CN112079921A - 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清及其制备方法。所述血清主要用于兽用生物制品的质量控制，该血清的制备包括猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原的制备、阴性试验动物的筛选、免疫及抗体水平监测及阳性血清检定。采用本发明制备的阳性血清纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染；特异性好，不含有除猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体外的其他猪常见病原抗体，中和效价高≥1:32。以上特征充分满足了外源病毒检验用阳性血清的要求，解决了长期困扰兽用生物制品行业猪繁殖与呼吸综合征活疫苗质量控制缺少标准阳性血清的瓶颈问题，对于提升我国猪繁殖与呼吸综合征活疫苗质量和猪繁殖与呼吸综合征疫病防控水平具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清及其制备方法，属于生物技术和动物病毒学领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS)，俗称“猪蓝耳病”，是一种引起母猪繁殖障碍及新生仔猪呼吸道症状和高死亡率的急性、高度传染性的疾病。该病在上个世纪80、90年代，曾在世界范围内流行和传播，给养猪业常造成严重经济损失。郭宝清等1996首次从国内疑似PRRS感染猪群中分离出PRRSV(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus)，从而证实了本病在我国的存在。随后各地相继发生流行性感染，特别是2006年，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)的出现，给我国养猪业带来了近乎毁灭般的打击。直到现在，该病仍是严重威胁我国养猪业发展的重要传染病之一。
目前我国蓝耳病以预防为主，猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗应用广泛。在兽用生物制品制造的过程中，因需要采用多种生物性原材料，如血清、胰酶、细胞等，极易受到外源因子的污染。而所污染的外源因子的不确定性给检验带来极大的困难。目前按照现行《中国兽药典》的规定，猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗和高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗需进行外源病毒检验。检验时应采用特异性血清对疫苗毒进行中和。PRRSV是典型的抗体依赖性的病毒，病毒的存在会对抗体的产生起到抑制作用，所以机体不易产生高效价的抗体，且抗体的存在也不能完全抑制病毒的增殖。在外源病毒检验过程中，低效价的猪繁殖与呼吸综合征病毒血清不能完全中和疫苗毒及种毒，且生产企业自行制备的血清存在特异性差、效价低、血清对细胞毒性大、外源因子污染等问题，严重影响了产品质量检验。
目前，已有一种采用兔体进行猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清制备的方法，制备的血清效价为1:16以上，用于毒种的鉴别检验，中和效价达不到外源病毒检验用病毒中和的目的，且兔血清往往对细胞毒性较大，不适合细胞培养试验用(专利申请号201210449829.0)。目前尚未见有采用经剖腹产且不吃母乳的猪(CDCD猪)免疫，浓缩抗原作为免疫原，制备出能保证良好纯净性和特异性且高效价的专门用于疫苗质量控制的猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清制备的报道。本发明提供了一种针对猪繁殖与呼吸综合征病毒高效价、成分单一、纯净良好的特异性阳性血清的制备工艺，该工艺制备的阳性血清充分满足了外源病毒检验对检验试剂的要求，解决了长期困扰高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征活疫苗质量控制的瓶颈问题，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。
发明内容
本发明为解决兽用生物制品标准物质短缺问题，提供了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清制备工艺。采用该工艺制备的阳性血清中和效价高，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时猪繁殖与呼吸综合征活疫苗中和不完全的问题；纯净性好，不含有其他猪常见病原；特异性好，不含有除猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体外的其他猪常见病原抗体。以上特征充分满足了外源病毒检验对阳性血清的要求，解决了长期困扰猪繁殖与呼吸综合征活疫苗质量控制的瓶颈问题，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。
为实现上述目标，本发明实施了以下技术方案：
