KR100388257B1 - 백신 또는 진단방법에서 사용하기 위한 피알알에스 바이러스의 피알알에스브이 항원부위 인식성 펩타이드 서열 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PRRSV 분리체의 항원부위를 제공한다. 항원부위는 중화성이며, 보존되거나 비보존되고 입체배좌성이며, 항체를 유도할 수 있고, PRRSV의 ORF4 및 ORF7에 의해 코드화된 단백질 GP4및 N상에서 발견된다. 이 부위에 의해 확인된 펩타이드 서열은 PRRS에 대해 배향된 백신 및 PRRS에 대한 진단시험에서 사용될 수 있다. 또한, 돼지군으로부터 PRRS를 근절시키기 위해 고안된 프로그램에서 마커 백신 다음에 필요할 수 있는 차별화시험이 개발될 수 있다.
Description
PRRS 바이러스(PRRSV)는 현재 돼지의 생식 및 호흡기 증후군(PRRS)이라고 불리우는 돼지 질병의 원인균이다. 이 바이러스는 미국에서는 대략 1987년 이후 및 유럽에서는 1990년 이후에 발견되어 초기에는 미스테리 돼지병, 돼지 불임 및 호흡기 증후군 등등과 같은 다수의 다양한 명칭으로 공지된 돼지 질병의 원인균이다. 바이러스 그 자체에도 또한 많은 명칭이 붙여져 있으며, 그중에는 렐리스태드 바이러스(Lelystad virus; LV), SIRS 바이러스 등이 있지만, 현재는 대부분 돼지 생식 및 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)라고 칭하고 있다. 이 바이러스는 돼지에게서 유산 및 호흡곤란을 야기시키며, 1991년에 유럽에서 최초로 분리되었고(EP 특허 587780, US 특허 5,620,691), 이어서 미국 및 세계의 여러 나라에서 분리되었다. PRRSV는 양성 스트랜드(positive strand) RNA 게놈을 함유하는 작은 외피(enveloped) 바이러스이다. PRRSV는 대식세포 내에서 우선적으로 성장한다. 대식세포 이외에, PRRSV는 세포계 CL2621, 및 원숭이 신장세포계 MA-104로부터 클로닝된 다른 세포계 내에서도 성장할 수 있다(Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest. 4; 127-133, 1992). 약 15kb의 폴리아데닐화 RNA인 PRRSV의 게놈은 1993년에 서열이 확인되었다 (Meulenberg et al., Virology 192; 62-74, 1993). 뉴클레오타이드 서열, 게놈 조직화 및 복제전략은 PRRSV가 아르테리바이러스(Arteriviruses)라고 칭하는 작은 외피 양성-스트랜드 RNA 바이러스의 그룹과 연관이 있음을 시사한다. 이 그룹에는 락테이트 디하이드로게나제-증진 바이러스(LDV), 말 동맥염 바이러스(EAV) 및 원숭이 출혈열 바이러스(SHFV)가 포함된다. 이들 바이러스는 유사한 게놈 조직화, 복제전략, 형태학 및 바이러스성 단백질의 아미노산 서열을 가지고 있다. 아르테리바이러스는 12.5 내지 15kb의 게놈을 함유하며, 복제기간중에 6개의 서브게놈 RNAs의 3' 네스트화된(nested) 세트를 합성한다. 이들 서브게놈 RNAs는 바이러스 게놈의 5' 말단으로부터 유도된 리더서열을 함유한다. ORFs 1a 및 1b는 바이러스 게놈의 대략 2/3를 포함하며, RNA 의존성 RNA 폴리머라제를 코드화한다. 6개의 더 작은 ORFs인 ORFs 2 내지 7은 바이러스 게놈의 3' 말단에 위치한다. ORFs 2 내지 6은 외피단백질을 코드화할 수 있는 반면에 ORF7은 뉴클레오캅시드(nucleocapsid) 단백질을 코드화한다 (Meulenberget al, Virology 206; 155-163, 1995).
PRRSV는 ORFs 2 내지 7에 의해 코드화된 6개의 단백질이 모두 비리온과 결합되어 있는 것으로 입증된 최초의 아르테리바이러스이다. 15-kDa N 단백질(ORF7에 의해 코드화됨) 및 18-kDa 내재(integral) 막단백질 M(ORF6)은 N-글리코실화되지 않는 반면에, 29- 내지 30-kDa GP2단백질(ORF2), 45- 내지 50-kDa 단백질 GP3단백질(ORF3), 31- 내지 35-kDa GP4단백질(ORF4) 및 25-kDa 단백질 GP5(ORF5)는 N-글리코실화된다. 이들 단백질은 또한 PRRSV의 북아메리카 분리체 ATCC-VR2332 및 PRRSV의 다른 분리체(PRRSV의 다른 분리체로는 예를들어 CNCM I-1140, ECACC V93070108, CNCM I-1387, CNCM I-1388, ATCC-VR2402, ATCC-VR2429, ATCC-VR2430, ATCC-VR2431, ATCC-VR2475, ATCC-VR2385가 있지만, 그밖의 다른 다수의 것도 공지되어 있다)에 의해 감염된 세포의 용해물(lysate) 및 세포외 바이러스에서도 검출되었다.
본 발명자들은 이미 GP3, GP4, M 및 N에 대해 특이적인 PRRSV-특이적 MAbs의 패널(panel)의 분리 및 특정화에 대하여 기술하였다 (van Nieuwstadt et al., J. Virol. 70, 4767-4772, 1996). 흥미롭게도, GP4에 대해 배향된 MAbs는 중화성이었으며, 이것은 단백질의 적어도 일부분이 비리온 표면에 노출되어 있음을 시사하는 것이다. 또한, N에 대해 배향된 대부분의 MAbs는 시험한 모든 PRRSV 분리체와 반응하였다.
PRRS 그 자체는 세계의 대부분의 지역에서의 돼지산업에서 주된 관심이 되고 있는 문제이다. 돼지 군(herds)으로의 PRRSV의 감염은 심각한 경제적 손실을 야기시키게 된다. PRRS에 대한 진단시험은 많은 수의사 및 실험실에서 광범하게 수행되었다. 각각 컨쥬게이트된 효소 또는 형광색소(fluorochromes), 및 다른 기질과 같은 검출에 적합한 수단을 함유하는 IPMA, IFT, IFA, ELISA와 같은 대부분의 진단시험은 PRRSV로부터 유래된 항원과 PRRSV에 대해 배향된 항체 사이의 상호작용을 이용하여 시험하고자 하는 동물(예를들어 돼지)로부터 샘플채취된 혈액, 혈청, 조직, 조직액, 세정액, 뇨, 변과 같은 생물학적 샘플내의 PRRSV 항원 또는 PRRSV에 대해 배향된 항체의 존재여부를 측정하는 것이다. PRRS 진단을 위한 이들 진단시험 또는 진단용 키트 또는 시험에서 사용되는 항원 및/또는 항체는 단지 그들이 유래하는 기원 또는 PRRSV와의 반응성에 의해서만 한정된다. 원칙적으로, 이것은 높은 특이성 또는 감수성이 명백하게 필요하지 않은 선별시험법에는 충분하다. 그러나, 끊임없이 지속되는 PRRS의 전파는 돼지 산업분야에서 PRRS를 돼지군으로부터 또는 돼지들을 사육하는 전체 영역, 지역 또는 국가로부터도 근절시키는 것이 필요하다고 생각할 정도로 큰 관심을 일으켰다. 이러한 필요성의 명백한 예는 덴마크에서 PRRS에 관하여 제안된 근절프로그램이다. 만일 PRRS를 완전히 근절시키기 위한 결정이 내려진다면 현재 사용되고 있는 시험방법보다 더 큰 특이성 또는 감수성을 나타내는 진단시험방법이 필요하다.
