JPH05501565A - ワクチン接合体の使用方法、ワクチン調整物および製造品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 処理方法 発明の分野 本発明は、生ウィルスおよび中和抗体または中和抗体のフラグメントから成るワ クチン接合体を被検体に投与することにより、能動免疫を生じさせる方法に関す る。

発明の背景 ガイルス（Ｇｙｌｅｓ）ら、４７．「ボウルトリー・サイエンス」（Ｐｏｕｌｔ ｒｙ　Ｓｃｉ、）Ｊ　４３０　（１９６８）並びにガイルスおよびブラウン（Ｂ ｒｏｗｎ）　、５０．　ｒボウルトリー・サイエンスＪ　、９０１．　（１９７ １）は、ラウス軍鶏肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）誘発性癌腫の再発がアーカンソープ ログレッサ系統およびアーカンソーレグレッサ系統のチキンにおいて遺伝制画下 にあることを見出した。ホイットフイル（Ｗｈｉｔｆｉｌｌ）ら、６１．「ボウ ルトリー・サイエンスＪ　、１５７３　（１９８２）は、ゲル浸透クロマトグラ フィーによりアーカンソーレグレッサチキン血清から低分子量のフラクションを 単離したことを報告した。この活性な低分子量のフラクションは、低分子量ウィ ルス中和因子（ＶＮＦ）と呼ばれた。ホイットフイルら、１７゜「イムノジエネ ティックス（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）」３８７　（１９８３）参照。

ガイルスおよびホイットフィル、［アニュアル・リポート・オブ・プロジェクト ・コントリビューションズ・トウ・ＮＥ−６０（ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｐｏｒｔ　 ｏｆ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ＮＥ−６０）　Ｊ （１９８６年１０月）は、その後、漿尿膜痘疹形成により測定して、生後９日の ５ＰＡＦＡＳ卵胚と共に投与した際、ＶＮＦはラウス家鶏肉腫ウィルスおよびニ ューキャッスル病ウィルスを中和したと報告した。後に、ガイルスおよびホイッ トフィル、［アニュアル・レポート・才ブ・プロジェクト・コントリビュージョ ンズ・トウ・ＮＥ−６０Ｊ　、　（１９８７年ｌＯ月）は、生後９日目の５ＰＡ ＦＡＳ卵胚と共に投与した際、ＶＮＦは伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス（Ｉ ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｂｕｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ　：　ＩＢＤ Ｖ）および伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）を中和し、抗菌活性を有していた と報告した。ＶＮＦかウィルス中和抗体であることは、現在まで示唆されていな い。

ウィルス中和抗体は、ウィルスと抗体とを十分な時間互いに反応させた場合、ウ ィルスの伝染性を中和することかてきる抗体である。かかる方法は、中和試験を 実施する過程の間実施する。中和試験は、血清中のウィルスに対する抗体を検出 するのに用いる第１の手法であるか、実質的に任意のウィルスを用いて実施する ことかできる。一般的に、「ハンドブック・才ブ・エクスピリメンタルイムノロ ジー（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇ Ｙ）Ｊ　、　３７．　９　（Ｄ、　Ｍ、ウアイア（Ｗｅｉｒ）編、第２編、（９ ７３）　（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Ｂｌ ａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ））参照。

Ｎ、フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）、　３３．ヴイラ・アグル（Ｖｉｒａ。

ａｇｒ、ＸＪ、ヴアシントン（Ｖａｓｉｎｇｔｏｎ）ら要約、３９．ボウルトリ ー・サイエンス、１４１８．　百１９　（１９６０）　）は、鳥類におけるニュ ーキャッスル病ウィルスに対する既座のおよび持続的免疫について議論すること を目的として、生ウィルスと共にプラズマおよび卵黄の効果について研究した。

プラズマは病気の生来の突発を免れた鳥から得、卵黄はこれと同一の鳥から生ま れた卵から得た。これらの研究の結果は、プラズマ−卵黄混合物およびウィルス の同時接種を受けた全てのチキン並びに２日後にウィルスを接種されたチキンか 人工接種による攻撃を免れたことを示した。

Ｊ、ヴアシントンら、３９．「ボウルトリー、サイエンス」、１４１８　（＋９ ６０）は、ニューキャッスル病ウィルス免疫性血清およびガンマグロブリンのニ ューキャッスル病ウィルスの攻撃に対する保護価を生後４〜５週間のチキンにお いて試験した。攻撃は、免疫性血清またはガンマグロブリンの投与と同時または 投与後に実施した。ＮＤＶおよびガンマグロブリンの１羽の鳥への同時投与によ り、鳥は死から保護されたか、能動免疫には至らなかったことか見出された。１ ４２４ページ、表４のＩｄおよびこの説明文を参照。ウィルスおよび抗体を複合 体として投与することは提案されていない。

Ｈ，ストーン（５ｔｏｎｅ）およびＷ、ポネー（Ｂｏｎｅｙ）、　１２８．　ｒ Ｐ。

Ｓ、　Ｅ、　Ｂ、　メト（ｍｅｄ、）　Ｊ　５２５　（１９６８）は、生後１〜 ２日のヒヨコのニューキャッスル病ウィルスに対する、抗原−抗体複合体形態の ワクチンを含有する化学的に不活性化されたウィルス抗原、遊離相同抗体および 水酸化アルミニウムアジュバントを含有するワクチンの投与を報告している。抗 原と不活性化されたウィルスとの複合により、攻撃に対するより大きな保護には 至らなかった。アジュバントの使用が結果に対して臨界的であることを示した２ ５８ページのＩｄおよびデータ参照。

Ｄ、ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）１４．　ｒアヴイアン・ディズイーズイス（ａ ｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）Ｊ　、　５７９．５８５　（１９７０）は、ニュ ーキャッスル病ウィルス（、ＮＤＶ）に対する免疫性を有するめんどりからの卵 の卵黄における母性中和抗体の存在がよく知られていることを記録している。ヒ ギンズは、ＮＯＶの卵黄嚢接種の後に形成した抗体−抗原複合体か瞬化前に肝組 織全体に拡散し、未結合の卵黄嚢抗体もまた拡散し、新生児のヒヨコ内に生存し た場合、これは後に能動抗ＮＤＶ免疫を励起させると提案している。ヒギンズは 、中和抗体が生ウィルスと複合してこのウィルスおよび次にワクチンとして投与 された複合体を弱毒化することは提案していない。

ブラット（Ｐｌａｔｔ）らの米国特許第４．４９３．８２５号明細書は、抗体か 免疫化剤に接合し、この抗体か更に抗体に結合した微粒子を有しているような、 免疫化剤から成るワクチン複合体を開示している。病原性微生物、全てのウィル スおよび抗原性タンパク質は免疫化剤として提案されている。本著者は、抗原性 タンパク質の免疫化活性が抗体結合により阻害されると考えられていたため、か かる複合体をワクチンとして用いる可能性は驚異的であると述べている。前記の 場所の第２欄、第１４〜１７行参照。

この著者は、これらのワクチンか微粒子を含まずに使用可能であること、中和抗 体を用いること、病気を発生させることかできる（すなわち病原性の）生ウィル スを用いること、抗体の生ウィルスへの接合により被検体かこの生ウィルスによ る伝染から保護されることおよび、病原性生ウィルスを免疫化剤として用いる際 、中和抗体を用いて病原性生ウィルスによる伝染に対する保護作用を得ることが できることは提案していない。

Ｋ、ファヘイ（Ｆａｈｅｙ）ら、７０．［ジェイ・ゲン・ヴイロル（Ｊ、　Ｇｅ ｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）Ｊ　（１９８９）は、ｒＢＤＶに対するウィルス中和抗体 を開示している。本来モノクローナルであるこの抗体を用いて、構造タンパク質 を可溶化ウィルス球体から分離し、ＩＢＤＶのサブユニットワクチンを感染させ た。ウィルス中和抗体が被検体をＩＢＤＶから保護し、この結合［ＢＤＶをこれ に結合した中和抗体と共に生ワクチンとして投与することができることは提案さ れていない。

発明の要約 本発明は、ウィルス中和因子（ＶＮＦ）を特徴づける本出願人の進行中の研究に 基いている。この研究の間、ＶＮＦの以前の調製物の活性成分は、意外なことに これらの一般に低分子量の調製物中のより高分子量の混在物質であることが見出 された。特に、ＶＮＦはウィルス中和抗体であることが見出された。この発見に より、生の弱毒化されたウィルスワクチンを製造するにあたりウィルス中和抗体 およびこれらのフラグメントの新規な利用が可能となる。母性抗体かヒヨコにお いて生ウィルスの攻撃に対する能動免疫の感染を阻害する傾向に関して、Ｐ、ア ブドウ（ａｂｄｕ）ら、［ワールズ・ボウルトリー・サイエンス（Ｗｏｒｌｄｓ Ｐｏｕｌｔｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ）ＪＶ、　４２．２１９．　（１９６８）；　 Ｐ、シャー７　（Ｓｈａｒｍａ）ら、ズーテクニ力・インターナショナル（Ｚｏ ｏｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｉｎｔｅｒｎａ−ｔｉｏｎａｌ）、　５１　（１９８９年 ６月）参照。これらの結果は特に意外なものである。

従って、本発明は、動物被検体にウィルス性疾患に対する能動免疫を生成させる 方法であって、生ウィルスと、この生ウィルスに結合された中和因子とからなる ワクチン接合物を前記被検体に投与することを特徴とする方法を提供する。この 中和因子は、抗体及び抗体フラグメントからなる群より選択される。

この抗体又は抗体フラグメントは、生ウィルスを中和する能力かある。このワク チン接合体を、被検体中の生ウィルスに免疫反応を生成させるのに有効な量投与 する。

本発明の他の態様は、動物被検体中にウィルス性疾患に対する能動免疫を生成さ せるのに有用なワクチン調製物である。このワクチン調製物は、ワクチン接合体 を含有する薬剤学上許容可能な調合物である。このワクチン接合体は、生ウィル スと、この生ウィルスに結合された中和因子とからなる。この中和因子は、抗体 と抗体フラグメントとからなる群より選択する。この抗体又は抗体フラグメント は、生ウィルスを中和する能力がある。このワクチン接合体は、被検体に生ウィ ルスに対する免疫応答を生成させるのに有効な量、薬剤学上許容可能な調合物中 に含まれている。

本発明の他の態様は、閉じられた、病原体不透過性の容器と、この容器内に包含 された上記の無菌ワクチン調合物とからなる製造品である。

図面の簡単な説明 図１．２及び３は、ＶＮＦの精製及び相対ＶＮＦ活性の測定に用いられた、アー カンソ−（Ａｒｋａｎｓａｓ）レグレッサ系統チキン血清からの種々の調製物を 図示するものである。

