CN113769076A - 抗猪链球菌感染的疫苗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种疫苗组合物，其包含有效量的至少一种多肽，所述多肽选自IdeSsuis、rIdeSsuis、其类似物或片段，或编码它们的多核苷酸。该疫苗组合物用于猪或人的猪链球菌感染的预防性、间免性或治疗性治疗。

Description

抗猪链球菌感染的疫苗组合物

分案申请

本申请为申请号201580032725.1、申请日为2015年5月29日、题为“抗猪链球菌感染的疫苗组合物”的分案申请。

技术领域

本发明涉及疫苗组合物及其在哺乳动物(特别是猪和人)免疫和保护中的用途，其抗猪链球菌(Streptococcus suis)。

背景技术

猪链球菌(S.suis)定植在猪的呼吸道、消化道和生殖道。猪链球菌也是最重要的猪病原体之一，引起不同的病变如脑膜炎、败血病、关节炎和心内膜炎。

猪链球菌感染导致全世界猪业中的高生产损失。通常使用抗生素治疗猪链球菌感染。但是复发性感染常常发生，以及正在进行的关于减少抗生素使用的讨论强调了对替代控制措施的需要。在欧洲，没有可用的许可疫苗，但通常使用自体菌苗。主要缺点是这些疫苗仅防御同源血清型的事实。但猪链球菌是一种非常多样的生物体，并且不同的血清型导致仔猪发病。尤其是血清型2菌株在全世界仔猪的疾病中扮演着重要的角色。

猪链球菌血清型2已经被鉴定在亚洲的成人中引起脑膜炎，但是迄今为止还没有检测到猪链球菌在人之间的传播。

通常，感染引起早期抗原特异性免疫球蛋白M(IgM)的响应，导致亲和力成熟和同型转换(isotope switching)。此外，IgM抗体在感染之前存在，其是天然存在的，在将天然免疫与获得性免疫相关联中是重要的。

在猪中，IgM作为单体膜IgM(mIgM)是尤其重要的，因为它是唯一出现的B细胞受体，因为猪中缺少IgD。此外，新生仔猪中IgM的合成比IgG和IgA的合成早得多。初乳中的IgM对病原体的防御至关重要，病原体的防御通过补体介导的杀伤来进行。因此，IgM抗体在防御不同病原体中是重要的。

已经鉴定了猪链球菌血清型2的各种毒力或毒力相关因子，在荚膜中，其是迄今为止唯一已知的保护病原体免受吞噬作用的必需毒力因子。猪链球菌血清型2的许多表面相关和分泌蛋白表现出与其它致病性链球菌的同源因子相同或非常相似的功能。各种人或动物的病原体如化脓性链球菌、马链球菌马亚种和马链球菌兽疫亚种表达彼此同源的特异性IgG内肽酶。

具有猪链球菌独有功能的表面相关或分泌因子已经首先由Seele等人描述(“Identification of a Novel Host-specific IgM Protease in Streptococcussuis.”2013；Journal of Bacteriology，195：930-940)。Seele等人表明该IgM蛋白酶(称为IdeSsuis)不起IgG内肽酶的作用。IgM蛋白酶降解细菌表面上调理作用的IgM，因此提高猪链球菌在菌苗初免的仔猪血液中的存活。IdeSsuis对IgM高度特异性，并且不切割IgG或IgA。然而，Seele等人没有提到IdeSsuis、rIdeSsuis及其类似物和片段作为抗猪链球菌感染的有效疫苗的功能。其仅仅假设IdeSsuis IgM蛋白酶活性的中和可以基本上改善诱导调理抗体的菌苗或其它未来疫苗的保护功效。然而，其没有公开IdeSsuis和相关蛋白可用作抗猪链球菌感染疫苗中的专有免疫剂。

Baums等人在《动物健康研究综述》，第10卷，第01期，2009年6月，第65-83页的《流行病学、发病机制和疫苗开发中的猪链球菌表面相关和分泌因子》(Surface-associatedand secreted factors of Streptococcus suis in epidemiology,pathogenesis andvaccine development,Animal Health Research Reviews,Volume 10,Issue 01,June2009,pp 65-83)中公开了细菌因子(表面相关的和分泌的细菌因子)，其被认为有助于猪链球菌与宿主因子和细胞的相互作用。因子相对于以下方面给出：(i)它们的鉴定和特征，(ii)它们在猪链球菌中的分布和(iii)它们对毒性、免疫响应和疫苗接种的重要性。该综述强调了未来仍有待解决的许多挑战性问题。

根据本发明所要解决的问题是克服本领域描述的问题，并提供一种新的疫苗组合物以免疫和保护哺乳动物，特别是猪和人，对抗猪链球菌感染。

发明内容

根据本发明，通过提供一种疫苗组合物来解决这一问题，该疫苗组合物包含有效量的选自下组的至少一种多肽或至少一种载体：

(a)称为IdeSsuis的蛋白质，其类似物或片段，

(b)称为rIdySsuis的蛋白质，其类似物或片段，

(c)插入多核苷酸的载体，该多核苷酸编码蛋白IdeSsuis、其类似物或片段，

(d)插入多核苷酸的载体，该多核苷酸编码蛋白rIdeSsuis、其类似物或片段，和

至少一种药物载体、稀释剂或佐剂。

本发明的详细说明

本发明使用的疫苗组合物包含至少一种由(a)或(b)限定的单一多肽，以及药物载体或稀释剂或佐剂或其混合物。此外，该疫苗还可以包含由(c)或(d)限定的至少一种单一载体，和药物载体、稀释剂或佐剂或其混合物。

根据本发明，优选的是一疫苗组合物，其中(a)的IdeSsuis包括：

(a.a)SEQ ID NO:1氨基酸序列；

(a.b)SEQ ID NO:1氨基酸序列的片段或类似物；或

(a.c)具有IgM蛋白酶活性的(a.a)或(a.b)的片段。

根据本发明，进一步优选的是一疫苗组合物，其中(b)的rIdeSsuis包括或由其组成：

(b.a)SEQ ID NO：2、6或7的氨基酸序列；

(b.b)SEQ ID NO：2、6或7的氨基酸序列的片段或类似物

(b.c)SEQ ID NO：1氨基酸序列上缺少从位置1至34的氨基酸的氨基酸序列；

(b.d)与SEQ ID NO：1的蛋白IdeSsuis的氨基酸序列具有至少60％同源性，优选70％同源性，最优选85％同源性的氨基酸序列；

(b.e)具有IgM蛋白酶活性的(b.a)或(b.b)或(b.c)或(b.d)的片段；或者

(b.f)包含或由SEQ ID NO：5氨基酸序列或与其至少95％同源的氨基酸序列组成的(b.a)或(b.b)或(b.c)或(b.d)的片段。

SEQ ID NO：2氨基酸序列代表SEQ ID NO：1序列，然而缺少氨基酸1-34(信号肽)，但添加了HIS标记。注意，SEQ ID NO：1源自猪链球菌血清型2菌株。

SEQ ID NO：6氨基酸序列代表SEQ ID NO：2的N端序列。

SEQ ID NO：7(也称为抗原rIdeSsuisB2)含有猪链球菌血清型7菌株成熟IdeSsuis蛋白的完整氨基酸序列，但添加了N末端HIS标记。猪链球菌血清型7菌株的IdeSsuis蛋白在蛋白质的C末端半部(C terminal half)中不同，因为其与SEQ ID NO：1相比缺少114个氨基酸的序列。SEQ ID NO：7的氨基酸80至414(所谓Mac-1结构域的高度保守部分)与SEQ IDNO：5序列的97.9％对应。SEQ ID NO：7和1之间的总体一致性是96.4％(不考虑N末端HIS标记和114个氨基酸的缺口)。