PRRS에 대한 예방접종이 또한 광범위하게 실시된다. 몇가지 예가 알려져 있는데, 그중에는 변형된 생백신이 사용되는 방법이 있고, 사멸백신도 또한 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로 생백신의 문제점, 및 따라서 또한 생 PRRS 백신으로 인한 문제점은 이들 백신이 예방접종하지 않은 돼지에게 전파되는 경향이 있고, 그것에 의해 돼지 군에서 검출가능한 감염을 감소시키는 대신 전파시켜, 완전한 근절과 반대되는 결과를 나타내는 경향이 있다는 점이다. 야생형 바이러스와 혈청학적으로 차별화될 수 있는 라인 마커(line marker) 백신이 사용되는 경우에 이러한 문제는 현저히 감소된다. 추가된 단점은 생백신이 밝혀지지 않은 항원성 성분으로 인하여 때때로 예방접종한 돼지에게서 과민반응을 야기시킨다는 점이다. 사멸백신은 일반적으로 예방접종한 돼지에게서 예방효과를 유도하는 것으로 보고되어 있으며, 돼지와 돼지 사이에서 전파되지 않는다는 추가 잇점을 가지고 있지만, 사멸백신의 단점은 이것이 백신의 1회 용량에서 측정가능한 예방적 면역반응을 유도하기에 충분한 항원성 매스(mass)를 생성시키기 어려울 수 있다는 점이다. 특히, 돼지에게서 측정가능한 중화항체 역가를 유도할 수 있는 사멸백신은, 예방접종된 돼지 개체군에서 이들 중화항체를 측정하는 것이 돼지군에 대한 예방접종에 의해 얻어지는 예방의 수준에 대한 이해를 도와줄 수 있기 때문에 유익하다. 또한, 필요한 항원성 매스를 수집하는데 성공한다면, 이것은 추가의 다른 밝혀지지 않은 항원성 매스가 또한 백신내에 존재하며, 이것은 상기한 바와 같이 과민반응을 또한 일으킬 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 점에서 중화반응에 관여하는 PRRSV 상의 특이부위를 아는 것은 중화항체를 유도하는데 필요한 중요한 펩타이드 서열을 포함시킨 더 적합한 백신의 디자인을 이끌어내는데 유익하다. 미국에서 분리된 PRRSV 분리체로부터 유래한 현재 사용되고 있는 백신의 이점은, 이러한 백신이, 비록 PRRSV의 유럽 분리체에 대해 완전히 예방적이며 면역학적으로 교차반응성을 갖기는 하지만, 이들을 PRRSV의 유럽 분리체와 차별화시킬 수 있는 아직까지 밝혀지지 않은 에피토프 또는 항원부위를 함유한다는 점이다. 역으로, 유럽에서 분리된 PRRSV 분리체로부터 유래하는 생백신은, PRRSV의 미국 분리체에 대해 완전히 예방적이고 면역학적으로 교차반응성을 갖기는 하지만, 이들을 PRRSV의 미국 분리체와 차별화시킬 수 있는 아직까지 밝혀지지 않은 유사한 에피토프 또는 항원부위를 함유한다.
미국으로부터 유래된 백신에 의해 예방접종되었거나 유럽 야생형 PRRSV에 의해 감염된 돼지들을 (PRRSV 분리체들 사이의 작은 에피토프 차이를 기준으로) 서로 구별할 수 있거나, 유럽으로부터 유래된 백신에 의해 예방접종되었거나 미국 야생형 PRRSV에 의해 감염된 돼지들을 서로 구별할 수 있는 혈청학적 시험이 이용될 수 있다면, PRRS에 대한 근절프로그램에서 큰 신뢰성을 가지고 사용될 수 있는 마커 백신 및 (상기의 식별 에피토프 또는 항원부위를 병합시키는) 상응하는 진단시험을 개발할 수 있다. 예를들어, 덴마크에서는 미국으로부터 유래된 백신으로 예방접종하고 덴마크 돼지에게서 유럽 야생형 PRRSV 상의 독특한 에피토프에 대해서만 유일하게 배향되고 미국 균주와는 교차반응하지 않는 항체의 셋트를 측정할 수 있다. 이것은 덴마크 돼지 군로부터 야생형에 의해 감염된 돼지를 명백히 검출하고, 이어서 제거할 수 있도록 한다. 현재는 PRRSV 분리체들 사이의 전반적인 광범위한 면역학적 교차반응성으로 인하여 이러한 구별은 불가능하다. 이러한 예방접종-시험 프로그램은 PRRS의 근절을 위한 기본이 될 것이고, 또한 필요에 따라 별개의 PRRSV 항원부위를 백신 및/또는 진단시험에서 사용하여 다른 나라에서도 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명은 사멸 또는 약독화 백신 또는 재조합 DNA 기술에 의해 유도된 백신일 수 있는 백신의 개발을 가능하게 하는 펩타이드 서열을 함유하는 PRRSV의 항원부위, 및 진단방법, 시험 및 키트의 개발 및 새로운 진단방법, 시험 및 키트의 제공을 가능하게 하는 항원부위를 제공한다. 항원성(예를들어 폴리클로날 혈청 또는 MAbs와의 반응성에 의해 정의되는 것) 및 따라서 항원부위의 작용성을 유지시키는 인공적인 변화 또는 아미노산 잔기 치환은 펩타이드 디자인 및 합성의 기술분야에서 통상적인 기술을 갖는 전문가에 의해 특정의 분리체의 항원부위를 구성하는 것으로 공지되어 있는 서열로부터 용이하게 유도될 수 있다. 예를들어, 특정의 아미노산 잔기는 통상적으로 동등한 특성을 갖는 다른 것으로 치환될 수 있는데, 예를들어 염기성 잔기는 다른 염기성 잔기로, 산은 산으로, 벌키 그룹은 벌키 그룹으로, 소수성이나 친수성 잔기는 또 다른 소수성 또는 친수성 잔기로 등과 같이 치환될 수 있다. 또한, 선택된 서열의 항원성을 유지시키거나 오히려 더 개선시키는 덜 통상적이지만 더 특이적인 다른 변화가 있을 수도 있다. 이러한 변화는 예를들어 펩스캔 (PEPSCAN) 기본 아미노산 치환 또는 치환 지도작성(mapping) 기술에 의해 이루어질 수 있다 (van Amerongen et al., Peptide Research (1992) 5, 269-274). 결국, 본 발명에 의해 제공되는 항원부위내의 아미노산 잔기는 예를들어 통상적으로 또는 치환 지도작성의 지침하에서 치환될 수 있고, 생성된 펩타이드 서열은 항원부위와 기능적으로 동등하다. 치환 아미노산은 L- 또는 D-아미노산 잔기일 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 제공되는 펩타이드 서열은 종래에 알려진 보조약 (adjuvant)(예를들어 KLH)에 컨쥬게이팅시킴으로써 훨씬 더 큰 면역원성을 갖도록 한다. 또한, 펩타이드는 이 펩타이드를 하나(예를들어 직렬 펩타이드) 또는 그 이상의 반복서열을 갖도록 제조하거나, 중합시키거나 환상으로 만들어서 훨씬 더 큰 면역원성을 갖도록 한다.
N 단백질이 면역원성이고 (Meulenberg (1995), J. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2, 652-656, GB 2 289 279 A) 유럽 균주(LV)와 미국 균주(VR2332)의 N 단백질 사이에는 보존 영역(conserved region) 및 비보존 영역이 존재한다는 것 (WO 96/04010)은 이전에 알려져 있었지만, 본 발명자들은 본 발명에서 보존영역과 비보존영역이 항원성이 있으며, 면역화 또는 진단시험을 위한 항원으로서 각각 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있다는 것을 최초로 입증하였다. 또한, 본 발명에서는 N 단백질의 항원영역이 선형 및 입체배좌 의존성 에피토프 둘다로 구성된다는 것이 확인되었다.
GP4 단백질은 바이러스를 중화시킬 수 있는 항체를 유도하는 것으로 밝혀진 PRRSV의 1차 구조 단백질이다. 항체를 중화하기 위한 표적으로서 비리온 표면에서 노출되어야 하며, 이렇게하여 바이러스가 세포를 감염시키는 것을 방지하는 약 40개의 아미노산으로 된 특정영역이 확인되고 확정되었다. 이것은 흥미로운 새로운 발견인데, 이는 일반적으로 PRRSV의 주된 구조인 GP5 단백질이 숙주세포의 부착에 관여하는 가장 중요한 후보(candidate)인 것으로 추정되었기 때문이다.
본 발명은 미스테리 돼지병(Mystery Swine Disease)의 원인균인 PRRS 바이러스, PRRS 바이러스내에서 확인된 펩타이드 서열, 및 백신 및 진단시험에 이들 서열을 병합시키는 방법에 관한 것이다.
도 1은 pSFV1에서 발현된 G 단백질 및 그들의 GP4-특이적 MAbs와의 반응성에 대한 개요도이다. 상이한 ORF4 유전자를 함유하는 플라스미드의 명칭이 표시되어 있다. 흰색 막대(bar)는 PRRSV의 ORF4에 의해 코드화된 G 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 나타내며, 검은 막대는 VR2332의 ORF4에 의해 코드화된 G 단백질로부터 유래된 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산의 수는 막대 위에 표시하였다. 재료 및 방법에서 상세히 기술한 바와 같이, 유전자를 우선 PGEM-4Z에 삽입시킨 다음 pSFV1에 트랜스펙션시켰다. 14개의 GP4-특이적 MAbs의 완전한 셋트는 IPMA에서 상이한 구조물들과 동일하게 반응하였으며, 반응성은 양성(+) 및 음성(-)으로 표시하였다.