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清，其特征在于该阳性血清是采用剖腹产、隔离饲养、人工饲喂的方式，排除了母源抗体的干扰的CDCD猪(经剖腹产且不吃母乳的猪)经高浓缩抗原多次免疫获得的，其血清的中和抗体效价≥1:32。
2.本发明所述一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清，其特征在于该血清的制备方法是：
(1)免疫原制备：将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)稀释成104.0TCID50/mL，按MOI0.01～0.001接种Marc145细胞，37℃培养3～5日，当CPE达80％或以上时收获病毒液，经冻融三次后，离心去除细胞碎片，将上清液浓缩100倍，经反复清洗并恢复至原体积的1/100，在经无菌检验、支原体检验、鉴别检验和外源病毒检验合格，且病毒含量不低于109.0TCID50/mL作为免疫抗原；
(2)动物的选择：选择3～4月龄(体重40～60kg)CDCD猪，猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒抗原和抗体均为阴性的健康猪；
(3)免疫及抗体水平监测：以每头猪1mL免疫抗原肌肉接种作为基础免疫；2个月后，每头猪分别肌肉接种5mL，加强免疫后14天开始每隔7天采血检测血清中高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中和抗体效价和病毒抗原。以血清中和抗体效价≥1:32且蓝耳抗原为阴性为最佳采血时间；
(4)血清采集：采取颈动脉放血法采集免疫猪血清，在37℃静置1小时后，转入2～8℃过夜，经离心分离血清；
(5)血清的检验：将上述最小取样单位作为独立的样品分别进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。其中外源病毒检验除满足国家标准要求外，采用细胞培养法对本病原进行检测；特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。检验合格的血清混合，分装，贴上标签，注明血清名称、批号、规格、生产日期等，置-15℃以下保存。
3.本发明所述一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清，其特征在于该血清主要用于兽用生物制品质量控制，也可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的其他相关检测。
本发明的积极意义
本发明涉及一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清及其应用。所述工艺包括猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫原的制备、阴性试验动物的筛选、免疫及抗体水平监测及阳性血清检定。采用本发明制备的阳性血清纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染；特异性好，不含有除猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体外的其他猪常见病原抗体，中和效价高≥1:32。以上特征充分满足了外源病毒检验用阳性血清的要求，解决了长期困扰兽用生物制品行业猪繁殖与呼吸综合征活疫苗质量控制缺少标准阳性血清的瓶颈问题，对于提升我国猪繁殖与呼吸综合征活疫苗质量和猪繁殖与呼吸综合征疫病防控水平具有重要意义。
本发明所获得的新的技术效果在于：
(1)采用纯净、高效价的毒种作为免疫原，确保了阳性血清的纯净性和免疫效果；
(2)采用CDCD猪作为免疫动物，确保了阳性血清纯净性；
(3)采用多次免疫，密集监测抗体水平，确保了阳性血清高效价；
(4)对血清进行全面的检定，确保了阳性血清的质量。
(5)该工艺制备的阳性血清，适用于任何毒株的猪繁殖与呼吸综合征病毒毒种、制品的外源病毒检验、鉴别检验等。
具体实施方式
1.免疫原制备
将猪繁殖与呼吸综合征病毒(任意株猪繁殖与呼吸综合征病疫苗生产毒株或经过严格鉴定猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株均可以作为阳性血清制备毒株)稀释成104.0TCID50/mL，按MOI 0.01～0.001接种Marc145细胞(该细胞经证实对PPRSV敏感，且纯净无污染)，37℃培养3～5日，应出现典型的细胞病变(CPE)。在CPE达80％或以上时收获。将收获的病毒液冻融三次后，8000r/min离心30min去除细胞碎片，取上清液经100KD膜包超滤浓缩100倍，然后用5～10倍的PBS反复清洗至无色并恢复至原体积的1/100，经无菌检验、无支原体检验、鉴别检验和外源病毒检验合格，且病毒含量不低于109.0TCID50/mL后，分装成10mL/瓶，-70℃以下保存，作为免疫原。
2.动物的选择
选择3～4月龄(体重40～60kg)CDCD猪，猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒抗原和抗体均为阴性的健康猪；实验前动物舍要经过严格的消毒处理，实验期间要严格控制动物舍的环境卫生和人员流动，避免交叉污染。