図４は、ＴＳＫクロマトグラフィーによる、アーカンソーレグしツサ系統チキン 血清の≧５０に血清成分の溶出分布図を示す。

図５は、ＴＳＫクロマトグラフィーによる、図４に示すピークＩの成分の溶出分 布図を示す。

図６は、ＴＳＫクロマトグラフィーによる、図４に示すピーク■の成分の溶出分 布図を示す。

図７は、ＴＳＫクロマトグラフィーによる、図４に示すピーク■の成分の溶出分 布図を示す。

図８は、ＴＳＫクロマトグラフィーによる、アーカンソーレグレッサ系統チキン 血清の≧１００に血清成分の溶出分布図を示す。

図９〜［ＪＩＩは、ＴＳＫクロマトグラフィーカラムを通して、図８に示すピー ク■の成分の第一、第二、及び第三の再循環によって、ＶＮＦ　（７）精製度の 向上か達成されたことを示す。

図１２は、ＴＳＫクロマトグラフィーによる、従来技術によって調製したＶＮＦ の精製を示す。

発明の詳細な説明 本発明を実施するのに用いる抗体は、ウィルス中和抗体である。ウィルス中和抗 体とは、ウィルスと本抗体とを充分な時間互いに反応させるならば、インビトロ でウィルスの感染力と戦うものである。このウィルス中和抗体の源は、重要では ない。

これらは、鳥（例えば、チキン、七面鳥）及び哺乳類（例えば、ラット、ウサギ 、羊、馬）を含む、あらゆる動物に由来するものであってよい。このウィルス中 和抗体は、元来はポリクローナル又はモノクローナルであってよい。例えば、Ｄ 、　Ｙｅｌｔｏｎ及びＭ、　５ｃｈａｒｆｆの６８「アメリカンサイエンスティ スト（ＡｍｅｒｉｃａｎＳｃｉｅｎｔｉｓｔ）Ｊ　５１０（１９８０）参照。こ の抗体はキメラ性であってよい。例えば、Ｍ−Ｗａｌｋｅｒ等の２６「分子免疫 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ−Ｏｇｙ）Ｊ　４０３　（１９８９）参 照。この抗体は、ウィルス中和因子（ＶＮＦ）のような従来知られた型のもので あってよい。例えば、Ｇｙｌｅｓ及びＷｈｉｔｆＮＩの前出誌参照。本発明を実 施するために用いるＶＮＦは、ＶＮＦを生成する能力のある、ジャイアントジャ ングルホウル（Ｇｉａｎｔ　Ｊｕｎｇｌｅ　Ｆｏｉｌ）　（Ｇａｌｌｕｓ　Ｇａ １ｌｕｓ）及びＧａ１ｌｕｓ　Ｇａ１ｌｕｓに由来する鳥の株から得ることかで きる。こうした誘導体の一例は、アーカンソーレグレッサチキン系統である。他 の手段の中で、鳥類のストックは、［家禽源ストックの国際登録（Ｉｎｔｅｒｎ ａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｇｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 　５ｔｏｃｋｓ）　、速報　丸４７６、農業出版Ｎｌｌ　Ｕ　−３５１３７６に よって検索することができる（コネチカット州、ストールス（Ｓｔｏｒｒｓ）、 コネチカット大学で入手できる）。

本発明を実施するのに用いるウィルス中和抗体は、［ｇＭ、　ＩｇＧ。

ＩｇＡ、　［ｇＤ、及びＩｇＥ免疫グロブリンを含む、あらゆるイソタイプの免 疫グロブリンであってよい。［ｇＧ及びＩｇＭが一層好ましく、かつＩｇＧ免疫 グロブリン（例えば、ＩｇＧ　ｌ、　［ｇＧ　２．１ｇＧ３、ＩｇＧ　４）が最 も好ましい。

本発明を実施するのに用いる抗体フラグメントは、その可変領域結合部位を保持 するウィルス中和抗体のフラグメントである。例えば、Ｆ（ａｂ’）ｚフラグメ ント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、及びＦａｂフラグメントである。「免疫学： 基本操作（［ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　：　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）　Ｊ 　９５〜９７　（Ｊ、　Ｂｅ１ｌａｎｔｉＥｄ、第二版、１９８５年）を一般的 に参照。

本発明を実施するのに用いる抗体又は抗体フラグメントは、これに結合した要素 を更に有していてよい。例えば、米国特許第４．４９３．８２５にＰｌａｔｔか 記載したように、ミクロスフェア又は微粒子を抗体又は抗体フラグメントに結合 させることかでき、この特許の開示は参照することによって本出願中に包含する 。

本発明は、中和因子に対してウィルスを接合させるためてはないとしても、処理 された被検体中で病原性（即ち、疾患を引き起こす能力がある）でありうるウィ ルスについて採用することが特に有利である。このウィルスの病原性は、ウィル スそれ自身の中に固有のものでありうるしく例えば、弱毒化することが難しい伝 染性ファブリキウス嚢病ウィルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｂｕｒｓａｌ　Ｄｉ ｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ）のようなウィルス）、又は処理すべき被検体の感受性 によるものでありうる（例えば、インオボの鳥類）。

一般に、多くの病原性ウィルスは、ウィルスに感染した被検体中に能動免疫を引 き起す陽性効果を有し、ウィルスの多くの弱毒性ワクチン株は、被検体中に少な くとも幾つかの疾患を生じさせる能力をもつ。従って、ここでウィルスを記述す るのに用いた「病原性」という用語は、ウィルスの投与によって被検体に引き起 こされる害か、これから得られる利益を上回ることを意味する。このウィルスは 、処理された被検体内に、ウィルスに対する活性免疫反応を生成させる能力のあ るものであることが好ましい。

本ワクチン接合体は、処理すべき被検体内にウィルスに対する活性免疫応答を引 き起すのに充分な単位服量当りの量で、ワクチン調合物中に含まれている。ここ で用いる「免疫応答」という用語は、続いてウィルスに曝露することから、被検 体の集団内に、死亡率の減少や、病変スコアの減少や、食糧変換率のて、幾らか の利益をもたらすというあらゆる段階の保護を意味し、この保護が部分的である か完全であるかに係わらない。

中和因子によって与えられる保護の程度に関しては、ワクチン中でウィルスと組 み合わせて投与される中和因子の量は、ウィルスからの完全な保護を与えるのに 充分である必要はなく、引き起された免疫応答の利益が、感染から生ずるあるゆ る害を上回るようなレベルにまで、ウィルスの引き起す悪い応答が低減されてい る限りてよい。好ましくは、ＶＮＦ投与されたトリ被検体については、ワクチン 接合体の服量当り約１０〜約１０００活性単位の間でトリに投与する。薬剤組成 物は、単位服量当りこれらの量のＶＮＦを含むように、調合する。

中和因子と混合されてワクチンを生成しうるウィルスは、哺乳類及びトリウィル スの双方を含む。哺乳類ウィルスの例としては、日本脳炎ウィルス、インフルエ ンザウィルス、センダイウィルス、麻疹ウィルス、ヒトインフルエンザウィルス 及び偽狂犬病（Ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ）かある。例えば、米国特許第４．６ ５９．５６９号及び４．４９３．８２５号参照。トリウィルスの例としては、ラ ウス軍鶏肉腫ウィルス（Ｒｏｕｓ　Ｓａｒｃｏｍａ　Ｖｉｒｕｓ）、ニューキャ ッスル病ウィルス（Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ）、 伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス及び伝染性気管支炎ウィルス（Ｉｎｆｅｃｔ ｉｏｕｓ　Ｂｒｏｎｃｈｉｔｊｓ　Ｖｉｒｕｓ）かある。

ここて用いた「伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス（ＩＢＤＶ）Ｊは、［ＢＤＶ のすべての菌株を含有するものである。例えば、ニューシャーシー州、ヴインラ ンド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）のヴインランド研究所又はアイオワ州チャールズ市の サルスベリ−研究所から得られる、ファブリキウス嚢病ワクチン、ラカルｌ−（ Ｌｕｋｅｒｔ）菌株、生ウィルス、アイオワ州エイムズ（Ａｍｅｓ）のＵ、　Ｓ 、　Ｄ、　Ａから入手できるファプリキウス嚢病毒性攻撃ウィルス（Ｓ、　Ａ、 エドガーから単離された原型）、及び米国特許第４．８２４．６６８号てメルキ オール及びメルソン（Ｍｅｌｃｈｉｏｒ　ａｎｄ　Ｍｅｌｓｏｎ）により開示さ れた伝染性ファブリキウス嚢病菌株ＶＲ２１６１かある。

ここで用いた「ラウス軍鶏肉腫ウィルス（ＲＳＶ）Ｊ　という用語は、ＲＳＶの すへての菌株を包含する。ＲＳＶの発見が今世紀の初めだったので、ＲＳＶは包 括的に研究されてきた。一般に、「１ＲＮＡ腫腸ウィルス：腫脹ウィルスの分子 生物学（Ｉ　ＲＮＡ　ＴｕｍｏｒＶｉｒｕｓｅｓ　；　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂ ｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｖｉｒｕｓｅｓ）　Ｊ等二版、５９〜６１頁 （Ｒ，Ｗｅｉｓｓ、　Ｎ、　Ｔｅ１ｃｈ、　Ｈ，Ｖａｒｍｕｓ及びＪ、　Ｃｏｆ ｆｌｎ編集、　１９８４年）参照。ラウス軍鶏肉腫ウィルスのためのアッセイ技 術は、ｒＢｒｉｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐｔｌ、　Ｍｅｄ、Ｊ　９９：　１８３に報告 されている。

モロニー（Ｍｏｌｏｎｅｙ）は、国立ガン研究悲報（Ｊ、Ｎｅｔ、　Ｃａｎｃｅ ｒＩｎｓｔ、）　Ｊ　１６　：　８７７で定量実験用のウィルスの標準ロフトの 進歩について報告している。米国特許第３．３２６．７６７号、Ｈｏ１ｐｅｒ及 びＫｉｇｉｎｓ）も参照。多数のラウス軍鶏肉腫ウィルス菌株は、動物及び植物 ウィルス、クラミジア、リケッチア及びウィルス抗血清のＡＴＴＣカタログ（第 ５版、１９８６年）に、１１Ｏ〜１１２頁に列記されている。

ここで用いた「伝染性気管支炎ウィルス（ＩＢＶ）という用語は、［ＢＶのすべ ての菌株を包含するものである。例えば、マサチューセッツ４１菌株、アーカン ソー９９菌株、コネチカットＡ　５９６８、及びミシガン州立大学レボジトリー コード４２菌株、メリーランド州ロックビルのアメリカンタイプ力ルチュアーコ レクションから入手可能なすべての菌株がある。「ニューキャッスル病ウィルス 」という用語は、ニューキャッスル病ウィルスのすへての菌株を包含するもので ある。

ここで用いる「動物」という用語は、とりわけ、哺乳類及び鳥類の双方を含むこ とを意図するものである。例えば動物には、マウス、ラット、ギニービッグ、ウ サギ、いたち、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ及びヒトを含む霊鳥類が含まれる。「鳥 」という用語は、オス又はメスのあらゆるトリ種を含むことを意図しているか、 まず、卵又は肉のために商業的に飼育される家禽を包含することを意図している 。従って、「鳥」という用語は、特に、チキン、七面鳥、あひる、がちょう、う ずら及びきじの雌鶏、雄鶏（Ｃｏｃｋｓ）および雄鳥（ｄｒａｋｅｓ）を包含す ることを意図している。家畜（即ち、ヒトでない動物）か好ましい。

