CN118265540A - 产生针对猪链球菌的疫苗的方法以及所述疫苗 - Google Patents
产生针对猪链球菌的疫苗的方法以及所述疫苗 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种产生保护猪免受猪链球菌的病原体感染的疫苗的方法，所述方法包括在大肠杆菌细菌中重组表达IgM蛋白酶抗原，使所述大肠杆菌细菌在至少500巴的压力下经历高压均质化操作以诱导所述大肠杆菌细菌的裂解以及所述IgM蛋白酶抗原释放至裂解物的上清液中，将所述上清液从沉淀分离，并将包含所述IgM蛋白酶抗原的所述上清液与药学上可接受的载体混合以构成所述疫苗。本发明还涉及一种用该方法产生的疫苗。
Description
发明总体领域
本发明总体上涉及一种产生用于保护猪免受猪链球菌细菌的病原体感染的疫苗的方法，所述疫苗是基于在大肠杆菌细菌中重组表达的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原。
发明背景
猪链球菌(S.suis)是猪的传染性细菌性疾病的主要病原体之一。该病原体可引起多种临床综合征，包括脑膜炎、关节炎、心包炎、多发性浆膜炎、败血症、肺炎和猝死。猪链球菌是一种革兰氏阳性兼性厌氧球菌，最初被定义为兰斯菲尔德群R、S、R/S或T。后来，基于位于细胞壁中的类型特异性荚膜多糖抗原提出了一种新的分型系统。这导致了一个包含35种血清型的系统(Rasmussen和Andresen，1998,“16S rDNA sequence variations of someStreptococcus suis serotypes”,Int.J.Syst.Bacteriol.48,1063-1065)，其中血清型1、2、7和9目前最为普遍，尤其是在欧洲。然而，已认识到荚膜血清型是毒力的不良标志。因此，开发了一种替代系统来帮助了解猪链球菌感染的流行病学和血清分型方法的生物学相关性，即所谓的多位点序列分型(MLST)，如King等在Journal of Clinical Microbiology，2002年10月，第3671-3680页(“Development of a Multilocus Sequence Typing Schemefor the pig pathogen Streptococcus suis:Identification ofvirulent clones andpotential capsular serotype exchange”)中所描述的。在该研究中，识别了92种序列类型，其中ST复合体ST1、ST27和ST87(每种都包含多种序列类型)在群体中占主导地位。另参见牛津大学的猪链球菌MLST网站(https://pubmlst.org/ssuis/)(Jolley等，WellcomeOpen Res 2018,3:124(网站由Wellcome Trust资助)，其中提及King等的论文并允许轻松识别任何猪链球菌菌株的序列类型。
控制猪群中的猪链球菌看起来是困难的。猪链球菌是猪的共生的和机会性病原体。显然，免疫系统并不是在每次感染和每个感染的情况下都会被触发。除此之外，猪链球菌是一种封装良好的病原体，且使用一大批毒力因子来逃避宿主免疫系统。这些特征共同对开发对抗这种重要病原体的有效疫苗提出了挑战。几年前发表了一篇概述文章，该文章回顾了现有的和探索性的针对猪链球菌的疫苗(Mariela Segura:“Streptococcus suisvaccines:candidate antigens and progress”,Expert Review of Vaccines，第14卷，2015年，第12期，第1587-1608页)。在这篇综述中，对临床现场信息和实验数据进行了汇编和比较，以概述针对猪链球菌的疫苗开发的状况。
