CN102973932A - 猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病与猪伪狂犬病三联灭活疫苗以及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒的三价灭活疫苗，灭活前，三种病毒含量分别大于10^8.5TCID₅₀/ml、10^6.0TCID₅₀/ml和10^8.0TCID₅₀/ml。灭活后各个抗原的体积比例为1∶1∶1。本发明通过大量细致的试验，选择三种病毒抗原的含量与配比，并在较大数量的实验动物和本动物的免疫效果测定，保证多价疫苗中各个免疫成分之间不发生免疫干扰现象。本发明的三价灭活疫苗和现有的打三针单项疫苗才能预防这三种传染病比较，经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本。本发明实现了本领域一直没有实现的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒多价灭活疫苗的制备与应用。

Description

猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病与猪伪狂犬病三联灭活疫苗以及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种动物多价灭活疫苗及其制备方法，特别是指一种猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒病与猪伪狂犬病的三联灭活疫苗及其制备方法。 

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Poreine reproduetive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种以妊娠母猪流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的高度接触性传染病。1996年从我国PRRS血清阳性猪群中分离到PRRSV，从而证实我国也有此病的流行，我国也将其列为二类传染病。由于PRRS具有高度的传染性，既能垂直传播又能水平传播，导致该病在世界各养猪国家蔓延，各国学者在疫苗研制方面都作了大量的工作。 

伪狂犬病(Pseudorables、PR)是由PRV引起多种家畜和野生动物的一种急性传染病。猪是PRV的储存宿主，对其危害大，可致妊娠母猪流产、死产、木乃伊胎；成年猪常呈隐性感染，但病毒可长期存在；初生仔猪则引起神经症状，出现运动失调、麻痹、衰竭死亡，病死率几乎达100％。PRV对环境的抵抗力较强。病毒在pH4-9之间保持稳定。PRV只有一个血清型，这为其疫苗制造带来了便利。PRV能在多种组织细胞内增殖，但表现的敏感度不同。 

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)引起猪的一种多系统功能障碍性疾病，猪圆环病毒属于圆环病毒科，是迄今发现的一种最小的动物病毒。根据猪圆环病毒的致病性以及基因组差异又可将其分为无致病性(或PK15源性)的猪圆环病毒I型(PCV-1)和有 致病性(PMWS源性)的猪圆环病毒II型(PCV-2)。PCV-2除了引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)外，还与猪皮炎与肾病综合征(porcinedermatitis and nephropathy syndrome，PDNS)、新生仔猪先天性脑震颤(Congenital tremors，CT)、增生性坏死性肺炎(proliferative and necrotizingpneumonia，PNP)以及怀孕母猪的繁殖障碍(reproductive disorders)等病的发生有关。 

猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病-猪伪狂犬病对养猪业危害十分严重，目前也有相应的单项疫苗和相应的二联灭活疫苗如猪圆环病毒病和繁殖与呼吸综合征二联灭活疫苗对此三种病的预防起到一定作用，但需要分别多次注射，动物应激反应强，使用不方便，防疫成本高。而多价疫苗虽然使用方便，但由于多价疫苗的抗原之间往往会相互干扰，因此，制备和应用多价疫苗或联合疫苗，必须首先保证其中各个免疫成分之间不发生免疫干扰现象，也就是不降低各该免疫成分的免疫效能。而在病毒多价疫苗中，干扰现象更为突出。因此，市场上一直缺少PRRSV、PRV以及PCV2三种病毒的多价疫苗。 

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种三价灭活疫苗，由猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒灭活后制备获得，其中，灭活获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，猪圆环病毒2型抗原以及猪伪狂犬病毒抗原的体积比例为1∶1∶1。 

优选地，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原灭活前，猪繁殖与呼吸综合征病毒的含量为≥10^8.5TCID₅₀/ml；猪圆环病毒2型抗原灭活前，猪圆环病毒2型含量为≥10^6.0TCID₅₀/ml；猪伪狂犬病毒抗原灭活前，猪伪狂犬病毒含量为≥10^8.0TCID₅₀/ml。 

优选地，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒使用潮汐式悬浮培养获得的。 

优选地，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒是经过超滤浓缩处理的。 

优选地，本发明的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒的灭活是将病毒液中加入体积比为1∶4000的β-丙内酯，混匀，放37℃培养箱中灭活12h获得的。 

