CN101885759B - 一种特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽及其筛选方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及特异性结合PRRSV的多肽及其筛选方法，属动物病毒学领域。该多肽为His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser；本发明还提供该多肽筛选方法：获得纯病毒；采用噬菌体随机肽库筛选出能与PRSSV有很高亲和力的噬菌体单克隆，并测序。检测各噬菌体单克隆对PRRSV的抑制能力，选取能明显抑制PRRSV复制的噬菌体单克隆，所含多肽就是目的多肽。所述多肽能应用于PRRSV的检测；可以将该多肽用FITC标记后用于检测PRRSV。本发明筛选多肽的方法，周期短，操作简单，与制作单克隆抗体的方法相比，更为方便快捷；筛选到的多肽能用于检测PRRSV，操作简单，具有高特异性和很高的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽及通过筛选获得该多肽的方法，属动物病毒学领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)引起猪的一种传染性疾病，其症状主要特点为怀孕母猪发生流产、早产、死胎或木乃伊胎等严重的繁殖障碍，仔猪与育肥猪出现呼吸道症状。我国于1995年底暴发此病，目前此病已成为危害我国养猪业的最主要疫病。人们对PRRSV结构蛋白及非结构蛋白的功能、病毒的致病机制、病毒的持续感染机制、机体对病毒的免疫机制等进行了深入的研究。PRRSV感染猪体的巨噬细胞系统，引起机体的细胞免疫功能低下，而体液免疫产生的高水平抗体不但不能中和病毒，在一定程度上还加深了病毒的感染。本病尚无特效治疗药物，在临床上只能采取防止继发感染和降温及补充能量与营养等辅助治疗。
噬菌体展示技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术。Smith于1985年首次成功将外源基因通过基因工程手段插入丝状噬菌体基因组中，使表达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示在噬菌体表面，从而建立了噬菌体展示技术。用抗原去淘洗抗体或随机多肽构成的噬菌体展示文库，根据抗原-抗体反应原理，可以将与抗原紧密结合的抗体或多肽片段筛选出来。
目前，利用多克隆抗体进行间接免疫荧光检测PRRSV，操作步骤繁琐，特异性不强，灵敏度不高。
发明内容
本发明提供一种能特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽、筛选该多肽的方法和该多肽的应用。
本发明提供一种能与猪繁殖与呼吸综合症病毒特异性结合的多肽，其氨基酸序列如下：
His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser
本发明还提供所述特异性结合多肽的筛选方法，包括如下步骤：
(1)纯化PRRSV获得纯病毒；然后进行噬菌体随机肽库筛选，通过三轮筛选富集能与PRRSV特异性结合的噬菌体。
(2)将第三轮筛选产物稀释后铺平皿，挑取各噬菌体单克隆进行ELISA鉴定，筛选出能与PRSSV有很高的亲和力的噬菌体单克隆，并测出噬菌体单克隆的序列。
(3)检测由步骤(2)所得各序列的噬菌体单克隆对PRRSV的抑制能力，选取能明显抑制PRRSV复制的噬菌体单克隆，展示于该噬菌体单克隆表面的多肽即为能与特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的多肽。
所述的多肽在猪繁殖与呼吸综合症病毒检测中的应用，优选方案是，将所述多肽采用FITC进行标记，然后应用于猪繁殖与呼吸综合症病毒的检测。
综上所述，本发明通过筛选噬菌体随机12肽库，得到能特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的噬菌体，再从该噬菌体中筛选出能够抑制病毒复制的噬菌体单克隆，该噬菌体展示的多肽即能高效检测猪繁殖与呼吸综合症病毒。