本文所用的术语“片段或类似物”定义如下：

“类似物”可以认为是与上述公开的氨基酸序列相似的氨基酸序列，并且显示与原始氨基酸序列(例如SEQ ID NO：1、2、6或7)至少60％，优选70％，最优选85％的同源性水平。本文还考虑更高的同源性程度，例如95％。本文所用的同源性是指一致性。因此，基于替换、删除或插入，序列可能彼此不同。

一致性的程度可以使用具有默认参数的blastp算法的蛋白blast程序来确定，所述默认参数是，例如，预期阈值：10，字大小：3，矩阵：BLOMSUM62，间隙成本：存在：11扩展：1和组成调整：条件组成分数矩阵调整(BLAST是国家医学图书馆的注册商标)。该程序可使用蛋白质查询来搜索蛋白质数据库。一致性报告了对齐的查询和数据库序列之间的精确匹配。

优选地，氨基酸“替换”是用具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代一个氨基酸的结果，即，保守的氨基酸取代。基于所涉及残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性可以进行氨基酸替换。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；而带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。

“插入”或“删除”通常在约1、2或3个氨基酸的范围内。允许的变化可以实验测定，通过使用重组DNA技术系统地在蛋白质中插入或删除氨基酸并测定所得重组变体的活性。这对于技术人员不需要超过常规的实验。

“类似物”可以替代地或另外地定义为与上文公开的氨基酸序列类似的氨基酸序列并包含Mac-1结构域的高度保守部分(SEQ ID NO：5)或与其至少95％同源的氨基酸序列。本发明人惊讶地发现，该结构域主要负责IdeSsuis蛋白质意想不到的免疫原性活性，并且本身足以为接种的动物提供免疫保护。存在不同血清型的猪链球菌，在其氨基酸序列中部分地显示出大的变化，因此导致同源性水平低至约60％。然而，高度保守的Mac-1结构域在不同血清型之间仅显示出小的变化，例如在血清型菌株2和7之间97.9％。

因此，可接受的是，本发明的氨基酸(和编码它们的核酸)在Mac-1结构域之外显示出比结构域之内更高水平的变化。

术语“片段”可以以相似的方式定义(参见上文)。其描述了比类似物更短的氨基酸序列(少于约400个氨基酸)。其含有或由Mac-1结构域的高度保守部分(SEQ ID NO：5)或与其至少95％同源的氨基酸序列组成。任选地，片段可以定义为具有IgM蛋白酶活性，尽管这不是基本要求。这些片段可以用作根据本发明的疫苗的专有活性成分。

因此，在优选的实施例中，本发明的疫苗组合物包含、基本上由或由蛋白质组成，该蛋白质包含或由SEQ ID NO：5氨基酸序列或与其至少95％同源的氨基酸序列组成。在更优选的实施例中，该蛋白质(或编码该蛋白质的载体)是唯一的活性或免疫原性成分。

本文在疫苗组合物情况中使用的术语“包含”是指可以存在进一步的活性或免疫原性组分。“由...组成”是指不存在进一步的组分，“基本上由...组成”是指可以存在特定的进一步组分，即不会实质上影响疫苗的基本特征的那些(即非活性或非免疫原性成分)。

在优选的实施例中，本发明提供了一种疫苗组合物，其基本上由与SEQ ID NO：1的蛋白IdeSsuis的氨基酸序列至少60％、70％、85％或95％同源的rIdeSsuis蛋白组成，和/或包含或由SEQ ID NO：5氨基酸序列或与其至少95％同源的氨基酸序列组成。

上述定义经必要修正后也适用于本发明编码这些蛋白质的核酸序列。同源性的定义相同，片段长度将少于约1200个核酸。

根据本发明进一步优选的是一疫苗组合物，其中有效量的(a)或(b)所述的多肽的片段是有至少一种其它蛋白质的融合蛋白的一部分。

根据本发明优选的是一疫苗组合物，其中(c)的多核苷酸包含编码定义为IdeSsuis的蛋白质的序列，即

(a.a)SEQ ID NO:1氨基酸序列；

(a.b)SEQ ID NO:1氨基酸序列的片段或类似物；或

(a.c)具有IgM蛋白酶活性的(a.a)或(a.b)片段。

根据本发明，特别优选的是一疫苗组合物，其特征在于所述多核苷酸包含

(c.a)SEQ ID NO:3序列或其互补序列；

(c.b)(c.a)序列的片段或

(c.c)编码具有IgM蛋白酶活性的蛋白的(c.a)序列片段。

根据本发明进一步优选的是一疫苗组合物，其中所述(d)的多核苷酸包含编码定义为rIdeSsuis的蛋白的序列，即

(b.a)SEQ ID NO:2氨基酸序列；

(b.b)SEQ ID NO:2氨基酸序列的片段或类似物；

(b.c)SEQ ID NO：1氨基酸序列上缺少从位置1至34的氨基酸的氨基酸序列；

(b.d)与SEQ ID NO：1的蛋白IdeSsuis的氨基酸序列具有至少60％同源性，优选70％同源性，最优选85％同源性的氨基酸序列；或者

(b.e)具有IgM蛋白酶活性的(b.a)或(b.b)或(b.c)或(b.d)的片段；和/或

(b.f)包含或由SEQ ID NO：5氨基酸序列或与其至少95％同源的氨基酸序列组成的(b.a)或(b.b)或(b.c)或(b.d)的片段。

根据本发明特别优选的是一疫苗组合物，其特征在于，所述多核苷酸包含

(d.a)SEQ ID NO：4、8或9序列或其互补序列；

(d.b)(d.a)序列的片段或

(d.c)编码具有IgM蛋白酶活性的蛋白质的(d.a)序列的片段。

根据本发明优选的是一疫苗组合物，其中多核苷酸是cDNA、DNA或cRNA、RNA。术语“核酸序列”是指核苷酸的杂聚物或这些核苷酸的序列。术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，是指核苷酸的杂聚物。

此外，根据本发明优选的疫苗组合物的特征还在于多核苷酸整合到载体中，其中所述多核苷酸可操作地连接到载体的表达控制区。

该表达载体优选包含一个或多个调节序列。术语“表达载体”通常是指质粒或噬菌体或病毒或载体，用于从DNA(RNA)序列表达多肽。表达载体可以包含转录单元，该转录单元包含组件(1)在基因表达中具有调节作用的遗传元件或元件，例如启动子或增强子，(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列，和(3)合适的转录起始和终止序列。打算用于酵母或真核表达系统的结构单元优选包括前导序列，该前导序列能够通过宿主细胞在细胞外分泌翻译的蛋白质。或者，当重组蛋白质在没有前导或转运序列的情况下表达时，其可以包括N端甲硫氨酸残基。该残基可以随后从表达的重组蛋白中被或不被切割以提供最终产物。

根据本发明还优选的疫苗组合物以生理可给药的形式提供，并且适合于肌内、静脉内、皮下或皮肤注射或粘膜施用。应注意，静脉内给药是不太优选的。

在另一方面，本发明涉及IdeSsuis的片段，其具有SEQ ID NO：5氨基酸序列，或与其至少95％同源的氨基酸序列。SEQ ID NO：5对应于Mac-1结构域的高度保守部分。尽管该结构域显示出IgM蛋白酶活性，但是免疫原性效应不一定与该活性相关。例如，在本发明范围内的SEQ ID NO：5的类似物，其中蛋白酶的活性中心已经通过Cys残基的诱变失活。同样在这种情况下，该类似物作为引起免疫响应的疫苗是有效的。

此外证明，如果氨基酸序列与SEQ ID NO：5保持至少95％的同源性，则氨基酸序列作为抗猪链球菌感染的疫苗可以是有效的。这包括单个氨基酸的替换、插入或删除。其证明，自然存在的Mac-1结构域，尽管显示出一些变化，但相差不超过5％，或换句话说，在该结构域中具有95％或以上的一致性。示例性的猪链球菌序列获取自不同地区(美洲、亚洲、欧洲)分离的菌株，并且来自不同的宿主生物体(人、猪)。这些菌株属于不同的血清型(1至4、7至9、14和16或非分型)。这总结在附表1中：

