CZ9903932A3 - Peptid vyvolávající tvorbu neutralizujících protilátek, imunogenní prostředek, vakcína, syntetická protilátka, diagnostická souprava, jejich použití a způsob testování výskytu PRRS viru u prasat - Google Patents

Peptid vyvolávající tvorbu neutralizujících protilátek, imunogenní prostředek, vakcína, syntetická protilátka, diagnostická souprava, jejich použití a způsob testování výskytu PRRS viru u prasat Download PDF

Info

Publication number
CZ9903932A3
CZ9903932A3 CZ19993932A CZ393299A CZ9903932A3 CZ 9903932 A3 CZ9903932 A3 CZ 9903932A3 CZ 19993932 A CZ19993932 A CZ 19993932A CZ 393299 A CZ393299 A CZ 393299A CZ 9903932 A3 CZ9903932 A3 CZ 9903932A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino acid
prrsv
protein
peptide
acid sequence
Prior art date
Application number
CZ19993932A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ297371B6 (cs
Inventor
Nieuwstadt Antonie Paul Van
Jan Langeveld
Janneke Meulenberg
Original Assignee
Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek filed Critical Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek
Publication of CZ9903932A3 publication Critical patent/CZ9903932A3/cs
Publication of CZ297371B6 publication Critical patent/CZ297371B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/10011—Arteriviridae
    • C12N2770/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

PEPTID VYVOLÁVAJÍCÍ TVORBU NEUTRALIZUJÍCÍCH PROTILÁTEK,
IMUNOGENNÍ PROSTŘEDEK, VAKCÍNA, SYNTETICKÁ PROTILÁTKA,
DIAGNOSTICKÁ SOUPRAVA, JEJICH POUŽITÍ A ZPŮSOB TESTOVÁNÍ
VÝSKYTU PRRS VIRU U PRASAT
Oblast techniky:
Navrhovaný vynález se zabývá původcem reprodukčního a respiračního syndromu prasat nazývaného také „Mystery Swine Disease“, PRRS virem, peptidovými sekvencemi, identifikovanými u tohoto viru a začleněním zmíněných sekvencí do vakcín a diagnostických testů.
Dosavadní stav techniky:
PRRS virus (PRRSV) je původcem onemocnění prasat, které se nyní nazývá reprodukční a respirační syndrom prasat (PRRS z anglického „porcine reproductive and respirátory syndrom“). Virus je původcem prasečího onemocnění, které je ve Spojených státech známo asi od roku 1987 a v Evropě od roku 1990. Nemoc byla zpočátku označována různými jmény jako jsou „mystery swine disease“, „swine infertility and respirátory syndrome“ a mnohá další. Také samotný virus byl známý pod mnoha jmény, například „Lelystad virus“ (LV) nebo SIRS virus, ale nyní je popisován převážně jako virus reprodukčního a respiračního syndromu prasat (PRRSV). Virus u prasat způsobuje potraty a respirační obtíže. Poprvé byl izolován v Evropě v roce 1991 (EP patent 587780 a US patent 5,620,691) a v zápětí nato také ve Spojených státech a v mnoha dalších zemích světa. PRRSV je malý obalený virus jehož genom je tvořený pozitivním řetězcem RNA. Preferovaným hostitelem PRRSV jsou makrofágy. Kromě makrofágů může PRRSV růst také v buňkách linie CL261 a v dalších buněčných liniích klonovaných z opičích ledvinných buněk linie MA-104 (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest. 4, 127-133, 1992). Genom PRRSV, polyadenylovaná RNA o velikosti asi 15 kb, byl sekvenován v roce 1993 (Meulenberg et al., Virology 192; 62-74, 1993). Nukleotidová sekvence, organizace genomu a replikační strategie ukazují, že PRRSV je příbuzný skupině malých obalených virů s genomem tvořeným pozitivním řetězcem RNA, souborně nazývané Arteriviry. Do této skupiny patří LDV („lactate dehydrogenase-elevating virus“), EAV (virus koňské arteritidy) a SHFV (virus opičí hemorhagické horečky). Všechny tyto viry mají podobnou organizaci genomu, replikační strategii, morfologii i aminokyselinovou sekvenci virových proteinů. Velikost genomu arterivirů se pohybuje v rozmezí od
12,5 do 15 kb a během replikace syntetizují arteriviry soubor šesti 3'překrývajících se subgenomických RNA. Tyto subgenomické RNA obsahují vedoucí sekvence odvozené od 5'konce virového genomu. ORF la a lb obsahují přibližně dvě třetiny virového genomu a kódují RNA dependentní RNA polymerázu. Šest menších ORF, ORF 2 až 7, je lokalizováno na 3'konci virového genomu. ORF 2 až 6 kódují pravděpodobně obalové proteiny zatímco ORF 7 kóduje nukleokapsidový protein (Meulenberg et al., Virology 206, 155-163, 1995).
PRRSV je prvním adenovirem, u kterého bylo prokázána asociace všech šesti proteinů kódovaných ORF 2 až ORF 7 s virionem. 15 kDa protein N (kódovaný ORF 7) a 18 kDa integrální membránový protein M (ORF 6) nejsou Nglykosylované, zatímco 29-30 kDa protein GP2 (ORF 2), 45-50 kDa protein GP3 (ORF 3), 31-35 kDa protein GP4 (ORF 4) a 25 kDa protein GP5 (ORF 5) Nglykosylované jsou. Tyto proteiny byly detekovány také u extracelulárních virů a v lyzátech buněk infikovaných severoamerickým izolátem PRRSV, ATCCVR2332, stejně jako dalšími izoláty PRRSV (jako jsou například CNCM 1-1140, ECACC V93070108, CNCM 1-1387, CNCM 1-1388, ATCC-VR2402, ATCCVR2429, ATCC-VR2430, ATCC-VR2431, ATCC-VR2475, ATCC-VR2385 a mnohé další).
Již dříve jsme popsali izolaci a charakterizaci souboru PRRSV-specifických monoklonálních protilátek (MAb), které specificky reagují s GP3, GP4, M a N proteiny (van Nieuwstadt et al., J.Virol. 70, 4767-4772, 1996). Překvapivě bylo zjištěno, že protilátky namířené proti GP4 jsou neutralizující což předpokládá, že alespoň část proteinu je vystavena na povrchu virionu. Dále také většina MAb namířených proti proteinu N reagovala se všemi testovanými izoláty PRRSV.
PRRS sám o sobě je pro průmysl zpracování vepřového masa významným problémem téměř na celém světě. Zavlečení PRRSV do prasečího stáda působí těžké ekonomické ztráty. Diagnostické testování zaměřené proti PRRS je rozšířenou praktikou mnoha veterinárních pracovišť i laboratoří. Existuje celá řada diagnostických testů jako jsou například IPMA, IPT, 1FA nebo ELISA, z nichž každý zahrnuje některý z detekčních systémů jako jsou konjugované enzymy nebo fluorochromy a další substráty využívající interakce mezi antigenem odvozeným od PRRSV a protilátkou namířenou proti PRRSV ke stanovení přítomnosti buď PRRSV antigenů nebo protilátek proti PRRSV v biologickém vzorku odebraném testovanému zvířeti (například praseti). Biologickým vzorkem může být například krev, sérum, tkáň, tkáňové tekutiny, tekutiny získané výplachem, moč či výkaly. Antigeny a/nebo protilátky používané ve zmíněných diagnostických testech nebo soupravách pro diagnostiku PRRS jsou definovány pouze na základě svého původu nebo reaktivity s PRRSV. V zásadě je toto dostačující pro testovací metody, kde není explicitně vyžadována vysoká specifičnost nebo citlivost. Ovšem stále pokračující šíření PRRS zapříčinilo značný zájem ze strany průmyslu zpracování vepřového masa, a to nejen o diagnostiku, ale o eradikaci PRRS z celých stád nebo dokonce z celých oblastí, regionů či zemí, kde se prasata chovají. Jasným příkladem zmiňovaných potřeb průmyslu je navržený eradikační program týkající se PRRS v Dánsku. V případě potřeby kompletního vyhubení PRRS jsou nezbytné diagnostické testy vykazující vyšší specifičnost nebo citlivost, než jakou mají dosud používané testy.
Očkování proti PRRS je další rozšířenou praktikou. Dosud se používá několik typů modifikovaných živých vakcín, ovšem jsou známé i neživé vakcíny. Ovšem obecným problémem živých vakcín, a tedy i živých PRRS vakcín, je tendence těchto vakcín rozšířit se i na neočkovaná zvířata, čímž namísto redukce detekovatelné infekce způsobí její rozšíření ve stádu a tak působí vzhledem k úplné eradikaci infekce kontraproduktivně. V případě použití „line markér“ vakcín, které jsou sérologicky odlišitelné od vakcín divokého typu, může být zmíněný problém z velké části redukován. Další nevýhodou je, že živé vakcíny mohou někdy u očkovaných prasat způsobit anafylaktickou reakci, neboť obsahují některé nedefinované antigenní složky. Je známo, že neživé vakcíny obecně indukují ochrannou odpověď u očkovaných prasat a mají i některé další výhody, ke kterým patří například fakt, že nedochází k jejich šíření mezi zvířaty ve stádě. Nevýhodou neživých vakcín je že může být obtížné podat v jediné dávce dostatečné množství antigenu pro vyvolání měřitelné a ochranné imunitní odpovědi. Bylo by vhodné mít především neživé vakcíny schopné vyvolat měřitelnou neutralizující protilátkovou odpověď u prasat, neboť právě stanovení neutralizujících protilátek u očkovaných populací prasat může významně přispět k rozvoji poznání rozsahu ochrany prasečího stáda pomocí vakcinace. Navíc pokud se podaří připravit vakcínu s dostatečným množstvím odpovídajícího antigenu, znamená to, že vakcína obsahuje i další nedefinované antigeny v nedefinovaném množství, což může způsobit anafylaktickou reakci tak jak byla popsána výše. S ohledem na výše uvedené skutečnosti by bylo výhodné vědět, které specifické místo na PRRSV je zahrnuto v procesu neutralizace. S pomocí takových znalostí by bylo možné navrhnout vhodnější vakcíny, zahrnující peptidové sekvence nezbytné pro vyvolání neutralizující reakce a tvorbu neutralizujících protilátek. Výhodou v současnosti používaných vakcín pocházejících z PRRSV izolátů ze » · · ·
Spojených států je, že takové vakcíny, ačkoliv vyvolávají úplnou ochrannou reakci proti Evropským izolátům PRRSV, se kterými také zkříženě reagují, obsahují dosud neidentifikované epitopy nebo antigenní místa pomocí kterých mohou být odlišeny od evropských izolátů PRRSV. Naopak živé vakcíny pocházející z PRRSV izolátů z Evropy, přestože jsou plně účinné proti imunologicky zkříženě reagujícím US izolátům PRRSV, obsahují podobné dosud neidentifikované epitopy nebo antigenní místa, pomocí kterých mohou být odlišeny od US izolátů PRRSV.