在过去的几年中，已经报道了一大组抗原性或免疫原性猪链球菌分子，其中大多数是通过免疫蛋白组学使用来自受感染的猪或人的恢复期血清和/或实验室产生的免疫血清发现的。WO2015/181356(IDT Biologika GmbH)显示，IgM蛋白酶抗原(全蛋白或仅代表全蛋白的约35％的高度保守的Mac-1结构域)可以通过使用IgM蛋白酶抗原的疫苗接种(任选地与包含菌苗的初疫苗接种组合)在仔猪中引发保护性免疫反应。‘356专利申请中建议，由于IgM蛋白酶抗原在大多数(如果不是全部)猪链球菌血清型(特别是最普遍的血清型1、2、7和9)中高度保守的事实，IgM蛋白酶抗原可用于在猪链球菌血清型之间实现广泛的交叉保护，特别是在血清型1、2、7和9之间。WO2017/005913(Intervacc AB)证实了IgM蛋白酶在各种猪链球菌血清型中高度保守的事实。
在本领域中，IgM蛋白酶抗原是使用Seele等在Journal of Bacteriology第930-940页，2013年3月，第195卷，第5期(“Identification of a Novel Host-Specific IgMProtease in Streptococcus Suis”)中公开的技术产生的。在该技术中，IgM蛋白酶抗原在大肠杆菌细菌中重组表达，并在天然条件下通过Ni2+次氮基三乙酸亲和层析纯化。通过该方式，可以获得高度纯化形式的IgM蛋白酶抗原，但产量相对较低。纯化的抗原可以与药学上可接受的载体混合以构成疫苗以防止猪链球菌的病原体感染。
发明目的
本发明的一个目的是提供一种产生包含IgM蛋白酶抗原的疫苗的替代方法。
发明内容
为了实现本发明的目的，设计了一种如上文“发明总体领域”部分所述的产生疫苗的方法，所述方法包括在大肠杆菌细菌中重组表达猪链球菌的IgM蛋白酶抗原，使大肠杆菌在至少500巴的压力下进行高压均质化操作以诱导大肠杆菌的裂解以及IgM蛋白酶抗原释放至获得的裂解物的上清液中，将上清液从裂解物的沉淀分离并将包含IgM蛋白酶抗原的上清液与药学上可接受的载体混合以构成疫苗。
发现为了获得大量IgM蛋白酶，需要裂解大肠杆菌细胞。显然，细菌不会将IgM蛋白酶抗原释放至上清液中。然而，还发现细胞必须在至少500bar的压力下经历高压均质化操作以确保足够量的抗原实际释放至上清液中，而不是与大肠杆菌细胞的残余物保持结合。将大量抗原释放至上清液中具有重要的优点，即可以通过直接使用该上清液(不包含(大量)细胞碎片)，任选地在过滤、进一步澄清、灭活、浓缩等之后作为抗原的来源而不需要通过柱进行高亲和力纯化，来非常简单地配制疫苗。尽管可以进行此类(或其他)纯化，但发现源自大肠杆菌细菌本身的其他蛋白质和小分子的存在并不是疫苗安全性和有效性的主要问题。因此，当使用本发明所述的方法时，可以省去纯化步骤。
本方法易于实施，带来高产量高且充足的疫苗。本发明还体现在使用该方法获得的包含猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的疫苗。该疫苗与已知疫苗的不同之处在于，大量的大肠杆菌蛋白(特别是多于蛋白总量，即蛋白总重的5％、10％、15％、20％、25％、30％、50％或甚至更大百分比)和其他大肠杆菌化合物(例如多糖)可存在于该疫苗中。
定义
疫苗是适合施用于受试者的组成，其包含免疫有效量(即，能够充分刺激目标受试者的免疫系统以至少减少野生型微生物攻击的负面影响)的一种或多种抗原，通常与药学上可接受的载体组合，在施用于受试者后诱导用于治疗感染的免疫反应，即帮助预防、改善或治愈感染或由该感染引起的任何疾病或病症。
防止微生物的病原体感染与获得保护性免疫相同，即帮助预防、改善或治愈该微生物的病原体感染或由该感染引起的病症，例如预防或减少实际感染或由病原体的病原体感染引起的一种或多种临床症状。
猪链球菌的IgM蛋白酶抗原是特异性降解猪IgM(而不是猪IgG或猪IgA；Seele等，Journal of Bacteriology,2013,195 930-940；和Vaccine33:2207-2212，2015年5月5日)的酶，用IdeSsuis表示的蛋白，或其免疫原性部分(其长度通常为全长酶的至少约30-35％)。整个酶的重量为约100-125kDa，对应于约1000-1150个氨基酸，大小取决于S.suis的血清型。在WO 2015/181356中给出了代表猪链球菌的IgM蛋白酶抗原的几个序列，即SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:5，后者是全长酶的免疫原性部分(表示为Mac-1结构域，即SED ID NO:7的氨基酸80-414)。