TW201522643A - 豬生殖與呼吸道症候群病毒、組合物、疫苗及使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於具有增加穩定性之豬生殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)突變株；含有病毒株或其所衍生之抗原之組合物；含有該等病毒株之疫苗，包括滅活、減毒或次單位疫苗；編碼PRRSV多肽之核酸、由該等核酸編碼之多肽，包括其抗原片段；與該等多肽特異性結合之抗體，及其製造與使用方法。

Description

豬生殖與呼吸道症候群病毒、組合物、疫苗及使用方法 序列表

本申請案包含序列表，其已根據37 C.F.R.1.821-1.825以ASCII的格式以電子方式呈送。於2014年1月29日所產生的該ASCII複本名為10-0145-WO-1-SEQ.txt，其大小為124,804位元組。伴隨本申請案的序列表全部併入本文以供參考。

本發明係關於豬生殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)組合物及相關方法。

儘管大量努力針對病原體消除及控制策略，但養豬業仍因PRRSV而持續經歷主要的經濟損失。PRRSV係一種分類為套式病毒目(order Nidovirales)、動脈炎病毒科(family Arteriviridae)及動脈炎病毒屬(genus Arterivirus)之包膜單股正義RNA病毒。該病毒導致豬生殖與呼吸道症候群(PRRS)，且亦稱為神秘豬病(Mystery Swine Disease)及SIR。PRRS之症狀包括育種雌性生殖失敗及生長期豬之呼吸道疾病。生殖失敗與中後期流產、木乃伊胎與弱出生仔豬數量增加及健康出生仔豬較少相關。PRRSV之特徵亦在於通常由顯微鏡可見之如同間質性肺炎之厭食、發熱及呼吸道疾病。因此，感染PRRSV對獸群之生產率可具有顯著之負面效應。據估計，PRRSV每年使美國養豬業耗費約5億6千萬美元。複合情形係PRRSV在大多數豬生產國具地方性且在 其他地方具有類似經濟效應的事實。

目前用於預防病毒在獸群內及其之間傳播的控制策略包括：適當管理育種動物、移除受感染個體、嚴格生物安全措施(包括空氣過濾系統)、血清接種及使用疫苗。失活與改質(減毒)活疫苗兩者均有市售。失活疫苗產生高水準安全性，但一般認為無效或傳遞極有限程度之功效。減毒活疫苗已廣泛用於減少由野生型PRRS病毒引起之傳播及臨床疾病。儘管改質活疫苗之功效可針對異源分離株而變化，但其仍為可用於對抗疾病之最佳疫苗接種選擇。

如同已報導疑似恢復毒性之若干種情形，減毒疫苗不帶有任何風險。因此，新的疫苗需要能夠提供充分免疫保護以減少傳播及臨床疾病，同時亦展現高度安全性及對遺傳改變之抗性。

為增加遺傳穩定性，已研發在nsp2(非結構蛋白質2)區具有源自細胞繼代之缺失的病毒。nsp2蛋白質係最大之PRRSV蛋白質、具高度抗原性且具有最高遺傳多樣性之PRRSV基因體。缺失突變之值源自其所賦予之穩定性增加。較短之序列導致恢復毒性之可能性較小。缺失部分將需要插入以回復其初始狀態，此比簡單取代回到初始毒性形式更不可能發生。

本發明提供克服此項技術之缺陷之免疫原性組合物、疫苗及相關方法。該等組合物及方法尤其提供遺傳穩定之PRRSV之免疫原性缺失突變體，由其可製得疫苗，包括減毒全病毒疫苗及多肽次單位疫苗，其中該等疫苗賦予對由PRRSV感染引起之臨床疾病之免疫性、對此疾病之保護抗性、減少此疾病之傳播及/或減少此疾病。

本發明之例示性免疫原性組合物包含由SEQ ID NO：1(PRRSV之預減毒Wetzel分離株)及SEQ ID NO：2(Wetzel分離株之減毒形式)之核苷酸序列編碼之多肽序列中之任一者或其片段，尤其為與其所源自之全長PRRSV蛋白質相比具有類似免疫原性特異性之在生物學或功能上 (例如在免疫學上)具有活性之片段。彼等多肽較佳具有免疫原性且在投予多肽之動物體內誘發對PRRS病毒之免疫反應性反應，該反應對PRRSV具免疫保護性。

在另一態樣中，本發明提供編碼一或多種多肽、抗體構建體或抗體結合物之核酸序列，包括DNA與RNA序列。編碼多肽之基因序列包含與Wetzel p3 ORF1a(SEQ ID NO：3)、Wetzel p3 ORF1b(SEQ ID NO：4)、Wetzel p3 GP2(SEQ ID NO：5)、Wetzel p3 GP3(SEQ ID NO：6)、Wetzel p3 GP4(SEQ ID NO：7)、Wetzel p3 GP5(SEQ ID NO：8)、Wetzel p3 M(SEQ ID NO：9)、Wetzel p3 N(SEQ ID NO：10)、Wetzel p41 ORF1a(SEQ ID NO：11)、Wetzel p41 ORF1b(SEQ ID NO：12)、Wetzel p41 GP2(SEQ ID NO：13)、Wetzel p41 GP3(SEQ ID NO：14)、Wetzel p41 GP4(SEQ ID NO：7-與p3 GP4序列相同)、Wetzel p41 GP5(SEQ ID NO：15)、Wetzel p3 M(SEQ ID NO：9-與p3 M序列相同)及Wetzel p3 N(SEQ ID NO：10-與p3 N序列相同)之核酸序列至少95%、90%、85%或甚至80%同源及/或相同之核酸序列，或其對豬生殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)具免疫反應性或免疫原性之片段。與以上序列互補之核酸序列係本發明之另一態樣。

此外，如本文所用之本發明之多肽包括(但不限於)包含以下之多肽：i)包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列之多肽；ii)與i)之多肽至少95%同源及/或相同之多肽；iii)i)及/或ii)之多肽之片段；iv)i)或ii)之多肽，或包含i)之多肽中任一者之胺基酸基元或免疫原性抗原決定基的iii)之片段； v)包含至少5個、較佳8個、更佳10個、甚至更佳15個或15個以上在i)之序列中所包括之鄰接胺基酸的iii)或iv)之片段；vi)由包含SEQ ID NO：1(預減毒Wetzel)或SEQ ID NO：2(減毒Wetzel)之序列的聚核苷酸編碼之多肽；vii)由與vi)之聚核苷酸至少95%同源或相同之聚核苷酸編碼之多肽；或viii)由包含至少15個、較佳24個、更佳30個、甚至更佳45個或45個以上在SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之序列中所包括之鄰接核苷酸的聚核苷酸編碼之蛋白質片段。

包含至少一或多種如本文所定義之PRRSV多肽、滅活或減毒病毒或基於DNA或RNA之疫苗(例如編碼該等免疫原)的本發明之免疫原性組合物可另外包含生理學上可接受之媒劑，諸如醫藥學或獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。

本文所提供之任何PRRSV多肽或本文所提供之包含一或多種該等PRRSV多肽之任何免疫原性組合物均可用作藥物，較佳用作疫苗或免疫原性組合物，最佳用於預防或治療個體抵抗PRRS感染。

熟習此項技術者將瞭解本文所用之組合物可併有已知可注射之生理學上可接受之無菌溶液。為製備用於非經腸注射或輸注之即用型溶液，隨時可用等張水溶液，例如鹽水或血漿蛋白質溶液。另外，本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括獸醫學上可接受之載劑、稀釋劑、等張劑、穩定劑或佐劑。

本發明之方法包括(但不限於)在個體體內引發針對PRRSV感染之免疫反應的方法，其包含向個體投予如本文所定義之包含一或多種PRRSV多肽之免疫原性組合物的步驟。較佳引發針對PRRSV之一種以上血清型或病毒株之免疫反應。本發明之組合物可用於治療或者預防PRRSV感染。該免疫反應較佳減小與一或多種PRRSV血清型感染 相關或由其引起之一或多種臨床徵象的發生率或嚴重性。

在本文中，適合之個體及需要投予本發明組合物之個體包括需要預防或治療與病毒、微生物、寄生蟲、原蟲、細菌或真菌相關之感染、疾病或病況之動物。藉由使用本發明之組合物或方法刺激免疫反應之動物包括家畜(諸如豬、牛、家禽(例如，雞、鴨、鵝或火雞)、山羊及綿羊)及家養動物(諸如小鼠、兔、狗、貓及馬)。較佳動物包括豬。

本發明亦提供一種減小與PRRSV感染相關或由其引起之一或多種臨床徵象之發生率或嚴重性的方法，其包含投予包含如本文所提供之一或多種PRRSV肽且較佳包含載劑分子的本發明之免疫原性組合物的步驟，以使得PRRSV感染之臨床徵象的發生率或嚴重性相對於未接受如本文所提供之免疫原性組合物的個體而言減小至少10%、較佳至少20%、甚至更佳至少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。該等臨床徵象包括育種雌性生殖失敗及生長期豬之呼吸道疾病。生殖失敗與中後期流產、木乃伊胎與弱出生仔豬數量增加及健康出生仔豬較少相關。PRRSV之特徵亦在於通常由顯微鏡可見之如同間質性肺炎之厭食、發熱及呼吸道疾病。

根據另一態樣，本發明亦係關於一種預防PRRSV感染之方法，其中該PRRSV感染可由血清型PRRSV或任何其他血清型之PRRSV引起，其包含投予如本文所提供之包含一或多種PRRSV肽的本發明之免疫原性組合物之步驟。

本發明亦提供一種製備本文所提供之任何免疫原性組合物之方法，彼方法包含將如本文所提供之一或多種PRRSV肽與載劑分子混合，較佳使得一或多種PRRSV肽與載劑分子彼此共價偶合或結合。該等結合物可為多價或單價的。多價組合物或疫苗包括多種PRRSV肽與載劑分子之免疫結合。在另一態樣中，本發明提供一種產生一或多種PRRSSSV肽之方法，彼方法包含以編碼如本文所提供之任何PRRSV 肽之核酸分子轉型宿主細胞，較佳為原核細胞，諸如大腸桿菌(E.coli)。或者，宿主細胞可為真核細胞，諸如動物細胞、原生生物細胞、植物細胞或真菌細胞。真核細胞較佳為哺乳動物細胞(諸如CHO、BHK或COS)或真菌細胞(諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))或昆蟲細胞(諸如Sf9)。

本發明之另一態樣提供一種產生一或多種PRRSV肽之方法，該(等)PRRSV肽誘發針對至少一種血清型之PRRSV且更佳兩種或兩種以上血清型之PRRSV的免疫反應。此方法包含培養編碼且表現本文所揭示之一或多種PRRSV肽之轉型表現載體。該等表現蛋白質由表現生物體保留或經分泌至培養基中。在足以產生能夠誘發對PRRSV之免疫反應之PRRSV肽的條件下進行表現。

本發明之又一態樣係包含基於DNA及/或RNA之疫苗的組合物及製造與投予該等疫苗之方法，包括編碼賦予免疫性之多肽(「免疫原性多肽」)之核酸(或聚核苷酸)或其中該核酸本身係免疫原。製造及使用該等基於DNA及/或RNA之疫苗的方法在此項技術中係熟知的。

製造本發明組合物之方法可另外包含將一或多種PRRSV抗原與載劑分子之結合物與生理學上可接受之媒劑(諸如醫藥學或獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合)混合。熟習此項技術者將意識到媒劑、佐劑或組合之選擇將尤其由傳遞途徑、個人喜好及動物種類來決定。

在另一態樣中，本發明提供一種診斷個體之PRRSV感染的方法。彼方法包含提供一或多種PRRSV肽；使該一或多種PRRSV肽與由個體獲得之樣本接觸；且若在樣本中偵測到能夠結合該一或多種PRRSV肽之抗體，則確定該個體患有PRRSV感染。

在另一方面，本發明提供一種確定個體先前已暴露於PRRSV感染且能夠對PRRSV表現免疫反應之方法。彼方法包含提供一或多種PRRSV肽；使該一或多種PRRSV肽與由個體獲得之樣本接觸；且若 在樣本中偵測到能夠結合該一或多種PRRSV肽之抗體，則確定該個體患有PRRSV感染。

本發明亦提供套組，其包含含有一或多種PRRSV肽較佳與載劑分子一起之免疫原性組合物；一用於封裝免疫原性組合物之容器；一組印刷版說明書；及一能夠將免疫原性組合物投予動物之施配器。該一或多種PRRSV肽與載劑分子視情況可以結合物或單獨化合物之形式封裝。當單獨供應時，亦供應一種使一或多種PRRSV肽與載劑分子結合之構件以及適當之印刷版說明書。

本發明亦提供用於對動物接種疫苗之套組，其包含一組印刷版說明書；能夠將本文所提供之包含一或多種PRRSV肽之免疫原性組合物投予動物之施配器；且其中至少一種PRRSV肽使動物有效免疫以抵抗至少一種與PRRSV感染相關之疾病。該一或多種PRRSV肽較佳選自本文提供之彼等。本發明之套組可另外包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。

本發明套組中之施配器能夠以液滴形式施配其內容物；且免疫原性組合物包含套組中所包括之如本文所提供之PRRSV肽，其在經鼻內、經口、皮內或肌肉內投予至動物時能夠減小至少一種PRRSV感染臨床徵象之嚴重性。與未經治療之感染動物相比，臨床徵象之嚴重性較佳減小至少10%、較佳至少20%、甚至更佳至少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。

亦揭示治療或預防由PRRSV引起之感染之方法。該方法包含向個體投予有效量之本發明之免疫原性組合物，其中該治療或預防係選自減輕PRRSV感染徵象、減小PRRSV感染臨床徵象之嚴重性或發生率、減小個體因PRRSV感染之死亡率及其組合組成之群。

本發明之組合物另外包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。該等組合物可用作疫苗且包含減毒疫苗、失活疫苗或其組合。該 等疫苗引發針對至少一種與PRRSV相關之疾病的保護性免疫反應。