도 2는 GP4의 잔기 25 내지 94를 포함하는 중복성 12-mer 펩타이드를 사용한 GP4-특이적 MAbs 및 폴리클로날 혈청의 펩스캔(Pepscan) 분석 결과이다. 4개의 연속적인 펩타이드를 인식하는 MAbs 130.7 및 MAb 138.28의 스캔은 도 2A에 나타내었다. 5개의 다른 MAbs(122.29, 122.30, 122.66, 122.71 및 138.28)는 유사한 특이성을 나타내었다. 면역시키기 전(va12-0 및 va14-0), 가광견병 바이러스 벡터 발현성 ORF4에 의해 면역시킨 후(va12-54 및 va14-54) 및 이어서 PRRSV로 공격한 후(va12-s1 및 va14-s1)의 두마리의 돼지로부터 얻은 폴리클로날 혈청의 스캔은 도 2A 및 2B에 나타내었으며, 다가의 돼지 항-LV 혈청 21(va21)의 스캔은 도 2D에 나타내었다. 반응성 펩타이드의 아미노산 서열은 공통 잔기의 코어를 네모 안에 넣어 함께 나타내었다.
도 3은 다양한 PRRSV 균주의 GP4(A) 및 N(B) 단백질의 아미노산 서열을 정렬한 것이다. I-1102 서열과는 상이한 아미노산 만을 나타내었다. 펩스캔 분석에서 MAbs 및/또는 폴리클로날 혈청에 의해 인식된 코어 펩타이드 서열은 밑줄을 그어 나타내었다.
도 4는 N 단백질 서열에서 항원결합부위의 위치결정 및 N 단백질 서열과 북아메리카 균주 VR2322 및 LDV의 서열의 비교를 나타낸 것이다. 항원부위 A, B, C 및 영역 D는 음영으로 나타내었다. 부위 A, B 및 C는 펩스캔 분석에서 확인되었으며, 부위 D는 키메라 N 단백질의 구성에 의해 확인되었다. 영역 D를 배치시키기 위하여 LDV의 상응하는 아미노산 서열에 대해 치환된 LV의 아미노산 서열은 밑줄을 그어 나타내었다. 부위 B를 돌연변이시키기 위하여 아미노산 25-30 사이에 삽입된 EAV의 N 단백질의 아미노산은 LDV 서열 아래에 나타내었다. 동일한 아미노산은 수직선으로 연결하였다.
본 발명은 PRRSV의 GP4상의 중화부위인 주항원부위를 제공한다. 본 발명은 아미노산 코어 서열과 PRRSV 분리체의 아미노산 코어 서열의 측면에 위치하며 PRRSV의 ORF4 단백질상의 중화부위를 포함하는 아미노산 서열을 함유하는, 효과적인 마커 백신의 디자인에 중요한 주요 중화부위의 위치결정을 제공한다. 다양한 형태의 백신에 적절한 중화부위 서열을 병합시킴으로써, 예방접종한 돼지중에서 중화항체를 특이적으로 유도할 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 중화부위를 포함하는 사멸백신은 측정가능한 중화항체를 유도하도록 만들어진다. 특히, PRRSV 분리체 I-1102에서 확인되는 것과 같이 대략 아미노산 40 내지 79에서 확인되는 것에 상응하는 PRRSV의 ORF4 코드화 단백질내의 위치에 존재하는 서열은 중화부위를 포함한다. 또한, 선택된 펩타이드 서열은 펩타이드를 보조약 또는 본 기술분야에서 공지된 다른 담체와 혼합시킴으로써 면역원성이 훨씬 더 크게 된다. 이렇게 하여 수득된 펩타이드 조성물이 백신으로서 사용된다. 그러나, 중화부위를 함유하는 선택된 펩타이드 서열은 또한 이종 바이러스 또는 박테리아로부터 유래된 별개의 재조합 벡터인 백신 벡터시스템에 병합되지만, 선택된 펩타이드 서열은 또한 PRRSV 벡터 바이러스 또는 이것으로부터 유도된 백신내에 선택적으로 병합될 수도 있다.
본 발명의 또다른 특징으로, 약 52 내지 75에 상응하는 위치에 존재하는 아미노산 서열은 광범한 반응성 중화부위를 더 특이적으로 구성한다. 본 발명에 의해 제공되는 중화부위의 또 다른 구현예를 공지되어 있거나 확인되는(참조예 본 명세서의 실험부분) 다양한 PRRSV 분리체중에서 발견할 수 있다. 분자생물학 분야의 전문가는 용이하게 본 발명에 의해 제공되는 중화부위를 함유하는 서열을 또 다른 PRRSV 분리체의 ORF4 코드화 단백질의 아미노산 서열과 비교할 수 있다.
본 발명은 또한 항원 또는 항체 검출시험인 진단시험을 개선시키는 PRRSV의 펩타이드 서열을 제공한다. 본 발명은 진단시험에서 단독으로 또는 조합하여 사용되는 다양한 그룹의 항원부위를 제공한다. 이러한 방식으로, 진단 및 감별진단과 관련된 분야에 존재하는 다양한 요구를 충족시키는 진단시험이 본 발명에 의해 제공된다. 항원-항체 상호작용은 항상 5 내지 15개의 아미노산 길이인 아미노산 서열의 교차반응성 에피토프-파라토프 상호작용을 수반한다. 따라서, 진단시험에 병합시키기 위해, 5 내지 15개의 아미노산 길이를 가지며 본 발명의 항원부위의 코어서열과 부분적으로 또는 완전히 중복되는 아미노산 서열이 본 발명에 의해 제공된다. 이들 펩타이드 서열은 사용되어질 시험에서 서열을 함유하는 항원 또는 항원성 물질을 선택하거나 디자인하는데 사용된다. 또 다른 대체방법으로, 본 발명에 의해 제공된 항원부위와 반응하는 합성항체가 본 발명에 의해 제공된다. 이들 부위 또는 관련 서열은 이종 발현시스템에서 용이하게 발현될 수 있는 항체-유사 분자를 구성하는 (중쇄) 항체의 클론선택 또는 파아지 디스플레이 라이브러리 (phage display libraries)와 같은 시스템으로부터 수득된 합성항체와 반응한다.
본 발명에 의해 제공되는 한가지 그룹은 상기에서 이미 설명한 바와 같이, 상기 중화부위에 상응하는 펩타이드 서열을 포함한다. 이 부위 및/또는 이 부위에 대해 특이적으로 배향된 항체를 함유하는 진단시험은 돼지에서 중화항체를 검출한다. 본 발명에 의해 제공되는 또 다른 그룹은 단백질 N 상에 보존된 항원부위를 포함한다. 본 발명은 보존된 항원부위내에서 코어서열 VNQLCQLLGA 또는 VNQLCQMLGK를 제공한다. 이 부위 및/또는 이 부위에 대해 특이적으로 배향된 항체를 포함하는 진단시험은 돼지에게서 대부분의 PRRSV 분리체와 특이적으로 반응하는 이들 항체를 검출한다. 또한, 보존된 부위에 대해 배향된 항체를 사용하여 PRRSV 항원을 검출함으로써 PRRSV 분리체를 그들의 기원에 관계없이 검출할 수 있도록 하는 진단방법이 제공된다.
본 발명에 의해 제공되는 또 다른 그룹은 단백질 N 상의 비보존된 차별화 항원부위를 포함한다. 이 부위 및/또는 이 부위에 대해 특이적으로 배향된 항체를 포함하는 진단시험은 돼지에게서 별개의 PRRSV 분리체와 특이적으로 반응하는 항체를 검출하는데, 이렇게 함으로써 예를들어 예방접종된 돼지를 야생형 PRRSV로 감염된 돼지로부터 구별할 수 있다. 또한, 비보존된 부위에 대해 배향된 항체를 사용하여 PRRSV 항원을 검출하고, 그것에 의해 상이한 PRRSV 분리체를 구분할 수 있도록 하는 진단시험이 제공된다. 본 발명은 하나의 이러한 비보존된 부위내에서 코어서열 PRGGQAKKKK 또는 PRGGQAKRKK 또는 PRGGQAKKRK 또는 GPGKKNKKKN 또는 GPGKKNKKKT 또는 GPGKKNRKKN 또는 GPGKKFKKKN 또는 GPGKKIKKKN 또는 GPGQINKKIN을 제공한다. 본 발명은 또 다른 비보존된 부위내에서 코어서열 MAGKNQSQKK 또는 MPNNNGKQTE 또는 MPNNNGKQPK 또는 MPNNNGKQQK 또는 MPNNNGKQQN 또는 MPNNNGKQQK 또는 MPNNNGRQQK를 제공한다. 또한, 항원성 및 따라서 GP4 또는 N 단백질내의 상기 코어서열의 기능성을 유지시키는 인공적인 변화는 상술한 바와 같이 펩타이드 디자인 및 합성의 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해 용이하게 도입될 수 있다.
