ES2846698T3 - Composición de vacuna contra la infección por Streptococcus suis - Google Patents

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Abstract

Una composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos que comprende una cantidad efectiva de al menos un polipéptido seleccionado del grupo de (a) una proteína denominada IdeSsuis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o (b) una proteína denominada rIdeSsuis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 6 o 7, y al menos un portador farmacéutico, un diluyente o un adyuvante.

Description

DESCRIPCIÓN
Composición de vacuna contra la infección por Streptococcus suis
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición de vacuna para su uso en la inmunización y protección de cerdos contra Streptococcus suis.
Antecedentes de la invención
Streptococcus suis (S. suis) coloniza el tracto respiratorio, digestivo y genital de los cerdos. S. suis es también uno de los patógenos porcinos más importantes, que causa diferentes patologías como meningitis, septicemia, artritis y endocarditis.
Las infecciones por S. suis son responsables de grandes pérdidas de producción en la industria porcina en todo el mundo. Los antibióticos se usan comúnmente para tratar las infecciones por S. suis. Pero las infecciones recurrentes ocurren con frecuencia, así como también las discusiones en curso sobre la reducción del uso de antibióticos subrayan la necesidad de medidas de control alternativas. En Europa, no hay una vacuna autorizada disponible, pero se usan comúnmente bacterinas autólogas. Un gran inconveniente es el hecho de que estas vacunas protegen solo contra el serotipo homólogo. Pero S. suis es un organismo muy diverso y diferentes serotipos son responsables de la morbilidad en los lechones. Especialmente las cepas del serotipo 2 juegan un papel importante en las enfermedades de los lechones en todo el mundo.
Se ha identificado que el serotipo 2 de S. suis causa meningitis en adultos en Asia, pero hasta la fecha no se ha detectado transmisión de S. suis entre humanos.
En general, las infecciones provocan una respuesta de inmunoglobulina M (IgM) antígeno-específica temprana que conduce a la maduración de la afinidad y al cambio de isótopos. Además, los anticuerpos IgM presentes antes de la infección, que se producen naturalmente, son importantes en la vinculación de la inmunidad innata con la adaptativa. En los cerdos, la IgM es especialmente importante como IgM de membrana monomérica (mlgM), ya que es el único receptor de células B que se produce ya que la IgD está ausente en los cerdos. Además, la síntesis de IgM en lechones recién nacidos comienza mucho antes que la síntesis de IgG e IgA. La IgM en el calostro es crucial para la protección contra patógenos que se lleva a cabo mediante la destrucción mediada por el complemento. Por lo tanto, los anticuerpos IgM son importantes en la protección contra diferentes patógenos.
Se han identificado diversos factores de virulencia o asociados a la virulencia del serotipo 2 de S. suis, entre la cápsula, que es hasta ahora el único factor de virulencia esencial conocido que protege al patógeno contra la fagocitosis. Varias proteínas secretadas y asociadas a la superficie del serotipo 2 de S. suis exhibe las mismas o funciones muy similares a la de los factores homólogos de otros estreptococos patógenos. Una variedad de patógenos humanos o animales tales como Streptococcus pyogenes, Streptococcus equi subespecie equi y Streptococcus equi subespecie zooepidemicus expresan endopeptidasas IgG específicas que son homólogas entre sí.
Se describió por primera vez un factor secretado o asociado a la superficie con una función única para S. suis por Seele y otros ("Identificación de una nueva proteasa IgM huésped-específica en Streptococcus suis". 2013; Journal of Bacteriology, 195: 930-940). Seele y otros, mostraron que esta proteasa IgM, designada IdeSsuis, no funciona como una endopeptidasa IgG. La proteasa IgM degrada la IgM opsonizante en la superficie bacteriana y, por lo tanto, promueve la supervivencia de S. suis en la sangre de lechones cebados con bacterina. La IdeSsuis es altamente específica para la IgM y no escinde la IgG ni la IgA. Sin embargo, Seele y otros, no dicen nada sobre la función de IdeSsuis, rIdeSsuis y análogos y fragmentos de los mismos como una vacuna efectiva contra infecciones por S. suis. Se plantea simplemente la hipótesis de que la neutralización de la actividad de la proteasa IgM de IdeSsuis podría mejorar sustancialmente la eficacia protectora de las bacterinas u otras vacunas futuras que induzcan anticuerpos opsonizantes. Sin embargo, no se describe que IdeSsuis y proteínas relacionadas puedan usarse como el agente inmunizante exclusivo en una vacuna contra infecciones por S. suis.
Baums y otros describen en Factores secretados y asociados a la superficie de Streptococcus suis en epidemiología, patogénesis y desarrollo de vacunas, Animal Health Research Reviews, Volumen 10, Número 01, junio de 2009, págs. 65-83, factores bacterianos, tanto asociados a la superficie como secretados, que se considera contribuye a la(s) interacción(es) de S. suis con factores y células del huésped. Los factores se presentan con respecto a (i) su identificación y características, (ii) su distribución entre S. suis y (iii) su importancia para la virulencia, la respuesta inmune y la vacunación. Esta revisión enfatiza las numerosas preguntas desafiantes que quedan por responder en el futuro.