熟習此項技術者將瞭解，本文中所用之組合物可併有已知可注射之生理學上可接受之無菌溶液。為製備用於非經腸注射或輸注之即用型溶液，隨時可用等張水溶液，例如鹽水或血漿蛋白質溶液。另外，本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括醫藥學或獸醫學上可接受之載劑、稀釋劑、等張劑、穩定劑或佐劑。

本發明之方法亦可包含將本發明之組合物與獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合混合。熟習此項技術者將意識到媒劑、佐劑或組合之選擇將尤其由傳遞途徑、個人喜好及動物種類來決定。

本發明亦提供一種減小動物體內之PRRSV感染嚴重性的方法，其包含向動物投予包含來自選自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14及SEQ ID NO：15之非毒性、滅活或減毒免疫有效抗原(包括其片段)及/或其組合組成之群之病毒培養物之分離株的組合物。

亦揭示治療或預防由PRRSV引起之感染之方法。該方法包含向動物投予有效量之本發明之免疫原性組合物，其中該治療或預防係選自減輕PRRSV感染徵象、減小PRRSV感染臨床徵象之嚴重性或發生率、減小動物因PRRSV感染之死亡率及其組合組成之群。

較佳投藥途徑包括鼻內、經口、皮內及肌肉內。較佳在飲用水中投藥，最佳以單次給藥。熟習此項技術者將意識到，本發明之組合物亦可以一或兩次或兩次以上給藥以及藉由其他投藥途徑來投予。舉例而言，該等其他途徑包括皮下、皮內、靜脈內、血管內、動脈內、腹膜內、鞘內、氣管內、皮內、心內、葉內、髓內、肺內或陰道內。視治療之所需持續時間及有效性而定，可一次性或分若干次，亦間歇 性地，例如在每日之基礎上歷時若干天、數週或數月且以不同劑量來投予本發明之組合物。

本發明亦提供用於對動物接種疫苗之套組，其包含一組印刷版說明書；能夠將疫苗投予動物之施配器；及至少一種來自PRRSV或使動物有效免疫以抵抗至少一種與PRRSV相關之疾病之免疫組合物的病毒培養物的分離株。本發明之套組可另外包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。

本發明套組中之施配器能夠以液滴形式施配其內容物；且套組中所包括之分離株在經鼻內、經口、皮內或肌肉內投予至動物時能夠減小至少一種PRRSV感染臨床徵象之嚴重性。在某些套組中，分離株亦能夠減小至少一種PRRSV感染臨床徵象之嚴重性。與未經治療之感染動物相比，臨床徵象之嚴重性較佳減小至少10%。

本發明之其他目標、特徵及優勢將自以下實施方式變得顯而易見。然而應瞭解實施方式及特定實例儘管指示本發明之較佳實施例，但係僅以說明方式來給出，因為熟習此項技術者根據此實施方式將清楚瞭解本發明之主旨及範疇內之各種改變及修改。

以下圖式形成本說明書之部分且包括該等圖式以進一步說明本發明之某些態樣。可藉由參考該等圖式中之一或多者，結合本文提供之特定實施例之詳細描述來更好地理解本發明。

圖1係來自實例1之呼吸道試驗之肺病理圖表。在第14天收集豬安全研究平均肺計分值。字母「a」指示平均肺計分值高於陰性對照組，而字母「b」指示計分值低於Isolate X野生型組。

圖2係來自實例1之呼吸道試驗之IDEXX ELISA曲線圖。若(S/P)比率至少為0.4，則認為樣本對於PRRSV特異性抗體而言係陽性的。

圖3係如經由具有對於實例1所偵測之相對短期病毒血症之 AgPath-ID^TM NA與EU PRRSV Multiplex套組，由RT-PCR所測定之生殖試驗之小母豬病毒血症的曲線圖。

圖4係如經由AgPath-ID^TM NA與EU PRRSV Multiplex套組，由RT-PCR所測定之仔豬病毒血症的曲線圖。在出生時不定程度之仔豬病毒血症，繼而在來自實例1之生殖試驗之幼崽內部水平傳播。

圖5係SEQ ID NO：1(預減毒Wetzel p3)與SEQ ID NO：2(減毒Wetzel p41)之核苷酸序列(RNA病毒序列之DNA對等物)對比。

圖6係來自實例3之平均PRRSV ELISA S/P的曲線圖。

圖7係由PCR展示對於實例3之PPRSV之陽性百分比的曲線圖。

圖8展示來自實例3之以受影響百分比表示之(A)呼吸道計分值(受影響%)、(B)行為計分值(%異常)及(C)咳嗽計分值(受影響%)的曲線圖。

圖9展示來自實例3之平均直腸溫度。

圖10展示來自實例3之平均重量增加(以磅計)。

本發明提供具有增強穩定性之減毒PRRSV病毒株。特定揭示SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之多肽及其片段(包括(但不限於)上述序列中所包括之至少5個、較佳8個、更佳10個、甚至更佳15個鄰接胺基酸)。另外，多肽與上述多肽至少95%同源及/或相同。此外，亦揭示上述多肽之相關聚核苷酸。

除非另外指示，否則本發明之實踐將採用此項技術中之分子生物學、微生物學、重組DNA技術、蛋白質化學及免疫學之習知技術。該等技術在文獻中完整解釋。例如參見Sambrook,Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第I、II及III卷，第2版(1989)：DNA Cloning，第I及II卷(D.N.Glover編，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait編，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J.Higgins編，1984)；Animal Cell Culture(R.K.Freshney編，1986)；Immobilized Cells and Enzymes(IRL出版社，1986)；Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；the series,Methods In Enzymology(S.Colowick及N.Kaplan編，Academic Press,Inc.)；Protein purification methods-a practical approach(E.L.V.Harris及S.Angal編，IRL Press，Oxford University Press)；及Handbook of Experimental Immunology，第I-IV卷(D.M.Weir及C.C.Blackwell編，1986,Blackwell Scientific Publications)。

在詳細描述本發明之前，應瞭解本發明不限於特定DNA、多肽序列或方法參數，當然同樣可變化。亦應瞭解，本文所用之術語僅用於描述本發明之特定實施例之目的，且不欲限制。必須注意，如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，除非內容中另外明確指示，否則單數形式「一」及「該」包括複數提及物。因此，例如提及「抗原」包括兩種或兩種以上抗原之混合物；提及「賦形劑」包括兩種或兩種以上賦形劑之混合物及其類似物。

A.定義

除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科技術語具有與熟習本發明在申請時所屬之技術者通常所理解之相同含義。術語之含義及範疇應明確；然而，在存在任何隱含歧義之情況下，本文中所提供之定義優先於任何詞典或非固有定義。另外，除非上下文另有需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。本文中，除非另外說明，否則使用「或」意謂「及/或」。此外，使用術語「包括」不具 有限制性。本文提及之所有專利及公開案均以引用方式併入本文中。

「針對疾病之保護」、「保護性免疫」、「功能性免疫」及類似短語意謂由投予一或多種本發明之治療性組合物或其組合產生之針對疾病或病況之反應，其導致比在暴露於疾病或感染之未經免疫個體中所預期較少之有害效應。即，在經接種疫苗之個體中，感染之有害效應的嚴重性降低。在經接種疫苗之個體中，可減少、減緩或可能完全預防感染。本文中，若欲完全預防感染，則特定陳述。若未陳述完全預防，則該術語包括部分預防。

本文中，「減小臨床徵象之發生率及/或嚴重性」或「減少臨床症狀」意謂(但不限於)與野生型感染相比減少群組中受感染個體之數目、減少或消除展現感染臨床徵象之個體的數目或減小在一或多個個體中存在之任何臨床徵象的嚴重性。舉例而言，其應係指任何病原體負載減少、病原體脫落、病原體傳播減少或瘧疾之任何臨床徵象症狀減少。與未接受組合物且受感染之個體相比，該等臨床徵象在接受本發明之治療性組合物的一或多個個體中較佳減少至少10%。臨床徵象在接受本發明組合物之個體中更佳減少至少20%、較佳至少30%、更佳至少40%且甚至更佳至少50%。

術語「保護增加」在本文中意謂(但不限於)分別在接種疫苗群組之個體相對於未經接種疫苗對照組之個體中，與由感染劑(較佳為PRRSV)引起之感染相關之一或多種臨床症狀在統計學上顯著減少。術語「臨床症狀在統計學上顯著減少」意謂(但不限於)至少一種臨床症狀在接種疫苗群組之個體中的發生頻率在攻毒感染劑之後比在未經接種疫苗之對照組中低至少10%、較佳至少20%、更佳至少30%、甚至更佳至少50%且甚至更佳至少70%。

「持久保護」應係指「改良之功效」持續至少3週、但更佳至少3個月、又更佳至少6個月。在家畜之情形下，持久保護最佳應持續直 至動物作為食用肉出售之平均年齡。

「免疫原性或免疫組合物」或「疫苗」係指包含至少一種PRRSV或其免疫原性部分之物質組合物，其在對組合物具有細胞或抗體介導之免疫反應之宿主體內引發免疫反應。在本發明之一較佳實施例中，免疫原性組合物誘發免疫反應，且更佳賦予針對PRRSV感染之一或多種臨床徵象的保護性免疫。因此，該術語涵蓋如下文所述之次單位免疫原性組合物以及含有全滅活或減毒及/或失活PRRSV之組合物。

如本文所用之術語「次單位免疫原性組合物」或「次單位疫苗」係指含有至少一種免疫原性多肽或抗原之組合物，但並非所有抗原均源自來自PRRSV之抗原或與來自PRRSV之抗原同源。該組合物大體上不含完整之PRRSV。因此，「次單位免疫原性組合物」或「次單位疫苗」係由來自PRRSV之至少部分純化或分餾(較佳大體上純化)免疫原性多肽或其重組類似物來製備。次單位免疫原性組合物可包含大體上不含來自PRRSV之其他抗原或多肽或以分餾形式之所關注次單位抗原。較佳之免疫原性次單位組合物包含PRRSV蛋白質或其片段，例如併入病毒外膜中之彼等蛋白質，例如gp2、gp4、gp5及/或基質(「M」)蛋白質。亦包括作為PRRSV病毒之改質類似物的次單位免疫原性組合物，其中抗原之胺基酸序列經改質以增強穩定性或免疫原性。

如本文所用之「免疫原性」PRRSV多肽或「抗原」係指如本文所述引發免疫反應之多肽或蛋白質。「免疫原性」PRRSV蛋白質或多肽包括本文識別之任何PPRSV之全長序列或其類似物或免疫原性片段。術語「免疫原性片段」或「免疫原性部分」係指包括一或多個抗原決定基且因此引發本文所述之免疫反應的PRRSV之片段或截斷及/或取代形式。一般而言，該等截斷及/或取代形式或片段將包含至少六個來自全長PRRSV蛋白質之鄰接胺基酸。截斷或取代形式或片段更 佳將具有至少10個、更佳至少15個且又更佳至少19個或19個以上來自全長PRRSV蛋白質之鄰接胺基酸。類似物包括對分子賦予諸如穩定性或免疫原性之增強特性的抗原改質。

術語「抗原決定基」意謂由免疫系統，特定而言由抗體、B細胞或T細胞識別之物質組合物(例如，蛋白質或多肽)的區段或片段。在本發明中，抗原決定基一般係病毒蛋白質之多肽序列的片段。

該等片段可使用此項技術中熟知之任意種抗原決定基定位技術來識別。例如參見，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷(Glenn E.Morris編，1996)Humana Press,Totowa,New Jersey。舉例而言，線性抗原決定基可由在固體支撐物上同時合成大量肽(該等肽對應於蛋白質分子之部分)且使該等肽與抗體反應同時使該等肽仍與支撐物連接來確定。該等技術在此項技術中已知且有所描述，例如參見美國專利第4,708,871號；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998-4002；及Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23：709-715。類似地，構形抗原決定基易於例如藉由x-射線結晶及二維核磁共振測定胺基酸之空間構形來識別。參見上文之Epitope Mapping Protocols。合成抗原亦包括在此定義中，例如多抗原決定基、側接抗原決定基及其他重組或合成衍生之抗原。例如參見Bergmann等人(1993)Eur.J.Immunol.23：2777-2781；Bergmann等人(1996),J.Immunol.157：3242-3249；Suhrbier,A.(1997),Immunol.and Cell Biol.75：402-408；及Gardner等人，(1998)第12次世界艾滋病大會(12th World AIDS Conference)，Geneva,Switzerland,1998年6月28日-7月3日。(其教示及內容均以引用方式併入本文中。)

「免疫反應(immune response)」或「免疫反應(immunological reponse)」意謂(但不限於)對所關注之組合物或疫苗產生由細胞及/或抗體介導之免疫反應。免疫或免疫反應通常包括(但不限於)一或多種 以下效應：產生或活化抗體、B細胞、輔助T細胞、抑制T細胞及/或細胞毒性T細胞，特定而言針對所關注之組合物或疫苗中所包括之抗原。宿主較佳將展示治療性或保護性免疫(記憶)反應，以使得可增強對新感染之抗性及/或減小疾病之臨床嚴重性。該保護作用將由症狀數目減少、症狀嚴重性減小或缺少一或多種與病原體感染相關之症狀、病毒血症發作延遲、病毒持久性減小、總體病毒負載減少及/或病毒排出減少得以證實。

本文中，「特定免疫反應性」係指識別PRRSV感染之抗原特徵，但不與嚴格攻毒對照物之抗原特徵反應之免疫反應性蛋白質或多肽。為確定潛在PRRSV免疫反應性蛋白質或其他多肽之特異性，將使用各種免疫分析(ELISA、IFA、西方墨點法(WesternBlot))來測試針對含有遺傳類似病毒之動物血清的蛋白質。亦由與表述方法相關之針對含有蛋白質之物質(桿狀病毒(Baculovirus)、Sf9細胞等)的各種免疫分析來測試蛋白質。

如本文所用，「醫藥學或獸醫學上可接受之載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、塗佈劑、佐劑、穩定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸附延遲劑及其類似物。在一些較佳實施例中，且尤其為包括凍乾免疫原性組合物之彼等實施例，本發明中所用之穩定劑包括用於凍乾或冷凍乾燥之穩定劑。