本発明のワクチンを、あらゆる適当な方法で動物に投与することができる。例え ば、経口投与、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、点眼又は経鼻 スプレーによる。処理すべき動物かトリであるときは、このトリは、新たに酢化 したトリ（即ち、酢化後の最初の約三日間）を含む、酢化した鳥であってよく、 青年期及び成熟した鳥であってよい。米国特許第４゜４５８、６３０号にシャル マ（Ｓｈａｒｍａ）か記載したように、鳥類にワクチンをインオポ（ｉｎ　ｏｖ ｏ）　で投与することかできる。この特許及び本明細書で引用する他のすべての 特許文献の開示は、参照によって本明細書中に包含されるべきものである。

ワクチンをインオポ投与することは、卵にワクチンを投与することを含む。本発 明のワクチンを投与する卵は、好ましくはインキュベーションの第四の四半期に ある無菌卵である。チキンの卵は、インキュベーションの約１５〜１９８目に処 理し、最も好ましくはインキュベーションの約１８８目に処理する（胚発生の１ ８日日目。七面鳥の卵は、好ましくはインキュベーションの約２１〜２６８目に 処理し、最も好ましくはインキュベージコンの約２５日日に処理する。

卵の殻に物質を通すあらゆる手段によって、本発明のワクチンを卵に投与するこ とかできる。しかし、好ましい投与方法は、注射である。この注射部位は、好ま しくは、卵黄のう中の羊水及び胚自体を含む、羊膜によって輪郭付けられた領域 内か、又は気室内である。最も好ましくは、羊膜によって輪郭付けられた領域中 へと注射を行う。インキュベーションの第四の四半期の初めには、羊膜か充分に 拡大し、卵の大きい方の端の中心からその長さ方向の軸に沿って注射をするとき 、はとんと全時間その浸透が確保される。

卵への注射の機構は臨界的でなくこの方法か卵を含む胚のまたは胚性の膜の組織 および器官を過度に損傷しない方法であり、従って処理のために町化速度が減少 しないことが好ましい。約１８〜２２ゲージの針を備えた皮下注射器がこの目的 のために適する。気室に注入するにあたり、針は卵中に約２ミリメートル注入す るのみてよい。１インチ（２，５４ｃｍ）の針は、卵の大きい方の端の中心から 十分挿入した際、殻、気室をふくむ外殻膜および内殻膜並びに羊膜を貫通する。

胚の成長および位置の正確な段階に依存して、この長さの針はヒヨコの上の流体 またはヒヨコそのものいずれかまで貫通する先導の穴を針の注入前に殻にパンチ で開けるかまたはドリルで開けて針の損傷または鈍化を防止する。所要に応して 、卵を実質的に微生物不透過の密封材、例えばろう等で密封して不所望な微生物 のその後の侵入を防止することができる。

鳥類の胚への高速自動卵注射装置か本発明を実施するのに特に適することか見込 まれる。多くのかかる装置が使用可能であり、これらの例はへブランク（Ｈｅｂ ｒａｎｋ）の米国特許第４．６８１．０６３号明細書およびミラー（ｍｉｌｌｅ ｒ）の米国特許第４．０４０．３８８．４、４６９．０４７および４．５９３． ６４６号明細書に開示されたものである。

本発明を実施するために適合されたようなかかる全ての装置は、ここに記載され たワクチンを含有する注射器と共にワクチンを有する装置により運搬された卵に 注入するように位置された注射器を有する。この装置の他の特徴は前に記載した 。さらに、所要に応じて、注射装置に作業的に接続された密封装置を卵への注入 後に卵の穴を密封するのに提供することができる。

本発明を実施するのに好ましい卵への注射装置はへブランクの米国特許第４．６ ８１．０６３および４．９０３．６３５号に開示されており、この開示を参照文 献としてここに包含した。この装置は、流体物質を複数の卵に到達させる注射装 置および、複数の個別の卵をこれらの上方に面した部分に同時に引きつけて上昇 させ、卵がこの吸引装置により引きつけられる間に卵に注射するための注射装置 と共に作動する吸引装置を有する。これらの装置の特徴は、上記の本発明を実施 するための装置の特徴を兼ね備える。

本発明を実施するのに適した被検体は鳥である。

本発明の方法は、好ましくは、トリにインオボで実施する。

本発明を実施するにあたり、用いるのに好ましいウィルスは伝染性滑液仮病ウィ ルス（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｂｕｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ）で ある。

本発明のワクチン接合体は、中和因子を生ウィルスと、薬学的に許容可能な担体 中で生ウィルス−中和因子接合体を形成するのに十分な時間混合することにより （例えば中和因子とウィルスとを通常の液体担体中で被検体に投与する少なくと も約１時間前に混合することにより）調製する。このことは、ＶＮＦを含有する 高度免疫血清を生ウィルスを含有する水溶液に単に混合することにより有利に実 施することかできる。本発明のワクチン調合物は、凍結乾燥形態のワクチン接合 体または薬学的に許容てきる担体中のワクチン接合体を有するのが好ましい。薬 学的に許容てきる担体は、好ましくは液状であり、特に水性の担体である。かか るワクチン調合物を調製するために、中和因子およびウィルスをリン酸ナトリウ ム緩衝溶液（ｐＨ７，４）または、ＭＥＭのような通常の媒体中で混合すること ができる。ワクチン調合物は、これを通して液体を注射することかできるゴム製 密栓て密封した無菌のガラス製容器中に貯蔵し、調合物をシリンジにより回収す るようにすることかできる。

本発明のワクチン調合物は、所要に応じて１種以上のアジュバントを含有するこ とかできる。抗原に対する免疫系の反応を増大させる化学的およびポリペプチド の免疫刺激剤を含有する任意の適切なアジュバントを用いることかできる。アジ ュバント、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、植物油および動物 油等をワクチン接合体と共に被種体のワクチン接合体に対する免疫反応を増大さ せるのに十分な量投与するのか好ましい。ワクチン接合体に加えるアジュバント の量はアジュバントの性質により、一般にウィルスの重量の０．１〜約１００倍 量、好ましくはウィルスの重量の約１〜約１０倍量の範囲内で変化する。

本発明のワクチン調合物は所要に応じて１種以上の安定剤を含有することかでき る。炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、デ キストリンまたはグルコース：タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼイン： 並びに緩衝液、例えばアルカリ金属リン酸塩等を含む任意の適切な安定剤を用い ることができる。安定剤の使用は、ワクチン調合物が凍結乾燥調合物である際に 特に有利である。

本発明の好適例では、インオポインキュベーションの最後の約四半期と瞬化後の 最初の約３日間との間に亘る時に、生伝染生フ７ブリキウス嚢病ウィルスとこの 生ウィルスに結合した中和因子とからなるワクチン接合体を、トリ被検体に投与 することによって、この被検体中に伝染性ファプリキウス嚢病ウィルスに対する 能動免疫を生成させる方法を提供する。この中和因子は、ＩｇＧ免疫グロブリン 及び［ｇＧ免疫グロブリンフラグメントからなる群より選ぶことか好ましく、生 ウィルスを中和する能力かある。このワクチン接合体は、前記被検体内に伝染性 ファブリキウス嚢病ウィルスに対する能動免疫を生成させるのに有効な量を投与 する。特定例では、伝染性ファブリキウス嚢病ウィルスに対して調製したチキン からの高度免疫血清を、次記の実施例で記載した比率で混合して接合体を形成す る（例えば、高度免疫血清５０μβ当り１３６単位の２２　ＥＩＤｓｏＳ　：高 度免疫血清ｌμ！当り３３８単位の２．２　ＥＩＤ、。Ｓ）。このウィルスは、 アメリカ合衆国メリーランド州ベルリンのサノフィアニマルヘルス（Ｓａｎｏｆ ｉ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ）電話（３０１）６４１−２０６０から入手で きる伝染性ファブリキウス嚢病ウィルスワクチンＩＢＤ　−ＢＬＥＭ”である。

次いで、この接合体を、ガラスびん中で最終ワクチン製品として凍結乾燥して乾 燥状態とし、貯蔵する。使用時には、このワクチン接合体を希釈剤中に再溶解さ せ、服量当り１００マイクロリツトルを、通常の４化後手順の間に（通常、酢化 後１又は２日に）チキンの首へと皮下注射する。

本発明の他の実施態様は、生ニューキャッスル病ウィルス及びこの生ウィルスに 結合された中和因子からなるワクチン接合体を、インビボインキュベーションの ほぼ最後の四半期と酢化後の最初の約３日間との間に亘る時に、トリ被検体へと 投与することによってこの被検体中にニューキャッスル病ウィルスに対する能動 免疫を生成させる方法を提供する。この中和因子は、［ｇＧ免疫グロブリン及び （ｇＧ免疫グロブリンフラグメントからなる群より選択することか好ましく、こ の生ウィルスを中和する能力かある。このワクチン接合体は、被検体中のニュー キャッスル病ウィルスに対する能動免疫を生成させるのに有効な量を投与する。

続〈実施例において、本発明を更に詳細に説明する。これらの実施例は、例示目 的のために提供したものであり、制限的に受け取るへきものではない。

ラウス肉腫ウィルスおよび次の血清収集により実験するのに用いる鳥をＧｙｌｅ ｓ氏ほか、Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉ、　４６．４６５（１９６７）に記載してい るアーカンソー　レグレッサ　チキン系統およびアーカンソー　ブログレッサ　 チキン系統にし、これらの群をアーカンソー大学のアグリ力ルチュア　リサーチ 　ファーム、アーカンソー州７２７０１　、ファイエテビレで飼育した。

レグレッサ　チキン血清における抗ウイルス因子の生成を刺激するのに用いるＲ ３Ｖ−ＲＡＶ−１の標準接種物を叶、　ＪｏｈｎＰ、　Ｂａｄｅｒ氏、ＮＣ１， ＮＩＨにより、メリーランド州　ロックビルのアメリカン　タイプ　力ルチュア ー　コレクションのために調製したロット＃１として確認したＲ３Ｖ−ＲＡＶ　 −ＩＢｒｙａｎＨｉｇｈ　Ｔｉｔｅｒ　５ｔｒａｉｎで調製した。タイターは２ Ｘ１０’　ＰＦＵ／−にし、使用前に一７０°Ｃて貯蔵した。鳥の接種をＷｈｉ ｔｆｉ１１氏らＰｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃｉ、　６１．１５７３（１９８１）に記載 しているように左のつばさ羽根（ｗｉｎｇ　ｗｅｂ）に、０．１−の希釈Ｒ３Ｖ −ＲＡＶ−１の標準接種物で感染することによって達成させた。

