As lesões do pulmão macroscópicas e histológicas foram selecionadas como o principal parâmetro para a determinação de 26 semanas DOI porque este parâmetro fornece a evidência mais clini-camente relevantes e convincentes de eficácia na avaliação de uma nova vacina dentro do modelo de desafio respiratório PRRS em suínos. Desenvolvimento da lesão do pulmão é uma das marcas da PRRS doenças respiratórias em suínos e pode ser considerado a fonte de todas as manifestações posteriores de características secundárias doença PRRSV como sinais clínicos, pirexia, diminuição GPMD, etc

[000525] O grupo de 94.881 MLV PRRS apresentaram uma redução significativa na patologia do pulmão bruto pós-desafio, como evidenciado por uma média dA pontuação de lesão do pulmão bruta de 0,1% em comparação com o grupo de controle, desafio, que apresentou um pontuação médio de lesão do pulmão bruta de 13,8% (p < 0,0001). Além disso, o grupo de 94.881 MLV PRRS apresentaram uma redução significativa na pontuação de lesão do pulmão histológicos, como evidenciado por uma média histologia do pulmãopulmão de pontuação da lesão de 6,0 para o grupo de PRRS 94.881 MLV em comparação com uma média histologia do pulmão de pontuação da lesão de 19,5 para o grupo de controle exposto (p < 0,0001). Dessa maneira , o DOI de 26 semanas para a PRRS 94.881 MLV na dosagem de 1 x 104,27 TCID50 foi estabelecido com base no parâmetro principal de uma redução significativa das lesões do pulmão pós-desafio. Este resultado foi alcançado com uma dose de vacina, ligeiramente menor do que a dose imunizante mínima alvo em 1 x 104,5 TCID50/mL. Um suíno do controle de desafio (n ° 123) não poderia ser marcado para lesões macroscópicas do pulmão por causa de pleurite e aderências, devido a infecções bacterianas, mas foi marcado por lesões do pulmão histológicas. A omissão desse suíno de análise da pontuação bruta do grupo de controle de desafio da lesão de pulmão não afetou o resultado des- te estudo.

[000526] A viremia pós-desafio foi escolhida como o parâmetro secundário mais importante, pois representa o nível de replicação viral e persistência que ocorre dentro do animal hospedeiro após a exposição. Uma redução significante (p < 0,05) em que a viremia corresponder com uma vacina de PRRS que induz imunidade adequada para limitar PRRS patogênese dentro do hospedeiro. No 3, 7 e 10 dias após o desafio, a 94.881 MLV grupo vacinado de PRRS demonstraram uma redução significativa na virémia (qPCR), em comparação com o grupo de controle exposto (p < 0,0001). Para avaliar ainda mais a viremia pós-desafio entre os grupos, a quantidade da carga viral ao longo de um período de tempo específico após o desafio foi calculado, como representado como "área sob a curva" ou AUC. A grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 tinha um valor médio de AUC 0 DPC para DPC 10 de 15,54 log10 GE/ml/dia, enquanto que o grupo de controle exposto tinha um valor médio de 44.77 AUC log10 GE/ml/dia (p < 0,0001) . Além disso, o grupo de 94.881 MLV-PRRS vacinados teve um valor médiao de 3 a AUC de DPC para DPC 10 de 8,88 log10 GE/ml/dia, enquanto que o grupo de controle de desafio tinha um valor médio de AUC para este período de 36,43 log10 GE/ml/dia (p < 0,0001). Se a viremia foi analisada no tempo de pontos de pós-desafio específico ou ao longo do período de pós-desafio, PRRS 94.881 MLV administrado 26 semanas antes do desafio com uma cepa virulenta de PRRS europeu heterólogo de forma significativa (p < 0,05) reduziu a viremia após a inoculação desafio.

[000527] Em associação com uma redução de PRRS viremia pós- desafio, uma redução significativa (p < 0,05) na carga viral no tecido do pulmão também seria de grande importância sob o ponto de vista da imunidade vacina PRRS. Uma redução da carga viral no tecido do pulmão podem ser associados com a estabilidade viral reduzida, repli- cação e persistência no interior do hospedeiro e, secundariamente, podem levar à diminuição da excreção de PRRSV para outros animais. Neste estudo, os tecidos do pulmão do grupo de 94.881 MLV PRRS apresentaram uma média resultado qPCR pulmão de 3,69 log10 da GE/ml 10 dias após o desafio (DPC 10), enquanto o grupo de controle de desafio tinha uma média resultado qPCR pulmão de 6,25 log10 da GE/mL. A diferença entre o grupo vacinado e o grupo de controle exposto foi significativa (p < 0,0001), suportando, dessa maneira , ainda mais a duração da imunidade de 26 semanas.

[000528] A redução acentuada na gravidade e frequência dos sinais clínicos pós-desafio em suínos também seria favorável à PRRS a eficácia da vacina e criação do DOI de 26 semanas para a PRRS 94.881 MLV. Apenas um suíno apresentou sinais clínicos após desafio : Suíno 149 (controle de desafio) tiveram uma pontuação respiratória de "1" (respiração ofegante/rapid) em D185. Nenhum suíno no grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 apresentaram sinais clínicos durante a fase de pós-desafio deste estudo e não houve diferenças estatísticas significativas entre os vacinados e os grupos de controle de desafio (p = 0,4878 ou nenhum teste realizado). Os sinais clínicos pós-desafio não eram fortes o suficiente neste estudo para avaliar o DOI.

[000529] Pirexia entre grupos variou pós-desafio. Suínos vacinados com MLV PRRS 94881 apresentaram significativamente Média LS da temperatura retal mais baixa em dois dias (DPC 8 e DPC 10 ; (p < 0,0183) e média LS de temperatura retal maior em quatro dias (DPC 0, DPC 2, 4 e DPC DPC 5 ; p < 0,0281) em comparação com animais controles de desafio. Caso contrário, não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos de pós-desafio (p > 0,0642). Embora tenham sido detectadas diferenças estatísticas entre os grupos de pós- desafio, essas diferenças não eram biologicamente significativas, considerando que média retal temperaturas permaneceu < 39,9 ° C (grupo de controle exposto, D182) para todos os grupos. Nenhuma diferença foi verificada entre os grupos no que diz respeito à percentagem de leitões com pirexia durante pelo menos um dia pós-desafio (p = 0,4537).

[000530] A presença de viremia significativa, patologia do pulmão e carga viral no tecido do pulmão devido à PRRS do grupo de controle de desafio resultou em uma diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos para o peso corporal em 9 DPC. Neste estudo, os LS vacinados e o grupo de controle apresentou média desafio pesos corporais em DPC 9 de 138,3 kg e 130,3 kg, de uma maneira respectiva (p = 0,0455). O LS significa GDPA de DPC para DPC 0 9 eram 0,4 kg/dia e 0,2 kg/dia, para os grupos vacinados e de desafio, de uma maneira respectiva. Esta diferença não foi estatisticamente significativa (p = 0,1041). Parâmetros Pós-Vacinação examinados neste estudo

[000531] Três suínos foram encontrados mortos durante a fase de vacinação deste estudo. Suíno 179 (PRRS 94.881 MLV-vacinados) foi encontrado morto em D6 associado com infecções suaves Escherichia coli e Enterococcus spp. Suíno 161 (grupo de controle do desafio) foi encontrado morto em D10 associado com Bordetella bronchiseptica, Streptococcus alfa hemolítico e infecções auricularis Staphylococcus. Suíno 124 (grupo de controle do desafio) foi encontrado morto em D21 associada a uma infecção por Streptococcus suis que ia levar a me- ningoencefalite. Para controlar e prevenir mais mortes, os suínos foram massa tratada com vitaminas e antibióticos injetáveis. Após os tratamentos, não houveram mais mortes ocorrendo. Desde mortes ocorreram em ambos os grupos de tratamento, pode-se presumir que a própria PIV não foi associada com as infecções. Mais provavelmente, os suínos chegaram ao centro de pesquisa abrigando essas infecções. Os dados para estes suínos foram incluídos, quando disponí- veis. As pontuações de lesão do pulmão macroscópicas e histológicas destes suínos foram omitidos das análises de lesão do pulmão uma vez que estes suínos morreram antes da administração desafio. A perda de um - PRRS 94.881 MLV suíno e dois - suíno controle de desafio durante o período de tempo prolongado de vacinação para desafio não afetou o resultado do estudo.

[000532] Não há avaliações clínicas anormais relacionadas com PRRS 94.881 MLV vacinação ou produto de controle foram observadas em suínos após a inoculação em D0. Sete suínos no grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 teve avaliações anormais após a vacinação, enquanto treze suínos controle de desafio teve avaliação anormais. Excluindo-se os três suínos que morreram devido a infecções bacterianas, essas avaliações anormais incluído magreza, tosse, inchaço, pêlos arrepiados, depressão, abscessos e condição corporal deficiente em vários pontos no tempo, nenhum dos que durou um longo período de tempo. Na opinião do autor, estes resultados não foram relacionados para a administração de qualquer produto experimental, mas são achados típicos de crescimento/amadurecimento suínos, em situações de alojamento do grupo, durante um período prolongado de tempo.

[000533] Todos os suínos eram PRRS ELISA de sorologia negativa em D0, confirmando, dessa maneira , que todos os suínos conheceram o critério de inclusão de sPRRS sero-negativos quando na entrada no estudo. A maioria dos suínos (90%) a receber PRRS 94.881 MLV sero-convertido PRRS por D14 e todas PRRS vacinados suínos eram soropositivos por D28. Por outro lado, os suínos de controle permaneceram seronegativos desafio até 7 dias após o desafio, quando este grupo começou a demonstrar PRRS seroconversão. Conforme abordado anteriormente, dois - os suínos de controle negativos foram PRRS ELISA soropositivos em D112, que foi considerado um achado incidental, possível devido a um erro de laboratório irrenunciável.

[000534] Aos 7, 14, 21 e 28 dias pós-vacinação, o grupo vacinado com PRRS - MLV 94881 exibiu a média dos resultados qPCR de 3,00, 0, 0 e 3,00 log10 GE/mL, de uma maneira respectiva. Esses resultados evidenciam que dentro de 4 semanas após a vacinação, em uma dose de 1 x 104,27 TCID50 de PRRS 94.881 MLV induzida replicação suficiente do MLV, que é muitas vezes necessário para construir a imunidade protetora já às 4 semanas após a vacinação. Por outro lado, o grupo de controle de desafio foi negativo para PRRS viremia até três dias pós-desafio.

Conclusão

[000535] Uma redução significativa (p < 0,05) de lesões macroscópicas e histológicas do pulmão na necropsia, a carga viral em tecidos do pulmão à necropsia e viremia pós-desafio para o 94881 grupo MLV PRRS comparado a grupo de controle de desafio demonstrou a eficácia da vacina contra PRRSV virulenta quando vacinadas às 2 semanas de idade e desafiados 26 semanas pós-vacinação. Os resultados deste estudo, portanto, apóiam a demonstração da duração da imunidade de 26 semanas após a vacinação com o PRRS 94.881 MLV. Estes resultados foram obtidos com uma dose de vacina de 1 x 104,27 TCID50/mL, o que foi ligeiramente menor do que a dose imunizante mínima (1 x 104,5 TCID50/ml).