JANA SEELE Y OTROS, "La enzima degradante de la inmunoglobulina M de Streptococcus suis, IdeSsuis, es un antígeno altamente protector contra el serotipo 2", Vaccine, 2015, volumen 33, 2207-2212, describen una enzima degradante de la inmunoglobulina M altamente específica designada como Idessuis y su uso en una vacuna recombinante contra Streptococcus suis.
WISSELINK HJ Y OTROS, "Protección de cerdos contra el desafío con cepas virulentas del Serotipo 2 de Streptococcus suis por una proteína liberada por muramidasa y una proteína extracelular y una vacuna de factor extracelular", VETERINARY RECORD, BRITISH VETERINARY ASSOCIATION, Londres, Reino Unido, (20010414), volumen 148, número 15, ISSN 0042-4900, páginas 473-477, describen la eficacia de una vacuna de proteína liberada por muramidasa (MRP) y factor extracelular (EF) para prevenir infecciones y enfermedades en cerdos desafiados con una cepa homóloga o heteróloga del serotipo 2 de Streptococcus suis (MRP+EF+). Se realizó una comparación con la eficacia de una vacuna que contenía bacterina muerta con formalina del serotipo 2 de S. suis (MRP+EF+).
El problema a resolver de acuerdo con la invención es superar los problemas descritos en la técnica y proporcionar una nueva composición de vacuna para inmunizar y proteger a mamíferos, en particular cerdos y humanos, contra infecciones por S. suis.
Resumen de la invención
Este problema se resuelve, de acuerdo con la presente invención, al proporcionar una composición de vacuna para su uso de acuerdo la reivindicación 1 en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos y comprende una cantidad efectiva de al menos un polipéptido seleccionado entre el grupo de
(a) una proteína denominada IdeSsuis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o
(b) una proteína denominada rIdeSsuis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 6 o 7, y
al menos un portador farmacéutico, un diluyente o un adyuvante.
Descripción detallada de la invención
La composición de vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención contiene al menos un único polipéptido definido por (a) o (b) junto con un portador farmacéutico o un diluyente o un adyuvante o una mezcla de los mismos. Además, las composiciones de vacuna se describen en la presente descripción, en donde rIdeSsuis comprende o consiste en un fragmento o un análogo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 6 o 7;
una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % homóloga, preferentemente 70 % homóloga y con la máxima preferencia 85 % homóloga de la secuencia de aminoácidos de la proteína IdeSsuis de la SEQ ID NO: 1; un fragmento como se describió anteriormente que tiene una actividad proteasa IgM; o
un fragmento como se describió anteriormente que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % homóloga a la misma.
La composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos se caracteriza preferentemente porque rIdeSsuis (b) comprende una secuencia de aminoácidos que carece de los aminoácidos de la posición 1 a la 34 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de la SEQ ID NO: 1, sin embargo, carece de los aminoácidos 1-34 (péptido señal) pero añade una etiqueta HIS. Se observa que la SEQ ID NO: 1 se derivó de la cepa del serotipo 2 de S. suis.
La secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 representa la secuencia N terminal de la SEQ ID NO: 2.
La SEQ ID NO: 7 (también denominada antígeno rIdeSsuisB2) contiene la secuencia de aminoácidos completa de la proteína IdeSsuis madura de una cepa del serotipo 7 de S. suis pero con una etiqueta HIS N terminal añadida. La proteína IdeSsuis de una cepa del serotipo 7 de S. suis difiere en la mitad C terminal de la proteína ya que carece de una secuencia de 114 aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 1. Los aminoácidos 80 a 414 de la SEQ ID NO: 7 (parte muy conservada del denominado dominio Mac-1) corresponden en un 97,9 % a la secuencia de la SEQ ID NO: 5. La identidad total entre la SEQ ID NO: 7 y 1 es 96,4 % (sin considerar la etiqueta HIS en el extremo N terminal y el espacio de 114 aminoácidos).
El término "fragmento o análogo" como se usa en la presente descripción se define como sigue:
Un "análogo" puede considerarse como una secuencia de aminoácidos similar a las descritas anteriormente y que muestra un nivel de homología de al menos 60 %, preferentemente 70 % y con la mayor preferencia 85 % con la secuencia de aminoácidos original (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1, 2, 6 o 7). También se contemplan en la presente descripción grados más altos de homología, tales como 95 %. Homología, como se usa en la presente descripción, significa identidad. Como tal, las secuencias pueden diferir entre sí en función de la sustitución, deleción o inserción. El grado de identidad puede determinarse con el programa de proteína blast mediante el uso del algoritmo blastp con parámetros predeterminados que son, por ejemplo, Umbral de expectativa: 10, Tamaño de palabra: 3, Matriz: BLOMSUM62, Costos de Brecha: Existencia: 11 Extensión: 1 y Composición ajustes: Ajuste de la matriz de puntuación de composición condicional (BLAST es una marca registrada de la Biblioteca Nacional de Medicina). El programa puede usarse para buscar en una base de datos de proteínas mediante el uso de una consulta de proteínas. Identity informa las coincidencias exactas entre la consulta alineada y las secuencias de la base de datos. Preferentemente, las "sustituciones" de aminoácidos son el resultado de reemplazar un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, es decir, reemplazos conservadores de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden realizarse sobre la base de la similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina; los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina; los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina; y los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.