关于蛋白质WP_044671938、WP_002935529、WP_015647040、WP_023370787和WP_044678723的Mac-1结构域的序列信息公开在SEQ ID NO：10至SEQ ID NO：14中。由于它们与SEQ ID NO：5的同源性高于95％，它们落入本发明的片段或同系物的定义内。

另一方面是包含SEQ ID NO：6或7氨基酸序列的rIdeSsuis蛋白，或与SEQ ID NO：6或7的蛋白IdeSsuis的氨基酸序列至少60％，优选70％、85％或95％同源的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是用载体转染宿主细胞。

本发明的另一个目的是生产定义为rIdeSsuis的蛋白质的方法，该蛋白在载体或不同生物体中作为客体抗原，宿主细胞在适于表达所述重组蛋白的条件下分别被转染。

本发明的另一方面是识别上述定义的IdeSsuis或rIdeSsuis蛋白、类似物或片段的抗体。

该抗体优选选自由多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体和合成抗体组成的组。

术语“抗体”在本文中用于完整的抗体以及具有选择性结合表位的一定能力的抗体片段。这样的片段包括但不限于Fab、F(ab')₂和Fv抗体片段。术语“表位”是指抗原的任何抗原决定簇，抗体的互补位可以结合到抗原决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖残基)组成，并且通常显示三维结构以及特定的物理性质。

根据本发明的抗体可以根据任何已知的程序生产。例如，根据本发明的纯的完整的IdeSsuis或rIdeSsuis蛋白或其片段/类似物可以生产并用作免疫原，以免疫动物并产生特异性抗体。

多克隆抗体的生产是公知的。详细的方案可以在例如Green等人在《免疫化学方案》(Manson，编辑)，第1-5页(胡马纳出版社1992)发表的《生产多克隆抗血清》(Productionof Polyclonal Antisera,in Immunochemical Protocols(Manson,editor),pages 1-5(Humana Press1992))和Coligan等人在《免疫学中的现行方案》，第2.4.1节(1992)发表的《在兔、大鼠、小鼠和仓鼠中生产多克隆抗血清》(Production of Polyclonal Antisera inRabbits,Rats,Mice and Hamsters,in Current Protocols In Immunology,section2.4.1(1992))中找到。此外，专家熟悉关于多克隆抗体以及单克隆抗体的纯化和浓缩的几种技术(Coligan等人，第9单元，《免疫学中的流行方案》，《威利跨学科》，1994(CurrentProtocols in Immunology,Wiley Interscience,1994))。

单克隆抗体的生产是众所周知的。实例包括杂交瘤方法(Kohler和Milstein，1975，《自然》，256：495-497，Coligan等，第2.5.1-2.6.7节；和Harlow等，《抗体：实验室手册》，第726页(冷泉港出版，1988))，三体瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，《今日免疫》，4:72)和EBV杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole等，1985，《单克隆抗体与癌症治疗》，Alan R.Liss，Inc.，第77-96页)。

简而言之，单克隆抗体可以通过将含有根据本发明的蛋白质的混合物注射到小鼠中来获得。通过血清探针检查在小鼠中产生的抗体。在足够的抗体滴度情况下，处死小鼠，并取出脾脏以分离B细胞。将B细胞与骨髓瘤细胞融合，得到杂交瘤。克隆杂交瘤并分析克隆。选出含有针对该蛋白的单克隆抗体的阳性克隆，并从杂交瘤培养物中分离抗体。有许多成熟的技术来分离和纯化单克隆抗体。这样的技术包括使用蛋白A琼脂糖的亲和色谱、尺寸排阻色谱和离子交换色谱。还参见例如Coligan等，《分子生物学方法》，第10卷，第79-104页(胡马纳出版社1992)中的第2.7.1-2.7.12节和“免疫球蛋白G(IgG)”部分(Coligan etal.,section 2.7.1–2.7.12and section“Immunglobulin G(IgG)”,in Methods InMolecular Biology,volume 10,pages 79–104(Humana Press 1992))。

优选地，本发明提供人源化的IdeSsuis或rIdeSsuis特异性小鼠抗体。

上述抗体可以形成用于治疗性治疗患有猪链球菌感染的人或动物(猪)患者的胃肠外组合物的一部分。然而，其也可以用于预防目的。

另一方面，本发明涉及如上文所公开的蛋白质用于生产上面描述的抗体的用途。

本发明的另一个目的是根据本发明的疫苗或胃肠外组合物的用途，以对猪中猪链球菌感染预防性或间免性(metaphylactic)或治疗性治疗。本文进一步考虑使用本发明的疫苗或胃肠外组合物用于在人类患者中预防或间免或治疗性治疗猪链球菌感染。

根据本发明特别优选的是疫苗组合物的用途，其中所述治疗在猪中引起免疫响应，而免疫响应是针对由猪链球菌产生的蛋白IdeSsuis的体液和细胞响应的激活。

治疗(疫苗接种)包括至少一次或两次免疫。每猪/人施用的总剂量为约0.05-2.0mg蛋白质。

根据本发明的疫苗组合物的制备在本领域是已知的，并且描述在本领域技术人员已知的手册中。为了生产根据本发明的疫苗组合物，可以使用药学上可接受的载体、稀释剂或佐剂，包括但不限于以下：矿物盐佐剂(例如铝-、钙-、铁-、锆-基)、张力活性佐剂(例如Quil A、QS-21、其它皂苷)、细菌衍生的佐剂(例如，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(MDP)、脂多糖(LPS)、单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)、DNA、CpGs、细菌毒素)、佐剂乳剂(例如FIA、Montanide、Adjuvant 65、Lipovant)、脂质体佐剂、聚合佐剂和载体、细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、碳水化合物佐剂，活的抗原传递系统(例如细菌、病毒)。此外，载体还可以包含干制剂，例如由钛或聚合物制成的包衣贴剂。用于本申请疫苗的配制和施用的技术也可以在“Remington,The Science and Practice of Pharmacy”，第22版中找到。

因此，本发明涉及疫苗组合物，其包含被称为IdeSsuis或rIdeSsuis的蛋白质或其任一者的片段；或表达蛋白IdeSsuis或rIdeSsuis或其任一者的片段的多核苷酸，该多核苷酸整合到表达载体中，而重组蛋白是优选的。

发明人检测到以下内容：

(a)调理抗体的诱导对于猪链球菌菌苗的保护功效是至关重要的。

(b)IdeSsuis促进猪链球菌在接种疫苗的仔猪血液中的存活。

此外，本发明人表明，使用单独的蛋白质rIdeSsuis作为唯一抗原的猪疫苗接种对感染了猪链球菌的猪提供了保护。根据本发明，用rIdeSsuis接种，通过诱导中和抗体防止了猪链球菌的IdeSsuis IgM蛋白酶切割IgM。

根据本发明，与恢复期或猪链球菌菌苗免疫的仔猪相比，用重组蛋白rIdeSsuis或其片段接种猪导致具有中和活性的IdeSsuis特异性IgG抗体的高滴度。此外，根据实施例1，已经显示，rIdeSsuis比现有技术的菌苗疫苗提供了更高的抗猪链球菌免疫力。

此外，本发明人表明，用重组蛋白质rIdeSsuis或其类似物或片段接种猪降低了猪链球菌在血液中的存活。

如上所述，本发明的一个重要方面在于令人惊讶的见解，即如上所定义的蛋白质、核酸和它们的类似物和片段可以用作提供抗猪链球菌感染的唯一免疫原性试剂。不需要其它活性成分，例如现有技术中使用的菌苗等。这得到实施例2中提供的实验证据的支持。据显示，根据本发明的疫苗相对于安慰剂/对照疫苗具有明显增强的功效，参见实施例2的试验1和2的杀菌测定(bactericidal assay)数据(图3和4)。从实验结果可以得出的结论如下：

