CN111328289A - 预防生殖、育龄和生长猪的疾病的猪链球菌疫苗及其制备和使用方法 - Google Patents

预防生殖、育龄和生长猪的疾病的猪链球菌疫苗及其制备和使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111328289A
CN111328289A CN201880066134.XA CN201880066134A CN111328289A CN 111328289 A CN111328289 A CN 111328289A CN 201880066134 A CN201880066134 A CN 201880066134A CN 111328289 A CN111328289 A CN 111328289A
Authority
CN
China
Prior art keywords
vaccine
streptococcus suis
reproductive
animal
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880066134.XA
Other languages
English (en)
Inventor
P·劳伦斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc
Original Assignee
Merial Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Merial Inc filed Critical Merial Inc
Publication of CN111328289A publication Critical patent/CN111328289A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/09—Lactobacillales, e.g. aerococcus, enterococcus, lactobacillus, lactococcus, streptococcus
    • A61K39/092—Streptococcus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B50/00—ICT programming tools or database systems specially adapted for bioinformatics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了在动物猪链球菌(S.suis)中引起免疫应答的猪链球菌菌株、包含所述菌株的组合物、针对猪链球菌的疫苗接种方法以及与这类方法和组合物一起使用的试剂盒。本发明进一步提供了基于全基因组测序和生物信息学的全面、明确的荚膜分型方法。即使菌株具有新型荚膜基因座时，这种荚膜分型方法也能够准确鉴定血清型，并且能够在配制疫苗(包括猪群特异性疫苗)时用于确定要包括的菌株。

Description

预防生殖、育龄和生长猪的疾病的猪链球菌疫苗及其制备和 使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月31日提交的美国临时申请号62/552975的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
通过引用并入
任何前述申请以及其中或在其审查进程期间引用的所有文件(“申请引用的文件”)和在所述申请引用的文件中引用或参考的所有文件，以及本文引用或参考的所有文件(“本文引用的文件”)，以及在本文引用的文件中引用或参考的所有文件，连同本文或在通过引用并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规范和产品表在此通过引用并入本文，并可在本发明的实践中采用。在本申请中对任何此类文件的引用或鉴定并不承认此类文件可用作本发明的现有技术，并且不反映对此类引用的专利文件的有效性、专利性和/或可实施性的任何观点。通过GenBank登录号在本文中引用的所有序列均通过引用整体并入本文，并且所述序列如在本申请提交日的GenBank中所示。
技术领域
本发明一般性涉及细菌疫苗，特别是那些为猪科动物提供安全且有效预防以针对由新鉴定的猪链球菌(Streptococcus suis)菌株引起的生殖、育龄和生长猪的疾病的细菌疫苗。本发明进一步涉及产生细菌的方法，以及鉴定与新型荚膜结构、cbpD基因以及可以赋予这些菌株独特的定植阴道的能力并提供针对其他菌株的竞争优势的替代分泌途径有关的核酸变异。因此，本发明涉及包含本发明所述的细菌(例如，活的、减毒的或杀死的细菌)的免疫原性或疫苗组合物。本发明进一步涉及用于制备和/或配制此类组合物的方法。本发明进一步涉及基于全基因组测序和生物信息学的全面、明确的荚膜分型方法。甚至是当菌株具有新型荚膜基因座时，这种荚膜分型方法也能够准确鉴定血清型，并且能够在配制疫苗(包括猪群(herd)特异性疫苗)时用于确定要包括的菌株。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质副本提供，并且在此通过引用并入本说明书。包含所述序列表的文本文件的名称是MER 17-323ST25.txt。该文本文件大小为1565KB；创建于2018年8月30日；并且在递交说明书的同时通过EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
猪链球菌是主要定植于猪的革兰氏阳性球菌。虽然成年猪作为无症状携带者，但它能够引起仔猪的致命性脑膜炎、败血症关节炎和支气管肺炎。成年猪通常在其扁桃体隐窝和上呼吸道中携带猪链球菌(S.suis)作为共生体，但也已从胃肠道和生殖道中分离出细菌。几乎所有的成年猪都作为猪链球菌的储库，这种病原体影响着全世界的养猪业。
猪链球菌也能在受感染的母猪中引起流产(Givens MD,Marley MS:Infectiouscauses of embryonic and fetal mortality.Theriogenology,2008,70:270-285)。基于凝集试验，迄今已鉴定出35种不同的猪链球菌血清型(Higgins R,Gottschalk M,BoudreauM,Lebrun A,Henrichsen J:Description of six new capsular types(29-34)ofStreptococcus suis.J Vet Diagn Invest.,1995,7:405-406)；但是，最近的工作表明，有六种原始血清型是新的种(Hill JE等人:Biochemical analysis,cpn60 and 16S rDNAsequence data indicate that Streptococcus suis serotypes 32and 34,isolatedfrom pigs,are Streptococcus orisratti.Vet Microbiol.,2005,107:63-69；Tien LHT等人:Reappraisal of the taxonomy of Streptococcus suis serotypes 20,22,26,and33based on DNA-DNA homology and sodA and recN phylogenies.Vet Microbiol.,2013,162:842-849)。猪链球菌是母猪生殖道的常住菌。但是，它也是一种机会致病菌，偶尔会从表现出阴道分泌物和子宫内膜炎症状的母猪中分离出来(TorremorrellM.Bacterial,rickettsial,protozoal,and fungal causes of infertility andabortion in swine:In Youngquist RS,Threlfall WR,编辑.Current therapy in largeanimal theriogenology.第2版,St.Louis:Elsevier；2007,794-801)。