全长酶的免疫原性部分的其他实例在WO2017/005913中给出。特别地，IgM蛋白酶可以是根据WO2015/1818356的SEQ IDNO:1的蛋白酶或在重叠区域中具有至少70％，特别是75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％直至100％序列同一性的蛋白。氨基酸序列同一性可以通过BLAST程序使用具有默认参数的blastp算法来建立。预期不同血清型的猪链球菌的IgM蛋白酶的序列同一性高于70％，特别是预期为75、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％直至100％。人工蛋白，例如为了优化抗原的重组生产系统中的产量而制造的，相比于全酶可导致较低的氨基酸序列同一性，例如85％、80％、75％、70％或甚至60％，同时保持所需的免疫原性功能，并被理解为本发明意义上的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原。
药学上可接受的载体是生物相容性介质，即在施用后不会在治疗的受试者中诱导显著的不良反应、能够在施用包含载体的组合物后将抗原呈递至受试者的免疫系统的介质。这种药学上可接受的载体可以例如是包含水和/或任何其他生物相容性溶剂的液体或固体载体，例如通常用于获得冻干疫苗(基于糖和/或蛋白)的那些，任选地包含免疫刺激剂(佐剂)。任选地，根据相应疫苗的预期用途或所需特性添加其他物质，例如稳定剂、粘度调节剂、佐剂或其他组分。
上清液是在结晶、沉淀、离心或其他过程之后在固体残余物上方的液体。
沉淀是例如在离心或其他沉积方法之后在液体中的不溶性沉积。
高压均质化是一种机械操作，其中用高压将液体推过狭窄的间隙(通常在微米范围内)，从而在非常短的距离内在液体中产生加速度，并通过这种方式建立高剪切应力，例如以减小颗粒大小或裂解细胞。通常使用的压力为100-2000巴(Dumont等，InternationalJournal of Pharmaceutics 541(2018)117-135)。均质化过程中施加的能量的量越高，颗粒大小越小或细胞裂解越完全。
微流化是高压均质化的一种形式，其工作原理是使液体通过微通道进入相互作用室以产生两股细小的射流，这些射流在通常高达2000巴的高压下以直角彼此相对。当两个微流碰撞时，由于碰撞时发生的湍流、空化和剪切效应，会出现突然的压力下降和均质化。增加通过微流化器的次数可以改善均质化，但通过次数超过3次则收效甚微。用于微流化的装置可获自MicrofluidicsTM,Westwood,MA,USA。
弗氏压力细胞压碎器(也称为“弗氏压碎器”)是生物实验中使用的一种设备，其通过在高压下使细胞通过狭窄的阀门来破坏细胞的质膜。其能够破坏细胞壁，同时保持细胞核不受破坏。弗氏压碎器是由华盛顿卡内基研究所(Carnegie Institution ofWashington)的Charles Stacy发明的。该压碎器使用外部液压泵来驱动包含液体样品的较大气缸内的活塞。然后将高压样品挤压通过针阀。当样品通过阀门时，流体会经历剪切应力和减压，导致细胞破裂。
猪链球菌的全IgM蛋白酶抗原是包含至少Mac-1结构域、与结构功能关联的区域、CNV区域和任选的细胞粘附区域的抗原(关于猪链球菌基因组中这些区域的识别，请参见实施例1)。这可以被视为全IgM蛋白酶抗原，因为信号肽被认为无论如何在天然存在的(即野生型)分泌酶中是缺失的，并且细胞粘附区不被认为对其作为蛋白酶的功能是必需的。
发明的其他实施方式
在本发明所述方法的第一进一步实施方式中，高压均质化操作期间的压力为至少1000巴。这样，更多的IgM蛋白酶抗原被释放至上清液中。优选地，高压均质化操作期间的压力为至少1300巴，例如1400、1500、1600、1700、1800、1900或甚至至少2000巴。
在根据本发明所述方法的另一实施方式中，用于进行高压均质化操作的装置是弗氏压力细胞压碎器或微流化装置。发现这些装置特别适合于执行根据本发明的方法。优选地，使用微流化装置。