优选地，本发明的三价灭活疫苗还含有佐剂，抗原与佐剂的体积比例为1∶1。 

优选地，本发明的佐剂为Montanide ISA 206佐剂。 

本发明的另一目的在于提供一种三价灭活疫苗的制备方法，由猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒灭活后制备获得，包括以下步骤： 

1)猪繁殖与呼吸综合征病毒液制备：运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养Marc-145细胞及猪繁殖与呼吸综合征病毒； 

2)猪圆环病毒病毒液制备：运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养PK15细胞及猪圆环病毒II型； 

3)伪狂犬病毒制备：运用潮汐式细胞微载体悬浮培养系统培养BHK21细胞及伪狂犬病毒； 

4)病毒液浓缩：使用超滤浓缩的方法处理； 

5)浓缩后的病毒液加入β-丙内酯灭活，然后等体积量混合乳化制成双相油乳剂联苗。灌装，压盖，贴签，入库。 

优选地，本发明的三价灭活疫苗的制备方法中，灭活获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒2型抗原以及猪伪狂犬病毒抗原的体积比例为1∶1∶1。 

技术效果

首先，本发明通过优化参数的方法使用微载体悬浮生物反应器系统培养的三种病毒，其数量和滴度显著高于转瓶培养方法，使得本发明可以获得适宜的抗原含量的病毒原液。而且在疫苗的后工艺中，该方法不但提高了疫苗产量，也可大量减少残余细胞宿主蛋白、残余细胞DNA、残余牛血清等异源物质的含量，进一步提高了疫苗接种的安全性。 

其次，本发明通过大量细致的试验，选择三种病毒抗原的含量与配比，并在较大数量的实验动物和本动物的免疫效果测定，保证多价疫苗中各个免疫成分之间不发生免疫干扰现象，也就是不降低各该免疫成分的免疫效能，使得三价灭活疫苗的免疫效力比单苗的免疫效力没有明显降低，实现了本领域一直没有实现的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒多价灭活疫苗的制备与应用。最后，本发明提供了适宜的佐剂与三种抗原混合配苗，适合的灭活方法和高效的超滤浓缩的处理方法，使得到三种抗原的相互干扰现象降到了最低，进一步提高了多价疫苗的安全性和免疫效力。本发明的三价灭活疫苗和现有的打三针单项疫苗才能预防这三种传染病比较，经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本。 

附图说明

图1为潮汐式微载体悬浮培养生物反应器结构示意图。 

具体实施方式

本发明实施例中使用了潮汐式微载体悬浮培养生物反应器，其他类型的微载体悬浮培养生物反应器，如：搅拌式、旋转式或灌注式微载体悬浮培养生物反应器，均可以使用本发明之方法大规模生产猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒或疫苗。优选地，本发明使用潮汐式微载体悬浮培养生物反应器，可以提高培养时的培养基和溶解氧的供应，无气泡并且剪切力小，对细胞伤害小。而且，可以保证获得本发明的三价灭活疫苗所需要的病毒的特定含量与质量。 

本发明实施例中采用的生物反应器为潮汐式生物反应器。结构示意图如图4所示。其中，各个标记分别为：恒温搅拌系统1，培养基恒温备料槽体2，自动馈料系统3，恒温培养箱4，载体瓶5，微载体6，DO检测器及pH控制器7，收集器8。培养系统分为两部份；一个是载体瓶5，另一个是培养基搅拌袋(槽)。细胞固定在载体瓶，培 养基流动于载体瓶与搅拌槽之间，造成间歇性的暴露与淹没载体。本发明试验了载体瓶5体积为0.5L、2.5L、5L、10L、20L、50L、100L，均能对温度、pH值、溶解氧、二氧化碳浓度自动控制。本发明的实施例中载体瓶体积为20L。 

本发明所述方法中，在细胞吸附微载体阶段与细胞培养阶段，启动了细胞吸附程序与细胞培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调整相应的参数，达到微载体与细胞充分结合后，大量扩增细胞的目的。 

本发明所述方法中，在病毒吸附微载体上的细胞阶段与病毒培养阶段，启动了病毒吸附程序与病毒培养程序，本发明实施例中优化了反应器的控制参数，但本发明方法不仅限于实施例中的参数，本领域技术人员可以根据本发明提供的技术启示，根据不同的生物反应器，调整相应的参数，达到病毒与细胞及微载体充分结合后，大量扩增病毒的目的。 