Pokud by byly dostupné sérologické testy, které by dokázaly rozlišit (na základě malých rozdílů v epitopech jednotlivých izolátů PRRSV) mezi prasaty buď očkovanými US vakcínou nebo nakaženými evropským divokým typem PRRSV (očkovanými či nikoliv), nebo které by dokázaly rozlišit prasata, která jsou buď očkována evropskou vakcínou, nebo infikovaná US divokým typem PRRSV (ať již byla očkována či nikoliv), potom by mohly být vyvinuty značkovací vakcína a odpovídající diagnostické testy (zahrnující zmíněné diskriminující epitopy nebo antigenní místa), vykazující vyšší spolehlivost při použití v programech pro eradikaci PRRS. Například v Dánsku by potom bylo možné očkovat vakcínou amerického původu a měřit soubor protilátek produkovaných dánskými vepři, namířených výhradně proti jedinečným epitopům evropského divokého typu PRRSV, které nevykazují žádnou zkříženou reaktivitu s US kmeny. To by umožnilo zcela jednoznačnou detekci a následné oddělení vepřů infikovaných divokým typem viru z dánských stád. V současnosti takový postup není možný v důsledku obecně široké imunologické zkřížené reaktivity mezi jednotlivými izoláty PRRSV. Je nesporné, že takové kombinované vakcinační a testovací programy budou základem pro celkovou eradikaci PRRS a že tyto programy mohou být použity i v dalších zemích, v případě potřeby s použitím vakcíny a/nebo diagnostického testu s odlišnými PRRSV antigenními místy.
Podstata vynálezu:
Navrhovaný vynález se zabývá peptidovými sekvencemi PRRSV nesoucími antigenní místa umožňující zdokonalení vakcín, ať už jsou to oslabené živé vakcíny nebo neživé vakcíny nebo vakcíny připravené technikami rekombinantní DNA, a antigenní místa umožňující zdokonalení diagnostických metod a testů a přípravu nových diagnostických souprav. Sekvence, o kterých je známo že tvoří antigenní místo konkrétního izolátů, mohou být snadno osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů pozměněny například ve smyslu substituce • · · · • · « · • « · · * · · · · • · ·
jedné nebo více aminokyselin, a to při zachování antigenicity (která je definována například reaktivitou s polyklonálním sérem nebo monoklonálními protilátkami) a tudíž i funkčnosti antigenního místa. Například určitý aminokyselinový zbytek může být standardně nahrazen jiným zbytkem srovnatelné povahy, tj. například bazický zbytek jiným bazickým zbytkem, kyselý kyselým, objemná objemnou, hydrofobní jinou hydrofobní a hydrofilní jinou hydrofilní atd. I jiné záměny, méně konvenční ale více specifické, jsou možné v případě kdy zachovávají nebo dokonce zvyšují antigenicitu vybrané sekvence.Takové záměny mohou být uskutečněny například s pomocí PEPSCAN aminokyselinových substitucí nebo techniky mapování na základě aminokyselinových záměn (van Amerongen et al., Peptide Research (1992) 5, 269-274). Krátce, aminokyselinové zbytky, které jsou součástí antigenních míst podle vynálezu, mohou být zaměňovány konvenčním způsobem nebo na základě mapování pomocí aminokyselinových záměn. Výsledná peptidová sekvence zůstává funkčně ekvivalentní původnímu antigennímu místu. Nově vložená aminokyselina může být buď D- nebo L- aminokyselina. Imunogenicita peptidových sekvencí podle vynálezu je navíc ještě zvýšena jejich spojením s adjuvans (například KLH), jaká jsou v oboru běžně používána. Dále může být imunogenicita zmíněných peptidů zvýšena jejich spojováním (tandemové peptidy) nebo přípravou opakujících se sekvencí, polymerizací nebo cirkularizací. Ačkoliv bylo již dříve popsáno, že N-protein je imunogenni (Meulenberg (1995), J. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2, 652-656, GB 2 289 279 A) a že mezi N-proteiny evropských izolátů (LV) a US kmenů (VR2332) existují konzervované a nekonzervované oblasti (WO 96/04010), teprve nyní bylo poprvé popsáno které konzervované a nekonzervované oblasti jsou antigenní a které mohou být použity individuálně nebo v různých kombinacích jako antigeny pro imunizaci nebo pro diagnostické účely. Navíc zde bylo prokázáno, že se antigenní oblasti N-proteinu sestávají jak z lineárních, tak i z konformačně závislých epitopů.
Protein GP4 je prvním strukturním proteinem PRRSV u kterého bylo prokázáno, že vyvolává tvorbu protilátek schopných neutralizovat virus. Byla identifikována specifická oblast dlouhá přibližně 40 aminokyselin a bylo zjištěno, že je-li vystavena na povrchu virionu, stává se cílem neutralizujících protilátek, které tak zabrání infekci buněk zmíněným virem. Je to překvapující nové zjištění, neboť dosud byl za nejdůležitější pro navázání viru na hostitelskou buňku považován protein GP5, hlavní strukturní protein PRRSV.
Vynález se zabývá hlavním antigenním místem, neutralizačním místem proteinu
GP4 PRRSV. Vynález se zabývá lokalizací hlavního neutralizačního místa, která je nezbytná pro navržení účinných značkovacích vakcín, které obsahují hlavní •· · ···· · · · · ···· · · ···· • ·· · ········ aminokyselinové sekvence a aminokyselinové sekvence sousedící s hlavní aminokyselinovou sekvencí PRRSV izolátů, které obsahují sekvenci neutralizačního místa na ORF4 proteinu PRRSV. Vnesení sekvencí pro určitá neutralizační místa do různých typů vakcín umožňuje specificky indukovat tvorbu neutralizačních protilátek u očkovaných prasat. Jsou připravovány neživé vakcíny obsahující neutralizační místo podle vynálezu, indukující měřitelnou produkci neutralizačních protilátek. Neutralizační místo obsahují především sekvence PRRSV proteinu kódovaného ORF4 odpovídající aminokyselinovým sekvencím v pozicích 40 až 79 v PRRSV izolátu 1-1102. Imunogenicita vybraných peptidových sekvencí je dále zvýšena smísením peptidů s vhodným adjuvans nebo s dalšími v oboru známými nosiči. Takto získaná peptidová směs je použita jako očkovací látka. Ovšem vybrané peptidové sekvence obsahující neutralizační místo jsou také součástí vektorových vakcinačních systémů ve formě rekombinantních vektorů odvozených od heterologních virů nebo bakterií, nebo mohou být vybrané peptidové sekvence selektivně inkorporovány do virů nebo vakcín odvozených od PRRSV.
Předmětem navrhovaného vynálezu jsou dále aminokyselinové sekvence lokalizované v pozicích odpovídajících aminokyselinám 52 až 75 tvořící neutralizační místo se širokým spektrem reaktivity. Další neutralizační místa podle vynálezu mohou být nalezena mezi dalšími PRRSV izoláty ať již objevenými nebo těmi, které teprve budou popsány (viz. například experimentální část popisu vynálezu). Pro člověka pracujícího v oblasti molekulární biologie je snadné porovnat sekvence obsahující neutralizační místo podle vynálezu s aminokyselinovou sekvencí proteinu kódovaného ORF4 z některého dalšího PRRSV izolátu.
Vynález se dále zabývá peptidovými sekvencemi PRRSV zlepšujícími diagnostické testy, ať již se jedná o testy přítomnosti antigenu, nebo o testy přítomnosti protilátek. Vynález se zabývá nejrůznějšími skupinami antigenních míst, které jsou použity buď samostatně, nebo v kombinaci s diagnostickými testy. Předmětem vynálezu jsou tedy diagnostické testy sloužící nejrůznějším potřebám v oblasti diagnostiky a diferenciální diagnostiky. Reakce antigen-protilátka je vždy doprovázena i zkříženou reakcí epitop-paratop aminokyselinových sekvencí, které jsou dlouhé 5 až 15 aminokyselin. Aminokyselinové sekvence dlouhé 5 až 15 aminokyselin, které se částečně nebo úplně překrývají s hlavní sekvencí antigenního místa podle vynálezu jsou předmětem vynálezu jako sekvence vhodné pro diagnostické testy. Tyto peptidové sekvence se používají pro výběr nebo navržení antigenu nebo antigenní substance obsahující testovanou sekvenci. Dále • · · ····· · ·· · · •·» · · · · · · ···· · · ··· • · « · ····· • « · · · ······ ······· ·· jsou předmětem vynálezu také syntetické protilátky reagující s antigenními místy podle vynálezu. Zmíněná antigenní místa nebo příbuzné sekvence reagují se syntetickými protilátkami připravenými pomocí systémů jako jsou fágové knihovny nebo klonální selekce (těžkých řetězců) protilátek, které tvoří protilátkám podobné molekuly, které mohou být snadno exprimovány v heterologních expresních systémech.
Jedna skupina látek, která je předmětem vynálezu, zahrnuje peptidovou sekvenci odpovídající zmíněnému neutralizačnímu místu tak, jak bylo popsáno výše. Diagnostické testy zahrnující toto místo a/nebo protilátky specificky reagující s tímto místem detekují u prasat přítomnost neutralizujících protilátek.
Další skupina látek podle vynálezu zahrnuje konzervované antigenní místo proteinu Ν. V rámci konzervovaného antigenního místa je předmětem vynálezu hlavní aminokyselinová sekvence VNQLCQLLGA nebo VNQLCQMLGK. Diagnostické testy zahrnující toto místo a/nebo protilátky specificky reagující s tímto místem detekují u prasat přítomnost protilátek které specificky reagují s většinou PRRSV izolátů. Předmětem vynálezu jsou dále diagnostické testy které využívají protilátky namířené proti konzervovanému místu, detekující PRRSV antigen. Takové testy umožňují diagnostikovat přítomnost PRRSV izolátů nezávisle na jejich původu.