·rIdeSsuis(SEQ ID NO：2)提供跨猪链球菌不同血清型的免疫保护，

·至少含有高度保守的Mac-1结构域(SEQ ID NO：5)的蛋白质足以提供免疫保护，

·另外，至少含有高度保守的Mac-1结构域(SEQ ID NO：5)的其它血清型的IdeSsuis蛋白诱导了保护，即使它们在该结构域外部的总体序列不同于血清型2菌株的序列(即使某些序列区段完全缺失)。

根据本发明，蛋白IdeSsuis或rIdeSsuis或其类似物/片段也可用于融合蛋白。融合蛋白通过连接两个或多个最初编码单独蛋白质的基因而产生。该融合基因的翻译导致具有衍生自最初蛋白质的每个功能的单个或多个多肽。在现有技术中，融合蛋白经常用于简化特定应用，例如目标蛋白的检测、整合或转运。通过荧光显微镜检测的突出成员是与目标蛋白融合的绿色荧光蛋白(GFP)。

可以与IdeSsuis融合以改善抗原的传递和免疫原性的其他蛋白质是免疫球蛋白FC片段、无毒的霍乱毒素CTA亚基、突变的热不稳定毒素、枯草芽孢杆菌孢子外壳蛋白或细菌鞭毛蛋白。此外，可以使用与病毒或噬菌体(例如经修饰的痘苗病毒安卡拉(MVA)、乙型肝炎病毒、λ噬菌体或丝状噬菌体如fd、M13或fI)的蛋白质融合的蛋白在病毒颗粒或病毒样颗粒表面上表达IdeSsuis。

检测融合蛋白的另一种可能性是使用所谓的蛋白标记，蛋白标记通常在融合蛋白的生产过程中使用，分别通过亲和色谱、免疫印迹、免疫组织化学或荧光显微镜进行纯化和检测。蛋白标记通常是短的氨基酸序列，例如HIS-标记、myc-标记、HA-标记、Step-标记、GST-标记、麦芽糖结合蛋白标记或硫氧还蛋白标记。

根据本发明用于生产重组蛋白例如rIdeSsuis、其片段或类似物的方法是本领域技术人员已知的，并且还通过本领域技术人员已知的手册来描述。通常，用编码目标蛋白的载体转染宿主细胞以生产重组蛋白。通常，那些宿主细胞可以是细菌(例如大肠杆菌、芽孢杆菌或乳球菌菌株)、人(例如293-T，HEK-293)、小鼠细胞系、昆虫细胞系、酵母细胞或基于植物的系统。

对于宿主细胞的转染，可以使用表达载体如质粒(例如pET、pQE)、病毒和噬菌体(例如杆状病毒、λ噬菌体或丝状噬菌体)。

通常的疫苗或胃肠外组合物制备为注射剂，无论是液体溶液还是悬浮液。

本发明的主题也是用于皮下、静脉内、肌内、皮肤或粘膜应用的疫苗或胃肠外组合物。

本发明的疫苗用于猪或人中猪链球菌感染的预防性或间免性或治疗性治疗。治疗包括至少一次，优选两次免疫。虽然在实践中一次单一免疫是优选的，但标准免疫通常包括初免-加强方案，即2次不同的接种。加强接种通常在初次免疫接种后1-3周，优选约2周的时间范围内给予。单次接种的剂量可以相同或不同，但优选两次的疫苗剂量相同。

必须给予动物或人类患者的总剂量是约0.05-2.0mg前文定义的IdeSsuis或rIdeSsuis蛋白质、类似物或片段。优选的剂量包括0.1-1.0，更优选约0.5mg。如果一次单独接种就足够，则该剂量以一个剂量施用。如果应用多于一次的疫苗接种，则将总剂量分成几个相等的子剂量，例如，如果使用两次接种，则接种的单次剂量为约0.025-1.0mg蛋白质。

附图说明

本发明参考以下附图进一步描述，其中

图1示出了表示猪中猪链球菌接种攻击实验的时间表，

图2示出了表示图1的接种攻击实验获得的结果的图，

图3显示了包括用安慰剂接种相对于用rIdeSsuis接种的杀菌测定图，以及

图4描绘了包括用rIdeSsuis或rIdeSsuis类似物接种相对于对照组的杀菌测定图。

此外，序列表附于本说明书。

SEQ ID NO：1示出了蛋白IdeSsuis的氨基酸序列；

SEQ ID NO：2示出了无信号肽的重组蛋白rIdeSsuis的氨基酸序列；

SEQ ID NO：3示出了编码IdeSsuis的核苷酸序列以及

SEQ ID NO：4示出了编码rIdeSsuis的核苷酸序列。

SEQ ID NO：5示出了IdeSsuis的Mac-1结构域的高度保守部分的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6示出rIdeSsuis的类似物rIdeSsuis_同系物的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7示出了rIdeSsuis类似物rIdeSsuisB2的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8示出了编码rIdeSsuis类似物rIdeSsuis_同系物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：9示出了编码rIdeSsuis类似物rIdeSsuisB2的核苷酸序列。

SEQ ID NO：10示出了WP_044671938的91至425氨基酸的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11示出了WP_002935529的91至425氨基酸的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12示出了WP_015647040的92至426氨基酸的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13示出了WP_023370787的92至426氨基酸的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14示出了WP_044678723的92至426氨基酸的氨基酸序列。

具体实施方式

以下实施例将解释本发明。这些实施例应理解为仅作为本发明的一个优选实施方案。这并不意味着本发明限制在给定实施例的范围内。

实施例1

以下实施例提供了在被猪链球菌感染的仔猪中进行接种攻击实验后的实验数据。

在不同猪链球菌血清型(血清型2和9)和感染途径(静脉内和鼻内)的仔猪中建立接种攻击实验。

简要地如图1所示，用rIdeSsuis疫苗初次接种5周龄的仔猪。在7周龄时，用rIdeSsuis加强接种这些仔猪，并且在一组中还通过肌内注射初次接种菌苗(在图1的表中给出)。一组仔猪仅在7周龄时用菌苗初次接种，最后一组动物用由缓冲液和佐剂组成的安慰剂接种两次。在第二次免疫后两周，对仔猪进行鼻内攻击。每8小时进一步监控动物。出于动物福利的原因，在仔猪表现出高热与冷漠和厌食症的结合的任何情况下，以及在急性多关节炎或严重脑膜炎的临床症状的情况下，动物被安乐死。

所有存活的仔猪在感染后14天处死。

实验表明，通过使用重组蛋白rIdeSsuis自身对仔猪进行免疫，足以保护仔猪免受猪链球菌血清型2的感染(图2)。

实施例2

在该实施例中，已经使用杀菌测定来评价给定疫苗的有效性。该测试涉及将某种血清型的猪链球菌细菌添加到测试动物的血液后确定其存活。如果在该测试动物的血液中存在针对某种血清型的保护性抗体，那么细菌将在2小时的孵育时间内有效地被杀死。保护程度被称为“存活因子”(SF)，并且是将细菌加入到测试动物的血液120分钟后的菌落计数与将细菌加入到测试动物的血液之后直接的菌落计数的比率。低存活因子意味着高效杀死血液中的细菌，并因此有效保护测试动物。

通过在LB肉汤加氨苄青霉素中培养适当的菌株，进行重组IdeSsuis(SEQ ID NO：2)、重组IdeSsuisB2(SEQ ID NO：7)和重组IdeSsuis_同系物(SEQ ID NO：6)的表达和纯化。通过加入IPTG诱导蛋白表达。如制造商(Macherey-Nagel)所推荐，在自然条件下通过Ni²⁺-次氮基三乙酸亲和色谱进行重组蛋白的纯化。