본 발명은 또한 분리체 I-1102에서 단백질 N 상의 아미노산 위치 51 내지 약 68(분리체 I-1102 내의 코어서열 PKPHFPLAAEDDIRHHL) 또는 79 내지 약 90(분리체 I-1102 내의 코어서열 SIQTAFNQGAGT) 또는 111 내지 124(분리체 I-1102 내의 코어서열 HTVRLIRVTSTSAS)에서 발견되는 위치에 상응하는 위치에서 발견될 수 있는 입체배좌성 에피토프(이것은 다양한 분리체들 사이에서 서로 크게 다르다)를 함유하는 그룹을 제공한다. 본 발명에 의해 제공되는, N 단백질내의 보존 및 비보존 및 차별화 및 입체배좌성 부위들은 PRRSV 감염을 명료하게 진단하는 진단시험을 제공한다. 시험은 비보존 부위의 사용을 피해서 수행함으로써 허위음성 결과를 피할 수 있다. 또한, 다양한 비보존 부위는 예를들어 PRRSV의 야생형 분리체에 의해 감염된 돼지로부터 예방접종된 돼지를 구별할 수 있는 차별화시험의 개발에 사용된다. 또한, 전술한 바와 같이 보존 또는 비보존 또는 입체배좌성 에피토프 부위를 함유하는 서열을 또 다른 PRRSV 분리체의 ORF7 코드화 단백질의 아미노산 서열과 함께 정열하는 것은 분자생물학의 분야에서 작업하는 전문가에게는 용이한 것이다. 본 발명에 의해 제공되는 부위는 PRRS의 근절프로그램에서 사용하기 위한 백신-식별성 진단시험의 새로운 쌍으로 사용된다.
실험부분
재료 및 방법
세포 및 바이러스
PRRSV의 테르 휴른(Ter Huurne) 균주(CNCM I-1102)는 1991 년에 분리되었다 (Wensvoort et al., 1991). 미국의 ATCC-VR2332 균주는 벤필드(Benfield) 등에 의해 분리되었다(1992). 균주 NL1(네덜란드, 1991)은 본 발명자들의 실험실에서 분리되었으며, 균주 NY2(영국, 1991)는 티. 드류(T. Drew)에 의해 친절하게 제공되었으며, 균쥬 DEN(덴마크, 1992)은 에이. 보트너(A. Botner)에 의해 친절하게 제공되었고, 균주 LUX(룩셈부르그, 1992)는 로쉬(Losch)에 의해 친절하게 제공되었으며, 균주 SPA1 및 SPA2(스페인, 1992)는 각각 쇼코우히(Shokouhi) 및 에스푸나(Espuna)에 의해 친절하게 제공되었고, 균주 FRA(프랑스, 1992)는 와이. 레포르반(Y. Leforban)에 의해 친절하게 제공되었다.
PRRSV 및 VR2332는 전술한 바와 같이 CL2621 세포상에서 증식하였다(van Nieuwstadt et al., 1996). 7 가지의 상이한 유럽의 분리체들은 돼지의 폐포 대식세포내에서 증식하였다. BHK-21 세포는 5% 소태아 혈청 및 항생물질이 보충된 둘베코의 최소필수배지(Dulbecco's Minimal Essential Medium)에서 유지시켰다. 트랜스펙션(transfection) 실험을 위해서는, BHK-21 세포를 글래스고우(Glasgow) 최소필수배지(GIBCO-BRL/Life Technologies Ltd.)에서 증식시켰다.
항혈청
이전의 실험들에서는 돼지 항-PRRSV 혈청 21 및 토끼 항-펩타이드 혈청 698 및 700을 사용하였다. 혈청 700은 PRRSV의 ORF4에 의해 코드화된 아미노산 106 내지 122(CLFYASEMSEKGFKVIF)에 대해 배향된 것이며, 토끼로부터 수득하였다. MAbs의 생산 및 특성화는 문헌에 기술되어 있다(van Nieuwstadt et al., 1996). 호성세포는 5회의 연속적인 융합실험으로부터 유도되었으며 ORF4 단백질(MAb 121.4, 122.1, 122.12, 122.20, 122.29, 122.30, 122.59, 122.66, 122.68, 122.70, 122.71, 126.1, 126.7, 130.7, 138.28) 또는 ORF7 단백질(MAb 122.17, 125.1, 126.9, 126.15, 130.2, 130.4, 131.7, 138.22, WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17)에 대해 배향되었다. Mabs WBE는 닥터 드류(Dr. Drew, Weybridge, UK)에 의해 호의적으로 제공되었으며, Mab SDOW17은 닥터 벤필드(Dr. Benfield, South Dakota, US)에 의해 호의적으로 제공되었다.
플라스미드 구성
ORF4의 상부(PRRSV13) 및 하부(PRRSV14)에 위치한 두개의 올리고뉴클레오티드는 프라이머내에 도입된 BamHI 및 HindIII 부위를 사용하여 pGEM-4Z 내에서 분리체 I-1102의 ORF4를 증폭시키고 클로닝하는데 이미 사용되어 왔다(Meulenberget al., 1995). 생성된 플라스미드는 pABV209라고 불리워졌다. VR2332의 ORF4의 개시코돈(PRRSV4) 및 종결코돈(PRRSV5)에 대해 유사한 위치에 존재하는 두개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 이전의 연구에서 기술한 바와 같이 RY-PCR을 사용하여 VR2332의 ORF4를 증폭시켰다. PCR 단편을 BamHI 및 부분적으로는 HindIII에 의해(이는 VR2332의 ORF4가 내부 HindIII 부위를 함유하기 때문이다) 분해시키고, pGEM-4Z 내에서 클로닝시켜 플라스미드 pABV270을 생성하였다. 재조합 DNA 기술은 필수적으로 샘브룩(Sambrook) 등에 의해 기술된 바와 같이 수행하였다(Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 자동화 DNA 서열결정기(Applied Biosystems)상에서 결정된 pABV270 내의 VR2332 ORF4의 뉴클레오타이드 서열은 공지되어 있는 서열(Murtaugh et al., Arch. Virol. 140; 1451-1460, 1995)과 동일하였다.
이어서, I-1102 및 VR2332의 ORF4를 셈리키 포리스트(Semliki Forest) 바이러스 발현벡터인 pSFV1에 전이시켰다. pABV209 및 pABV270을 BamHI 및 HindIII (pABV270의 경우에 부분적으로)로 분해시키고, ORF4 단편을 클레노우(Klenow) 폴리머라제로 처리하여 평활말단을 생성시키고, 이들을 송아지 장알칼리성 포스파타제 (Pharmacia)에 의해 탈포스포릴화된 pSFV1의 SmaI 부위에 결찰시켰다. 정확한 배향으로 I-1102(pABV265) 및 VR2332(pABV271)의 ORF4 를 함유하는 플라스미드를 GP4단백질을 발현시키기 위하여 더 처리하였다. 또한, I-1102 및 VR2332의 4개의 상이한 키메라 ORF4 유전자를 제조하였다. VR2332의 GP4단백질의 아미노산 1 내지 39를 코드화하는 ORF4의 뉴클레오타이드 서열을 올리고뉴클레오타이드 PRRSV4 및 PRRSV6을 갖는 플라스미드 pABV270으로부터 증폭시켰다. 수득된 단편을 BamHI 및 SacII로 분해시켰다. 이 단편을 BamHI 및 SacII로 분해된 pABV209에 결찰시켜 VR2332의 GP4단백질의 아미노산 1 내지 39 및 pABV306 내의 I-1102의 GP4단백질의 아미노산 40 내지 183 사이에서 구조내 융합(in frame fusion)을 생성하였다. VR2332의 GP4의 아미노산 1 내지 75를 코드화한 ORF4의 뉴클레오타이드 서열을 올리고뉴클레오타이드 PRRSV4 및 PRRSV9에 의해 증폭시켰다(참조 표 2). 이 단편을 KpnI 및 BamHI로 분해시켰다. I-1102 GP4단백질의 아미노산 80 내지 183을 코드화하는 ORF4의 뉴클레오타이드 서열을 PRRSV46 및 PRRSV14에 의해 증폭시키고, 증폭된 단편을 KpnI 및 BamHI로 분해시켰다. 이 두가지 단편을 BamHI 및 HindIII에 의해 분해된 pGEM-4Z 내에 함께 결찰시켜 플라스미드 pABV308을 생성시켰다. 동일한 방식으로, pGEM-4Z 내에서 PRRSV10 및 PRRSV5에 의해 증폭된 VR2332의 아미노산 76 내지 178을 코드화한 단편에 연결된 PRRSV13 및 PRRSV57에 의해 증폭된 I-1102 GP4단백질의 아미노산 1 내지 79를 코드화한 뉴클레오타이드 서열로 구성된 pABV314 내에서 상보적 구조물을 생성시켰다. 4번째 키메라 구조물은 VR2332 GP4단백질의 아미노산 1 내지 39 및 아미노산 76 내지 178을 코드화한 단편에 융합된 PRRSV GP4단백질의 아미노산 40 내지 79 를 코드화한 단편으로 구성되었다. 이것은 BamHI 및 HindIII에 의해 분해된 pGEM-4Z 내에서 pABV270의 BamHI/SacII ORF4 단편과 pABV314의 SacII/HindIII ORF4 단편을 연결시킴으로써 이루어졌다. 이 플라스미드를 pABV325라고 지정하였다. 플라스미드 pABV306, pABV308 pABV314 및 pABV325는올리고뉴클레오타이드 서열결정에 의해 정확한 서열을 갖는지 검사하였다. 키메라 ORF4 유전자를 VR2332 및 PRRSV의 ORF4 유전자에 대하여 상술한 바와 동일하게 pABV306, pABV308, pABV314 및 pABV325로부터 PSFVI에 전이시켜 각각 pABV296, pABV305, pABV321 및 pABV326을 생성시켰다(도 3).