本发明试验了如下猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒株及疫苗的制备方法：猪繁殖与呼吸综合征病毒株为NVDC-JXA1毒株(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2007年3月9日，保藏号：CGMCC  No.1964)，猪圆环病毒为SH毒株(保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2008年3月4日，保藏号：CGMCC No.2389)，猪伪狂犬毒株为Fa毒株，购自中国兽医药品监察所(保藏于国家兽医微生物菌种保藏管理中心，保藏号：VRIPRV0002)。 

本发明实施例中，传代细胞使用了非洲绿猴肾细胞(Marc-145)，猪肾细胞系(PK15细胞)和幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21细胞)其他本领域常用的传代细胞如：CL2621细胞、MA104细胞，也可用于本发明之方法大规模生产猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒或疫苗。 

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本 发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。 

实施例1：猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗的制备及检验 

1材料与方法： 

1.1毒株来源： 

选用毒株为猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株(参见中国专利CN100439494C)，猪圆环病毒2型为SH株(参见中国专利CN101240264A)，伪狂犬毒株为Fa株(购自中国兽医药品监察所)， 

1.2制苗用病毒液的制备及检验 

(1)PRRSV病毒液的制备及检验 

将Marc-145接种PH值为7.0-7.4的培养液和聚酯纤维的载体罐中，并将Marc-145细胞与聚酯纤维混合均匀，启动贴附程序4h，使Marc-145细胞贴服在聚酯纤维上。切换细胞培养程序，在37℃，5％的CO₂培养环境中，使Marc-145生长至接种浓度的5-40倍时，换用细胞维持液，将PRRSV制成病毒悬液，使其吸附在上述的Marc-145细胞上，适宜的环境下连续培养2-3日后收获病毒液。 

(2)PCV-2病毒液的制备及检验 

将PK15细胞接种到细胞生长所用的PH为7.0-7.4的培养液与聚酯纤维的载体罐中，并将PK15细胞与聚酯纤维混合均匀，启动贴附程序4h；在37℃，CO₂浓度为5％的环境下，使PK15细胞生长至接种浓度的5-40倍时，将细胞生长液换成细胞维持液，并同步加入PCV-2种毒，启动贴附程序4h，使其吸附在细胞上，然后进行培养增殖病毒。培养10日后，收获病毒液。 

(3)PRV病毒液的制备及检验 

将BHK21细胞接种到细胞生长液PH为7.0-7.4与聚酯纤维的载体罐中，启动贴附程序4h，使BHK21细胞与聚酯纤维混合均匀，启动细胞培养程序，培养条件为37℃，CO₂浓度为5％。当BHK21细胞 生长至接种浓度的5-40倍时换用细胞维持液，接种PRV病毒，启动病毒吸附程序，使其完全吸附到细胞上后，适宜的环境下培养PRV病毒。病毒培养10日后，收获伪狂犬病毒。 

3种病毒液检验：按《中华人民兽药典》2005年版附录15、19、20页的相关规定进行检验，检测结果为完全符合安全、无副作用、无细菌霉菌，支原体，外源病毒污染。通过接种细胞，观察细胞病变作用，测定病毒含量。 

1.3病毒液的浓缩 

(1)浓缩设备 

使用美国密理博公司的MINI-PELLICON标准超滤设备。该设备由两部分装置组成。其一是病毒尿囊液预过滤装置，此装置使用平板式293圆盘过滤器，该滤器用316L不锈钢制造，全不锈钢接口。运行成本低，病毒液残留体积很小，可夹持预过滤及除菌过滤膜数片。使用0.45μm孔径的MILLIPORE的AP2529325型号专用预过滤膜，对病毒液进行粗滤，可滤除病毒液中的杂质和很多微生物。其二是病毒液超过滤浓缩装置，该装置使用316L不锈钢膜包夹具及管路，全部采用卫生接口，内外表面电抛光处理。动力装置使用不锈钢蠕动泵和硅胶蠕动泵管。此超滤膜包采用低蛋白吸附改良纤维材料，其蛋白吸附量仅为国际通用的聚醚砜材料的1/4～1/5。本超滤装置的进液口和回流口及透过口均配有隔膜压力表及隔膜阀，可控制系统的压力，保证超滤浓缩过程的安全和高效。同时膜包夹具为直立式结构，系统排放容易，残留体积小，再加上最后用灭菌生理盐水冲洗、顶洗病毒液，使病毒液损耗极小。 