对链球菌感染的第一次描述是由奥地利外科医生Theodor Billroth于1874年完成的(Billroth,1874；Billroth,1877)。Friedrich Julius Rosenbach于1884年对链球菌属(Streptococcus)的名称进行了进一步改进，他检查了从化脓性病变中分离出的细菌，并开始对种进行命名(Evans，1936)。Hugo Schottmuller在1903年引入血琼脂平板是将区分链球菌(streptococci)向前推进的重要一步(Schottmuller,1903；Becker,1916)。1933年，Lancefield使用各种链球菌之间的表面抗原差异，将它们进一步细分为由字母A到X指定的组(
Figure BDA0002445347490000031
2008)。来自人类疾病的菌株分为A组；来自牛和乳制品来源的菌株分为B组；来自各种动物来源的菌株分为C组；等等。为了进行流行病学研究，伦敦的Fred Griffith于1934年引入了通过载玻片凝集法确定T抗原的方法(Griffith，1934)(Kohler，1974)。
Figure BDA0002445347490000032
的“present state of species within the genus Streptococcus andEnterococcus”(
Figure BDA0002445347490000033
2007)的最新描述，以及Richards等人的“phylogenomicanalysis of genome evolution in the genus Streptococcus”(Richards等人，2014)提供了链球菌属的重要新概述。完整的引文可以在www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK333430上找到。
关于链球菌的动物菌株，在分类方面的进展要小得多。根据荚膜多糖的抗原差异，有35种已知的猪链球菌血清型。一些研究人员认为只有29种独特的血清型，不包括20、22、26、33、32和34号(图7)。血清型2(ST2)在北美和欧洲最为普遍，其次是血清型3和1/2。
上述两种已知的鉴定方法各自仅鉴定35种已知种的一部分(图6)。因此，在畜牧业中长期以来都希望获得更全面的血清分型。本文所述的新衍生的方法满足了这一需求。
全细胞和许多猪链球菌蛋白已经作为潜在的疫苗候选物进行了研究。用野生型菌苗进行的免疫完全保护免受同源血清型的攻击，而未包封在荚膜内的突变体则未能提供保护(Wisselink等人，2002)。在Li等人进行的一项研究中，重组SAO(猪链球菌表面蛋白)与Quil A的结合可预防猪的猪链球菌血清型2的疾病。用SAO进行肌内免疫引起显著的体液抗体应答，但主要是IgG2。重组SAO免疫也诱导了调理吞噬抗体(Li,Yuanyi等人，“Immunization with Recombinant Sao Protein Confers Protection againstStreptococcus Suis Infection.”Clinical and Vaccine Immunology,AmericanSociety for Microbiology,2007年8月1日,cvi.asm.org/content/14/8/937)。用来自猪链球菌菌株P1/7(血清型2)的经纯化的猪溶素(suilysin)对仔猪进行免疫，中和抗体滴度增加，这表明SLY可能起保护性抗原的作用(Jacobs,A.A.C等人，“Protection ofExperimentally Infected Pigs by Suilysin,the Thiol-Activated Haemolysin ofStreptococcus Suis.”Veterinary Record,British Medical Journal PublishingGroup,1996年9月7日,veterinaryrecord.bmj.com/content/139/10/225)。但是，这些实验都没有使用异源血清型来攻击接种了这些抗原的猪。在Baums等人的一项研究中，猪链球菌血清型2菌苗诱导了针对同源攻击的保护性免疫。相比之下，尽管MAP免疫导致了针对MRP和SAO的高血清IgG2滴度，但MAP亚单位疫苗的保护效力低。重要的是，用菌苗而不是用MAP进行免疫诱导针对血清型2菌株的调理抗体滴度，并且发现这些抗体滴度与保护作用相关。但是，在用未包封在荚膜内的等基因突变体吸收后，来自经菌苗免疫的仔猪的血清未能促进中性粒细胞的杀伤，这表明针对荚膜的抗体可能不是调理吞噬作用所必需的(Baums,Christoph Georg等人，“Streptococcus Suis Bacterin and Subunit VaccineImmunogenicities and Protective Efficacies against Serotypes2and 9.”Clinicaland Vaccine Immunology,American Society for Microbiology,2009年2月1日,cvi.asm.org/content/16/2/200)。此外，在接受菌苗的组或接受MAP疫苗的组中未检测到针对血清型9的调理抗体的诱导，导致针对血清型9菌株的低保护。
缺乏针对猪链球菌的生殖、育龄和生长猪的疾病的有效疫苗是现代家猪生产中的新问题。
发明概述
因此，本公开内容的主要目的是针对生殖、育龄和生长猪的疾病提供一种安全且有效的猪链球菌疫苗。
本发明进一步提供了用于诱导针对猪链球菌的生殖、育龄或生长猪/家猪的疾病的免疫(或免疫原性)或保护性应答的方法。本发明的一个目的是提供疫苗以及通过已被鉴定为堕胎剂的猪链球菌新菌株治疗和预防生殖、育龄和生长猪的疾病的方法。
本发明进一步涉及猪链球菌新菌株的免疫原性区域，其提供针对生殖疾病的安全且有效的保护性免疫。相对于亲本猪链球菌菌株，所述菌株可具有一种或多种荚膜变体，其存在与独特的定植阴道的能力相关，并提供针对其他菌株的竞争优势。
因此，本发明涉及包含本发明所述的细菌(例如，活的、减毒的或杀死的细菌)的免疫原性或疫苗组合物。
在一个特定的实施方案中，所述新发现的菌株具有高度不同的血清型，与血清型27和12有些类似(图3)。
根据一个特定的实施方案，所述菌株可以具有“基因的替代形式”，相对于其亲本猪链球菌菌株，其在本文被定义为“等位基因”。在一个实施方案中，所述替代等位基因负责降低毒力。
根据另一方面，本发明涉及通过充当宿主细胞粘附蛋白而有助于与这些菌株相关的病理的两种操纵子。第一种操纵子是替代分泌操纵子，第二种操纵子是一组参与磷酸胆碱代谢的荚膜基因。
根据另一方面，所述新鉴定的菌株具有裂解性胆碱结合蛋白D同源物(cbpD)。这种蛋白质在具有活性输出系统(competent export system)的菌株中的功能不同。
因此，本发明进一步涉及用于制备和/或配制此类组合物的方法；例如，在合适的培养基上或在合适的培养基中培养或生长或繁殖所述细菌，收获所述细菌，可选地杀死、灭活或减毒所述细菌，以及可选地将所述细菌与合适的兽医学上或药学上可接受的承载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂。因此，本发明还涉及所述细菌在配制此类组合物中的用途。
还公开了用于预防或治疗猪链球菌的生殖、育龄和生长猪/家猪的疾病或由猪链球菌引起的生殖、育龄和生长猪/家猪的一种或多种疾病状态的方法，其包括施用所述细菌(其能够是活的、杀死的、减毒的或灭活的细菌)或其免疫原性区域；或包含所述活的、杀死的、减毒的或灭活的细菌或所述细菌的免疫原性区域的组合物给有此需要的动物。