在根据本发明所述方法的另一实施方式中，IgM蛋白酶抗原是全IgM蛋白酶抗原。发现至少包含Mac-1结构域、与结构功能关联的区、CNV区域和任选的细胞粘附区域(关于猪链球菌基因组中这些区域的识别，请参见实施例1)的这种类型的抗原可被高水平表达，易于释放至上清液中，且非常适合作为疫苗抗原。优选地，全IgM蛋白酶抗原是血清型1、2或7的猪链球菌细菌的。虽然抗原的重组表达本身不依赖于血清型，但发现这三种血清型的抗原在猪链球菌的各种血清型中提供了足够的保护。为此，我们参考了2021年8月3日以Intervet International BV名义作为优先权申请向欧洲专利局提交的名称为“一种防止各种血清型的猪链球菌的疫苗(A vaccine for protection against Streptococcussuis of various serotypes)”的欧洲专利申请EP21189283.1。
现将使用以下具体实施例进一步解释本发明。
实施例
实施例1：猪链球菌的基因组的结构分析。
实施例2：包含全IgM蛋白酶抗原的疫苗的产生。
实施例3：疫苗的保护性作用。
实施例1
在本实施例中，提供了猪链球菌的基因组(即编码IgM蛋白酶的部分)的分析，以显示基因组的该部分是如何构成的。为此，我们使用血清型2细菌的猪链球菌的基因组，如从WO 2015/181356中已知的，在该专利申请中公布为SEQ ID NO:1。该序列再次作为SEQ IDNO:1包含在本专利的序列表中。使用Needleman-Wunsch比对的序列相似性检索(参见Needleman等1970，Laskowski等1997，Apweiler等2000；默认设置)加之蛋白注释(PDBSum和InterPro)，揭示了IgM蛋白酶基因组的结构，其中5个区域可被识别：
区域1(Met 1–Thr 34)：来自位置1的信号序列；
区域2(Val 35–Glu 426)：具有预测的水解酶活性的Mac-1结构域；
区域3(Thr 427–Pro 687)：与结构功能(例如涉及正确折叠)和底物结合关联的区域。
区域4(Thr 688–Ser 919)：由4个重复序列组成的区域(1*{Thr 688–Ser 744}、2*{Thr 745–Ser 801}、3*{Thr 802–Ser 858}、4*{Thr 859–Ser 919})，其与具有水解酶活性的已知蛋白序列具有相似性；这就是所谓的CNV区域(拷贝数变异区域)，基因组的各个部分在其中重复。
区域5(Thr 920–Lys 1141)：包含预测的跨膜区域，指示细胞壁锚定功能(细胞粘附区域)。
其他血清型的猪链球菌细菌的结构基本相同，最显著的区别是CNV区域中重复序列数。
实施例2
在本实施例中，显示了一种用于产生包含IgM蛋白酶抗原的疫苗的方法。用BL21-AI(DE3)质粒，使用Seele等(2013年；参见上文)中描述的方法，将血清型2和血清型7的猪链球菌菌株的全IgM蛋白酶基因克隆到大肠杆菌(E.coli)中。使用阿拉伯糖与乳糖的组合作为诱导剂。
在包含乳糖、葡萄糖、甘油、酵母提取物、酵母酸盐、NaCl、KH2PO4和Na2HPO4 x 2H2O的无动物组分的培养基中培养大肠杆菌细胞。首先在摇瓶中进行预培养，在37℃下轻轻摇动，使细胞生长到指数生长期的中期。接下来，使用相同的培养基将细胞以1％的接种比率接种到15L培养规模的实验室规模发酵罐中。使用4M NaOH和4M乙酸溶液将pH控制在7.0。使用搅拌器速度、气流和纯氧的级联控制将溶解氧(pO2)控制在50％。温度控制在37℃。一旦培养基中的葡萄糖耗尽(使用CEDEX分析仪确定)，就添加阿拉伯糖作为诱导剂。再继续培养3小时以获得足够的IgM蛋白酶蛋白浓度。
此后，从培养物中收集大肠杆菌细胞，并冷保存，不浓缩在培养基中或0.04M PBS缓冲液中，或者使用离心浓缩至多4倍。此后使用微流化器装置(Microfluidics)在30.000PSI(2068巴)或弗氏压碎均质器(范围为600-2000巴)破碎细胞。最后，将细胞破碎后的全组分离心，分离上清液和沉淀，并使用BPL(β丙内酯)灭活。使用SDS凝胶用已知的BSA系列作为参考来测定蛋白产量。IgM蛋白酶没有进一步纯化。
