KR101125244B1 - 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(ｐｒｒｓｖ)의 ｇｐ5를 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 포함하는 ｐｒｒｓｖ 감염증 예방 또는 치료용 조성물, 및 그의 제조 방법 - Google Patents

돼지생식기호흡기증후군 바이러스(ｐｒｒｓｖ)의 ｇｐ5를 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 포함하는 ｐｒｒｓｖ 감염증 예방 또는 치료용 조성물, 및 그의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)의 항원성 당단백질 5(glycoprotein 5, GP5)를 이종 항원 단백질로 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 균주, 그의 제조 방법, 및 그를 이용한 PRRSV 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
돼지생식기호흡증후군, GP5, 보르데텔라 브론키셉티카, 면역원성 조성물, 상동 재조합, 이종 항원 단백질

Description

돼지생식기호흡기증후군 바이러스(ＰＲＲＳＶ)의 ＧＰ5를 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 포함하는 ＰＲＲＳＶ 감염증 예방 또는 치료용 조성물, 및 그의 제조 방법{A composition for preventing or treating PRRSV infection comprising live attenuated Bordetella bronchiseptica strain expressing GP5 of PRRSV and method for producing thereof}
본 연구는 농림부 농림기술관리센터(ARPC)의 농림기술개발 연구과제의 일환으로 수행되었음[107086-03-2-HD110, 107086-03-2-HD120, 이종항원발현 생균백신 system을 이용한 PRRSV 백신 및 감별진단법 개발].
본 발명은 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)의 항원성 당단백질 5(glycoprotein 5, GP5)를 이종 항원 단백질로 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 균주, 그의 제조 방법, 및 그를 이용한 PRRS 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
돼지생식기호흡기증후군(PRRS)은 모돈의 유사산 및 태아의 폐청색증, 분만율 저하, 기타 2차적인 세균감염 등으로 인해 국내 및 국외에서 양돈 사업에 심각한 피해를 주고 있는 돼지의 질병이다. 원인체인 PRRS 바이러스(PRRSV)는 피막이 있는 단일-가닥형의 포지티브-센스(positive-sense) RNA 바이러스로서, 국내에서는 1993년 최초로 분리되어 보고되었다. PRRS 발병 형태는 생식기형, 호흡기형, 혼합형이 모두 발생하여 피해를 주고 있다.
PRRSV의 전체 게놈 크기는 약 15kb인데 9개의 개방 해독 프레임(open reading frame, ORF)(ORF1a, 1b, 2a, 2b, 및 3-7)을 가지고 있다. 그 중 ORF1a와 1b는 복제 관련 비구조 단백질이고, ORF2 내지 7은 구조 단백질인 GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, M, 및 N 단백질을 생성한다.
국외에서 PRRS의 발병 상황을 살펴보면, 이전에는 같은 지역간에 분리주들의 특성이 비슷했던 것에 비하여, 최근에는 유럽주 및 북미주의 발병이 동일 지역에서 동시에 나타나고 있는 특징을 보인다. 그런데, 특이할 만한 사항은 유럽 및 아시아의 경우 북미 백신주에 의한 백신이 허용되지 않는 국가에서도 백신주인 VR2332와 유전적으로 매우 유사한 분리주가 보고되고 있으며, 실제로 미국에서 분리되는 PRRSV 야외주는 유럽주에 비하여 VR2332와 단순히 유전적으로 더 유사한 것들 이외에 일부는 VR2332에서 유래된 것으로 나타나 백신주에 의한 감염이 다양하게 보고되고 있다. 이 백신주는 현재 우리나라에서도 사용되는 상황이어서 국내에서 이 백신주에 의한 감염이 얼마나 심각한지 알아볼 필요가 있다.
PRRS를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 약독화된 VR2332 균주를 이용한 생독 백신을 돼지에게 투여하는 방법이 제시되고 있다. 그러나, 이 방법은 상기에서도 살핀 바와 같이, 백신주 VR2332에 의한 감염을 유발하는 단점이 있다.