本例は、比較目的のために、高度免疫血清からウィルス中和因子の生成を誘導す るのにレグレッサ　チキンを追加免疫する（ｂｏｏｓｔ）に可能なチキンからの 主要ホモジネートを調製する従来の手順をしめしている。レグレッサ　チキンを Ｒ３Ｖの標準接種物で実験し、腫瘍の可視消失により測定しうるように腫瘍か完 全に減少した後、ラウス肉腫ウィルス腫瘍ホモジネート（Ｒ３ＴＨ）追加免疫の 標準接種物で、少なくとも３週間にわたり１週１回注射した。最後の追加免疫Ｒ ３ＴＨ注射後５日目に、２０ｒｄの血液を各チキンから心穿刺（ｃａｒｄｉａｃ 　ｐｕｎｃｔｕｒｅ）により除去し、室温で１時間にわたり凝固させた。凝固血 液を室温で１０分間にわたりツルパル（Ｓｏｒｖａｌ　ｌ）遠心機で３０００　 Ｘ　ｇで沈降させ、高度免疫血清を除去し、５°Ｃて貯蔵した。このおきまりの 手順を与えられたグループのドナー　レグレサ　チキンに数週間にわたり継続さ せた。

本例は、比較目的のために、多量の高度免疫血清レグレツサチキン血清からウィ ルス中和因子を部分的に精製する従来技術について示している。上記比較例Ａに より作った約４００艷のレグレッサ　チキン高度免疫血清をセファデックス（Ｓ ｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５微細カラム（８ｘ　３５ｃｍ）に供給し、０．００５ Ｍりん酸緩衝液（ｐｉ−１７，０）て２５０　ｒｎｌ／時て溶出した。４個のピ ークをカラムから溶出し、最後に２８００ｒＩＬｌにおいて溶出したピーク■は Ｒ３Ｖ−ＲＡＶ−１に対するＶＮＦ活性を含んでいた。ピーク■は、セファデッ クスＧ−１００フラクシヨン■について上述するように、可能なチキンのつばさ 羽根への注射のウィルスによるインキュベーションによってＲ３Ｖ−ＲＡＶ−１ を中和することを示している（Ｗｈｉｔｆｉ１１氏ほか、Ｐｏｕｌｔｒｙ　Ｓｃ ｉ、　６１．１５７３（１９８１）　、一般に、ピーク■を１０１００Ｏ全量の 緩衝液において２８ｍ１／チユーブで溶出し、凍結乾燥し、滅菌蒸留水に１００ ｍｇ／ｍｌの濃度で再溶解した。

本例はゲル濾過カラム　クロマトグラフィーを用いる初期予備活性フラクション からのウィルス中和因子の精製および脱塩についての従来技術について示してい る。

上記比較例Ｂに記載するようにして得た約３５ｍ１の再溶解セファデックスＧ− ２５ピークＩＶ　（３５００ｍｇ）をバイオゲルＰ−２カラム（５ｃｍ　ｘ　４ ０ｃｍ）に供給し、蒸留水に９０−７時の流速で溶離した。抗ウィルス活性を、 １４ｍ１／チユーブにおいて３９０　ｒｎｌｎｌイボイドボリューム出すること によって第１ピーク（ピークＩ）においてＲ３Ｖ−ＲＡＶ−１に対して確かめた 。１００艷の前容積における溶出てのこのピークＩを凍結乾燥し、遊離塩の生成 かＶＮＦの一層高い精製調製を示した。りん酸緩衝液または蒸留水におけるＶＮ Ｆの原液を、活性について試験する前に、５ｍｇ／ｒｎｌの濃度に新しく調製し た。

この原液についての１活性量位を、１ｍＡのこのＶＮＦ溶液におけるラウス肉腫 ウィルスに対する活性量として規定した。１−のこの溶液は５００標準投与量の ラウス肉腫ウィルスを完全に中和した。ラウス肉腫ウィルスの標準投与量は、１ ６日間に５ＰＦ９日経過の肝葉尿膜に平均７０ポツクを生ずる１００ｕｌにおけ るウィルスの希釈について規定した。ＶＮＦは、０．１活性量位の投与レベルに 達するまで、７Ｘ１０’チキン繊維芽細胞の生成に有害でなかった。

本例はレグレッサ　チキン高度免疫血清を作る細菌の好ましい技術について説明 している。血清を上述する比較例Ａに記載するように調製したか、ただし、凝固 血液を１５分間にわたり３０００ｒｐｍで遠心分離して粒子材料を除去し、次い で生成血清をそれぞれ５ミクロン、１．２　ミクロンおよび０．４５ミクロンの フィルターを通して濾過した。最後に、血清を０１８カートリツジに通して血清 に含有する脂質を除去した。

ＶＮＦを生成するために最近の好ましい手順を図１．２および３に示す。この試 料は、これらの図に記載する手順における付加情報を与える。

上述する実施例３に記載するようにして調製した血清をスペクトラム（Ｓｐｅｃ ｔｒｕｍ）５０ｋまたは１００に中空繊維ブレーカ−（スペクトラム（Ｓｐｅｃ ｔｒｕｍ）、アメリカ合衆国カリフォルニア州口サンゼルスから入手）に通して 循環させ、５０．０００分子量フラクション以上（≧５０に血清成分）または１ ０．０００分子量フラクション以上（≧１００に血清成分）について少な（とも ４倍濃縮した。≧５０に血清または≧１００に血清成分を、次に示す実施例５に 記載している手順によって調製ＴＳＫカラムにおいて、各血清成分の１５０ｋ　 −１８０に部分に含有するＶＮＦにより分別した。

調製スフェロゲル（Ｓｐｈｅｒｏｇｅｌ）　Ｔ　Ｓ　Ｋ２Ｏ０Ｏ３Ｗカラム、２ １．５ｍｍＸ　６０ｃｍを、りん酸緩衝液で３回、８ｍｌ／分の流速で操作して ≧５０におよび≧１００に血清成分を図４または図８に示すフラクションに分離 した。図４および８についてのビーク割合を以下に示す表１および２に示す。ピ ークについての溶出時間は予備カラムの使用および緩衝液におけるわずかな変化 のような実験パラメータによりわずかに変えた。５０に以上のフラクションをカ ラムに後方に再循環することによって、ピーク■、■または■を互いに部分的に 分離した。この事は、それぞれ図５　（５，８９分における図４のピークＩ）、 図６　（６，７１分における図４のピーク■）、および図７　（７，８６分にお ける図４のピーク■）に示している。ウィルス中和活性は、最大量の比活性を含 むことを示すように、ピーク■にたけに確認した。

表１ 図８．９、ＩＯおよび１１は、図８のピークがＴＳＫカラムに連続的に再循環さ せることにより、とのようにして精製するかを示している。未精製≧１００に血 清成分のこの混合物を５０６９ａで始めに標識付けし、次いてさらに精製して５ ０７０ａ、　５０７７ａおよび最後にもっとも高い精製形態である５０７９ａて 標識付けした。

図に示すように、時間ごとにＴＳＫカラムから溶出するビーク■セクションをカ ッｌ−Ｌ、再循環し、さらに精製し比活性を高めた。図ｔｉにおけるピーク割合 を以下に示す表３に示す。活性ＶＮＦを含有する高精製ＩｇＧフラクションにつ いての活性単位を次のように計算した。ＩＢＤＶに対するＥＤ、、タイターは後 述するウィルス中和アッセイを用いて定めた。ＥＤ６．タイターはウィルスで死 んでから細胞の５０％を保護するＶＮＦの５０ｕｌ希釈を示している。計算はｌ 活性単位に等しいｌ：２５のＥＤ、。希釈タイターを任意に与えるようにして行 った。次いで、ＶＮＦの特定調製における実際のＥＤ５．タイターを一当たりの 単位に換算し、最後に比活性として規定するｕｇあたりの単位に換算した（この 計算の実施例についての表５〜７参照）。

この例は上述のＶＮＦ調製物の純度が不足していることを示す。上述の比較例Ｃ に記載したようにして調製したＶＮＦ貯蔵溶液を、上述の実施例５に記載したよ うなＴＳＫクロマ１〜グラフィーカラムに適用した。溶出分布図を図１２に示し 、各ピークのパーセンティジを下記の表４に示す。ＩｇＧの面積パーセントは１ ８．４％にすぎなかった。この表を表３と比較されたい。

上述の実施例で得た最高度に精製されたＶＮＦ成分をＳＤＳ−ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離することによって、結論として ＶＮＦはＩｇＧ免疫グロブリンであると同定した。

５、０００〜２００．０００の分子量範囲で分離する勾配を有する５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ用のｌＯｃｍＸ　１０ｃｍゲルを、米国マサチュセッツ州ハイドバーク所在 のＩ　Ｓ　Ｓ　−Ｅｎｐｒｏｔｅｅｃｈから得た。このようなケルに対し、ビー ク■は２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）の存在下にチキンのＩｇＧと同じ 働きをした。しかし、このようなゲルに対し、ビーク■は２−ＭＥの不存在下に チキンＩｇＧと同様に移動し、分子量約Ｌ８０．０００の位置に最大バントを示 した。

チキン繊維芽細胞アッセイは、ＶＮＦ活性を同定するためのビトロスクリーニン グとして有用であった。これは既知源からのＶＮＦの精製を確認するのに有用で あるか、あるいは将来考えられる供給源（ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ　５ｏｕｒｃ ｅ）におけるＶＮＦの存在を確認するのに有用であった。ここで行うアッセイは Ｊ、　５ｋｅｅｌｓら（２３Ａｖｉａｎ　Ｄｉｓ、　９５　（１９７９）　）　 ニよって開発された標準方法に基く。また、ｒＤｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｐｏｕ ｌｔｒｙ、　５７４　（Ｍ、Ｈｏｆｓｔａｄ編、第８版、１９８４）を参照され たい。要するに、培養皿において完全最小必須培地上て薄層にまで成長させた９ 〜ｌ１日目の特定の無病原胚から採取し、伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス（ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｂｕｒｓａｌ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｖｉｒｕｓ　）　（ル ーカート菌株（Ｌｕｋｅｒｔ’ｓ　５ｔｒａｉｎ　）　（Ｉ　ＢＤＶ）の入って いるマイクロタイタープレートのくぼみ（ｗｅｌｌ）に移した。所望の時期に、 繊維芽細胞を添加する前に、マイクロタイタープレート内のＩＢＤＶと、ＶＮＦ を含有するかあるいはＶＮＦを含有する疑いのある調製物とを混合して、調製物 中におけるウィルス中和活性の有無またはその程度をめた。中和作用が予期され る調製物を用いたＩＢＤＶの培養を、３７℃において約１時間行った。ここでは ＭＴＴ染料還元アッセイを使用してアッセイの終点をめた。本発明等の行った特 定の操作は以下に示す通りである。

１、繊維芽細胞を採取し、培養する。

２、細胞か融合状態になった後に、組織培養皿（フアツジ（Ｆａｌｃｏｎ）社、 　１５０　ｘ　２５ｍｍ）から培地を取り出し、１５〜２０ｍ１のトリプシンで トリプシン処理する。トリプシンの添加後２〜５分の間これらのプレートを培養 器に入れると、これに助けられて皿からの細胞の釈放か常温におけるより速やか になる。

３、細胞か培養皿から釈放された後に、生まればかりの子牛の血清５ｍｌを添加 してトリプシンを中和する。培養皿をゆるやかに旋回させて血清をトリプシンと 十分に混合する。

４、血清／トリプシンおよび細胞を培養皿から５０ｍ１遠心分離機管中に環子り コートづつ入れる。さらにプレートを僅かに傾斜させるのが有用であり、プレー トをトリプシン／血清混合物で洗浄して付着細胞を釈放するのか有用である。遠 心分離機管の容積４０ｍ１のマークの所まで、５％のＦｅ２を含有するＭＥＭを 加えて残留するトリプシンを中和する。