本发明的另一个目的是提供基于全基因组测序和生物信息学的全面、明确的荚膜分型方法，甚至是当菌株具有新型荚膜基因座时，也能够准确鉴定血清型。
本发明的另一个目的是使用这种荚膜分型方法来确定配制疫苗(包括猪群特异性疫苗)时要包括的菌株。
在一个实施方案中，所述疫苗还包含佐剂。与单独的疫苗相比，所述佐剂可以是任何提高和/或增加所引发的免疫应答的物质。粘膜佐剂(包括壳聚糖及其衍生物)对于所公开的口服疫苗特别有用。
在进一步的实施方案中，本发明包括使用这种荚膜分型方法来确定配制疫苗(包括猪群特异性疫苗)时要包括的菌株。本发明的另一个目的是提供试剂盒，其包含至少新鉴定的猪链球菌菌株的活的、杀死的、减毒的或灭活的细菌或所述细菌的免疫原性区域，以及用于预防或治疗生殖、育龄和生长猪/家猪的疾病的使用说明书。
本发明的另一个目的是提供用于对猪链球菌新菌株进行宏基因组学分析的试剂盒。
本发明的另一个目的是提供用于制备针对宏基因组学分析中发现的任何血清型的疫苗的试剂盒。
从以下详述公开了这些和其他实施方案或从以下详述中这些和其他实施方案显而易见并涵盖在以下详述中。
附图简要说明
在本说明书的其余部分中，包括参考附图，对本领域普通技术人员更详细地阐述了本发明的完整且可行的公开内容，包括其最佳模式，其中：
图1显示了阴道拭子分离株和来自YS-149(新型Cps基因座菌株)和血清型12参考菌株的Cps操纵子之间的荚膜操纵子比较。
图2显示了宏基因组学分析-阴道拭子的代表性门水平结果；2a是在正常母猪中，2b是在有阴道分泌物的流产母猪中。
图3显示了用于比较分析的不同血清型27菌株的基于图谱的血清分型结果。
图4显示了如何基于全基因组测序来推断简单的血清型3基因座。蓝色实线显示血清型3特有且类似于血清型3的区域。
图5显示了如何基于全基因组测序来推断复杂的镶嵌荚膜结构和CPS基因座。荚膜区域在血清型1、2、1/2和14之间共享。推断正确的荚膜有助于交叉保护。
图6显示了野外分离株的常规血清分型技术(PCR，凝集)与全基因组测序之间的差异。
图7显示了来自美国各地的野外样品的猪链球菌血清型的分布(使用NPL数据库)。
发明详述
本发明提供了涉及鉴定猪链球菌的核苷酸序列和基因、由所述核苷酸序列编码的产物(例如，蛋白质、抗原、免疫原、表位)、产生这种核苷酸序列的方法、产物、微生物及其用途，例如，用于制备疫苗或免疫原性组合物或用于引发免疫学的或免疫应答，或作为载体，例如，作为表达载体(例如，体外或体内表达载体)。
特别地，本发明包括猪链球菌新菌株和包含它们的疫苗，其在动物中引发免疫原性应答，特别是在猪科动物中引发、诱导或刺激应答的猪链球菌菌株。本发明的方案保护动物免受猪链球菌的侵害和/或预防疾病在受感染的动物中进展。
在一个实施方案中，所述菌株包含与SEQ ID NO所示的序列具有至少70％、至少80％或至少90％同一性的核酸序列，所述SEQ ID NO包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示的核苷酸；或具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32中所示的序列的多肽的保守变体(或至少70％、至少80％或至少90％同一性)；或其组合。
在一个实施方案中，所述菌株包含与SEQ ID NO：3、7和11或其组合所示的核苷酸具有至少70％、至少80％或至少90％同一性的核酸序列。在另一个实施方案中，所述猪链球菌菌株包含编码具有与SEQ ID NO：4、8、12或其组合所示的序列的保守变体(或至少70％、至少80％或至少90％同一性)的肽的核酸。
在另一方面，将所述新型猪链球菌菌株配制成针对猪链球菌和由猪链球菌引起的感染/疾病的安全、有效的疫苗。
在一个实施方案中，所述猪链球菌疫苗还包含佐剂。在一个特定的实施方案中，所述佐剂为粘膜佐剂，例如，壳聚糖、甲基化壳聚糖、三甲基化壳聚糖或其衍生物或组合。
在一个实施方案中，所述佐剂包括完整细菌和/或病毒，包括副猪嗜血菌(H.parasuis)、梭菌属(clostridium)、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒(PCV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、Mannhemia、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、Histophious、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)或其组合和/或变体。在几个实施方案中，所述佐剂增加了动物的IgM、IgG、IgA和/或其组合的产生。
“抗原”或“免疫原”或“免疫原性区域”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。所述抗原可以包括被杀死的或活的完整的生物体；生物体的部分或亚单位；包含具有免疫原性的插入物的重组载体；呈递给宿主动物时能够诱导免疫应答的一片或一段DNA；多肽、表位、半抗原或其任何组合。或者，所述免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
术语“蛋白质”、“肽”、“多肽”和“多肽片段”在本文可互换使用，是指任何长度的氨基酸残基的聚合物。所述聚合物能够是线性或有分支的，它可以包含经修饰的氨基酸或氨基酸类似物，并且它可以被氨基酸以外的化学部分打断。该术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或生物活性组分的缀合。
如本文所使用的术语“免疫原性或抗原多肽”包括免疫活性多肽，其意义在于一旦施用给所述宿主后，它能够引起针对该蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，所述蛋白质片段使得其具有与总蛋白质基本相同的免疫学活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含或基本上由至少一种表位或抗原决定簇组成。如本文所使用的“免疫原性”蛋白质或多肽包括该蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指包含一个或多个表位并因此引发上面所描述的免疫应答的蛋白质片段。可以使用本领域众所周知的许多表位作图技术来鉴定此类片段。参见例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,编辑,1996)。例如，线性表位可以通过例如在固体支持物上同时合成大量肽，所述肽与所述蛋白质分子部分相对应以及在所述肽仍附着在所述支持物上时使所述肽与抗体反应来确定。这样的技术是本领域已知的，并且在例如美国专利号4708871；Geysen等人,1984；Geysen等人,1986中描述。类似地，通过确定氨基酸的空间构象(例如，通过X射线晶体学和二维核磁共振)很容易鉴定构象表位。参见，例如，上述Epitope Mapping Protocols。在PCT/US2004/022605中充分描述了特别适用于小泰勒虫(T.parva)的蛋白质的方法，该专利通过引用整体并入本文。
如本文所使用的术语“野外株”包括在发现母猪和生长猪的任何地区(例如，在农场环境中或在野生环境中)中采集的样品。