또 다른 PRRS 예방 또는 치료하는 방법으로서, 대한민국 공개특허 제2005-40172에 의하면 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(MN-Hs)를 돼지 폐 탐식 세포 및 MARC-145 세포에 접종하여 감염된 배양액을 포르말린으로 불활화시키고, 면역 증강제인 Oil Adjuvant(Montanide IMS 1313 N PR)에 PRRS 바이러스 항원(바이러스 감염 배양액)을 동량 혼합한 후, 1,000 rpm에서 30분간 혼합 유제하여 제조되는 것을 특징으로 하는 돼지생식기호흡기증후군 불활화 백신을 이용하는 기술이 제시되어 있다. 그러나, 불활화 백신은 바이러스를 죽이기 위해 포르말린과 같은 불활화제를 처리하고 적절한 보조제와 혼합하여 제조되는 것으로, 생산하고 적용하는데 비용이 비싼 단점이 있다.
보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)는 돼지 비점막의 상재균으로서 돼지 위축성 비염(Atropic rhinitis, AR)을 발생시키는 균으로, 돼지 위축성 비염에 걸릴 경우 재채기, 콧물의 양이 증가하고, 코막힘, 호흡곤란 및 성장 부진의 증상이 나타난다. 염증성 콧물이 나온 후 비출혈도 관찰된다. 보르데텔라 브론키셉티카는 1주령의 자돈에 발병하여 비갑개골을 위축시키고 4주령의 자돈에서는 미약한 증상을 유발시키고 9주령에서는 병변을 형성시키지 않지만, 모돈에 잠복 감염하여 지속적으로 자돈에 수직 감염을 유발시키고 있다.
이에, 본 발명자는 종래 약독화된 VR2332 균주를 이용한 생독 백신의 단점을 해소하고, PRRS 백신을 생산하고 적용시 경제적인 효과를 달성할 수 있으며, 보르데텔라 브론키셉티카에 의한 감염증을 유발하지 않고, PRRS와 함께 보르데텔라 브론키셉티카 감염증의 예방 또는 치료 효과도 달성할 수 있는 돼지생식기호흡기증후 군을 예방 또는 치료할 수 있는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PRRSV의 GP5를 이종 항원 단백질로 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 PRRS 감염증을 예방 또는 치료하는 방법 및 면역원성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 PPRSV의 GP5를 이종 항원 단백질로 발현하는 것을 특징으로 하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 제공한다.
상기 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주는 바람직하게는 수탁번호 KCCM 10956P인 것이다. 상기 이종 항원 단백질인 PRRSV의 GP5는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주는 상기 균주의 aroA 유전자좌에 PPRSV의 GP5 유전자 서열이 삽입되어 있는 것을 특징으로 한다.
PRRSV의 구조 단백질 중 ORF2-7은 구조 단백질인 GP2a, GP2b, GP3, GP4, GP5, M 단백질, 및 N 단백질을 생성한다. 가장 면역원성이 높은 단백질은 ORF7에 의해 코딩되는 N 단백질이지만, 이 단백질은 피막 내부의 캡시드(capsid) 구조 단백질이라 백신으로 사용하기 어렵다. 그러나 구조 단백질 GP5는 바이러스 최외곽에 존재하는 항원성 단백질로서 백신의 설계에 매우 타당할 것이다.
본 발명의 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주는 보르데텔라 브론키셉티 카 감염증을 유발시키지 않고, PRRS와 함께 보르데텔라 브론키셉티카 유래 감염증을 예방 또는 치료할 수 있는 효과도 있다.
본 발명은 PPRSV의 GP5를 이종 항원 단백질로 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 균주를 제조하는 방법은 보르데텔라 브론키셉티카의 aroA 유전자좌에 PRRSV의 GP5를 코딩하는 유전자를 삽입하는 단계를 포함한다. 본 발명의 제조 방법으로 제조된 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주의 일례는 수탁번호 KCCM 10956P인 것이다.