仔猪的免疫：将仔猪用含有0.25mg rIdeSsuis或0.25mg rIdeSsuisB2或0.5mgrIdeSsuis_同系物(含有20％[vol/vol]Emulsigen作为佐剂)的1.5ml疫苗进行初免和加强免疫接种。

试验1：

两窝或四窝同窝仔随机分成两个试验组(n＝9/组)，组1对照(安慰剂)，组2用rIdeSsuis(SEQ ID NO：2)免疫。根据以下测试方案对动物进行免疫和测试：

图3示出了达到的结果。

对照组(安慰剂)比接种组显示比高得多的存活因子。含有血清型2菌株的IdeSsuis蛋白质的完整序列的重组抗原rIdeSsuis(接种组)(SEQ ID NO：2)诱导产生高效杀死菌株2以及菌株9的猪链球菌细菌的抗体。

试验2：

将4窝同窝仔随机分配到四个试验组(n＝6/组，除了组4，其n＝5)，组1对照(未免疫)，组2用rIdeSsuis_同系物(SEQ ID NO：6)免疫，组3用来源于血清型7菌株(rIdeSsuisB2；SEQ ID NO：7)的IdeSsuis免疫，组4用SEQ ID NO：2免疫。根据以下测试方案免疫并测试动物：

图4示出了达到的结果。

结果显示，对照组(组1)中的存活因子显著高于三个接种组。仅含有包含高度保守的Mac-1结构域(IgM-蛋白酶-结构域)的N-末端片段的重组抗原rIdeSsuis_同系物(组2)，诱导了与对照组相比导致细菌杀灭好得多的抗体。组2的结果可以与组4获得的结果相比。含有猪链球菌血清型2菌株的成熟IdeSsuis蛋白的完整氨基酸序列的抗原rIdeSsuis，也诱导了显着降低猪链球菌血清型9菌株在血液中的存活的抗体。血清型9菌株的存活甚至被已经由抗原rIdeSsuisB2诱导的抗体进一步损害(组3)。

rIdeSsuisB2(SEQ ID NO：7)含有猪链球菌血清型7菌株的成熟IdeSsuis蛋白的完整氨基酸序列，并且在蛋白质的C末端半部分不同，因为其与SEQ ID NO：1相比缺少114aa的序列。SEQ ID NO：7的Aa 80至414(所谓的Mac-1结构域的高度保守部分)对应于SEQ ID NO：5的序列的97.9％。SEQ ID NO：7的剩余C-末端部分和SEQ ID NO：1之间的一致性是96.4％。

从实验结果可以得出的结论如下：

·rIdeSsuis(SEQ ID NO：2)提供了跨猪链球菌不同血清型的免疫保护，

·至少含有高度保守的Mac-1结构域的氨基酸足以提供免疫保护，

·此外，至少含有高度保守的Mac-1结构域的其他血清型的IdeSsuis蛋白诱导了保护，即使它们的结构域外部的总体序列与血清型2菌株的不同(即使某些序列区段完全缺失)。

序列表

<110> 诗华动物保健公司

<120> 抗猪链球菌感染的疫苗组合物

<130> P37819-WO

<150> EP14170637.4

<151> 2014-05-30

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1141

<212> PRT

<213> 猪链球菌

<400> 1

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<211> 1130

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<213> 人工

<220>

<223> rIdeSsuis

<400> 2

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Asp Asp Lys Ser Pro Asp Pro Val Val Thr Gly Val Asn Glu Ile Ile

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Glu Glu Ser Gln Val Lys Asp Glu Val Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asn

35 40 45

Glu Ser Leu Asp Gly Ser Asn Ile Glu Ile Val Glu Glu Ile Ala Asp

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tctaagaggg acacgaatgc agaagtagaa gtttcttcat tatcgaaaag agaggttaga 2940