５、管内の混合物を１６°Ｃにおいて１５００ｒｐｍで１０分間回転させる。

６、回転させた後に、上澄液を流し出し、容管に５％ＦＣ３を含有するＭ　Ｅ　 Ｍ　１０ｍ１を加える。ピペットで細胞を混合して塊をこわす。全アリコートを １個の容器に入れて一緒にし、十分混合する。

７、−緒にしたアリコートから、小部分を取り出し、５％のＦｅ２を含有するＭ ＥＭ中で１．ｌＯまたはｌ：２０の希釈を行う（普通ｌｍｌＸ９ｍ１の希釈は代 表的な試料を得るのに十分であるか、Ｉ　ｍｌ　Ｘ　１９ｍ１の希釈は数えられ る細胞の数を減少させる）。

８、希釈された細胞について血球計で細胞数を数え、５９６のＦｅ２を含有する ＭＥＭて希釈して０．５　ＸＩＯ’細胞／細胞７溶ｌを作る。

９、マルチチャンネルピペッタ−を使用してマイクロタイマープレートの所望の くほみに２００μｌの前記細胞溶液を加える。

この細胞溶液は十分に混合された状態に維持して全くぼみ内の細胞を均一に分散 された状態に維持する必要がある。無菌ベトリ皿に１５〜２０ｍ１の細胞溶液を 入れ、新たに混合した細胞を各対のプレート管に補給した場合には、これによっ て助けられ全くぼみ中の細胞の均一な分散か確実に行われる。

Ｂ、マイクロタイタープレートの培養 ５．５％のＣＯ□を含む３７°Ｃの培養器内でマイクロタイタープレートを２日 間培養する。これらのプレートは、予備試験結果のために、あるいは目に見える 混在状態を点検するために、１〜２日後に顕微鏡て観察することができる。混在 状態は曇りまたは小さい黒色斑点として培地に現れることがある。

１、ＭＴＴテトラゾリウム染料の５ｍｇ／ｍｌ溶液（米国オハイオ州クリーブラ ンド所在のバイオケミカル社から入手したもの）をＩ　ＸＰＢＳ中に混入する。

結晶はすべてではないが溶解する。

無菌フード下に０．４５μｍ注射器フィルタに通して無菌状態で濾過する。

２、無菌フード下に、各プレートの各くぼみから１００μｌの液体を取り出す。

液体を取り出した後に、各くぼみに２０μｌのＭＴＴを加えることにより、プレ ートを「パルス（ｐｕｌｓｅ　）　Ｊさせる。プレートを培養器に３時間戻す。

３．培養後に、プレートの各くほみから１００μｌの溶液を取り出し、廃棄する （この工程は無菌状怒で行う必要はない）。

４、各くほみに１００μｌの酸性イソプロパツール（１リツトルのイソプロパツ ール中に４０ｍ１のＩ　ＮＨＣＬを含むもの、または３．３ｍ１の１２ＮＨＣＬ を含むもの）を加える。

５ｏ振どう器において中程度の高速（ダイナチック（Ｄｙｎａｔｅｃｋ）社のシ ェーカーにおいて６の位置）で１分間混合する。

６、５７０ｎｍの波長を使用して３０分以内の間ＯＤを読み取る。

７、培地＋ＭＴＴを用いて０吸光度に校正する。

８、マイクロプレート読み取り器で適当なソフトウェアプログラム（すなわち、 イムノソフトＴｈ１）および型板（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を使用して読み取る。

実施例８ 上述の実施例３〜６に記載した種々の血清クラクションを、上述の実施例７に記 載した方法に従って、ＩＢＤＶに対する活性について試験した。これらのデータ を下記の表５および表６に示した。ピーク■はウィルス中和活性の大部分を有す る唯一のフラクションであった。すべての場合に、比活性はピーク■の場合に最 大てあり、最高度に精製されたピーク■の形態の場合に最大であった（表７−５ ０７９ｂ、ピーク■、あるいは表８−５０７９ａ）。ピークＩＩＩｇＧフラクシ ョンに含まれる活性ＶＮＦの相対的バーセンティジは血清調製物毎に変化してい た。図３および図８〜１１はそれぞれ精製の系統図およびＶＮＦを含む■ｇＧフ ラクションの分布図を示す。表５〜７はＴＳＫ２０００カラムからの種々のフラ クションの活性を示す。表８にはフラクション５０７９　ａの活性を示す。この ５０７９　ａフラクションは、極めて低いレベルのマクログロブリン混在物質を 含む５０７９　ｂ、ピーク■と、ＩｇＧフラクションを含む５０７９［］、ビー ク■とに分割された。表７は５０７９　ｂ、ピーク■がＶＮＦ活性を有すること を示す。

表５ １、アッセイては２００μｌの容積中のｌＸｌ０’個の細胞／くぼみのＨｙＶＡ チキンの繊維芽細胞を使用した。

２、種々のフラクションは５０μＩの容積／くぼみ中でｌ　：　１５，６２５に より５倍希釈して試験した。

３、使用したウィルスは５０μｌの容積のくほみ中てｉ　：　ｔｏｏ希釈を行っ たロイカーラ（Ｌｅｕｋｅｒｔｓ）菌株ＩＢＤＶてあった。

４、計算は５０μＩの容積において１：２５希釈＝１単位の活性に基づいて行っ た。

５．３−スペクトル中空繊維（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　Ｈｏｌｌｏｗ　Ｆｉｂｅｒ　 ）　、５ａｒ＝縫工筋（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）膜系。

表７ ヂギン線繊維芽細胞アッセイによる他のレグレッサ系統のチキンからの血清に見 出されたウィルス中和因子これらの実験は、ウィルス中和因子の代わりの源を試 験した点を除いて、上記実施例８に記載した実験と本質的に同一の方法により実 施した。これらの実験のデータは以下の表８に示す。また、表８はレグレソサ血 清とハイライン（Ｈｙｌｉｎｅ）血清とを比較している。これらのデータは、イ ーストランシング（Ｅａｓｔ　Ｌａｎｓｉｎｇ）レグレッサ系統の試験したチキ ンか有意なＶＮＦ活性を有していないことを示す。さらに、攻撃されてないアー カンサスレグレッサの鳥からの血清かＶＮＦを有することおよび攻撃されたアー カンザスブログレッサの鳥からの血清か攻撃されたアーカンサスレグレッサの鳥 に相当するＶＮＦに類似した活性を有することか見い出された。

表８ 実施例１０ ＶＮＦをインオポ投与した生ウィルスからの酢化におけるヒヨコの保護 本実施例はＶＮＦにより、インキュベーション１８８目でインオポにおいて、ワ クチンとして投与したＩＢＤＶから酢化におけるチキンを保護することを例示す る。１ＢＤＶの存在するワクチン株は、伝染性なので、酢化可能性かかなり減少 することなしに、インオボにおいて使用することは困難であることに注意を要す る。

また、ここにおいて記載した方法は、ワクチンとしての使用の接合可能性のテス ト法を供する。

本研究は、各グループにおいて、１０〜１５のＨＹＶＡＣ受精卵の９のグループ からなった。ＩＢＤＶに対する標準ワクチンはＣＥＶＡ研究室によりＩ　ＢＤ− ＢＬＥＮＴＭ（１０００ドーズ／バイアル（ｄｏｓｅｓ／ｖｉａｌ）か供された 。５０μｌの体積につき、ワクチンの１０倍、１倍、０．１倍、０．０１倍の投 与量を調製した。ＶＮＦは１倍の投与量として、８００μｇ１５０μ！体積にて 使用され、ＶＮＦの投与量は１倍（８００μｇ）及びｏ、ｉ倍（８０μｇ）１５ ０μｌ量で調製された。インオボ注射につき、５０μｐのＩＢＤ−ＢＬＥＮ及び ５０μｌのＶＮＦか混合され、ＣＥＶＡ希釈剤を使用して　２００μｌの全体積 にまてした。１８日口の古い胚に種々の投４量のＩＢＤ−ＢＬＥＮプラスＶＮＦ をワクチンとして投与し、種々の投与量のＩ　ＢＤ−ＢＬＥＮワクチンを単独で 、接種した。表９は、種々のグループか受けたワクチン処理を表わす。

鳥は酢化でき、酢化後５日日まで分けたグループで育った。このとき鳥は重さを 測り、ファブリキウス嚢は重さを測り、試験された。

９グループのファブリキウス嚢は、グループにつき３であるか、組織学的評価を 受けた。これらの組織は以下の方法で駅別に示した。即ち、０＝正常、ｌ＝少し 変化（これは、表面粘膜のわずかな異常、正常な大きさの小胞におけるリンパ球 の消耗を含む）、２−軽い変化、リンパ球の消耗及び小胞の萎縮を伴った軽い陥 入（これは、懐石のない炎症性の変化も含む）、３＝中位の変化、折りたたんで 大きさが減少する、より広範囲にわたる粘膜の陥入（はとんどの小胞は萎縮及び ／又は消耗したリンパ球であろう、より広範な炎症あるいは壊ｉ）、４＝広範な 変化、明らかに萎縮した折りたたみ（小胞上皮間は小胞様形成を引き起こす折り たたみにおいて押されるだろう。これは、より広範な炎症あるいは壊厄を伴う正 常てない小胞を含むてあろう）、５−重度、正常な構造は非常に破壊され、大き さか非常に減少して折りたたまれる。これは、広範な炎症あるいは壊厄も含む。

表９及び１０は、種々のグループ間の、体重増加、酢化の百分率、ファブリキウ ス嚢の重さ、及びファブリキウス嚢の組織を示す。ＩＢＤ−ＢＬＥＮ（７）１０ 倍投与量＋ＶＮＦ（７）１倍投与量を受けた鳥は、ＩＢＤ−ＢＬＥＮ単独の１０ 倍投与量を受けた鳥（５５％）より有為に大きい酢化可能性（１００％）を示し た。１倍のワクチン投与量レベルでも同してあった。体重増加は非接種のコント ロール（１４，８ｇ）と比へると１倍、０．１倍及び０．０１倍のＩ　ＢＤ−Ｂ ＬＥＮワクチン単独投与を受けた鳥において（表■）、減少した（５〜９ｇ）。

しかしながらＩＢＤ−ＢＬＥＮのそれぞれ同じ投与量にＶＮＦを加えると、体重 増加は有為に増加した（１７〜１８ｇ）。

本質的に体重増加と同じ効果かファブリキウス嚢において見られた。ＩＢＤ−Ｂ ＬＥＮ単独投与は、コントロール（０，１３ｇ）と比べると、５日目でファブリ キウス嚢萎縮及びファブリキウス嚢重さの減少を生じた（０．０４〜ｏ、　ｏ６ 　ｇ　）。ワクチンにＶＮＦを加えると、ファブリキウス嚢は正常な重さく０． １２〜ｏ、ｉ５ｇ）になる（表１０）。しかしなから、ファブリキウス嚢組織は 、１０倍ＶＮＦに対する１倍ウィルスのワクチンの比か、Ｉ　ＢＤＶ感染からフ ァブリキウス嚢をより完全に保護するために必要であることを示した。ワクチン に関する１倍つィルス対１倍ＶＮＦの比は、町化可能性、体重増加、及びファブ リキウス嚢重さを保護したか、いくつかの中和されていないウィルスか滑液包の リンパ球の消耗を引き起こすことを防げなかった（表１０）。