구체적으로, 본 발명의 균주는 보르데텔라 브론키셉티카의 aroA 유전자 부위 중 N-말단 50-500 bp 바람직하게는 약 300머(300mer)와 C-말단 50-500 bp 바람직하게는 약 300머(mer), 선택 마커 유전자 서열, PRRSV의 GP5의 유전자 서열을 클로닝하는 단계, 클로닝한 산물인 N-말단 50-500bp 바람직하게는 약 300머(300mer), 선택 마커 유전자 서열, C-말단 50-500bp 바람직하게는 약 300머(mer), 및 PRRSV의 GP5의 유전자 서열을 연결하여 삽입체(insert)를 제조하는 단계; 보르데텔라 브론키셉티카의 원래 aroA 유전자좌에 상기 삽입체를 상동 재조합(homologous recombination)에 의해 삽입하는 단계에 의해 제조될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 균주를 제조하는 방법은
a) 보르데텔라 브론키셉티카 aroA 유전자 부위 중에서 N-말단 약 300머(300mer)와 C-말단 약 300머(300mer)를 각각 PCR로 증폭하고 이를 클로닝 벡터인 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하여 클로닝된 pGEM-aroA-F와 pGEM-aroA-R을 제조하고;
b) 선택 마커 유전자, 바람직하게는 KanR 유전자가 삽입된 pKD13 헬퍼 벡터로부터 KanR을 증폭하고 이를 클로닝 벡터인 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하여 클로닝된 pGEM-KanR을 제조하고;
c) PRRSV의 GP5 유전자 서열을 PCR로 증폭하고 pGEM-T easy 벡터에 클로닝하여 클로닝된 pGEM-PRRS을 제조하고;
d) 상기 클로닝된 4개의 분획, pGEM-aroA-F, pGEM-aroA-R, pGEM-KanR, 및 pGEM-PRRS을 도 1에 제시된 바와 같이 순서대로 제한효소로 처리하고 연결하여 작제물 "pGEM-aroA-KanR-PRRS"을 제조하고;
e) 상기 작제물 "pGEM-aroA-KanR-PRRS"을 제한 효소 Xhol+HindIII로 처리하여 상동 재조합에 사용할 선형 DNA 삽입체를 제조하고;
f) 보르데텔라 브론키셉티카 야생 균주의 전기감응성(electrocompetent) 세포에 pKD46 플라스미드를 전기천공 방법으로 형질전환시켜 형질전환된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 제조하고;
g) pKD46 플라스미드가 도입되어 형질전환된 보르데텔라 브론키셉티카를 최종 농도 L-아라비노스를 포함하는 배지에서 배양하고;
h) 상기 선형 DNA 삽입체를 상기 배지에 첨가하고 배양하여 본 발명의 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 제조하는 것일 수 있다.
상기 pKD46 헬퍼 벡터는 상동 재조합을 일으키는 효소인 λ Red 재조합효소(recombinase)를 발현시켜 균주 내에서 상동 재조합에 의한 유전자좌 치환을 일으킨다.
본 발명은 본 발명의 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는, 포유 동물의 이종 항원 원인균 감염증 및 보르데텔라 브론키셉티카 감염증으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 감염증의 예방 또는 치료용 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주는 PRRSV의 GP5를 이종 항원 단백질로 발현하고, 바람직하게는 수탁번호 KCCM 10956P인 것이다.
본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 이종 항원은 보르데텔라 브론키셉티카 유래 이외의 항원이고, 상기 이종 항원은 이종 항원 원인균으로 인한 포유 동물의 감염증에 대한 면역원성 반응을 야기하는 것을 말한다. 이종 항원 원인균은 PCV2(Porcine Circovirus 2), PRRSV(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus), PPV(Porcine Parvovirus) 및 SIV(Swine Influenza virus) 등과 같은 바이러스성 병원체 및 마이코플라스마(mycoplasma), 파스투렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 해모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 살모넬라(Salmonella) 종 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 종 등의 세균성 병원체 등이 있으며, 바람직하게는 PRRSV이다. PRRSV 감염증은 PRRSV에 의해 야기되는 돼지의 생식기 및 호흡기 질환과 관련된 각종 임의의 증상을 포함할 수 있고, 예를 들면 모돈의 유사산 및 태아의 폐청색증, 분만율 저하, 기타 2차적인 세균 감염으 로 인한 증상이다.