如本文所讨论，本发明涵盖所述抗原多肽的活性片段和变体。因此，术语“免疫原性或抗原多肽”进一步考虑了序列的缺失、添加和置换，只要多肽起到产生如本文所定义的免疫应答的作用。术语“保守变异”表示氨基酸残基被另一种生物学上类似的残基替代，或核酸序列中核苷酸的替代，使得所编码的氨基酸残基不变或是另一种生物学上类似的残基。在这方面，特别优选的置换一般本质上是保守的，即发生在氨基酸家族内的那些置换。例如，氨基酸一般分为四个家族：(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性--赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性--丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；以及(4)不带电荷的极性--甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的例子包括用一种疏水残基(例如，异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸)置换另一种疏水残基，或用一个极性残基置换另一种极性残基(例如，精氨酸置换赖氨酸、谷氨酸置换天冬氨酸或谷氨酰胺置换天冬酰胺等)；或用结构上相关的不会对生物活性产生重大影响的氨基酸进行类似的氨基酸保守替代。因此，具有与参考分子基本相同的氨基酸序列但具有基本不影响该蛋白质的免疫原性的少数氨基酸置换的蛋白质在参考多肽的定义之内。通过这些修饰产生的所有多肽都包括在本文中。术语“保守变异”还包括使用置换的氨基酸代替未置换的亲本氨基酸，前提是针对该置换的多肽产生的抗体也与该未置换的多肽发生免疫反应。
术语“表位”是指抗原或半抗原上的特定B细胞和/或T细胞对其应答的位点。该术语也与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。可以在简单的免疫测定法中鉴定出识别相同表位的抗体，其显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。
对组合物或疫苗的“免疫应答”是在所述宿主中对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答的进展。通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种效应：抗体、B细胞、辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生，其特异性针对所述感兴趣的组合物或疫苗中包含的一种或多种抗原。优选地，所述宿主将表现出治疗或保护性免疫应答，从而将增强对新感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重性。这种保护将通过被感染宿主通常表现出的症状和/或临床疾病征象减轻或缺乏、恢复时间更快和/或所述被感染宿主病毒滴度降低来得到证明。
可以通过向动物施用活的、杀死的、减毒的或灭活的细菌或施用其免疫原性区域，或包含活的、杀死的、减毒的或灭活的细菌或细菌的免疫原性区域的组合物来产生针对猪链球菌的生殖、育龄和生长猪的疾病的免疫应答。
“动物”是指哺乳动物、鸟类等。本文所使用的动物或宿主包括哺乳动物和人类。所述动物可以选自由下列各项组成的组：马科动物(例如，马)、犬科动物(例如，狗、狼、狐狸、丛林狼、豺)、猫科动物(例如，狮子、老虎、家猫、野猫、其他大型猫和其他猫科动物(包括猎豹和猞猁))、绵羊属动物(例如，绵羊)、牛科动物(例如，牛)、猪科动物(例如，猪、家猪)、禽类动物(例如，鸡、鸭、鹅、火鸡、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦、驼鸟、鸸鹋以及食火鸡)、灵长类动物(例如，原猴、跗猴、猴子、长臂猿、猿)、雪貂、海豹和鱼。术语“动物”还包括处于所有发育阶段的个体动物，包括新生、胚胎和胎儿阶段。
除非另有解释，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另外明确指出，否则单数术语“a”、“an”和“the”包括复数的所指对象。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。
注意，在本公开内容中，特别是在权利要求和/或段落中，诸如“包含”(“comprises”、“comprised”、“comprising”)等术语可以具有在美国专利法中赋予它的含义；例如，它们可以表示“包括”(“includes”、“included”、“including”)等；并且诸如“基本上由......组成”(“consisting essentially of”和“consists essentially of”)的术语具有在美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确叙述的元素，但排除了在现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的元素。
组合物
本发明涉及猪链球菌疫苗或组合物，其可包含猪链球菌菌株和药学上或兽医学上可接受的承载体、赋形剂或媒介物，其在动物中引发、诱导或刺激应答。
术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性或分支的、单链或双链的RNA或DNA或其杂交体。该术语还涵盖RNA/DNA杂交体。以下是多核苷酸的非限制性示例：基因或基因片段、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、经分离的任何DNA序列、经分离的任何RNA序列、核酸探针和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，例如，甲基化核苷酸和核苷酸类似物、uracyl、其他糖和连接基团(例如，氟核糖(fluororibose)和硫醇盐，以及核苷酸分支)。可以在聚合后进一步修饰核苷酸序列，例如，通过用标记组分缀合。该定义中包括的其他类型的修饰是帽，用类似物置换一种或多种天然存在的核苷酸，以及引入用于将所述多核苷酸连接到蛋白质、金属离子、标记组分、其他多核苷酸或固体支持物的方法。所述多核苷酸能够通过化学合成获得或衍生自微生物。
术语“基因”广泛地用于指与生物学功能相关的任何多核苷酸片段。因此，基因包括如基因组序列中的内含子和外显子，或仅包括如cDNA中的编码序列和/或它们表达所需的调控序列。例如，基因还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，并且其包括调控序列。“基因”还应包括编码和非编码序列(即上游和下游调控序列、启动子、5'/3'UTR、内含子和外显子)。在仅提及基因的编码序列的情况下，术语“基因的编码序列”或“CDS”将在本公开内容中互换使用。
“分离的”生物组分(例如，核酸或蛋白质或细胞器)是指已经与天然存在该组分的生物体的细胞中的其他生物组分(例如，其他染色体和染色体外的DNA和RNA、蛋白质和细胞器)基本上分离或纯化的组分。已被“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白质。
术语“保守变异”表示氨基酸残基被另一种生物学上类似的残基替代，或核酸序列中核苷酸的替代，使得所编码的氨基酸残基不变或是另一种生物学上类似的残基。在这方面，如上面所描述的，特别优选的置换一般本质上是保守的。
术语“重组(的)”是指具有半合成或合成来源的多核苷酸，其不是天然存在的，或者以自然界中未发现的排列方式与另一多核苷酸连接。
“异源”是指从遗传上不同的实体中衍生出来，其不同于与之比较的该实体的其余部分。例如，可以通过基因工程技术将多核苷酸置于衍生自不同来源的质粒或载体中，该多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中取出并不同于该天然序列的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。
本发明所述的多核苷酸可包含附加序列，例如，相同转录单元内的附加编码序列、控制元件例如启动子、核糖体结合位点、5'UTR、3'UTR、转录终止子、聚腺苷酸化位点、在相同或不同启动子控制下的附加转录单元、允许克隆、表达、同源重组和宿主细胞转化的序列以及为提供本发明的实施方案可能需要的任何此类构建体。