表９ 平均体重　ＳＥＭ　ｎ　町化９６ ［ＢＤ−ＢＬＥＮ　ＩＯＸ’　１　５５ｒＢＭ−ＢＬＥＮ　１０χ＋　１１．３ ９”　１．９１　１１　１００ＶＮＦ−１（ＩＸ）２ ＩＢＤ−ＢＬＥＮ　ＩＸ　５．０１Ｄ２．５５　１０　８３ＩＢＤ−ＢＬＥＮ　 ＬＸ　＋　１８．３３Ａ１．４９　１１　９２ＶＮＦ−１（ＩＸ） ［ＢＤ−ＢＬＥＮ、ＩＸ　７．７０ＣＤ！、５３　９　９１１ＢＤ−ＢＬＥＮ　 、　ＩＸ　＋　１６．４３Ａ１．６４　１０　９１ＶＮＦ−２（、ＩＸ） ＩＢＤ−ＢＬＥＮ、ＯＩＸ　８．９９ＣＤ１．２６　１０　９１１ＢＤ−ＢＥ、 ＥＮ　、０１Ｘ　＋　１７．５２Ａ１．５０　１０　１００ＶＮＦ−２（、ＩＸ ） ボッチイブ　１７トロール　１４．８０Ａ８　１．２０　１１　１００（ワクチ ン　非接種） 処理は異なった上付き記号を有するグループにつき０．０５レベルで有為であっ た。

［ＢＤ−ＢＬＥＮ（７）　’ＡＩＸ投与量ハＥＤｓｏタイター値１：５００を示 す。

ＶＮＦの”ＡＩＸは８００μｇ／ドーズを示す。

表１Ｏ ＩＢＤ−ＢＬＥＮ”及びＶＮＦによるインオボ接種及びファブ重さく重さ）ＳＥ Ｍｎ　組織スコア ＩＢＤ−ＢＬＥＮ　ＩＯＸ　１　３．３ＩＢＭ−ＢＬＥＮ　ＩＯＸ　＋　０．０ ７８　０．０１　Ｎ　３．３．３ＶＮＦ−１（ＩＸ） ＩＢＤ−ＢＬＥＮＩＸ　Ｏ，０４８０，００１０３，４，４［ＢＤ−ＢＬＥＮＩ Ｘ＋０．１２Ａ０．０２　１！　３，３．３ＶＮＦ−１（ＩＸ） ［ＢＤ−ＢＬＥＮ、ｌＸ　Ｏ，０６’　（１００９３，４，３ＩＢＤ−ＢＬＥＮ 　、ｌＸ　＋　０．１１ＡＯ，０１１０３，３，４ＶＮＦ−２（、ＩＸ） ＩＢＤ−ＢＬＥＮ、０１Ｘ　Ｏ，０６８０，０＋　６　３．３，５ＩＢＤ−ＢＬ ＥＮ　、０１Ｘ　＋　０．１５ＡＯ，０２６０，０，２ＶＮＦ−２（、ＩＸ） ボッチイブ　コント叶ル　０．＋３Ａ　Ｏ，０１８０，０，１処理は異なった上 付き記号を有するグループにつき０．０５レヘルて有為てあった。

実施例１１ インオボのＶＮＦ及び生ウィルスの投与によるヒヨコの免疫この実施例は、ＶＮ Ｆ−Ｉ　ＢＤＶ接合体か、伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス（ＩＢＤＶ）に対 してチキンを実際に免疫することを例示することによって、上記実施例１０をお し進めるものである。本実施例においてＶＮＦはＣＥＶＡ　ＩＢＤ−ＢＬＥＮ” ワクチンで前インキニーベートされ、そのワクチンは推薦される最適濃度より少 ない濃度て供され、ワクチン接種後３９Ｂ１（あるいは酢化後３５日日）てＵＳ ＤＡ−Ｉ　ＢＤＶの攻撃を受ける前に混合物はインオポ受精卵に投与された。

研究はｌＯのグループからなった。ＨＹＶＡ卵はグループ１〜６て使用され、５ ＰＡＦＡＳ卵はグループ７〜ｌＯで使用された。

各グループは分かれた独立の単位で育てられ、全単位は、同じ室に置かれた。処 理は、投与される材料により、及び投与の方法により異なった。処理グループ、 投与量、及び試料サイズは以下の表■に示される。

ベースラインデータは、ポジティブコントロールグループ（グループ１及び７） から、及びネガティブコントロールグループ（グループ２及び８）から集められ た。多産の、活力ある５ＰＡＦＡＳ−３ＰＦおよびＨＹＶＡＣ卵はインキュベー ションの１８日目にインオボで手による注射によりワクチン接種された。

注射は卵の頂部から羊膜中になされた。注射の体積は２００μｐであった。測定 したパラメータは酢化可能性、酢化重さ、ＢＤ抗体タイター、体重、ファブリキ ウス嚢重さ、及びファブリキウス嚢組織てあった。

本実施例結果は、以下の表１２〜１５に示される。

例示されたＴＢＤ−ＢＬＥＮを混合したＶＮＦを受けたＨＹＶＡＣ鳥は、ワクチ ン単独を受けた鳥（３２％）と比へると酢化可能性が増加した（８２％）、モし てＶＮＦの濃度（８２〜４７％）か高い程鼾化可能性がよいことか分かった（表 １２）。Ｓ　ＰＡＦＡｓｈ化可能性は、酢化中に生じた他の問題のために、比較 することかできない（表１２）。しかしなから、研究の残りの部分のために、生 き残っているものは、パラメータの研究の実験のために、たよりになる鳥である ことを表わす。３５日目の死亡率はワクチン単独あるいは低投与量のＶＮＦを組 み合わせたワクチンを受けたグループにおいてより高かった（表１２）。ワクチ ンに混合するに際し、ＶＮＦの投与量か多いと高死亡率から守る（データはコン トロールに似ている）。

ＩＢＤ−ＢＬＥＮと混合しｆ、−Ｖ　Ｎ　Ｆを受ケタＨＹ　Ｖ　Ａ　Ｃ鳥は、Ｕ ＳＤＡ−Ｉ　ＢＤＶ（７）攻撃の後、正常な体重増加（４５〜５９ｇ）を示した が、非接種の鳥は低い体重増加（５，６ｇ　）を示した（表１３）。ＶＮＦ単独 の接種はＵＳＤＡ攻撃から守らなかった。また、これらのグループの死亡率は非 接種のコントロールに比べると減少した（表１２）。

一般に、ウィルスに対するＶＮＦの比が高いと、ＵＳＤＡの攻撃の後、ファブリ キウス嚢の保護か増加する（表１４）。非接種のコントロールファブリキウス嚢 は、攻撃後、非常に出血し、浮腫を生じた（表１４）。ワクチン単独を受けた鳥 は攻撃後、ファブリキウス嚢が非常に萎縮し、ワクチンとＶＮＦを受けた鳥は部 分的にファブリキウス嚢が萎縮した。

Ｉ　ＢＤ−ＢＬＥＮの混合物を接種された鳥は、ＩＢＤ−ＢＬＥＮ単独を受けた 鳥より、ＵＳＤＡ−ＩＢＤＶの攻撃に対して有為に高い抗体タイターを示した（ 表１５）。これは、これらの鳥がウィルスワクチン単独を受けた鳥に比へて、接 種後に成長にわたって第２の伝染に対して非常に高い保護を有したことを示す。

再び、ウィルスと混合されると、ＶＮＦの最低投与量に抗体タイターか低下しは じめることが分かる。このことは、接種てファブリキウス嚢に大きすぎるダメー ジが生じると、抗体タイターによる保護か鳥の命の残りの間に失われることを示 している。

表　１１ 処理グループ　投与量　および試料サイズ表　１１（つづき） 処理グループ　投与量　および試料サイズ８　ネガティブ　、ＩＸ　４７　２５ コントロール ＩＢＤ−ＢＬＥＮ” 十ＶＮＦ（投与量１） １０　［ＢＤ−ＢＬＥＮ”（、ＩＸ）、ＩＸ　４７８０　２５＋　ＶＮＦ（投与 量２） ＩＢＤ−ＢＬＥＮの’Ａ　ＬＸ投与量（または標準投与量）はＥＤ、、タイター 値１：５００を示す。

２ＶＮＦ投与量１−１標準ＶＮＦ投与量（８００μｇ／ドーズ）　、ＶＮＦ投与 量２＝、ＩＸ標準ＶＮＦ投与量及びＶＮＦ投与量３＝、ＯＩＸ標準ＶＮＦ投与量 表　１２ ＩＢＤ−ＢＬＥＮＴＭ＃、Ｊｌ、びｖＮＦによるインオホ接種、オヨび貯化可能 性および死亡率の効果 １　１６／２１　７６．２’　０／１６　０．０Ａ７／１６　４３．８Ｂ２　１ ２／３８　３６．６”　４／１２　３３．０ＡＯ／８　０．０Ｂ３　１８／２２ 　８１．８ＡＯ／１８　０．０Ａ１／１８　５．６８４　１６／２２　７２．７ Ａ１／１６　６．３ＡＯ／１５　０．０’５　１８／３８　４７．４Ａ８５／１ ８　２７．８ＡＩ／１３　７．７’６　１５／２１　７１．４Ａ８０／１５　０ ．０Ａ２／１５　１３．３１１７　１３／２５　５２．０’″　７／１３　５３ ．８“ｂｌ／６　１６．６Ａ８　１１／２５　４４．０’　１０／１１　９０． ９ｂＯ１０Ｏ，ＯＡ９　７／２５　２８．０’　１／７　１４．３ｂＯ／６　０ ．ＯＡ異なる上付き記号はχ２解析による有意な差を示してし）る。