[000536] As sequências da cepa atenuada PRRSV 94881 e a cepa parental são como se segue: SEQ ID NO : 1 : SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS COMPRIMEN TO COMPLETO DE PRRS do Vírus da Semente Principal de 94881 1 TTTGTGTACC TTGGAGGCGT GGGTACAGCC CTGCCCCACC CTTTGGTCCC TGTTCTAGCC 61 CGACAAGTAC CCTTCTCTCT CGGGGCGAGC GCGCCGCCTG CTG- CTCCCTT GCGGCGGGAA 121 GGACCTCCCG AGTATTTCCG GAGAGCACCT GCTTTACGGG ATCTCCGCCC TTTAACCATG 181 TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGG- TATTTTG GAACGCCGGC 241 CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC 301 ACGGACCTCG GTGCAGTTGG ACAAGCTCCA TTGGAAAGTT CTTGTTTCAC AAGCCTAAAG 361 CCCATTGGTA TCCCCCAGGT GTTGCTGGCT GTCAACCATT GGAATGTTCT CCATCTGGGT 421 TTTCCTTTAG CGCGCATGAC TTCAACGACT CGTGAAGGTT CTCCGGCAAT CACAACTTCC 481 GCTGATGTAT TGTACCGTGA CGGTTGCTTA ACCCCTAGAC AC- CTCCGTGA ACTCCAAGTT 541 TACGAGCGTG GTTGCAATTG TGCCTGGGAT GGCTGTGTAC GTATCCGATT ACGGGGCCTG 601 GCGAACTCCA TGCACGTGTC CCACTCATGT GTTAACAAAT CGACCAACCG TTCCCTGGTG 661 TCCCCTTTGC CTCAACGGGC CGTTCGAAGA GGCCCATTCT TTGTCGGCAG CCGTTCTGTC 721 AGCATATACA GGTGGGAAAA CCTCCTCCGA CGGTCGATCT ATTTGTAATT TTTATGGATT 781 CGCATGATGT GGACTCCGGA TGGAAGTTCT GCCGCCCGAG ATCCGATGAC TCCACGGCTT 841 CTAGAACACC AGGTCAAGGT CCCATCACCT TGTCGACCTT CCTTGTTCGG AGCTTTCCCG 901 GCCGATTGGG AGCTCACTGA CCTTCAGCAC GTCACATCCT GTCCCCTGAT AACGGTTTTT 961 TGCGGCTACC TTGTTCGGGA CCCGGCTGTA TCCGAAGGCA AG- TGTTGGCT TTCCTGCTTT 1021 TTGAGCCAGT CAGCCGAAGT GCTCAGTCGC GAGGCGCATC TGGCTACCGC CTATGGTTAC 1081 CAAACCAAGT GGGGTGTGCC TGGCAAGTAC ATCCAGCGCA GA- CTTCAAGT TCACGGTCTC 1141 CGTGCTGTGG TCGACCCTGA TGGTCCCATT CACGTTGAAG CA- TTGTCTTG CCCCCAGTCT 1201 TGGATCAGGC ACTTGACCCT GAATGATGAT GTCACCCCGG GATTCGTTCG CCTAATGTCT 1261 CTTCGCATTG TGCCGAACAC AGAGCCTACC ACACACCGGA TCTTTCGTTT TGGAGTGCAC 1321 AAGTGGTATG GTGCCGCCGG CAAACGGGCC CGTGGCAAGC GTGCCGCCAA AAGTGAGAAA 1381 GACTCGGCTT CCACCCTCAA GGTTGCCCGA CCGACTTCCA CCAGTGGAAT CGTCACCTAC 1441 TCCCCACCTG CGGACGGGTC TTGTGGTTGG CATGCCCTTG CCGCCATACT GAACCGGATG 1501 ATTAATAATG ACTTCACGTC CCCTCTGCCT CGGTACAACA GGCCGGAGGA CGATTGGGCT 1561 TCTGATGGTG ACCTTGCTCA GGCCATTCAA TGTTTGCAAC TACCTGCCGC CATAGCTCGG 1621 AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC ATAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA 1681 GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AG- TGCGTTGT TGGCGTCTGC 1741 TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG 1801 GCCCTGGCGT CTGCTTATAG ACTGCCTTCA GACTGTGTTT GTGATGGTAT TATTGACTTC 1861 CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AA- ATGTTGAC TTCCCCGTCA 1921 CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGTCTGTAT AAATTGTTGT TAGAGATCTT GCCGCAGAAA 1981 TGCGGATCCA CAGAAGGGGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG 2041 AGCTCCAAAC AGGCCATGGC TCCCATCCTC AAAGGCCCCA 2101 TCCGTGACTC TGAACGAGTG TCAACTCTGA GTTAATATCT 2161 TGGGAAGAGC CCAAAGACCC GTCCATCGGA TGCAAAAGAA 2221 TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA GTAAGGTCCT TCACCCTGTG 2281 GTCCTTACCG AGGAACTTAG TTGAGGGTGA TCAGGATATG 2341 CCACTGGATT TGACTTGGCC CCCCTGTTAG AGGGCCGGTA 2401 CCGGACAATT TGAGCTCTGG CCGTTCAAGA ACTCATTCTG 2461 GCGAGGCCTG CACCCCGTCT TGTTGAGCGC TGTGGCACGG AG- TCGAACGG 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AACTGAAACG GCGGTAAAAA TCGTAAAATA CCACAGCAGA ACTTTCACCT 7321 TAGGCTCTTT AGACCTAAAA GTCACCTCCG AGGTGGAGGT GAAGAAATCA ACTGAGCAGG 7381 GGCACGCTGT CGTGGCGAAC TTATGTTCCG GTGTCGTCTT GATGAGGCCT CACCCACCGT 7441 CCCTTGTTGA CGTTCTCCTC AAACCCGGAC TTGACACAAC AC- CCGGCATT CAACCAGGGC 7501 ATGGGGCCGG GAATATGGGC GTGAACGGTT CTATTTGGGA TTTTGAAACT GCACCCACAA 7561 AGGTAGAACT AGAGTTGTCC AAGCAAATAA TCCAAGCATG TGAAGTCAGG CGCGGGGACG 7621 CCCCTAACCT CCAACTCCCC TACAAGCTTT ATCCTGTCAG GGGGGACCCC GAGCGGCGTA 7681 AAGGTCGCCT TGTCAACACT AGGTTTGGAG ATTTACCTTA CA- AAACTCCC CAAGACACCA 7741 AGTCCGCAAT TCATGCGGCT TGTTGCCTGC ATCCCAATGG GGTCCTCGTG TCTGATGGCA 7801 AATCCACGCT GGGTACCACT CTTCAACATG GTTTCGAGCT TTATGTCCCC ACTGTACCTT 7861 ATAGTGTCAT GGAATACCTT GATTCACGCC CTGACACCCC TTTTATGTGT ACTAAACATG 7921 GCACTTCCAA GGCTGCTGCA GAGGACCTCC AAAAATATGA CCTATCCACT CAAGGGTTTG 7981 TCTTGCCTGG GGTCCTACGC CTAGTGCGCA GGTTCATCTT TAGCCATGTT GGTAAGGCGC 8041 CACCACTGTT CCTTCCATCA ACCTACCCTG CCAAGAACTC CA- TGGCAGGG GTCAATGGCC 8101 AGAGGTTCCC 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10621 TCGCTAGTAT GCGCCCAATT GATGCCCGCT ACAGCAAGCC AATGGTCGGT GCAGGGTATG 10681 TGGTCGGGCC ATCCATTTTT CTTGGCACTC CTGGTGTGGT GTCATACTAT CTCACATTAT 10741 ACATCGGGGG CGAGCCTCAG GCCCTGCCAG AAACACTCGT TTCAACAGGA CGTATAGCCA 10801 CAGATTGTCG GGAATATCTC GACGCGGCTG AGGAAGAGGC AGCGAGAGAA CTTCCCCACG 10861 CATTTATTGG CGATGTCAAA GGCACTACGA TCGGGGGGTG TCACCACATT ACATCGAAAT 10921 ACCTACCTAG GTCCCTGCCT AAAGACTCTG TTGCTGTGGT TGGGGTGAGT TCGCCCGGTA 10981 GGGCTGCTAA AGCCGTGTGC ACTCTCACCG ATGTGTACCT CCCCGAACTC CGACCATATT 11041 TGCAACCGGA GACGGCATCA AAATGCTGGA AACTTAAACT GGATTTCAGG GATGTTCGAC 11101 TGATGGTCTG GAAAGGCGCC ACAGCCTATT TCCAGTTGGA AGGGCTGACA TGGTCAGCGC 11161 TGCCCGATTA TGCTAGGTTC ATTCAGCTAC CCAAGGATGC CGTTGTGTAC ATCGATCCGT 11221 GTATAGGGCC GGCAACAGCC AATCGCAAGG TTGTGCGAAC CACAGACTGG CGGGCCGACC 11281 TGGCAGTGAC ACCGTATGAT TACGGTGCTC AGGTCATTTT GACAACAGCC TGGTTCGAGG 11341 ACCTTGGGCC GCAGTGGAAG ATTTTGGGGT TGCAGCCTTT CAGACGAACA TTTGGCTTTG 11401 AGAACACTGA AGATTGGGCA ATTCTCGCAC GCCGTATGAA TGACGGCAAA 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CAGTGCTTTG GCTTCGAATT 12301 CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA 12361 CTATCAATTA CACTATATGT AAGCCATGCC CTACCAGTCA AGCTGCCCAA CAAAGACTCG 12421 AGCCTGGCCG TAACGTGTGG TGCAAAATAG GGCACGACAG GTGTGAGGAA CGTGACCATG 12481 ATGAGTTGTC AATGTCCATT CCGTCCGGGT ACGACAACCT CAAACTTGAG GGTTATTATG 12541 CTTGGCTGGC TTTTTTGTCC TTTTCCTACG CGGCCCAATT CCATCCGGAG CTGTTCGGAA 12601 TAGGAAACGT GTCGCGCGTC TTTGTGGATA AGCGACACCA GTTCATTTGC GCCGAGCATG 12661 ATGGACAAAA TTCAACCATA TCTGCCAGAC ACAACATCTC CGCGTCGTAT GCGGTGTATT 12721 ACCATCATCA AATAGACGGG GGCAATTGGT TTCATTTGGA ATGGCTGCGA CCATTCTTTT 12781 CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT 12841 CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT 12901 TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT 12961 CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAACGGC 13021 TAATGTGACC GATGAATCGT ATTTGTACAA CGCGGACTTG CTGATGCTTT CCGCGTGCCT 13081 TTTCTACGCC TCGGAAATGA GCGAGAAAGG CTTCAAAGTC ATCTTTGGGA ATATTTCTGG 13141 CGTTGTTTCC GCTTGTGTTA ATTTCACAGA TTATGTGGCC CATGTGACCC AACACACTCA 13201 GCAGCACCAT TTGGTAATTG ATCACATTCG GTTACTACAC TTCTTGACAC CGTCTACGAT 13261 GAGGTGGGCT ACAACCATTG CTTGTTTGCT TGCCATTCTT TTGGCGGTAT GAAATGTTCT 13321 TGCAAGTTGG GGCATTTCTT GACTCCTCAC TCTTGCTTCT GGTGGCTTTT TTTGCTGTGT 13381 ACCGGCTTGT CTTGGTCCTT TGTCGATGGC AACGACGACA GCTCGACATC CCAATACATA 13441 TATAATTTGA CGATATGCGA GCTGAATGGG ACCGAATGGT TGTCCGGTCA TTTTGATTGG 13501 GCAGTCGAAA CCTTTGTGCT TTACCCAGTT GCCACTCATA TCATTTCACT GGGTTTTCTC 13561 ACAACAAGCC ATTTCCTTGA TGCGCTCGGT CTCGGCGCTG TGTCCGCCAC AGGATTCATT 13621 GGCGAGCGGT ATGTACTTAG CAGCATGTAC GGCGTTTGCG CCTTCGCGGC GTTCGTATGT 13681 TTTGTCATCC GTGCTGCTAA AAATTGCATG GCTTGCCGCT ATGCCCGCAC CCGGTTTACC 13741 AACTTCATCG TGGACGACCG GGGAAGAATC CATCGATGGA AGTCTTCAAT AGTGGTGGAG 13801 AAATTGGGCA AAGCTGAAGT CGGTGGTGAC CTTGTCAACA TTAAGCATGT TGTCCTCGAA 13861 GGGGTTAAAG CTCAACCTTT GACGAGGACT TCGGCTGAGC AATGGGAAGC CTAGACGACT 13921 TTTGCAACGA TCCCACCGCC GCACAAAAAC TCGTGCTGGC CTTTAGCATC ACATATACAC 13981 CCATAATGAT ATACGCCCTT AAGGTGTCAC GCGGCCGACT CCTGGGGCTG TTGCACATCT 14041 TGATATTTCT GAATTGTTCC TTTACTTTTG GGTACATGAC ATATGTGCAT TTTCAATCCA 14101 CCAACCGTGT CGCATTCACT CTGGGGGCTG TAGTCGCCCT TTTGTGGGGT GTTTACAGCC 14161 TCACAGAGTC ATGGAAGTTC ATCACTTCCA GATGCAGATT GTGTTGCCTA GGCCGGCGAT 14221 ACATTCTGGC CCCTGCCCAT