使用方法和制品
本发明包括以下方法实施方案。在一个实施方案中，公开了一种给动物接种疫苗的方法，该方法包括向动物施用包含猪链球菌菌株和药学上或兽医学上可接受的承载体、赋形剂或媒介物的组合物。在该实施方案的一方面，所述动物为猪科动物。
在本发明的一个实施方案中，可以采用初免-加强方案，其包括使用至少一种常见的多肽、抗原、表位或免疫原的至少一次初免施用和至少一次加强施用。通常，初免施用中使用的免疫组合物或疫苗与用作加强剂的免疫组合物或疫苗本质不同。但是，应注意相同的组合物可以用作所述初免施用和所述加强施用。这种施用方案称为“初免-加强”。
初免-加强方案包括使用至少一种常见多肽和/或其变体或片段的至少一次初免施用和至少一次加强施用。初免施用中使用的疫苗本质上可能与后来用作加强疫苗的这些疫苗不同。所述初免施用可以包括一个或多个施用。类似地，所述加强施用可以包括一个或多个施用。
基于细菌抗原的以哺乳动物为目标物种的组合物的剂量体积(例如，猪或家猪的组合物的剂量体积)一般为大约0.1至大约2.0ml、大约0.1至大约1.0ml以及大约0.5ml至大约1.0ml。
可以在最后一次免疫后大约2至4周通过用猪链球菌强毒株攻击动物(例如，猪科动物)来测试所述疫苗的功效。同源和异源菌株均用于攻击以测试所述疫苗的功效。可以通过IM或SC注射、喷雾、鼻内、眼内、气管内和/或口服来攻击动物。可以在攻击之前和之后收集来自关节、肺、脑和/或口腔的样品，并可以分析猪链球菌特异性抗体的存在。
在所述初免-加强方案中使用的包含本发明所述的细菌菌株的组合物包含在药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂中。本发明所述的方案保护所述动物免受猪链球菌的侵害和/或预防疾病在受感染的动物中进展。
各种施用优选隔开1至6周进行。优选的时间间隔是3至5周，并且根据一个实施方案，最佳为4周，还考虑了每年加强。第一次施用时，所述动物(例如，猪)可以是至少3-4周龄。
在另一个实施方案中，在产仔前大约3周至大约6周向母猪施用所述疫苗。与未接种疫苗的母猪相比，这些母猪的生殖、育龄和生长猪的疾病应有所减少。
本领域技术人员应理解，本文的公开内容是作为示例提供的，并且本发明不限于此。根据本文的公开内容和本领域的知识，本领域技术人员能够确定每种注射方案的施用次数、施用途径和剂量，而无需任何过度的实验。标准实验室规程的说明可以在许多文本和期刊文章中找到；参见，例如，Methods in Molecular Biology,第66卷(Glenn E.Morris,编辑,1996)。
本发明的另一个实施方案是一种试剂盒，其用于执行在动物中引发或诱导针对猪链球菌的免疫或保护性应答的方法，所述试剂盒包含猪链球菌免疫组合物或疫苗，以及用于执行以有效量递送以在所述动物中引发免疫应答的方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是一种试剂盒，其用于执行在动物中诱导针对猪链球菌的免疫或保护性应答的方法，所述试剂盒包含含有本发明的猪链球菌菌株的组合物或疫苗，以及用于执行以有效量递送以在所述动物中引发免疫应答的方法的说明书。
本发明的另一个实施方案是用于检测新发现的猪链球菌菌株的试剂盒。
本发明的另一方面涉及如上所述的根据本发明的用于初免-加强疫苗接种的试剂盒。所述试剂盒可包含至少两个小瓶：第一小瓶，其含有用于根据本发明所述的用于初免疫苗接种的疫苗或组合物，以及第二小瓶，其含有用于根据本发明所述的加强疫苗接种的疫苗或组合物。所述试剂盒可有利地包含附加的第一或第二小瓶，用于附加的初免疫苗接种或附加的加强疫苗接种。
所述药学上或兽医学上可接受的承载体或媒介物或赋形剂是本领域技术人员众所周知的。例如，药学上或兽医学上可接受的承载体或媒介物或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲液。能够用于本发明的方法的其他药学上或兽医学上可接受的承载体或媒介物或赋形剂包括但不限于聚(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。所述药学上或兽医学上可接受的承载体或媒介物或赋形剂可以是促进所述载体(或在体外由本发明载体表达的蛋白质)施用的任何化合物或化合物的组合；有利地，所述承载体、媒介物或赋形剂可促进转染和/或改善所述载体(或蛋白质)的保存。本文在一般描述中讨论剂量和剂量体积，并且也可以由本领域技术人员结合本领域知识阅读从本公开内容进行确定，无需任何过度实验。
根据本发明所述的免疫组合物和疫苗可以包含一种或多种佐剂或基本上由一种或多种佐剂组成。用于实施本发明的合适佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和链烯基衍生物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如，具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人,1996；WO98/16247)，(3)水包油乳液，例如，由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995年出版的“Vaccine Design,The Subunit andAdjuvant Approach”第147页上所描述的SPT乳液，以及同一作品中第183页上所描述的乳液MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在被引用并通过引用并入本申请的任何文献中讨论的其他佐剂，或(9)其任何组合或混合物。
在一个实施方案中，佐剂包括那些通过黏膜内衬促进改善的吸收的佐剂。一些示例包括MPL、LTK63、毒素、PLG微粒等(Vajdy,M.Immunology and Cell Biology(2004)82,617-627)。在一个实施方案中，所述佐剂可以是壳聚糖(Van der Lubben等人，2001；Patel等人，2005；Majithiya等人，2008；美国专利序列号5,980.912)。
在一个实施方案中，所述佐剂可以是灭活细菌、灭活病毒、灭活细菌级分、细菌脂多糖、细菌毒素或其衍生物或组合。
在一个实施方案中，所述佐剂包含完整细菌和/或病毒，包括副猪嗜血菌、梭菌属、猪流感病毒(SIV)、猪圆环病毒(PCV)、猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、Mannhemia、巴斯德氏菌属、Histophious、沙门氏菌属、大肠杆菌或其组合和/或变体。在几个实施方案中，所述佐剂增加了动物的IgM、IgG、IgA和/或其组合的产生。
参考文献：
1.Hill JE,Gottschalk M,Brousseau R,Harel J,Hemmingsen SM,GohSH.Biochemical analysis,cpn60 and 16S rDNA sequence data indicate thatStreptococcus suis serotypes 32and 34,isolated from pigs,are Streptococcusorisratti.Vet Microbiol.2005；107(1–2):63–9.
2.le Tien HT,Nishibori T,Nishitani Y,Nomoto R,Osawa R.Reappraisal ofthe taxonomy of Streptococcus suis serotypes 20,22,26,and 33based on DNA-DNAhomology and sodA and recN phylogenies.Vet Microbiol.2013；162(2–4):842–9.