表　１３ ＩＢＤ−ＢＬＥＮＴＭおよびＶＮＦのインオボのワクチン投与並びに酢化後３５ 日日におけるＵＳＤＡ、−ＩＢＤＶ攻撃後のＳＰＦチキンの体重増加量に対する 効果 グループＮα　平均値（ｇ）　ＳＥＭ　ｎ３５〜３９日目の体重日日量 １　５．６１８６．９９　９ ２　５９．２９Ａ３．６３　８ ３　４５．６４Ａ１．８１　１７ ４　’　５６．２６Ａ２．９４　１５ ５　５０．２８Ａ５．９８　１２ ６　１６．３３Ｂ４．８０　１３ ７　１８．２０°　０．６２　５ ８　５７、９０　１ ９　４３．３５ｂ６．２６　６ １０　６２．６０”　４．６４　８ 異なる肩字を有する平均値は０．０５のレベルにおいて有意に異なった（　５Ｐ ＡＦＡＳの０．１ｘの処理は統計的分析に含まなかった）表１４ ＤＶ攻撃後のＳＰＦチキングループのファブリキウス嚢の重量グループＮα　平 均値（ｇ）　ＳＥＭ　ｎ３９日目Ｏ７ァブリキウス嚢の重量 １　２．０３Ａ０．２９　９ ２　０．５５′ＩＯ，２０８ ３０，７３Ｂ０．０７　１７ ４０．６２”　０．１２　１５ ５　０．４７８０．０９　１２ 異なる扇子を有する平均値は０．０５のレベルにおいて有意に異なった（　５Ｐ ＡＦＡＳの０．ＩＸの処理は統計的分析に含まなかった）表１５ ＵＳＤＡ−ＩＢＤＶ攻撃後の抗体タイターの効果１　０．６６’　０．７１　０ ．２４　９　４．５７２　２．１５’　Ｑ、９３　０．３３　８　１４１．２５ ’３　３．３３ＡＯ，２９０，０７１７２１３７，９６”４　３．３１ＡＯ，４ ００，１０１５２０４１，７４５２，９５Ａ０．７６　０．２２　１２　８９１ ．２５６　０．６１°　０．５９　０．］、７　１２　４．０７７　０．８５’ 　０．５４　０．２４　５　７．０８８　０．３０　０．００　０．００　１　 ２．００９　３．３０′″　０．２０　０．０８　６　１９９５．２６異なる上 付き記号の付いている平均値は０．０５レベルにおいて有意に異なっている。

■グループ２において、１３９６の鳥は１０００より高いタイターを有し、およ び８７％は１０００より低いタイターを有していた。

２グループ３において、８２９イの鳥は１０００より高いタイターを有し、およ びｌ８９６たけは１０００より低いタイターを有していた。

実施例採 本例は前記実施例７に記載したチキン繊維芽細胞アツセイてＶＮＦの他の供給源 を示す。

表１６は種々の鳥からの血清試料の１ＢＤＶに対するウィルス中和タイター並び に対応するイライザ（ＥＬＩＳＡ）タイターを示す。このデータから若干の血清 試料（／％イライン（Ｈｙｌｉｎｅ）チキン］は、極めて高いイライザ　タイタ ーと対応するウィルス中和タイターを有することを知ることかできる。従ってＩ ＢＤＶに極めて強力に結合するがＩＢＤＶを中和しない抗体を有することは可能 である。ハイライン　チキンをＲ３Ｖて攻撃し、腫瘍を退行させ、ＩＢＤＶに対 して結合する抗体を生成したが、Ｉ　ＢＤＶに対するウィルス性中和抗体を生成 しなかった。アーカンソー　レグレッサ系統チキン血清試料はＩＢＤＶに対し結 合および中和活性を有する。

興味ある観察は、アーカンソー大学およびミシン・ノビ−州立大学の両者からの 攻撃されなかったジャングル　ホウル　チキンはＩ　ＢＤＶに対する中和抗体を 有する血清を生成することである。また表１６はＶＮＦと同様の活性かＩＢＤＶ で無害化したスバファス（ＳＰＡＦＡＳ）チキンの血清に見出されることを示す 。

表１６ 種々の血清試料のウィルス中和活性およびイライザタイター、ＶＮＦ（５０７７ Ｄ）オヨび（ＢＤＶ＋ニ一対ｔ６ＳＰＡＦＡＳ　ＩＢＤＶ抗血清血清 実施例１３ 本例の目的はＶＮＦ−Ｔ　ＢＤ−ＢＬＥＮＴＭ混合物をＵＤＳＡ−ＩＢＤＶ攻撃 ウィルスの第２攻撃に対する免疫を刺激するため瞬化後１〜２日にチキンに筋肉 （ＩＭ）注射により投与した場合その効率を試験することである。

ＩＢＤ−ＢＬＥＮ”菌株に極めて敏感であり、ワクチンを認可するための調整研 究に代表的に使用された約１６０匹の健康な１日または２日令のハイ−バック（ ｔ（ｙ　−Ｖａｃ）チキンを用いた。

ワクチン投与した鳥の攻撃を伝染性ファブリキウス嚢病ウィルス（７）ＵＳＤＡ 攻撃菌株（ＵＳＤＡ−ＩＢＤＶ−ＣＶ）（７）Ｏット＃８３−１、＋０３”　Ｅ 　Ｉ　Ｄ　ｓｏ／ｍｌを用いて実施した。ＩＢＤＶに対する標準ワクチンはサノ フィ（Ｉ　ＢＤ−ＢＬＥＮＴＭ）から１０００ドーズ／バイアル、１０”　７Ｅ 　Ｉ　Ｄ　ｓｏ／ドーズて得た。アーカンソー　レグレッサ系統の鳥からのＶＮ Ｆを上述の如くして１．５Ｘリン酸緩衝液、（ＰＢＳ）ｐＨ７，４に１６．００ ０　ｕ　ｇ／ｍｌとして調整した。その活性をマイクロ中和アッセイにおいてバ イ−バックチキン繊維芽細胞を用いＩＢＤＶのルカート（Ｌｕｋｅｒｔ）菌株に 対するウィルスの中和活性により決定した。純度をＨＰＬＣによりチェックした 。

Ｉ　ＢＤ−ＢＬＥＮＴＭＩ　Ｘまたは０．ＩＸドースのワクチンを受入れた各チ キンは左足のももに１Ｍ注射により１００μＩＩＢＤ−ＢＬＥＮ”調整物を投与 された。１００μｍの全長は５０μｌのＴ　ＢＤ−ＢＬＥＮ”　（ｌ　Ｘまたは ０．Ｉ　Ｘ）　＋５０μｌ　ＣＥＶＡ稀釈剤稀釈酸る。（グループ２−ＩＸドー ズ、グループ５−０．ＩＸドーズ）。

ＩＢＤ−ＢＬＥＮ”ＩＸ＋ＶＮＦ　（ドーズ１またはドーズ２）或いは０．１　 Ｘ十ＶＮＦ　（ドーズｌ）を受入れた各チキンに１Ｍ注射により１００μｌのワ クチン混合物を投与した。１００μｌの全量は５０μｌ　ＩＢＤ−ＢＬＥＮ”（ ＩＸまたは０．１　Ｘ）＋５０μＶＮＦ　（ドーズ１またはドーズ２）から構成 された。（グルーＶＮＦのみを受入れた各チキンに１Ｍ注射により１００μｌの ＶＮＦ調整物を投与した。１００μｌの全量は５０μｌ　ＶＮＦ−ドーズｌ＋５ ０μｌ　ＣＥＶＡ稀釈剤稀釈酸成された。（グループ７）ＵＳＤＡ−Ｉ　ＢＤＶ 攻撃ワクチンを受入れた各チキンにワクチン投与後２１日に冬眠に３０μｌの調 製物を投与する。両眼に必要とされる６０μＩの全量はＥＩＤｓｏ／ｍｌである ＵＳＤＡ−Ｉ　ＢＤＶ株ウィルスの１．８稀釈の調製物から構成された。（１， ４ｍ１ＵｓＤＡ−Ｉ　ＢＤＶ＋９．８ｍｌ　ＣＥＶＡ稀釈剤稀釈酸、　５Ｅ　Ｉ 　Ｄ　！。

／３０μｌ）。

この実験のデータを下記の表１７に示す。グループ６の鳥はウィルス−ＶＮＦ接 合体におけるワクチンウィルスから１０日の保護を示した。従ってこの研究から のデータは０．ＩＸドーズのＩＢＤ−ＢＬＥＮ”を１３６単位のＶＮＦて中和ま たは抑制してウィルス−ＶＮＦ接合体におけるウィルスから繊維芽細胞を１０日 まで保護することが可能であることを示す。更に、これ等の鳥を２９日にＵＳＤ Ａ攻撃菌株で攻撃する場合に、鳥は攻撃から保護されることを示す（体重の減少 なし、死亡早業）。

実施例１４ この実験の目的は、免疫学的および病理学的変化をサノフイＩＢＤ−ＢＬＥＮ” の注射を受けたチキンの２１日令時点抗体タイターおよびファブリウキス嚢パラ メータによって評価することてあり、そのサノフィＩＢＤ−ＢＬＥＮＴＭはＳＣ ノ１イライン血清とともに製置し、完全なワクチン接合体として鳥の首に皮下注 射したものである。

に強い健康な１日令ハイバッチＳＰＦチキン（総数約９０）をこれらの研究に使 用した。

ＳＣ＝血清（”３５０００　μｇ／ｍｌ、＃ＳＣ２２２９０，ＥＤｓ０／、、１ 　：　３００００００は、ＶＮＦを含み、既知の手法に従ってサノフィＩＢＤ− ＢＬＥＮ”をＳＣ１＼イラインチキンに補充することによって生成する全血清で ある。

ＩＢＤ−ＢＬＥＮ”、およびＳＣ１＼イライン血清は使用するまて４°Ｃに保存 した。一旦調製したＩＢＤ−ＢＬＥＮＴＭワクチンおよび血清−ＩＢＤ−ＢＬＥ Ｎ”混合物は接種前１時間、室温に保った。

この研究における種々の実験グループおよび対照グループのデータを表１８に示 す。これらのデータは、ＶＮＦの濃度が３１６に等しいかそれ以上で、ファブリ キウス嚢は１日日にワクチン血清接合体を与えたものにおいて２２日においてワ クチン　ウィルスから重量が保護されることを示す。

実施例１５ サノフィＩＢＤ−ＢＬＥＮ１ＭはＳＰＦチキンにワクチン投与後３〜９日で急性 および慢性ファブリキウス嚢病害を起し得る有毒生ウィルスである。このワクチ ンを１〜２日令バイバックＳＰＦチキンに用いた以前の実験は、ｌＸ〜Ｏ，０Ｏ ０１ＸドーズのＩＢＤ−ＢＬＥＮ”の筋肉および皮下接種後１０〜１４日でファ ブリキウス嚢萎縮を示した。

この研究で、若干の１日令ハイバックＳＰＦチキンに種々のドーズのサノフィＩ ＢＤ−ＢＬＥＮ”だけおよび種々のドーズＶＮＦ　ＳＣハイライン血清と組合せ 皮下にワクチン投与した。

ワクチン投与したチキンおよび対照チキンを１５日又は２２日にファブリキウス 嚢の形態並びに肉眼の病変を調べＵＳＤＡ−ＩＢＤＶ攻磐菌種て２９日に攻撃し て免疫原性を確かめた（ワクチン投与後１４．２１および２８日）。この実験の 目的は免疫および病状の変化を、種々のドーズのサノフィＩＢＤ−ＢＬＥＮＴＭ だけを１日で（ワクチン投与後１４．２１および２８日）接種したチキンおよび 種々のドーズのＳＣハイライン血清と一緒に培讐し完全なワクチンとして投与し たチキンについて１５および２２日に抗体夕イターおよびファブリキウス嚢パラ メータにて評価することである。