Další skupina látek podle vynálezu zahrnuje nekonzervované diferencující antigenní místo proteinu N. Diagnostické testy zahrnující toto místo a/nebo protilátky specificky reagující s tímto místem detekují u prasat přítomnost protilátek které specificky reagují s konkrétními PRRSV izoláty a tudíž například umožňují rozlišení očkovaných prasat od prasat infikovaných divokým typem PRRSV. Předmětem vynálezu jsou dále diagnostické testy které využívají protilátky namířené proti nekonzervovanému místu, detekující PRRSV antigen. Takové testy umožňují diagnostikovat přítomnost konkrétních PRRSV izolátů. V rámci jednoho nekonzervovaného místa je předmětem vynálezu hlavní sekvence PRGGQAKKKK nebo PRGGQAKRKK nebo PRGGQAKKRK nebo GPGKKNKKKN nebo GPGKKNKKKT nebo GPGKKNRKKN nebo GPGKKFKKKN nebo GPGKKIKKKN nebo GPGQINKKIN. V rámci jiného nekonzervovaného místa je předmětem vynálezu hlavní sekvence MAGKNQSQKK nebo MPNNNGKQTE nebo MPNNNGKQPK nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGKQQN nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGRQQK. Jak již bylo popsáno výše, není pro člověka zabývajícího se navrhováním a syntézou peptidů obtížné pozměnit uměle zmíněné sekvence GP4 nebo N proteinu tak, aby byla zachována jejich antigenicita a tudíž i funkčnost.
Další skupina látek podle vynálezu zahrnuje konformační epitopy (které se navzájem mezi jednotlivými izoláty velmi liší), které se nacházejí v pozicích odpovídajících aminokyselinám 51 až 68 proteinu N u izolátů 1-1102 (u tohoto izolátů se jedná o hlavní sekvenci PKPHFPLAAEDDIRHHL) nebo aminokyselinám 79 až asi 90 proteinu N (u izolátů 1-1102 se jedná o hlavní sekvenci SIQTAFNQGAGT) nebo aminokyselinám 111 až 124 proteinu N (u izolátů 1-1102 se jedná o hlavní sekvenci HTVRLIRVTSTSAS).
Konzervovaná, nekonzervovaná, diferencující i konformační místa proteinu N, která jsou předmětem navrhovaného vynálezu, umožňují při použití v diagnostických testech zcela jednoznačnou diagnostiku PRRSV infekcí. Byly připraveny testy které nevyužívají nekonzervované sekvence a tudíž zabraňují vzniku falešně negativních výsledků. Ovšem různá nekonzervovaná místa byla použita při přípravě diferenciačních testů, které mohou například rozlišovat mezi očkovanými prasaty a prasaty infikovanými divokým typem PRRSV. Jak již bylo řečeno, není pro molekulárního biologa obtížné porovnat sekvence obsahující konzervované, nekonzervované, diferencující či konformační epitopy s aminokyselinovými sekvencemi proteinů kódovaných ORF7 některého dalšího PRRSV izolátů. Antigenní místa, která jsou předmětem navrhovaného vynálezu, jsou použita v nových souborech očkovací látka-diskriminační diagnostický test, určených pro použití v programech pro eradikaci PRRS.
Příklady provedení vynálezu:
Příklad 1
MATERIÁL A METODY
Buňky a viry
Ter Huurne kmen PRRSV (CNCM 1-1102) byl izolován v roce 1991 (Wenswoort el al. 1991). Americký kmen PRRSV ATCC-VR2332 byl izolován o rok později Benfield et al. (1992). Kmen NL1 (Nizozemí, 1991) byl izolován v naší laboratoři, kmen NY2 (Velká Británie, 1991) laskavě poskytnul T. Drew, kmen DEN (Dánsko, 1992) laskavě poskytnul A. Botner, kmen LUX (Lucembursko, 1992) laskavě poskytnul Losch, kmeny SPA1 a SPA2 (Španělsko, 1992) laskavě poskytli Shokouhi a Espuna resp. a kmen FRA (Francie, 1992) laskavě poskytnul Y. Leforban.
PRRSV a VR2332 byly pěstovány na CL2621 buňkách tak jak to bylo popsáno dříve (van Nieuwstadt et al., 1996). Sedm odlišných evropských izolátů bylo pěstováno na prasečích alveolárních makrofázích. Makrofágy byly pěstovány tak ) · · · » · · · • · · · · ·
jak to bylo popsáno dříve (Wensvoort et al., 1991). BHK-21 buňky byly pěstovány na Dulbeccově základním minimálním médiu doplněném 5% fetálním hovězím sérem a antibiotiky. Pro účely transfekce byly BHK-21 buňky pěstovány na Glasgow základním minimálním médiu (GIBCO-BRL/Life Technologies Ltd.). Antiséra
Prasečí anti-PRRSV sérum 21 a králičí anti-peptidové sérum 698 a 700 byly použity již v dřívějších experimentech. Sérum 700 je namířeno proti aminokyselinám 106 až 122 (CLFYASEMSEKGFKVIF) kódovaným ORF4 PRRSV a bylo získáno imunizací králíků. Příprava a charakterizace monoklonálních protilátek byla popsána již dříve (van Nieuwstadt et al., 1996). Hybridomy byly připraveny v pěti po sobě následujících fúzních experimentech a byly připraveny proti proteinu kódovanému ORF4 (MAb 121.4, 122.1, 122.12, 122.20, 122.29, 122.30, 122.59, 122.66, 122.68, 122.70, 122.71, 126.1, 126.7, 130.7, 138.28) nebo proti proteinu kódovanému ORF7 (MAb 122.17, 125.1, 126.9, 126.15, 130.2,
130.4, 131.7, 138.22, WBE1, WBE4, WBE5, WBE6, SDOW17). Mnonoklonální protilátky WBE nám laskavě poskytnul Dr. Drew, Weybridge, UK; MAb SDOW17 laskavě poskytnul Dr. Benfield, South Dakota, US.
Plazmidové konstrukty
Dva oligonukleotidy lokalizované po směru transkripce (PRRSV13) a proti směru transkripce (PRRSV14) ORF4 byly již dříve použity pro amplifikací a klonování ORF4 izolátu 1-1102 do plazmidů pGEM-4Z. Pro klonování byla použita BamHI a HindlII restrikční místa zabudovaná do oligonukleotidových primerů (Meulenberg et al., 1995). Takto vzniklý konstrukt byl nazván pABV209. Dva oligonukleotidové primery lokalizované v podobných pozicích vzhledem k iniciačnímu kodonů (PRRSV4) a terminačnímu kodonů (PRRSV5) ORF4 VR2332 izolátu byly použity pro amplifikací ORF4 z VR2332 metodou RT-PCR tak, jak to bylo popsáno v dřívějších studiích. PCR produkty byly opracovány BamHI restrikčním enzymem a částečně také HindlII enzymem (částečně z toho důvodu, že ORF4 z VR2332 obsahuje interní HindlII místo) a klonovány do pGEM-4Z plazmidů za vzniku konstruktu pABV270. Rekombinantní DNA techniky byly použity v podstatě tak jak byly popsány v Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, Ny, 1989). Nukleotidová sekvence ORF4 z VR2332 v pABV270, stanovená pomocí automatikého DNA sekvenátoru (Applied Biosystems) byla shodná s publikovanou sekvencí (Murtaugh et al., Arch. Virol. 140; 1451-1460, 1995).
Následně byly ORF4 z 1-1102 a VR2332 přeneseny do Semliki Forest virus expresního vektoru pSFVl. pABV209 a pABV270 byly štěpeny restrikčními enzymy BamHI a HindlII (jen částečně v případě pABV270), ORF fragmenty byly opracovány Klenowovým fragmentem DNA polymerázy (Pharmacia) za vzniku tupých konců a takto opracovaná DNA byla ligována do Smál místa pSFVl, defosforylovaného telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Pharmacia). Plazmidy nesoucí ORF4 1-1102 (pABV265) a VR2332 (pABV271) ve správné orientaci byly dále testovány na expresi GP4 proteinu. Dále byly z 1-1102 a VR2332 připraveny čtyři různé chimérní ORF4 geny. Nukleotidová sekvence ORF4 genu kódující aminokyseliny 1 až 39 GP4 VR2332 byla amplifikována pomocí oligonukleotidů PRRSV4 a PRRSV6 z plazmidu pABV270. Takto získaný fragment byl opracován enzymy BamHI a SacII. Takto upravený fragment byl zaligován do pABV209 vektoru rozštěpeného BamHI a SacII restrikčními enzymy a za vzniku „in frame“ fúze (tj. fúze bez porušení čtecího rámce) mezi aminokyselinami 1 až 39 proteinu GP4 VR2332 a aminokyselinami 40 až 183 proteinu GP4 1-1102 v plazmidu pABV306. Nukleotidová sekvence ORF4 genu kódující aminokyseliny 1 až 75 GP4 VR2332 byla amplifikována pomocí oligonukleotidů PRRSV4 a PRRSV9 (viz. tabulka 2). tento fragment byl opracován restrikčními enzymy KpnI a BamHI. Nukleotidová sekvence ORF4 genu kódující aminokyseliny 80 až 183 proteinu GP4 z 1-1102 izolátu byla amplifikována pomocí oligonukleotidových primerů PRRSV46 a PRRSV14 a vzniklý fragment byl opracován restrikčními enzymy KpnI a BamHI. Oba fragmenty byly společně zaligovány do vektoru pGEM-4Z opracovaného enzymy BamHI a HindlII za vzniku plazmidu pABV308. Stejným způsobem byl připraven komplementární konstrukt pABV314 obsahující nukleotidovou sekvenci kódující aminokyseliny 1 až 79 GP4 proteinu z 1-1102 amplifikovanou z primerů PRRSV13 a PRRSV57 spojenou ligací s fragmentem kódujícím aminokyseliny 76 až 178 VR2332, připraveným amplifikací z primerů PRRSV10 a PRRSV5 ve vektoru pGEM-4Z. Čtvrtý chimérní konstrukt byl tvořen fragmentem kódujícím aminokyseliny 40 až 79 PRRSV GP4 proteinu fúzovaným s fragmenty kódujícími aminokyseliny 1 až 39 a aminokyseliny 76 až 178 VR2332 GP4 proteinu. Toho bylo dosaženo ligací BamHI/SacII ORF4 fragmentu pABV270 a SacII/HindlII ORF4 fragmentu pABV314 s pGEM-4Z opracovaným BamHI a HindlII. Výsledný plazmid byl nazván pABV325. Správnost sekvence plazmidů pABV306, pABV308, pABV314 a pABV325 byla ověřena sekvenací oligonukleotidů. Chimérní ORF4 geny byly přeneseny z pABV306, pABV308, pABV314 a pABV325 do PSFVl, tak jak to bylo popsáno výše v případě ORF4 • · • · genů z VR2332 a PRRSV. Výsledkem byly plazmidy pABV296, pABV305, pABV321 a pABV326 resp. (obr. 3).