CACGTAGAAA GTGCTGCAGG CCTCCATTCA ATCCCAGCGT 14281 CTGGTAACCG AGCATACGCT GTGAGAAAGC CCGGACTAAC ATCAGTGAAC GGCACTCTAG 14341 TACCTGGGCT TCGGAGCCTC GTGCTGGGCG GCAAACGAGC TGTTAAACGA GGAGTGGTTA 14401 ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAAGAACCAG AGCCAGAAGA AAAGAAGAAA TGCAGCTCCG 14461 ATGGGGAAAG GCCAGCCAGT CAATCAACTG TGCCAGTTGC TGGGTACAAT GATAAAGTCC 14521 CAGCGCCAGC AATCTAGGGG AGGACAGGCC AAAAAGAAGA AGCCTGAGAA GCCACATTTT 14581 CCCCTAGCTG CTGAAGATGA CATTCGGCAC CATCTCACCC AGGCCGAACG TTCCCTCTGC 14641 TTGCAATCGA TCCAGACGGC TTTCAATCAA GGCGCAGGAA CTGCGTCGCT TTCATCCAGC 14701 GGGAAGGTCA GTTTCCAGGT TGAGTTCATG CTGCCGGTTG CTCATACAGT GCGCCTGATT 14761 CGCGTGACTT CTACATCCGC CAGTCAGGGT GCAAATTAAT TTGACAGTCA GGTGAATGGC 14821 CGCGATTGAC GTGTGGCCTC TAA SEQ ID NO : 2 : ORF 1a DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEO- TÍDEOS 178..7227 MSGMFSRCMCTPAARVFWNAGQVYCTRCLSARSLLSPELQDTDL- GAVGLFHKPKDKLHWKVPIGIPQVECSPSGCCWLSTIFPLARMTSGNHN- FLQRLVKVADVLYRDGCLTPRHLRELQVYERGCNWYPITGPVPGMAVYANS- MHVSDQPFPGATHVLTNSPLPQRACRQPFCPFEEAHSSIYRWEK- FVIFMDSSSDGRSRMMWTPESDDSTALEVLPPELEHQVKVLVRSFPAHHLV- DLADWELTESPDNGFSFSTSHPCGYLVRDPAVSEGKCWLSCFLSQSAEVLS- REAHLATAYGYQTKWGVPGKYIQRRLQVHGLRAVVDPDGPI- HVEALSCPQSWIRHLTLNDDVTPGFVRLMSLRIVPNTEPTTHRIFRF- GVHKWYGAAGKRARGKRAAKSEKDSASTLKVARPTSTSGIVTYSPPAD- GSCGWHALAAILNRMINNDFTSPLPRYNRPEDDWASDGDLAQAIQCLQL- PAAIRNARACPNAKYLIKLNGVHWEVEVRPGMAPRSLSRECVVGVCSEG- CVASPYPEDGLPKRALEALASAYRLPSDCVCDGIIDFLANPPPQEFWTLDK- MLTSPSPEQSGFSSLYKLLLEILPQKCGSTEGEFIYTVERMLKDCPSSKQA- MALLAKIKVPSSKAPSVTLNECFPTDVPVNSELISWEEPKDPGAAVVLCPS- DAKESKETAPEEAQRNARKVLHPVVLTEELSEQQVQVVEGDQDMPLDLTW- PTLTATATPVRGPVPDNLSSGIGAQPATVQELILARPAPRLVERCGTES- NGSSSFLDLPDVQTSDQPLDLSLAAWPVRATASDPGWIHGRREPVFVK- PRGVFSDGESALQFGELSEASSVVDDRTKEAPVVDAPIDLTTSNETLSGSD- PFEFAKFRRPRFSAQALIDRGGPLADVHAKIKSRVYEQCLQACEPGS- RATPATKKWLDKMWDRVDMKTWRCTSQFQAGHILESLKFLPDMIQDTPPPV- PRKNRAGDSAGLKQLVAQWDRKSSVTPPTKPVGPVLDQAVPLPMDIQQG- DAISADKPPHSQNPSSQVDVGGGWKSFMLSGTRFAGSVSQR- LTTWVFEVLSHLPAFMLTLFSPRGSMAPGDWLFAGAVLLALLLCRSYPILG- CLPLLGVFSGSVRCVRLGVFGSWMAFAVFLFSTPPDPVGSSCDHDSPECHA- ELLALEQRQLWEPVRSLVVGPSGLLCVILGKLLGGSRCLWFVLL- RICMLADLAISLIYVVSQGRCHKCWGKCIRTAPAEVALNVFPFSRATRSS- LVSLCDRFQAPKGVDPVHLATGWRGCWCGESPIHQSHQKPIAYANLDEK- KISAQTVIAVPYDPSQAIKCLKVLQAGGAIVD- QPTPEVVRVSEIPFSAPFFPKVPVNPDCRVVVDSDTFVAA- VRCGYSTAQLVLGRGNFAKLNQTPLRNSVPTKTTGGASYTLAVAQVSVW- TLVHFILGLWLTSPQVCGRGTSDPWCSNPFSYPTYGPGVVCSSRLCVSAD- GVTLPLFSAVAHLSGREVGIFILVLASLGALAHRLALKADMSMVFLAFCA- YAWPMSSWLICFFPMLLRWVTLHPLTMLWVHSFLVFCLPAAGVLSL- GITGLLWAVGRFTQVAGIITPYDIHQYTSGPRGAAAVATAPEGTYMAAVR- RAALTGRTLIFTPSAVGSLLEGAFRTQKPCLNTVNVVGSSLGSGGVFTID- GRRVIVTATHVLNGNTARVTGDSYNRMHTFNTNGDYAW- SHADDWQGVAPMVKIAKGYRGRAYWQTSTGVEPGIMGEG- FAFCFTNCGDSGSPVISEAGDLIGVHTGSNKLGSGLVTTPEGETCSIKETR- LSDLSRHFAGPSVPLGDIKLSPAIIPDVTTIPSDLASLLASVPVME- GGLSTVQLLCVFFLLWRMMGHAWTPIVAVGFFLLNEILPAVLVRAVFSFAL- FVLAWATPWSAQVLMIRLLTAALNRNRLSLAFYAFGGVVGLATEIGT- FAGGWPELSQALSTYCFLPRFLAVTSYVPTIIIGGLHALGVILWLF- KYRCLHNMLVGDGSFSSAFFLRYFAEGNLRKGVSQSCGMNNESLTAALAC- KLSQADLDFLSSLTNFKCFVSASNMKNAAGQYIEAAYARALRQELASLVQV- DKMKGVLAKLEAFAETATPSLDTGDVIVLLGQHPHGSILDINVGGER- KTVSVQETRCLGGSKFSVCTVVSNTPVDTLTGIPLQTPTPLFENGPRHRSE- DDDLKVERMKKHCVSLGFHKINGKVYCKIWDKSNGDTFYTDDSRYT- QDHAFQDRSTDYRDRDYEGVQTAPQQGFDPKSEAPVGTVVIGGITYN- RHLVKGKEVLVPKPDNCLEAARLSLEQALAGMGQTCDLTATEVEKLKRIIS- QLQGLTTEQALNC SEQ ID NO : 3 ORF 1B DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEO- TÍDEOS 7209...11600 TGFKLLAASGLTRCGRGGLVVTETAVKIVKYHSRTFTLGSLDLKVTSE- VEVKKSTEQGHAVVANLCSGVVLMRPHPPSLVDVLLKPGLDTTPGI- QPGHGAGNMGVNGSIWDFETAPTKVELELSKQIIQACEVRRGDAPNLQL- PYKLYPVRGDPERRKGRLVNTRFGDLPYKTPQDTKSAIHAAC- CLHPNGVLVSDGKSTLGTTLQHGFELYVPTVPYSVMEYLDSRPDTPFMCT- KHGTSKAAAEDLQKYDLSTQGFVLPGVLRLVRRFIFSHVGKAPPLFL- PSTYPAKNSMAGVNGQRFPTKDVQSIPEIDEMCARAVKENWQTVTPCTLK- KQYCSKPKTRTILGTNNFIALAHRSALSGVTQAFMKKAWKSPIALGKNKF- KELHCTVAGRCLEADLASCDRSTPAIVRWFVANLLYELAGCEEYLPSY- VLNCCHDLVATQDGAFTKRGGLSSGDPVTSVSNTVYSLIIYAQHMVLSALK- MGHEIGLKFLEEQLKFEDLLEIQPMLVYSDDLVLYAERPT- FPNYHWWVEHLDLMLGFKTDPKKTVITDKPSFLGCRIEAGRQLVPNRDRI- LAALAYHMKAQNASEYYASAAAILMDSCACIDHDPEWYEDLICGIARCAR- QDGYRFPGPAFFMSMWEKLKSHNEGKKCRHCGICDAKADYASACGLDL- CLFHSHFHQHCPVTLSCGHHAGSKECSQCQSPVGAGKSPLDAVLKQIPYK- PPRTIIMKVDNKTTTLDPGRYQSRRGLVAVKRGIAGNEVDLSDGDYQVV- PLLPTCKDINMVKVACNVLLSKFIVGPPGSGKTTWLLN- QVQDDDVIYTPTHQTMFDIVSALKVCRYSIPGASGLPFPPPARSGPWVR- LIASGHVPGRVSYLDEAGYCNHLDILRLLSKTPLVCLGDLQQLHPVG- FDSYCYVFDQMPQKQLTTIYRFGPNICAAIQPCYREKLESKRNATRVVFT- TRPVAFGQVLTPYHKDRTGSAITIDSSQGATFDIVTLHLPSPKSLNKS- RALVAITRARHGLFIYDPHDQLQEFFNLTPERTDCNLAFSRGDELVVLNVD- NAVTTVAKALETGSPRFRVSDPRCKSLLAACSASLEGSCMPLPQVAHNLG- FYFSPDSPAFAPLPKELAPHWPVVTHQNNRAWPDRLVASMRPIDARYSK- PMVGAGYVVGPSIFLGTPGVVSYYLTLYIGGEPQALPETLVSTGRIA- TDCREYLDAAEEEAARELPHAFIGDVKGTTIGGCHHITSKYLPRSLPK- DSVAVVGVSSPGRAAKAVCTLTDVYLPELRPYLQPETASKCWKL- KLDFRDVRLMVWKGATAYFQLEGLTWSALPDYARFIQLPKDAVVYIDPCIG- PATANRKVVRTTDWRADLAVTPYDYGAQVILTTAWFEDLGPQWKIL- GLQPFRRTFGFENTEDWAILARRMNDGKDYTDYNWHCVRERPHAI- YGRARDHTYHFALGTELQVELGRPRLPPEQVP SEQ ID NO : 4 ORF 2 DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 11611..12360 MQWVYCGVKSVSCSWMPSLSSLLVWLTLSSFSPYCLGSLLQAGYWSS- FSEWFAPRFSVRALPFTLPNYRRSYEGLLPNCRPDVPQFAVKHPLGILWHM- RVSHLIDEMVSRRIYRTMEHSGQAAWKQVVSEATLTKLSRLDVVTHFQHLA- AVEADSCRFLSSRLAMLKNLAVGNVSLEYNTTLDRVELIFPTPG- TRPKLTDFRQWLISVHASIFSSVASSVTLFTVLWLRIPALRYVFGFHWPTA- THHSN SEQ ID NO : 5 ORF 3 DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 12219..13016 MAYQRARFHLLLCGFVCYLVHSALASNSSSTLCFWFPLAHGNTSFEL- TINYTICKPCPTSQAAQQRLEPGRNVWCKIGHDRCEER- DHDELSMSIPSGYDNLKLEGYYAWLAFLSFSYAAQFHPELFGIGNVSRVFV- DKRHQFICAEHDGQNSTISARHNISASYAVYYHHQIDGGNWFHLEWL- RPFFSSWLVLNISWFLRRSPASPASRRIYQILRPTRPRLPVSWSFRT- SIVSNLTGPQQRKVPLPSGGRPNVVKPSAFPSTSR SEQ ID NO : 6 ORF 4 DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 12761..13312 MAATILFLLAGAQHLMVSEAFACKPCFSTHLSDIKTNTTAAAGFMVLQNIN- CFQSHRASTAQGTTPLRRSSQCREAVGIPQYITITAN- VTDESYLYNADLLMLSACLFYASEMSEKGFKVIFGNISGVVSACVNFTDY- VAHVTQHTQQHHLVIDHIRLLHFLTPSTMRWATTIACLLAILLAV SEQ ID NO : 7 ORF 5 DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 13309..13914 MKCSCKLGHFLTPHSCFWWLFLLCTGLSWSFVDGNDDSSTSQYIYNLTI- CELNGTEWLSGHFDWAVETFVLYPVATHIISLGFLTTSHFLDALGL- GAVSATGFIGERYVLSSMYGVCAFAAFVCFVIRAAKNCMACRYARTRFTN- FIVDDRGRIHRWKSSIVVEKLGKAEVGGDLVNIKHVVLEGVKAQPL- TRTSAEQWEA SEQ ID NO : 8 ORF 6 DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 13902..14423 MGSLDDFCNDPTAAQKLVLAFSITYTPIMIYALKVSRGRLLGLLHILI- FLNCSFTFGYMTYVHFQSTNRVAFTLGAVVALLWGVYSLTESWKFITSRCR- LCCLGRRYILAPAHHVESAAGLHSIPASGNRAYAVRKPGLTSVNGTLVPGL- RSLVLGGKRAVKRGVVNLVKYGR SEQ ID NO : 9 ORF 7 DE 94881 MSV CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 1 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 14413..14799 MAGKNQSQKKRRNAAPMGKGQPVNQLCQLLGTMIKSQRQQSRGGQAKKKK- PEKPHFPLAAEDDIRHHLTQAERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGKVS- FQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAN SEQ ID NO : 10 DE SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE COM PRIMENTO TOTAL DE CEPA PRRS 94881 PARENTAL 1 TTTGTGTACC TTGGAGGCGT GGGTACAGCC CTGCCCCACC CCTTGGCCCC TGTTCTAGCC 61 CGACAGGTAC CCTTCTCTCT CGGGGCGAGC GCGCCGCCTG CTG- CTCCCTT GCGGCGGGAA 121 GGACCTCCCG AGTATTTCCG GAGAGCACCT GCTTTACGGG ATCTCCGCCC TTTAACCATG 181 TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGG- TATTTTG GAACGCCGGC 241 CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC 301 ACGGACCTCG GTGCAGTTGG CTTGTTTCAC AAGCCTAAAG ACAAGCTCCA TTGGAAAGTT 361 CCCATTGGTA TCCCCCAGGT GGAATGTTCT CCATCTGGGT GTTGCTGGCT GTCAACCATT 421 TTTCCTTTAG CGCGCATGAC CTCCGGCAAT CACAACTTCC TTCAACGACT CGTGAAGGTT 481 GCTGACGTAT TGTACCGTGA CGGTTGCTTA ACCCCTAGAC AC- CTCCGTGA ACTCCAAGTT 541 TACGAGCGTG GTTGCAATTG GTATCCGATT ACGGGGCCTG TGCCTGGGAT