aaaacaaata ctgacgggct aatctctgtt caatcaaaag ttattaagaa agaattgcta 3000

gaatcaagct tagcagaagc agggtctcca ttgctagaag ccaccattgc tcagtcttca 3060

aactcaaata gtactgagat aggtatgagc tatcagaata ctgtgttatt agagtctaat 3120

aatacagagc gtcaggtgtc taaagcagaa attgttatgg aacacaagga gacagagtta 3180

gttgaaacgg tttcatctgc ttctgagcct gtagtgctcg tagaaaatat ctcacaaacc 3240

tcaaataata ctattgaatc tggtaagaat atgggagttc aatctcaagc aggtgcaaaa 3300

caaattttag gcgtagaaca atcttcgaaa gtaagtacac ctacttcaag acagattatg 3360

ggagtcggtc tattgactct tgttcttggt agtgctttag gtttgttaaa gaaaagacgt 3420

aagtaa 3426

<210> 4

<211> 3393

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 编码rIdeSsuis的核苷酸序列

<400> 4

atggcacatc accaccacca tcacgtgggt accggttcga atgatgacga cgacaagagt 60

ccggatccag ttgttacagg agtgaatgaa ataattgaag aatcacaagt caaggatgag 120

gtatctattg aatcagaaaa aaatgaatcc ctagatggtt ctaatattga aattgtagag 180

gaaatagcag acaacatccc atcacctgtt atcgctgaag gggaagtagc ggtagagatg 240

aaagttgaca gagggaccga gaatgtagtt tctagaaatg atacagaagt tacgacgagc 300

gagcaaaatc agatagaggt tactgagaca aaagaaattt tgaatcagac cagttatcaa 360

acggagagtg gcgagcaacg acaaattata tgggcccatg gaattactcc tcctgcaatg 420

gaacaaagcg gtggttttgt aaaggaaaag tatggagact atttaaacta tacagcgcca 480

tttgaggctg gaaaaggcta ctatgatacc aataagagtc tgaatgcttc atttattgac 540

cttaatcttt gttttgcagc tgtgtcttca aacatggtac attggtggtt ggaacagaat 600

agttcctatg ttgagcgata tctcaaagaa aaaaagggta cagtaaatgt tgaagaaaac 660

tacgcaataa cggacttacg gcgctatatt aattcattcc aaaatcaaca aaatagtcga 720

gtttttgata tgttcaaaac ttactatggt tatcgtacaa atggttttgt atcagatgcc 780

ttggttgact tgtttattaa cggatataaa cctaaggcac agggcggtgt caatctggaa 840

gatagccagt tagtaccaga tagtaggggt ggctttttct acgacgtttt caaagagaaa 900

aaactgacaa atcgaatttt tagtggtagt tatgagcggt ttggtgagga tgttcgaact 960

gttttggaaa gcaaaggatt actcggctta acttatagaa cattaggtta tgcaacgcat 1020

attgtgacgg tatggggtgc tgagtacgac aatcaaggta agattaaggc tgtctatatc 1080

acagattctg atgatcaaca agaacaaatt ggtttgaagc gtatgggaat cactcgtgat 1140

gcttccggaa atccacgttt gaataatcat atgaaaaata attcagctgg agcgcttttg 1200

gattatgtcc atacaatccg tctgggtcaa gacttatggg aagaatattt caatccgctt 1260

gcaaaagcca aagaaacagc tagtcagaca ttagccgata caaagaaggc gttggatttg 1320

tctattcaag gacaatctga attgccagaa tcaatgcgac tgatttatct tgaaaaacta 1380

aataatctct ataatcaagg aattctatct attcaaaagg cagaaagttc tgagatgcta 1440

agtggtgcat tggaaaatgg tttaaatagt ttaaagagtt tagattttcc tatttcagaa 1500

gttggaaatg ctttggcacc agatttacca gtaggtgatc gctcaacggt ttcagatgtt 1560

gattctctat catctcaaga aacaagttcc acaaatttgg aagcagacac agagaatgca 1620

ggtattattg cagatggtac caatcaattg cattttccag tggaggccca aacgacatct 1680

tcagtagagg ctgagggaga taatgttttt gaacaagagg cagatacatt accaataatt 1740

attgaaaaca aggatgaatt tggttcagaa ctatcaagaa acatgcaaac gtcagaaacg 1800

gattcgctag tagtagctgt tgaagaagat gtgaaaaatg atgaggtagc ccaagttgaa 1860

gagcttcttg aatcagaaaa agttgaaaat cagagttcgg aacttctgtc agacacccta 1920

atcgtagaga gtgcaaatga caaagaagaa gatagagtgg aggcggttgt ttctgaacaa 1980

ccagactcaa taccacatca aaatgtagaa atctctcttg tagaaccaac gaatgtcgaa 2040

actgaaactg tggtcactcc tattaatgat gcagctactc ctcatggttc cccgacgtat 2100

atagataatt ccgtaactga atctgtagct actccacttg aaaaagactc cattcaagcc 2160

ggggagacag agattgcaga accaacctcg agcgaatcaa cgaatgtcga aactgaaact 2220

gtggtcactc ctgttaatga tgtagctact cctcatggtt ccccgacgta tatagataat 2280

tccgtaactg aatctgtagc tactccactt gaaaaagact ccattcaagc cggagagaca 2340

gaaattgcag aaccaacctc gagcgaatca acgaatgtcg aaactgaaac tgtggtcact 2400

cctgttaatg atgtagctac tcctcatggt tccccgacgt atatagataa ttccgtaact 2460

gaatctgtag ctactccact tgaaaaagac tccattcaag ccggggagac agagattgca 2520

gaaccaacct cgagcgaatc aactagtgtt gaagctgaac ttgtcgacaa ttctgaaatt 2580

catgcagcta cctcttcagt tactccctgt ggctcctcgg catatgcaga tggttccaca 2640

actgaatctg tagccactcc gcttgaaaaa gactccattc agactggaaa tacagaaatt 2700

gcagaaccaa cctcgagcaa atcaactaat gtagaagctg catctgtcga caattctgaa 2760

attcatgcag atgcctctct aactgctgtt tcatcagtta atctggataa tccagtgatt 2820

gaaccagtag ctatctccct tatcggttct aagagggaca cgaatgcaga agtagaagtt 2880

tcttcattat cgaaaagaga ggttagaaaa acaaatactg acgggctaat ctctgttcaa 2940

tcaaaagtta ttaagaaaga attgctagaa tcaagcttag cagaagcagg gtctccattg 3000

ctagaagcca ccattgctca gtcttcaaac tcaaatagta ctgagatagg tatgagctat 3060

cagaatactg tgttattaga gtctaataat acagagcgtc aggtgtctaa agcagaaatt 3120

gttatggaac acaaggagac agagttagtt gaaacggttt catctgcttc tgagcctgta 3180

gtgctcgtag aaaatatctc acaaacctca aataatacta ttgaatctgg taagaatatg 3240

ggagttcaat ctcaagcagg tgcaaaacaa attttaggcg tagaacaatc ttcgaaagta 3300

agtacaccta cttcaagaca gattatggga gtcggtctat tgactcttgt tcttggtagt 3360

gctttaggtt tgttaaagaa aagacgtaag taa 3393

<210> 5

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> Mac-1结构域的部分序列

<400> 5

Met Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr

1 5 10 15

Glu Val Thr Thr Ser Glu Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys

20 25 30

Glu Ile Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg

35 40 45

Gln Ile Ile Trp Ala His Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser

50 55 60

Gly Gly Phe Val Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala

65 70 75 80

Pro Phe Glu Ala Gly Lys Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn

85 90 95

Ala Ser Phe Ile Asp Leu Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn

100 105 110

Met Val His Trp Trp Leu Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr

115 120 125

Leu Lys Glu Lys Lys Gly Thr Val Asn Val Glu Glu Asn Tyr Ala Ile

130 135 140

Thr Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Ser Phe Gln Asn Gln Gln Asn Ser

145 150 155 160

Arg Val Phe Asp Met Phe Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly

165 170 175

Phe Val Ser Asp Ala Leu Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro

180 185 190

Lys Ala Gln Gly Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp

195 200 205

Ser Arg Gly Gly Phe Phe Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr

210 215 220

Asn Arg Ile Phe Ser Gly Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg

225 230 235 240

Thr Val Leu Glu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu

245 250 255

Gly Tyr Ala Thr His Ile Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn

260 265 270

Gln Gly Lys Ile Lys Ala Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln

275 280 285

Glu Gln Ile Gly Leu Lys Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly

290 295 300

Asn Pro Arg Leu Asn Asn His Met Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu

305 310 315 320

Leu Asp Tyr Val His Thr Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu

325 330 335

<210> 6

<211> 457

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> rIdeSsuis_同系物

<400> 6

Met Ala His His His His His His Val Gly Thr Gly Ser Asn Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Lys Ser Pro Asp Pro Val Val Thr Gly Val Asn Glu Ile Ile

20 25 30

Glu Glu Ser Gln Val Lys Asp Glu Val Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asn

35 40 45

Glu Ser Leu Asp Gly Ser Asn Ile Glu Ile Val Glu Glu Ile Ala Asp

50 55 60

Asn Ile Pro Ser Pro Val Ile Ala Glu Gly Glu Val Ala Val Glu Met

65 70 75 80

Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr Glu

85 90 95

Val Thr Thr Ser Glu Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Ile Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg Gln

115 120 125

Ile Ile Trp Ala His Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser Gly

130 135 140

Gly Phe Val Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala Pro

145 150 155 160

Phe Glu Ala Gly Lys Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn Ala

165 170 175

Ser Phe Ile Asp Leu Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn Met

180 185 190

Val His Trp Trp Leu Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr Leu

195 200 205

Lys Glu Lys Lys Gly Thr Val Asn Val Glu Glu Asn Tyr Ala Ile Thr

210 215 220

Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asn Ser Phe Gln Asn Gln Gln Asn Ser Arg

225 230 235 240

Val Phe Asp Met Phe Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly Phe

245 250 255

Val Ser Asp Ala Leu Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro Lys

260 265 270

Ala Gln Gly Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp Ser

275 280 285

Arg Gly Gly Phe Phe Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr Asn

290 295 300

Arg Ile Phe Ser Gly Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg Thr

305 310 315 320

Val Leu Glu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu Gly

325 330 335

Tyr Ala Thr His Ile Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Gln

340 345 350

Gly Lys Ile Lys Ala Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln Glu

355 360 365

Gln Ile Gly Leu Lys Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly Asn

370 375 380

Pro Arg Leu Asn Asn His Met Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu Leu

385 390 395 400

Asp Tyr Val His Thr Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu Glu Tyr