Dva oligonukleotidy lokalizované proti směru transkripce (LV108; 5'GGAGTGGTTAACCTCGTCAAGTATGGCCGGTAAAAACCAGAGCC-3') a po směru transkripce (LVI 12; 5'-CCATTCACCTGACTGTTTAATTAACTTGCACCCT GA-3') 0RF7 byly použity pro amplifikaci a klonování ORF7 genu do plazmidu pGEM-T za vzniku pABV431. Sekvence a pozice těchto a i dalších oligonukleotidů, použitých pro amplifikaci fragmentů ORF7, jsou uvedeny v tabulce 1. Další čtyři chimérní konstrukty byly připraveny mutagenezí pomocí PCR. Sekvence kódující aminokyseliny 25 až 26 a 28 až 30 (místo B; obrázek 3) byly nahrazeny odpovídajícími sekvencemi EAV N proteinu. Této záměny bylo dosaženo PCR amplifikaci ORF7 z primerů LV108 a LV134 (5'TGGGGAATGGCCAGCCAGTCAATGACCTGTGCCGGATGTTTGGTGCAATGAT AAAGTCC-3'). Mutantní DNA fragmenty byly s pomocí MscI a PacI restrikčních míst vneseny do pABV431 za vzniku pABV455. Oblast ORF7 kódující aminokyseliny 51 až 67 byla nahrazena odpovídající oblastí LDV ORF7. Plazmid pABV431 byl štěpen enzymy EcoNI a Clal a byl ligován s PCR fragmentem vzniklým amplifikaci z primerů LV98 (5CCAGCAACCTAGGGGAGGACAGGCCAAAAAGAAAAAGCAGCCGAAGCTACA TTTTCCCATGGCTGGTCCATCTGAC-3') a LV99 (5'CGTCTGGATCGATTGCAAGCAGAGGGAGCGTTCAGTCTGGGTGAGGACGTGC CGGAGGTCAGATGGACCAGCC-3') a opracovaným stejnými restrikčními enzymy. Vzniklý plazmid byl nazván pABV463. Oblast ORF7 kódující aminokyseliny 80 až 90 byla nahrazena odpovídajícím úsekem LDV ORF7 genu. ORF7 gen LV byl mutován pomocí PCR s použitím primerů LV101 (5 GCTTGCAGGCGCCCGTGACGCTTTTCAATCAAGGCGGAGGACAGGCGTCGCT TTCATCCA-3) a LVI 12. Získaný fragment byl opracován enzymy Narl a Pacl a byl ligován do vektoru pABV431 štěpeného Clal a Pacl. Vzniklý plazmid byl nazván pABV453. Konečně oblast kódující C-terminální část proteinu N (aminokyseliny 111 až 128) byla nahrazena sekvencí kódující odpovídající aminokyseliny v N proteinu LDV. Gen ORF7 byl amplifikován z primerů LV108 a LV102 (5'-ATGTCCCGGGCTAAGCGGCGGAGGAATTAGCAGAAGCGTTAATCA GGCGCTGTGTAGCAGCAACCGGCAG-3') a klonován do vektoru pGEM-T. Vzniklý konstrukt byl nazván pABV456. Divoký typ ORF7 genu i mutované ORF7 geny byly z vektorů pABV431, pABV453, pABV455 a pABV463 vystřiženy pomocí enzymu Pacl (tupé konce) a Hpal z vektoru pABV456 pomocí enzymů Hpal a Swal. Získané geny byly následně vloženy do defosforylovaného Smál místa expresního vektoru pSFVI (Semliki forest virus). Plazmidy pABV470, pABV460, pABV462, pABV518 a pABV471 nesoucí odpovídající ORF7 geny ve správné orientaci byly dále testovány na expresi N proteinu. In vitro transkripce a transfekce SFV ORF7 RNA byla provedena stejně jako to bylo popsáno výše pro SFV-ORF4 konstrukty.
ORF4 geny sedmi různých evropských izolátů byly klonovány následujícím způsobem: makrofágy byly infikovány NL1, NY2, DEN, FRA, SPA1, SPA2 a LUX a RNA byla izolována tak jak to popsal Meulenberg et al., (1993). ORF4 geny byly amplifikovány pomocí RT-PCR z oligonukleotidových primerů PRRSV13 a PRRSV14 a klonovány pomocí BamHl a HindlII do pGEM-4Z. Pro každý kmen byla stanovena sekvence ORF4 genu dvou nezávislých klonů pocházejících z nezávislých PCR reakcí. Proteinové sekvence odvozené z nukleotidových sekvencí byly zpracovány programem pro mnohonásobné porovnání sekvencí CLUSTAL PCGene (Intelligenetics Tm).
In vitro transkripce a transfekce SFV-ORF4 RNA.
Plazmidy pSFV obsahující různé ORF4 konstrukty byly linearizovány štěpením Spěl a transkribovány in vitro. Syntetizovaná RNA byla transfekcí vnesena do BHK-21 buněk. Transfekce byla provedena v 15 mm jamkách na destičce s dvacetičtyřmi jamkami s použitím lipofectinu. Buňky byly fixovány ledovým 50% (v/v) methanolem v acetonu a GP4 protein exprimovaný různými ORF4 konstrukty byl značen monoklonálními protilátkami metodou IPMA (immunoperoxidase monolayer assay). ORF4 expresní produkty byly analyzovány imunoprecipitací. 107 BHK-21 buněk bylo transfektováno 10 pg in vitro transkribované SFV-ORF4 RNA. Transfekce byla provedena elektroporací. Poté byly buňky vysety do tří 35 mm jamek šesti-jamkové kultivační destičky a 18 hodin po transfekcí byly buňky značeny.
Metoda pepscan
Kompletní soubor překrývajících se nonapeptidů nebo dodekapeptidů byl syntetizován z aminokyselin odvozených od sekvence ORF4 nebo ORF7 PRRSV (popis viz Meulenberg et al. 1993). Syntézu peptidů na pevné fázi na polyethylénových tyčinkách a imunologické testování metodou ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) jsme prováděli přesně podle zavedené metody PEPSCAN (Geysen et al., PNAS 81, 3998-4002, 1984).
• «
Výsledky
Již dříve jsme popsali soubor neutralizujících monoklonálních protilátek reagujících s 31 až 35 kDa proteinem PRRSV nazvaným GP4 a soubor monoklonálních protilátek reagujících při testování metodou Western imunoblot s proteinem N. Bylo prokázáno že GP4 je strukturální glykoprotein kódovaný kódovaný ORF4 a N je protein nukleokapsidy kódovaný ORF7. V imunoprecipitačních pokusech s GP4 specifickými monoklonálními protilátkami putoval GP4 protein z lyzátů buněk infikovaných PRRSV jako oddělený pruh o velikosti 28 kDa spolu s nepatrnou skvrnou o něco větší zdánlivé molekulové hmotnosti. Monoklonální protilátky imunoprecipitovaly difúzní (glykosylovaný) GP4 protein veliký asi 31 kDa z extracelulárního média PRRSV infikovaných buněk ale nikoliv z extracelulárního média falešně infikovaných buněk.
Identifikace neutralizující domény GP4.
Již dříve bylo popsáno, že monoklonální protilátky specifické pro GP4 protein rozeznávaly 1-1102, ale nikoliv US izolát VR2332 (van Nieuwstadt et al., 1996). Abychom mohli identifikovat doménu GP4 proteinu vážící neutralizující monoklonální protilátky, připravili jsme fúzní proteiny sestávající se z částí GP4 proteinu 1-1102 a VR2332. Tyto proteiny byly exprimovány s použitím SFV (Semliki forest virus) expresního systému vyvinutého Liljestrom et al. (Biotechnol, 9, 1356-1362, 1991). Nejprve byl do pSFVl klonován ORF4 z I1102 izolátu za vzniku plazmidu pABV265 (obr. 1). RNA získaná transkripcí z pABV265 byla transfekcí vnesena do BHK-21 buněk a 24 hodin po transfekci byly buňky pozitivně značeny souborem 15 neutralizujících monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky nereagovaly s BHK-21 buňkami nesoucími pSFVl -RNA. Rekombinantní GP4 protein byl imunoprecipitován monoklonální protilátkou MAb
126.1 z BHK-21 buněk značených L-[35S]-methioninem, transfektovaných pABV265 RNA. Tento protein měl stejnou velikost jako původní GP4 protein syntetizovaný CL2621 buňkami infikovanými 1-1102 a také obsahoval PNGaseF a EndoH citlivé N-glykany. Také GP4 protein VR2332 byl klonován do pSFVl, ale tento protein nebyl po expresi v BHK-21 buňkách rozpoznán monoklonálními protilátkami (obr. 1). Aby bylo možné ještě blíže určit oblast GP4 proteinu rozpoznávanou monoklonálními protilátkami, byly připraveny čtyři chimérní ORF4 geny z 1-1102 a VR2332 a vneseny do SFV1 vektoru (obr. 1). RNA získaná transkripcí z plazmidů pABV296, pABV30S, pABV321 a pABV326 byla vnesena transfekcí do BHK-21 buněk. Reaktivita exprimovaných proteinů s GP4 specifickými MAb byla testována metodou IPMA. Výsledek reakce se všemi 15 ····· · · » · · ·· ··* · · · * ··«· ···* · · · · · ·
MAb byl identický, což dokazuje, že všechny tyto monoklonální protilátky byly namířeny proti oblasti GP4 proteinu velké 40 aminokyselin. Produkt exprese pABV326, který obsahoval aminokyseliny 40 až 79 odvozené od GP4 proteinu CNCM 1-1102 izolátu a celý zbytek sekvence GP4 proteinu odvozený od GP4 proteinu VR2332, byl stále ještě rozpoznáván celým souborem monoklonálních protilátek. Abychom se ujistili, že byly různé GP4 proteiny, především ty, které nebyly rozpoznány monoklonálními protilátkami, v BHK-21 buňkách správně exprimovány, byly tyto proteiny z lyzátu BHK-21 buněk transfektovaných RNA připravenou in vitro transkripcí z plazmidů pABV265, pABV271, pABV296, pABV305, pABV321 a pABV326 imunoprecipitovány. Proteiny byly imunoprecipitovány prasečím anti-PRRSV sérem 21, MAb 126.1 a antipeptidovými séry 698 a 700. Sérum 700 je namířeno proti aminokyselinám 106122 PRRSV GP4 proteinu izolátu CNCN 1-1102, tj. proti sekvenci která je s výjimkou aminokyseliny 121 identická s odpovídající sekvencí GP4 proteinu izolátu ATCC-VR2332. Proto byly sérem 700 imunoprecipitovány všechny GP4 proteiny. Zmíněné GP4 proteiny byly při analýze na SDS-PAGE co do velikosti nerozeznatelné. Výjimku tvořily GP4 proteiny exprimované pABV305 a pABV271, které se pohybovaly nepatrně rychleji. To je pravděpodobně způsobeno delecí čtyř aminokyselin u izolátu VR2332 oproti sekvenci 1-1102. Ktéto deleci dochází mezi aminokyselinami 62 až 64 (obr. 3). Kompletní soubor GP4 specifických monoklonálních protilátek rozpoznával GP4 proteiny exprimované z plazmidů pABV265, pABV296, pABV321, pABV326, ale nikoliv proteiny exprimované z plazmidů pABV305 a pABV271, což jen potvrdilo výsledky získané metodou IPMA (obr. 3). Sérum 698 vykazovalo stejný reakční profil jako monoklonální protilátky. Sérum 698 je namířeno proti aminokyselinám 62 až 77 GP4 proteinu PRRSV, které jsou lokalizovány v nově popsané neutralizační doméně GP4 proteinu. Tato oblast je u VR2332 GP4 proteinu velice heterogenní, a proto nebyly produkty získané expresí genů nesoucích v této oblasti VR2332 sekvenci sérem 698 rozpoznány. Ovšem neutralizující polyklonální prasečí sérum rozpoznává I1102 GP4 protein stejně jako chimérní GP4 proteiny i VR2332 GP4 protein, což naznačuje, že toto sérum obsahuje celou řadu neutralizujících protilátek, které jsou namířeny proti neutralizačnímu místu GP4 proteinu, tvořenému aminokyselinami 40 až 79.