GGCTGTGTAC 601 GCGAACTCCA TGCACGTGTC CGACCAACCG TTCCCTGGTG CCACTCATGT GTTAACAAAT 661 TCCCCTTTGC CTCAACGGGC TTGTCGGCAG CCGTTCTGTC CGTTCGAAGA GGCCCATTCT 721 AGCATATACA GGTGGGAAAA ATTTGTAATT TTTATGGATT CCTCCTCCGA CGGTCGATCT CCTTCAGCAC GTCACATCCT 961 TGCGGCTACC TTGTTCGGGA CCCGGCTGTA TCCGAAGGCA AG- TGTTGGCT TTCCTGCTTT 1021 TTGAGCCAGT CAGCCGAAGT GCTCAGTCGC GAGGCGCATC TGGCTACCGC CTATGGTTAC 1081 CAAACCAAGT GGGGTGTGCC TGGCAAGTAC ATCCAGCGCA GA- CTTCAAGT TCACGGTCTC 1141 CGTGCTGTGG TCGACCCTGA TGGTCCCATT CACGTTGAAG CA- TTGTCTTG CCCCCAGTCT 1201 TGGATCAGGC ACTTGACCCT GATTCGTTCG CCTAATGTCT GAATGATGAT GTCACCCCGG 1261 CTTCGCATTG TGCCGAACAC TCTTTCGTTT TGGAGTGCAC AGAGCCTACC ACACACCGGA 1321 AAGTGGTATG GTGCCGCCGG GTGCCGCCAA AAGTGAGAAA CAAACGGGCC CGTGGCAAGC 1381 GACTCGGCTT CCACCCTCAA CCAGTGGAAT CGTCACCTAC GGTTGCCCGA CCGACTTCCA 1441 TCCCCACCTG CGGACGGGTC CCGCCATACT GAACCGGATG TTGTGGTTGG CATGCCCTTG 1501 ATTAATAATG ACTTCACGTC GGCCGGAGGA CGATTGGGCT CCCTCTGCCT CGGTACAACA 1561 TCTGATGGTG ACCTTGCTCA TACCTGCCGC CATAGCTCGG GGCCATTCAA TGTTTGCAAC 1621 AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC GTAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA 1681 GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AG- TGCGTTGT TGGCGTCTGC 1741 TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG 1801 GCCCTGGCGT CTGCTTATAG ACTGCCTTCA GACTGTGTTT GTGATGGTAT TATTGACTTC 1861 CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AA- ATGTTGAC TTCCCCGTCA 1921 CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGAGGTCTT GCCGCAGAAA TAGTCTGTAT AAATTGTTGT 1981 TGCGGATCCA CAGAAGGGGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG ATTCATCTAT ACTGTTGAGA 2041 AGCTCCAAAC AGGCCATGGC TCCCATCCTC AAAGGCCCCA CCTCCTTGCA AAAATTAAGG 2101 TCCGTGACTC TGAACGAGTG TCAACTCTGA GTTAATATCT CTTCCCCACG GATGTTCCAG 2161 TGGGAAGAGC CCAAAGACCC GTCCATCGGA TGCAAAAGAA TGGCGCTGCT GTTGTCCTAT 2221 TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA GTAAGGTCCT CCACCCTGTG AGAAGCTCAA GCGAGAAACC 2281 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PARENTAL CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 10 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 7209..11600 TGFKLLAASGLTRCGRGGLVVTETAVKIVKYHSRTFTLGSLDLKVTSE- VEVKKSTEQGHAVVANLCSGVVLMRPHPPSLVDVLLKPGLDTTPGI- QPGHGAGNMGVNGSIWDFETAPTKVELELSKQIIQACEVRRGDAPNLQL- PYKLYPVRGDPERRKGRLVNTRFGDLPYKTPQDTKSAIHAAC- CLHPNGVLVSDGKSTLGTTLQHGFELYVPTVPYSVMEYLDSRPDTPFMCT- KHGTSKAAAEDLQKYDLSTQGFVLPGVLRLVRRFIFSHVGKAPPLFL- PSTYPAKNSMAGVNGQRFPTKDVQSIPEIDEMCARAVKENWQTVTPCTLK- KQYCSKPKTRTILGTNNFIALAHRSALSGVTQAFMKKAWKSPIALGKNKF- KELHCTVAGRCLEADLASCDRSTPAIVRWFVANLLYELAGCEEYLPSY- VLNCCHDLVATQDGAFTKRGGLSSGDPVTSVSNTVYSLIIYAQHMVLSALK- MGHEIGLKFLEEQLKFEDLLEIQPMLVYSDDLVLYAERPT- FPNYHWWVEHLDLMLGFKTDPKKTVITDKPSFLGCRIEAGRQLVPNRDRI- LAALAYHMKAQNASEYYASAAAILMDSCACIDHDPEWYEDLICGIARCAR- QDGYRFPGPAFFMSMWEKLKSHNEGKKCRHCGICDAKADYASACGLDL- CLFHSHFHQHCPVTLSCGHHAGSKECSQCQSPVGAGKSPLDAVLKQIPYK- PPRTIIMKVDNKTTTLDPGRYQSRRGLVAVKRGIAGNEVDLSDGDYQVV- PLLPTCKDINMVKVACNVLLSKFIVGPPGSGKTTWLLN- QVQDDDVIYTPTHQTMFDIVSALKVCRYSIPGASGLPFPPPARSGPWVR- LIASGHVPGRVSYLDEAGYCNHLDILRLLSKTPLVCLGDLQQLHPVG- FDSYCYVFDQMPQKQLTTIYRFGPNICAAIQPCYREKLESKRNATRVVFT- TRPVAFGQVLTPYHKDRTGSAITIDSSQGATFDIVTLHLPSPKSLNKS- RALVAITRARHGLFIYDPHDQLQEFFNLTPERTDCNLAFSRGDELVVLNVD- NAVTTVAKALETGSPRFRVSDPRCKSLLAACSASLEGSCMPLPQVAHNLG- FYFSPDSPAFAPLPKELAPHWPVVTHQNNRAWPDRLVASMRPIDARYSK- PMVGAGYVVGPSIFLGTPGVVSYYLTLYIGGEPQALPETLVSTGRIA- TDCREYLDAAEEEAARELPHAFIGDVKGTTVGGCHHITSKYLPRSLPK- DSVAVVGVSSPGRAAKAVCTLTDVYLPELRPYLQPETASKCWKL- KLDFRDVRLMVWKGATAYFQLEGLTWSALPDYARFIQLPKDAVVYIDPCIG- PATANRKVVRTTDWRADLAVTPYDYGAQVILTTAWFEDLGPQWKIL- GLQPFRRTFGFENTEDWAILARRMNDGKDYTDYNWHCVRERPHAI- YGRARDHTYHFALGTELQVELGRPRLPPEQVP SEQ ID NO : 13 ORF 2 DE CEPA PRRSV 94881 PARENTAL CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 10 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 11611..12360 MQWVHCGVKSVSCSWMPSLSSLLVWLTLSSFSPYCLGSLLQAGYWSS- FSEWFAPRFSVRALPFTLPNYRRSYEGLLPNCRPDVPQFAVKHPLGILWHM- RVSHLIDEMVSRRIYRTMEHSGQAAWKQVVSEATLTKLSRLDVVTHFQHLA- AVEADSCRFLSSRLAMLKNLAVGNVSLEYNTTLDRVELIFPTPG- TRPKLTDFRQWLISVHASIFSSVASSVTLFTVLWLRIPALRYVFGFHWPTA- THHSN SEQ ID NO : 14 ORF 3 DE CEPA PRRSV 94881 PARENTAL CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 10 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 12219..13016 MAYQRARFHLLLCGFVCYLVHSALASNSSSTLCFWFPLAHGNTSFEL- TINYTICKPCPTSQAAQQRLEPGRNVWCKIGHDRCEER- DHDELSMSIPSGYDNLKLEGYYAWLAFLSFSYAAQFHPELFGIGNVSRVFV- DKRHQFICAEHDGQNSTISARHNISASYAVYYHHQIDGGNWFHLEWL- RPFFSSWLVLNISWFLRRSPASPASRRIYQILRPTRPRLPVSWSFRT- SIVSNLTGPQQRKVPLPSGGRPNVVKPSAFPSTSR SEQ ID NO : 15 ORF 4 DE CEPA PRRSV 94881 PARENTAL CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 10 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 12761..13312 MAATILFLLAGAQHLMVSEAFACKPCFSTHLSDIKTNTTAAAGFMVLQNIN- CFQSHRASTAQGTTPLRRSSQCREAVGIPQYITITAN- VTDESYLYNADLLMLSACLFYASEMSEKGFKVIFGNISGVVSACVNFTDY- VAHVTQHTQQHHLVIDHIRLLHFLTPSTMRWATTIACLFAILLAV SEQ ID NO : 16 ORF 5 DE CEPA PRRSV 94881 PARENTAL CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 10 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 13309..13914 MKCSCKLGHFLTPHSCFWWLFLLCTGLSWSFVDGNDNSSTSQYIYNLTI- CELNGTEWLSGHFDWAVETFVLYPVATHIISLGFLTTSHFLDALGL- GAVSATGFIGERYVLSSMYGVCAFAALVCFVIRAAKNCMACRYARTRFTN- FIVDDRGRIHRWKSSIVVEKLGKAEVGGDLVNIKHVVLEGVKAQPL- TRTSAEQWEA SEQ ID NO : 17 ORF 6 DE CEPA PRRSV 94881 PARENTAL CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 10 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 13902..14423 MGSLDDFCNDPTAAQKLVLAFSITYTPIMIYALKVSRGRLLGLLHILI- FLNCSFTFGYMTYVHFQSTNRVALTLGAVVALLWGVYSLTESWKFITSRCR- LCCLGRRYILAPAHHVESAAGLHSIPASGNRAYAVRKPGLTSVNGTLVPGL- RSLVLGGKRAVKRGVVNLVKYGR SEQ ID NO : 18 ORF 7 DE CEPA PRRSV 94881 PARENTAL CODIFICADA POR MEIO DA SEQUÊNCIA DE SEQ ID NO : 10 ENTRE OS NUCLEOTÍDEOS 14413..14799 MAGKNQSQKKRRNAAPMGKGQPVNQLCQLLGTMIKSQRQQSRGGQAKKKK- PEKPHFPLAAEDDIRHHLTQAERSLCLQSIQTAFNQGAGTASLSSSGKVS- FQVEFMLPVAHTVRLIRVTSTSASQGAN SEQ ID NO : 19 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO PRRSV 94881 ORF1A ATENUADO 178 ATG 181 TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGG- TATTTTG GAACGCCGGC 241 CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC 301 ACGGACCTCG GTGCAGTTGG CTTGTTTCAC 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TACCTGCCGC CATAGCTCGG 1621 AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC ATAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA 1681 GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AG- TGCGTTGT TGGCGTCTGC 1741 TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG 1801 GCCCTGGCGT CTGCTTATAG GTGATGGTAT TATTGACTTC ACTGCCTTCA GACTGTGTTT 1861 CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AA- ATGTTGAC TTCCCCGTCA 1921 CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGAGATCTT GCCGCAGAAA TAGTCTGTAT AAATTGTTGT 1981 TGCGGATCCA CAGAAGGGGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG ATTCATCTAT ACTGTTGAGA 2041 AGCTCCAAAC AGGCCATGGC TCCCATCCTC AAAGGCCCCA CCTCCTTGCA AAAATTAAGG 2101 TCCGTGACTC TGAACGAGTG TCAACTCTGA GTTAATATCT CTTCCCCACG GATGTTCCAG 2161 TGGGAAGAGC CCAAAGACCC GTCCATCGGA TGCAAAAGAA TGGCGCTGCT GTTGTCCTAT 2221 TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA GTAAGGTCCT TCACCCTGTG AGAAGCTCAA GCGAGAAACC 2281 GTCCTTACCG AGGAACTTAG TTGAGGGTGA TCAGGATATG CGAGCAACAG GTGCAGGTGG 2341 CCACTGGATT TGACTTGGCC CCCCTGTTAG AGGGCCGGTA AACCTTAACC GCTACGGCGA 2401 CCGGACAATT TGAGCTCTGG CCGTTCAAGA ACTCATTCTG CATTGGTGCC CAGCCCGCTA 2461 GCGAGGCCTG CACCCCGTCT TGTTGAGCGC TGTGGCACGG AG- TCGAACGG CAGCAGTTCA 2521 TTTCTGGATT TGCCTGACGT GCAGACCTCG GACCAGCCTT TA- GACCTGTC CCTGGCCGCG 2581 TGGCCTGTAA GGGCTACCGC GTCTGACCCC