在一些實施例中，本發明之免疫原性組合物含有佐劑。如本文所用之「佐劑」可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、皂素類，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge MA)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。乳液特定而言可基於輕質液體石蠟油(歐洲藥典(European Pharmacopea)類型)；類異戊二烯油，諸如角鯊烷或角鯊烯；由烯烴(特定而言為異丁烯或癸烯)寡聚作用產生之油；含有直鏈 烷基之酸或醇之酯，更尤其為植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/癸酸酯)、甘油基三-(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支鏈脂肪酸或醇之酯，特定而言為異硬脂酸酯。油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子性界面活性劑，特定而言為脫水山梨糖醇之酯、二縮甘露醇之酯(例如，無水甘露醇油酸酯)、二醇之酯、聚甘油之酯、丙二醇之酯及油酸、異硬脂酸、蓖麻油酸或羥基硬脂酸之酯(其視情況經乙氧基化)及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特定而言為Pluronic產品，尤其為L121。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(編者Stewart-Tull,D.E.S.),John Wiley及Sons,NY，第51-94頁(1995)及Todd等人，Vaccine 15：564-570(1997)。例示性佐劑為在由M.Powell及M.Newman編輯之「Vaccine Design,The Subunit and Adjuvant Approach」,Plenum Press,1995中第147頁所述之SPT乳液及在此本書第183頁所述之乳液MF59。

佐劑之另一實例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利之佐劑化合物係尤其與糖或多元醇之聚烯基醚交聯之丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。該等化合物由術語卡波姆(carbomer)已知(Pharmeuropa第8卷，第2期，1996年6月)。熟習此項技術者亦可參考美國專利第2,909,462號，其描述與具有至少3個羥基(較佳不大於8個)之多羥基化化合物交聯之該等丙烯酸系聚合物，至少三個羥基之氫原子係經具有至少2個碳原子之不飽和脂族基團置換。較佳基團係含有2至4個碳原子之彼等基團，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不飽和基團。不飽和基團本身可含有其他取代基，諸如甲基。以名稱CARBOPOL^®(BF Goodrich,Ohio,USA)出售之產品尤其適合。其與烯丙基蔗糖或烯丙基異戊四醇交聯。其中可提及CARBOPOL^® 974P、934P及971P。最佳使用CARBOPOL^® 971P。順丁烯二酸酐與烯基衍生物之共聚物尤其係共聚物EMA(Monsanto)，其係 順丁烯二酸酐與乙烯之共聚物。該等聚合物溶解於水中產生酸溶液，其較佳經中和至生理學pH以產生將合併免疫原性、免疫性或疫苗組合物本身之佐劑溶液。

其他適合之佐劑尤其包括(但不限於)RIBI佐劑系統(Ribi Inc.)、Block共聚物(CytRx,Atlanta GA)、SAF-M(Chiron,Emeryville CA)、單磷醯基脂質A、阿夫立定(Avridine)脂質-胺佐劑、來自大腸桿菌之熱不穩定腸毒素(重組或以其他方式)、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁醯二肽、或天然產生或重組之細胞激素或其類似物或內源細胞激素釋放之刺激劑。

預期可以每劑量約100μg至約10mg之量、較佳以每劑量約100μg至約10mg之量、更佳以每劑量約500μg至約5mg之量、甚至更佳以每劑量約750μg至約2.5mg之量且最佳以每劑量約1mg之量添加佐劑。或者，以最終產物之體積計，佐劑可為約0.01至50%之濃度、較佳為約2%至30%之濃度、更佳為約5%至25%之濃度、又更佳為約7%至22%之濃度且最佳為10%至20%之濃度。

「稀釋劑」可包括水、鹽水、葡萄糖、乙醇、甘油及其類似物。等張劑尤其可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇及乳糖。穩定劑尤其包括白蛋白及乙二胺四乙酸之鹼金屬鹽。

「分離」意謂「藉由人工」自其天然狀態改變，亦即若天然存在，則由其初始環境改變或移除，或兩者兼有。舉例而言，如此術語在本文中所用，在活生物體中天然存在之聚核苷酸或多肽不經「分離」，但自其天然狀態共存之物質分離之相同聚核苷酸或多肽係經「分離」。

「安全」係指經接種疫苗之動物在接種疫苗之後不存在不利結果，包括(但不限於)：可能恢復以細菌為基礎之疫苗的毒性、臨床上顯著之副作用，諸如持久之全身性疾病或在疫苗投予位點處不可接受 之發炎。

如本文所用之術語「接種疫苗(vaccination)」或「接種疫苗(vaccinating)」或其變化形式意謂包括投予本發明之免疫原性組合物之過程，本發明之免疫原性組合物在投予至動物時引發或能夠引發(直接或間接)動物針對PRRSV之免疫反應。

在本發明之情形下，「死亡率」係指由PRRSV感染引起之死亡，且包括感染嚴重致使對動物施以安樂死以防受苦且為其提供人為結束生命的情形。

「減毒」意謂減小病原體之毒性。在本發明中，「減毒」與「無毒性」同義。在本發明中，減毒病毒係毒性經減少以使其不引起PRRSV感染之臨床徵象、但能夠在標靶哺乳動物體內誘發免疫反應之病毒，但亦可意謂與感染未減毒PRRSV但未接受減毒細菌之「對照組」動物相比，動物受減毒PRRSV感染之臨床徵象發生率或嚴重性減小。在此情形下，術語「減小(reduce/reduced)」意謂與如上文定義之對照組相比，減小至少10%、較佳25%、甚至更佳50%、又更佳60%、甚至更佳70%、又更佳80%、甚至更佳90%且最佳100%。因此，減毒、無毒性之PRRSV病毒株係適合併入包含經改質活PRRSV病毒之免疫原性組合物中的病毒株。

「滅活」或「失活」意謂經致使PRRSV病毒死亡及/或以其他方式無法生殖之物理劑或化學劑處理。PRRSV可藉由習知方式滅活，諸如加熱、輻射或在紫外線存在下之補骨脂素。PRRSV可藉由習知方式失活，諸如經由使用一或多種化學失活劑進行化學失活，該等化學失活劑包括(但不限於)二元伸乙基亞胺(BEI)、β-丙內酯、福馬林(formalin)、戊二醛及/或十二烷基硫酸鈉中之一或多者。使該等病毒之毒性病毒株減毒之方法及製造失活病毒製劑之方法在此項技術中已知且例如描述於U.S.4,567,042及4,567,043中。來自本發明之疫苗組 合物中所用之PRRSV的抗原因此可為全病毒之形式，其尤其係經改質及/或減毒活病毒製劑或滅活或失活病毒製劑。

如本文所用之「抗體」包括抗-PRRSV抗體，例如單株及多株抗體、單鏈抗體、嵌合抗體、人類化、人類、豬及CDR-接枝抗體，包括包含特異性識別本發明之PRRSV多肽之CDR序列的化合物。術語「對……具特異性」指示本發明抗體之可變區專門識別且結合PRRSV多肽(亦即，能夠區分單一PRRSV多肽與相關多肽，而與在多肽家族中發現之序列一致性、同源性或類似性無關)，且(視情況)允許其經由與抗體可變區以外且特定而言為抗體分子恆定區中之序列相互作用而與其他蛋白質(例如，金黃色葡萄球菌(S.aureus)蛋白質或ELISA技術中之其他抗體)相互作用。此項技術中熟知且常規進行篩選分析來測定本發明抗體之結合特異性。關於該等分析之廣泛論述，參見Harlow等人(編)，Antibodics A Laboratory Manual：Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor,NY(1988)，第6章。亦涵蓋識別且結合本發明之PRRSV多肽之片段的抗體，只要該等抗體如上文所定義首先且最先對片段所衍生之本發明之PPRSV多肽具特異性即可。為明確之目的，「抗體」係指由於對特異性抗原之免疫反應而可結合彼抗原之免疫球蛋白分子。免疫球蛋白係由具有「恆定」區與「可變」區之「輕」及「重」多肽鏈組成且基於恆定區之組成分類(例如，IgA、IgD、IgE、IgG及IgM)之血清蛋白質。抗體可以多種形式存在，例如以功能活性片段(諸如Ev、Fab'、F(ab')2)以及單鏈形式，且包括含有一或多個抗體單鏈多肽序列中之全部或部分的合成多肽。此項技術中熟知用於製造本發明抗體之遺傳構建體及方法，包括選殖載體、經選殖載體轉型之宿主細胞及融合瘤。

本文中，「有效劑量」意謂(但不限於)在投予抗原之動物體內引發或能夠引發致使臨床症狀減少之免疫反應的抗原量。

如本文所用，在組合物之情形下，術語「有效量」意謂能夠在動物體內誘發使感染發生率減小或減輕感染嚴重性或疾病事件之免疫反應的免疫原性組合物之量。有效量尤其係指每劑量之群落形成單位(CFU)。或者，在治療之情形下，術語「有效量」係指足以減小或緩解疾病或病症或其一或多種症狀之嚴重性或持續時間、預防疾病或病症前進、導致疾病或病症衰退、預防與疾病或病症相關之一或多種症狀復發、發展、發作或進展，或增強或改良另一種治療或治療劑之預防或治療的治療量。

如本文所用之術語「對PRRSV具免疫反應性」意謂肽或片段引發針對PRRSV之免疫反應。

如本文所用，「互補」意謂核酸分子具有與參考模板序列互補之序列，其中兩種序列可特異性雜交。該術語較佳係指精確互補，例如在天然產生之DNA編碼基因之兩股核苷酸序列中所發現。

「序列一致性」如在此項技術中已知係指兩個或兩個以上多肽序列或兩個或兩個以上聚核苷酸序列之間之關係，即參考序列及欲與參考序列比較之指定序列。序列一致性係藉由在將指定序列與參考序列最佳對準以產生最高程度之序列類似性之後對該等序列進行比較來測定，如由該等序列串之間的匹配所測定，若必要引入間隙。經此對準後，基於位置來確定序列一致性，例如若特定位置之核苷酸或胺基酸殘基相同，則彼位置處之序列係「相同的」。該等位置一致性之總數隨後除以參考序列中之核苷酸或殘基總數，得到序列一致性%。序列一致性可易於由已知方法來計算，包括(但不限於)Computational Molecular Biology,Lesk,A.N.編，Oxford University Press,New York(1988),Biocomputing：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編，Academic Press,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data，第I部分，Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編，Humana Press,New Jersey(1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinge,G.,Academic Press(1987)；Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編，M.Stockton Press,New York(1991)；及Carillo,H.及Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48：1073(1988)中所述之彼等方法；其教示以引用的方式併入本文中。用以測定序列一致性之較佳方法係經設計以使所測試之序列之間產生最大匹配。用以測定序列一致性之方法可經編纂成用以測定指定序列之間之序列一致性的公開可用電腦程式。該等程式之實例包括(但不限於)GCG程式封裝(Devereux,J.等人，Nucleic Acids Research,12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN及BLASTX(Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215：403-410(1990))。BLASTX程式由NCBI及其他來源公開可用(BLAST Manual,Altschul,S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda,MD 20894,Altschul,S.F.等人，J.Molec.Biol.,215：403-410(1990)，其教示以引用的方式併入本文中)。該等程式使用預設間隙權數最佳對準序列以在指定與參考序列之間產生最高程度之序列一致性。作為說明，具有與參考核苷酸序列具有例如至少85%、較佳90%、甚至更佳95%「序列一致性」之核苷酸序列的聚核苷酸意指除了指定聚核苷酸序列在參考核苷酸序列之每100個核苷酸中可包括至多15個、較佳至多10個、甚至更佳至多5個點突變以外，指定聚核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換言之，在具有相對於參考核苷酸序列具有至少85%、較佳90%、甚至更佳95%一致性之核苷酸序列的聚核苷酸中，參考序列之至多15%、較佳10%、甚至更佳5%之核苷酸可缺失或經另一核苷酸取代，或佔參考序列中總核苷酸之至多15%、較佳10%、甚至更佳5%之多個核苷酸可插入參考序列中。參考序列之該等突變可發生在參考核苷酸序列之5'或3'末端位置或彼等末端位置之間之任意處，個別地散置於參考序列中或參考序列內之一或多個鄰接群組中的核苷酸之間。類似地，具有 與參考胺基酸序列具有例如至少85%、較佳至少90%、甚至更佳至少95%序列一致性之指定胺基酸序列的多肽意指除了指定多肽序列在參考胺基酸序列之每100個胺基酸中可包括至多15個、較佳至多10個、甚至更佳至多5個胺基酸變化以外，多肽之指定胺基酸序列與參考序列相同。換言之，為獲得與參考胺基酸序列具有至少85%、較佳90%、甚至更佳至少95%之序列一致性的指定多肽序列，參考序列中至多15%、較佳至多10%、甚至更佳至多5%之胺基酸殘基可缺失或經另一胺基酸取代，或佔參考序列中胺基酸殘基總數至多15%、較佳至多10%、甚至更佳至多5%之多個胺基酸可插入參考序列中。參考序列之該等改變可發生在參考胺基酸序列之胺基或羧基末端位置或彼等末端位置之間之任意處，個別地散置於參考序列中或參考序列內之一或多個鄰接群組中的殘基之間。不同之殘基位置較佳由保守性胺基酸取代來區分。然而，在測定序列一致性時，保守性取代不作為匹配包括在內。

如本文所用之「序列同源性」係指一種測定兩種序列之相關性的方法。為測定序列同源性，使兩個或兩個以上序列最佳對準且若必要引入間隙。然而，與「序列一致性」相反，在測定序列同源性時，保守性胺基酸取代亦作為匹配計算在內。換言之，未獲得與參考序列具有95%序列同源性之多肽，參考序列中85%、較佳90%、甚至更佳95%之胺基酸殘基必須匹配或包含經另一胺基酸保守性取代，或佔參考序列中總胺基酸殘基(不包括保守性取代)至多15%、較佳至多10%、甚至更佳至多5%之多個胺基酸可插入參考序列中。同源序列較佳包含延伸至少50個、甚至更佳100個、甚至更佳250個、甚至更佳500個編碼同源胺基酸之核苷酸。