본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 담체는 희석제, 완충제, 보존제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아쥬반트는 항원의 면역원성을 증진시키기 위해 사용되는 물질로서, 미네랄 염, 예컨대 Alum, 알루미늄 히드록시드, 알루미늄 포스페이트 및 칼슘 포스페이트; 계면활성제 및 미립자, 예컨대, 비이온성 블록 중합체 계면활성제(예컨대, 콜레스테롤), 비로솜(virosome), 사포닌(saponin)(예컨대, Quil A, QS-21 및 GPI-0100), 프로테오솜, 면역 자극 착체, 코클레이트, 4차 아민(디메틸 디옥타데실 암모늄 브로마이드(DDA)), 아브리딘, 비타민 A, 비타민 E; 박테리아 생성물, 예컨대 RIBI 아주반트 시스템(Ribi Inc.), 미코박테리룸 플레이(Mycobacterum phlei)의 세포벽 골격(Detox？, 무라밀 디펩티드(MDP) 및 트리펩티드(MTP), 모노포스포릴 지질 A, 바실러스 칼메테-구에린(Bacillus Calmete-Guerin, BCG), 열-불안정한 대장균 엔테로톡신(enterotoxin), 콜레라 독소, 트레할로스 디미콜레이트, CpG 올리고데옥시뉴클레오티드; 시토카인 및 호르몬, 예컨대, 인터류킨(IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18), 과립구집락자극인자, 데히드로에피안드로스테론, 1,25-디히드록시 비타민 D3; 폴리아니온, 예컨대 덱스트란; 폴리아크릴릭(예컨대, 폴리메틸메타크릴레이트, Carbopol 934P); 담체, 예컨대 파상풍 톡시드, 디프테리아 톡시드, 콜레라 독소 B 서브유닛, 내독소 생성 대장균의 돌연변이체 열-불안정한 엔테로톡신(rmLT), 열 쇼크 단백질; 수중유적형 유화액, 예컨대 AMPHIGEN？(Hydronics, 미 국); 및 유중수적형 유화액, 예컨대 프로인트(Freund)의 완전 및 불완전 아주반트가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려진 임의의 형태 예를 들면, 액제 및 주사제의 형태일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 액제 또는 주사제의 경우, 필요시 10-40％의 프로필렌 글리콜, 및 용혈 현상을 방지하는데 충분한 양(예: 약 1％)의 염화나트륨을 함유할 수 있다. 상기 액제 또는 주사제는 당업계에 알려진 임의의 희석제 또는 완충제가 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 면역원성 조성물은, PRRSV의 GP5를 이종 항원성 단백질로 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 동결 건조하여 바이알과 같은 용기에 보존하고, 사용하기 전에 주사제에 필요한 담체 또는 아쥬반트, 식염수 등을 부가함으로써 사용 직전에 조제될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 면역원성 조성물은 전신으로 또는 국부로 투여될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 있어서, 상기 포유 동물은 인간, 소, 돼지, 염소, 개, 양 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 포유 동물은 돼지이다.
본 발명은 PRRSV의 GP5를 이종 항원 단백질로 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주, 또는 상기 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 포유 동물의 PRRSV 감염증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서, 상기 포유 동물은 인간, 소, 돼지, 염소, 개, 양 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 포유 동물은 돼지이다.
본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 균주 또는 면역원성 조성물은 당업계에 알려져 있는 임의의 투여 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 투여는 정맥내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 코안, 기관내 또는 피하로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 균주 또는 면역원성 조성물은 전신으로 또는 국부로 투여될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물 또는 방법에 있어서, 본 발명의 균주 또는 면역원성 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. "유효량"은 치료 또는 예방하고자 하는 증상을 완화 또는 제거하는데 요구되는 양을 의미하며, 당업자라면 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면, 치료학적 또는 예방학적 유효량은 상기 PRRSV의 GP5를 이종 항원성 단백질로 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 1일당 1x106 내지 1x1010 cfu(colony forming unit)/ml, 바람직하게는 1일당 1x107 내지 1x109 cfu/ml, 더욱 바람직하게는 1일당 1x107 내지 1x108 cfu/ml 범위이다.
본 발명의 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주는 생독 백신으로 사용될 수 있고, 포유 동물에 투여되는 경우 보르데텔라 브론키셉티카에 의한 감염증은 없으면서 이종 항원 단백질인 PRRSV의 GP5의 발현에 의해 PRRSV에 대한 예방 백신 또 는 치료 균주로서 사용될 수 있다.
본 발명의 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주 또는 이를 함유하는 면역원성 조성물은 종래 약독화된 VR2332 균주를 이용한 생독 백신의 단점을 해소할 수 있고, 생산하고 적용하는데 경제적인 효과가 있다.