GGTTGGATCC ACGGTAGGCG TGAGCCTGTC 2641 TTTGTGAAGC CTCGAGGTGT TTTCTCTGAT GGCGAGTCGG CCCTTCAGTT CGGAGAGCTT 2701 TCCGAAGCCA GTTCTGTCGT CGATGACCGG ACAAAAGAAG CTCCGGTGGT TGACGCCCCC 2761 ATCGATTTGA CAACTTCGAA CGAGACGCTC TCTGGGTCTG AC- CCCTTTGA ATTCGCCAAA GAGGTGGTCC GCTTGCCGAT TTCAAGCTTG TGAACCTGGT TGTGGGACAG GGTGGACATG TTCTTGAGTC CCTCAAATTC GGAAGAACCG AGCTGGTGAC 3121 AGTGCCGGCC TGAAGCAACT GGTGGCGCAG TGGGATAGGA AA- TCGAGTGT GACACCCCCC 3181 ACAAAACCGG TTGGACCGGT GCTTGACCAG GCCGTCCCTC TGCCTATGGA CATCCAGCAA 3241 GGAGATGCCA TCTCCGCTGA CAAGCCACCC CATTCGCAAA AC- CCTTCTAG TCAAGTAGAT 3301 GTGGGTGGAG GTTGGAAAAG TTTTATGCTC TCCGGCACCC GTTTCGCGGG GTCCGTTAGT 3361 CAGCGCCTTA CGACATGGGT TTTTGAGGTT CTCTCCCATC GCAAGTTACT CGGTGGGTCA 3781 CGTTGTCTCT GGTTTGTTCT CCTACGTATA TGCATGCTCG CA- GATTTGGC AATTTCTCTT 3841 ATTTATGTGG TGTCCCAAGG GCGTTGTCAC AAGTGTTGGG GAAAGTGTAT AAGGACGGCT 3901 CCTGCAGAAG TGGCCCTTAA TGTGTTTCCT TTTTCGCGCG CCACCCGCTC ATCTCTTGTG 3961 TCCTTGTGTG ATCGGTTCCA AGCGCCAAAA GGAGTTGACC CCGTGCACTT GGCGACAGGC 4021 TGGCGCGGGT GCTGGTGTGG TGAGAGCCCT ATTCATCAAT CA- CACCAAAA ACCGATAGCT 4081 TATGCCAACT TGGATGAAAA GAAGATATCC GCCCAGACGG TGATTGCTGT CCCGTATGAT 4141 CCTAGTCAGG CCATTAAATG CCTGAAAGTT TTGCAGGCAG GAGGGGCTAT TGTGGACCAG 4201 CCTACGCCCG AGGTCGTCCG TGTGTCTGAG ATTCCCTTCT CGGCCCCATT TTTTCCGAAG 4261 GTCCCAGTCA ACCCAGACTG CAGGGTTGTG GTAGATTCGG ACACTTTTGT GGCTGCGGTC 4321 CGCTGCGGTT ATTCGACAGC ACAACTGGTC CTTGGTCGGG GCAACTTTGC CAAGCTAAAT 4381 CAGACCCCCC TCAGGAACTC TGTCCCCACC AAAACAACTG GTGGGGCCTC ATACACCCTT 4441 GCCGTGGCCC AGGTATCTGT GTGGACTCTT GTTCATTTCA TCCTCGGCCT TTGGTTAACG 4501 TCACCTCAAG TGTGTGGTCG AGGGACCTCT GACCCGTGGT GTTCGAACCC TTTTTCGTAT 4561 CCTACTTATG GCCCCGGAGT TGTGTGTTCC TCTCGACTCT GCGTGTCTGC CGACGGAGTT 4621 ACCCTGCCAT TGTTCTCAGC CGTTGCCCAT CTTTCCGGTA GAGAGGTGGG GATTTTTATT 4681 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AACAAACTCG GTTCTGGTCT TGTGACAACC CCTGAAGGGG AGACCTGCTC CATCAAGGAA 5581 ACTAGGCTCT CTGACCTTTC TAGACATTTT GCAGGTCCAA GCGTCCCTCT TGGGGACATT 5641 AAGTTGAGCC CAGCCATCAT CCCTGATGTG ACAACTATTC CGAGTGACTT GGCATCGCTC 5701 CTTGCTTCTG TCCCCGTGAT GGAAGGTGGC CTCTCAACTG TCCAGCTTTT GTGCGTCTTT 5761 TTCCTTCTCT GGCGCATGAT GGGCCATGCC TGGACACCCA TTGTTGCCGT AGGCTTCTTT 5821 TTGCTGAATG AAATTCTCCC AGCAGTCTTG GTCCGAGCTG TGTTCTCTTT TGCACTCTTT 5881 GTACTTGCAT GGGCCACCCC CTGGTCGGCA CAAGTGTTGA TGATTAGACT CCTCACGGCG 5941 GCTCTCAACC GCAACAGGTT GTCCCTGGCG TTCTACGCAT TCGGAGGTGT CGTTGGCCTG 6001 GCCACAGAAA TCGGGACTTT TGCTGGTGGA TGGCCTGAAC TGTCCCAAGC CCTCTCGACA 6061 TACTGCTTCC TGCCCAGGTT CCTTGCTGTG ACTAGTTATG TCCCCACCAT CATCATCGGT 6121 GGGCTCCATG CCCTCGGCGT AATTTTGTGG TTATTCAAAT AC- CGATGCCT CCACAACATG 6181 CTGGTTGGTG ATGGGAGTTT CTCAAGCGCT TTCTTCCTAC GGTATTTTGC TGAGGGTAAT 6241 CTTAGGAAAG GCGTGTCGCA GTCCTGTGGC ATGAATAACG AA- TCCCTGAC AGCTGCTTTG 6301 GCTTGCAAGT TGTCGCAAGC TGACCTTGAT TTTTTGTCCA GTTTAACGAA CTTCAAGTGC 6361 TTTGTGTCCG CTTCAAACAT ACATCGAGGC GGCGTATGCT 6421 AGAGCTCTGC GTCAGGAGCT ACAAGATGAA AGGAGTATTG 6481 GCCAAGCTCG AGGCTTTCGC TTGACACAGG GGACGTGATT 6541 GTTCTGCTTG GGCAACACCC TTAATGTGGG GGGTGAAAGG 6601 AAAACTGTGT CTGTGCAAGA CCAAATTCAG TGTCTGCACT 6661 GTCGTGTCCA ACACGCCCGT CACTTCAGAC GCCAACCCCA 6721 CTTTTTGAAA ATGGCCCGCG CCATCGCAGC GAGGACGACG AC- CTCAAAGT TGAGAGAATG 6781 AAAAAACACT GTGTATCCCT CGGCTTCCAC AAAATCAATG GTAAAGTTTA CTGCAAAATT 6841 TGGGACAAGT CTAACGGCGA CCCGATACAC TCAAGACCAT 6901 GCTTTTCAGG ACAGGTCAAC ATGAAGGTGT ACAGACCGCC 6961 CCCCAACAGG GATTCGATCC GCACTGTTGT AATCGGTGGC 7021 ATTACGTATA ACAGGCATCT TAGTTCCCAA ACCTGACAAC 7081 TGCCTTGAAG CTGCCAGACT CTGGGATGGG CCAAACTTGT 7141 GACCTTACAG CTACCGAAGT GGAGAAACTA AAGCGCATCA TTAGTCAACT CCAAGGTCTG 7201 ACCACTGAAC AGGCTTTAAA CTGCTAG SEQ ID NO : 20 SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍ- DEO DE PRRSV 94881 ORF1B ATENUADO 7209 AC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GACCCGCTGT GGCCGCGGCG 7261 GCCTAGTTGT AACTGAAACG GCGGTAAAAA TCGTAAAATA CCACAGCAGA ACTTTCACCT 7321 TAGGCTCTTT AGACCTAAAA GTCACCTCCG AGGTGGAGGT GAAGAAATCA ACTGAGCAGG 7381 GGCACGCTGT CGTGGCGAAC TTATGTTCCG GTGTCGTCTT GATGAGGCCT CACCCACCGT 7441 CCCTTGTTGA CGTTCTCCTC AAACCCGGAC TTGACACAAC AC- CCGGCATT CAACCAGGGC 7501 ATGGGGCCGG GAATATGGGC GTGAACGGTT CTATTTGGGA TTTTGAAACT GCACCCACAA 7561 AGGTAGAACT AGAGTTGTCC AAGCAAATAA TCCAAGCATG TGAAGTCAGG CGCGGGGACG 7621 CCCCTAACCT CCAACTCCCC TACAAGCTTT ATCCTGTCAG GGGGGACCCC GAGCGGCGTA 7681 AAGGTCGCCT TGTCAACACT AGGTTTGGAG ATTTACCTTA CA- AAACTCCC CAAGACACCA 7741 AGTCCGCAAT TCATGCGGCT TGTTGCCTGC ATCCCAATGG GGTCCTCGTG TCTGATGGCA 7801 AATCCACGCT GGGTACCACT CTTCAACATG GTTTCGAGCT TTATGTCCCC ACTGTACCTT 7861 ATAGTGTCAT GGAATACCTT GATTCACGCC CTGACACCCC TTTTATGTGT ACTAAACATG 7921 GCACTTCCAA GGCTGCTGCA GAGGACCTCC AAAAATATGA CCTATCCACT CAAGGGTTTG 7981 TCTTGCCTGG GGTCCTACGC CTAGTGCGCA GGTTCATCTT TAGCCATGTT GGTAAGGCGC 8041 CACCACTGTT CCTTCCATCA ACCTACCCTG CCAAGAACTC CA- TGGCAGGG GTCAATGGCC 8101 AGAGGTTCCC AACAAAGGAT GTCCAGAGCA TACCTGAAAT TGATGAAATG TGCGCCCGTG 8161 CCGTCAAGGA AAATTGGCAG ACTGTGACAC CTTGCACCCT CA- AAAAACAG TACTGTTCCA 8221 AACCTAAAAC TAGAACCATC CTAGGTACCA ACAACTTCAT AG- CCTTGGCT CACAGGTCAG 8281 CACTCAGTGG TGTCACCCAG GCGTTCATGA AGAAGGCCTG GAAGTCCCCA ATTGCCTTGG 8341 GGAAAAACAA GTTTAAGGAA TTGCATTGCA CTGTCGCCGG CA- GATGCCTT GAGGCTGACC GTTTGTTGCC AACCTCCTGT GCTCAACTGT TGCCATGACC CCTGTCGTCC GGGGACCCCG CGCCCAGCAC ATGGTGCTTT TGAGGAACAG CTCAAATTTG TGACCTCGTC TTGTATGCGG TCTTGACCTG ATGTTGGGCT 8821 TTAAAACGGA CCCAAAGAAA ACTGTCATAA CTGATAAACC CA- GTTTTCTC GGCTGCAGAA 8881 TTGAAGCAGG ACGGCAGTTA GTCCCCAATC GCGACCGTAT TCTGGCTGCT CTTGCATATC 8941 ATATGAAGGC GCAGAACGCC TGCCGCAATT CTGATGGATT TCAGAGTATT ATGCGTCCGC 9001 CGTGTGCTTG CATTGACCAT TCTTATCTGC GGCATCGCCC GACCCCGAGT GGTATGAGGA 9061 GGTGTGCTCG CCAGGACGGT ATTTTTCATG TCCATGTGGG TACCGTTTTC CAGGCCCGGC 9121 AGAAGCTGAA AAGTCATAAT CTGCGGCATC TGCGACGCCA GAAGGGAAGA AATGCCGTCA 9181 AAGCCGACTA TGCGTCCGCC GTTCCATTCA CACTTTCATC TGTGGACTTG ATTTGTGTTT 9241 AACACTGCCC AGTCACTCTG TTCAAAGGAA TGTTCGCAGT AGCTGTGGCC ACCATGCCGG 9301 GTCAGTCACC TGTCGGGGCT GGCAAATCCC CCCTTGACGC TGTGCTGAAA CAAATCCCGT 9361 ACAAACCTCC TCGTACCATT ATCATGAAGG TGGACAACAA AA- CAACGACC CTTGACCCGG 9421 GAAGATATCA GTCCCGTCGA GGTCTTGTTG CAGTCAAAAG AGGTATTGCA GGTAATGAGG 9481 TTGATCTTTC TGATGGAGAC TACCAAGTGG TGCCTCTTTT GCCGACTTGC AAAGACATAA 9541 ACATGGTGAA GGTGGCTTGC AACGTACTAC TCAGCAAGTT TA- TAGTAGGG CCGCCAGGTT 9601 CCGGAAAAAC CACCTGGCTA CTGAACCAAG TCCAGGACGA TGATGTCATT TACACACCTA 9661 CTCATCAGAC AATGTTTGAC ATAGTCAGTG CTCTTAAAGT TTGCAGGTAT TCCATCCCAG 9721 GAGCCTCAGG ACTCCCTTTT CCACCACCTG CCAGGTCCGG GCCGTGGGTT AGGCTCATCG 9781 CCAGCGGACA TGTCCCTGGC CGAGTGTCAT ATCTCGATGA GGCAGGATAT TGCAATCATC 9841 TAGACATTCT AAGGCTGCTT TTTGGGTGAC CTTCAGCAAC TCCAAAACAC CCCTTGTGTG 9901 TTCACCCGGT CGGCTTTGAT TCAGATGCCT CAGAAGCAGC TCCTATTGTT ATGTGTTCGA 9961 TGACCACCAT TTATAGATTT GGCCCTAACA TCTGTGCAGC CA- TCCAGCCT TGTTACAGGG 10021 AGAAACTTGA ATCCAAGGCC CACCACCCGG CCTGTGGCCT AGGAACACCA GAGTGGTTTT 10081 TTGGTCAGGT CCTGACACCG CTCTGCAATA ACTATAGATT TACCACAAAG ATCGTACCGG 10141 CATCCCAGGG GGCGACCTTC ACCATCGCCA AAGTCCCTAA GACATTGTGA CATTGCATCT 10201 ACAAATCCCG AGCACTTGTA TGGGTTGTTC ATTTATGACC GCCATCACTC GGGCAAGACA 10261 CTCATGACCA ACTCCAGGAG GCGCACTGAT TGTAACCTTG TTTTTCAACT TAACCCCCGA 10321 CGTTCAGCCG TGGGGATGAG TAATGCGGTC ACAACTGTAG CTGGTTGTTT TGAATGTGGA 10381 CGAAGGCCCT AGAGACAGGT GGACCCGAGG TGCAAGTCTC TCACCCCGAT TTCGAGTATC 10441 TCTTAGCCGC TTGTTCGGCC GCCACTACCA CAAGTAGCAC AGTCTAGAAG GGAGCTGCAT 10501 ATAACCTGGG GTTTTACTTT TGCACCCCTG CCAAAAGAGC TCCCCGGACA GCCCAGCTTT 10561 TGGCGCCACA TTGGCCAGTG AGCGTGGCCT GATCGACTTG GTCACCCACC AGAATAATCG 10621 TCGCTAGTAT GCGCCCAATT AATGGTCGGT GCAGGGTATG GATGCCCGCT ACAGCAAGCC 10681 TGGTCGGGCC ATCCATTTTT GTCATACTAT CTCACATTAT CTTGGCACTC CTGGTGTGGT 10741 ACATCGGGGG