ORF7의 상부(LV108; 5' GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC 3') 및 하부(LV112; 5' CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCTGA 3')에 위치한 두개의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 pGEM-T 내에서 ORF7 유전자를 증폭시키고 클로닝시켜 pABV431을 생성시켰다. ORF7의 단편을 증폭시키는데 사용된 이들 및 그밖의 다른 올리고뉴클레오타이드의 서열 및 위치는 표 1에 제시하였다. 또한 4개의 상이한 키메라 구조물은 PCR-지시된 돌연변이유발에 의해 제조되었다. 아미노산 25-26, 28-30를 암호화하는 서열(부위 B; 도 3)을 EAV N 단백질의 상응하는 서열에 대해 치환시켰다. 이것은 LV108 및 LV134 (5' TGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATGACCTGTGCCGGATGT TTGGTGCAATGATAAAGTCC 3')에 의한 ORF7의 PCR 증폭에 의해 이루어졌다. 돌연변이된 DNA 단편을 NcsI 및 PacI 부위를 이용하여 pABV431에 도입시켜 pABV455를 생성시켰다. 아미노산 51 내지 67을 코드화하는 ORF7의 영역을 LDV ORF7의 상응하는 영역에 대하여 치환시켰다. pABV431을 EcoNI 및 ClaI에 의해 분해시키고 동일한 효소에 의해 분해된 프라이머 LV98(5' CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACATTTTCCCATGGCTGGTCCATCTGAC 3') 및 LV99(5' CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGAGGGAG CGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGCCGGAGGTCAGATGGACCAGCC 3')에 의해 생성된 PCR 단편에 결찰시켰다. 이 플라스미드를 pABV463이라고 지정하였다. 아미노산 80 내지 90을 코드화하는 ORF7의 영역을 LDV ORF7 유전자의 상응하는 영역에 대해 치환시켰다. LV의 ORF7 유전자를 프라이머 LV101(5' GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAATCAAGGCGGAGGAC AGGCGTCGCTTTCATCCA 3') 및 LV112에 의해 PCR에서 돌연변이시켰다. 수득된 단편을 NarI 및 PacI로 분해시키고, ClaI 및 PacI로 분해된 pABV431에 결찰시켰다. 이렇게하여 pABV453을 생성시켰다. 최종적으로, N 단백질의 C 말단부를 코드화하는 영역을 LDV의 N 단백질의 상응하는 아미노산을 코드화하는 서열에 대해 대체시켰다. ORF7 유전자를 프라이머 LV108 및 LV102(5' ATGTCCCGGGCTAAGCGGCGGAGGAATTAGCAGAA GCGTTAATCAGGCGCTGTGTAGCAGCAACCGGCAG 3')에 의해 증폭시키고 pGEM-T 벡터내에서 클로닝시켜 pABV456을 생성시켰다. 야생형 및 돌연변이된 ORF7 유전자를 pABV431, pABV453, pABV455 및 pABV463으로부터 PacI(평활말단화) 및 HpaI로 분해시켜 제거하고, pABV456으로부터 HpaI 및 SwaI로 분해시켜 제거하였다. 이들 유전자는 이어서 셈리키 포리스트 바이러스 발현벡터 pSFV1의 탈포스포릴화된 SmaI 부위에 삽입시켰다. 정확한 배향으로 각각의 ORF7 유전자를 함유하는 플라스미드 pABV470, pABV460, pABV462, pABV518 및 pABV471을 N 단백질의 발현에 관하여 추가로 시험하였다. 셈리키 포리스트 바이러스 ORF7 RNA의 시험관내 전사 및 트랜스펙션은 SFV-ORF4 구조물에 대하여 상술한 바와 같다.
7개의 상이한 유럽 분리체의 ORF4 유전자를 클로닝하기 위하여 대식세포를 NL1, NY2, DEN, FRA, SPA1, SPA2 및 LUX로 감염시키고, 뮬렌버그(Meulenberg) 등에 의해 기술된 바와 같이(1993) RNA를 분리시켰다. ORF4 유전자를 올리고뉴클레오타이드 PRRSV13 및 PRRSV14에 의해 RT-PCR을 사용하여 증폭시키고 pGEM-4Z 내에서 BamHI 및 HindIII에 의해 클로닝하였다. 각각의 균주에 대하여, 두개의 독립적인 PCRs에서 유도된 두개의 클론의 ORF4의 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 뉴클레오타이드 서열로부터 유도된 단백질 서열은 PCGene의 다중서열 정렬프로그램 클루스탈(CLUSTAL)(Intelligenetics Tm)을 사용하여 정렬하였다.
SFV-ORF4 RNA의 시험관내 전사 및 트랜스펙션
상이한 ORF4 구조물을 함유하는 pSFV1 플라스미드를 Spe1로 분해시켜 선형으로 만들고, 시험관내에서 전사시켰다. 합성된 RNA를 리포펙틴(lipofectin)을 사용하여 24-웰 플레이트의 15㎜ 웰에서 BHK-21 세포에 트랜스펙션시켰다. 세포를 빙냉된 50%(v/v) 메탄올/아세톤으로 고정시키고, 상이한 ORF4 구조물에 의해 발현된 GP4단백질을 이뮤노퍼옥시다제 단층시험(immunoperoxidase monolayer assay; IPMA)에서 MAbs로 염색시켰다. 면역침강반응에 의해 ORF4 발현생성물을 분석하기 위하여, 107BH K-21 세포를 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 시험관내에서 전사된 SFV-ORF4 RNA 10㎍으로 트랜스펙션시켰다. 일렉트로포레이션된 세포를 6-웰 플레이트의 35㎜ 웰 3개에 도말하고, 트랜스펙션시킨지 18시간 후에 세포를 표지하였다.
펩스캔(Pepscan) 방법
이전에 결정된 바와 같이(Meulenberget al., 1993), PRRSV의 ORF4 또는 ORF7 서열에서 유래된 아미노산으로부터 오버래핑 노나펩타이드 또는 도데카펩타이드의 완전한 셋트를 합성하였다. 폴리에틸렌 로드(rod)상에서의 고체상 펩타이드 합성 및 효소-결합된 면역흡착시험(ELISA) 형태의 시험에 의한 면역선별을 확립된 펩스캔 (PEPSCAN) 방법(Geysen et al., PNAS, 81, 3998-4002, 1984)에 따라 실시하였다.
결과
본 발명자들은 웨스턴 면역블럿(Western immunoblot)분석에 의해, GP4로 지정된 PRRSV의 31 내지 35kDa 단백질과 반응하는 중화성 MAbs의 패널, 및 N 단백질과 반응하는 Mabs의 패널을 이미 기술하였다. GP4는 ORF4에 의해 코드화된 구조 당단백질인 것으로 확인되었으며, N은 ORF7에 의해 코드화된 뉴클레오캡시드 단백질인 것으로 확인되었다. GP4특이 Mabs에 의한 면역침강실험에서, PRRSV로 감염된 세포의 용해물로부터 유래된 GP4단백질은 외관 분자량이 약간 더 큰 밝은 도말표본과 함께 28kDa의 별개의 밴드로서 이동하였다. MAbs는 PRRSV-감염된 세포외배지로부터 약 31kDa의 확산 (글리코실화된) GP4단백질을 면역침강시켰지만, 모의-감염된 세포의 세포외배지로부터는 면역침강시키지 않았다.