「保守性取代」係指以具有類似特徵或特性(包括大小、疏水性等)之另一胺基酸殘基取代胺基酸殘基以使得總體功能不顯著改變。 其亦可意謂導致保守性胺基酸取代之核苷酸取代。

B.載劑分子

本發明之PRRSV肽可與之結合或共價連接之載劑分子較佳為上文所述之彼等。供動物使用之較佳載劑為牛血清白蛋白及鑰孔血藍蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)。適合人類使用(但亦可用於動物)之蛋白質載劑包括破傷風類毒素、白喉類毒素、非細胞百日咳疫苗(LPF類毒素)、與細菌毒素在抗原上類似但藉由突變而非毒性之交叉反應性物質(CRM)。舉例而言，可使用根據Pappenheimer等人，Immunochemistry,9,891-906(1972)獲得之CRM 197及其他細菌蛋白質載劑，例如腦膜炎球菌外膜蛋白質。載劑蛋白質本身較佳為免疫原。

本發明之PRRSV肽可藉由此項技術中已知之任何便利方法與載劑共價偶合。儘管使用如Schneerson等人，J.Experimental Medicine,152,361-376(1980)所述之對稱連接劑(諸如己二酸二醯肼)或如Fattom等人，Infection and Immunity,56,2292-2298(1988)所述之雜雙官能連接劑(諸如N-丁二醯亞胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯)(均以引用方式併入)在本發明之範疇內，但較佳避免使用任何連接劑，而相反使本發明之豬鏈球菌(S.suis)肽直接與載劑分子偶合。該偶合可藉由如以引用方式明確併入本文之Landi等人J.Immunology,127,1011-1019(1981)所述之還原胺化來達成。

如由平均分子量定義之免疫原性組合物之大小係可變的且取決於所選之PRRSV肽及PRRSV肽與載劑之偶合方法。因此，其可小至1,000道爾頓(dalton，10³)或大於10⁶道爾頓。經由還原胺化偶合方法，PRRSV肽之分子量通常在5,000至500,000、例如300,000至500,000或例如5,000至50,000道爾頓之範圍內。

載劑分子(亦即，肽、其衍生物及類似物)及特異性結合本發明之 PRRSV肽之肽模擬物可由此項技術中已知之各種方法來產生，包括(但不限於)固相合成或藉由溶解(Nakanishi等人，1993,Gene 137：51-56；Merrifield,1963,J.Am.Chem.Soc.15：2149-2154；Neurath,H.等人編，The Proteins，第II卷，第3版，第105-237頁，Academic Press,New York,N.Y.(1976)，其所有均以全文引用的方式併入本文中)。

本發明之PRRSV肽或本發明之抗體或其結合部分可藉由與醫藥學或獸醫學載劑在稀釋劑中之溶液或懸浮液以可注射劑型來投予。

該等分子之安全性及功效係如獸醫生物製品中心(CVB)所述及調節在細胞培養物或實驗動物中由標準程序來測定。該等分子之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中藉由例如用於測定LD₅₀(使群體之50%致死之劑量)之標準醫藥學程序來測定。

本發明之疫苗可為多價或單價。多價疫苗係由多個PRRSV肽與載劑分子之免疫結合而製得。

在一態樣中，PRRSV肽組合物包含有效免疫量之免疫原性結合物，較佳與免疫刺激劑及生理學上可接受之媒劑組合。如本發明中所用，「免疫刺激劑」欲涵蓋能夠增強免疫系統活性之任何化合物或組合物，而無論其與特異性抗原組合是否具有特異性增強效應或對免疫反應之一或多種要素之活性僅具有獨立效應。免疫刺激劑化合物包括(但不限於)礦物質凝膠，例如氫氧化鋁；表面活性物質，諸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)；聚陰離子；肽；油乳液；明礬及MDP。此項技術中已知使用該等物質之方法且熟習此項技術者即有能力測定針對指定疫苗之刺激劑的最佳量。在指定調配物中可使用一種以上免疫刺激劑。亦可將免疫原併入脂質體中，或與用於疫苗調配物中之多醣及/或其他聚合物結合。

如需要，組合物可呈現於封裝或施配器裝置中，其中可含有一或多個含有活性成分之單位劑型。該封裝可例如：包含金屬或塑膠 箔，例如發泡封裝。封裝或施配器裝置可附有較適於向哺乳動物(尤其為豬)投藥之投藥說明書。與該(等)容器相關者係由管理醫藥品或生物製品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之說明書，該說明書說明該機構已核准其製造、使用或銷售，以供投藥。

C.佐劑

為進一步增加本文所提供免疫原性組合物之免疫原性，含有一或多種PRRSV肽者亦可包含一或多種佐劑。

佐劑可由先前所述或此項技術中已知之任何技術來純化。較佳純化技術係矽膠層析，特定而言為如W.Clark Still等人，J.Organic Chemistry,43,2923-2925(1978)所述之「急驟」(快速)層析技術。然而，可使用其他層析方法(包括HPLC)來純化佐劑。亦可使用結晶來純化佐劑。在某些情形下，當直接由合成獲得具有分析純度之產物時，無需純化。

本發明之疫苗組合物係藉由根據用於產生佐劑組合物之已知技術，將佐劑與PRRSV肽在適當無菌條件下進行物理混合來製備。藉由在結合物上存在對長鏈烷基化合物佐劑上存在之正電荷具有靜電引力之淨負電荷來促進PRSV肽與佐劑之複合。

預期可以每劑量約100μg至約10mg之量、較佳以每劑量約100μg至約10mg之量、更佳以每劑量約500μg至約5mg之量、甚至更佳以每劑量約750μg至約2.5mg之量且最佳以每劑量約1mg之量添加佐劑。或者，以最終產物之體積計，佐劑可為約0.01%至75%之濃度、較佳為約2%至30%之濃度、更佳為約5%至25%之濃度、又更佳為約7%至22%之濃度且最佳為10%至20%之濃度。

D.生理學上可接受之媒劑

本發明之疫苗組合物可使用與用於其他醫藥學多肽組合物之彼等技術類似之技術來調配。因此，佐劑及RRSV肽(較佳與載劑分子結 合及/或與佐劑混合)可以凍乾形式儲存且在投藥之前於生理學上可接受之媒劑中復原以形成懸浮液。或者，佐劑及結合物可儲存於媒劑中。較佳媒劑為無菌溶液，特定而言為無菌緩衝溶液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水。將佐劑與結合物在媒劑中合併以使得免疫原性組合物之免疫有效性改良的任何方法均係適當的。

單劑量本發明疫苗之體積可變化，但一般在習知疫苗通常所採用之範圍內。在上文所述結合物與佐劑之濃度下，單劑量之體積較佳在約0.1ml與約3ml之間、較佳在約0.2ml與約1.5ml之間、更佳在約0.2ml與約0.5ml之間。

本發明之疫苗組合物可由任何便利方式來投予。

E.調配物

包含與載劑分子偶合之PRRSV肽之免疫原性結合物可用作用於針對PRRSV之一或多種血清型免疫的疫苗。在生理學上可接受之媒劑中包含免疫原性結合物之疫苗適用於使動物(較佳為豬)免疫以治療或預防PRRSV感染之方法。

藉由免疫原性結合物之免疫作用而針對本發明之免疫原性結合物所產生之抗體可用於被動免疫治療中且產生用於治療或預防PRRSV感染之抗個體基因型抗體。

組合物所投予之個體較佳為動物，包括(但不限於)奶牛、馬、綿羊、豬、家禽(例如，雞)、山羊、貓、狗、倉鼠、小鼠及大鼠；哺乳動物最佳為豬。

本發明之調配物包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物或其抗體及生理學上可接受之媒劑。疫苗包含有效免疫量之一或多種免疫原性組合物及生理學上可接受之媒劑。該調配物應適應投藥模式。

若需要，免疫原性組合物亦可含有微量潤濕劑或乳化劑或pH緩衝劑。免疫原性組合物可為液體溶液、懸浮液、乳液、錠劑、藥丸、 膠囊、持續釋放之調配物或散劑。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥級別之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。

F.有效劑量

本文所述之化合物可以治療PRRSV相關疾病之治療有效劑量投予至個體。劑量將取決於接受疫苗之宿主以及諸如宿主大小、重量及年齡之因素。

調配物中欲採用之本發明之免疫原性結合物或抗體之精確量將取決於投藥途徑及個體之性質(例如，種類、年齡、大小、疾病之階段/程度)，且應根據醫師之判斷及每一個體之情形根據標準臨床技術來決定。有效免疫量係足以治療或預防個體之PRRSV感染疾病的量。有效劑量亦可由源自動物模型測試系統之劑量-反應曲線來推算且可在0.001mg/kg至100mg/kg間變化。

化合物之毒性及治療功效可在細胞培養物或實驗動物中例如藉由測定LD₅₀(使群體之50%致死之劑量)及ED₅₀(對群體之50%治療有效之劑量)之標準醫藥程序來測定。毒性與治療效應之間的劑量比為治療指數且其可表述為比率LD₅₀/ED₅₀。展現大治療指數之化合物較佳。儘管可使用展現毒性負作用之化合物，但應謹慎設計用於將該等化合物靶向受影響組織位點之傳遞系統以使得對未受感染細胞之潛在損害最小化，且由此減少副作用。

由細胞培養物分析及動物研究獲得之資料可用於調配用於動物(尤其為豬)之多種劑量。該等化合物之劑量較佳在循環濃度之範圍內，包括毒性極低或無毒性之ED₅₀。視所用劑型及所用投藥途徑而定，劑量可在此範圍內變化。對於本發明方法中所用之任何化合物而言，治療有效劑量最初可由細胞培養物分析來估計。劑量可在動物模型中調配以達成包括如在細胞培養物中所測定之IC₅₀(亦即，達到對症 狀之最大抑制一半的測試化合物濃度)的循環血漿濃度範圍。該信息可用於更準確地確定在個體中之適用劑量。血漿中之含量例如可藉由高效液相層析來量測。

可藉由在以組合物免疫之後，藉由使用此項技術中已知之任何免疫分析來監控測試個體之免疫反應來確定組合物之免疫原性。產生體液(抗體)反應及/或細胞介導之免疫性可視作對免疫反應之指示。測試個體可包括動物，諸如豬、小鼠、倉鼠、狗、貓、兔、奶牛、馬、綿羊及家禽(例如，雞、鴨、鵝及火雞)。

可藉由各種方式來分析測試個體之免疫反應，諸如：如由已知技術(例如酶聯結免疫吸附劑分析(ELISA)、免疫墨點、免疫沈澱等)分析之所得免疫血清對免疫原性結合物之反應性；或如由此項技術中已知之用於分析疾病感染劑水準(例如細菌水準)之任何方法(例如，藉由培養來自個體之樣本)或此項技術中已知之其他技術所測定，藉由保護經免疫宿主免受病原體感染及/或使經免疫宿主中由於病原體感染引起之症狀減輕。疾病感染劑之水準亦可藉由量測免疫球蛋白所針對之抗原水準來測定。疾病感染劑水準之減少或感染性疾病症狀之緩解指示組合物係有效的。

在活體外用於動物之前，可經活體外測試本發明治療劑之所需治療或預防活性。舉例而言，可用於確定是否指示投予特定治療劑之活體外分析包括使來自細胞株之適當細胞或由患有特定疾病或病症之個體培養之細胞暴露於治療劑或以其他方式投予治療劑之活體外細胞培養物分析，且觀測治療劑對細胞之效應。

或者，可藉由使治療劑與易受疾病感染劑感染影響但未經疾病感染劑感染之細胞(由個體或經培養之細胞株培養)接觸、使細胞暴露於疾病感染劑且隨後確定與治療劑接觸之細胞的感染率是否低於未與治療劑接觸之細胞的感染率來對治療劑進行分析。可藉由此項技術中 已知之任何方法來分析疾病感染劑對細胞之感染。

另外，可藉由在治療前、治療期間或治療後以適合之時間間隔量測抗體在動物模型中所針對之分子的水準來評估治療劑。可確定分子之量的任何變化或不存在變化且與對個體之治療效應相關。可藉由此項技術中已知之任何方法來確定分子之水準。

在使用本發明之方法及組合物對動物接種針對PRRSV之疫苗之後，可使用此項技術中已知之任何結合分析來評估所得抗體與特定分子間之結合。亦可進行該等分析來選擇對特定抗原展現較高親和性或特異性之抗體。

G.偵測及診斷方法

由使用本發明之PRRSV肽產生之抗體或其結合部分適用於偵測樣本中PRRSV之存在。此偵測方法包含提供針對本發明之PRRSV肽所產生之分離抗體或其結合部分、向分離抗體或其結合部分添加疑似含有一定量PRRSV之樣本且偵測是否存在與PRRSV結合之包含分離抗體或其結合部分之複合物的步驟。

本發明之抗體或其結合部分亦適用於偵測樣本中是否存在PRRSV肽。此偵測方法包含提供針對PRRSV肽所產生之分離抗體或其結合部分、向分離抗體或其結合部分添加疑似含有一定量PRRSV肽之樣本且偵測是否存在與PRRSV肽結合之包含分離抗體或其結合部分之複合物的步驟。

如本文所述，結合作為結合對一員之特異性分子的免疫球蛋白，尤其為抗體(及其功能活性片段)可用作診斷劑及預後劑。在各種實施例中，本發明提供對結合對一員之量測及該等量測在臨床應用中之用途。本發明中之免疫球蛋白例如可用於偵測生物樣本中之抗原，由此可測試個體中與免疫球蛋白結合之分子的異常水準及/或是否存在該等分子之異常形式。「異常水準」意謂在來自身體一部分或未患 疾病之個體的類似樣本中，相對於現有水準或代表現有水準之標準水準而言增加或減少。在用於診斷或預後技術之套組中亦可包括本發明之抗體作為試劑。

在一態樣中，可使用與PRRSV肽免疫特異性結合之本發明之抗體來診斷、預後或篩選PRRSV感染。

在另一態樣中，本發明提供一種診斷或篩選是否存在PRRSV感染或與其之免疫性的方法，其包含在個體體內量測抗體與源自個體之樣本的免疫特異性結合水準，其中抗體與PRRSV肽免疫特異性結合，其中該免疫特異性結合水準相對於在來自不具有疾病感染劑之個體之類似樣本中的該免疫特異性結合水準而言增加指示存在PRRSV。