CGAGCCTCAG GCCCTGCCAG AAACACTCGT TTCAACAGGA CGTATAGCCA 10801 CAGATTGTCG GGAATATCTC GACGCGGCTG AGGAAGAGGC AGCGAGAGAA CTTCCCCACG 10861 CATTTATTGG CGATGTCAAA GGCACTACGA TCGGGGGGTG TCACCACATT ACATCGAAAT 10921 ACCTACCTAG GTCCCTGCCT AAAGACTCTG TTGCTGTGGT TGGGGTGAGT TCGCCCGGTA 10981 GGGCTGCTAA AGCCGTGTGC ACTCTCACCG ATGTGTACCT CCCCGAACTC CGACCATATT 11041 TGCAACCGGA GACGGCATCA AAATGCTGGA AACTTAAACT GGATTTCAGG GATGTTCGAC 11101 TGATGGTCTG GAAAGGCGCC ACAGCCTATT TCCAGTTGGA AGGGCTGACA TGGTCAGCGC 11161 TGCCCGATTA TGCTAGGTTC ATTCAGCTAC CCAAGGATGC CGTTGTGTAC ATCGATCCGT 11221 GTATAGGGCC GGCAACAGCC AATCGCAAGG TTGTGCGAAC CACAGACTGG CGGGCCGACC 11281 TGGCAGTGAC ACCGTATGAT TACGGTGCTC AGGTCATTTT GACAACAGCC TGGTTCGAGG 11341 ACCTTGGGCC GCAGTGGAAG ATTTTGGGGT TGCAGCCTTT CAGACGAACA TTTGGCTTTG 11401 AGAACACTGA AGATTGGGCA ATTCTCGCAC GCCGTATGAA TGACGGCAAA GATTACACTG 11461 ACTATAATTG GCATTGTGTA CGAGAACGCC CACACGCAAT TTACGGGCGC GCCCGTGACC 11521 ATACGTATCA TTTTGCCCTT GGCACTGAAC TGCAAGTAGA GCTGGGCAGA CCCCGGCTGC 11581 CTCCTGAGCA AGTGCCGTGA SEQ ID NO : 21 SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍ- DEO DE PRRSV 94881 ORF2 ATENUADO 11611 ATGCAATGGG TTTACTGTGG AGTAAAATCA 11641 GTCAGTTGTT CGTGGATGCC TTCACTGAGT TCCTTGTTAG TGTGGTTGAC ATTGTCATCT 11701 TTCTCGCCAT ATTGTTTGGG TTCACTGTTG CAGGCTGGTT ATTGGTCTTC CTTCTCAGAG 11761 TGGTTTGCTC CGCGTTTCTC CGTTCGCGCT CTGCCATTCA CTCTTCCGAA CTATCGAAGG 11821 TCCTATGAGG GCTTGCTACC CAACTGCAGA CCGGATGTCC CACAATTCGC AGTTAAGCAC 11881 CCGTTGGGTA TACTTTGGCA TATGCGAGTC TCCCACCTAA TTGACGAAAT GGTCTCTCGC 11941 CGCATTTACC GGACCATGGA ACATTCGGGT CAAGCGGCCT GGAAGCAGGT TGTTAGTGAA 12001 GCCACTCTCA CAAAACTGTC AAGGCTTGAC GTAGTCACTC ATTTCCAACA CCTGGCCGCA 12061 GTGGAGGCTG ATTCTTGCCG CTTCCTTAGC TCACGACTCG CGATGCTGAA AAACCTTGCC 12121 GTTGGCAATG TGAGCCTGGA GTACAACACT ACTTTGGACC GCGTTGAGCT CATCTTTCCC 12181 ACACCAGGTA CGAGGCCCAA GTTGACCGAT TTTAGGCAAT GGCTTATCAG CGTGCACGCT 12241 TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT 12301 CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA SEQ ID NO : 22 SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍ- DEO DE PRRSV 94881 ORF3 ATENUADO 12219 AT GGCTTATCAG CGTGCACGCT 12241 TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT 12301 CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA 12361 CTATCAATTA CACTATATGT AAGCCATGCC CTACCAGTCA AGCTGCCCAA CAAAGACTCG 12421 AGCCTGGCCG TAACGTGTGG TGCAAAATAG GGCACGACAG GTGTGAGGAA CGTGACCATG 12481 ATGAGTTGTC AATGTCCATT CCGTCCGGGT ACGACAACCT CAAACTTGAG GGTTATTATG 12541 CTTGGCTGGC TTTTTTGTCC TTTTCCTACG CGGCCCAATT CCATCCGGAG CTGTTCGGAA 12601 TAGGAAACGT GTCGCGCGTC TTTGTGGATA AGCGACACCA GTTCATTTGC GCCGAGCATG 12661 ATGGACAAAA TTCAACCATA TCTGCCAGAC ACAACATCTC CGCGTCGTAT GCGGTGTATT 12721 ACCATCATCA AATAGACGGG GGCAATTGGT TTCATTTGGA ATGGCTGCGA CCATTCTTTT 12781 CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT 12841 CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT 12901 TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT 12961 CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAA SEQ ID NO : 23 SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍ- DEO DE PRRSV 94881 ORF4 ATENUADO 12761 ATGGCTGCGA CCATTCTTTT 12781 CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT 12841 CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT 12901 TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA TTGGCGGTAT GA SEQ ID NO : 24 SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍ- DEO DE PRRSV 94881 ORF5 ATENUADO 13309 AT GAAATGTTCT 13321 TGCAAGTTGG GGCATTTCTT GACTCCTCAC TCTTGCTTCT GGTGGCTTTT TTTGCTGTGT 13381 ACCGGCTTGT CTTGGTCCTT TGTCGATGGC AACGACGACA GCTCGACATC CCAATACATA 13441 TATAATTTGA CGATATGCGA GCTGAATGGG ACCGAATGGT TGTCCGGTCA TTTTGATTGG 13501 GCAGTCGAAA CCTTTGTGCT TTACCCAGTT GCCACTCATA TCATTTCACT GGGTTTTCTC 13561 ACAACAAGCC ATTTCCTTGA TGCGCTCGGT CTCGGCGCTG TGTCCGCCAC AGGATTCATT 13621 GGCGAGCGGT ATGTACTTAG CAGCATGTAC GGCGTTTGCG CCTTCGCGGC GTTCGTATGT 13681 TTTGTCATCC GTGCTGCTAA AAATTGCATG GCTTGCCGCT ATGCCCGCAC CCGGTTTACC 13741 AACTTCATCG TGGACGACCG GGGAAGAATC CATCGATGGA AGTCTTCAAT AGTGGTGGAG 13801 AAATTGGGCA AAGCTGAAGT CGGTGGTGAC CTTGTCAACA TTAAGCATGT TGTCCTCGAA 13861 GGGGTTAAAG CTCAACCTTT GACGAGGACT TCGGCTGAGC AATGGGAAGC CTAG SEQ ID NO : 25 SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍ- DEO DE PRRSV 94881 ORF6 ATENUADO 13902 ATGGGAAGC CTAGACGACT 13921 TTTGCAACGA TCCCACCGCC CTTTAGCATC ACATATACAC 13981 CCATAATGAT ATACGCCCTT CCTGGGGCTG TTGCACATCT 14041 TGATATTTCT GAATTGTTCC ATATGTGCAT TTTCAATCCA 14101 CCAACCGTGT CGCATTCACT TTTGTGGGGT GTTTACAGCC 14161 TCACAGAGTC ATGGAAGTTC GTGTTGCCTA GGCCGGCGAT 14221 ACATTCTGGC CCCTGCCCAT CCTCCATTCA ATCCCAGCGT 14281 CTGGTAACCG AGCATACGCT ATCAGTGAAC GGCACTCTAG 14341 TACCTGGGCT TCGGAGCCTC TGTTAAACGA GGAGTGGTTA 14401 ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAA SEQ ID NO : 26 SEQUÊNCIA DE CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍ- DEO DE PRRSV 94881 ORF7 ATENUADO 14413 ATGGCCGG TAAGAACCAG AGCCAGAAGA AAAGAAGAAA TGCAGCTCCG 14461 ATGGGGAAAG GCCAGCCAGT CAATCAACTG TGCCAGTTGC TGGGTACAAT GATAAAGTCC 14521 CAGCGCCAGC AATCTAGGGG AGGACAGGCC AAAAAGAAGA AGCCTGAGAA GCCACATTTT 14581 CCCCTAGCTG CTGAAGATGA CATTCGGCAC CATCTCACCC AGGCCGAACG TTCCCTCTGC 14641 TTGCAATCGA TCCAGACGGC TTTCAATCAA GGCGCAGGAA CTGCGTCGCT TTCATCCAGC 14701 GGGAAGGTCA GTTTCCAGGT TGAGTTCATG CTGCCGGTTG CTCATACAGT GCGCCTGATT 14761 CGCGTGACTT CTACATCCGC CAGTCAGGGT GCAAATTAAT TTGACAGTCA GGTGAATGGC 14821 CGCGATTGAC GTGTGGCCTC TAA SEQ ID NO : 27 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF1a PARENTAL 178 ATG 181 TCTGGGATGT TCTCCCGGTG CATGTGCACC CCGGCTGCCC GGG- TATTTTG GAACGCCGGC 241 CAAGTCTATT GCACACGGTG TCTCAGTGCA CGGTCTCTTC TCTCTCCAGA ACTTCAGGAC 301 ACGGACCTCG GTGCAGTTGG CTTGTTTCAC AAGCCTAAAG ACAAGCTCCA TTGGAAAGTT 361 CCCATTGGTA TCCCCCAGGT GGAATGTTCT CCATCTGGGT GTTGCTGGCT GTCAACCATT 421 TTTCCTTTAG CGCGCATGAC CTCCGGCAAT CACAACTTCC TTCAACGACT CGTGAAGGTT 481 GCTGACGTAT TGTACCGTGA CGGTTGCTTA ACCCCTAGAC AC- CTCCGTGA ACTCCAAGTT 541 TACGAGCGTG GTTGCAATTG GTATCCGATT ACGGGGCCTG TGCCTGGGAT GGCTGTGTAC 601 GCGAACTCCA TGCACGTGTC CGACCAACCG TTCCCTGGTG CCACTCATGT GTTAACAAAT 661 TCCCCTTTGC CTCAACGGGC TTGTCGGCAG CCGTTCTGTC CGTTCGAAGA GGCCCATTCT CCTTCAGCAC GTCACATCCT 961 TGCGGCTACC TTGTTCGGGA CCCGGCTGTA TCCGAAGGCA AG- TGTTGGCT TTCCTGCTTT 1021 TTGAGCCAGT CAGCCGAAGT GCTCAGTCGC GAGGCGCATC TGGCTACCGC CTATGGTTAC 1081 CAAACCAAGT GGGGTGTGCC TGGCAAGTAC ATCCAGCGCA GA- CTTCAAGT TCACGGTCTC 1141 CGTGCTGTGG TCGACCCTGA TGGTCCCATT CACGTTGAAG CA- TTGTCTTG CCCCCAGTCT 1201 TGGATCAGGC ACTTGACCCT GATTCGTTCG CCTAATGTCT GAATGATGAT GTCACCCCGG 1261 CTTCGCATTG TGCCGAACAC TCTTTCGTTT TGGAGTGCAC AGAGCCTACC ACACACCGGA 1321 AAGTGGTATG GTGCCGCCGG GTGCCGCCAA AAGTGAGAAA CAAACGGGCC CGTGGCAAGC 1381 GACTCGGCTT CCACCCTCAA CCAGTGGAAT CGTCACCTAC GGTTGCCCGA CCGACTTCCA 1441 TCCCCACCTG CGGACGGGTC CCGCCATACT GAACCGGATG TTGTGGTTGG CATGCCCTTG 1501 ATTAATAATG ACTTCACGTC GGCCGGAGGA CGATTGGGCT CCCTCTGCCT CGGTACAACA 1561 TCTGATGGTG ACCTTGCTCA TACCTGCCGC CATAGCTCGG GGCCATTCAA TGTTTGCAAC 1621 AACCGCGCCT GCCCTAACGC CAAATACCTC GTAAAACTCA ACGGAGTTCA TTGGGAGGTA 1681 GAGGTGAGGC CTGGAATGGC TCCTCGCTCC CTCTCTCGTG AG- TGCGTTGT TGGCGTCTGC 1741 TCTGAAGGCT GTGTCGCGTC GCCTTACCCG GAGGACGGGT TGCCTAAACG TGCACTTGAG 1801 GCCCTGGCGT CTGCTTATAG GTGATGGTAT TATTGACTTC ACTGCCTTCA GACTGTGTTT 1861 CTTGCCAATC CACCTCCCCA GGAGTTCTGG ACTCTTGACA AA- ATGTTGAC TTCCCCGTCA 1921 CCGGAGCAGT CCGGCTTCTC TAGAGGTCTT GCCGCAGAAA TAGTCTGTAT AAATTGTTGT 1981 TGCGGATCCA CAGAAGGGGA GGATGTTGAA GGATTGTCCG ATTCATCTAT ACTGTTGAGA 2041 AGCTCCAAAC AGGCCATGGC TCCCATCCTC AAAGGCCCCA CCTCCTTGCA AAAATTAAGG 2101 TCCGTGACTC TGAACGAGTG TCAACTCTGA GTTAATATCT CTTCCCCACG GATGTTCCAG 2161 TGGGAAGAGC CCAAAGACCC GTCCATCGGA