405 410 415

Phe Asn Pro Leu Ala Lys Ala Cys Arg Ser Thr Ser Leu Arg Pro His

420 425 430

Ser Ser Leu Val Lys Lys Pro Leu Leu Arg Asn Leu Asn Ala Ser Thr

435 440 445

Trp Thr Arg Leu Leu Ala Gln Leu Asn

450 455

<210> 7

<211> 1016

<212> PRT

<213> 人工

<220>

<223> rIdeSsuisB2

<400> 7

Met Ala His His His His His His Val Gly Thr Gly Ser Asn Asp Asp

1 5 10 15

Asp Asp Lys Ser Pro Asp Pro Val Val Thr Gly Val Asn Glu Ile Ile

20 25 30

Glu Glu Ser Gln Val Lys Asp Glu Val Ser Ile Glu Ser Glu Lys Asn

35 40 45

Glu Ser Leu Asp Gly Ser Asn Ile Glu Ile Val Glu Glu Ile Ala Asp

50 55 60

Asn Ile Pro Ser Pro Val Ile Ala Glu Gly Glu Val Ala Val Glu Met

65 70 75 80

Lys Val Asp Arg Gly Thr Glu Asn Val Val Ser Arg Asn Asp Thr Glu

85 90 95

Val Thr Thr Ser Glu Gln Asn Gln Ile Glu Val Thr Glu Thr Lys Glu

100 105 110

Ile Leu Asn Gln Thr Ser Tyr Gln Thr Glu Ser Gly Glu Gln Arg Gln

115 120 125

Ile Ile Trp Ala His Gly Ile Thr Pro Pro Ala Met Glu Gln Ser Gly

130 135 140

Gly Phe Val Lys Glu Lys Tyr Gly Asp Tyr Leu Asn Tyr Thr Ala Pro

145 150 155 160

Phe Lys Ala Gly Lys Gly Tyr Tyr Asp Thr Asn Lys Ser Leu Asn Ala

165 170 175

Ser Phe Ile Asp Leu Asn Leu Cys Phe Ala Ala Val Ser Ser Asn Met

180 185 190

Val His Trp Trp Leu Glu Gln Asn Ser Ser Tyr Val Glu Arg Tyr Leu

195 200 205

Lys Glu Lys Lys Gly Thr Val Asn Val Gly Glu Asn Tyr Ala Ile Thr

210 215 220

Asp Leu Arg Arg Tyr Ile Asp Ser Phe Gln Asp Gln Gln Asn Ser Arg

225 230 235 240

Val Phe Asp Met Phe Lys Thr Tyr Tyr Gly Tyr Arg Thr Asn Gly Phe

245 250 255

Val Ser Asp Ala Leu Val Asp Leu Phe Ile Asn Gly Tyr Lys Pro Lys

260 265 270

Val Gln Gly Gly Val Asn Leu Glu Asp Ser Gln Leu Val Pro Asp Ser

275 280 285

Arg Gly Gly Phe Phe Tyr Asp Val Phe Lys Glu Lys Lys Leu Thr Asn

290 295 300

Arg Ile Phe Ser Gly Ser Tyr Glu Arg Phe Gly Glu Asp Val Arg Thr

305 310 315 320

Val Leu Glu Ser Lys Gly Leu Leu Gly Leu Thr Tyr Arg Thr Leu Gly

325 330 335

Tyr Ala Thr His Ile Val Thr Val Trp Gly Ala Glu Tyr Asp Asn Gln

340 345 350

Gly Lys Ile Arg Ala Val Tyr Ile Thr Asp Ser Asp Asp Gln Gln Glu

355 360 365

Gln Ile Gly Leu Lys Arg Met Gly Ile Thr Arg Asp Ala Ser Gly Asn

370 375 380

Pro Arg Leu Asn Asn His Val Lys Asn Asn Ser Ala Gly Ala Leu Leu

385 390 395 400

Asp Tyr Val His Thr Ile Arg Leu Gly Gln Asp Leu Trp Glu Glu Tyr

405 410 415

Phe Asn Pro Phe Ala Lys Ala Lys Glu Ile Ala Ser Gln Ile Leu Ala

420 425 430

Asp Arg Lys Lys Ala Leu Val Leu Ser Ile Gln Gly Gln Ser Glu Leu

435 440 445

Pro Glu Ser Met Arg Leu Ile Tyr Leu Glu Lys Leu Asn Asn Leu Tyr

450 455 460

Asn Gln Gly Ile Leu Ser Ile Gln Lys Thr Glu Ser Ser Glu Met Leu

465 470 475 480

Ser Gly Ala Leu Glu Asn Gly Leu Asn Ser Leu Lys Ser Leu Asp Phe

485 490 495

Pro Ile Ser Glu Val Gly Asn Ala Leu Ala Pro Asp Leu Ser Val Gly

500 505 510

Asp Arg Ser Thr Val Ser Asp Val Asp Ser Leu Ser Ser Gln Glu Thr

515 520 525

Ser Ser Thr Asn Leu Glu Ala Asp Thr Glu Asn Ala Gly Ile Ile Ala

530 535 540

Asp Gly Thr Asn Gln Leu His Phe Pro Val Glu Ala Gln Thr Thr Ser

545 550 555 560

Ser Val Glu Ala Glu Gly Asp Asn Val Phe Glu Gln Glu Ala Asp Thr

565 570 575

Leu Pro Ile Ile Ile Glu Asn Lys Asp Glu Phe Gly Ser Glu Leu Ser

580 585 590

Gly Asn Met Gln Thr Ser Glu Thr Asp Ser Leu Val Val Ala Val Glu

595 600 605

Glu Asp Val Lys Asn Asp Glu Val Asp Gln Val Glu Lys Leu Leu Glu

610 615 620

Ser Glu Lys Val Glu Asn Gln Ser Ser Glu Leu Leu Ser Asp Thr Leu

625 630 635 640

Ile Val Glu Gly Ala Asn Asp Lys Glu Glu Asp Arg Val Glu Ala Val

645 650 655

Val Ser Glu Gln Pro Asp Ser Ile Pro His Gln Asn Val Glu Ile Ser

660 665 670

Pro Val Glu Pro Met Asn Val Glu Thr Glu Ser Val Val Thr Pro Ile

675 680 685

Asn Asp Ala Ala Thr Pro His Gly Phe Pro Met Tyr Ile Asp Asn Ser

690 695 700

Val Thr Glu Ser Val Ala Thr Pro Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala

705 710 715 720

Gly Glu Thr Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Glu Ser Thr Ser Val