用於偵測是否存在PRRSV肽或其拮抗劑之適合分析的實例包括(但不限於)ELISA、放射免疫分析、凝膠-擴散沈澱反應分析、免疫擴散分析、凝集分析、螢光免疫分析、蛋白質A免疫分析或免疫電泳分析。

用於特定分子之免疫分析通常將包含在經可偵測標記之抗體存在下培育樣本(諸如生物流體、組織提取液、新鮮收集之細胞或培養細胞之溶胞物)且藉由此項技術中熟知之多種技術中之任一種偵測結合抗體。

可根據熟知方法來測定指定抗體之結合活性。熟習此項技術者將能夠藉由採用常規實驗來確定用於每次測定之操作性及最佳分析條件。

本發明之另一態樣係關於用於偵測或量測PRRSV之診斷套組。提供用於診斷用途之套組，其在一或多個容器中包含抗PRRSV肽抗體，且視情況包含該抗體之經標記結合搭配物。或者，抗PRRSV肽抗體可經標記(以可偵測之標記，例如化學發光、酶、螢光或放射性部分)。因此，本發明提供一種包含抗PRRSV肽抗體與對照免疫球蛋白 之診斷套組。在一特定實施例中，可偵測性地標記容器中之以上化合物之一。套組可視情況在容器中另外包含預定量之由套組之抗體識別之PRRSV肽用作標準物或對照。

H.向個體投藥

較佳投藥途徑包括(但不限於)鼻內、經口、皮內及肌肉內。最佳以單次給藥在飲用水中投藥係有利的。熟習此項技術者將意識到，本發明之組合物亦可以一或兩次或兩次以上給藥以及藉由其他投藥途徑來投予。舉例而言，該等其他途徑包括皮下、皮內、靜脈內、血管內、動脈內、腹膜內、鞘內、氣管內、皮內、心內、葉內、髓內、肺內及陰道內。視治療之所需持續時間及有效性而定，可一次性或分若干次，亦間歇性地，例如在每日之基礎上歷時若干天、數週或數月且以不同劑量來投予本發明之組合物。

包括以下實例以說明本發明之較佳實施例。熟習此項技術者應瞭解，在以下實例中所揭示之技術代表由本發明者所發現之技術，以在實踐本發明中發揮良好作用，且因此可視其為構成用於其實踐之較佳模式。然而，根據本發明，熟習此項技術者應瞭解在不悖離本發明之精神及範疇的情況下可對所揭示之特定實施例中進行諸多改變且仍獲得相同或類似之結果。

本文引用之所有申請案、專利及公開案之整個揭示內容均明確以引用的方式併入本文中。

實例：

實例中所用之本發明之病毒株係SEQ ID NO：1(Wetzel p3(預減毒))及SEQ ID NO：2(Wetzel p41(減毒))。

實例1：細胞繼代-減毒PRRS病毒之呼吸道及生殖安全性

以下揭示內容係關於對不同PRRSV分離株進行之實驗；然而，使用類似方法製備本發明之Wetzel分離株，且可由熟習此項技術者用 以製備該等及類似減毒分離株。

細胞繼代

以產生具有天然產生之缺失之分離株為目的，使用一種獨特繼代方法。在96孔細胞培養盤中種植MA-104細胞(ATCC CRL2621)且在37℃下以10%胎牛血清(Invitrogen)及5% CO₂以最低必需培養基(EMEM,SAFC Biosciences M56416)培育。細胞一經培育3天後，向培養盤上整列之每一孔中添加100μL親本病毒MN184(MN/01/A2)或Isolate X。隨後使用每一孔沿每一行進行四次1/10稀釋。稀釋之後，經每一孔之頂部添加100μL新鮮培養基。將盤培育3至8天，之後檢查細胞病變效應。在讀取盤之後，將每一行之最高陽性稀釋液傳遞至具有3天大MA-104細胞之另一盤中。在此新盤上進行四次1/10稀釋，覆蓋培養基且再次培育盤。在活體外細胞第51次繼代中連續進行此過程。有時，若一行展示無生長，則試圖傳遞最低稀釋液以產生足夠之病毒來維持傳遞感染。隨後，若在下一盤上仍無CPE徵象，則使用另一行來種植下一盤。

Isolate X係一種來自2007 PRRS爆發之展現ORF5 1-7-4 RFLP圖案且具有JA-142樣nsp2區之分離毒性野外病毒。MN184係2002年在北美出現之一種導致高死亡率及嚴重生殖病症的極具病原性之分離株。此分離株與VR-2332(2型原型病毒株)相比在nsp2區中具有131個胺基酸缺失。此外，已發現MN184具有迄今為止發現之15,019kb之最短PRRS基因體[12][16]。經繼代過程產生之缺失突變體稱為96孔缺失突變體，而與Isolate X相關之Isolate X-9在nsp2區中不含顯著缺失，但經選擇用於比較目的。

核苷酸序列分析

由活體外細胞培養物及研究動物血清樣本進行核苷酸序列分析。對於活體外樣本而言，使用QIAamp病毒RNA小套組(Qiagen Inc, Valencia,CA)進行核糖核酸(RNA)提取，而使用總核酸MagNA純套組(Roche Applied Science)自所收集之豬血清進行提取。根據製造商之建議，使用SUPERSCRIPT^® III第一鏈合成(Invitrogen公司，Carlsbad,CA)來產生互補去氧核糖核酸(cDNA)。cDNA產物隨後在具有以下配置之ENEAMP^® PCR系統9700(Applied Biosystems)96孔機器中經歷聚合酶鏈反應(PCR)：初始化步驟在95℃下歷時5分鐘(min.)，變性步驟在95℃下歷時30秒鐘(sec.)、黏接步驟在53℃下歷時30sec.、繼而為延長步驟在72℃下歷時150sec.進行35個循環，最後為單次伸長步驟在72℃下歷時5min。使樣本保持在4℃直至自熱循環器移除。每一PCR孔相應設定為：25μL 2X AmpliTaq Gold Mastermix(Applied Biosystems)、21μL DEPC水(EMD Chemicals,Gibbstown,NJ)、2μL cDNA模板及各自1μL單獨引子(參見表1)。

關鍵字母：A-腺苷；T-胸苷；K-G或T；G-鳥苷；R-A或G；Y-C或T；C-胞苷；H-A、C或T

隨後根據製造商之建議，以WIZARD^® DNA清除系統(Promega,Madison WI)來純化PCR產物。隨後將樣本以中等速度置於Savant Speedvac DNA 110(Global Medical Instrumentation,Ramsey,MN)中歷時10min.以移除任何殘餘異丙醇。隨後將樣本與10μL負載染料混合且負載至1.5%瓊脂糖凝膠上。藉由施加120伏特(volt)進行電泳歷時45min。視覺觀測具有適當大小之帶且經歷以WIZARD^® SV凝膠及PCR清除系統(Promega)進行純化。

隨後將樣本送至愛荷華州立大學(Iowa State University,ISU)DNA Facility進行序列分析，其中以適當引子建立定序反應。在ISU，使用一種Applied Biosystems 3730x1 DNA分析儀。以2.0版GeneTool(BioTools Inc.)對序列進行分析。如明尼蘇達大學獸醫診斷實驗室(University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory)所概述，根據其限制片段長度多形現象對ORF5序列進行分類。

呼吸道安全性試驗

對此研究而言，將25隻3週大之未接受過PRRSV之市售雜種豬按重量隨機分為5組，歷時14天進行呼吸道安全性試驗。將所有動物圈養在研究設施中且在整個研究期間使以動物進行工作之所有個人看不到動物。除陰性對照組以外，使研究組中之每隻動物在頸部接受2mL含有MN184(Isolate Y)(4.86對數傳遞)、Isolate X-2(Isolate X之另一減毒分離株)(6.13對數傳遞)、Isolate X-9(6.31對數傳遞)之減毒純系或野生型Isolate X(3.59對數傳遞)的肌肉內(IM)注射。由TCID₅₀/ml測定病毒效價(Johnson W,Roof M,Vaughn E,Christopher-Hennings J,Johnson CR,Murtaugh MP。對豬生殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)之病原性及體液免疫反應與急性感染中之病毒負載相關。Vet Immunol Immunopathol 2004年12月8日；102(3)：233-47[17]及Reed LJ,Muench H.A simple method of estimating fifty percent end-points.Amer J Hyg 1938；27：493-7[18]，二者均以引用的方式併入本文中)。

研究在第14天結束，所有動物均經歷安樂死及由執業獸醫進行驗屍。收集血液樣本，之後在研究日第0天以及第7天及第14天進行處理投藥。

生殖安全性試驗

生殖安全性試驗包括16隻圈養在研究設施中且所有動物看守者及研究者均看不見之懷孕90±4天之PRRS ELISA陰性市售雜種小母 豬。將動物隨機分為四個由相同之來自呼吸道試驗之三個細胞繼代測試件組成之處理組及一個陰性對照組。在第0天當對雌性經鼻內以每側鼻孔接種2.0mL以下中之一者時正式開始研究：Isolate Y、Isolate X-2、Isolate X-9或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。以含有2%胎牛血清(FBS)(Sigma,St.Louis,MO.)之最低必需培養基(MEM；Sigma,St.Louis,MO.)稀釋所有病毒以向每隻動物傳遞4ml標靶之5.00對數病毒。由TCID₅₀/劑量測定病毒效價。在各自產仔日(DOF)21天之後，對每隻小母豬及其仔豬結束研究。在第0天、第7天、第14天、第21天、產仔日(DOF)、產仔7天後(DOF+7)、產仔14天後(DOF+14)及產仔21天之後(DOF+21)對所有小母豬進行抽血。另外，對活的仔豬在DOF、DOF+7、DOF+14及DOF+21進行抽血，而死的仔豬在檢查時即刻收集血液或胸液，而與研究日無關。

呼吸道安全性試驗臨床肺部評估

在驗屍時評估豬安全性研究中所有動物肺部與PRRSV感染一致之實變百分比。使用標準化計分系統關於每一個別葉及總的大體肺部病理學對肺部進行計分。參見Halbur PG、Miller LD、Paul PS、Meng XJ、Huffman EL、Andrews JJ.Immunohistochemical identification of porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)antigen in the heart and lymphoid system of three-week-old colostrum-deprived pigs.Vet Pathol 1995 Mar；32(2)：200-4[19]。最終觀測計分值與所有個別肺葉計分值之權重總和相等。

生殖安全性試驗生殖效能

記錄每隻雌性之流產及產仔資料。產仔日定義為分娩出幼崽中之第一隻活出生小豬之日。至少每天6：00 AM至10：00 PM定期觀測小母豬。幼崽觀測包括每隻雌性之流產數、死產數、木乃伊胎數、活仔豬數及弱出生活仔豬數。記錄發現由於母畜擠壓而死亡之仔豬且由驗 屍進行證實。

血清學

經由靜脈穿刺自每隻動物收集全血(5-10mL)。將樣本返回實驗室以藉由離心自凝塊分離。隨後將血清傾析至螺旋蓋之低溫小瓶中且在4℃下最大儲存24小時或在-70℃下冷凍直至可進行測試。使用IDEXX HERDCHEK^® PRRS ELISA 2XR(IDEXX Laboratories Inc,Westbrook,ME)針對PRRSV特異性抗體分析血清樣本。所有測試均如製造商之說明書所述來進行。若樣本陽性比(S/P)至少為0.4，則認為樣本對於PRRSV抗體係陽性的。

平均每日重量增加

記錄平均每日重量增加(ADWG)作為衡量研究動物健康狀況之另一參數。在每次使用前均校準之級別上記錄動物重量。對於呼吸道安全性研究而言，在接種免疫前3天(第-3天)及驗屍時(第14天)對動物進行稱重以用於平均每日重量增加分析。對於生殖安全性研究而言，在產仔8小時內對分娩之所有仔豬進行稱重且在21天後對所有剩餘之活仔豬再次進行稱重以供分析。

生殖安全性試驗病毒血症

經由逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)測試小母豬與仔豬血清中PRRSV核酸之存在性。藉由具有總核酸MagNA純套組(Roche Applied Science)之Roche MagNA純提取機器人提取血清。根據製造商之說明書，以AgPath-ID^TM NA及EU PRRSV Multiplex(Applied Biosystems)進行RT-PCR。在具有以下配置之Roche Lightcycler 480 96孔機器上運行反應：黏接步驟在45℃下歷時10min.，變性在95℃下歷時10min.及變性在97℃下歷時2sec.繼而黏接步驟在60℃下歷時40sec.進行40個循環，且最後為冷卻步驟在40℃下歷時40秒鐘。

生殖安全性研究動物臨床觀測

每日觀測所有研究動物之總體健康及與PRRS相關之臨床徵象。以對每一類指定之計分值評估每隻動物之呼吸、行為及咳嗽。可能計分值在0(正常)至1(異常)之範圍內。異常行為定義為異常呼吸、異常行為(諸如嗜睡)及存在咳嗽。基於3次個別計分值之總和記錄每日總分。將任何死仔豬指定為3分且隨後稱重，且隨後進行驗屍以確定可能之死因。除每日觀測以外，自處理前一日(第-1天)開始至研究結束(DOF+21)定期獲取小母豬之直腸溫度。

統計學/生物統計學

將呼吸道安全性及生殖安全性研究之所有資料輸入9.1版SAS中以供管理及分析。適當時，對於所有變數由處理組產生概要統計，包括平均、中值、標準偏差、標準誤差、最小值、最大值、變化係數及頻率分佈。對於豬及生殖研究而言，比較第1至4組(成對)相對於第5組之間之所有參數，且對於呼吸道研究而言，比較第1至3組相對於第4組之間之所有參數。根據APHIS所推薦之方法，僅報導雙面結果且所有比較均在α=0.05下。用於分析資料之特定方法展示於表2中。