본 발명의 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주 또는 이를 함유하는 면역원성 조성물은 PRRS와 함께 보르데텔라 브론키셉티카 감염증도 예방 또는 치료할 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: PRRS5 의 GP5 를 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주의 제조
(1) 공시 균주 및 플라스미드
대장균 JM109는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)사로부터 구입하여 사용하였고, pGEM-T easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)는 클로닝에 이용되었다. Red 헬퍼 플라스미드 pKD46(Gene bank ＃AY048746)은 pBAD 프로모터를 이용하여 red와 gam 단백질을 생산하는 벡터로서 균주 내로 외부 DNA가 유입되었을 경우, 상동 재조합을 일으키는 것으로, Red 헬퍼 플라스미드 pKD46 벡터는 Red 재조합효소를 포함하고 있는 벡터이다. 선택 마커로는 KanR을 사용하였고, KanR은 pKAD13 헬퍼 벡 터(Gene bank ＃AY048744)로부터 클로닝하여 사용하였다. 보르데텔라 브론키셉티카 표준 균주(RB50)는 국립수의과학 검역원에서 분양받아 사용하였다.
(2) 상동 재조합에 사용할 삽입체 pGEM - aroA - Kan R - PRRSV 의 제조
1) aroA N-말단 300머(300mer)와 C-말단 300머(300mer)
PCR 프라이머의 구성은 다음과 같다. 기존의 aroA 유전자 정보(Gene Bank database: AF182427)를 이용하여, N-말단의 증폭을 위해 정방향 프라이머로 aroA-N-F(P1): 5'-GCGCCTCGAGATGAGCGGATTGGCATATCTCGACC-3'(서열번호 2)을 사용하였고, 역방향 프라이머로 aroA-N-R(P2): 5'-ATATAGATCTCCGGAACGCGGTGCCGGCGTTGCCT-3'(서열번호 3)을 사용하였다. C-말단의 증폭을 위해 정방향 프라이머로 aroA-C-F(P3): 5'-ATATGGTACCTGCCGCCTGCGCAACATCGGCAGCT-3'(서열번호 4)를 사용하였고, 역방향 프라이머로서 aroA-C-R(P4): 5'-ATATAAGCTTTCAGTCCCGCGCGGCCAGCAGGCCC-3'(서열번호 5)를 사용하였다.
2) 카나마이신 내성 유전자(KanR)
KanR은 pKAD13 헬퍼 벡터(Gene Bank ＃AY048744)로부터 클로닝하여 사용하였고, KanR을 위한 정방향 프라이머로는 KanR-F(P5):5'-GCGCAGATCT ATGATTGAACAAGATGGATT-3'(서열번호 6)을 사용하였고, 역방향 프라이머로는 KanR-R(P6):5'-GGCCGGTACCTCAGAAGAACTCGTCAAGAA-3'(서열번호 7)을 사용하였다.
3) PRRSV의 GP5 유전자
PRRSV의 GP5 유전자 클로닝을 위한 DNA 염기 서열 정보는 Gene Bank ＃AJ223082를 참조하였고, 정방향 프라이머로는 GP5-F(P7): 5'-AATTGGTACC ATGAGCAACGACAGCAGCTCCCA-3'(서열번호 8)을 사용하였고, 역방향 프라이머로는 GP5-R(P8):5'-GGCCGGATCCCTAAGGACGACCCCATTGTT-3'(서열번호 9)를 사용하였다.
4) PCR과 클로닝
PCR 조건은 94℃에서 5분간 예비변성, 94℃에서 30초, 57℃에서 30초, 및 72℃에서 1분으로 30 사이클을 실시하였고, 최종 연장을 72℃에서 5분 동안 실시하였다. 각각의 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 패널 A는 aroA-N-말단, 패널 B는 aroA-C-말단, 패널 C는 KanR, 패널 D는 PRRSV의 GP5 유전자를 나타낸다.