3.免疫及抗体水平监测
将制备好的免疫原每头猪肌肉注射1mL作为基础免疫；基础免疫2个月后，每头猪分别肌肉注射5mL，继续观察。加强免疫后14天开始每隔7天采血检测血清中蓝耳中和抗体效价和PRRSV抗原(Marc145培养后进行免疫荧光检测)。以血清中和抗体效价≥1:32且蓝耳抗原为阴性为最佳采血时间。若离上次免疫2个月以上中和抗体效价仍达不到1:32，可再进行一次免疫。
4.血清采集
猪血清采集采取颈动脉放血法，可最大程度保证无菌操作。使用的容器具均需灭菌处理。具体操作如下：猪仰卧固定后，将颈部用碘酊消毒后，再用75％酒精脱碘。局部消毒后，在靠近气管的一侧切开皮肤将皮下组织与肌肉作钝性分离，以手指沿气管处摸到强烈博动的颈动脉，轻轻用手指勾出并小心将其与颈静脉和迷走神经分开，剥离动脉外结缔组织，将颈动脉两端用止血钳夹住，以手术刀在两止血钳之间的动脉上作一纵行切口，将连有消毒硅胶管的玻璃牛角管插入动脉腔内并固定，将橡皮管的另一端插入消毒的采血容器内，打开近血端的止血钳让血液流入牛角管内。待采血到猪失去挣扎能力时，将猪四肢松绑，活动其四肢，并锤击猪心脏部位，以增加出血量。每头猪采血时均需更换容器具和器材。采血完毕后将采血容器加盖，在37℃静置1小时后，转入2～8℃过夜。第2天在无菌室II级生物安全柜内分离血清后，10000r/min离心20min，取上清。将分离的血清放入56℃水浴灭活30min，每瓶取样10mL待检，其余置-15℃以下保存。
5.血清的检验
将上述最小取样单位作为独立的样品分别进行性状检验、无菌检验、、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。其中外源病毒检验除满足国家标准要求外，采用细胞培养法对本病原进行检测；特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。检验合格的血清混合，分装，贴上标签，注明血清名称、批号、规格、生产日期等，置-15℃以下保存。
实施例
以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制。
实施例1——阳性血清的制备
1.免疫原制备
将猪繁殖与呼吸综合征病毒TJM-F92株(来自商品化的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗TJM-F92株)稀释成104.0TCID50/mL，按MOI 0.01接种Marc145细胞，37℃培养3～5日，应出现典型的细胞病变(CPE)。在CPE达80％或以上时收获。将收获的病毒液冻融三次后，8000r/min离心30min去除细胞碎片，取上清液经100KD膜包超滤浓缩100倍，然后用5～10倍的PBS反复清洗至无色并恢复至原体积的1/100，分装成10mL/瓶，分别进行无菌检验、无支原体检验、病毒含量测定、鉴别检验和外源病毒检验。结果该批免疫原病毒含量为109.25TCID50/mL，无菌、无支原体、无外源病毒污染，-70℃以下保存备用。
2.动物的选择
选择经剖腹产且不吃母乳的3月龄(体重40～60kg)CDCD猪。经检测，猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒抗原和抗体均为阴性(每头猪为1个批次)。实验前动物舍经过严格的消毒处理，实验期间严格控制动物舍的环境卫生和人员流动，避免交叉污染。3头猪常见病原抗体检测结果见下表1：
表1 3头猪常见病原抗体检测结果
3.免疫及抗体水平监测
将制备好的免疫原每头猪肌肉注射1mL作为基础免疫；基础免疫2个月后，每头猪分别肌肉注射5mL，继续观察。加强免疫后14天开始，每隔7天采血检测血清中蓝耳中和抗体效价，同时检测其抗原。加强免疫后2个月时，抗体效价未达到1:32，再加强免疫一次。经监测，在第三次免疫后28～35天时，3头猪血清中和抗体效价分别达到1:64、1:128、1:64，且血清中蓝耳病抗原(采用Marc145培养法检测)为阴性，此时为最佳采血时间。
4.血清采集
采取颈动脉放血法采集猪血清。具体操作如下：猪仰卧固定后，将颈部用碘酊消毒后，再用75％酒精脱碘。局部消毒后，在靠近气管的一侧切开皮肤将皮下组织与肌肉作钝性分离，以手指沿气管处摸到强烈博动的颈动脉，轻轻用手指勾出并小心将其与颈静脉和迷走神经分开，剥离动脉外结缔组织，将颈动脉两端用止血钳夹住，以手术刀在两止血钳之间的动脉上作一纵行切口，将连有消毒硅胶管的玻璃牛角管插入动脉腔内并固定，将橡皮管的另一端插入消毒的采血容器内，打开近血端的止血钳让血液流入牛角管内。待采血到猪失去挣扎能力时，将猪四肢松绑，活动其四肢，并锤击猪心脏部位，以增加出血量。每头猪采血时均需更换容器具和器材。采血完毕后将采血容器加盖，在37℃静置1小时后，转入2～8℃过夜。第2天在无菌室II级生物安全柜内分离血清后，10000r/min离心20min，取上清。将分离的血清放入56℃水浴灭活30min，每瓶取样10mL待检，其余置-15℃以下保存。
5.血清的检验