PEPSCAN ORF4 a ORF7 proteinů.
Vzhledem k tomu že při testování metodou western blot reagovalo s GP4 proteinem všech 15 monoklonálních protilátek, předpokládali jsme, že tyto « · « v»«· *> · · • · · »♦ · ·»·· · « · · · · • · · · ·······>« • · · * · · »····· ··*««·>· ·« · v protilátky rozpoznávají lineární epitop v oblasti spojující aminokyseliny 40 až 79 proteinu GP4 z izolátů 1-1102. Pro další mapování oblasti vážící monoklonální protilátky byla použita metoda PEPSCAN s použitím překrývajících se nonapeptidů nebo dodekapeptidů z této oblasti. Peptidy byly považovány za představitele antigenního místa, pokud vrcholy v takovém souboru opakovaně dosahovaly více než dvojnásobných hodnot v porovnání s pozadím. MAb 122-29, 122-30, 122-66, 122-71, 130-7 a 138-28 reagovaly pozitivně s jedním specifickým antigenním místem tvořeným aminokyselinami 59 až 67 (SAAQEKISF) (obr. 2). MAb 122-12 reagovala s tímto antigenním místem jen slabě, zatímco zbývajících 7 monoklonálních protilátek vykazovalo při PEPSCAN analýze negativní výsledky. Polyklonální prasečí sérum zmíněné místo při PEPSCAN analýze také identifikovalo. Neutralizující sérum 21, odebrané v šestém týdnu po infekci prasete 21 PRRSV, vykazovalo s tímto místem i přilehlými oblastmi silnou a širokou reaktivitu. Také neutralizující polyklonální prasečí séra (val2 a val4), odebraná 54. den po očkování PRV-ORF4 virovým vektorem a při porážce 30 dní po vyvolání reakce v 54. dnu s PRRSV, reagovala s neutralizačním místem identifikovaným metodou PEPSCAN silně a v nejširším spektru případů.
U izolátů 1-1102 obsahuje základní sekvence neutralizačního místa aminokyselinovou sekvenci SAAQEKISF lokalizovanou v oblasti aa 59 až 67. U dalších izolátů je tato základní sekvence lokalizována v místě a nebo v blízkosti místa odpovídajícího pozici zmíněných aminokyselin. Jedná se o aminokyselinovou sekvenci odpovídající neutralizačnímu místu GP4 proteinu, obsahující například sekvence jako SAAQEEISF, nebo STAQENISF, nebo STAQENIPF, nebo SEESQSVT, nebo SASEAIR, nebo SASEAFR, nebo PAPEAFR, nebo SAFETFR, nebo STSEAFR, ale předpokládáme, že další izoláty PRRSV nesou odpovídající, ale nepatrně odlišné základné sekvence neutralizačního místa, lokalizované v a nebo v blízkosti aminokyselinové sekvence odpovídající aminokyselinám 59-67 ORF4 PRRSV izolátů 1-1102. Zmíněná sekvence může být také snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti základní sekvence, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna. Také, jak bylo zcela zjevně demonstrováno mnohem širší reaktivitou neutralizujícího polyklonálního séra v PEPSCAN testech, aminokyselinové sekvence různých izolátů PRRSV obsahující základní aminokyselinovou sekvenci a sekvence přilehlé k této základní sekvenci navíc tvoří neutralizační místa na ORF4 proteinu. Neutralizační místo tvoří především sekvence lokalizované v pozicích odpovídajících aminokyselinám 40 až 79 (obr. 1). A znovu, zmíněná sekvence může být snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti základní
99 9 • · · sekvence, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna. Vezmeme-li v úvahu širokou reaktivitu polyklonálního neutralizujícího séra val2 nebo séra val4 (obr. 2), je zřejmé že aminokyselinové sekvence lokalizované v pozicích odpovídajících aminokyselinám 52 až 75 ještě specifičtěji tvoří široce reaktivní neutralizační místo.
Monoklonální protilátky namířené proti ORF7 proteinu reagovaly v testu PEPSCAN ve čtyřech různých skupinách; skupina A (4), B (2), C (3) a D (1). Skupina 1 (D) (ve které byly mezi jinými MAb 122.17, 130.3, 130.4, 131.7, WBE1, WBE4, WBE6, SDOW17 obsahující konzervovaná i nekonzervovaná reaktivní místa) reagovala s konformačním epitopem, který nebyl metodou PEPSCAN detekován. Skupina 2 (B) (ve které byly mezi jinými MAb 125.1, 126.9, NS95 a NS99, reagující se všemi testovanými PRRSV izoláty a tudíž rozeznávající konzervované antigenní místo) rozeznává základní sekvenci VNQLCQLLGA (nacházející se u izolátu 1-1102 v pozici 22 až 32) nebo sekvenci VNQLCQMLGK. Skupina 3 (C) (ve které byla mezi jinými MAb 126.15 a reagující především s evropskými izoláty PRRSV a tudíž rozpoznávající diferenciační antigenní místo) rozpoznává základní sekvenci PRGGQAKKKK (nacházející se u izolátu 1-1102 v pozici 41 až 50) nebo PRGGQAKRKK nebo PRGGQAKKRK nebo GPGKKNKKKN nebo GPGKKNKKKT nebo GPGKKNRKKN nebo GPGKKFKKKN nebo GPGKKIKKKN nebo GPGQINKKIN. Skupina 4 (A) (ve které byla mezi jinými MAb 138.22 a reagující především s evropskými izoláty PRRSV a tudíž rozpoznávající diferenciační antigenní místo) rozpoznává základní sekvenci MAGKNQSQKK (nacházející se u izolátu 1-1102 v pozici 1 až 10) nebo MPNNNGKQTE nebo MPNNNGKQPK nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGKQQN nebo MPNNNGKQQK nebo MPNNNGRQQK. Zmíněná antigenní místa mohou být snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti výše zmíněných antigenních míst proteinu N, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna. Přestože skupina 1 netvoří lineární epitopy, porovnání PRRSV aminokyselinových sekvencí s LDV aminokyselinovými sekvencemi ukazuje, že se v pozicích odpovídajících aminokyselinám 51 až 68 izolátu 1-1102 (u izolátu 1-1102 je to sekvence PKPHFPLAAEDDIRHHL) nebo aminokyselinám 79 až 90 (u izolátu 1-1102 je to sekvence SIQTAFNQGAGT) nebo aminokyselinám 111 až 124 (u izolátu 1-1102 je to sekvence HTVRLIRVTSTSAS) nacházejí konformační epitopy. Zmíněná konformační antigenní místa mohou být snadno, při zachování antigenicity a tím i funkčnosti výše zmíněných antigenních míst proteinu N, osobou odborně zdatnou v oblasti navrhování a syntézy peptidů uměle změněna, především s přihlédnutím ···· » ·« · · · · • ··<· ···· ··· · · ·**· ·· · · · ······ • * · · · k poznatkům získaným porovnáváním sekvencí PRRSV izolátů se sekvencemi N proteinů jiných zástupců Arteriviridae. To bylo potvrzeno expresí chimérních LDV/PRRSV ORF7 proteinů v SFV expresním systému (postup byl stejný jako v případě ORF4) a stanovením reaktivity výsledných produktů s monoklonálními protilátkami ze skupiny 1.
Chimérní proteiny N.
Doména D byla dále mapována pomocí konstruktů ORF7 exprimujících chimérní proteiny N. Vzhledem k tomu, že 6 z 10 monoklonálních protilátek namířených proti doméně D rozeznávalo jak evropské, tak i severoamerické izoláty PRRSV, byly oblasti N proteinu, nejvíce konzervované mezi LV a severoamerickým izolátem VR2332 (obr. 4) mutovány. Nukleotidová sekvence kódující aminokyseliny 51 až 67, 80 až 90 a 111 až 128 byla nahrazena sekvencí kódující odpovídající aminokyseliny LDV (obr. 4). Pro úplnost bylo místo B (aminokyseliny 25 až 30), které je u evropských i severoamerických izolátů také konzervováno, mutováno. Vzhledem k tomu, že se aminokyselinová sekvence LV proteinu N v místě B velmi podobá aminokyselinové sekvenci LDV proteinu N, byla tato oblast LV proteinu N nahrazena oblastí kódující odpovídající aminokyseliny v N proteinu EAV (obr. 4). Mutované i divoké proteiny N byly exprimovány v BHK-21 buňkách (Semliki forest virus expresní systém) a byly testovány metodou IPMA s použitím N-specifíckých monoklonálních protilátek. D-specifické monoklonální protilátky reagovaly shodně (tabulka 1). Jejich vazba byla narušena mutacemi mezi aminokyselinami 51 až 67 a 80 až 90, ale nikoliv mutacemi mezi aminokyselinami 111 až 128 nebo 25 až 30 (místo B). Jak jsme očekávali, proteiny N nesoucí mezi aminokyselinami 51-67 a 80-90 LDV sekvenci byly stále ještě značeny protilátkami proti místům A, B a C. Ovšem množství barvených buněk a intenzita zbarvení byla nižší, než jaká byla pozorována u divokého typu proteinu N a u proteinu N mutovaného v oblasti mezi aminokyselinami 25 až 30 (místo B) nebo v oblasti mezi aminokyselinami 111-128 (tabulka 1). To bylo pravděpodobně způsobeno nižší úrovní exprese proteinu N mutovaného mezi aminokyselinami 51-67 a 80-90, neboť i v případě kdy byla stejná množství transkriptů translatována in vitro, byly získané výtěžky zmíněných proteinů v porovnání s ostatními N proteiny nižší (data nejsou zobrazena). Jak jsme očekávali, proteiny N nesoucí v místě B EAV sekvence nebyly monoklonálními protilátkami proti místu B rozpoznány (pepscan analýza), ale byly rozpoznány monoklonálními protilátkami proti místům A, C a proti • · doméně D. Z těchto dat vyplývá, že epitopy patřící do domény D jsou závislé na konformaci a jsou tvořeny (zčásti) aminokyselinami 51-67 a 80-90.