증폭된 각각의 유전자에 대한 PCR 산물을 pGEM-T easy 클로닝 벡터 내로 클로닝하여, pGEM-aroA-N, pGEM-aroA-C, pGEM-KanR, 및 pGEM-PRRSV을 생성하였다. 이들의 클로닝 여부를 확인하기 위하여 제한효소 EcoRI으로 처리하고 각각의 크기를 아가로스 겔에서 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 패널 1은 pGEM-aroA-N, 패널 2는 pGEM-aroA-C, 패널 3은 pGEM-KanR, 패널 4는 pGEM-PRRS를 나타낸다. 그 결과 기대되는 크기를 보유하고 있음을 확인하였다.
5) 상동 재조합에 사용될 삽입체 pGEM-aroA-KanR-PRRSV의 제조
pGEM-aroA-N, pGEM-aroA-C, pGEM-KanR, 및 pGEM-PRRSV을 도 1에서 보여지는 바와 같이 순서대로 제한효소로 처리하고 리가제로 연결하였다. 즉, aroA-N-말단이 클로닝된 pGEM-aroA-F와 pGEM- KanR을 각각 BglII와 SalI으로 자르고 T4 DNA 연결효소를 이용하여 다시 연결시켰다. 계속하여 aroA-C-말단이 클로닝된 작제물인 pGEM-aroA-R을 KpnI과 SalI으로 잘라서 상기 제조된 aroA-N-말단 + KanR을 같은 제한효소로 자른 후 연결하였다. 여기에 PRRSV GP5 유전자가 클로닝된 작제물인 pGEM-GP5를 KpnI과 BamHI로 자른 다음 pGEM-aroA-KanR 을 동일한 제한효소로 잘라 연결하여 작제물 pGEM-aroA-KanR-PRRSV을 제조하였다. 이들의 연결 여부를 확인하기 위하여 상기 작제물 pGEM-aroA-KanR-PRRSV을 XhoI과 HindIII로 잘라 그 크기를 확인하여, 작제물 pGEM-aroA-KanR-PRRSV의 형성 여부를 확인하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 나타난 바와 같이, 약 1.68 kb의 선형 DNA가 검출되었고 이를 통해 pGEM-aroA-KanR-PRRSV가 만들어졌음을 확인하였다.
(3) PRRSV 의 GP5 를 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주의 제조
보르데텔라 브론키셉티카 배양액 5ml를 500ml BHI 브로쓰(BBL™, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD)에 접종하여 OD 값이 0.5가 될 때까지 배양하고, 배양 후 얼음 위에서 20분간 냉각 후 4,000xg로 15분간 원심분리하여 균을 회수하였다. 이를 2.5ml의 냉각된 10% 글리세롤 용액으로 농축하여, 전기천공용 전기감응성(electrocompetent) 세포를 제조하였다. 상기 균체에서 λ Red 재조합 효소 를 발현하기 위해 pKD46 플라스미드를 Gene Pulser Xcell™ 전기천공 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 형질전환 후, 암피실린과 L-아라비노스 (최종 농도 10 mM)가 첨가된 250ml SOB 배지(증류수 1 리터에 박토-트립톤 20 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 0.5 g를 넣고 멸균)에서 선택 후, 30℃에서 OD값이 0.5가 될 때까지 배양하였다. 그 후, 다시 2.5ml의 냉각된 10% 글리세롤 용액으로 농축하였다.
40㎕의 상기 얻어진 pKD46 플라스미드가 도입되어 형질전환된 전기감응성 보르데텔라 브론키셉티카 균주에 1㎕ (100ng)의 상기 제조한 pGEM-aroA-KanR-PRRSV 삽입체 DNA를 전기천공법으로 형질전환하고, 50 ㎍/ml 카나마이신이 첨가된 LB 배지에서 배양하여, 본 발명의 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 선택하였다.
실시예 2: PRRSV 의 GP5 유전자 삽입 여부 확인
도 5에서 나타난 바와 같이, 보르데텔라 브론키셉티카 균주의 aroA 유전자좌 중에 KanR과 PRRSV의 GP5 유전자가 삽입되었는지 여부를 확인하기 위하여 PCR을 실시하였다. KanR의 삽입 여부를 확인하기 위해서는 상기 서열번호 6과 7의 프라이머 세트를 사용하였고, PRRSV의 GP5 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위해서는 서열번호 2와 5의 프라이머 세트를 사용하였다. PCR 검증 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 패널 1과 2에서 나타난 바와 같이, 보르데텔라 브론키셉티카 균주의 aroA 유전자좌가 부분 제거되고 KanR(패널 1, 0.7kb)과 GP5 유전자(패널 2, 0.5kb)가 삽입되어 있음을 확인하였다.