結果： 序列分析

經歷連續細胞繼代之病毒在nsp2區上每約10次繼代及在ORF5區上在第50次繼代時進行基因體序列分析。如所預期，若干個分離株在整個過程中發生天然缺失。在細胞第50次繼代時，Isolate Y在nsp2區中具有連續6個核苷酸缺失，預期導致損失2個胺基酸。Isolate X-2在細胞第50次繼代時在nsp2區中展現連續63個核苷酸缺失，此導致損失連續21個胺基酸序列。Isolate X-9仍與JA-142類似且在nsp2區中無大的缺失。對ORF5區之定序結果顯示，MN184分離株仍具有1-8-4 RFLP切割圖案，而Isolate X分離株維持1-7-4 RFLP切割圖案。

來自生殖安全性試驗之樣本亦經歷序列分析以確定病毒在活體外如何穩定。來自研究最後一天(DOF+21)之所有PCR陽性仔豬血液樣本經歷嘗試性序列分析，且自每一接種疫苗組成功獲得至少一個序列。所有病毒在活體外複製之後保持相對穩定。來自每一個別動物之nsp2區定序揭示每種病毒僅存在數個取代。導致胺基酸變化之取代概括於表3中且與MN184A及JA142 AY424271相比進行描述。亦對ORF5區進行定序且所有分離株維持其初始切割圖案。

呼吸道安全性試驗肺部病理學

在第14天完成研究時，對所有動物進行驗屍且評估肺部病理(圖1)。使用ANOVA比較各組平均肺部計分值，僅野生型Isolate X組之臨床肺部計分值與陰性對照組相比在統計學上顯著增加。Isolate Y組與Isolate X-9組具有比Isolate X野生型組在統計學上顯著較低之肺部計分值。肺部計分值顯示細胞繼代過程的確顯著減小Isolate Y與Isolate X-9分離株之毒性，而Isolate X-2仍能夠導致某種程度之呼吸道疾病。

平均每日重量增加

對於呼吸道安全性研究而言，經由ANOVA之平均每日重量增加分析證實對於所有處理組之研究持續時間而言，各組之平均初始體重或平均每日增加在統計學上無顯著差異。野生型Isolate X處理比其他組具有略微較高之平均初始體重，此可歸因於與其他組相比缺少ADWG之統計學差異。

對於生殖安全性研究而言，ANOVA分析證實Isolate X-2組之仔豬在產仔時具有比陰性對照組在統計學上顯著較低之平均體重。有趣的係，所有處理組之仔豬與陰性對照組相比均具有在統計學上顯著較低之ADWG。然而，藉由使用另一種統計學測試ANCOVA，確定初始仔豬平均體重及初始仔豬平均體重-處理組相互作用顯著有助於仔豬ADWG，而每一仔豬所屬之處理組並不顯著有助於ADWG。

HERDCHEK ^® ELISA

對於呼吸道安全性研究而言，在第0天及第7天，經由IDEXX HERDCHEK^® PRRS ELISA 2XR，所有動物均為陰性的。然而，在第14天，Isolate Y組之所有動物及第4組(野生型Isolate X)之大多數動物已血清轉化，而投予Isolate X-2及X-9之處理組在約50次繼代之後展現不良血清轉化(圖2)。使用費希爾精確測試比較每一組中經血清轉化之動物數。結果顯示僅Isolate Y組及野生型Isolate X組與陰性對照 組相比具有顯著較高數目之由ELISA確定為陽性之動物。野生型Isolate X處理組與Isolate X-2組、而非Isolate X-9組中之動物在統計學上不同。

對於生殖安全性研究而言，所有動物在第0天及第7天仍為陰性的。然而，到第21天，接受病毒作為處理之幾乎所有小母豬均為陽性的。在研究持續期間，MN184處理組之小母豬全部維持由ELISA確定之陽性。在第21天、DOF 0及DOF+14，所有處理組之陽性動物與陰性對照組相比在統計學上顯著增加。

發現來自生殖安全性研究之仔豬具有相當量之PRRSV特異性抗體。對於所有樣本收集日而言，Isolate X-9及Isolate Y組在陽性ELISA測試中展示與屬於陰性對照組之仔豬相比在統計學上顯著增加。發現Isolate X-2處理組仔豬僅在DOF+7與陰性對照組在統計學上不同。

來自兩種研究之ELISA發現回應相同結果。儘管如由HERDCHEK^® PRRS ELISA 2XR所偵測，證明所有分離株均能夠誘發PRRSV特異性抗體反應，但在MN184處理組中所偵測之抗體之發作及持續時間似乎比Isolate X處理組之反應更早且持續更長。在Isolate X分離株中，Isolate X-9組始終比接受Isolate X-2之組具有更多測試陽性的動物。

小母豬生殖效能

如表4中所概述，研究中包括之所有雌性均分娩相對正常且健康之幼崽。

由於設施及勞動力限制，每種分離株僅使用4隻小母豬。在任何經測試之分離株中均無劇烈之毒性徵象。對於統計學分析而言，使用Wilcoxon雙樣本測試對每一處理組與陰性對照組之間進行比較。將出生仔豬總數、死產數、健康活仔豬數、弱小活仔豬數、木乃伊胎數及產仔21天後仍存活之豬數與陰性對照組進行比較。對於任何生殖效能變數均未發現統計學差異。該等發現顯示所述減毒過程已成功減少了由每種分離株引起之生殖失敗的量。

仔豬、豬及小母豬之死亡率

對於呼吸道安全性研究而言，在研究期間無動物損失。然而，對於生殖安全性研究而言，在DOF 0至DOF+21損失6隻仔豬。該等損失仍在斷乳之前所預期之仔豬死亡率範圍內。Isolate X-2處理組之一隻小母豬由於胎盤滯留引起之疾病而被施以安樂死。此小母豬僅分娩3隻死產仔豬，因此不違背仔豬效能資料。

病毒血症

對於大多數組而言，由RT-PCR所偵測之小母豬病毒血症相對較短(圖3)。使用費希爾精確測試將每一處理組與陰性對照組進行比較以供統計學分析。Isolate X-9組、Isolate Y組及Isolate X-2組在研究第14天對於PRRS RNA為陽性之動物在統計學上顯著增加，而Isolate Y組在第7天時亦在統計學上不同。陰性對照組在DOF+7時具有1隻測試陽性之動物。此可能係由於在加工過程某個時刻樣本受到污染，因為此係此組中唯一之陽性測試。

對於PRRS之重要安全性指示係自母畜經胎盤轉移至仔豬。對於Isolate X處理組而言，大部分仔豬在產仔日係陰性的。然而，到DOF+21，屬於Isolate X-9及Isolate Y處理組之大多數仔豬係陽性的，據推測係由於病毒之水平傳播。使用費希爾精確測試進行統計學分析。所有處理組均展現對PRRS RNA測試陽性之仔豬數在統計學上顯 著增加，除了Isolate X-2在DOF+7由於陰性對照組之26隻仔豬中有4隻在當日測試陽性而喪失顯著性。陰性對照陽性樣本可能係由於在樣本收集、處理及加工過程某個時刻受到污染，因為在DOF+7之前或之後並無其他陰性對照組樣本為PCR陽性(圖4)。

生殖安全性研究臨床觀測

記錄生殖安全性研究之臨床觀測作為剩餘分離株毒性之支持資料。除了被施以安樂死之小母豬以外，僅記載數個異常計分值為1之分離事件。在至少一天使用費希爾精確測試比較每組中具有臨床異常計分值之動物數時，並無某組與陰性對照組在統計學上不同。又，收集平均小母豬組之直腸溫度且使用ANOVA與陰性對照組進行比較。在第7天(Isolate X-9與Isolate X-2)及第14天(Isolate Y)注意到在統計學上顯著較高之平均直腸溫度。所有處理組之小母豬的體溫在研究持續期間維持正常。

對於仔豬臨床觀測計分值而言，與陰性對照組相比，Isolate X-9及Isolate X-2處理組中之仔豬臨床異常在統計學上顯著增加。Isolate Y處理組之仔豬P值為0.0547，此接近統計顯著性，但大於用於此研究之所有統計學分析所用之0.05截斷值。如前文提及，在研究期間發現8隻仔豬死亡(4隻來自Isolate X-9組、每個MN184組各1隻且2隻來自Isolate X-2組)。陰性對照組在研究期間未發現仔豬死亡。所有其他臨床異常動物未受到嚴重影響且無異常性違背研究結果。

在此研究中，描述一種繼代方法，其中藉由限制性稀釋使單一分離株繼代多次。使用頻繁序列分析作為選擇工具來活體外測試個別純系之疫苗潛能。標靶nsp2基因中之基因體缺失，因為咸信該等分離株在動物宿主中更具基因體穩定性，同時亦能夠提供針對野生型病毒之充分免疫保護。經由使用呼吸道及生殖動物模型針對基因體穩定性及安全性對所選分離株進行篩選。

此試驗結果充當所有分離株均在某種程度上減毒之證據。在與陰性對照組相比時，所有細胞繼代分離株之肺部病理學或平均每日重量增加均無統計學差異。此外，野生型Isolate X組之肺部病理學比Isolate Y及Isolate X-9組具有統計學上顯著較高之計分值。此研究中未使用野生型MN184，但先前已測試[17]。Johnson等人在細胞培養物第1次繼代時以MN184對十隻2-3週大之豬進行接種，且記錄彼組中到研究最初14天時有2隻豬死亡。對於MN184組而言未收集肺部病理學，但此組之死亡率代表親本野生型分離株之一般毒性。此處，在豬呼吸道試驗中，在研究過程中任何處理組均無動物損失。顯然，所有分離株引起呼吸道疾病之能力減小，但Isolate X-2組可能更小。與野生型Isolate X處理組相比，此組之肺部計分值並無統計學差異。

生殖安全性試驗之結果模擬呼吸道試驗之彼等結果。在與陰性對照組相比時，任何所測試分離株之所有生殖效能參數及小母豬臨床觀測均無統計學差異。兩種試驗之ELISA結果顯示，所有分離株到第21天為止均能夠在小母豬體內誘發產生PRRSV特異性抗體，儘管MN184組中之血清轉化似乎比在Isolate X組中更一致且更持久。RT-PCR所偵測到之病毒血症展示在小母豬體內，病毒僅在短時間內即在血液中達到可偵測之水準，而經胎盤傳播之病毒隨後水平擴散至所有組中之同窩幼畜。儘管先天性傳播之病毒的確傳播至同窩幼畜，但並未負面影響所有組之效能。在與陰性對照組相比時，Isolate Y組之仔豬臨床觀測並無統計學差異，此係先前關於目前可用減毒疫苗所述之現象。參見Mengeling WL、Lager KM、Vorwald AC.Clinical effects of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on pigs during the early postnatal interval.Am J Vet Res 1998 Jan；59(1)：52-5[20]，其以引用的方式併入本文中。隨著對可能恢復毒性形式之改質活疫苗的關注日益增加，疫苗分離株之穩定性增加且得到證明將變得愈加重 要。吾人之基因體穩定性資料顯示，該等分離株似乎足夠穩定，在nsp2及ORF 5區中具有相對極少變化，此係期望的且PRRS尤為如此。參見Wesley RD、Mengeling WL、Lager KM、Vorwald AC、Roof MB.Evidence for divergence of restriction fragment length polymorphism patterns following in vitro replication of porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Am J Vet Res 1999 Apr；60(4)：463-7[21]，其以引用的方式併入本文中。

提出之結果顯示，分離株能夠誘發活體外血清轉化且比親本病毒毒性小得多，但仍能夠導致某些疾病或產量損失。因此，該等分離株可在細胞培養物中進一步繼代以試圖進一步減毒且穩定基因體。96孔缺失繼代方法係一種用於產生具有增加功效及基因體穩定性之新穎改質活疫苗的有效且高效之方法。

實例2：細胞繼代-減毒PRRS病毒在5週大仔豬中之安全性

在此研究中，評估三種PRRSV純系之安全性：Isolate X-6、Wetzel Clone 3 p51及Wetzel Clone 9 p48。對5週大之三組6隻剖腹產分娩-剝奪初乳(CD-CD)豬之一經肌肉內(IM)投予2mL劑量之每種純系。第四組之5隻豬接受安慰劑且充當對照。基於PRRSV血清轉化、病毒血症及與PRRSV相關之肺部病變來評估純系之安全性。

在研究之第0天(D0)，對易受PRRSV影響(血清學陰性；<0.4，藉由ELISA對於PRRSV抗體而言)的二十三(23)隻健康5週大CD-CD仔豬以PRRSV Isolate X-6(T1組)、Wetzel Clone 3 p51(T2組)、Wetzel Clone 9 p48(T3組)或安慰劑(C組)進行接種。

在D0、第7天及第14天時，收集所有豬之血清樣本。在D14，對所有豬施以安樂死，此時進行大體病理學檢查及肺部病變計分。

在D-1至D14，每日臨床觀測總體健康狀況及與PRRS疾病相關之徵象，特定而言為呼吸、行為及咳嗽。在整個研究期間，任何豬均未 觀測到臨床徵象。另外，在驗屍時，任何豬均未觀測到肺部病變(計分值=0)。

在所有血清樣本上完成聚合酶鏈反應(PCR)，測試是否存在PRRSV病毒血症。所有組之豬的PCR結果在D0呈陰性，其表示在接種時沒有暴露到PRRSV。對照組C在其餘時間點的結果亦呈陰性，表示在研究期間之環境沒有暴露到PRRSV。在D7，T1組(6/6，100%)及T2組(6/6，100%)之所有豬均為PCR陽性，而T3組(0/6，0.0%)之所有豬均為陰性。在D14，T1組(6/6，100%)及T2組(6/6，100%)維持相同水準，而T3組(2/6，33.3%)顯示有兩隻豬出現PRRS病毒血症陽性。為證實該等最後兩隻豬中之PRRSV為其在接種時所接受之純系，進行ORF 5序列分析，結果與Wetzel Clone 9 p48匹配，表示無交叉污染及/或環境感染。