Sekvenční analýza GP4 proteinu z různých PRRSV kmenů.
Aby bylo možné analyzovat, je-li hlavní neutralizační antigenni místo, rozpoznávané GP4-specifickými protilátkami, mezi jednotlivými izoláty PRRSV konzervované, byla testována reaktivita a neutralizující aktivita monoklonálních protilátak na sedmi různých evropských kmenech. Výsledky ukázaly, že zmíněné protilátky rozpoznávají a neutralizují nizozemský kmen NL1 a anglický kmen NY, ale nikoliv dánský izolát DEN, dva španělské kmeny SPA1 a SPA2, francouzský izolát FRA a kmen LUX izolovaný v Lucembursku. Z toho důvodu nás zajímala aminokyselinová sekvence zmíněných izolátů v oblasti GP4 proteinu, ve které se nachází neutralizační místo. ORF4 byly klonovány metodou RT-PCR s použitím primerů odvozených od PRRSV sekvence a klonované úseky DNA byly osekvenovány. Aminokyselinové sekvence GP4 proteinů zmíněných izolátů, odvozené od stanovené nukleotidové sekvence, byly identické se sekvencí GP4 kmene 1-1102 z 86 až 97 %. Porovnání zmíněných aminokyselinových sekvencí ukázalo, že neutralizační místo (aminokyseliny 40 až 79) je mnohem více divergentní než zbývající části proteinu. V této oblasti se lišily především aminokyselinové sekvence izolátů DAN, SPA1, SPA2 a FRA. Tento poznatek je ve shodě se zjištěním, že tyto kmeny nejsou neutralizovány 1-1102 specifickými monoklonálními protilátkami a dále potvrdil, že tato oblast není mezi evropskými izoláty příliš konzervovaná. Další vysoce heterogenní oblast byla nalezena na Nkonci GP4 proteinu. Porovnáním aminokyselinové sekvence PRRSV GP4 proteinu a GP4 proteinu z VR2332 a z dalších severoamerických kmenů ukázalo, že také americké izoláty jsou v oblasti neutralizačního místa GP4 proteinu heterogenní. Porovnáním aminokyselinových sekvencí bylo zjištěno, že neutralizační místo severoamerických izolátů je v porovnání s evropskými kmeny kratší (výsledkem porovnání sekvencí je mezera v neutralizační oblasti sekvence amerických izolátů) (obr. 3), což je v dobré shodě se zjištěním, že žádný ze zmíněných izolátů není rozpoznáván použitými monoklonálními protilátkami. Celkově byla mezi americkými izoláty pozorována vyšší diverzita než mezi evropskými kmeny.
To je ve shodě s vlastnostmi, charakteristickými pro typický virový obal, reprezentovanými například aminokyselinovou sekvencí GP4 proteinu. Potenciál neutralizačního místa, využitelný pro přípravu vakcíny, má, vzhledem k heterogenicitě neutralizačních míst, velký význam. Porovnáním • · ·
aminokyselinových sekvencí GP4 proteinů různých evropských kmenů bylo zjištěno, že neutralizační místa vykazují mnohem vyšší variabilitu než ostatní Části proteinu, což předpokládá, že tato místa jsou citlivá k imunoselekci. Porovnání sekvencí neutralizačních míst evropských a severoamerických izolátů ukázalo, že severoamerické kmeny mají v porovnání s evropskými v sekvenci mezeru velkou 4 aminokyseliny, což znovu ilustruje obrovskou variabilitu v aminokyselinové sekvenci nově identifikovaného neutralizačního místa PRRSV. Neutralizační místo GP4 proteinu popsané zde, je prvním takovým místem identifikovaným u Lelystad viru. V případě dalších dvou arterivirů, EAV a LDV, byly izolovány neutralizující monoklonální protilátky a, které byly všechny namířeny proti Gi/VP3 proteinu, kódovanému ORF5 (Deregt et al., 1994; Glaser et al., 1995; Balasuriya et al., 1995; Harty and Plagemann, 1988). Mapováním pomocí mutantů necitlivých k neutralizaci byla určena poloha neutralizačního místa EAV. Toto místo je tvořeno specifickými aminokyselinami ve vnější doméně Gj.
Podobně byla analyzována sekvence ORF7 proteinu PRRSV (obr. 4). Tato analýza opět potvrdila velkou variabilitu v aminokyselinové sekvenci nově identifikovaných antigenně konzervovaných i nekonzervovaných míst PRRSV. V této části projektu byla identifikována čtyři různá antigenní místa nacházející se na proteinu N PRRSV. Tři místa, nazvaná A, B a C, jsou tvořena lineárními epitopy a nachází se mezi aminokyselinami 2-12, 25-30 a 40-46 resp. Na rozdíl od nich čtvrté místo, nazvané doména D, obsahuje konformačně závislé epitopy, které jsou (alespoň z části) tvořeny aminokyselinami 51-67 a 80-90. Místa A a C nesou epitopy, které jsou konzervované mezi evropskými, ale nikoliv mezi americkými izoláty PRRSV, místo B obsahuje epitopy konzervované jak mezi evropskými, tak mezi americkými izoláty a místo D obsahuje konzervované i nekonzervované epitopy jak u evropských, tak i severoamerických izolátů PRRSV. Konzervovaná místa proteinu N popsaná výše jsou pro vývoj diagnostických testů určených pro jednoznačnou diagnózu PRRSV infekcí velmi důležitá. Tyto testy by se měly vyhnout využití nekonzervovaných míst a tudíž by měly zabránit vzniku falešně negativních výsledků. Kromě toho je znalost různých nekonzervovaných míst obrovskou výhodou při vývoji diferenciačních testů, které například dokáží rozlišit mezi očkovanými prasaty a prasaty infikovanými divokým typem PRRSV.
• · • ·
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1: Schematické znázornění proteinů G exprimovaných v pSFVl a jejich reaktivita s GP4 specifickými monoklonálními protilátkami. Vyznačeny jsou také názvy plazmidů nesoucích jednotlivé ORF4 geny. Prázdné obdélníky představují aminokyselinové sekvence odvozené od proteinu G kódovaného ORF4 PRRSV, černě jsou vyznačeny aminokyselinové sekvence odvozené od proteinu G kódovaného ORF4 VR2332. Pořadová čísla aminokyselin jsou vyznačena nad odpovídajícími obdélníky. Geny byly nejprve vneseny do plazmidů pGEM-4Z, a teprve poté byly přeneseny do pSFVl, jak bylo podrobněji popsáno v kapitole „materiál a metody“. Kompletní soubor 14 GP4-specifických monoklonálních protilátek reagoval s různými konstrukty v IPMA testu identicky a reaktivita jednotlivých konstruktů je na obrázku vyznačena symboly + (pozitivní) nebo (negativní.
Obrázek 2: Pepscan analýza GP4-specifických monoklonálních protilátek a polyklonálního séra s překrývajícími se 12-merními peptidy reprezentujícími aminokyseliny 12 až 94 proteinu GP4. Výsledky získané s protilátkami 130.7 a 138.28, které rozeznávají po sobě jdoucí peptidy, jsou znázorněny na obr. 2A. Dalších 5 monoklonálních protilátek (122.29, 122.30, 122.66,122.71 a 138.28) vykazovalo obdobnou specifitu. Výsledky pokusů s polyklonálním sérem, získaným ze dvou prasat před imunizací (val2-0 a val4-0), po imunizaci vektorem odvozeným od pseudoviru vztekliny, exprimujícím ORF4 (val2-54 a val4-54) a po následné expozici PRRSV (val2-sl a val4-sl) jsou znázorněny na obrázcích 2A a 2B. Výsledky pokusu s polyvalentním prasečím anti-LV sérem 21 (va21) jsou na obrázku 2D. Na obrázcích jsou vyznačeny aminokyselinové sekvence reaktivních peptidů, nejčastěji se vyskytující aminokyselinové zbytky jsou uvedeny v rámečku.
Obrázek 3: Porovnání aminokyselinových sekvencí GP4 (A) a Ν (B) proteinů z různých PRRSV kmenů. Zobrazeny jsou pouze aminokyseliny, které se liší od sekvence 1-1102, která je znázorněna v prvním řádku. Základní aminokyselinová sekvence, která je při pepscan analýze rozpoznávána monoklonálními protilátkami a/nebo polyklonálním sérem je podtržena.
Obrázek 4: Lokalizace antigen-vazebných míst v sekvenci proteinu N a porovnání sekvence N proteinu LV se sekvencí N proteinu severoamerického izolátů VR2332 a LDV. Antigen-vazebná místa A, B a C a doména D jsou znázorněny stínováním.
Místa A, B a C byla identifikována pepscan analýzou, doména D byla identifikována na základě konstrukce a analýzy chimérních N proteinů.
• ·
Aminokyselinové sekvence LV, které byly za účelem mapování domény D nahrazeny odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi LDV jsou podtrženy. Aminokyseliny proteinu N EAV, které byly vloženy mezi aminokyseliny 25-30 za účelem mutace místa B, jsou zobrazeny pod sekvencí LDV. Identické aminokyseliny jsou spojeny vertikálními úsečkami.