(2)超滤浓缩工艺方法 

粗滤：将病毒液先用3000～5000rpm/min的离心机离心30min.去除沉渣，吸取上清液至消毒容器内。 

预过滤：将293圆盘平板滤器及管道等高压蒸汽消毒(121℃，30min)，把盛有病毒液的容器通过管道与滤器连接充入除菌的空气加压后，病毒液在一定压力下通过平板滤器的滤膜，从出口流出。用消 毒的容器收集从平板滤器滤过后流出的病毒液，完成预过滤。 

超滤浓缩：先将超滤装置用蒸馏水反复冲洗干净，然后用1N浓度的氢氧化钠溶液浸泡过夜12小时以上，使用时先用消毒的蒸镏水反复冲洗，将NaOH冲洗干净，使冲洗后的废弃液近中性。然后将预过滤的病毒液容器通过消毒管道与超滤装置连接，开启蠕动泵，使其流量达到4L/分钟，这样高的流速保证超滤膜包较长的使用寿命和最佳的超滤效果。经超滤浓缩的病毒液盛入密闭的容器内，并反复循环通过超滤装置，直至达到要求的浓缩终点。 

(3)浓缩效果测定 

3种病毒液按相关规程浓缩终点进行浓缩，浓缩后的病毒应达到浓缩终点的要求，即达到制备多价疫苗的病毒含量，具体参见含量测定部分。 

1.4浓缩病毒液的灭活 

将病毒液中加入体积比为1∶4000的β-丙内酯，混匀，放37℃培养箱中灭活12h。 

细胞感染法检测灭活效果：将灭活后的病毒液进行稀释并分别接种Marc-145细胞，PK15细胞，BHK21细胞3瓶/组，观察细胞无细胞致病作用(Cytopathogenic，CPE)出现。 

1.5含量测定 

1.5.1猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1株病毒含量测定 

将病毒用含1％的牛血清细胞维持液做10倍系列稀释，取10^-9-10^-1。每个稀释度接种8个孔，同时设立阴性对照，放入5％CO2温箱中37℃培养。在倒置显微镜下逐步观察CPE，每天观察一次，并记录结果。观察天数为直至出现CPE终点，即能看到引起病毒增殖的病毒最高稀释度。并根据Reed-Muench法计算病毒含量，每1.0ml病毒含量≥10^8.5TCID₅₀

1.5.2猪圆环病毒SH株病毒含量测定 

将病毒液用MEM维持液做10倍系列稀释，取10^-5、10^-6、10^-73个稀释度，每个稀释度分别接种96孔培养板PK15-B1细胞单层4孔， 每孔0.1ml，同时设立阴性对照，在37℃含5％CO₂的温箱中继续培养24小时，换含2mM的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM维持液，继续培养24小时；用冷丙酮固定细胞，用间接免疫荧光试验(IFA)测定每个稀释度含有PCV2阳性细胞(呈绿色)的孔数，根据Karber氏法计算病毒TCID₅₀。每ml病毒含量≥10^6.0TCID₅₀。 

1.5.3伪狂犬病毒Fa株病毒含量测定 

将PK15细胞接种于96孔细胞板中，每孔细胞含量为1×10⁴个培养16-24h备用；按含毒组织量用DMEM培养液将毒种做10倍系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8

六个稀释度各接种上述制备好的96孔细胞板，每孔0.1ml，每个稀释度设8个重复，观察细胞病变率，根据Reed-Muench法计算病毒含量计算TCID₅₀。每1ml病毒含量≥10^8.0TCID₅₀。 

1.6三联苗的乳化与分装 

(1)油相制备：所用的Montanide ISA 206佐剂为法国SEPPIC公司生产，经121℃60min高压灭菌后冷却备用。 

(2)水相制备：经检验合格后的3种灭活浓缩病毒液，等量混合并充分振荡混均后备用。 

(3)疫苗的乳化：先将Montanide ISA 206佐剂加入到乳化机料桶内，在搅拌过程中将灭活的抗原水相PRRSV/PCV2/PRV病毒液按1∶1∶1(v∶v∶v)的比例滴入到佐剂中，使抗原与佐剂的比例为1∶1(v∶v)。滴完后，继续循环搅拌至抗原与佐剂充分混合，乳化成双相油乳剂灭活疫苗，分装。 