将上述最小取样单位作为独立的样品分别进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。其中外源病毒检验除满足国家标准要求外，采用Marc145细胞培养法对本病原进行检测；特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。将检验合格的每头猪的血清分别混合，分装，贴上标签，注明血清名称、批号、规格、生产日期等，置-15℃以下保存。结果该3批血清中和效价分别为1:40、1:128、1:50，且均为淡黄色或略带红色澄清稍粘稠液体，无明显溶血或异物；无菌、无支原体、无外源病毒污染；血清病毒血症检测均为阴性；3批血清均未检出猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒抗体，特异性良好。
实施例2——本发明制备的阳性血清中和能力试验
选取本发明制备的阳性血清分别中和不同毒株的高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗和猪繁殖与呼吸综合征病毒活疫苗，结果表明：当阳性血清效价为1:32时，均能中和106.0TCID50/mL以上的PRRSV病毒，且当效价为1:16时，仍能中和106.0TCID50/mL的JXA1-R株、GDr180株、CH-1R株和HuN4-F112株PRRSV，说明采用本发明工艺制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性阳性血清能基本满足活疫苗或毒种的外源病毒检验。
实施例3——本发明制备的阳性血清在猪繁殖与呼吸综合征活疫苗外源病毒检验中的应用
选取本发明制备的中和效价为1:40的阳性血清分别用于12批高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXA1-R株)、6批高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(TJM-F92株)、3批高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F112株)和3批猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-R株)外源病毒检验。按照《中国兽药典》二〇一五年版三部附录3305方法，取1头份疫苗与制备的阳性血清进行中和，然后进行外源病毒检验。结果：所有批次均未出现中和不完全的现象，且未出现因阳性血清造成的细胞毒性。
Claims (3)
1.一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清，其特征在于该阳性血清是采用剖腹产、隔离饲养、人工饲喂的方式，排除了母源抗体的干扰的CDCD猪(经剖腹产且不吃母乳的猪)经高浓缩抗原多次免疫获得的，其血清的中和抗体效价≥1:32。
2.如权利要求1所述一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清，其特征在于该血清的制备方法是：
(1)免疫原制备：将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)稀释成104.0TCID50/mL，按MOI0.01～0.001接种Marc145细胞，37℃培养3～5日，当CPE达80％或以上时收获病毒液，经冻融三次后，离心去除细胞碎片，将上清液浓缩100倍，经反复清洗并恢复至原体积的1/100，在经无菌检验、支原体检验、鉴别检验和外源病毒检验合格，且病毒含量不低于109.0TCID50/mL作为免疫抗原；
(2)动物的选择：选择3～4月龄(体重40～60kg)CDCD猪，猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环2型病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、猪乙脑病毒抗原和抗体均为阴性的健康猪；
(3)免疫及抗体水平监测以每头猪1mL免疫抗原肌肉接种作为基础免疫；2个月后，每头猪分别肌肉接种5mL，加强免疫后14天开始每隔7天采血检测血清中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体中和抗体效价和病毒抗原。以血清中和抗体效价≥1:32且血清中蓝耳抗原为阴性为最佳采血时间；
(4)血清采集：采取颈动脉放血法采集免疫猪血清，在37℃静置1小时后，转入2～8℃过夜，经离心分离血清；
(5)血清的检验：对血清进行性状检验、无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验，特异性检验包括猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行型腹泻病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒等猪常见病原。
3.如权利要求1-2所述一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清，其特征在于该血清主要用于兽用生物制品质量控制，也可用于猪繁殖与呼吸综合征病毒的其他相关检测。
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