Las "inserciones" o "deleciones" están típicamente en el intervalo de aproximadamente 1, 2 o 3 aminoácidos. La variación permitida puede determinarse experimentalmente mediante inserciones o deleciones de aminoácidos en una proteína de forma sistemática mediante el uso de técnicas de ADN recombinante y mediante ensayos de la actividad de las variantes recombinantes resultantes. Esto no requiere más que experimentos de rutina para una persona experta.
Un "análogo" puede definirse además o alternativamente como una secuencia de aminoácidos similar a las descritas anteriormente y que comprende la parte altamente conservada del dominio Mac-1 (SEQ ID NO: 5) o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % homólogo al mismo. Los inventores encontraron sorprendentemente que este dominio es el principal responsable de la actividad inmunogénica inesperada de las proteínas IdeSsuis y, por sí mismo, es suficiente para proporcionar protección inmunitaria al animal vacunado. Diferentes serotipos de S. suis existen que muestran parcialmente grandes variaciones en su secuencia de aminoácidos, por tanto, conducen a un nivel de homología de hasta aproximadamente el 60 %. Sin embargo, el dominio Mac-1 altamente conservado muestra solo pequeñas variaciones entre los diferentes serotipos, por ejemplo, el 97,9 % entre las cepas de los serotipos 2 y 7.
Por lo tanto, es aceptable que los aminoácidos (y los ácidos nucleicos que los codifican) muestren un mayor nivel de variación fuera del dominio Mac-1 que dentro.
El término "fragmento" puede definirse de manera similar (ver más arriba). Describe una secuencia de aminoácidos más corta que un análogo (menos de aproximadamente 400 aminoácidos). Contiene o consiste en la parte altamente conservada del dominio Mac-1 (SEQ ID NO: 5) o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % homóloga a la misma. Opcionalmente, un fragmento puede definirse como que tiene actividad proteasa IgM, aunque esto no es un requisito esencial.
Una composición de vacuna adicional como se describe en la presente descripción comprende, consiste esencialmente en o consiste en una proteína que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % homóloga a la misma.
En una modalidad preferida, la proteína comprendida en una vacuna para su uso según la presente invención es el único ingrediente activo o inmunogénico.
El término "que comprende" como se usa en la presente descripción en el contexto de la composición de vacuna significa que pueden estar presentes componentes activos o inmunogénicos adicionales. "Que consiste de" significa que no hay componentes adicionales presentes y "que consiste esencialmente en" significa que pueden estar presentes componentes específicos adicionales, es decir, aquellos que no afectan materialmente las características esenciales de la vacuna (es decir, los ingredientes inactivos o no inmunogénicos).
También se describe aquí una composición de vacuna que consiste esencialmente en una proteína rIdeSsuis que es al menos 60 %, 70 %, 85 % o 95 % homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína IdeSsuis de la SEQ ID NO: 1 y/o comprende o consiste de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % homóloga a la misma.
Las definiciones anteriores son también aplicables mutatis mutandis a las secuencias de ácidos nucleicos que codifican estas proteínas. Las definiciones de homología son las mismas, la longitud del fragmento sería inferior a aproximadamente 1200 ácidos nucleicos.
Se describe además una composición de vacuna en donde un fragmento de la cantidad efectiva de dicho polipéptido de (a) o (b) es parte de una proteína de fusión con al menos otra proteína.
En la presente descripción se describe una composición de vacuna que contiene un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una proteína definida como IdeSsuis, específicamente
(a.a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(a.b) un fragmento o un análogo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
o
(a.c) un fragmento de (a.a) o (a.b) que tiene una actividad proteasa IgM.
Tal composición de vacuna puede caracterizarse porque el polinucleótido comprende
(c.a) una secuencia de la SEQ ID NO: 3 o una secuencia complementaria a la misma;
(c.b) un fragmento de la secuencia de (c.a) o
(c.c) un fragmento de la secuencia de (c.a) que codifica una proteína que tiene actividad proteasa IgM.
Tal composición de vacuna puede comprender un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una proteína definida como rIdeSsuis, específicamente
(b.a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(b.b) un fragmento o un análogo de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2;
(b.c) una secuencia de aminoácidos que carece de los aminoácidos de la posición 1 a la 34 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1;
(b.d) una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % homóloga, preferentemente 70 % homóloga y con la mayor preferencia 85 % homóloga de la secuencia de aminoácidos de la proteína IdeSsuis de la SEQ ID NO: 1; o
(b.e) un fragmento de (b.a) o (b.b) o (b.c) o (b.d) que tiene una actividad proteasa IgM, y/o
(b.f) un fragmento de (b.a) o (b.b) o (b.c) o (b.d) que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % homóloga a la misma.