本发明采用噬菌体展示技术筛选获得可特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽，该方法周期短，操作简单，与目前采用制作单克隆抗体的方法相比，更为方便，快捷；筛选到的多肽能够特异性的结合猪繁殖与呼吸综合症病毒，用于检测PRRSV，操作简单，具有高特异性和很高的灵敏度。
附图说明
图1表示噬菌体与PRRSV结合特异性ELISA检测结果；
图2为FITC标记的多肽检测PRRSV的图示。
具体实施方式
实旅例1筛选与猪繁殖与呼吸综合症病毒特异性结合的噬菌体
1.PRRSV病毒的纯化
细胞方瓶中培养Marc-145细胞，37℃培养36小时加入PRRSV液500μL，用2％(v/v)小牛血清的DMEM培养液(美国Gibcol公司)在37℃、5％CO2条件下培养，出现典型病变时，将培养病毒-20℃冻存。将冻存的PRRSV培养细胞反复冻融3次，5000转离心10分钟，取上清，向其中加入10％(10g/100mL)的PEG-8000(Sigma公司)4℃过夜。14000转离心20分钟沉淀PRRSV。沉淀悬于PBS缓冲液得到PRRSV悬液，-80℃保存，留作病毒TCID50测定。用NTE缓冲液制备蔗糖梯度(30％、45％、60％)，将PRRSV悬液缓慢加入梯度上面，35000转(L902K超高速离心机，美国Beck-man)4℃，离心3小时，吸取45％至60％之间的可见区带，-80℃速冻保存。蔗糖梯度离心所得的PRRSV悬液，用PBS透析去蔗糖，PEG20000浓缩，获得纯病毒，分装到1.5mL离心管，-80℃保存。采用紫外分光法，测定样品蛋白浓度。
2.噬菌体随机肽库筛选
2.1第一轮筛选——PRRSV筛选噬菌体随机肽库
在150μL包被液中加入2μL纯病毒，包被96孔酶标板，置于潮湿环境中于4℃过夜。次日倾去包被液，每孔加入200μL浓度为10mg/mL的BSA封闭液，37℃封闭2小时。倾去封闭液，用TBST(TBS+0.1％(v/v)Tween-20)洗涤6次，加入1.5×1011个(100μL TBST中)噬菌体(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit，购自NewEngland Biolabs公司)，37℃反应60分钟。倾去噬菌体，用TBST洗10次，加入100μL洗脱液，轻摇洗脱至多10分钟，将洗脱物转至1.5mL离心管中，立刻加入15μL浓度为1M的Tris-HCl(pH9.1)中和，即为第一轮洗脱产物(筛选产物)。取10μL洗脱产物进行滴度测定，剩余洗脱物加入20mL对数生长早期(OD600～0.3)的宿主菌ER2738(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit，购自New England Biolabs公司)中，37℃培养4.5小时，10000转离心10分钟，取上清，再离心一次，取80％上清至50mL离心管中，加入1/6体积PEG-NaCl，4℃沉淀过夜。次日10000转离心15分钟，取沉淀，用1mLTBS悬浮，转到1.5mL离心管中，离心5分钟去掉残余的细胞碎片，将上清转至一新管中，加1/6体积PEG-NaCl沉淀1小时，离心1分钟，取沉淀，用200μL TBS，0.02％(质量浓度)NaN3悬浮，离心1分钟去掉未溶的残渣，将上清转至一新管中，即为第一轮洗脱产物的扩增液。
2.2噬菌体滴度测定
将步骤2.1获得的第一轮洗脱产物的扩增液做10-8～10-11(洗脱产物10-1到10-4)四个连续10倍稀释后，取10μL加入到200μL过夜培养的ER2738宿主菌，室温作用5分钟，然后加入到3mL 60℃预热的顶琼脂中，快速铺于LB/IPTG/X-gal平皿上，37℃培养过夜，对蓝斑进行记数，算出噬菌体滴度。
2.3进一步筛选
重复步骤2.1和2.2的方法再进行两轮筛选，每次的筛选对象为上一轮洗脱产物或其扩增液，所用噬菌体含量为1.5×1011PFU(利用噬菌体滴度算出所需扩增产物的体积)，但是将筛选过程中用到的TBST中Tween-20的含量提高到0.5％(v/v)。第三轮筛选产物不做扩增，直接测定滴度，挑选单克隆用于ELISA鉴定。
噬菌体随机肽库筛选结果如下表：
上表表示，三轮筛选的靶分子(PRRSV)的用量从30μg降低到1μg，而所得噬菌体的产出与投入比例却从10-6量级提高到10-4量级，说明通过筛选有效地富集了针对PRRSV特异性结合的噬菌体。
本实施例中所采用的试剂配方如下：