由IDEXX^® ELISA測定對於PRRSV之抗體效價。所有豬在D0均為血清陰性(<0.4)。此表示在接種時沒有母性抗體。所有豬在D7均維持陰性。在D14，T1組、T2組及T3組分別具有4/6(66.7%)、5/6(83.3%)及1/6(16.7%)之陽性豬。對照組在D14維持陰性，表示沒有暴露到PRRSV。

儘管仔豬在第14天時發生病毒血症，但資料顯示此研究中所用之PRRSV純系並未導致肺部病變及/或PRRSV感染之臨床徵象。認為該等純系對5週大之仔豬安全。

在此研究中，評估三種純系之安全性：Isolate X-6、Wetzel Clone 3 p51及Wetzel Clone 9 p48。對5週大之三組6隻剖腹產分娩-剝奪初乳(CD-CD)豬中之一組經肌肉內(IM)投予2mL劑量之每種純系。第四組之5隻豬接受安慰劑且充當對照組。基於PRRSV血清轉化、病毒血症及與PRRSV相關之肺部病變來評估純系之安全性，以有助於確定其用作MLV候選物之可行性。

此研究之目標在於評估PRRSV純系Isolate X-6、Wetzel Clone 3 p51及Wetzel Clone 9 p48在5週大仔豬體內之安全性。自第1天至第14天每天對所有仔豬進行臨床評估。評估包括死亡發生率、臨床計分值(呼吸窘迫、嗜睡、行為及咳嗽)、病毒血症、肺部病變、血清狀態及病毒分離(VI)。事件進程展示於表5中。

研究設計：

購買二十三(23)隻易受PRRS影響(ELISA<0.4)的CD-CD研究動物、運輸且隨後圈養在一起1週，之後在Veterinary Resources,Inc.'s(VRI)Cambridge,IA設施中進行疫苗接種。個別地識別測試動物且由研究調查者檢查總體健康狀況。

如表6中所示，仔豬隨機分為四組。

隨機化方法

為進行隨機分組，由研究調查者在研究開始之前準備該研究所包括之所有動物名冊。使用電腦隨機數產生器(Microsoft Excel)為每隻動物指定獨特之隨機數。將動物依體重分組(實驗組)中。在實驗組中，將具有最低隨機數之動物分配至第一處理組。以遞增之隨機數繼續分配，直至所有動物均分配至某一處理組。關於分組法可參見附件 7。

盲蔽方法

盲蔽該研究法，以評估實驗室樣本測試中之偏差。進行研究樣本實驗室測試之人並非施行處理或進行每日觀測之同一人。關於包涵標準參見表7。

淘汰政策

在動物期完成之前不自研究淘汰動物。

識別測試動物

由與處理組無關之雙重耳標識別所有測試動物。

動物管理及圈養

將動物根據其標準操作程序圈養於Veterinary Resources,Inc.之設施中。

動物看護

在研究開始前，認為動物處於良好健康及營養狀態。研究者在隨機化程序之前進行健康檢查。

由於CD/CD動物易受影響，因此所有仔豬在接種前六天(D-6)根據標籤說明接受一劑量之Pfizer EXCEDE^®。另外，在D-6至D0對仔豬餵飼PURINA^® Mills Senior加藥飼料。自D1至研究結束，仔豬接受PURINA^® Mills Senior飼料。

食物及水管理

根據設施標準操作程序，飼料定量適合測試動物之年齡、狀況及物種。在整個研究期間隨意提供水。

研究用獸醫產品(IVP)

藉由在經改質最低必需培養基(mMEM)中以2% FBS感染AK MA-104細胞來製備PRRSV純系。使培養物在37℃下培育直至CPE80%，此時將其置於-70℃下。在接種當日(D0)，自冷凍器移除燒瓶且使其在室溫下解凍。隨後將每種純系之懸浮液轉移至塑料之瓶塞蓋疫苗瓶中且標記為T1、T2或T3(參見表1)。隨後直接將其於冰上傳遞至研究地點。測試所有純系製劑且在接種前及接種後由TCID₅₀分析定量。對於對照組C而言，使用1×PBS作為安慰劑。在D0對豬投予2.0mL IM之適當IVP或安慰劑。在接種後將任何剩餘之IVP返回至BIVI-Ames。關於PRRSV純系IVP之詳情，參見表8、9及10。

藉由油脂精煉處置所有安樂死研究豬之屍體。在接種後或驗屍前不自研究移除測試動物。在投予所有劑量之研究用獸醫產品之後，將剩餘IVP返回研究監控人員進行適當處置。

評估CLONE安全性

基於血清轉化為PRRSV、病毒血症及與PRRSV相關之肺部病變的存在性/嚴重性來評估純系之安全性。接種後在任意時間點單次發生病毒血症將豬分類為病毒血症陽性。根據12.3.1部分中所述之程序計算每隻動物肺部之病理學百分比。將每個測試組之結果與對照組之結果相比較。亦對豬評估PRRSV在血清及肺部灌洗液中之分離、臨床觀測/計分值及死亡率。

使用無菌18-20g×1吋(2.54cm)至1.5吋(3.81cm)1-1½"VACCUTAINER^®針、VACCUTAINER^®針鉗及13mL血清分離管(SST)，由研究、研究者或指定人員經由前腔靜脈自每隻豬收集不超過10mL之靜脈全血。在接種前及在第7天及第14天收集血液。對每個血液管標記以動物之ID號、研究編號、收集日期、研究日及樣本類 型。

藉由PCR測試血清樣本之PRRSV病毒血症且使用市售測試-IDEXX^® PRRS ELISA測試血清樣本之PRRSV抗體。亦藉由病毒分離(VI)測試血清樣本是否存在PRRSV。每隻動物在接種疫苗之前均為PRRS血清陰性(ELISA S/P比率<0.4)，指示有效研究。病毒分離結果報導為陽性或陰性。

臨床觀測

由研究者或指定人員在第-1天至第14天每天觀測豬之總體健康狀況及與PRRS疾病相關之臨床徵象。特定而言，每天檢查豬之呼吸、行為及咳嗽，每一類定級0為正常且1為異常(參見表11)。每隻豬之每日總分為其在特定日之呼吸計分值、行為計分值及咳嗽計分值之總和。在研究期間未發生死亡。

呼吸、行為、咳嗽及觀測計分值計分如下：呼吸計分值：0=正常呼吸、1=異常呼吸；行為計分值：0=正常行為、1=異常行為；咳嗽計分值：0=未注意到咳嗽、1=存在咳嗽。

在驗屍當日，在收集資料及樣本之後，由研究者或指定人員對每隻豬施以安樂死且進行驗屍。安樂死之後，研究者或指定人員完整移除肺部及氣管，沿氣管置放一夾鉗以防止血液交叉污染。觀測肺部病理學之一般描述且記錄每個肺葉中之病理學百分比。藉由每個肺葉之肺部病理學百分比總和確定每隻豬之肺部病理學總%。

在評估肺部之病理學之後，由研究者或指定人員自每一組肺收集肺部灌洗樣本。對每個樣本標記以動物編號、研究編號、樣本類型、收集日期及研究日。對此研究而言，未收集肺部組織樣本。

結果：

在第0天，所有豬之ELISA結果均為陰性(S/P<0.400)，表示在接種時沒有母性抗體存在。第0天，T1組、T2組、T3組及C組之平均值 分別為-0.070、-0.042、-0.037及-0.032。所有豬在第7天仍為陰性，T1組、T2組、T3組及C組之平均值分別為-0.069、-0.038、-0.023及-0.053。在第14天，T1組中四隻陽性豬(4/6，66.7%)、T2中五隻陽性豬(5/6，83.3%)且T3組中一隻陽性豬(1/6，16.7%)。然而，C組仍為全部陰性(0/5，0.0%)。T1組、T2組、T3組及C組在第14天之平均值分別為1.122、1.024、0.247及-0.045。ELISA資料可見於表11中。

在第0天，所有豬均為PCR陰性，表示在接種時沒有暴露到PRRSV。在第7天，T1組(6/6，100%)及T2組(6/6，100%)中之所有豬均為陽性，而T3組(0/6，0.0%)及C組(0/5，0.0%)全部為陰性豬。第14天，每組中陽性豬之數目為T1 6/6(100%)、T2 6/6(100%)、T3 2/6(33.3%)及C 0/5(0.0%)。對照組C在整個研究期間沒有陽性豬，表示該環境沒有暴露到PRRSV。PCR總數可見於表12中。

由於T3組直至第14天尚未展示任何PCR陽性豬之事實，因此進行定序以證實88及97號豬受Wetzel Clone 9感染。比較由上文所列之豬 分離之PRRSV與此研究中所用之三個PRRSV純系之間的ORF 5序列。來自88及97號豬之結果與Wetzel純系9同源。序列結果可見於圖5中。

血清樣本上之病毒分離與PCR結果類似。在第0天，由CPE及FA顯示所有豬均為陰性。在第7天，對於CPE及FA而言，T1組、T2組、T3組及C組每組中之陽性豬分別為6/6(100%)、6/6(100%)、2/6(33.3%)及0/5(0.0%)。在第14天，對於CPE及FA而言，T1組、T2組、T3組及C組每組中之陽性豬分別為5/6(83.3%)、2/6(33.3%)、5/6(83.3%)及0/5(0.0%)。對照組C在整個研究期間再次保持陰性，表示沒有暴露到PRRSV。參見表13中之病毒分離-血清結果。亦在驗屍時獲得之支氣管-肺泡灌洗樣本上進行病毒分離。結果顯示T1組、T2組、T3組及C組分別為2/6(33.3%)、3/6(50.0%)、1/6(16.7%)及0/5(0.0%)陽性豬。關於病毒分離-灌洗結果，參見表14。

臨床觀測

所有豬均具有0之臨床計分值，意謂未觀測到異常之臨床呼吸徵象、異常行為或咳嗽。關於觀測計分值，參見表15。

所有豬均具有0之肺葉病理學%計分值，意謂在經大體病理學檢查後在任何肺葉上均無可見病變。關於肺部病變計分值參見表16，且關於IVP滴定參見表17。

結論：

此研究之目標在於評估PRRSV純系Isolate Y-6、Wetzel Clone 3 p51及Wetzel Clone 9 p48在5週大仔豬中之安全性以確定其作為疫苗候 選物之活力。儘管在接種14天後無可見之肺部病變，但對於兩個純系(Isolate Y-6及Wetzel Clone 3 p51)而言，到第7天時存在PRRS病毒血症。接種第三種純系(Wetzel Clone 9 p48)之兩隻仔豬在第14天時測試PCR陽性。另外，在病毒血症存在一週後，直至第14天，在任何IVP仔豬中均未偵測到PRRSV抗體。儘管仔豬到第14天時發生病毒血症，但資料顯示此研究中所用之PRRSV純系並未導致肺部病變及/或PRRSV感染之臨床徵象。認為該等純系在5週大仔豬體內係安全的。未來研究應包括接種疫苗-攻毒模型以確定該等純系在以PRRSV進行毒性攻毒後減少肺部病變之能力。

實例3：減毒PRRS病毒(Wetzel減毒)在呼吸道攻毒模型中之功效

此研究之目標在於評估INGELVAC PRRS^® MLV及實驗疫苗在呼吸道攻毒模型中針對最近之NA-PRRSV攻毒分離株的功效。評估包括死亡率、臨床計分值(呼吸窘迫、行為、咳嗽等)、病毒血症、肺部病變、血清學、病毒分離、平均每日增加及直腸溫度。

此研究之目標在於評估INGELVAC PRRS^® MLV及實驗疫苗在呼吸道攻毒模型中針對最近之NA-PRRSV攻毒分離株的功效。評估包括死亡率、臨床計分值(呼吸窘迫、行為、咳嗽等)、病毒血症、肺部病變、血清學、病毒分離、平均每日增加及直腸溫度。在表18中提供事件進程。

個別地識別65隻易受PRRS影響之研究豬且由研究者進行檢查，且認為健康以供錄用。將豬隨機分為四組，如表19中所示。

在第0天，在研究之第0天(D0)，對第2組及第3組分別根據標籤說明以INGELVAC PRRS^® MLV或2.0mL實驗疫苗經IM進行疫苗接種。第1組以相同方式接受等劑量之安慰劑。SC組充當嚴格對照且不接受處理。在3週大時對豬進行疫苗接種。在D22，以1-4-4分離株對第1組、第2組及第3組進行攻毒。在攻毒期間僅兩個室可用。將第1組與第2組圈養在一起且第3組留在其初始室中。攻毒途徑及劑量為1.0ml經鼻內(每鼻孔0.5mL)。在攻毒當日滴定攻毒病毒之效能，結果指示每次給藥傳遞5.13 log之劑量。攻毒後第14天(D36)，對所有豬施以安 樂死並驗屍。移除肺部及氣管，且觀測肺部病理學之一般描述。記錄每一肺葉中之病理學百分比。計分之後，收集肺部灌洗。藉由PCR測試個別肺部灌洗液中是否存在PRRSV。

獲取直腸溫度且自攻毒前一天(D21)至驗屍日(D36)對動物進行觀測；觀測係關於死亡率、呼吸窘迫、行為及咳嗽。在D0接種疫苗之前且在D7、14、21、D28及D35收集血清。藉由IDEXX^® ELISA個別地測試血清樣本之PRRSV抗體且藉由PCR、qPCR及VI測試血清樣本之病毒血症。另外，收集固定肺部組織且若必要保留用於組織測試。在研究開始時(第0天)、攻毒時(第22天)及在驗屍之前(第36天)對動物進行稱重。在此研究中使用65隻混合育種、混合性別、個別識別之豬，其在研究中分配之前係PRRSV抗體與病毒血症陰性的。將動物根據適當之SOP圈養於BSL2設施中。為消除各組間散毒，在研究持續期間將疫苗與對照物分房置放，參見表1。又，SC組與未經接種疫苗之第1組保持在一起直至攻毒日且在第22天進行驗屍。

根據該等區可接受之動物管理實踐，動物空間適合豬之大小及數目。根據設施標準操作程序，飼料定量適合測試動物之年齡、狀況及物種。在整個研究期間隨意提供水。在研究期間未向豬投予方案以外之生物劑或醫藥劑。