Por ejemplo, tal composición de vacuna puede caracterizarse porque el polinucleótido comprende
(d.a) una secuencia de la SEQ ID NO: 4, 8 o 9 o una secuencia complementaria a la misma;
(d.b) un fragmento de la secuencia de (d.a) o
(d.c) un fragmento de la secuencia de (d.a) que codifica una proteína que tiene actividad proteasa IgM
Tal composición de vacuna puede comprender un polinucleótido que es ADNc, ADN o ARNc, ARN. El término "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a un heteropolímero de nucleótidos o la secuencia de estos nucleótidos. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a un heteropolímero de nucleótidos.
Tal polinucleótido puede integrarse en un vector, en donde el polinucleótido está operativamente unido a una región de control de expresión del vector.
Este vector de expresión comprende preferentemente una o más secuencias reguladoras. El término "vector de expresión" generalmente se refiere a un plásmido o fago o virus o vector, para expresar un polipéptido a partir de una secuencia de ADN (ARN). Un vector de expresión puede comprender una unidad transcripcional que comprende un ensamblaje de (1) un elemento o elementos genéticos que tienen un papel regulador en la expresión génica, por ejemplo, promotores o potenciadores, (2) una secuencia estructural o codificante que se transcribe en ARNm y se traduce en proteína, y (3) secuencias de iniciación y terminación de la transcripción apropiadas. Las unidades estructurales que se pretenden usar en levaduras o sistemas de expresión eucariotas incluyen preferentemente una secuencia líder que permite la secreción extracelular de la proteína traducida por una célula huésped. Alternativamente, cuando la proteína recombinante se expresa sin una secuencia líder o de transporte, puede incluir un residuo de metionina en el extremo N-terminal. Este residuo puede o no escindirse subsecuentemente de la proteína recombinante expresada para proporcionar un producto final.
También se prefiere que una composición de vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención, se proporcione en una forma fisiológicamente administrable y sea adecuada para una inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea o dérmica o una aplicación en mucosas. Cabe señalar que se prefiere menos una administración intravenosa.
Un fragmento de IdeSsuis puede tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, o una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % homóloga a la misma. La SEQ ID NO: 5 corresponde a la parte altamente conservada del dominio Mac-1. Aunque este dominio muestra una actividad proteasa IgM, el efecto inmunogénico no está necesariamente vinculado a esta actividad. Por ejemplo, los análogos de la SEQ ID NO: 5 pueden caracterizarse porque el centro activo de la proteasa ha sido inactivado por mutagénesis del residuo Cys. También en este caso, el análogo será efectivo como una vacuna para provocar una respuesta inmune.
Además, resultó que las secuencias de aminoácidos pueden ser efectivas como una vacuna contra S. suis si mantienen una homología de al menos el 95 % con la s Eq ID NO: 5. Esto incluye la sustitución, inserción o deleción de aminoácidos individuales. Resultó que los dominios Mac-1 de origen natural, aunque muestran algunas variaciones, no difieren en más del 5 %, o, en otras palabras, comparten una identidad del 95 % o más en este dominio. Se obtuvieron secuencias ilustrativas de Streptococcus suis a partir de cepas aisladas en diferentes regiones geográficas (América, Asia, Europa) y se derivaron de diferentes organismos hospedadores (humanos, cerdos). Estas cepas pertenecen a diferentes serotipos (1 a 4, 7 a 9, 14 y 16 o que no fueron tipificables). Esto se resume en la Tabla 1 adjunta:
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La información de secuencia en el dominio Mac-1 de las proteínas WP_044671938, WP_002935529, WP_015647040, WP_023370787 y WP_044678723 se describe en la SEQ ID NO: 10 a la SEQ ID NO: 14. Dado que su homología con la SEQ ID NO: 5 es superior al 95 %, se encuentran dentro de la definición de fragmento u homólogo como se proporcionó anteriormente.
Otro aspecto más es una vacuna para su uso de acuerdo con la invención que comprende una proteína rIdeSsuis que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 o 7. También se describe en la presente descripción una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 %, preferentemente 70 %, 85 % o 95 % homóloga a la secuencia de aminoácidos de la proteína IdeSsuis de la SEQ ID NO: 6 o 7.
También se describe una célula huésped que se transfecta con el vector.
En la presente descripción se describe además un método para producir una proteína definida como rIdeSsuis como un antígeno huésped en un vector o un organismo diferente, respectivamente una célula huésped transfectada en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína recombinante.
También se describe un anticuerpo que reconoce a rIdeSsuis o una proteína, análogo o fragmento de IdeSsuis definido anteriormente.
El anticuerpo se selecciona preferentemente de un grupo que consiste de anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos sintéticos.