包被液：0.1M的NaHCO3(pH8.6)溶液。
封闭液：0.1M的NaHCO3(pH8.6)溶液，其中含有5mg/mL BSA，0.02％NaN3，过滤除菌，4℃保存。
TBS：50mM的Tris-HCl(pH7.5)缓冲液，其中含有浓度为150mM的NaCl，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。
洗脱液：0.2M的甘氮酸-盐酸(pH2.2)缓冲液。
PEG-NaCl：浓度为2.5M的NaCl溶液，含有浓度为20％(w/v)的聚乙二醇8000，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。
LB培养基：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，加水至1L，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。
LB/IPTG/X-gal平皿：在LB培养基中添加琼脂粉至浓度为15g/L，121℃高温灭菌30分钟，冷却到＜70℃，加入IPTG和X-gal使IPTG终浓度为0.05mg/mL，X-gal终浓度为0.04mg/mL。4℃避光保存。
顶琼脂(Agarose Top)：10g胰化蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，1gMgCl·6H2O，7g琼脂糖。121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。
NTE缓冲液：50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)，含有150mmol/L的NaCl，1mmol/L的EDTA。
实施例2 筛选到的噬菌体与PRRSV结合特性的鉴定
1.挑单克隆进行ELISA鉴定
将实施例1中的第三轮筛选产物(洗脱产物)稀释后铺平皿，挑取各噬菌体单克隆分别接种对数生长早期(OD600约为0.3)的ER2738(Ph.D.-12TM PhageDisplay Peptide Library Kit，购自New England Biolabs公司)中扩增4.5个小时，离心取上清，测噬菌体滴度，调整浓度为1011pfu/10μL。
将纯化的PRRSV包被ELISA板(阳性值P)，同时包被Marc-145细胞裂解上清做阴性对照(阴性值N)，4℃包被过夜，次日用封闭液4℃封闭1小时后将同一个噬菌体克隆分别加到两种包被的孔中，然后依次次叠加兔抗M13噬菌体血清和羊抗兔酶标二抗，此后洗涤、显色、终止按常规方法进行。测定450nm处的吸光值，将P/N值＞3的判为阳性克隆。此实验中，还需要设置野生型噬菌体对照。
从检测结果中挑取17个阳性结果，以一个野生型噬菌体作为对照，结果如图1所示：图1中，C是野生型噬菌体对照，N是噬菌体克隆针对Marc-145裂解上清包被的阴性值，以白色柱表示；P是噬菌体克隆针对PRRSV的阳性值，以黑色柱表示；P/N值＞3。筛选到的克隆与PRSSV有很高的亲和力。
实验中用到的试剂按照如下方法配制：
包被液：0.1M的NaHCO3(pH8.6)；
封闭液：0.1M的NaHCO3(pH8.6)，含有浓度为5mg/mL的BSA；
洗涤液：50mM的Tris-HCl(pH7.5)，含有浓度为150mM的NaCl和0.5％(v/v)的Tween-20；
底物液：底物液A：0.006％(v/v)H2O2缓冲液；底物液B：取Na2HPO4·12H2O14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1M磷酸盐柠酸级冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(T′MB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。
终止液：2M H2SO4。
2.阳性噬菌体的测序
取步骤1得到的阳性噬菌体克隆上清500μL加入200μL的PEG-NaCl溶液，颠倒混匀，室温静置10分钟，离心10分钟，去上清，瞬离一下，用枪头将残余上清吸干，用100μL的Iodide Buffer溶解沉淀，再加入250μL无水乙醉，室温孵育10分钟，离心10分钟，去上清，70％(v/v)乙醇洗，真空干燥后用30μL的TE缓冲液溶解，即得测序模板。