疫苗、安慰劑及攻毒病毒

關於此研究中所用之疫苗、安慰劑及攻毒病毒，參見表20、21、22及23。

有效性評估

基於PRRSV病毒血症及與PRRSV相關之肺部病變總百分比的減少來評估疫苗功效。接種疫苗後在任意時間點單次發生病毒血症將豬 分類為病毒血症陽性。根據實驗方案中所述之程序計算每隻動物肺部之病理學百分比。亦對豬評估PRRSV在血清及肺部灌洗液中之分離、臨床觀測/計分值、血清學、死亡率、平均每日增加(ADG)及直腸溫度。

結果：

在驗屍報導記錄(Necropsy Report Record)上記錄肺部病理學之一般描述及每一肺葉中之病理學百分比。藉由總和每一肺葉之肺部病理學百分比來確定每隻豬之肺部病理學總百分比。附錄中包括個別肺部病變計分值。概括性統計學列於表24中。使用3型測試及最小均方差值，在混合程序中使用SAS來分析肺部計分值；處理及空間由於圈養限制而混亂。在與攻毒對照組相比時，兩個接種疫苗之組中具有統計學上顯著較低之肺部計分值。未提交組織病理學。

在評估肺部之病理學之後，由研究者或指定人員自每一組肺收集肺部灌洗樣本。藉由PCR、qPCR及VI測試肺部灌洗樣本之PRRSV。基於qPCR，所有BAL樣本對於攻毒病毒而言均為陽性的。在BAL中偵測之病毒量在統計學上無差異。

在D0、D7、14、22、D28及D36收集血液。自每一管收穫血清且轉移至低溫小瓶中用於保留且轉移至HMC中用於測試。將BIVI-Ames處之血清樣本保持在2-8℃下直至測試且保持在-70±10℃下用於保留。

血清樣本係用於使用市售測試(IDEXX® PRRS ELISA)之PRRSV 抗體。ELISA結果記錄為樣本與陽性(S/P)比。S/P比0.4被認為係陽性。結果展示於圖6中。

由PCR及qPCR測試對於PRRSV而言之病毒血症。結果報導為陽性或陰性，其使用用於任何PRRS病毒之通用引子。接種疫苗後在任意時間點單次發生病毒血症將豬分類為病毒血症陽性。藉由使用經特定設計用以在不偵測每一疫苗病毒之情形下偵測攻毒144 PRRS病毒之引子的qPCR測試來確定PRRS病毒之相對複本數。使用3型測試及最小均方差值，在混合程序中使用SAS來分析定量資料；處理及空間由於圈養限制而混亂。在第29天，W96117#9 p42接種疫苗組之血清中具有比攻毒對照組顯著較少之病毒(p-值=<0.0001)。在第36天，經INGELVAC PRRS^® MLV接種疫苗之組比攻毒對照組具有顯著較少之病毒血症(p-值=0.0089)。結果展示於圖7中。

臨床觀測

由研究者或指定人員自攻毒前一天(D27)至驗屍當日(D36)每天觀測豬之總體健康狀況及與PRRS疾病相關之臨床徵象。特定而言，每天檢查豬之呼吸、行為及咳嗽，每一類正常定級為0且異常定級為1。結果展示於圖8中。

自D22至D36，每天獲取直腸溫度。使用JMP8.0學生檢驗分析資料。在比較經W96117#9 p42疫苗接種疫苗之組的溫度反應時，平均溫度與攻毒對照組相比在第22至25天顯著較高，且在第26、33至35天顯著較低。在比較經接種疫苗之組時，在第24天及第29天具有比攻毒對照豬顯著較高之平均溫度；在第22、33至35天之平均溫度顯著較低。在此研究中，攻毒對照組之一隻豬在第35天時由於發病而被施以安樂死。結果展示於圖9中。

在第0天、第22天及第36天對動物進行稱重。計算接種疫苗期間及攻毒期間之總的平均重量增加。使用3型測試及最小均方差值，在 混合程序中使用SAS來分析重量增加資料；處理及空間由於圈養限制而混亂。經INGELVAC PRRS^® MLV接種疫苗之組與攻毒對照組相比在接種疫苗期間具有統計學上較低之增加(p-值=<0.0001)且在攻毒期間具有統計學上較高之增加(p-值=0.0039)。W96117#9 p42組在攻毒期間具有比攻毒對照組顯著較高之增加(p-值=<0.0001)。結果展示於圖10中。

論述：

此研究之目標在於評估INGELVAC PRRS^® MLV及實驗疫苗在呼吸道攻毒模型中針對最近之NA-PRRSV攻毒分離株的功效。攻毒分離株具有高度毒性且產生極高(高達100%之肺部病變計分值，指示肺炎)肺部病變及明顯之臨床疾病，包括重量損失及死亡。

在毒性攻毒存在下評估兩種疫苗之功效。通常推薦在預期攻毒期之前4週對豬接種疫苗。然而，在此研究中，在接種疫苗後22天時對豬進行攻毒。兩種疫苗均導致統計學上顯著減少之肺部病變，重量增加在攻毒後之時期內得以改良且病毒血症在攻毒後減少。

在此研究之過程中，研發一種特定半定量性PCR來特定偵測144攻毒病毒。以此工具，血清病毒血症資料可對攻毒病毒具特異性且不偵測疫苗病毒。證實未經接種疫苗之組在移至具有經接種疫苗之動物之室中之後在攻毒期間無可偵測之疫苗病毒。

實例4： Wetzel預減毒(p3 Wetzel(SEQ ID NO：1之核苷酸序列))與Wetzel減毒((SEQ ID NO：2之核苷酸序列))之核苷酸及由其編碼之蛋白質序列 核苷酸序列

此研究之目的在於為PRRSV分離株預減毒Wetzel病毒株(p3)及減毒後疫苗Wetzel病毒株(p41)提供PRRSV全基因體序列。預減毒及減毒後疫苗病毒株之基因體定序可提供有助於理解病毒適應性之生物決定 子及病毒恢復所需之界限的重要信息。注意，儘管PRRSV病毒係單股RNA病毒，但本文揭示DNA等效物(其中T取代實際RNA病毒序列中之U)與NCBI GenBank用法一致。

基因體定序

採用一種病毒宏觀基因體學方法，其中使每種PRRS病毒之組織培養物質經受病毒粒子保護之核酸提取及隨機引物擴增子之454-定序。總計嘗試6種病毒株：1-4-4(資料未展示)、第3次繼代Wetzel(p3)、p10 Wetzel、p20 Wetzel、p30 Wetzel、p40 Wetzel及疫苗病毒株p41 Wetzel。在7次嘗試中，對於6種病毒株之完全/近完全基因體分析實現充分定序，其中p20 Wetzel失敗。表25顯示每種分離株之序列數及平均覆蓋深度。獲得高百分比之PRRSV序列且在任何樣本中均未偵測到其他病毒。p3 Wetzel及p41 Wetzel之基因體序列在下文中分別列為序列ID 1及2。

減毒之組分

對在減毒期間測試之每次繼代時經改質或具多形性之彼等位置進行詳細分析；基於定序資料，在疫苗病毒株中確定無大規模之缺失。如表26中概述，在p3與p41之間識別33個點突變，大部分(19/33)係靜止的或具多形性。

蛋白質序列：

來自Wang等人(22)(刪除內部參考；明確以引用方式併入本文中)：PRRSV係一種包括編碼九個ORF之約15kb基因體的小包膜單股陽性RNA病毒。PRRSV基因體包含兩個聚合酶基因(ORF1a與1b)及七個結構基因(ORF2a、2b、3、4、5、6及7)。ORF1a與ORF1b佔病毒基 因體之約75%，且由轉譯為大的聚合蛋白質之核糖體框架移位方法來表徵；其自身裂解產生包括RNA依賴型RNA聚合酶之非結構蛋白質(NSP)。開放閱讀框架2a、3、4及5均編碼糖基化蛋白質，分別指定為GP2a、GP3、GP4及GP5。最新定義之ORF2b編碼指定為GP2b之病毒粒子的最小蛋白質。ORF7編碼非糖基化核鞘蛋白質(N)，佔病毒粒子之蛋白質含量的20-40%。ORF6編碼類似非糖基化基質蛋白質(M)。

識別由SEQ ID NO：1及2之核苷酸序列編碼之多肽，且列舉如下：

由SEQ ID NO：1編碼之p3 Wetzel蛋白質序列

由SEQ ID NO：2編碼之不同於p3序列之p41減毒Wetzcl蛋白質序列

參考文獻：

以下參考文獻以對本文所述之彼等內容提供例示性程序或其他 詳細補充之程度而特定以引用的方式併入本文中。

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根據本發明，在無需過度實驗之情況下，可製造並執行本文中所揭示且主張之所有組合物及方法。雖然已依照較佳實施例描述本發明之組合物及方法，但熟習此項技術者將顯而易見，在不偏離本發明之概念、精神及範疇之情況下，可對本文所述之組合物及方法及該方法之步驟或步驟次序施加變化。更特定而言，將顯而易見，在可達成相同或類似之結果的情況下，可用化學上與生理學上均相關之某些試劑替代本文所述之試劑。認為熟習此項技術者易於瞭解之所有該等類似替代及修改在如下文申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概念的範圍內。

<110> 美商百靈佳殷格翰家畜藥品公司

<120> 豬生殖與呼吸道症候群病毒、組合物、疫苗及使用方法

<130> 10-0145-WO-1

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<150> 61/791,504

<151> 2013-03-15

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人造序列

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<221> 來源

<223> /註釋=「人造序列之描述：合成引子」

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Claims (19)

1. 一種豬生殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)之免疫原性組合物，其包含以下至少一者a)包含聚核苷酸之組合物，該聚核苷酸為i)SEQ ID NO：1之聚核苷酸(預減毒Wetzel p3)，或ii)SEQ ID NO：2之聚核苷酸(減毒Wetzel p41)；b)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之聚核苷酸之免疫原性片段；c)選自由以下組成之群之多肽i)SEQ ID NO：3(Wetzel p3之ORF1a蛋白質)ii)SEQ ID NO：4(Wetzel p3之ORF1b蛋白質)、iii)SEQ ID NO：5(Wetzel p3之GP2蛋白質)、iv)SEQ ID NO：6(Wetzel p3之GP3蛋白質)、v)SEQ ID NO：7(Wetzel p3及Wetzel p41之GP4蛋白質)、vi)SEQ ID NO：8(Wetzel p3之GP5蛋白質)、vii)SEQ ID NO：9(Wetzel p3及Wetzel p41之M蛋白質)、viii)SEQ ID NO：10(Wetzel p3及Wetzel p41之N蛋白質)、ix)SEQ ID NO：11(Wetzel p41之ORF1a蛋白質)、x)SEQ ID NO：12(Wetzel p41之ORF1b蛋白質)、xi)SEQ ID NO：13(Wetzel p41之GP2蛋白質)、xii)SEQ ID NO：14(Wetzel p41之GP3蛋白質)及xiii)SEQ ID NO：15(Wetzel p41之GP5蛋白質)；或d)SEQ ID NO：3-15之多肽之免疫原性片段。
2. 一種經分離之聚核苷酸，其包含以下聚核苷酸a)具有SEQ ID NO：1(預減毒Wetzel p3)或SEQ ID NO：2(減毒Wetzel p41)之核酸序列； b)具有編碼SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之多肽的核酸序列；c)具有與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2 95%相同且編碼具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之多肽之生物學或免疫有效活性之多肽的核酸序列；d)係SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之核酸序列之片段，其包含SEQ ID NO：1之至少30個鄰接核苷酸序列，或e)係SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之核酸序列之片段，其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之至少30個鄰接核苷酸序列且編碼SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列的免疫有效活性。
3. 一種經分離之多肽，其包含以下多肽a)具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列；b)具有與SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15 95%相同之胺基酸序列且具有分別由SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15編碼之多肽的生物學或免疫有效活性；c)係SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列之片段，其分別包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之至少15個鄰接胺基酸；d)係SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列之片段，其分別包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之至少15個鄰接胺基酸且具有免疫有效活性；或e)係由包含該等SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2序列中所包括之至少15個連續核苷酸之聚核苷酸編碼的蛋白質片段。
4. 一種經分離之豬生殖與呼吸道症候群病毒(PRRSV)，其包含a)SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之核酸序列，或 b)與SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2 95%相同之核酸序列，其編碼具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之多肽之生物學或免疫有效活性之多肽。
5. 如請求項4之PRRSV，其包含減毒、非毒性形式之PRRSV。
6. 一種用於治療或預防毒性PRRSV感染之疫苗，其包含如請求項4之PRRSV之滅活或減毒形式。
7. 一種用於治療或預防毒性PRRSV感染之疫苗，其包含如請求項4之PRRSV之滅活或減毒形式之次單位。
8. 一種免疫原性製劑，其包含免疫有效量之如請求項3之多肽及醫藥學或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
9. 一種如請求項4之PRRSV之用途，其係用於製造用以在哺乳動物體內產生免疫反應之免疫原性組合物。
10. 一種如請求項3之多肽之用途，其係用於製造用以在哺乳動物體內產生免疫反應之免疫原性組合物。
11. 一種用於治療或預防毒性PRRSV感染之次單位疫苗，其包含如請求項3之多肽。
12. 一種免疫原性製劑，其包含免疫有效量之如請求項3之多肽及醫藥學或獸醫學上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑。
13. 一種如請求項6或7之疫苗的用途，其係用於製造用以在哺乳動物體內產生免疫反應之免疫原性組合物。
14. 如請求項13之用途，其中該哺乳動物係豬。
15. 如請求項13之用途，其中該免疫原性組合物對由PRRSV感染引起之疾病提供保護性免疫。
16. 一種經分離之抗體，其特異性地結合由具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之序列之聚核苷酸編碼之PRRSV多肽，該多肽具有SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15之胺基酸序列，且其中該抗體不會結合由不同PRRSV病毒株編碼之多肽。
17. 一種包含如請求項2之聚核苷酸的載體或質體。
18. 一種包含如請求項17之載體的宿主細胞。
19. 一種表現如請求項16之抗體的融合瘤。