TGCAAAAGAA TGGCGCTGCT GTTGTCCTAT 2221 TCTAAGGAAA CAGCCCCTGA GTAAGGTCCT CCACCCTGTG AGAAGCTCAA GCGAGAAACC 2281 GTCCTTACCG AGGAACTTAG TTGAGGGTGA TCAGGATATG CGAGCAACAG GTGCAGGTGG 2341 CCACTGGATT TGACTTGGCC CCCCTGTTAG AGGGCCGGTA AACCTTAACC GCTACGGCGA 2401 CCGGACAATT TGAGCTCTGG CATTGGTGCC CAGCCCGCTA CCGTTCAAGA ACTCATTCTG 2461 GCGAGGCCTG CACCCCGTCT TGTTGAGCGC TGTGGCACGG AG- TCGAACGG CAGCAGTTCA 2521 TTTCTGGATT TGCCTGACGT GCAGACCTCG GACCAGCCTT TA- GACCTGTC CCTGGCCGCG 2581 TGGCCTGTAA GGGCTACCGC ACGGTAGGCG TGAGCCTGTC 2641 TTTGTGAAGC CTCGAGGTGT CCCTTCAGTT CGGAGAGCTT 2701 TCCGAAGCCA GTTCTGTCGT CTCCGGTGGT TGACGCCCCC 2761 ATCGATTTGA CAACTTCGAA 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TTTTCCGAAG 4261 GTCCCAGTCA ACCCAGATTG CAGGGTTGTG GTAGATTCGG ACACTTTTGT GGCTGCGGTC 4321 CGCTGCGGTT ATTCGACAGC ACAACTGGTC CTTGGTCGGG GCAACTTTGC CAAGCTAAAT 4381 CAGACCCCCC TCAGGAACTC TGTCCCCACC AAAACAACTG GTGGGGCCTC ATACACCCTT 4441 GCCGTGGCCC AGGTATCTGT GTGGACTCTT GTTCATTTCA TCCTCGGCCT TTGGTTAACG 4501 TCACCTCAAG TGTGTGGTCG AGGGACCTCT GACCCGTGGT GTTCGAACCC TTTTTCGTAT 4561 CCTACTTATG GCCCCGGAGT TGTGTGTTCC TCTCGACTCT GCGTGTCTGC CGACGGAGTT 4621 ACCCTGCCAT TGTTCTCAGC CGTTGCCCAT CTTTCCGGTA GAGAGGTGGG GATTTTTATT 4681 TTGGTGCTTG CCTCCTTGGG CGCTTTAGCC CACCGCTTGG CTCTTAAGGC AGACATGTCA 4741 ATGGTCTTTT TGGCGTTTTG TGCTTACGCC TGGCCCATGA GCTCCTGGTT AATTTGCTTC 4801 TTTCCTATGC TCTTGAGGTG GGTAACCCTT CATCCTCTCA CTATGCTTTG GGTGCACTCA 4861 TTTTTGGTGT TTTGCCTACC AGCTGCCGGC GTTCTCTCGC TGGGAATAAC CGGTCTTCTT 4921 TGGGCAGTTG GCCGTTTCAC CCAGGTTGCC GGAATTATCA CACCTTATGA CATCCACCAG 4981 TATACCTCCG GACCACGTGG TGCAGCTGCT GTAGCAACGG CTCCAGAAGG TACTTACATG 5041 GCGGCCGTTC GGAGAGCCGC TTTGACTGGA CGGACTTTGA TCTTCACACC ATCTGCAGTC 5101 GGATCCCTTC TTGAAGGTGC TTTCAGAACT CAAAAGCCCT GCCTTAACAC CGTGAATGTC 5161 GTAGGCTCTT CCCTTGGTTC TGGAGGAGTT TTCACCATTG ATGGCAGAAG AGTCATCGTC 5221 ACTGCCACCC ATGTGTTGAA TGGTAACACA GCCAGGGTCA CTGGTGATTC CTACAACCGC 5281 ATGCACACGT TCAATACTAA TGGTGATTAT GCCTGGTCCC ATGCTGATGA CTGGCAAGGC 5341 GTTGCCCCTA TGGTTAAGAT CGCTAAGGGG TATCGCGGTC GTGCCTACTG GCAAACGTCA 5401 ACCGGAGTCG AACCTGGCAT CATGGGGGAA GGATTCGCCT TCTGTTTCAC TAACTGTGGC 5461 GACTCAGGGT CACCTGTCAT TTCAGAAGCT GGTGACCTTA TTGGAGTCCA TACCGGTTCA 5521 AACAAACTCG GTTCTGGTCT TGTGACAACC CCTGAAGGGG AGACCTGCTC CATCAAGGAA 5581 ACTAGGCTCT CTGACCTTTC TAGACATTTT GCAGGTCCAA GCGTCCCTCT TGGGGACATT 5641 AAGTTGAGCC CAGCCATCAT CCCTGATGTG ACAACTATTC CGAGTGACTT GGCATCGCTC 5701 CTTGCTTCTG TCCCCGTGAT GGAAGGTGGC CTCTCAACTG TCCAGCTTTT GTGCGTCTTT 5761 TTCCTTCTCT GGCGCATGAT GGGCCATGCC TGGACACCCA TTGTTGCCGT AGGCTTCTTT 5821 TTGCTGAATG AAATTCTCCC AGCAGTCTTG GTCCGAGCTG TGTTCTCTTT TGCACTCTTT 5881 GTACTTGCAT GGGCCACCCC CTGGTCGGCA CAAGTGTTGA TGATTAGACT CCTCACGGCG 5941 GCTCTCAACC GCAACAGGTT GTCCCTGGCG TTCTACGCAC TCGGAGGTGT CGTTGGCCTG 6001 GCCACAGAAA TCGGGACTTT TGCTGGTGGA TGGCCTGAAC TGTCCCAAGC CCTCTCGACA 6061 TACTGCTTCC TGCCCAGGTT CCTTGCTGTG ACTAGTTATG TCCCCACCAT CATCATCGGT 6121 GGGCTCCATG CCCTCGGCGT AATTTTGTGG TTATTCAAAT AC- CGATGCCT CCACAACATG 6181 CTGGTTGGTG ATGGGAGTTT CTCAAGCGCT TTCTTCCTAC GGTATTTTGC TGAGGGTAAT 6241 CTTAGGAAAG GCGTGTCGCA GTCCTGTGGC ATGAATAACG AA- TCCCTGAC AGCTGCTTTG 6301 GCTTGCAAGT TGTCGCAAGC GTTTAACGAA CTTCAAGTGC TGACCTTGAT TTTTTGTCCA 6361 TTTGTGTCCG CTTCAAACAT ACATCGAGGC GGCGTATGCT GAAAAATGCA GCTGGCCAAT 6421 AGAGCTCTGC GTCAGGAGCT ACAAGATGAA AGGAGTATTG GGCCTCCTTG GTTCAGGTTG 6481 GCCAAGCTCG AGGCTTTCGC TTGACACAGG TGACGTGATT TGAGACGGCC ACTCCGTCAC 6541 GTTCTGCTTG GGCAACACCC TTAATGTGGG GGGTGAAAGG CCATGGATCC ATCCTCGACA 6601 AAAACTGTGT CTGTGCAAGA CCAAATTCAG TGTCTGCACT AACACGATGC CTGGGTGGTT 6661 GTCGTGTCCA ACACGCCCGT CACTTCAGAC GCCAACCCCA GGATACCTTG ACCGGCATCC 6721 CTTTTTGAAA ATGGCCCGCG CCATCGCAGC GAGGACGACG AC- CTTAAAGT TGAGAGAATG 6781 AAAAAACACT GTGTATCCCT GTAAAGTTTA CTGCAAAATT CGGCTTCCAC AAAATCAATG 6841 TGGGACAAGT CTAACGGCGA CCCGATACAC TCAAGACCAT CACCTTTTAC ACGGATGATT 6901 GCTTTTCAGG ACAGGTCAAC ATGAAGGTGT ACAGACCGCC CGACTATAGA GACAGGGATT 6961 CCCCAACAGG GATTCGATCC GCACTGTTGT AATCGGTGGC AAAGTCCGAA GCCCCTGTTG 7021 ATTACGTATA ACAGGCATCT TAGTTCCCAA ACCTGACAAC GGTCAAAGGT AAGGAGGTCC 7081 TGCCTTGAAG CTGCCAGACT CTGGGATGGG CCAAACTTGT GTCCCTTGAG CAAGCTCTTG 7141 GACCTTACAG CTACCGAAGT TTAGTCAACT CCAAGGTCTG GGAGAAACTA AAGCGCATCA 7201 ACCACTGAAC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GA- CCCGCTGT GGCCGCGGCG SEQ ID NO : 28 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF1b PARENTAL 7209 AC AGGCTTTAAA CTGCTAGCCG CCAGCGGCTT GACCCGCTGT GGCCGCGGCG 7261 GCCTAGTTGT AACTGAAACG GCGGTAAAAA TCGTAAAATA CCACAGCAGA ACTTTCACCT 7321 TAGGCTCTTT AGACCTAAAA GTCACCTCCG AGGTGGAGGT GAAGAAATCA ACTGAGCAGG 7381 GGCACGCTGT CGTGGCGAAC TTATGTTCCG GTGTCGTCTT GATGAGGCCT CACCCACCGT 7441 CCCTTGTTGA CGTTCTCCTC AAACCCGGAC TTGACACAAC AC- CCGGCATT CAACCAGGGC 7501 ATGGGGCCGG GAATATGGGC GTGAACGGTT CTATTTGGGA TTTTGAAACT GCACCCACAA 7561 AGGTAGAACT AGAGTTGTCC AAGCAAATAA TCCAAGCATG TGAAGTCAGG CGCGGGGACG 7621 CCCCTAACCT CCAACTCCCC TACAAGCTTT ATCCTGTCAG GGGGGACCCC GAGCGGCGTA 7681 AAGGTCGCCT TGTCAACACT AGGTTTGGAG ATTTACCTTA CA- AAACTCCC CAAGACACCA 7741 AGTCCGCAAT TCATGCGGCT TGTTGCCTGC ATCCCAATGG GGTCCTCGTG TCTGATGGTA 7801 AATCCACGCT GGGTACCACT CTTCAACATG GTTTCGAGCT TTATGTCCCC ACTGTACCTT 7861 ATAGTGTCAT GGAATACCTT GATTCACGCC CTGACACCCC TTTTATGTGT ACTAAACATG 7921 GCACTTCCAA GGCTGCTGCA GAGGACCTCC AAAAATATGA CCTATCCACT CAAGGGTTTG 7981 TCTTGCCTGG GGTCCTACGC CTAGTGCGCA GGTTCATCTT TAGCCATGTT GGTAAGGCGC 8041 CACCACTGTT CCTTCCATCA ACCTACCCTG CCAAGAACTC CA- TGGCAGGG GTCAATGGCC 8101 AGAGGTTCCC AACAAAGGAT GTCCAGAGCA TACCTGAAAT TGATGAAATG TGCGCCCGTG 8161 CCGTCAAGGA AAATTGGCAG ACTGTGACAC CTTGCACCCT CA- AAAAACAG TACTGTTCCA 8221 AACCTAAAAC TAGAACCATC CTAGGTACCA ACAACTTCAT AG- CCTTGGCT CACAGGTCAG 8281 CACTCAGTGG TGTCACCCAG GCGTTCATGA AGAAGGCCTG GAAGTCCCCA ATTGCCTTGG 8341 GGAAAAACAA GTTTAAGGAA TTGCATTGCA CTGTCGCCGG CA- GATGCCTT GAGGCTGACC 8401 TGGCTTCCTG CGATCGCAGC GTTTGTTGCC AACCTCCTGT ACCCCCGCCA TTGTGAGGTG 8461 ATGAACTTGC AGGATGTGAA GCTCAACTGT TGCCATGACC GAGTACTTGC CTAGCTACGT 8521 TTGTGGCAAC GCAGGATGGC CCTGTCGTCC GGGGACCCCG GCTTTCACAA AACGCGGTGG 8581 TCACCAGTGT GTCCAACACC CGCCCAGCAC ATGGTGCTTT GTCTACTCAC TGATAATTTA 8641 CGGCCTTGAA GATGGGTCAT TGAGGAACAG CTCAAATTTG GAAATTGGTC TCAAGTTCCT 8701 AGGACCTTCT TGAAATCCAG TGACCTCGTC TTGTATGCGG CCCATGTTAG TGTATTCTGA 8761 AAAGACCCAC TTTTCCCAAC TACCATTGGT GGGTCGAGCA TCTTGACCTG ATGTTGGGCT 8821 TTAAAACGGA CCCAAAGAAA ACTGTCATAA CTGATAAACC CA- GTTTTCTC GGCTGCAGAA 8881 TTGAAGCAGG ACGGCAGTTA GTCCCCAATC GCGACCGTAT TCTGGCTGCT CTTGCATATC 8941 ATATGAAGGC GCAGAACGCC TGCCGCAATT CTGATGGATT 9001 CGTGTGCTTG CATTGACCAT TGTGCTGAAA CAAATCCCGT 9361 ACAAACCTCC TCGTACCATT ATCATGAAGG TGGACAACAA AA- CAACGACC CTTGACCCGG 9421 GAAGATATCA GTCCCGTCGA GGTCTTGTTG CAGTCAAAAG AGGTATTGCA GGTAATGAGG 9481 TTGATCTTTC TGATGGAGAC TACCAAGTGG TGCCTCTTTT GCCGACTTGC AAAGACATAA 9541 ACATGGTGAA GGTGGCTTGC AACGTACTAC TCAGCAAGTT TA- TAGTAGGG CCGCCAGGTT 9601 CCGGAAAAAC CACCTGGCTA CTGAACCAAG TCCAGGACGA TGATGTCATT TACACACCTA 9661 CTCATCAGAC AATGTTTGAC ATAGTCAGTG CTCTTAAAGT TTGCAGGTAT TCCATCCCAG 9721 GAGCCTCAGG ACTCCCTTTT CCACCACCTG CCAGGTCCGG GCCGTGGGTT AGGCTCATCG 9781 CCAGCGGACA TGTCCCTGGC CGAGTGTCAT ATCTCGATGA GGCAGGATAT TGCAATCATC 9841 TAGACATTCT AAGGCTGCTT TCCAAAACAC CCCTTGTGTG TTTGGGTGAC CTTCAGCAAC 9901 TTCACCCGGT CGGCTTTGAT TCAGATGCCT CAGAAGCAGC TCCTATTGTT ATGTGTTCGA 9961 TGACCACCAT TTATAGATTT GGCCCTAACA TCTGTGCAGC CA- TCCAGCCT TGTTACAGGG 10021 AGAAACTTGA ATCCAAGGCC CACCACCCGG CCTGTGGCCT AGGAACACCA GAGTGGTTTT 10081 TTGGTCAGGT CCTGACACCG CTCTGCAATA ACTATAGATT TACCACAAAG ATCGTACCGG 10141 CATCCCAGGG GGCGACCTTC ACCATCGCCA AAGTCCCTAA GACATTGTGA CATTGCATCT 10201 ACAAATCCCG AGCACTTGTA TGGGTTGTTC ATTTATGACC GCCATCACTC GGGCAAGACA 10261 CTCATGACCA ACTCCAGGAG GCGCACTGAT