GP4 내의 중화영역의 확인
본 발명자들은 이미 GP4단백질에 대해 특이적인 MAbs가 I-1102는 인식하지만 미국 분리체인 VR2332는 인식하지 못한다는 것을 입증하였다(van Nieuwstadt et al., 1996). GP4 단백질내의 중화 MAbs의 결합영역을 확인하기 위하여 본 발명자들은 I-1102 및 VR2332의 GP4단백질의 융합단백질을 제조하였다. 이들 단백질은 릴제스트롬(Liljestrom) 등(Biotechnol, 9, 1356-1362, 1991)에 의해 개발된 셈리키 포리스트 바이러스 발현벡터 시스템에서 발현되었다. 우선, I-1102의 ORF4를 pSFV1에서 클로닝하여 플라스미드 pABV265를 생성시켰다(도 1). pABV265로부터 전사된 RNA를 BHK-21 세포에 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션시킨지 24시간 후에 세포를 15가지 중화 MAbs의 패널로 양성 염색시켰다. MAbs는 pSFV1-RNA에 의해 트랜스펙션된 BHK-21 세포와 반응하지 않았다. 재조합 GP4단백질을 pABV265 RNA에 의해 트랜스펙션된 L-[35S]-메티오닌 표지 BHK-21 세포로부터 MAb 126.1에 의해 면역침강시켰다. 이것은 I-1102에 의해 감염되고, 또한 PNGaseF 및 EndoH 민감성 N-글리칸을 함유하는 CL2621 세포에서 합성된 단백질인 인증된 GP와 유사한 크기를 가졌다. VR2332의 GP4단백질을 또한 pSFV1 내에서 클로닝시켰지만, 이 단백질은 BHK-21 세포에서 발현 후 MAbs에 의해 인식되지 않았다(도 1). MAbs에 의해 인식되는 GP4단백질에서의 영역을 국지화시키기 위하여, I-11022 및 VR2332의 ORF4의 4개의 키메라 유전자를 pSFV1에서 구성하였다(도 1). 플라스미드 pABV296, pABV305, pABV321 및 pABV326으로부터 전사된 RNA를 BHK-21 세포에 트랜스펙션시키고, 발현된 단백질의 GP4-특이 MAbs와의 반응성을 IPMA에서 시험하였다. 이들 15 가지 MAbs의 반응패턴은 동일하였으며, 이들 MAbs가 GP4단백질내의 40개의 아미노산 부분에 배향되어 있음을 시사하였다. 분리체 CNCM I-1102의 GP4단백질로부터 유도된 아미노산 40 내지 79로 구성되고 VR2332 GP4단백질로부터 유도된 서열에 의해 둘러싸인 pABV326의 발현생성물은 MAbs의 패널에 의해 여전히 인식되었다. 상이한 GP4단백질, 특히 MAbs에 의해 인식되지 않는 단백질이 BHK21 세포내에서 바르게 발현되었음을 확실히 하기 위하여, 이들을 플라스미드 pABV265, pABV271, pABV296, pABV305, pABV321 및 pABV326으로부터 시험관내에서 전사된 RNA로 트랜스펙션된 BHK-21 세포의 용해물로부터 면역침강시켰다. 면역침강반응은 돼지의 항-PRRSV 혈청 21, MAb 126.1 및 항-펩타이드 혈청 698 및 700을 사용하여 수행하였다. 혈청 700은 분리체 CNCN I-1102의 PRRSV GP4단백질의 아미노산 106-122(그의 서열은 아미노산 121을 제외하고는 분리체 ATCC-VR2332의 GP4단백질에서와 동일하다)에 대해 배향된다. 따라서, 모든 GP4단백질은 혈청 700에 의해 면역침강되었다. 이들은 SDS-PAGE에 의해 분석하는 경우에, 약간 더 빨리 이동하는 pABV305 및 pABV271에 의해 발현된 GP4단백질을 제외하고는 크기에 의해 구별할 수 없었다. 이것은 아미노산 62-64 사이에서 I-1102 서열에 비해 VR2322 서열에서 4개의 아미노산이 결실되었기 때문에 일어나는 것으로 보인다(도 3). GP4-특이적 MAbs의 완전한 셋트는 pABV265, pABV296, pABV321, pABV326으로부터 발현된 GP4단백질은 인식하였지만, pABV305 및 pABV271로부터 발현된 GP4단백질은 인식하지 않았으며, 이것은 IPMA에 의해 얻어진 결과를 확인한다(도 3). 혈청 698은 MAbs와 동일한 반응프로필을 가졌다. 혈청 698은 현재 확인된 GP4단백질의 중화영역내에 위치하는 PRRSV의 GP4의 아미노산 62 내지 77에 대해 배향된다. 이 부분은 VR2322 ORF4에서는 매우 이종의 것이며, 따라서 이 부분에서 VR2322 서열을 함유하는 발현생성물은 이 혈청에 의해 인식되지 않았다. 그러나, 중화성 폴리클로날 돼지 혈청은 I-1102 GP4단백질 및 키메라 GP4단백질 및 VR2322 GP4단백질을 인식하는데, 이것은 돼지의 항-PRRSV 혈청내에 GP4단백질의 아미노산 40 내지 79에 의해 형성된 중화부위에 대해 배향된 다양한 중화항체가 존재함을 시사하는 것이다.
ORF4 및 ORF7 단백질의 펩스캔
ORF4 단백질과 반응성인 15 가지의 MAbs는 모두 웨스턴 블럿분석(western blot analysis)에서 GP4단백질과 반응하였기 때문에, 이들은 분리체 I-1102의 GP4의 아미노산 40 내지 79에 걸친 부분에서 선형 에피토프를 인식할 것으로 예상하였다. MAbs의 결합부분에 대한 더 상세한 지도를 만들기 위해서 이 부분에서 중복성 노나펩타이드 또는 도데카펩타이드를 사용하여 펩스캔 분석을 수행하였다. 이러한 셋트에서 피크가 재현성있게 바탕의 2배 이상에 달한다면 펩타이드는 항원부위를 나타내는 것으로 판단되었다. MAbs 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7, 138-28은 아미노산 59 내지 67(SAAQEKISF)로 구성된 하나의 특이적 항원부위와 양성적으로 반응하였다(도 2). MAb 122-12는 이 항원부위와 단지 약하게 반응하였으며, 그 반면에 나머지 7개의 MAbs는 펩스캔 분석에서 음성이었다. 폴리클로날 돼지 혈청은 또한 펩스캔에서 이 부위를 확인하였다. 돼지 21을 PRRSV로 감염시킨 후 제 6주에 채취된 중화항체 21은 부위 및 그의 측면부위와 강력하고 광범하게 반응하였다. 또한, PVR-ORF4 벡터 바이러스로 예방접종한 후 제 54일 및 제 54일에 PRRSV로 공격한 지 30일후에 도살할 때 채취한 중화성 폴리클로날 돼지 혈청(va12 및 va14)은 펩스캔에서 확인된 중화부위와 강력하고 더욱 광범하게 반응하였다. 분리체 I-1102에서 중화부위의 코어서열은 아미노산 위치 59-67에 존재하는 아미노산 서열 SAAQEKISF를 포함한다. 다른 분리체에서 코어서열은, 예를들어 SAAQEEISF 또는 STAQENISF 또는 STAQENIPF 또는 SEESQSVT 또는 SASEAIR 또는 SASEAFR 또는 PAPEAFR 또는 PAPEAIR 또는 SAFETFR 또는 STSEAFR과 같은 서열을 포함하는, 단백질 GP4의 중화부위에 상응하는 아미노산 서열인, 상응하는 아미노산 위치 또는 그 주위에서 확인될 수 있지만, PRRSV의 다른 분리체는 PRRSV의 I-1102 분리체의 ORF4 아미노산 서열의 아미노산 59-67에 상응하는 아미노산 위치에 또는 그 주변에 존재하는 중화부위의 상응하지만 약간 다른 코어서열을 갖는 것으로 예상된다. 또한, 항원성 및 따라서 상기 코어서열의 작용성을 유지시키는 인공적인 변화는 펩타이드 디자인 및 합성의 기술분야에서 숙련된 보통의 전문가에 의해 용이하게 도입될 수 있다. 또한, 중화성 폴리클로날 혈청의 펩스캔에서의 훨씬 더 광범한 반응성에 의해 명백하게 입증된 바와 같이, 다양한 PRRSV 분리체의 아미노산 코어서열 및 코어서열에 인접한 아미노산 서열을 함유하는 아미노산 서열은, 추가로 PRRSV의 ORF4 단백질상의 중화부위를 구성한다. 특히, 대략 아미노산 40 내지 79에 상응하는 위치에 존재하는 서열은 중화부위를 구성한다(도 1). 역시, 항원성 및 따라서 상기 항원부위의 작용성을 유지시키는 인공적인 변화는 펩타이드 디자인 및 합성의 기술분야에서 숙련된 보통의 전문가에 의해 용이하게 도입될 수 있다. 또한, 폴리클로날 중화혈청 va12 및 va14의 광범한 반응성을 고려하면(도 2), 대략 아미노산 52 내지 75에 상응하는 위치에 존재하는 아미노산 서열은 더욱 구체적으로 광범하게 반응성인 중화부위를 구성한다.