乳化工具：胶体磨JTM50为沈阳新光机械厂制造，匀浆泵为上海东华机械厂制造。使用前先用0.5％甲醛溶液浸泡消毒8小时以上，用前以灭菌的热蒸馏水冲洗干净。用后用热水反复冲洗，彻底消除残留油苗。 

1.7物理性状检验 

稳定性：将各批次试制疫苗以3000r/min离心15min，观察疫苗分层现象。 

粘度：用1mL吸管(出口内径为1.2mm)吸取25℃左右的疫苗1mL，令其垂直自然流出，记录流出所需时间。 

1.8无菌检验 

按《兽用生物制品规程》有关方法对三批三联苗进行无菌检验，结果无菌生长。 

1.9安全性试验 

1.9.1新生仔猪安全性试验 

选择健康1日龄初生仔猪，每批疫苗接种5头猪，各肌肉注射2倍免疫剂量4ml联苗，另设5头作空白对照。接种后每天观察猪的生长状况、精神、食欲、体温及局部变化，观察15d。 

1.9.2妊娠母猪安全性试验 

每批疫苗用4倍免疫剂量接种妊娠80d左右的母猪3头，每头肌肉注射8ml。观察母猪的反应和产仔情况。 

1.10效力检验 

1.10.1猪繁殖与呼吸综合征病毒部分 

用3～6周龄PRRSV抗原、抗体阴性猪10头，其中5头耳后部肌肉注射疫苗2ml，另5头做对照，同条件下饲养。28日后，所有猪对侧耳后部肌肉注射PRRSV NVDC-JXA1毒株强毒3ml(含10^5.0TCID₅₀/ml)，每目测温并观察21日。5头对照猪应全部发病，且至少2头死亡；免疫猪至少4头健活。 

1.10.2猪圆环病毒2型部分 

用14～21日龄健康易感仔猪15头，分成3组，每组5头，第1组每头颈部肌肉注射疫苗1ml，两周后按相同途径和剂量进行第2次接种，第2组作非免疫攻毒对照，第3组作空白对照(非免疫、非攻毒)，均隔离饲养观察。首免后5周对所有猪称重，第1、2组各用PCV2SH株(含10^6.0TCID₅₀/ml)滴鼻1ml、肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒第4、7日，分别在每头猪的两侧腋下及两侧臀部共4个点对所有猪接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml)，每个点接种1ml(4ml/头)，同时腹腔接种巯基乙酸培 养基，10ml/头；攻毒后第11、19日再次腹腔接种巯基乙酸培养基，10ml/头。攻毒后连续观察25日。攻毒对照组应至少4头发病，免疫组至少4头保护。 

1.10.3伪狂犬病毒部分 

用体重17～22g小鼠20只，各皮下注射疫苗0.3ml。15日后，再次各皮下注射疫苗0.3ml，继续观察15日后，连同对照小鼠5只，皮下注射伪狂犬强毒液0.2ml(含10^5.0TCID₅₀/ml)，观察10日。对照组应全部死亡，免疫组至少保护14只。 

1.11田间试验 

用3个批次的浓缩PRRSV-PCV2-PRV三联灭活疫苗在猪场对生产母猪进行田间免疫效果实验，具体方法是配种前10天在母猪颈部肌肉接种2ml浓缩三联苗，配种后30天在加强一次，以未注射三联苗的生产母猪作为空白对照组，生产以后进行统计。 

2.结果 

2.1抗原含量结果 

3批猪蓝耳病毒NVDC-JXA1株、猪圆环病毒2型SH株、伪狂犬病毒Fa株分别培养三批，批号为1101、1102和1103，抗原的含量见表2-1，其病毒液含量均符合要求。 

表2-1抗原含量测定 

2.2抗原的灭活效果测定3批猪蓝耳病毒NVDC-JXA1株猪圆环病毒2型SH株、伪狂犬病毒Fa株分别培养三批结果见表2-2，灭活是彻底的。 

表2-23批抗原的灭活检验效果 

2.3物理性状检验结果 

试制的3批疫苗均为矿物油乳剂型，外观呈白色或者淡粉红色略带粘滞性流体，分别取一滴滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散；用离心管取10mL于离心机中以3000r/min离心15min，水相析出不超过0.5mL。用1mL吸管(出口内径为1.2mm)，吸取25℃左右的疫苗1mL，令其垂直自然流出计算各批次疫苗的滴出速度均在8s以内。 