为了研究细胞破碎过程中压力的影响，进行了多项实验，其中在不同压力下在微流化床或弗氏压碎器中破碎大肠杆菌细胞(血清型2)。表1显示细胞破碎时施加的压力与细胞破碎后离心后上清液中IgM蛋白酶蛋白的回收率之间的关系。回收率的计算方法是将细胞破碎和离心后上清液中的IgM蛋白酶蛋白浓度除以细胞破碎后但离心前(即全组分)的IgM蛋白酶蛋白浓度乘以100％。没有发现设备类型有显著影响，只发现施加的压力有显著影响。
表1上清液中IgM蛋白酶抗原的回收率
| 压力(巴) | 回收率(％) |
| 100 | 5％* |
| 600 | 30％ |
| 1300 | 60％ |
| 2000 | 100％ |
*通过外推法确定
实施例3
在本实施例3中，显示了使用如用实施例2的方法提供的抗原产生的疫苗的保护性作用。
研究设计
通过将根据实施例2获得的上清液与可获自MSD Animal Health的(水包油)佐剂X-Solve混合来配制疫苗，以在相同量的油佐剂的情况下达到第一疫苗35μg IgM蛋白酶/ml和第二疫苗3.5μg IgM蛋白酶/ml的浓度。在这项研究中，使用了三十只三周大的仔猪。这些仔猪被分配到三组(不同的窝均匀分布在各组中)，每组10只仔猪。第1组和第2组在3周龄和5周龄时分别用不同的疫苗进行了两次肌内疫苗接种。第1组每次疫苗接种2ml的第一疫苗(即每次疫苗接种70μg抗原)，第2组每次疫苗接种2ml的第二疫苗(即每剂7μg IgM蛋白酶抗原)。第3组留为未接种疫苗的攻击对照。7周龄时，仔猪被运送到攻击室并立即进行攻击。在运输和模拟自然压力的攻击之间没有适应期。攻击后，每天观察猪的猪链球菌感染临床症状(例如抑郁、运动问题和/或神经症状)，并使用常规评分系统(从0(无症状)到3的严重病例)进行评分。严重受影响的动物被安乐死并进行尸检。研究结束时(攻击后11天)，所有幸存的猪均被安乐死并进行尸检。就在疫苗接种和攻击之前，收集血清血用于抗体测定。在攻击肝素之前和之后定期收集血液以重新分离攻击菌株。
结果
这些疫苗均未引起任何不可接受的部位或全身反应，因此可以被认为是安全的。在疫苗接种当天(3周龄)，大多数猪的母源抗体滴度低或中等。疫苗接种后，所有疫苗组均显示出抗体反应(数据未显示)。攻击后不同参数的结果示于下表2中(存活时间以天为单位)。
表2攻击后数据
结论
结果证明，在第二次疫苗接种2周后，疫苗在仔猪中诱导了针对病原体猪链球菌的攻击的保护。低至7μg的疫苗剂量就能提供足够的保护。
Claims (9)
1.一种产生保护猪免受猪链球菌的病原体感染的疫苗的方法，所述方法包括：
-在大肠杆菌细菌中重组表达猪链球菌IgM蛋白酶抗原；
-使所述大肠杆菌细菌在至少500巴的压力下经历高压均质化操作以诱导所述大肠杆菌细菌的裂解以及所述IgM蛋白酶抗原释放至裂解物的上清液中；
-将所述上清液从所述裂解物的沉淀分离；
-将包含所述IgM蛋白酶抗原的所述上清液与药学上可接受的载体混合以构成所述疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述高压均质化操作期间的压力为至少1000巴。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于所述高压均质化操作期间的压力为至少1300巴。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于所述高压均质化操作期间的压力为至少2000巴。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于用于执行所述高压均质化操作的装置是弗氏压力细胞压碎器或微流化装置。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于所述IgM蛋白酶抗原是全IgM蛋白酶抗原。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述全IgM蛋白酶抗原是血清型1、2或7的猪链球菌细菌的。
8.一种疫苗，其包含使用根据权利要求1至7中任一项所述的方法获得的猪链球菌的IgM蛋白酶抗原。
9.根据权利要求8所述的疫苗，其特征在于所述疫苗相对于所述IgM蛋白酶抗原包含至少5％的天然大肠杆菌蛋白。
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