El término "anticuerpo" se usa en la presente descripción para anticuerpos intactos, así como también para fragmentos de anticuerpos, que tienen cierta capacidad para unirse selectivamente a un epítopo. Tales fragmentos incluyen, sin limitaciones, fragmentos de anticuerpos Fab, F(ab')2 y Fv. El término "epítopo" significa cualquier antígeno determinante de un antígeno, al que se puede unir el parátopo de un anticuerpo. Los determinantes de epítopos normalmente consisten en grupos de moléculas de superficie químicamente activos (por ejemplo, aminoácidos o residuos de azúcar) y normalmente presentan una estructura tridimensional así como también propiedades físicas específicas.
Los anticuerpos pueden producirse de acuerdo con cualquier procedimiento conocido. Por ejemplo, la proteína IdeSsuis completa pura o la proteína rIdeSsuis o un fragmento/análogo de la misma puede producirse y usarse como inmunógeno, para inmunizar un animal y producir anticuerpos específicos.
La producción de anticuerpos policlonales es comúnmente conocida. Pueden encontrarse protocolos detallados, por ejemplo, en Green y otros, Producción de Antisueros Policlonales, en Immunochemical Protocols (Manson, editor), páginas 1-5 (Humana Press 1992) y Coligan y otros, Producción de Antisueros Policlonales en Conejos, Ratas, Ratones y Hámsteres, en Current Protocols In Immunology, sección 2.4.1 (1992). Además, el experto está familiarizado con varias técnicas relacionadas con la purificación y concentración de anticuerpos policlonales, así como también de anticuerpos monoclonales (Coligan y otros, Unidad 9, Current Protocols in Immunology, Wiley Interscience, 1994).
La producción de anticuerpos monoclonales también es comúnmente conocida. Los ejemplos incluyen el método del hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256: 495-497, Coligan y otros, Sección 2.5.1 - 2.6.7; y Harlow y otros, Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio, página 726 (Cold Pub de Spring Harbor. 1988)), la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor y otros, 1983, Immunology Today 4: 72), y la técnica del hibridoma EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole, y otros, 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96).
En resumen, los anticuerpos monoclonales pueden obtenerse al inyectar una mezcla que contiene la proteína en ratones. La producción de anticuerpos en los ratones se controla mediante una sonda de suero. En el caso de un título de anticuerpos suficiente, se sacrifica el ratón y se extrae el bazo para aislar las células B. Las células B se fusionan con células de mieloma dando lugar a hibridomas. Se clonan los hibridomas y se analizan los clones. Se seleccionan los clones positivos que contienen un anticuerpo monoclonal contra la proteína y se aíslan los anticuerpos de los cultivos de hibridoma. Existen muchas técnicas bien establecidas para aislar y purificar anticuerpos monoclonales. Tales técnicas incluyen cromatografía de afinidad con proteína A sefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico. Ver también, por ejemplo, Coligan y otros, Sección 2.7.1 - 2.7.12 y sección "Immunglobulin G (IgG)", en Methods In Molecular Biology, volumen 10, páginas 79-104 (Humana Press 1992).
Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos de ratón específicos de IdeSsuis o rIdeSsuis humanizados.
Los anticuerpos anteriores pueden formar parte de una composición parenteral para el tratamiento terapéutico de un paciente humano o animal (cerdo) que padece de una infección de S. suis. Sin embargo, también podría usarse con fines profilácticos.
La presente invención proporciona la composición de vacuna para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, para el tratamiento profiláctico o metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos. En la presente descripción se describe además el uso de la vacuna para el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por S. suis en un paciente humano.
La composición de vacuna es especialmente preferida para su uso de acuerdo con la presente invención, en donde el tratamiento provoca una respuesta inmunológica en los cerdos mientras que la respuesta inmunológica es la activación de una respuesta humoral y celular contra la proteína IdeSsuis producida por Streptococcus suis.
El tratamiento (vacunación) implica al menos una o dos inmunizaciones. La dosis total administrada por cerdo/humano es de aproximadamente 0,05-2,0 mg de proteína.
La preparación de la composición de vacuna para su uso de acuerdo con la invención es conocida en la técnica y se describe en manuales conocidos por el experto en la técnica. Para la producción de la composición de vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención, los portadores, diluyentes o adyuvantes farmacéuticamente aceptables que pueden usarse comprenden, pero no se limitan a lo siguiente: adyuvantes de sales minerales (por ejemplo, a base de aluminio, calcio, hierro, zirconio), adyuvantes tensioactivos (por ejemplo, Quil A, QS-21, otras saponinas), adyuvantes derivados de bacterias (por ejemplo, N-acetil muramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP), lipopolisacáridos (LPS), monofosforilo lípido A, dimicolato de trehalosa (TDM), ADN, CpG, toxinas bacterianas), emulsiones de adyuvantes (por ejemplo, FIA, Montanide, Adjuvant 65, Lipovant), adyuvantes de liposomas, adyuvantes poliméricos y portadores, citocinas (por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos), adyuvantes de carbohidratos, sistemas de suministro de antígenos vivos (por ejemplo, bacterias, virus). Además, los portadores también pueden comprender formulaciones secas tales como parches recubiertos hechos de titanio o polímero. Las técnicas para la formulación y administración de las vacunas de la presente solicitud también pueden encontrarse en "Remington, La Ciencia y Práctica de Farmacia", 22a edición.