2.4无菌检验结果 

按《兽用生物制品规程》方法对3批三联苗进行无菌检验，结果均无菌生长，如表2-3。 

表2-3三联苗无菌检验结果 

2.5安全试验结果 

用三个批次的PRRS-PCV2-PRV浓缩三联灭活疫苗接种12头初生仔猪和12头妊娠母猪安全试验表明，2倍免疫剂量4ml联苗注射后，初生仔猪体温、生长情况正常，精神、食欲良好，注射局部无肿 胀、硬结。8ml联苗接种妊娠名80d左右的母猪，母猪健康，胎儿发育正常，未发生流产(表2-4)。 

表2-43个批次三联苗安全试验结果 

2.6效力检验结果 

三批疫苗均对猪蓝耳病毒NVDC-JXA1株，猪圆环病毒2型SH株、伪狂犬病毒Fa株免疫攻毒保护，结果三批疫苗均表现良好的免疫效果。 

表2-5批疫苗的效力检验结果 

2.7田间试验结果 

用3个批次的PRRS-PCV2-PRV浓缩三联灭活疫苗对400头生产母猪进行田间免疫实验。实验组窝均活仔数10.3头比对照组(未注射疫苗组)7.0头提高了3.3头，死仔数由对照组的14.3％下降到3.01％，差异均极显著。上述结果表明PRRS-PCV2-PRV浓缩三联灭活疫苗有非常明显的免疫效果。 

表2-6田间免疫试验结果 

实施例2、猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗与单苗(猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗或猪圆环病毒2型灭活疫苗或猪伪狂犬灭活疫苗)的免疫效果比较。 

1.材料 

猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗，实施例1中的实验室制品，批号：1101；猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗(NVDC-JXA1株)，来源：洛阳普莱柯生物工程有限公司，批号：110213；猪圆环病毒2型灭活疫苗(SH株)，来源：洛阳普莱柯生物工程有限公司，批号：110115；猪伪狂犬病灭活疫苗(Ea株)，来源：武汉科前生物制品有限公司，批号：110221。 

2.试验方法 

2.1猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗与猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗单苗的免疫效果比较 

用3周龄的PRRSV抗体检测阴性体重一致的猪20头，分为4组，每组5只。第1组首免PRRSV单苗2ml，4周后二免2ml；第2组首免猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗2ml，4周后二免三联苗2ml。第3、4组不接种。在28日后，第1、2、3组每头注射PRRSV NVDC-JXA1强毒株3ml(含10^5.0TCID₅₀/ml)，攻毒后观察21d；第4组作为空白对照。分别于攻毒后的7d，14d， 21d称量各组猪的体重作记录。于攻毒后第21日对存活猪扑杀剖检，判定结果。 

2.2猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗单苗的免疫效果比较 

用3周龄PCV2抗体检测阴性体重一致的猪20头，分成4组，每组5头，第1组颈部肌肉注射PCV2单苗1ml，2周后二免1ml；第2组首免猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗1ml，2周后二免三联苗1ml。第3、4组不接种。在21日后，第1、2、3组注射PCV2SH株2ml(含10^6.0TCID₅₀/ml)，观察21日；第四组作为空白对照。分别于攻毒后的7d，14d，21d称量各组猪的体重作记录。于攻毒后第21日扑杀，剖检，判定结果。 

2.3猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗与猪伪狂犬病灭活疫苗单苗的免疫效果比较 

用4周龄PRV抗体检测阴性体重一致的猪20头，分成4组，每组5头，第一组颈部肌肉注射PRV单苗2ml，2周后二免2ml；第二组首免猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗2ml，2周后二免三联苗2ml。第3、4组不接种。在21日后，第1、2、3组第三组注射伪狂犬强毒液2ml(含10^5.0TCID₅₀/ml)；观察21日；第四组为空白对照组。分别于攻毒后的7d，14d，21d称量各组猪的体重作记录。于攻毒后第21日扑杀，剖检，判定结果。 

3结果与讨论 

3.1猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗与猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗单苗的免疫效果比较结果 