TGTAACCTTG TTTTTCAACT TAACCCCCGA 10321 CGTTCAGCCG TGGGGATGAG TAATGCGGTC ACAACTGTAG CTGGTTGTTT TGAATGTGGA 10381 CGAAGGCCCT AGAGACAGGT GGACCCGAGG TGCAAGTCTC TCACCCCGAT TTCGAGTATC 10441 TCTTAGCCGC TTGTTCGGCC GCCACTACCA CAAGTAGCAC AGTCTAGAAG GGAGCTGCAT 10501 ATAACCTGGG GTTTTACTTT TGCACCCCTG CCAAAAGAGC TCCCCGGACA GCCCAGCTTT 10561 TGGCGCCACA TTGGCCAGTG AGCGTGGCCT GATCGACTTG GTCACCCACC AGAATAATCG 10621 TCGCTAGTAT GCGCCCAATT AATGGTCGGT GCAGGGTATG GATGCCCGCT ACAGCAAGCC 10681 TGGTCGGGCC ATCCATTTTT GTCATACTAT CTCACATTAT CTTGGCACTC CTGGTGTGGT 10741 ACATCGGGGG CGAGCCTCAG TTCAACAGGA CGTATAGCCA GCCCTGCCAG AAACACTCGT 10801 CAGATTGTCG GGAATATCTC GACGCGGCTG AGGAAGAGGC AGCGAGAGAA CTTCCCCACG 10861 CATTTATTGG CGATGTCAAA GGCACTACGG TCGGGGGGTG TCACCACATT ACATCGAAAT 10921 ACCTACCTAG GTCCCTGCCT AAAGACTCTG TTGCTGTGGT TGGGGTGAGT TCGCCCGGTA 10981 GGGCTGCTAA AGCCGTGTGC ACTCTCACCG ATGTGTACCT CCCCGAACTC CGACCATATT 11041 TGCAACCGGA GACGGCATCA AAATGCTGGA AACTTAAACT GGATTTCAGG GATGTTCGAC 11101 TGATGGTCTG GAAAGGCGCC ACAGCCTATT TCCAGTTGGA AGGGCTGACA TGGTCAGCGC 11161 TGCCCGATTA TGCTAGGTTC ATTCAGCTAC CCAAGGATGC CGTTGTGTAC ATCGATCCGT 11221 GTATAGGGCC GGCAACAGCC AATCGCAAGG TTGTGCGAAC CACAGACTGG CGGGCCGACC 11281 TGGCAGTGAC ACCGTATGAT TACGGTGCTC AGGTCATTTT GACAACAGCC TGGTTCGAGG 11341 ACCTTGGGCC GCAGTGGAAG ATTTTGGGGT TGCAGCCTTT CAGACGAACA TTTGGCTTTG 11401 AGAACACTGA AGATTGGGCA ATTCTCGCAC GCCGTATGAA TGACGGCAAA GATTACACTG 11461 ACTATAATTG GCATTGTGTA CGAGAACGCC CACACGCAAT TTACGGGCGC GCCCGTGACC 11521 ATACGTATCA TTTTGCCCTT GGCACTGAAC TGCAAGTAGA GCTGGGCAGA CCCCGGCTGC 11581 CTCCTGAGCA AGTGCCGTGA SEQ ID NO : 29 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF2 PARENTAL 11611 ATGCAATGGG TTCACTGTGG AGTAAAATCA 11641 GTCAGTTGTT CGTGGATGCC TTCACTGAGT TCCTTGTTAG TGTGGTTGAC ATTGTCATCT 11701 TTCTCGCCAT ATTGTTTGGG TTCACTGTTG CAGGCTGGTT ATTGGTCTTC CTTCTCAGAG 11761 TGGTTTGCTC CGCGTTTCTC CGTTCGCGCT CTGCCATTCA CTCTCCCGAA CTATCGAAGG 11821 TCCTATGAGG GCTTGCTACC CAACTGCAGA CCGGATGTCC CACAATTCGC AGTTAAGCAC 11881 CCGTTGGGTA TACTTTGGCA TATGCGAGTC TCCCACCTAA TTGACGAAAT GGTCTCTCGC 11941 CGCATTTACC GGACCATGGA ACATTCGGGT CAAGCGGCCT GGAAGCAGGT TGTTAGTGAA 12001 GCCACTCTCA CAAAACTGTC AAGGCTTGAC GTAGTCACTC ATTTCCAACA CCTGGCCGCA 12061 GTGGAGGCTG ATTCTTGCCG CTTCCTTAGC TCACGACTCG CGATGCTGAA AAACCTTGCC 12121 GTTGGCAATG TGAGCCTGGA GTACAACACT ACTTTGGACC GCGTTGAGCT CATCTTTCCC 12181 ACACCAGGTA CGAGGCCCAA GTTGACCGAT TTTAGGCAAT GGCTTATCAG CGTGCACGCT 12241 TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT 12301 CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA SEQ ID NO : 30 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF3 PARENTAL 12219 AT GGCTTATCAG CGTGCACGCT 12241 TCCATCTTCT CCTCTGTGGC TTCGTCTGTT ACCTTGTTCA CAGTGCTTTG GCTTCGAATT 12301 CCAGCTCTAC GCTATGTTTT TGGTTTCCAT TGGCCCACGG CAACACATCA TTCGAACTAA 12361 CTATCAATTA CACTATATGT AAGCCATGCC CTACCAGTCA AGCTGCCCAA CAAAGACTCG 12421 AGCCTGGCCG TAACGTGTGG TGCAAAATAG GGCACGACAG GTGTGAGGAA CGTGACCATG 12481 ATGAGTTGTC AATGTCCATT CCGTCCGGGT ACGACAACCT CAAACTTGAG GGTTATTATG 12541 CTTGGCTGGC TTTTTTGTCC TTTTCCTACG CGGCCCAATT CCATCCGGAG CTGTTCGGAA 12601 TAGGAAACGT GTCGCGCGTC TTTGTGGATA AGCGACACCA GTTCATTTGC GCCGAGCATG 12661 ATGGACAAAA TTCAACCATA TCTGCCAGAC ACAACATCTC CGCGTCGTAT GCGGTGTATT 12721 ACCATCATCA AATAGACGGG GGCAATTGGT TTCATTTGGA ATGGCTGCGA CCATTCTTTT 12781 CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT 12841 CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT 12901 TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT 12961 CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAA SEQ ID NO : 31 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF4 PARENTAL 12761 ATGGCTGCGA CCATTCTTTT 12781 CCTCCTGGCT GGTGCTCAAC ATCTCATGGT TTCTGAGGCG TTCGCCTGCA AGCCCTGCTT 12841 CTCGACGCAT CTATCAGATA TTAAGACCAA CACGACCGCG GCTGCCGGTT TCATGGTCCT 12901 TCAGAACATC AATTGTTTCC AATCTCACAG GGCCTCAACA GCGCAAGGTA CCACTCCCCT 12961 CAGGAGGTCG TCCCAATGTC GTGAAGCCGT CGGCATTCCC CAGTACATCA CGATAACGGC 13021 TAATGTGACC GATGAATCGT ATTTGTACAA CGCGGACTTG CTGATGCTTT CCGCGTGCCT 13081 TTTCTACGCC TCGGAAATGA GCGAGAAAGG CTTCAAAGTC ATCTTTGGGA ATATTTCTGG 13141 CGTTGTTTCC GCTTGTGTTA ATTTCACAGA TTATGTGGCC CATGTGACCC AACACACTCA 13201 GCAGCACCAT TTGGTAATTG ATCACATTCG GTTACTACAC TTCTTGACAC CGTCTACGAT 13261 GAGGTGGGCT ACAACCATTG CTTGTTTGTT TGCCATTCTT TTGGCGGTAT GA SEQ ID NO 32 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF5 PARENTAL 13309 AT GAAATGTTCT 13321 TGCAAGTTGG GGCATTTCTT GACTCCTCAC TCTTGCTTCT GGTGGCTTTT TTTGCTGTGT 13381 ACCGGCTTGT CTTGGTCCTT TGTCGATGGC AACGACAACA GCTCGACATC CCAATACATA 13441 TATAATTTGA CGATATGCGA GCTGAATGGG ACCGAATGGT TGTCCGGTCA TTTTGATTGG 13501 GCAGTCGAAA CCTTTGTGCT TTACCCAGTT GCCACTCATA TCATTTCACT GGGTTTTCTC 13561 ACAACAAGCC ATTTCCTTGA TGCGCTCGGT CTCGGCGCTG TGTCCGCCAC AGGATTCATT 13621 GGCGAGCGGT ATGTACTTAG CAGCATGTAC GGCGTTTGCG CCTTCGCGGC GCTCGTATGT 13681 TTTGTCATCC GTGCTGCTAA AAATTGCATG GCTTGCCGCT ATGCCCGCAC CCGGTTTACC 13741 AACTTCATCG TGGACGACCG GGGAAGAATC CATCGATGGA AGTCTTCAAT AGTGGTGGAG 13801 AAATTGGGCA AAGCTGAAGT CGGTGGTGAC CTTGTCAACA TTAAGCATGT TGTCCTCGAA 13861 GGGGTTAAAG CTCAACCCTT GACGAGGACT TCGGCTGAGC AATGGGAAGC CTAG SEQ ID NO : 33 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF6 PARENTAL 13902 ATGGGAAGC CTAGACGACT 13921 TTTGCAACGA TCCCACCGCC GCACAAAAAC TCGTGCTGGC CTTTAGCATC ACATATACAC 13981 CCATAATGAT ATACGCCCTT AAGGTGTCAC GCGGCCGACT CCTGGGGCTG TTGCACATCT 14041 TGATATTTCT GAATTGTTCC TTTACTTTTG GGTACATGAC ATATGTGCAT TTTCAATCCA 14101 CCAACCGTGT CGCACTCACT CTGGGGGCTG TAGTCGCCCT TTTGTGGGGT GTTTACAGCC 14161 TCACAGAGTC ATGGAAGTTC ATCACTTCCA GATGCAGATT GTGTTGCCTA GGCCGGCGAT 14221 ACATTCTGGC CCCTGCCCAT CACGTAGAAA GTGCTGCAGG CCTCCATTCA ATCCCAGCGT 14281 CTGGTAACCG AGCATACGCT GTGAGAAAGC CCGGACTAAC ATCAGTGAAC GGCACTCTAG 14341 TACCTGGGCT TCGGAGCCTC GTGCTGGGCG GCAAACGAGC TGTTAAACGA GGAGTGGTTA 14401 ACCTCGTCAA GTATGGCCGG TAA SEQ ID NO : 34 CODIFICAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO DE PRRSV 94881 ORF7 PARENTAL 14413 ATGGCCGG TAAGAACCAG AGCCAGAAGA AAAGAAGAAA TGCAGCTCCG 14461 ATGGGGAAAG GCCAGCCAGT CAATCAACTG TGCCAGTTGC TGGGTACAAT GATAAAGTCC 14521 CAGCGCCAGC AATCTAGGGG AGGACAGGCC AAAAAGAAGA AGCCTGAGAA GCCACATTTT 14581 CCCCTAGCTG CTGAAGATGA CATTCGGCAC CATCTCACCC AGGCCGAACG TTCCCTCTGC 14641 TTGCAATCGA TCCAGACGGC TTTCAATCAA GGCGCAGGAA CTGCGTCGCT TTCATCCAGC 14701 GGGAAGGTCA GTTTCCAGGT TGAGTTCATG CTGCCGGTTG CTCATACAGT GCGCCTGATT 14761 CGCGTGACTT CTACATCCGC CAGTCAGGGT GCAAATTAA 1/1

Claims (3)

1. Composição de proteína, caracterizada pelo fato de que compreende - uma proteína com a sequência de SEQ ID NO: 7, ou - as proteínas com as sequências de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 8.

2. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende - a sequência da SEQ ID NO: 24, ou - as sequências de SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21; e SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25.

3. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica (i) o ORF do PRRSV de SEQ ID NO: 7 operacionalmente li-gado a um promotor, ou (ii) os ORFs do PRRSV da SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, e SEQ ID NO: 8 opera-cionalmente ligada a um promotor, em que(a) a referida sequência de ácido nucleico que codifica a referida ORF é a SEQ ID NO: 24 ou sequências nucleotídicas degeneradas da mesma que codificam as mesmas sequências de aminoácidos, ou (b) a referida sequência de ácido nucleico que codifica as referidas ORFs compreende a SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; e SEQ ID NO: 25 ou se-quências nucleotídicas degeneradas da mesma que codificam as mesmas sequências de aminoácidos.

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