Por tanto, en la presente descripción se describe una composición de vacuna que comprende una proteína denominada IdeSsuis o rIdeSsuis o un fragmento de cualquiera de las mismas; o un polinucleótido que expresa la proteína IdeSsuis o rIdeSsuis o un fragmento de las mismas que está integrado en un vector de expresión, mientras que se prefiere la proteína recombinante.
Los inventores detectaron lo siguiente:
(a) la inducción de anticuerpos opsonizantes es crucial para la eficacia protectora de una bacterina de S. suis. (b) La IdeSsuis promueve la supervivencia de S. suis en la sangre de lechones vacunados.
Además, los inventores mostraron que la vacunación de cerdos mediante el uso de la proteína rIdeSsuis sola como único antígeno proporciona una protección para los cerdos infectados por S. suis. De acuerdo con la invención, la vacunación con rIdeSsuis previene la escisión de las IgM por la IdeSsuis IgM proteasa de S. suis al inducir anticuerpos neutralizantes.
Los inventores mostraron además que la vacunación de cerdos con la proteína recombinante rIdeSsuis o un fragmento de la misma condujo a títulos altos de anticuerpos IgG IdeSsuis específicos con actividad neutralizante en contraste con los reconvalecientes o lechones inmunizados con bacterina de S. suis. Además, de acuerdo con el Ejemplo 1, se ha demostrado que rIdeSsuis proporciona una mayor inmunidad contra S. suis que las vacunas de bacterina de la técnica anterior.
Además, los inventores mostraron que la vacunación de cerdos con la proteína recombinante rIdeSsuis o un análogo o fragmento de la misma reduce la supervivencia de S. suis en la sangre.
Un punto importante, como se señaló anteriormente, reside en la sorprendente comprensión de que las proteínas, los ácidos nucleicos y sus análogos y fragmentos, tal como se definen anteriormente, pueden usarse como el único agente inmunogénico para proporcionar protección contra infecciones por S. suis. No se requieren otros ingredientes activos, tales como bacterinas, etc., usados en la técnica anterior. Esto está apoyado por la evidencia experimental proporcionada en el Ejemplo 2. Se demostró que las vacunas para su uso de acuerdo con la presente invención tienen una eficacia espectacularmente mejorada frente a las vacunas placebo/control, ver los datos del ensayo bactericida de los ensayos 1 y 2 del Ejemplo 2 (Figura 3 y 4). Las conclusiones que pueden extraerse de los resultados experimentales son las siguientes:
• rIdeSsuis (SEQ ID NO: 2) proporciona protección inmunitaria a través de diferentes serotipos de S. suis,
• Una proteína que contiene al menos el dominio Mac-1 altamente conservado (SEQ ID NO: 5) es suficiente para proporcionar protección inmunológica,
• Además, las proteínas IdeSsuis de otros serotipos, que al menos contienen el dominio Mac-1 altamente conservado (SEQ ID NO: 5) inducen protección, incluso si su secuencia general fuera de este dominio difiere de la de las cepas del serotipo 2 (incluso si ciertos segmentos de secuencia están completamente ausentes).
Las proteínas IdeSsuis o rIdeSsuis o análogos/fragmentos de las mismas también pueden usarse en proteínas de fusión. Las proteínas de fusión se crean al unir dos o más genes que originalmente están codificados para proteínas separadas. La traducción de este gen de fusión da como resultado un polipéptido único o múltiple con funciones derivadas de cada una de las proteínas originales. En el estado de la técnica, las proteínas de fusión se usan a menudo para simplificar aplicaciones específicas, como la detección, integración o transporte de la proteína de interés. Un miembro destacado para la detección por microscopía fluorescente es la proteína fluorescente verde (GFP) fusionada con la proteína de interés.
Otras proteínas que podrían fusionarse con IdeSsuis para mejorar la liberación y la inmunogenicidad del antígeno son el fragmento FC de inmunoglobulina, la subunidad CTA de la toxina no tóxica del cólera, las toxinas termolábiles mutadas, la proteína de la cubierta de la espora de Bacillus subtilis o las flagelinas bacterianas. Además, las proteínas de fusión con proteínas de virus o fagos (por ejemplo, virus vaccinia modificado Ankara (MVA), virus de la hepatitis B, fago Lambda o bacteriófagos filamentosos como fd, M13 o fl) pueden usarse para la expresión de IdeSsuis en la superficie de una partícula de virus o una partícula similar a un virus.
Otra posibilidad para detectar proteínas de fusión es el uso de las denominadas etiquetas de proteínas que se usan a menudo durante la producción de proteínas de fusión, respectivamente, su purificación y detección mediante la realización de cromatografía de afinidad, transferencia de Western, inmunohistoquímica o microscopía fluorescente. Las etiquetas de proteínas son comúnmente secuencias cortas de aminoácidos, por ejemplo, etiqueta HIS, etiqueta myc, etiqueta HA, etiqueta Step, etiqueta GST, etiqueta de la proteína de unión a maltosa o etiqueta de tiorredoxina. El método para producir proteínas recombinantes tales como rIdeSsuis, fragmentos o análogos de las mismas, descrito en la presente descripción es conocido por el experto en la técnica y también descrito por manuales conocidos por el experto en la técnica. En general, las células huésped se usan para transfectarlas con un vector que codifica la proteína de interés para la producción de una proteína recombinante. En general, esas células huésped pueden ser bacterias (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus o Lactococcus), humanas (por ejemplo, 293-T, HEK-293), líneas celulares de ratón, líneas celulares de insectos, células de levadura o sistemas basados en plantas.