免疫效果研究结果如表3-1，三联苗对猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株的攻毒保护为4/5(80％)，单苗对猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株的攻毒保护为4/5(80％)，均呈现良好的免疫效果，表明三联苗与单苗的免疫效果相当。如表3-2，三联苗实验组的猪平均体重增长率比猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗单苗(NVDC-JXA1株)的体重增长率要高。 

表3-1三联苗与猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗单苗(NVDC-JXA1株)的免疫效果比较 

表3-2猪繁殖与呼吸综合征NVDC-JXA1株攻毒后各组猪的体重增长情况 

3.2猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗单苗的免疫效果比较结果 

免疫效果研究结果如表3-3，三联苗对猪圆环病毒2型SH株的攻毒保护为5/5(100％)，单苗对猪圆环病毒2型SH株的攻毒保护为5/5(100％)，均呈现良好的免疫效果，表明三联苗与单苗的免疫效果基本相当。如表3-4，三联苗实验组的猪平均体重增长率比猪圆环 病毒2型灭活疫苗单苗(SH株)的体重增长率要高。 

表3-3三联苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗单苗(SH株)的免疫效果比较 

表3-4猪圆环病毒2型SH株攻毒后各组猪的体重增长情况 

3.3猪繁殖与呼吸综合征-猪圆环病毒病2型-猪伪狂犬病三联灭活疫苗与猪圆环病毒2型灭活疫苗单苗的免疫效果比较结果 

免疫效果研究结果如表3，三联苗对猪伪狂犬Fa株的攻毒保护为4/5(80％)，单苗对猪猪伪狂犬Ea株的攻毒保护为4/5(80％)，均 呈现良好的免疫效果，表明三联苗与单苗的免疫效果基本相当，如表3-6，三联苗实验组的猪平均体重增长率比猪伪狂犬灭活疫苗Ea株的体重增长率要高。 

表3-5三联苗与猪伪狂犬Fa株的免疫效果比较 

表3-6猪伪狂犬Fa株攻毒后各组猪的体重增长情况 

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (9)

1.一种三价灭活疫苗，由猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒灭活后制备获得，其特征在于，灭活获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，猪圆环病毒2型抗原以及猪伪狂犬病毒抗原的体积比例为1∶1∶1。

2.根据权利要求1所述的三价灭活疫苗，其特征在于，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原灭活前，猪繁殖与呼吸综合征病毒的含量为≥10^8.5TCID₅₀/ml；猪圆环病毒2型抗原灭活前，猪圆环病毒2型含量为≥10^6.0TCID₅₀/ml；猪伪狂犬病毒抗原灭活前，猪伪狂犬病毒含量为≥10^8.0TCID₅₀/ml。

3.根据权利要求1所述的三价灭活疫苗，其特征在于，所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒使用潮汐式悬浮培养获得的。

4.根据权利要求1所述的三价灭活疫苗，其特征在于，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒是经过超滤浓缩处理的。

5.根据权利要求1所述的三价灭活疫苗，其特征在于，猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒的灭活是将病毒液中加入体积比为1∶4000的β-丙内酯，混匀，放37℃培养箱中灭活12h获得的。

6.根据权利要求1所述的三价灭活疫苗，其特征在于，所述三价灭活疫苗还含有佐剂，抗原与佐剂的体积比例为1∶1。

7.根据权利要求5所述的三价灭活疫苗，其特征在于，所述佐剂为Montanide ISA 206佐剂。

8.一种三价灭活疫苗的制备方法，由猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病毒灭活后制备获得，其特征在于，包括以下步骤：

1)猪繁殖与呼吸综合征病毒液制备：运用潮汐式微载体悬浮培养技术培养Marc-145细胞及猪繁殖与呼吸综合征病毒；

2)猪圆环病毒病毒液制备：运用潮汐式微载体悬浮培养技术高密度培养PK15细胞及猪圆环病毒II型；

3)伪狂犬病毒制备：运用潮汐式细胞微载体悬浮培养系统培养BHK21细胞及伪狂犬病毒；

4)病毒液浓缩：使用超滤浓缩的方法处理；

5)浓缩后的病毒液加入β-丙内酯灭活，然后等体积量混合乳化制成双相油乳剂联苗。灌装，压盖，贴签，入库。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，灭活获得的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原，猪圆环病毒2型抗原以及猪伪狂犬病毒抗原的体积比例为1∶1∶1。

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