ＩＢＤ−ＢＬＥＮ”’７りｆン投与およびＵＳＤＡ−Ｉ　ＢＤＶ攻撃に敏感であ る健康な一日令ハイバックＳＰＦチキンをこの研究に用いた。ＳＣ−血清（４０ ，０００μｇ／ｍ、　＃　５−１８−９０．　夕１：　５１１．０００のＥＤｓ ｏ／ｍｌ）はＶＮＦを含有する全血清であり、ＳＣハイライン　チキンにサノフ ィＩＢＤ−ＢＬＥＮＴＭを補充することにより生成する。ＩＢＤＶ、ＩＢＤ−Ｂ ＬＥＮＴＭに対する市販のワクチンはサノフィ　ラボラトリーズにより１０００ ドーズ／バイアル、ＩＱ”ＥＩＤ５゜タイターで供給される。伝染性ファブリキ ウス嚢ウィルス、ロット＃８３−３．　１０３’　Ｅ　Ｉ　Ｄ、。／ｍｌのＵＳ ＤＡ−攻撃菌株を攻撃として使用した。ワクチン投与を皮下注射により行いＵＳ ＤＡ−ＩＢＤＶ攻撃を酢化後２９日に眼に点滴することにより行った。

この実験からのデータを一部表１９に示す。示す結果は３３８単位のＶＮＦのド ーズおよび０．ＯＩＸのワクチン　ドーズ（２，２４Ｅ■ＤＳｏ／ドーズ）で、 ファブリキウス嚢は１５日および２２日（こワクチン　ウィルスから保護され、 ２９日にＵＳＤＡ攻撃菌種に対し確実に免疫にされた。２９日にＵＳＤＡ攻撃後 このグループでは正常な体重増加かあり死亡率は零であった。

１、負の対照を除き全てのグルニブに対し４７Ｅ　Ｉ　Ｄ　ｓｏ／鳥て酢化後２ ９日限に点滴して投与したＵＳＤＡ−Ｉ　ＢＤＶ攻撃菌株。

２、示してないが統計的分析。

３、０．０１　ＸドーズのサノフィＴＢＤ−ＢＬＥＮで２．２４Ｅ　Ｉ　Ｄｓｏ ／ドーズ（ロフト＃　２９９６７）を含む。

４、ウィルス中和活性はＳＣハイライン　チキンからのＶＮＦを含む全血清、単 位１５０μｌ　ドーズとして表わす。

本　ＩＢＤＶで汚染されたグループ。

上記実施例は本発明を例示するもので、本発明を制限せんとするものではない。

本発明は次の請求の範囲および請求の範囲と同等のことにより規定される。

イ芝来／１反ｙ′身斤犬見なウィルス中上■椙千自棄蚤製士便九律１１児Ｃｂ） 縄製用ＴＳＫ−ＨＰＬＣ頼製 （ｃ　）　５Ｄ５−ＰＡ＃を気う；亭ζ、１１フ１（１１）ウィルス中測アアτ イ 口２ ウィルス中刹■］壬ｊ千１校１０−吟ｉ−に刀７ 匹Ｄ４のヒーワｌｒヲ曵を出４〒イｂし０巳６ アー刀ンソーしグレ７ザ旦涜め〉Ｌすに血清へ脅ｎ溶ム肩プｉａ 国９ し”ｔＢｔ＋ｌビーワｆｆｔ￥−め典イ首工１Σ右−辷６シ中し］呂１０ テ〕ｅのピー９■の￥二り虱ｔ［ｔ＋ハｉ弘脅オ５丘］圀１１ ｆ２ イ、ｔ！ｒＶＮＦα々ａ勺ハラ社商１シ阻国際調査報告

Claims (50)

【特許請求の範囲】
1. １．動物被検体にウイルス性疾患に対する能動免疫を生成させるための薬物を製 造するためにワクチン接合体を使用する方法であって、このワクチン接合体が、 生ウイルス及びこの生ウイルスに結合した中和因子からなり；この中和因子が、 抗体及び抗体フラグメントからなる群より選択され；かつ この抗体又は抗体フラグメントが生ウイルスを中和する能力を有している、ワク チン接合体の使用方法。
2. ２．前記生ウイルスが、前記被検体に疾患を引き起こす能力を有している、請求 項１によるワクチン接合体の使用方法。
3. ３．前記生ウイルスが、被検体に生ウイルスに対する免疫応答を生成させる能力 を有する、請求項１によるワクチン接合体の使用方法。
4. ４．前記生ウイルスがトリウイルスであり、前記被検体がトリである、請求項１ によるワクチン接合体の使用方法。
5. ５．前記生ウイルスがラウス家鶏肉腫ウイルスである、請求項４によるワクチン 接合体の使用方法。
6. ６．前記生ウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスである、請求項４によ るワクチン接合体の使用方法。
7. ７．前記生ウイルスが、伝染性気管支炎ウイルスである、請求項４によるワクチ ン接合体の使用方法。
8. ８．前記生ウイルスがニューキャッスル病ウイルスである、請求項４によるワク チン接合体の使用方法。
9. ９．前記中和因子が、ＩｇＧ免疫グロブリン及びＩｇＧ免疫グロブリンフラグメ ントからなる群より選択されている、請求項１によるワクチン接合体の使用方法 。
10. １０．前記中和因子がポリクローナル起源のものである、請求項１によるワクチ ン接合体の使用方法。
11. １１．前記中和因子がモノクローナル起源のものである、請求項１によるワクチ ン接合体の使用方法。
12. １２．前記被検体に前記ワクチン接合体を皮下投与する、請求項１によるワクチ ン接合体の使用方法。
13. １３．前記被検体に前記ワクチン接合体を腹腔内注射によって投与する、請求項 １によるワクチン接合体の使用方法。
14. １４．前記被検体に前記ワクチン接合体を筋肉内注射によって投与する、請求項 １によるワクチン接合体の使用方法。
15. １５．前記被検体がトリであり、前記投与工程をインオボで実施する、請求項１ によるワクチン接合体の使用方法。
16. １６．前記被検体が以前に前記生ウイルスに感染したことがない、請求項１によ るワクチン接合体の使用方法。
17. １７．動物被検体にウイルス性疾患に対する能動免疫を生成させるのに有用なワ クチン調製物であって、このワクチン調製物が、 ワクチン接合体を含む薬剤学上許容可能な調合物からなり、前記ワクチン接合体 が、生ウイルスとこの生ウイルスに結合された中和因子とからなり、 この中和因子が、抗体及び抗体フラグメントからなる群より選択されており、 前記抗体又は抗体フラグメントが前記生ウイルスを中和する能力を有しており、 かつ 前記ワクチン接合体が、前記薬剤学上許容可能な調合物中に、前記被検体に前記 生ウイルスに対する免疫応答を生成させるのに有効な量含有されている、ワクチ ン調製物。
18. １８．前記生ウイルスが、前記被検体に疾患を引き起す能力を有する、請求項１ ７記載のワクチン調製物。
19. １９．前記生ウイルスが、前記被検体に生ウイルスに対する免疫応答を生成させ る能力を有する、請求項１７記載のワクチン調製物。
20. ２０．前記の薬剤学上許容可能な調合物が凍結乾燥されている、請求項１７記載 のワクチン調製物。
21. ２１．前記の薬剤学上許容可能な調合物が、薬剤学上許容可能な担体を含む、請 求項１７記載のワクチン調製物。
22. ２２．前記の薬剤学上許容可能な担体が液状担体である、請求項２１記載のワク チン調製物。
23. ２３．前記の薬剤学上許容可能な担体が水性担体である、請求項２１記載のワク チン調製物。
24. ２４．前記の薬剤学上許容可能な調合物が更にアジュバントを含有している、請 求項１７記載のワクチン調製物。
25. ２５．前記の薬剤学上許容可能な調合物が更に安定化剤を含有している、請求項 １７記載のワクチン調製物。
26. ２６．前記生ウイルスがトリウイルスである、請求項１７記載のワクチン調製物 。
27. ２７．前記生ウイルスがラウス家鶏肉腫ウイルスである、請求項１７記載のワク チン調製物。
28. ２８．前記生ウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスである、請求項１７ 記載のワクチン調製物。
29. ２９．前記生ウイルスが伝染性気管支炎ウイルスである、請求項１７記載のワク チン調製物。
30. ３０．前記生ウイルスがニューキャッスル病ウイルスである、請求項１７記載の ワクチン調製物。
31. ３１．前記中和因子が、ＩｇＧ免疫グロブリン及びＩｇＧ免疫グロブリンフラグ メントからなる群より選択されている、請求項１７記載のワクチン調製物。
32. ３２．前記中和因子がポリクローナル因子である、請求項１７記載のワクチン調 製物。
33. ３３．前記中和因子がモノクローナル因子である、請求項１７記載のワクチン調 製物。
34. ３４．閉じられた病原体不透過性の容器とこの容器内に包含された無菌ワクチン 調製物とを備えた製造品であって、前記ワクチン調製物が、動物被検体にウイル ス性疾患に対する能動免疫を生成させるのに有用であり、このワクチン調製物が 、ワクチン接合体を含む薬剤学上許容可能な調合物からなり、前記ワクチン接合 体が、生ウイルスとこの生ウイルスに結合された中和因子とからなり、 この中和因子が、抗体及び抗体フラグメントからなる群より選択されており、 前記抗体又は抗体フラグメントが前記生ウイルスを中和する能力を有しており、 かつ 前記ワクチン接合体が、前記薬剤学上許容可能な担体中に、前記被検体に前記生 ウイルスに対する免疫応答を生成させるのに有効な量含有されている、製造品。
35. ３５．前記生ウイルスが、前記被検体に疾患を引き起す能力を有する、請求項３ ４記載の製造品。
36. ３６．前記生ウイルスが、前記被検体に生ウイルスに対する免疫応答を生成させ る能力を有する、請求項３４記載の製造品。
37. ３７．前記の薬剤学上許容可能な調合物が凍結乾燥されている、請求項３４記載 の製造品。
38. ３８．前記の薬剤学上許容可能な調合物が、薬剤学上許容可能な担体を含む、請 求項３４記載の製造品。
39. ３９．前記の薬剤学上許容可能な担体が液状担体である、請求項３８記載の製造 品。
40. ４０．前記の薬剤学上許容可能な担体が水性担体である、請求項３８記載の製造 品。
41. ４１．前記の薬剤学上許容可能な調合物が更にアジュバントを含有している、請 求項３４記載の製造品。
42. ４２．前記の薬剤学上許容可能な調合物が更に安定化剤を含有している、請求項 ３４記載の製造品。
43. ４３．前記生ウイルスがトリウイルスである、請求項３４記載の製造品。
44. ４４．前記生ウイルスがラウス家鷄肉腫ウイルスである、請求項３４記載の製造 品。
45. ４５．前記生ウイルスが伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスである、請求項３４ 記載の製造品。
46. ４６．前記生ウイルスが伝染性気管支炎ウイルスである、請求項３４記載の製造 品。
47. ４７．前記生ウイルスがニューキャッスル病ウイルスである、請求項３４記載の 製造品。
48. ４８．前記中和因子が、ＩｇＧ免疫グロブリン及びＩｇＧ免疫グロブリンフラグ メントからなる群より選択されている、請求項３４記載の製造品。
49. ４９．前記中和因子がポリクローナル因子である、請求項３４記載の製造品。
50. ５０．前記中和因子がモノクローナル因子である、請求項３４記載の製造品。