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
实施例1–生殖疾病暴发的分析
接受阴道拭子样品作为调查的一部分，所述调查旨在鉴定最近在农场流产激增的原因。还接受了来自相同猪群的鼻拭子和组织样品。图2a显示了母猪中正常的细菌分布。图2b显示了具有阴道分泌物的流产母猪的细菌分布，注意到从所述拭子和组织样品中分离出了几株猪链球菌。
使用最近开发的血清分型方法(Lawrence PK:Map-based serotyping ofStreptococcus suis field isolates for vaccine formulation.AAVLD annualmeeting,2015；www.aavld.org/assets/2017)，从这些样品中鉴定出许多分离株为高度不同的血清型菌株，与血清型27和12有一些相似性(图3)。猪链球菌是唯一检测到与生殖疾病有关的病原体。
标准的分型方法无法确切确定生殖疾病暴发的原因。因此，为了确定是否存在其他堕胎剂，对阴道拭子和组织样品进行了宏基因组分析。
实施例2–阴道拭子的宏基因组学分析
使用比较基因组学进一步分析了来自该病例的猪链球菌变异株，以鉴定所述阴道分离株特有的毒力因子。从该病例具有类似血清型的所述猪链球菌菌株以及集合中表现出与血清型27类似的血清分型结果的另外两个菌株中组装了基因组草图。
阴道拭子样品取自同一农场有症状和无症状的母猪，并在运输前置于核酸保存溶液中。从所有样品中提取RNA，将其转化为cDNA，并用于文库制备。使用MiSeq仪器，使用2x300bp化学进行测序。在将针对野猪(Sus scrofa)基因组的宿主读数进行过滤之后，使用Kraken进行宏基因组学分析。使用Krona可视化结果。这些步骤中的每一个均根据本领域已知并在参考文献中描述的标准方法进行。参见，例如，Aline,Ines等人，“DifferentialSharing and Distinct Co-Occurrence Networks among Spatially Close BacterialMicrobiota of Bark,Mosses and
Figure BDA0002445347490000181
:International InformationSystem for the Agricultural Science and Technology,Hillsdale,N.J.:B.L.ErlbaumAssociated,1982.,1970年1月1日,agris.fao.org/agris-search/search.do？recordID＝US201700210871。
在鉴定猪链球菌为潜在的堕胎剂后，从同一农场地点的不同猪中获得分离株，并使用先前描述的方法进行血清分型(Lawrence PK，2015)。基因组使用2x150bp化学在MiSeq仪器上进行测序并从头开始组装。在共有血清型27基因型的所有分离株之间进行基因组比较。这些比较显示在图4以及还有图1和图6中。
从所述宏基因组样品获得的结果令人惊讶；在这种情况下，寄生虫学家不会期望将猪链球菌鉴定为可能的堕胎剂。但是，在该宏基因组中几乎没有其他东西可以解释兽医在该农场地点报告的后遗症。比较分析最初集中于比较最接近血清型匹配是血清型27的菌株，因为先前尚未分离出与血清型27和12都具有同源性的菌株。但是，在所述阴道分离株中荚膜基因座的整体结构更接近血清型12。特别是所述基因座3'末端的cpsN、cpsO和cpsP基因在所述阴道分离株和血清型12和20之间共享(图1)。
但是，尽管来自所述阴道分离株的cpsN基因在核苷酸水平上与血清型12具有显著相似性，但所述cpsO和cpsP基因与先前报道的带有新型荚膜的分离株YS-149的cpsT和cpsU基因具有更大的相似性(图1)(Zheng H等人:Eight novel capsular polysaccharidesynthesis gene loci identified in nontypeable Streptococcus suis isolates.Appl.Environ.Microbiol.,2015,81:4111-4119)。有趣的是，所述阴道分离株的荚膜基因座还具有Fic家族蛋白，它们与YS-149(cpsF)和血清型3、13、17、18、19、21、24、29、33共享(Okura M等人:Genetic analysis of capsular polysaccharide synthesis geneclusters from all serotypes of Streptococcus suis:potential mechanisms forgeneration of capsular variation.Appl Environ Microbial.2013,79:2796-2806)，但不与血清型12共享。此外，在血清型12中标注为cpsF和cpsG的糖基转移酶和差向异构酶基因与所述阴道分离株中的血清型24和21的关系比与任何其他血清型更密切(图5)。
这种镶嵌结构在猪链球菌分离株中似乎并不罕见，因为最近已报道了具有新型荚膜基因座的其他菌株(Pan Z等人:Novel variant serotype of Streptococcus suisisolated from piglets with meningitis.Appl.Environ.Microbiol.,2015,81:976-985；Qiu Z,等人:Novel capsular polysaccharide loci and new diagnostic toolsfor high-throughput capsular gene typing in Streptococcussuis.Appl.Environ.Microbiol.,2016,21:7102-7112)。但是，这是第一份报告，其中将特定的血清型与生殖疾病初步联系起来。
在所述阴道分离株的基因组中存在替代分泌途径也是一个不寻常的发现。由新型荚膜基因座、替代分泌途径和所述cbpD基因组成的独特的基因集群可以赋予这些菌株独特的定植阴道的能力。这些基因不仅编码几种独特的粘附蛋白，而且它们一起可以赋予这些分离株竞争优势。肺炎链球菌(S.pneumoniae)中CbpD的分泌与近缘种细胞的裂解相关(Edholm V等人:Fratricide in Streptococcus pneumoniae:contributions and roleof the cell wall hydrolases CbpD,LytA and LytC.Microbiology.,2009,155:2223-2234)。在肺炎链球菌中，lytA和lytC是体外有效靶细胞裂解所必需的。但是，当使用EDTA螯合二价阳离子时，仅使用CbpD显著增强裂解。可以预料在受感染母猪的生殖道中类似的情况会很普遍。如果CbpD能够通过本文所鉴定的替代分泌途径输出，则所述阴道分离株可能会获得一个重要的优势，使它们能够胜过生殖道中存在的其他菌株。
因此，相对于其亲本猪链球菌菌株，所述菌株似乎具有“基因的替代形式”，其在本文中定义为“等位基因”。在一个实施方案中，所述替代等位基因负责降低毒力。
另外，据信，两种操纵子通过充当宿主细胞粘附蛋白而有助于与这些菌株相关的病理。第一种是替代分泌操纵子。该分泌操纵子的功能是将富含丝氨酸重复的糖蛋白输出至所述细胞表面，在那里它们已被证明可以充当宿主细胞粘附蛋白。第二种操纵子是一组参与磷酸胆碱代谢的荚膜基因。所述荚膜基因有助于将磷酸胆碱掺入细胞壁，改变荚膜结构并允许胆碱结合蛋白的附着。由链球菌属的种的致病菌株和共生菌株分泌的胆碱结合蛋白已被认为是宿主细胞粘附蛋白。
另外，发现新鉴定的菌株具有裂解性胆碱结合蛋白D同源物(cbpD)。这种蛋白质在具有活性输出系统的菌株中的功能不同。
这些发现显示在以下SEQ ID NO中：
SEQ ID NO：1和2：1307.1544.peg.724β-1,3-葡萄糖基转移酶[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：3和4：1307.1544.peg.723核苷酸糖合成酶样蛋白[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：5和6：1307.1544.peg.722糖基转移酶，家族8[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：7和8：1307.1544.peg.721β-1,3-葡萄糖基转移酶[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：9和10：1307.1544.peg.720预测的细胞壁锚定蛋白SasA(LPXTG基序)[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：11和12：11 1307.1544.peg.719前蛋白移位酶SecY2亚基(TC3.A.5.1.1)[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：13和14：1307.1544.peg.718辅助分泌蛋白Asp1[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：15和16：1307.1544.peg.717辅助分泌蛋白Asp2[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：17和18：1307.1544.peg.716辅助分泌蛋白Asp3[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：19和20：1307.1544.peg.715蛋白质输出细胞质蛋白SecA2 ATP酶RNA解旋酶(TC 3.A.5.1.1)[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：21和22：1307.1544.peg.714聚(甘油-磷酸)α-葡萄糖基转移酶GftA(EC 2.4.1.52)[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：23和24：1307.1544.peg.713GftB：糖基转移酶，家族8[猪链球菌17-00802-29][aSec操纵子基因]及其翻译。