Para la transfección de células huésped, pueden usarse vectores de expresión tales como plásmidos (por ejemplo, pET, pQE), virus y fagos (por ejemplo, baculovirus, fagos Lambda o bacteriófa.0000000gos filamentosos).
Normalmente, las composiciones de vacuna o parenterales se preparan como inyectables, tanto como soluciones líquidas o suspensiones.
La vacuna para su uso de acuerdo con la presente invención puede ser para una aplicación subcutánea, intravenosa, intramuscular, dérmica o en mucosas.
Las presentes vacunas se usan para realizar un tratamiento profiláctico o metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos. El tratamiento implica al menos una, preferentemente dos inmunizaciones. Aunque en la práctica se prefiere una única inmunización, una inmunización estándar normalmente comprende un régimen de cebado-refuerzo, es decir, 2 vacunas distintas. La vacunación de refuerzo generalmente se administra en un período de tiempo de 1-3, preferentemente aproximadamente 2 semanas después de la vacunación de cebado. La dosis de las vacunas individuales puede ser la misma o diferente, aunque se prefiere que la dosis de vacuna de ambas sea idéntica.
La dosis total que debe administrarse al paciente animal es de aproximadamente 0,05-2,0 mg de proteína IdeSsuis o rIdeSsuis como se define anteriormente. Las dosis preferidas incluyen 0,1-1,0, con mayor preferencia aproximadamente 0,5 mg. Esta dosis se administra en una dosis si una sola vacuna es suficiente. Si se aplica más de una vacuna, la dosis total se divide en varias subdosis iguales, por ejemplo, si se utilizan dos vacunas, la dosis individual de la vacuna es de aproximadamente 0,025-1,0 mg de proteína.
La presente invención se describe además con referencia a las siguientes figuras, donde
La Figura 1 muestra un cronograma que representa los experimentos de desafío de vacunación con S. suis en cerdos,
La Figura 2 muestra un gráfico que representa los resultados obtenidos con los experimentos de desafío de vacunación de la Figura 1,
La Figura 3 muestra un diagrama de un ensayo bactericida que implica la vacunación con placebo contra rIdeSsuis, y
La Figura 4 representa un diagrama de un ensayo bactericida que implica la vacunación con rIdeSsuis o análogos de rIdeSsuis contra un grupo control.
Además, se adjunta una Lista de Secuencias a esta descripción.
La SEQ ID NO: 1 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína IdeSsuis;
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína recombinante rIdeSsuis sin el péptido señal;
La SEQ ID NO: 3 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica IdeSsuis y
La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica rIdeSsuis.
La SEQ ID NO: 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la parte altamente conservada del dominio Mac-1 de IdeSsuis.
La SEQ ID NO: 6 muestra la secuencia de aminoácidos del análogo de rIdeSsuis rldeSsuis_homólogo.
La SEQ ID NO: 7 muestra la secuencia de aminoácidos del análogo de rIdeSsuis rIdeSsuisB2.
La SEQ ID NO: 8 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica el análogo de rIdeSsuis rldeSsuis_homólogo. La SEQ ID NO: 9 muestra la secuencia de nucleótidos que codifica el análogo de rIdeSsuis rIdeSsuisB2.
La SEQ ID NO: 10 muestra la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 91 a 425 de WP_044671938. La SEQ ID NO: 11 muestra la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 91 a 425 de WP_002935529. La SEQ ID NO: 12 muestra la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 92 a 426 de WP_015647040. La SEQ ID NO: 13 muestra la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 92 a 426 de WP_023370787. La SEQ ID NO: 14 muestra la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 92 a 426 de WP_044678723. Los siguientes ejemplos explicarán la presente invención. Los ejemplos se entenderán únicamente como una modalidad preferida de la invención. No se pretende limitar la presente invención al alcance de los ejemplos dados. Ejemplo 1
El siguiente ejemplo proporciona datos experimentales después de realizar experimentos de desafío de vacunación en lechones infectados por S. suis.
Establecimiento de experimentos de desafío de vacunación en lechones para diferentes serotipos de S. suis (serotipos 2 y 9) y vías de infección (intravenosa e intranasal).