실시예 3: PRRSV 의 GP5 의 발현 여부 확인
카나마이신으로 선택된 보르데텔라 브론키셉티카 변이주에서 GP5가 발현되는지 여부를 알아보기 위하여 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 카나마이신으로 선택된 보르데텔라 브론키셉티카 변이주 배양액 5ml를 원심분리하여 펠렛을 준비하였고, 2X 시료 완충액(0.125M Tris(pH 6.8), 4％ SDS, 20％ 글리세롤, 10％ 2-메르캅토에탄올, 0.2％ 브로모-페놀 블루)을 첨가하고 변성시킨 후, 10％ SDS-PAGE에서 전기영동을 실시하였다. 추출한 단백질을 PVDF 막으로 옮긴 후 토끼 항-GP5 항체를 1차 항체로, 염소 항-토끼 IgG HRP-접합된 항체(Pierce, USA)를 2차 항체로 사용하여 GP5의 발현을 확인하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 원하는 크기 약 22 kDa의 단백질을 나타내는 밴드가 형성되어, PRRSV의 GP5가 발현되었음을 확인하였다.
실시예 4: PRRSV 의 GP5 를 발현하는 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 이용한 면역원성 실험
보르데텔라 브론키셉티카 균주에서 발현된 PRRSV의 GP5가 면역원성을 나타내는지 알아보기 위해 마우스에 균주를 접종하여 항체의 생성 여부를 알아보았다. 이를 위하여 균주를 1X108/ml로 준비하고 마우스의 피하에 10㎕씩 접종하였다. 접종 후 2주간격으로 2회 더 추가 접종을 실시하고 마지막 접종 후 1주일째 마우스를 희생하여 혈액을 채취하고 혈청을 분리하였다. 혈청중에 존재하는 항-GP5 항체를 검사하기 위해 ELISA를 실시하였다. 즉, 96-웰 마이크로플레이트에 재조합 GP5를 1㎍ /ml로 준비하고 웰당 90㎕씩 접종하여 항원을 코팅하였다. 채취된 마우스 혈청은 PBS로 100배 희석하여 사용하였고 2차 항체는 염소 항-마우스 IgG (HRP-conjugated)를 500배 희석하여 사용하였다. 양성대조군으로는 항-재조합 GP5 표준혈청을 사용하였고 음성대조군으로는 일반 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 동일한 방법으로 접종하여 준비된 혈청을 사용하였다. 결과의 판독은 ELISA에서 측정된 OD값의 평균치±표준편차로 나타내었다.
실험결과, 양성대조군의 항체가는 1.32±0.291로, 그리고 음성대조군의 항체가는 0.208±0.012로 나타나 대조군 실험이 잘 이루어졌음을 보여주었다. 실험군인 PRRSV의 GP5를 발현하는 보르데텔라 브론키셉티카 균주를 접종한 마우스의 혈청중에 존재하는 항-GP5 항체가는 0.827±0.273로 나타나 통계적으로 유의성있게 (P < 0.05) 음성대조군에 비해 높은 항체가를 나타내어 보르데텔라 브론키셉티카 균주에서 발현되는 GP5에 대해 항체가 잘 형성됨을 알 수 있었다.
도 1은 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)의 aroA 유전자 N-말단 약 300머(300mer)와 C-말단 약 300머(300mer), 선택 마커 유전자인 카나마이신 저항 유전자, 및 이종 항원 단백질인 PRRSV의 GP5 유전자를 클로닝하고 이를 서로 연결하여 pGEM-aroA-kanR-PRRS 작제물을 제조하는 단계를 개략적으로 나타낸 것으로, 상기 작제물은 상동 재조합용 삽입체로 사용된다.
도 2는 aroA N-말단(A), C-말단(B), kanR 유전자(C), PRRSV GP5 유전자(D)를 PCR로 증폭한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 PCR로 증폭한 aroA N-말단(1), C-말단(2), kanR 유전자(3), PRRSV GP5 유전자(4)를 pGEM-T easy 클로닝 벡터에 클로닝한 후 제한효소 EcoRI으로 처리하고 각각의 크기를 아가로스 겔 상에서 확인한 것이다.