• ·
2.2
V)
L3 o
CZ) >
Uh
CZ) ε
o <u >
x) o
c ns >
O ε
cL x
tu »3
C '53 o
-C o
'(U ε § = C h o 2 -5 « c Η N
Značení MAb metodou IPMA 122.15/130.2/130.4/131.7/131.9/WBE1/WBE4/WBE5/WBE6/SDOW17 Q +++ +++ 1 +++
126.15 O + + + + + + + +
125.1/126.9/NS95/NS99 CQ + + + 1 + + + + +++
138.22 +++ +++ + + + + +++
Mutace 1 25-30 51-67 80-90 [111-124
Plazmid PABV470 pABV462 PABV518 pABV460 PABV471
Tabulka 2
Sekvence primerů použitých pro PCR za účelem klonování ORF4 genů LV a VR2332 a chimémích ORF4 genů do plazmidových vektorů pGEM-4Za pSFVl.
Název
Sekvence
Vložené restrikční místo
LV13 5' GGCAATTGGM 7CCATTTGGA 3' ZtamHI
LV 14 5' AGAAGC/L4GC77GCGGAGTC 3' Hindill
LV46 5'GCCGTCGG7L4CCCCTCAGTACAT 3' Kpnl
LV57 5' ATGTACTGAGGGGL4CCGACGGC3' Kpnl
PRRSV4 5GGCAATTGG47UCACCTAGAATGGC3' Ba/wHI
PRRSV5 5' GCGAGCA4GC77CCGCGGTCAAGCATTTCT 3' Hindlll
PRRSV6 5 'CTTGCCGCCGCGGTGGTGTTG3' Sacll
PRRSV9 5' ACAGCTGG7L4CCTATCGCCGTACGGCACTGA 3' Kpnl
PRRSVl0 5' GCGATAGGZ4CCCCTGTGTATGTTACCAT 3' Kpnl * Podtržené nukleotidy v těchto primerech byly vzhledem k původním sekvencím mutovány tak, aby vznikla restrikční místa nebo přesahující sekvence a aby bylo zabráněno dlouhým sekvencím s opakujícím se jediným nukleotidem. Restrikční místa v primerech jsou vyznačena proloženě.

Claims (27)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    Pl/
    1. Peptid vyvolávající tvorbu neutralizujících protilátek vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci nejméně 7 až 40 aminokyselinových zbytků, odvozenou od aminokyselinové sekvence odpovídající neutralizačnímu místu proteinu GP4 PRRSV.
  2. 2. Peptid vyvolávající tvorbu neutralizujících protilátek podle nároku 1 vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci kde byly aminokyselinové zbytky nahrazeny konvenčním způsobem nebo na základě mapování pomocí aminokyselinových záměn.
  3. 3. Peptid podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že zmíněné neutralizační místo obsahuje aminokyselinové zbytky lokalizované u GP4 proteinu PRRSV izolátu I-1102v pozicích 40 až 79.
  4. 4. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 vyznačující se tím, ž e zmíněné neutralizační místo obsahuje aminokyselinové zbytky lokalizované u GP4 proteinu PRRSV izolátu 1-1102 v pozicích 52 až 75.
  5. 5. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 vyznačující se tím, ž e zmíněné neutralizační místo obsahuje aminokyselinové zbytky lokalizované u GP4 proteinu PRRSV izolátu 1-1102 v pozicích 59 až 67.
  6. 6. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, ž e zmíněná aminokyselinová sekvence zahrnuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující SAAQEKISF, SAAQEEISF, STAQENISF, STAQENIPF, SEESQSVT, SASEAIR, SASEAFR, PAPEAFR, PAPEAIR, SAFETFR a STSEAFR.
  7. 7. Peptid vyvolávající tvorbu protilátek reagujících nejméně se dvěma různými
    PRRSV izoláty vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci nejméně 5 až 15 aminokyselinových zbytků odvozených od aminokyselinové sekvence odpovídající konzervovanému místu proteinu N PRRSV.
  8. 8. Peptid vyvolávající tvorbu protilátek reagujících nejméně se dvěma různými PRRSV izoláty podle nároku 7 vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci kde byly aminokyselinové zbytky nahrazeny konvenčním způsobem nebo na základě mapování pomocí aminokyselinových záměn.
    • · • · · · • · · · * · · · · · ·
  9. 9. Peptid podle nároku 7 nebo 8 vyznačující se tím, že zmíněné konzervované místo obsahuje aminokyselinové zbytky lokalizované u proteinu N PRRSV izolátu 1-1102 v pozicích 22 až 32.
  10. 10. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 7až9vyznačující se tím, ž e zmíněná aminokyselinová sekvence zahrnuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující VNQLCQLLGA A VNQLCQMLGK.
  11. 11. Peptid vyvolávající tvorbu protilátek, které jsou schopny rozlišit mezi nejméně dvěma různými PRRSV izoláty vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci nejméně 5 až 15 aminokyselinových zbytků odvozených od aminokyselinové sekvence odpovídající nekonzervovanému a diferencujícímu místu proteinu N PRRSV
  12. 12. Peptid vyvolávající tvorbu protilátek, které jsou schopny rozlišit mezi nejméně dvěma různými PRRSV izoláty podle nároku 11 vyznačující se tím, že obsahuje aminokyselinovou sekvenci kde byly aminokyselinové zbytky nahrazeny konvenčním způsobem nebo na základě mapování pomocí aminokyselinových záměn.
  13. 13. Peptid podle nároku 11 nebo 12 vyznačující se tím, že zmíněné nekonzervované místo zahrnuje aminokyselinové zbytky lokalizované u proteinu N PRRSV izolátu 1-1102 v pozicích 41 až 50.
  14. 14. Peptid podle kteréhokoliv z nároků 11 až 13 vyznačující se tím, že zmíněná aminokyselinová sekvence zahrnuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující PRGGQAKKKK, PRGGQAKRKK, PRGGQAKKRK, GPGKKNKKKN, GPGKKNKKKT, GPGKKNRKKN, GPGKKFKKKN, GPGKKIKKKN a GPGQINKKIN.
  15. 15. Peptid podle nároku 11 vyznačující se tím, že zmíněné nekonzervované místo zahrnuje aminokyselinové zbytky lokalizované u proteinu N PRRSV izolátu 1-1102 v pozicích 1 až 10.
  16. 16. Peptid podle nároku 11, 12 nebo 15 vyznačující se tím, že zmíněná aminokyselinová sekvence zahrnuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující MAGKNQSQKK, MPNNNGKQTE, MPNNNGKQPK, MPNNNGKQQK, MPNNNGKQQN, MPNNNGKQQK a MPNNNGRQQK.
  17. 17. Peptid vyvolávající tvorbu protilátek, které jsou namířeny proti konformačnímu epitopu proteinu N PRRSV vyznačující se tím, ž e zmíněný peptid má délku 5 až 15 aminokyselinových zbytků a zmíněné aminokyselinové zbytky odpovídají konformací aminokyselinové sekvenci • * • · · proteinu N Lelystad viru izolátu 1-1102 v pozicích 68-79 nebo 79-90 nebo 11124.
  18. 18. Peptid podle nároku 17 vyznačující se tím, že zmíněná aminokyselinová sekvence zahrnuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny obsahující sekvence PK.PHFPLAAEDDIRHHL, SIQTAFNQGAGT a HTVRLIRVTSTSAS.
  19. 19. Imunogenní prostředek určený pro indukci tvorby neutralizujících protilátek odpovídajících neutralizačnímu místu proteinu GP4 Lelystad viru vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jeden peptid podle nároku 1 až 6.
  20. 20. Vakcína určená pro ochranu před PRRS infekcí vyznačující se tím, že obsahuje peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 nebo imunogenní prostředek podle nároku 19 spolu s vhodným adjuvans nebo s nosičem určeným pro podávání zvířeti.
  21. 21. Syntetická protilátka vyznačující se tím, že reaguje s peptidem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18.
  22. 22. Diagnostická souprava pro detekci nebo identifikaci protilátek namířených proti PRRSV izolátům vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jeden peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 18 spolu s vhodnými detekčními prostředky.
  23. 23. Diagnostická souprava pro detekci nebo identifikaci protilátek namířených proti antigenům odvozeným od PRRSV izolátů vyznačující se tím, že obsahuje protilátky podle nároku 21.
  24. 24. Použití vakcíny podle nároku 20 nebo diagnostické soupravy podle nároku 22 nebo 23 za účelem snížení výskytu PRRS v prasečím stádu.
  25. 25. Použití diagnostické soupravy podle nároku 22 nebo 23 pro testování výskytu PRRS u prasat nebo v celém prasečím stádu.
  26. 26. Použití vakcíny podle nároku 20 nebo diagnostické soupravy podle nároku 22 nebo 23 v eradikačních programech zaměřených na snížení nebo úplné zamezení výskytu PRRS v prasečích stádech.
  27. 27. Způsob testování výskytu PRRS u prasat nebo v prasečím stádu vyznačující se tím, že zahrnuje použiti diagnostické soupravy podle nároku 22 až 24.