Brevemente, como se muestra en la Figura 1, los lechones a una edad de cinco semanas se vacunaron con una vacuna con rIdeSsuis. A una edad de 7 semanas, estos lechones fueron reforzados con rIdeSsuis y en un grupo también se vacunó con cebado con una bacterina por inyección intramuscular (que se muestra en la tabla de la Figura 1). Un grupo de lechones sólo se vacunó con cebado con una bacterina a la edad de 7 semanas y un último grupo de animales se vacunó dos veces con un placebo que consistía en tampón y adyuvante. Los lechones se desafiaron dos semanas después de las segundas inmunizaciones por vía intranasal. Además, los animales se monitorearon cada ocho horas. Por razones de bienestar animal, se sacrificaron los animales en cualquier caso en el que un lechón presenta fiebre alta en combinación con apatía y anorexia, así como también en el caso de signos clínicos de poliartritis aguda o meningitis grave.
Todos los lechones que sobrevivieron se sacrificaron a los 14 días después de la infección.
El experimento reveló que la inmunización de lechones mediante el uso de la proteína recombinante rIdeSsuis por sí sola es suficiente para proteger a los lechones de las infecciones por serotipo 2 de S. suis (Figura 2).
Ejemplo 2
En este ejemplo, se usó el ensayo bactericida para evaluar la efectividad de una vacuna determinada. Esta prueba implica la determinación de la supervivencia de la bacteria S. suis de un determinado serotipo después de añadir la misma a la sangre de un animal de prueba. Si en la sangre de este animal de prueba hay presentes anticuerpos protectores contra un determinado serotipo, las bacterias se matarán durante un tiempo de incubación de 2 horas de manera eficiente. El grado de protección se designa como "factor de supervivencia" (SF) y es la relación del recuento de colonias después de 120 minutos y el recuento de colonias directamente después de agregar las bacterias a la sangre del animal de prueba. Un factor de supervivencia bajo significa una eliminación efectiva de las bacterias en la sangre y, por lo tanto, una protección efectiva del animal de prueba.
Se realizó la expresión y purificación de IdeSsuis recombinante (SEQ ID NO: 2), IdeSsuisB2 recombinante (SEQ ID NO: 7) y de IdeSsuis_homólogo recombinante (SEQ ID NO: 6) mediante el crecimiento de las cepas apropiadas en caldo LB más ampicilina. Se indujo la expresión de proteínas al añadir IPTG. Se llevó a cabo la purificación de las proteínas recombinantes mediante cromatografía de afinidad con ácido Ni2+-nitrilotriacético en condiciones nativas según lo recomendado por el fabricante (Macherey-Nagel).
Inmunización de lechones: Los lechones se vacunaron de ceba y refuerzo con 1,5 ml de vacuna que contenía 0,25 mg de rIdeSsuis o 0,25 mg de rIdeSsuisB2 o 0,5 mg de rldeSsuis_homólogo que contenía un 20 % [vol/vol] de Emulsigen como adyuvante.
Ensayo 1:
Se distribuyen aleatoriamente dos o cuatro compañeros de camada cada uno en dos grupos de ensayo (n = 9/grupo), grupo 1 control (placebo), grupo 2 inmunizado con rIdeSsuis (SEQ ID NO: 2). Los animales fueron inmunizados y probados de acuerdo con el siguiente esquema de prueba:
1 inmunización 2 inmunización
Figure imgf000010_0001
edad
(semanas)
Figure imgf000010_0002
La Figura 3 muestra los resultados obtenidos.
El grupo control (placebo) mostró un factor de supervivencia mucho más alto que el grupo vacunado. El antígeno recombinante rIdeSsuis (grupo vacunado), que contiene la secuencia completa de proteínas IdeSsuis de la cepa de serotipo 2 (SEQ ID NO: 2), induce anticuerpos que efectúan una eliminación efectiva de S. suis de la cepa 2 así como también de la cepa 9.
Ensayo 2:
Cuatro compañeros de camada se distribuyen al azar en cuatro grupos de ensayo (n = 6/grupo con la excepción del grupo 4, donde n = 5), grupo 1 control (no inmunizado), grupo 2 inmunizado con rldeSsuis_homólogo (SEQ ID NO:

Claims (6)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Una composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos que comprende una cantidad efectiva de al menos un polipéptido seleccionado del grupo de
    (a) una proteína denominada IdeSsuis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, o (b) una proteína denominada rIdeSsuis que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, 6 o 7,
    y
    al menos un portador farmacéutico, un diluyente o un adyuvante.
  2. 2. La composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque rIdeSsuis de (b) comprende una secuencia de aminoácidos que carece de los aminoácidos de la posición 1 a 34 de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
  3. 3. La composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la proteína es el único ingrediente activo o inmunogénico.
  4. 4. La composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 a 3, que contiene una cantidad total de aproximadamente 0,05-2 mg de proteína.
  5. 5. La composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque se proporciona en forma fisiológicamente administrable y es adecuada para la inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea o dérmica o la aplicación en mucosas.
  6. 6. La composición de vacuna para su uso en el tratamiento profiláctico, metafiláctico o terapéutico de una infección por Streptococcus suis en cerdos de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1-5, en donde el tratamiento implica al menos una, preferentemente dos inmunizaciones, opcionalmente
    en donde la dosis total de IdeSsuis o rIdeSsuis administrada por cerdo es de 0,05-2,0 mg.
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