ORF7 단백질에 대해 배향된 Mabs는 펩스캔에서 4가지의 상이한 그룹, 즉 그룹 A(4), B(2), C(3) 및 D(1)에서 반응하였다. 그룹 1(D)(여기에서는 그중에서도 특히 Mabs 122.17, 130.3, 130.4, 131.7, WBE1, WBE4, WBE6, SDOW17이며, 보존 및 비보존 반응성 부위를 함유한다)는 펩스캔에서 검출될 수 없는 입체배좌성 에피토프와 반응하였다. 그룹 2(B)(여기에서는 그중에서 특히 125.1, 126.9, NS95 및 NS99이며, 시험된 PRRSV의 모든 분리체와 반응성이 있고, 따라서 보존된 항원부위를 확인할 수 있다)는 코어서열 VNQLCQLLGA(분리체 내의 아미노산 위치 22 내지 대략 32에서 발견됨) 또는 VNQLCQMLGK를 확인한다. 그룹 3(C)(여기에서는 그중에서 특히 Mab 126.15이며, 주로 유럽에서 분리된 PRRSV의 균주와 반응성이 있어 차별화 항원부위를 확인할 수 있다)는 코어서열 PRGGQAKKKK(분리체 I-1102 내에서 아미노산 위치 41 내지 대략 50에서 발견됨) 또는 PRGGQAKRKK 또는 PRGGQAKKRK 또는 GPGKKNKKKN 또는 GPGKKNKKKT 또는 GPGKKNRKKN 또는 GPGKKFKKKN 또는 GPGKKIKKKN 또는 GPGQINKKIN을 확인한다. 그룹 4(A)(여기에서는 그중에서도 특히 Mab 138.22 이며, 주로 유럽에서 분리된 PRRSV 분리체와 반응성이 있어 차별화 항원부위를 확인할 수 있다)는 코어서열 MAGKNQSQKK(분리체 I-1102 내에서 아미노산 위치 1 내지 대략 10에서 발견됨) 또는 MPNNNGKQTE 또는 MPNNNGKQPK 또는 MPNNNGKQQK 또는 MPNNNGKQQN 또는 MPNNNGKQQK 또는 MPNNNGRQQK를 확인한다. 또한, 항원성 및 따라서 N 단백질내의 상기 항원부위의 작용성을 유지시키는 인공적인 변화는 펩타이드 디자인 및 합성의 기술분야에서 숙련된 보통의 전문가에 의해 용이하게 도입될 수 있다. 그룹 1이 선형 에피토프를 구성하지는 않지만, PRRSV 아미노산과 LDV 서열과의 비교는 입체배좌성 에피토프(이것은 다양한 분리체들 사이에서 상당히 변화한다)가 분리체 I-1102 내에서 아미노산 위치 51 내지 대략 68(분리체 I-1102 내의 아미노산 서열 PKPHFPLAEDDIRHHL) 또는 79 내지 대략 90(분리체 I-1102 내의 아미노산 사열 SIQTAFNQGAGT) 또는 111 내지 124(분리체 I-1102 내의 아미노산 서열 HTVRLIRVTSTSAS)에서 발견되는 것에 상응하는 위치에서 발견될 수 있다. 또한, 항원성 및 따라서 N 단백질내의 상기 입체배좌성 에피토프 부위의 작용성을 유지시키는 인공적인 변화는 특히 PRRSV 분리체의 서열비교 및 다른 아르테리비리다에 (Arteriviridae)의 N 단백질 서열과의 비교에 의해 수집된 정보를 가지고 펩타이드 디자인 및 합성의 기술분야에서 숙련된 보통의 전문가에 의해 용이하게 도입될 수 있다. 이것은 SFV 발현시스템에서 키메라 LDV/PRRSV ORF7 단백질을 발현시키고 그룹 1로부터의 Mabs와의 반응성을 측정하여 측정되었다.
키메라 N 단백질
영역 D는 ORF7 발현성 키메라 N 단백질의 구조물과 함께 더 상세히 지도가 작성되었다. 영역 D에 대해 배향된 10개의 MAbs중에서 6개가 PRRSV의 유럽 및 북아메리카 분리체 모두를 인식하였기 때문에, LV의 N 단백질 및 북아메리카 기본형 (prototype) VR2332(도 4) 사이에서 대부분 보존되었던 부분들은 돌연변이되었다. 아미노산 51 내지 67, 80 내지 90 및 111 내지 128에 대해 코드화된 뉴클레오타이드 서열은 LDV의 상응하는 아미노산에 대해 코드화된 서열에 대해 치환되었다(도 4). 완결을 위해서, 유럽 및 북아메리카 분리체에서도 보존되는 부위 B(아미노산 25-30)를 돌연변이시켰다. LV N 단백질의 아미노산 서열은 부위 B에서 LDV N 단백질의 아미노산 서열과 매우 유사하였기 때문에, LV N 단백질의 이 부분을 EAV N 단백질의 상응하는 아미노산을 코드화한 영역에 대해 치환시켰다(도 4). 돌연변이 및 야생형 N 단백질을 셈리키 포리스트 바이러스 발현시스템을 사용하여 BHK21 세포에서 발현시키고, 이들을 IPMA에서 N-특이적 MAbs로 시험하면, D-특이적 MAbs는 동일하게 반응하였다(표 1). 이들의 결합은 아미노산 51-67 및 80-90 사이에서의 돌연변이에 의해 차단되었지만 아미노산 111-128 또는 아미노산 25-30(부위 B) 사이에서의 돌연변이에 의해서는 차단되지 않았다. 예상한 바와 같이, 아미노산 51-67 및 80-90 사이에서 LDV 서열을 갖는 N 단백질은 여전히 부위 A, B 및 C에 대해 배향된 MAbs에 의해 염색되었다. 그러나, 염색된 세포의 수 및 이 염색의 명도는 야생형 N 단백질 및 아미노산 25-30(부위 B) 또는 아미노산 111-128(표 1)에서 돌연변이된 N 단백질에 대해 관찰되는 것보다는 덜하다. 이것은 아미노산 51-67 또는 80-90 사이에서의 돌연변이를 함유하는 N 단백질의 더 낮은 발현에 기인하는 것으로 보이는데, 그 이유는 동등한 양의 전사물을 시험관내에서 해독시켰을 때 다른 N 단백질에 비해 이들 돌연변이 N 단백질이 더 낮은 수율로 얻어졌기 때문이다(데이타는 제시되지 않음). 예상한 바와 같이, 부위 B에서 EAV 서열을 함유하는 N 단백질은 부위 B 에 대해 배치된 MAbs에 의해서는 인식되지 않았지만, 영역 A, C 또는 영역 D에 대해 배치된 MAbs에 의해서는 여전히 인식되었다. 이들 데이타는 영역 D에 대해 지도작성된 에피토프가 입체배좌-의존성이며, (부분적으로는) 아미노산 51-67 및 80-90으로 구성됨을 시사하는 것이다.