使用自动测序仪进行测序，测序引物(Ph.D.-12TM Phage Display PeptideLibrary Kit，购自New England Biolabs公司)如下：5’-CCC TCA TAG TTA GCGTAA CG-3’。
对17个阳性克隆进行序列测定，结果如下表所示：
从表中可见，克隆9和12为同一序列；克隆4、8、13和14为同一序列；表中“共有序列”栏内所列的HWW、GWW、QSS、SLT等，表示其为多个噬菌体克隆所共有的基序。
本实施例中使用的试剂配方如下：
Iodide Buffer：浓度为10mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，含有浓度为1mM的EDTA，浓度为4M的NaI，室温(25℃)避光保存。
PEG-NaCl：浓度为2.5M的NaCl溶液，含有浓度为20％(w/v)聚乙二醇8000，121℃高温灭菌30分钟，室温(25℃)保存。
TE缓冲液：浓度为10mM的Tris-HCl(pH8.0)缓冲液，含有浓度为1mM的EDTA，室温(25℃)保存。
实施例3 阳性噬菌体对PRRSV的抑制能力的检测
1.阳性噬菌体克隆的扩增
取实施例2步骤1得到的阳性噬菌体克隆上清5μL，加入到20mL对数生长早期(OD600～0.3)的宿主菌ER2738(Ph.D.-12TM Phage Display Peptide Library Kit，购自New England Biolabs公司)中，扩增4小时，10000转离心10分钟，取上清，用PEG-NaCl溶液沉淀两次，最后用200μL的TBS溶解，得到扩增的阳性噬菌体克隆，再检测它的滴度，方法同实施例1中步骤2.2的操作。
2.半数组织感染量(TCID50)的测定
预先接种Marc-145细胞于96孔板中，待单层细胞贴壁铺满孔的80％，将10μL的1.0×1011PFU的噬菌体与90μL的10倍连续梯度稀释的PRRSV混合，感染96孔板中培养的细胞。37℃孵育1小时后弃感染液，用基础培养基洗3次，去除游离的病毒粒子。加入2％小牛血清的DMEM培养液37℃继续培养，连续4天观察记录病变，并按Reed and Munch公式计算各组的TCID50，实验结果如下表。
表中可见11个展示不同多肽序列的噬菌体克隆对PRRSV复制能力(TCID50)的影响，其中，噬菌体克隆2、4体外能明显抑制PRRSV的复制，使TCID50由10-7.2/0.1mL分别降至10-3.2、10-3.6/0.1mL，其余克隆能够抑制病毒复制，但效果不明显。
实施例4 FITC标记短肽检测PRRSV
1、FITC标记段肽的人工合成
综合比较ELISA、TCID50检测结果，选取噬菌克隆Ph.D-PRRSV-4，其展示的短肽序列为His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser，因此人工合成短肽：His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser-FITC。
2、直接免疫荧光检测PRRSV
Marc-145细胞在24孔细胞培养板上以5.0×106个细胞/孔铺板，24h长成单层细胞后每孔加入200个TCID50的PRRSV病毒，另留两个孔作为对照，继续培养48h至明显病变。弃掉培养液后用PBS冲洗3次，乙醇固定10min，PBS冲洗3次。0.3％(v/v)Triton裂解5min，PBS冲洗3次，加入FITC标记的多肽于37℃孵育1h，PBS冲洗3次，荧光显微镜观察。结果如图2所示：该多肽在5μg/mL浓度时就能在Marc-145细胞对PRRSV进行检测。图2的A图可见细胞表面有荧光信号，这是由于细胞固定后经Triton处理，其表面膜解构被破坏，多肽分子可以渗透到细胞内部与病毒粒子结合，故在细胞内部也有可见的荧光信号；图2的B图为细胞对照，没有可见荧光。
Claims (1)
1.一种特异性结合猪繁殖与呼吸综合症病毒的多肽，其氨基酸序列如下：His Trp Trp Ser Trp Pro Ser Tyr Thr Gln Ser Ser。
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