725 730 735

Glu Ala Glu Leu Val Asp Asn Ser Glu Ile His Ser Ala Thr Ser Ser

740 745 750

Val Thr Pro Arg Gly Ser Ser Ala Tyr Ala Asp Ser Ser Thr Thr Glu

755 760 765

Ser Val Ala Thr Leu Leu Glu Lys Asp Ser Ile Gln Ala Gly Glu Thr

770 775 780

Glu Ile Ala Glu Pro Thr Ser Ser Lys Ser Thr Asn Val Glu Ala Ala

785 790 795 800

Ser Val Asp Asn Ser Glu Ile His Ala Asp Thr Ser Leu Thr Ala Val

805 810 815

Ser Ser Val Asn Leu Asp Asn Pro Val Ile Glu Pro Val Ala Ile Pro

820 825 830

Leu Ile Gly Ser Lys Arg Asp Thr Asn Ala Glu Val Glu Val Ser Ser

835 840 845

Leu Ser Lys Arg Glu Val Arg Lys Pro Asn Thr Glu Gly Leu Ile Ser

850 855 860

Val Gln Ser Lys Val Ile Lys Lys Glu Leu Leu Glu Ser Ser Leu Val

865 870 875 880

Glu Ala Gly Ser Pro Leu Leu Glu Ala Thr Ile Ala Gln Ser Ser Asn

885 890 895

Ser Asn Ser Thr Glu Ile Gly Met Ser Tyr Gln Asn Thr Val Leu Leu

900 905 910

Glu Ser Asn Asn Thr Glu Arg Gln Val Ser Lys Ala Glu Ile Val Ile

915 920 925

Glu His Lys Glu Thr Glu Leu Val Glu Thr Val Ser Ser Ala Ser Glu

930 935 940

Pro Val Val Leu Val Glu Asn Ile Ser Gln Thr Ser Asn Asn Thr Ile

945 950 955 960

Glu Ser Gly Lys Asn Met Gly Val Gln Ser Gln Ala Gly Ala Lys Gln

965 970 975

Ile Leu Gly Ile Glu Gln Ser Ser Lys Val Ser Thr Pro Thr Ser Arg

980 985 990

Gln Ile Met Gly Val Gly Leu Leu Thr Leu Val Leu Gly Ser Ala Leu

995 1000 1005

Gly Leu Leu Lys Lys Arg Arg Lys

1010 1015

<210> 8

<211> 1374

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 编码rIdeSsuis_同系物的核苷酸序列

<400> 8

atggcacatc accaccacca tcacgtgggt accggttcga atgatgacga cgacaagagt 60

ccggatccag ttgttacagg agtgaatgaa ataattgaag aatcacaagt caaggatgag 120

gtatctattg aatcagaaaa aaatgaatcc ctagatggtt ctaatattga aattgtagag 180

gaaatagcag acaacatccc atcacctgtt atcgctgaag gggaagtagc ggtagagatg 240

aaagttgaca gagggaccga gaatgtagtt tctagaaatg atacagaagt tacgacgagc 300

gagcaaaatc agatagaggt tactgagaca aaagaaattt tgaatcagac cagttatcaa 360

acggagagtg gcgagcaacg acaaattata tgggcccatg gaattactcc tcctgcaatg 420

gaacaaagcg gtggttttgt aaaggaaaag tatggagact atttaaacta tacagcgcca 480

tttgaggctg gaaaaggcta ctatgatacc aataagagtc tgaatgcttc atttattgac 540

cttaatcttt gttttgcagc tgtgtcttca aacatggtac attggtggtt ggaacagaat 600

agttcctatg ttgagcgata tctcaaagaa aaaaagggta cagtaaatgt tgaagaaaac 660

tacgcaataa cggacttacg gcgctatatt aattcattcc aaaatcaaca aaatagtcga 720

gtttttgata tgttcaaaac ttactatggt tatcgtacaa atggttttgt atcagatgcc 780

ttggttgact tgtttattaa cggatataaa cctaaggcac agggcggtgt caatctggaa 840

gatagccagt tagtaccaga tagtaggggt ggctttttct acgacgtttt caaagagaaa 900

aaactgacaa atcgaatttt tagtggtagt tatgagcggt ttggtgagga tgttcgaact 960

gttttggaaa gcaaaggatt actcggctta acttatagaa cattaggtta tgcaacgcat 1020

attgtgacgg tatggggtgc tgagtacgac aatcaaggta agattaaggc tgtctatatc 1080

acagattctg atgatcaaca agaacaaatt ggtttgaagc gtatgggaat cactcgtgat 1140

gcttccggaa atccacgttt gaataatcat atgaaaaata attcagctgg agcgcttttg 1200

gattatgtcc atacaatccg tctgggtcaa gacttatggg aagaatattt caatccgctt 1260

gcaaaagcct gcaggtcgac aagcttgcgg ccgcactcga gtctggtaaa gaaaccgctg 1320

ctgcgaaatt tgaacgccag cacatggact cgtctactag cgcagcttaa ttaa 1374

<210> 9

<211> 3051

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<223> 编码rIdeSsuisB2的核苷酸序列

<400> 9

atggcacatc accaccacca tcacgtgggt accggttcga atgatgacga cgacaagagt 60

ccggatccag ttgttacagg agtgaatgaa ataattgaag aatcacaagt caaggatgag 120

gtatctattg aatcagaaaa aaatgaatcc ctagatggtt ctaatattga aattgtagag 180

gaaatagcag acaacatccc atcacctgtt atcgctgaag gggaagtagc ggtagagatg 240

aaagttgaca gagggaccga gaatgtagtt tctagaaatg atacagaagt tacgacgagc 300

gagcaaaatc agatagaggt tactgagaca aaagaaattt tgaatcagac cagttatcaa 360

acggagagtg gcgagcaacg acaaattata tgggcccatg gaattactcc tcctgcaatg 420

gaacaaagcg gtggttttgt aaaggaaaag tatggagact atttaaacta tacagcgcca 480

tttaaggcag gaaaaggcta ttatgatacc aataaaagtc tcaatgcttc atttattgac 540

cttaacctat gttttgcagc cgtgtcttcc aacatggtac attggtggtt ggaacagaat 600

agttcctatg ttgagcgata tctcaaagaa aaaaagggta cagtaaatgt tggggaaaac 660

tatgcaataa cggacctacg tcgctatatt gattcgttcc aggatcagca aaatagtcga 720

gtctttgata tgttcaaaac ttactacggt tatcgtacaa atggttttgt gtcagatgcc 780

ctagttgact tgtttattaa tggatataaa cctaaggtac agggtggtgt caatctggaa 840

gatagccagt tagtaccaga tagtaggggt ggctttttct acgacgtttt caaagagaaa 900

aaactgacaa atcgtatttt tagtggtagc tatgagcgtt ttggtgagga tgttcgaact 960

gttttggaga gcaaaggatt actcggtcta acttatagaa cattaggcta tgcaacgcat 1020

attgtgacgg tatggggtgc tgagtacgat aatcaaggta agattagggc tgtctatatc 1080

actgattccg atgatcaaca agaacaaatt ggtttgaagc gtatgggaat cactcgtgat 1140

gcttctggaa atccgcgttt gaataatcat gtgaaaaata attcagctgg ggcgcttttg 1200

gattatgtcc atacaatccg tcttggtcaa gacttatggg aagaatattt caatccgttc 1260

gcaaaagcca aagaaatagc tagtcagata ctagctgata gaaagaaggc gttggttctg 1320

tctattcaag gacaatctga attgccagaa tcaatgcggc tgatttatct tgaaaaacta 1380

aataatctct ataatcaagg gattctatct attcaaaaga cagaaagttc tgagatgcta 1440

agtggtgcat tggaaaatgg tttaaatagt ttaaagagtt tagattttcc tatttcagaa 1500

gttggaaatg ctttggcacc agatttatca gtaggtgatc gctcaacggt ttcagatgtt 1560

gattctctat catctcaaga aacaagttcc acaaatttgg aagcagacac agagaatgca 1620

ggtattattg cagatggtac caatcaattg cattttccag tggaggccca aacgacatct 1680

tcagtagagg ctgagggaga taatgttttt gaacaagagg cagatacatt accaataatt 1740

attgaaaaca aggatgaatt tggttcagaa ctatcaggaa acatgcaaac gtcagaaacg 1800

gattcgctag tagtagctgt tgaagaagat gtgaaaaatg atgaggtaga ccaagttgaa 1860

aagcttcttg aatcagaaaa agttgaaaat cagagttcgg aacttctgtc agacacccta 1920

atcgtagagg gtgcaaatga caaagaagaa gatagagtgg aggcggttgt ttctgaacaa 1980

ccagactcaa taccacatca aaatgtagaa atctctcctg tagaaccaat gaatgtcgaa 2040

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atagataatt ccgtaactga atctgtagct actccacttg aaaaagactc cattcaagcc 2160

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<213> 人工

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<400> 12

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Claims (11)

1.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包含有效量的作为类似物的蛋白质，其与SEQ IDNO：1氨基酸序列上缺少从位置1至34的氨基酸的氨基酸序列具有至少95％同源性并包含与SEQ ID NO：5氨基酸序列具有95％同源性的氨基酸序列；和

至少一种药物载体、稀释剂或佐剂。

2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述蛋白质是唯一的活性或免疫原性成分。

3.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，含有总量为约0.05-2mg的蛋白质。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物以生理可给药的形式提供，并且适合于肌内、静脉内、皮下或皮肤注射或粘膜应用。

5.一种抗体，其识别权利要求1所定义的蛋白质。

6.一种胃肠外组合物，其包含权利要求5所述的抗体。

7.权利要求1所定义的蛋白质的用途，所述蛋白质用于生产根据权利要求5所述的抗体。

8.一种宿主细胞，其被编码权利要求1所定义的蛋白质的多核苷酸转染。

9.根据权利要求1-4中任一项所述的疫苗组合物或根据权利要求6所述的肠胃外组合物在猪中的猪链球菌感染的预防性、间免性或治疗性治疗中的用途。

10.根据权利要求9所述的疫苗组合物在猪中的猪链球菌感染的预防性、间免性或治疗性治疗中的用途，其中所述治疗包括至少一次，优选两次免疫。

11.根据权利要求10所述的疫苗组合物在猪中的猪链球菌感染的预防性、间免性或治疗性治疗中的用途，其中每只猪施用的蛋白质的剂量为0.05-2.0mg。

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