상이한 PRRSV 균주의 GP
4
단백질의 서열분석
GP4-특이적 항체에 의해 인식되는 주된 항원중화부위가 상이한 PRRSV 분리체들 사이에서 보존되었는지 여부를 분석하기 위하여, MAbs의 반응성 및 중화활성을 7가지의 상이한 유럽 균주에 대하여 시험하였다. 그 결과는 이들 MAbs가 또 다른 네덜란드 균주 NL1 및 영국 균주 NY는 인식하고 중화시켰지만, 덴마크 분리체 DEN, 두가지의 스페인 균주 SPA1 및 SPA2, 프랑스 분리체 FRA 및 룩셈부르그에서 분리된 LUX는 인식하거나 중화시키지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 이들 분리체의 GP4단백질의 중화부위의 부분에서의 아미노산 서열에 관심을 갖게 되었다. ORF4 유전자를 PRRSV 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 이용하여 클로닝시키고, 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다. 이들 뉴클레오타이드 서열로부터 유래된 상이한 분리체들의 GP4단백질의 아미노산 서열은 I-1102의 것과 86 내지 97% 동일하였다. 이들 아미노산 서열의 정렬은 중화부위(아미노산 40 내지 79)가 단백질의 나머지 부분보다 훨씬 더 다양함을 나타내었다. 이 부분에서, 특히 균주 DAN, SPA1, SPA2 및 FRA의 아미노산 서열은 상이하다. 이것은 이들 균주가 I-1102 특이적 MAbs에 의해 중화되지 않는다는 사실과 일치하는 것이며, 또한 이 부위가 유럽 분리체들 사이에서 고도로 보존되지 않음을 확인하는 것이다. 더 큰 이질성을 갖는 또 다른 부분이 GP4단백질의 N-말단부에서 관찰되었다. PRRSV GP4단백질의 아미노산 서열과 VR2322 및 다른 북아메리카 균주의 아미노산 서열의 비교는 후자의 것이 또한 단백질의 중화부위에서 이질성임을 나타내었다. 아미노산 서열의 정렬은 북아메리카 분리체의 중화부위에 갭(gap)의 도입을 유도하는데(도 3), 이것은 이들 분리체중의 어떤 것도 MAbs에 의해 인식되지 않는다는 관찰결과와 일치하는 것이다. 전반적으로, 유럽 분리체의 서열들 사이에서 보다 아메리카 분리체의 서열들 사이에서 더 큰 다양성이 관찰되었다.
이것은 예를들어 GP4의 아미노산 서열에서 확인되는 대표적인 바이러스성 외피에 대해 특유한 특징과 일치하는 것이다.
백신 개발을 위한 중화부위의 가능성은 중화부위의 이질성의 관점에서 상당히 중요하다. 상이한 유럽 균주들의 GP4단백질의 아미노산 서열의 비교는 중화부위가 단백질의 다른 부분보다 훨씬 더 가변적임을 나타내었으며, 이것은 이 부위가 면역학적 선택에 대해 감수성이 있음을 시사하는 것이다. 유럽 및 북아메리카 균주의 중화부위 서열의 비교는 유럽 균주와 비교하여 북아메리카 서열에서 아미노산 4개의 갭을 나타내었고, 이것은 현재 동정된 PRRSV의 중화부위의 큰 아미노산 가변성을 추가로 설명하는 것이다.
본 명세서에 기술된 GP4단백질에서의 중화부위는 렐리스태드 바이러스에 대해 확인된 첫번째 부위이다. 두가지의 다른 아르테리바이러스인 EAV 및 LDV의 경우에는 분리된 중화성 MAbs가 모두 ORF5에 의해 코드화된 G1/VP3 단백질에 대해 배향되었다(Deregtet al, 1994; Glaser et al, 1995; Balasuriyaet al, 1995; Harty and Plagemann, 1988). 중화-회피 돌연변이체를 사용하여 EAV의 중화부위를 G1의 외부영역(ectodomain)에서 특이적인 아미노산에 대해 배치하였다.
PRRSV의 ORF7 단백질에 대하여 유사한 서열비교가 행해졌으며(도 4), 이것은 현재 동정된 PRRSV의 항원적으로 보존된 부위 및 비보존된 부위의 큰 아미노산 가변성을 추가로 설명하는 것이다. 이 연구에서, 본 발명자들은 PRRSV의 N 단백질에서 4개의 별개의 항원부위를 확인하였다. A, B 및 C로 지정된 3 개의 부위는 선형 에피토프를 함유하며, 이들은 각각 아미노산 2-12, 25-30 및 40-46 사이에 배치되었다. 반대로, 영역 D로 지정된 네번째 부위는 (부분적으로) 아미노산 51-67 및 80-90으로 이루어진 입체배좌-의존성 에피토프를 함유한다. 부위 A 및 C는 PRRSV의 유럽 분리체에서는 보존되지만 북아메리카 분리체에서는 보존되지 않는 에피토프를 함유하며, 부위 B는 PRRSV의 유럽 및 북아메리카 분리체에서 보존되는 에피토프를 함유하는 반면에, 부위 D는 PRRSV의 유럽 및 북아메리카 분리체에서 보존 및 비보존된 에피토프를 둘다 함유한다. 본 명세서에 기술된 N 단백질 내의 보존 부위는 PRRSV의 명백한 진단을 목적으로 하는 진단시험의 개발에 큰 중요성을 가지며, 이들 시험은 비보존 부위의 사용을 피함으로써 허위음성 결과를 피하여야 한다. 또한, 다양한 비보존된 부위에 대한 지식이 예를들어 PRRSV의 야생형 분리체에 의해 감염된 돼지로부터 예방접종된 돼지를 구분할 수 있는 차별화 시험방법의 개발에 매우 유용하다.
| 플라스미드 | 돌연변이 | IPMA에서 MAbs에 의한 염색 | |||
| 138.22 | 125.1/ 126.9/NS95/NS99 | 126.15 | 122.15/130.2/130.4/131.7/131.9/WBE1/WBE4/WBE5/WBE6/SDOW17 | ||
| A | B | C | D | ||
| pABV470 | - | +++ | +++ | ++ | +++ |
| pABV462 | 25-30 | +++ | - | ++ | +++ |
| pABV518 | 51-67 | ++ | ++ | + | - |
| pABV460 | 80-90 | ++ | ++ | + | - |
| pABV471 | 111-124 | +++ | +++ | ++ | +++ |
| 명칭 | 서열a | 삽입된 제한부위 |
| LV13LV14LV46LV57PRRSV4PRRSV5PRRSV6PRRSV9PRRSV10 | 5'GGCAATTGG A TCCATTTGGA 3'5'AGAAGCAAG CTT GCGGAGTC 3'5'GCCGTCGGTAC C CCTCAGTACAT 3'5'ATGTACTGAGGGGTACCGACGGC 3'5'GGCAATTGG A T C CACCTAGAATGGC 3'5'GCGAGCAA GCTT CCGCGCGGTCAAGCATTTCT 3'5'CTTGCCGC C GCGGTGGTGTTG 3'5'ACAGCTG GTACCTATCGCCGTACGGCACTGA 3'5'GCGATAGG T AC C CC TGTGTATGTTACCAT 3' | BamHIHindIIIKpnIKpnIBamHIHindIIISacIIKpnIKpnI |
| a 이들 프라이머에서 밑줄을 그은 뉴클레오타이드는 원래의 서열에 비해 돌연변이되어 제한부위 또는 돌출(overhanging) 서열을 생성시키거나, 하나의 특정한 뉴클레오타이드가 길게 신장되는 것을 피한다. 프라이머 내의 제한부위는 이탤릭체로 나타내었다. |
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- 보존된 부위에 상응하는 아미노산 서열로부터 유래된 적어도 5 내지 15개의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 포함하며 적어도 2개의 상이한 PRRSV 분리체와 반응하는 항체를 유도하는 펩타이드로, 상기 보존된 부위는 PRRSV 분리체 I-1102의 단백질 N의 아미노산 위치 22 내지 32에 존재하는 아미노산 잔기를 함유하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
- 제 7항에 있어서, 아미노산 잔기가 통상적으로 또는 치환지도작성의 지침에 따라 치환된 아미노산 서열을 함유하는, 적어도 2개의 상이한 PRRSV 분리체와 반응하는 항체를 유도하는 펩타이드.
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- 제 7항에 있어서, 상기 아미노산 서열이 VNQLCQLLGA 및 VNQLCQMLGK로 구성된 그룹중에서 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 펩타이드.
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- 제 7항, 제 8항 및 제 10항중 어느 하나의 항에 따른 펩타이드와 반응하는 합성 항체.
- 적합한 검출수단과 함께 제 7항, 제 8항 및 제 10항중 어느 하나의 항에 따른 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는, PRRSV 분리체에 대해 배향된 항체의 검출 또는 동정용 진단시험 키트.
- 제 21항에 따른 항체를 포함하는, PRRSV 분리체에 대해 배향되거나 이 분리체로부터 유래된 항체의 검출 또는 동정용 진단시험 키트.
- 제 22항에 따른 진단시험 키트를 사용하는 것으로 이루어지는 돼지군에서의 PRRS의 발생을 감소시키는 방법.
- 제 22항에 따른 진단시험 키트를 사용하는 것으로 이루어지는 돼지 또는 돼지군에서의 PRRS의 발생을 시험하는 방법.
- 제 22항의 진단시험 키트를 사용하는 것으로 이루어지는 돼지군에서의 PRRS의 발생을 감소시키거나 종결시키기 위한 근절 프로그램 방법.
- 제 22항에 따른 진단시험 키트를 사용하는 것으로 이루어지는 돼지 또는 돼지군에서의 PRRS의 발생을 시험하는 방법.
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