SEQ ID NO：25和26：1307.1544.peg.1161磷酸胆碱胞苷酰转移酶LicC(EC2.7.7.15)/胆碱激酶(EC 2.7.1.32)[猪链球菌17-00802-29][licABC基因]及其翻译。
SEQ ID NO：27和28：1307.1544.peg.1160胆碱通透酶LicB[猪链球菌17-00802-29][licABC基因]及其翻译。
SEQ ID NO：29和30：1307.1544.peg.1159磷酸胆碱胞苷酰转移酶(EC 2.7.7.15)LicA[猪链球菌17-00802-29][licABC基因]及其翻译。
SEQ ID NO：31和32：17-00802-29_阴道_CbpD_真猪链球菌17-00802-29及其翻译。
因此，本发明包括用于制备和/或配制免疫原性组合物的方法；例如，在合适的培养基上或在合适的培养基中培养或生长或繁殖所述细菌，收获所述细菌，可选地杀死、灭活或减毒所述细菌，以及可选地将所述细菌与合适的兽医学上或药学上可接受的承载体、赋形剂、稀释剂或媒介物和/或佐剂和/或稳定剂。因此，本发明还涉及所述细菌在配制此类组合物中的用途。
总结：该分析鉴定了两种操纵子，其可能有助于与这些菌株相关的病理。第一种是替代分泌操纵子，第二种是一组参与磷酸胆碱代谢的荚膜基因。该分泌操纵子的功能是将富含丝氨酸重复的糖蛋白输出至所述细胞表面，在那里它们已被证明可以充当宿主细胞粘附蛋白(Bensing BA,Seepersaud R,Yen YT,Sullam PM:Selective transport by SecA2:an expanding family of customized motor proteins.Biochim Biophys Acta.2014,1843:1674-1686)。所述荚膜基因可能有助于将磷酸胆碱掺入细胞壁，改变荚膜结构并允许胆碱结合蛋白的附着。由链球菌属的种的致病菌株和共生菌株分泌的胆碱结合蛋白已被认为是宿主细胞粘附蛋白(Hakenbeck R,Msfhout A,Denapaite D,Bruckner R:Versatilityof choline metabolism and choline-binding proteins in Streptococcuspneumoniae and commensal streptococci.FEMS Microbiol Rev.,2009 33:572-586)。所有经测序的分离株均具有裂解性胆碱结合蛋白D同源物(cbpD)，但该蛋白在具有潜在活性输出系统的菌株(例如，经分离的阴道菌株)中的功能不同。
图4显示了如何基于全基因组测序来推断血清型3基因座。蓝色实线显示血清型3特有和类似于血清型3的区域。血清型3是简单基因座的示例。
实施例3–准确鉴定所有菌株的猪链球菌细胞分型新方法的开发
基于实施例2中所描述的成功鉴定，本文描述新的血清分型方法。
以下工作流程描述了通过对分离株进行测序和血清分型来基于全基因组序列(WGS)进行荚膜分型。提取基因组DNA并测序，荚膜类型衍生自基因组草图。
-从受感染的动物中分离样品；
-提取基因组DNA；
-纯化基因组DNA；
-制备用于对所述基因组DNA进行测序的文库；
-对所述基因组DNA进行测序；
-从头开始组装基因组草图；和
-通过将选定的基因参考映射到基因组数据库，从所述基因组草图中得出所述荚膜类型。
在这个实施例中，所述基因组数据库来源于美国国家生物技术信息中心(NCBI,https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和NCBI的GenBank(/www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，并包括分离的附加样品。附加样品可以在许多公共数据库中找到，例如Superfund:National Priorities List(NPL,www.epa.gov/superfund/superfund-national-priorities-list-npl)。
在该实施例中鉴定和使用的血清型在以下SEQ ID NO中给出：SEQ ID NO：33是血清型1/2以及SEQ ID NO：34-67分别是血清型1-34。
与其他疫苗配制方法相比，以这种方式得到的疫苗和免疫原性试剂将提供改善的针对猪链球菌感染的保护。
实施例4–针对猪链球菌新菌株的疫苗
可以使用选自SEQ ID NO：3、7或11或其组合的组的多核苷酸，或编码来自选自SEQID NO：4、8或12或其组合的组的序列的多肽的多肽，来制备针对在生殖、育龄和生长猪中引起疾病的猪链球菌新菌株的链球菌疫苗。
所述疫苗组合物可进一步包括药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。它还可以包括佐剂，其中所述佐剂可以是灭活细菌、灭活病毒、灭活细菌级分、细菌脂多糖、细菌毒素或其衍生物或组合。
开发疫苗的过程和方案在与疫苗开发有关的专利和出版物中以及与疫苗开发有关的学术文章中找到，例如，能够在Vaccines，www.journals.elsevier.com/vaccine杂志上找到的那些文章。
实施例5–用于预防猪链球菌新菌株的试剂盒
本发明还包括用于检测猪链球菌菌株的试剂盒，其包含用于收集样品的材料和试剂以及用于进行宏基因组学分析的材料和试剂。
本发明包括用于在动物中引发或诱导针对猪链球菌的免疫或保护性应答的试剂盒，其不必使用疫苗制剂。例如，可以使用将动物暴露于猪链球菌免疫组合物的较简单的方法(例如，气雾剂递送方法)。可以将引发免疫应答所需的量吹入鼻孔。剂量将取决于所述动物的年龄和体型。
本发明还包括用于初免-加强疫苗接种的试剂盒，其包含至少两个小瓶：含有用于根据本发明的初免疫苗接种的疫苗或组合物的小瓶，以及含有用于根据本发明的加强疫苗接种的疫苗或组合物的第二小瓶。
这个试剂盒还能包括用于附加的初免疫苗接种或附加的加强疫苗接种的附加的小瓶。
总之，这项研究已经揭示了在表现出生殖疾病症状的母猪中存在具有新型毒力因子和荚膜结构的猪链球菌菌株。
*＊＊＊＊＊＊*
因此，在详细描述了本发明的优选实施方案后，应当理解，由以上段落定义的本发明不限于以上描述中给出的特定细节，因为在不偏离本发明的精神或范围的前提下，许多明显的改变是可能的。

Claims (22)

1.猪链球菌(S.suis)的纯化的多核苷酸，其在动物中引发免疫原性应答，其中所述多核苷酸包含：
a)与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示序列的多核苷酸具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；或者
b)具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示序列的多肽的保守变体。
2.疫苗或免疫原性组合物，其包含根据权利要求1所述的氨基酸序列或多肽或其组合。
3.根据权利要求2所述的疫苗或免疫原性组合物，其能够在猪科动物中提供针对猪链球菌引起的生殖、育龄和生长猪的疾病的安全且有效的免疫应答。
4.根据权利要求3所述的疫苗或免疫原性组合物，其具有编码SEQ ID NO：4、8、12或其组合所示序列的多肽的保守变体的多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含药学上或兽医学上可接受的媒介物、稀释剂或赋形剂。
6.根据权利要求5所述的疫苗或免疫原性组合物，其进一步包含佐剂。
7.根据权利要求6所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂是灭活细菌、灭活病毒、灭活细菌级分、细菌脂多糖、细菌毒素或其衍生物或组合。
8.根据权利要求3所述的疫苗或免疫原性组合物，其针对强毒猪链球菌的攻击在猪科动物中提供保护性免疫应答。
9.一种给猪科动物接种疫苗的方法，其包括至少一次施用权利要求1-8中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述猪科动物是产仔前大约3周至大约6周的母猪。
11.根据权利要求10所述的方法，其中与未接种疫苗的母猪相比，所得到的母猪的生殖、育龄和生长猪的疾病减少。
12.预防或治疗家猪的生殖、育龄和生长猪的疾病的方法，其包括向所述家猪施用权利要求2或3所述的疫苗。
13.猪链球菌荚膜分型的方法，其包括：
从受感染的动物中分离样品；
提取基因组DNA；
纯化基因组DNA；
制备用于对所述基因组DNA进行测序的文库；
对所述基因组DNA进行测序；
从头开始组装基因组草图；和
通过将选定的基因参考映射到基因组数据库，从所述基因组草图中得出所述荚膜类型。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述荚膜类型用于配制疫苗以匹配野外株。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述野外株选自SEQ ID NO：33-67。
16.根据权利要求14或15所述的方法，与其他疫苗配制方法相比，所述方法提供了针对猪链球菌感染的改善的保护。
17.用于在动物中引发或诱导针对猪链球菌的免疫或保护性应答的试剂盒，其包含：
猪链球菌免疫组合物；和
用于执行以有效量递送以在所述动物中引发免疫应答的方法的说明书。
18.根据权利要求17所述的试剂盒，其中所述免疫组合物包含：
a)与具有SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31所示序列的多核苷酸具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；或者
b)具有SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32所示序列的多肽的保守变体；或者