CZ0393299A 1997-05-06 1998-05-05 Peptid mající 5 az 15 aminokyselinových zbytku vyvolávající tvorbu protilátek, protilátka reaktivnís tímto peptidem a diagnostická testovací souprava CZ297371B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97201343 1997-05-06

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ9903932A3 true CZ9903932A3 (cs) 2000-10-11
CZ297371B6 CZ297371B6 (cs) 2006-11-15

Family

ID=8228298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ0393299A CZ297371B6 (cs) 1997-05-06 1998-05-05 Peptid mající 5 az 15 aminokyselinových zbytku vyvolávající tvorbu protilátek, protilátka reaktivnís tímto peptidem a diagnostická testovací souprava

Country Status (21)

Country Link
US (1) US6495138B1 (cs)
EP (2) EP1882696A3 (cs)
JP (1) JP2000512313A (cs)
KR (1) KR100388257B1 (cs)
CN (1) CN1259141B (cs)
AT (1) ATE365746T1 (cs)
AU (1) AU754938B2 (cs)
BR (1) BR9809221A (cs)
CA (2) CA2703181C (cs)
CZ (1) CZ297371B6 (cs)
DE (1) DE69837992T2 (cs)
DK (1) DK0980387T3 (cs)
ES (1) ES2289781T3 (cs)
HU (1) HU228704B1 (cs)
ID (1) ID23399A (cs)
PL (1) PL197057B1 (cs)
PT (1) PT980387E (cs)
RU (1) RU2220978C2 (cs)
SK (1) SK286063B6 (cs)
UA (1) UA73915C2 (cs)
WO (1) WO1998050426A1 (cs)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6592873B1 (en) 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US5695766A (en) * 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6773908B1 (en) 1992-10-30 2004-08-10 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6380376B1 (en) * 1992-10-30 2002-04-30 Iowa State University Research Foundation Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
EP0839912A1 (en) * 1996-10-30 1998-05-06 Instituut Voor Dierhouderij En Diergezondheid (Id-Dlo) Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
US20040224327A1 (en) * 1996-10-30 2004-11-11 Meulenberg Johanna Jacoba Maria Infectious clones of RNA viruses and vaccines and diagnostic assays derived thereof
WO2000053787A1 (en) * 1999-03-08 2000-09-14 Id-Lelystad, Instituut Voor Dierhouderij En Dierg Ezondheid B.V. Prrsv vaccines
DE19850718C1 (de) * 1998-11-03 2000-05-18 Hildt Eberhardt Zellpermeabilität-vermittelndes Polypeptid
DK1183332T3 (da) 1999-04-22 2010-09-06 Us Agriculture Porcint Reproduktions- og Respirations Syndrom-vaccine baseret på isolere JA-142
CZ20032743A3 (cs) * 2001-03-09 2004-02-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Atenuované kmeny viru PRRS
US7335361B2 (en) * 2003-06-09 2008-02-26 Animal Technology Institute Taiwan Fusion antigen used as vaccine
BRPI0510928A (pt) 2004-06-18 2007-11-13 Univ Minnesota identificação de organismos viralmente infectados e vacinados
US7632636B2 (en) 2004-09-21 2009-12-15 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome isolates and methods of use
KR20130105750A (ko) * 2005-02-25 2013-09-25 아이덱스 래보러토리즈, 인코포레이티드 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스에 대한 항체를 검출하기 위한 펩티드
UA95778C2 (ru) 2005-06-24 2011-09-12 Риджентс Оф Зе Юниверсити Оф Миннесота Вирусы репродуктивно-респираторного синдрома свиней, их инфекционные клоны и мутанты и способы применения
EP1962900A2 (en) 2005-11-29 2008-09-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Identification of protective antigenic determinants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv) and uses thereof
WO2007065151A2 (en) * 2005-12-02 2007-06-07 Iowa State University Research Foundation, Inc. Differential immunoassay for prrs vaccine antibody
UA106475C2 (uk) * 2008-08-25 2014-09-10 Берингер Ингельхайм Ветмедика, Инк. Спосіб вакцинації свині проти високопатогенного репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (hp prrs)
KR101101386B1 (ko) * 2008-12-04 2012-01-02 주식회사 바이오리쏘스 북미형 ｐｒｒｓｖ에 특이적인 면역원성 펩티드 및 그의 용도
TWI627281B (zh) 2009-09-02 2018-06-21 百靈佳殷格翰家畜藥品公司 降低ｐｃｖ－２組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之ｐｃｖ－２組合物
CA2800824A1 (en) * 2010-06-02 2011-12-08 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Novel modified live-attenuated vaccines (mlv) and subunit vaccines created by dna shuffling against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)
CN101885759B (zh) * 2010-06-25 2013-01-09 国家兽用生物制品工程技术研究中心 一种特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽及其筛选方法和应用
MY186535A (en) 2011-02-17 2021-07-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Novel european prrsv strain
WO2012110490A1 (en) 2011-02-17 2012-08-23 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Commercial scale process for production of prrsv
US9315781B2 (en) 2011-07-29 2016-04-19 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Infectious CDNA clone of european PRRS virus and uses thereof
US9187731B2 (en) 2011-07-29 2015-11-17 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh PRRS virus inducing type I interferon in susceptible cells
MX358912B (es) * 2011-12-30 2018-09-07 United Biomedical Inc Vacuna de marcadores basados en péptidos sintéticos y sistema de diagnóstico para el control efectivo del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (prrs).
KR101430223B1 (ko) * 2012-10-09 2014-09-25 전북대학교산학협력단 면역유도능이 증가된 돼지생식기호흡기증후군 바이러스
CN103421817B (zh) * 2012-10-15 2016-01-13 华中农业大学 人工合成的猪繁殖与呼吸综合征病毒多表位基因及应用
MX366051B (es) 2012-12-07 2019-06-26 Univ Illinois Composiciones del virus del síndrome reproductor y respiratorio de porcino y sus usos.
CN103059142B (zh) * 2012-12-17 2015-02-25 重庆市畜牧科学院 猪圆环病毒的抗原和猪繁殖与呼吸综合征病毒的抗原的重组蛋白及其制备方法与应用
EP2968513A2 (en) 2013-03-15 2016-01-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, compositions, vaccine and methods of use
EP2804000A1 (en) * 2013-05-15 2014-11-19 Prionics AG Method for the detection and classification of PRRSV-infections in swine herds and diagnostic antigen compositions for such methods
DK3083947T3 (da) 2013-12-20 2019-07-08 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prrs-virusvariant, cdna-klon af europæisk prrs-virus, samt anvendelser deraf
US10072046B2 (en) 2014-03-21 2018-09-11 Nutech Ventures Non-naturally occurring porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and methods of using
EA201890110A1 (ru) 2015-06-23 2018-05-31 Мериал, Инк. Рекомбинантные вирусные векторы, содержащие минорные белки prrsv, и способы их получения и применения
CN106442968B (zh) * 2016-09-21 2018-03-06 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 猪繁殖与呼吸综合征血清学鉴别诊断试剂盒
CN109022613A (zh) * 2018-04-24 2018-12-18 上海申亚动物保健品阜阳有限公司 一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒及检测方法
KR102138287B1 (ko) * 2018-08-07 2020-07-29 대한민국 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 유전형별 재조합 항원 단백질 및 이의 용도
KR102091279B1 (ko) * 2018-08-07 2020-03-20 대한민국 돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 진단용 재조합 항원 단백질 및 이의 용도
CN110894243B (zh) * 2019-12-16 2021-07-13 中国农业大学 一种猪蓝耳病毒嵌合抗原以及检测猪蓝耳病毒抗体的胶体金免疫层析试纸条
CN112458115B (zh) * 2020-10-21 2022-06-07 天津农学院 一种基因构建重组质粒pEGFP-GRE-GP5gB及应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0587780B2 (en) 1991-06-06 2008-08-20 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Causative agent of the mystery swine disease, vaccine compositions and diagnostic kits
WO1993003760A1 (en) 1991-08-26 1993-03-04 James Edward Collins Sirs vaccine and diagnosis method
CA2076744C (en) 1991-08-26 2000-06-27 Danny W. Chladek Viral agent associated with mystery swine disease
US5846805A (en) 1991-08-26 1998-12-08 Boehringer Ingelheim Animal Health, Inc. Culture of swine infertility and respiratory syndrome virus in simian cells
JPH07501049A (ja) 1991-10-14 1995-02-02 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー ブタ生殖・呼吸系症候群ワクチン及び診断方法
US5695766A (en) 1992-10-30 1997-12-09 Iowa State University Research Foundation Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses which produce lesions in pigs and vaccines that protect pigs against said syndrome
US6592873B1 (en) * 1992-10-30 2003-07-15 Iowa State University Research Foundation, Inc. Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
US6251397B1 (en) * 1992-10-30 2001-06-26 Iowa State University Research Foundation, Inc. Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
ES2152304T3 (es) 1993-02-08 2001-02-01 Bayer Ag Procedimiento para el crecimiento del virus del sindrome reproductivo y respiratorio porcino y su uso en vacunas.
ES2074950B1 (es) 1993-09-17 1996-03-16 Iberica Cyanamid Vacuna para la prevencion de la enfermedad reproductiva y respiratoria de la cerda.
GB2289279B (en) * 1994-05-13 1998-09-16 Iberica Cyanamid Diagnostic kits and vaccines containing recombinant PRRSV proteins
DE69535061T2 (de) * 1994-08-05 2007-01-25 Regents Of The University Of Minnesota, Minneapolis Virale nukleotidsequenz vr-2332 und nutzungsverfahren
US5690940A (en) 1995-06-21 1997-11-25 Regents Of The University Of Minnesota Low pathogencity PRRS live virus vaccines and methods of preparation thereof
ES2122921B1 (es) * 1996-12-30 1999-09-16 Inmunologia & Genetica Aplic Proteinas recombinantes de fusion del virus reproductivo y respiratorio porcino (prrsv) y su empleo en diagnostico.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2289980A1 (en) 1998-11-12
DK0980387T3 (da) 2007-10-22
CA2703181A1 (en) 1998-11-12
ATE365746T1 (de) 2007-07-15
EP1882696A2 (en) 2008-01-30
AU754938B2 (en) 2002-11-28
EP0980387B1 (en) 2007-06-27
SK286063B6 (sk) 2008-02-05
PL336714A1 (en) 2000-07-03
WO1998050426A1 (en) 1998-11-12
BR9809221A (pt) 2000-07-04
US6495138B1 (en) 2002-12-17
CN1259141B (zh) 2013-03-27
SK152699A3 (en) 2000-08-14
HU228704B1 (en) 2013-05-28
EP1882696A3 (en) 2008-03-05
HUP0002176A2 (hu) 2000-11-28
CN1259141A (zh) 2000-07-05
ID23399A (id) 2000-04-20
RU2220978C2 (ru) 2004-01-10
EP0980387A1 (en) 2000-02-23
UA73915C2 (uk) 2005-10-17
KR20010012337A (ko) 2001-02-15
PT980387E (pt) 2007-07-31
HUP0002176A3 (en) 2001-09-28
DE69837992T2 (de) 2008-03-20
CZ297371B6 (cs) 2006-11-15
DE69837992D1 (de) 2007-08-09
PL197057B1 (pl) 2008-02-29
CA2289980C (en) 2010-07-20
ES2289781T3 (es) 2008-02-01
CA2703181C (en) 2016-06-28
AU7457198A (en) 1998-11-27
JP2000512313A (ja) 2000-09-19
KR100388257B1 (ko) 2003-06-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ9903932A3 (cs) Peptid vyvolávající tvorbu neutralizujících protilátek, imunogenní prostředek, vakcína, syntetická protilátka, diagnostická souprava, jejich použití a způsob testování výskytu PRRS viru u prasat
US7264802B2 (en) Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
Meulenberg et al. Characterization of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus
US6251397B1 (en) Proteins encoded by polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus and immunogenic compositions containing the same
US6977078B2 (en) Proteins encoded by polynucleic acids of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)
US6592873B1 (en) Polynucleic acids isolated from a porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and proteins encoded by the polynucleic acids
Meulenberg et al. Localization and fine mapping of antigenic sites on the nucleocapsid protein N of porcine reproductive and respiratory syndrome virus with monoclonal antibodies
US6410031B1 (en) Attentuated porcine reproductive and respiratory syndrome virus strain and method of use
Faaberg Arterivirus structural proteins and assembly
MXPA99010185A (en) Prrsv antigenic sites identifying peptide sequences of prrs virus for use in vaccines or diagnostic assays

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20180505