도 4는 작제물인 삽입체 pGEM-aroA-KanR-PRRS를 XhoI과 HindIII로 잘라 크기를 확인한 전기영동 사진으로서, 기대되는 크기인 1.68kb의 삽입체가 형성되었음을 보여주는 사진이다.
도 5는 aroA 유전자좌 중에 KanR 유전자와 PRRSV GP5 유전자가 삽입되었는지 여부를 확인하기 위한 검증(verification) PCR의 모식도이다.
도 6은 aroA 유전자좌 중에 KanR 유전자와 PRRSV GP5 유전자가 삽입되었는지 여부를 확인하기 위한 검증 PCR을 통해 증폭된 PCR 산물을 보여주는 사진이다.
도 7은 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카 변이주에서 PRRSV-GP5의 발현 여부를 알아본 웨스턴 블롯팅 실험 결과로서, 패널 1은 야생형 보르데텔라 브론키셉티카이고, 패널 2는 본 발명에서 제조된 이종 항원 단백질인 GP5(약 20 kDa)을 발현하는 변이주 보르데텔라 브론키셉티카이다.
<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY BIORESOURCE INC. <120> A COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING PRRSV INFECTION COMPRISING LIVE ATTENUATED BORDETELLA BRONCHISEPTICA STRAIN EXPRESSING GP5 OF PRRSV AND METHOD FOR PRODUCING THEREOF <130> PN079447 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 200 <212> PRT <213> PRRSV GP5 PROTEIN <400> 1 Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Phe 1 5 10 15 Leu Trp Cys Ile Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30 Asn Asn Asn Ser Ser His Ile Gln Leu Ile Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45 Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asp Trp Ala Val 50 55 60 Glu Thr Phe Val Ile Phe Pro Val Leu Thr His Ile Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80 Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95 Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser Ile Tyr 100 105 110 Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu Ile Cys Phe Val Ile Arg Leu Ala 115 120 125 Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140 Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val Ile 145 150 155 160 Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu Ile Asp Leu 165 170 175 Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val 180 185 190 Ser Ala Glu Gln Trp Gly Arg Leu 195 200 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> aroA-N-F(P1) <400> 2 gcgcctcgag atgagcggat tggcatatct cgacc 35 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> aroA-N-R(P2) <400> 3 atatagatct ccggaacgcg gtgccggcgt tgcct 35 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> aroA-C-F(P3) <400> 4 atatggtacc tgccgcctgc gcaacatcgg cagct 35 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> aroA-C-R(P4) <400> 5 atataagctt tcagtcccgc gcggccagca ggccc 35 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> KanR-F(P5) <400> 6 gcgcagatct atgattgaac aagatggatt 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> KanR-R(P6) <400> 7 ggccggtacc tcagaagaac tcgtcaagaa 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> GP5-F(P7) <400> 8 aattggtacc atgagcaacg acagcagctc cca 33 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> GP5-R(P8) <400> 9 ggccggatcc ctaaggacga ccccattgtt 30

Claims (12)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 돼지생식기호흡기증후군 바이러스(Porcine Reproductive Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)의 당단백질 5(glycoprotein 5, GP5)를 발현하는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 균주 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는, 포유 동물의 PRRSV 감염증 및 보르데텔라 브론키셉티카 감염증을 예방 또는 치료하기 위한 피하 투여용 면역원성 조성물.
  7. 삭제
  8. 제6항의 면역원성 조성물을 인간을 제외한 포유 동물에게 피하 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유 동물의 PRRSV 감염증 및 보르데텔라 브론키셉티카 감염증을 예방 또는 치료하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 PRRSV의 GP5 유전자 서열이 상기 균주의 aroA 유전자좌에 삽입되어 있는 것인 조성물.
  10. 제6항에 있어서, 상기 균주는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카(수탁번호 KCCM 10956P)인 것인 조성물.
  11. 제8항에 있어서, 상기 PRRSV의 GP5 유전자 서열이 상기 균주의 aroA 유전자좌에 삽입되어 있는 것인 방법.
  12. 제8항에 있어서, 상기 균주는 약독화된 보르데텔라 브론키셉티카(수탁번호 KCCM 10956P)인 것인 방법.
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