c)其组合。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述免疫组合物是编码选自由SEQ ID NO：4、8、12或其组合组成的组的多肽的保守变体的多核苷酸。
20.用于鉴定猪链球菌菌株的试剂盒，其包含用于收集样品的材料和试剂以及用于执行根据权利要求13所述的荚膜分型方法的材料和试剂。
21.用于初免-加强疫苗接种的试剂盒，其包含至少两个小瓶：第一小瓶，其包含用于初免疫苗接种的根据权利要求1-8中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，以及第二小瓶，其包含用于加强疫苗接种的不同于根据权利要求1-8中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物。
22.根据权利要求21所述的试剂盒，其进一步包含用于附加的初免疫苗接种或附加的加强疫苗接种的附加的第一或第二小瓶。
CN201880066134.XA 2017-08-31 2018-08-31 预防生殖、育龄和生长猪的疾病的猪链球菌疫苗及其制备和使用方法 Pending CN111328289A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762552975P 2017-08-31 2017-08-31
US62/552,975 2017-08-31
PCT/US2018/049041 WO2019046691A1 (en) 2017-08-31 2018-08-31 STREPTOCOCCUS AM VACCINES FOR THE PROTECTION AGAINST DISEASES OF REPRODUCTIVE PIGS, PIGLETS AND GROWING PIGS AND METHODS OF MAKING AND USING THEM

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111328289A true CN111328289A (zh) 2020-06-23

Family

ID=63787998

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880066134.XA Pending CN111328289A (zh) 2017-08-31 2018-08-31 预防生殖、育龄和生长猪的疾病的猪链球菌疫苗及其制备和使用方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10968258B2 (zh)
EP (1) EP3675901A1 (zh)
CN (1) CN111328289A (zh)
AU (1) AU2018325528A1 (zh)
CA (1) CA3074004A1 (zh)
WO (1) WO2019046691A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118178628A (zh) * 2024-03-15 2024-06-14 深圳市龙华区中心医院 链球菌疫苗

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140004144A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-02 Merial Limited Attenuated Streptococcus suis Vaccines and Methods of Making and Use Thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0138854B1 (en) 1983-03-08 1992-11-04 Chiron Mimotopes Pty. Ltd. Antigenically active amino acid sequences
EP0930893B1 (en) 1996-10-11 2005-04-13 The Regents of The University of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
US5980912A (en) 1997-03-25 1999-11-09 Zonagen, Inc. Chitosan induced immunopotentiation
RS54963B1 (sr) * 2005-09-02 2016-11-30 Valorisation-Recherche Limited Partnership Polipeptidi stereptococcus suis-a i polinukleotidi koji ih kodiraju i njihova primena u vakcinama i dijagnostici
EP2949340A1 (en) * 2014-05-30 2015-12-02 IDT Biologika GmbH Vaccine composition against Streptococcus suis infection
US10279031B2 (en) * 2016-05-11 2019-05-07 Phibro Animal Health Corporation Composition comprising antigens and a mucosal adjuvant and a method for using

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140004144A1 (en) * 2012-06-27 2014-01-02 Merial Limited Attenuated Streptococcus suis Vaccines and Methods of Making and Use Thereof
CN104780935A (zh) * 2012-06-27 2015-07-15 梅里亚有限公司 减毒猪链球菌疫苗及其制造和使用方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SEGURA M 等: "Streptococcus suis vaccines: candidate antigens and progress"", EXPERT REV VACCINES *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118178628A (zh) * 2024-03-15 2024-06-14 深圳市龙华区中心医院 链球菌疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018325528A1 (en) 2020-04-16
US10968258B2 (en) 2021-04-06
US20190241625A1 (en) 2019-08-08
CA3074004A1 (en) 2019-03-07
WO2019046691A1 (en) 2019-03-07
EP3675901A1 (en) 2020-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3166634B1 (en) Novel vaccine compositions for porcine epidemic diarrhea virus
AU2016222520B2 (en) Attenuated Streptococcus suis vaccines and methods of making and use thereof
CN107197626B (zh) 含有减毒睡眠嗜组织菌的免疫组合物
KR101647180B1 (ko) 면역학적 보르데텔라 브론키셉티카 조성물
US20160158336A1 (en) Attenuated Mannheimia haemolytica Vaccines and Methods of Making and Use
EP2189164A1 (en) Salmonella marker vaccine
CN1929859A (zh) 抗睾丸bvdv感染的疫苗接种方法
US10968258B2 (en) Streptococcus suis vaccines to protect against reproductive, nursery-age, and growing pig diseases and methods of making and use thereof
Ziech et al. Protective efficacy of commercial vaccines against a virulent field strain of Clostridium chauvoei
JP7399865B2 (ja) 哺乳動物における趾皮膚炎に使用されるワクチン組成物
Bajzert et al. Evaluation of local and systemic humoral immune responses to selected recombinant bacterial antigens administered intranasally and subcutaneously to dairy calves
WO2023011812A1 (en) A vaccine for protection against streptococcus suis of various serotypes
JP2021535138A (ja) 混合ワクチン

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200623

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication