KR100767018B1

KR100767018B1 - 종양 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화를측정하는 방법

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Publication number: KR100767018B1
Application number: KR1020060043411A
Authority: KR
Inventors: 고정헌; 김용삼; 유향숙; 유종신; 오세정; 김철호; 김남순
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-05-15
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2007-10-12
Also published as: WO2007132967A1

Abstract

본 발명은 종양 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 좀더 상세하게는 종양의 발생과 전이에 관여하는 여러 당단백질의 N-연결형 당쇄 변화를 측정하는 방법에 관한 것이다.

당단백질, 측정, 당쇄

Description

종양 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화를 측정하는 방법{An analyzing method for measuring the changes of glycosylation in various glycoprotein}

도 1은 N-연결형 당쇄와 당전이효소가 촉매하여 얻어지는 당쇄, 그리고 렉틴 L-PHA가 인식하는 당쇄 가지를 나타낸 모식도이다.

도 2는 당전이효소 GnT-V에 의해 β1,6 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)이 부가되는 반응을 나타낸 모식도이다.

도 3은 대장암 세포주 WiDr이 상대적으로 GnT-V(N-acetylglucosaminyl-transferase-V; 이하 "GnT-V")의 발현이 낮으며 과발현 세포주의 구축시 GnT-V가 높게 발현됨을 보여주는 노던 블럿(Northern-Blot)결과이다.

도 4는 대장암 세포주 두 가지(대조구(Mock), GnT-V 과발현 세포주)의 무혈청 배양액에 대하여 수행한 2차원 전기영동과 L-PHA 블럿팅을 수행한 사진이다.

도 5는 ESI/Q-TOF을 이용하여 TIMP-1의 아미노산 서열을 결정한 한 크로마토그램의 예를 제시한 것이다.

도 6은 TIMP-1에 의해 MMP-3가 저해되는 기전을 밝힌 논문에 실린 구조 사진이다.

도 7은 지금까지 알려진 TIMP 시리즈의 단백질과 각각의 발현특성 및 당질화 등을 정리한 표와 그 구조 모델이다.

도 8은 지금까지 알려진 MMP 효소의 작동 모식도와 구조에 관한 그림이다.

도 9는 TIMP-1에 두 개의 N-연결형 당쇄의 위치와 그 변이주를 제작하는 도식과 구조를 보여주는 그림이다.

도 10은 TIMP-1의 당쇄 변이주를 대장암 세포주 WiDr에 도입한 다음 각각의 발현 정도를 면역블럿으로 보여주는 사진이다.

도 11은 WiDr:mock과 WiDr:GnT-V 세포주에서 정제한 TIMP-1에 대하여 간접적으로 구조를 알아보기 위하여 2차원 전기영동을 수행하고 TIMP-1자체에 대한 면역 블럿, β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지를 인식하는 L-PHA 블럿, 락토스아민(lactosamine)을 인식하는 렉틴 DSA 블럿의 사진이다.

도 12는 N-연결형 당쇄가 ‘잘못된 당질화’에 이르는 경로를 설명하는 모식도이다.

도 13은 폴리카보네이트 필터를 이용하여 다양한 TIMP-1 변이주에 대하여 암세포의 이동을 측정하는 방법과 결과의 그림이다.

도 14는 매트릭스로 코팅된 마트리겔을 이용하여 다양한 TIMP-1 변이주에 대하여 암세포의 침윤을 측정하는 방법과 결과의 그림이다.

도 15는 대장암 세포주 WiDr의 mock과 GnT-V 트랜스펙턴트(transfectant)에 대하여 MMP-2와 -9에 대한 자이모그래피(zymography) 사진으로 MMP 발현 상의 차이가 없음을 제시하고 있다.

도 16은 MMP의 활성 조사에서 형광기질을 이용하여 MMP의 작용으로 형광을 띠게 되는 원리를 설명하는 그림이다.

도 17은 MMP-2에 대하여 형광기질을 이용, TIMP-1의 변이주들 사이의 MMP-2에 대한 저해능력의 차이를 조사한 그림이다.

도 18은 MMP-9에 대하여 형광기질을 이용, TIMP-1의 변이주들 사이의 MMP-9에 대한 저해능력의 차이를 조사한 그림이다.

도 19는 MMP-2와 -9의 젤라틴 분해능력을 보여주는 자이모그래피 사진으로 TIMP-1의 변이주들 사이의 차이를 보여주고 있다.

도 20은 TIMP-1:mock 세포주에 대하여 MMP-2의 기질분해 능력(형광값)을 시간에 따라 조사하여 TIMP-1과 MMP-2 사이의 결합의 세기를 보여주는 카이네틱스를 실시한 도표이다.

도 21은 TIMP-1:GNT-V 세포주에 대하여 MMP-2의 기질분해 능력(형광값)을 시간에 따라 조사하여 TIMP-1과 MMP-2 사이의 결합의 세기를 보여주는 카이네틱스를 실시한 도표이다.

도 22는 MMP-2에 대하여 TIMP-1:mock과 TIMP-1:GNT-V 사이의 시간에 따른 저해능력의 차이를 보여주는 도표이다.

도 23은 TIMP-1:mock 세포주에 대하여 MMP-9의 기질분해 능력(형광값)을 시간에 따라 조사하여 TIMP-1과 MMP-9사이의 결합의 세기를 보여주는 카이네틱스를 실시한 도표이다.

도 24는 TIMP-1:GNT-V 세포주에 대하여 MMP-9의 기질분해 능력(형광값)을 시 간에 따라 조사하여 TIMP-1과 MMP-9사이의 결합의 세기를 보여주는 카이네틱스를 실시한 도표이다.

도 25는 MMP-9에 대하여 TIMP-1:mock과 TIMP-1:GNT-V 사이의 시간에 따른 저해능력의 차이를 보여주는 도표이다.

도 26은 TIMP-1을 보유한 세포주를 누드 마우스에 이식하여 피하에서 암이 형성되는 예를 보여주는 사진이다.

도 27은 GnT-V:TIMP-1의 각 변이주가 시간에 따라 암이 형성되는 정도를 비교한 도표이다(n=4).

도 28은 mock:TIMP-1의 각 변이주가 시간에 따라 암이 형성되는 정도를 비교한 도표이다(n=4).

도 29는 조직병리학적인 현미경 사진으로 TIMP-1의 ‘잘못된 당질화’로 인하여 근육조직 내로 암세포가 침윤되어 들어갔음을 보여주는 사진이다.

도 30은 세 가지 세포주(야생형, T-WT: GnT-V, T-N30/78Q: GnT-V)에 대하여 각각 열 마리를 이식하고 형성된 암의 정도를 비교한 도표이다.

도 31은 대장암 환자의 조직에서 각 단계마다 RT-PCR을 통해 GnT-V의 발현 정도를, 면역 블럿을 통해 TIMP-1의 발현 정도를 비교한 도표이다.

도 32는 대표적인 열 명의 환자 조직에 대해 정상과의 차이를, TIMP-1의 발현, GnT-V의 RT-PCR, 그리고 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지를 인식하는 L-PHA 블럿을 수행한 사진이다.

도 33은 TIMP-1에 GnT-V에 의하여 ‘잘못된 당질화’가 일어남으로 인해 MMP 활성을 저해하지 못하고 궁극적으로 발암 전이에 이르게 되는 과정을 설명하는 모식도이다.

도 34는 항체와 렉틴을 이용하여 표적 당단백질을 이중으로 검출해내는 ELISA 방법을 모사한 그림이다.

본 발명은 종양 발생 및 전이에 관여하는 여러 당단백질의 당쇄 변화를 측정하여 분석하는 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 종양의 발생과 전이에 관여하는 당단백질의 N-연결형 당쇄 변화를 측정하고 이 당쇄 변화로 인하여 암의 발생과 전이 정도를 확인하는 방법에 관한 것이다.

단백질의 기능을 분석하기 위한 방법으로는 오래전부터 전기영동 방법의 일종으로 2차원 전기영동 방법이 많이 사용되어 왔으나 최근 들어 MALDI-TOF와 같은 질량분석기기의 발달과 N-말단 아미노산 서열 결정이 쉬워지면서 포스트 게놈(Post-Genome) 시대의 기능 분석 방법으로서 프로테오믹스(proteomics)가 등장하였다. 그러나 프로테오믹스는 다이내믹하게 움직이는 생체에 대하여 정지된 한 시점이 선택적으로 분석되므로 복잡한 신호 전달의 결과로 발생하는 것으로 알려진 종양에 대한 연구에는 어느 정도 한계를 지니고 있으며, 실제 단순 염색에 의해 새로 운 스팟(spot)의 출현보다는 신호전달의 결과물로서 단백질 발현량의 증가나 단백질의 번역 후 변형(post-translational modification)이라는 양상으로 나타나는 것이 일반적이다.

특히 2차원 전기영동 상에서 펼쳐지는 단백질 중 신호전달과 관련되는 단백질은 대단히 소량이어서 단순 염색에 의해서는 고도화된 분석이 어려운 실정이다. 이러한 어려움을 극복하고 분석 상의 차이점을 번역 후 변형의 관점에서 광범위하게 확인할 수 있는 분야가 단백질의 당질화(glycosylation)이다. 대조군과 비교할 때 일반적인 전기영동으로는 스팟(spot)의 차이를 발견할 수 없는 경우에도 당쇄의 변화를 렉틴(lectin)으로 분석하면 더 세밀하게 달라진 양상을 관찰할 수 있다.

최근 들어 이런 당쇄의 변화를 이용하는 분석을 프로테오믹스와 대비하여 "글리코믹스(glycomics)"라 하며, 이는 이미 진행되고 있는 프로테오믹스의 분석 상의 어려움을 극복한 한 단계 진전된 분석방법으로서, 번역 후 변형 중 단백질의 당질화 변화를 추적하는 것이다.

발암 및 전이의 과정에서 일어나는 세포 생물학적 변화를 보면, 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 당단백질이나 당지질에 암 유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받아 "잘못된 당질화(aberrant glycosylation)"로 인한 당쇄(sugar chain)의 변화가 일어나 세포 간의 접착(adhesion), 인식(recognition)에 변화를 일으켜 세포의 암화 및 암 전이를 일으킨다(Hakomori and Kannagi, 1983, J. Natl. Cancer Inst., 71:231-251; Feizi, 1985, Nature, 314:53-571). 단백질이 소포체(endoplasmic reticulum)에서 만들어질 때 당단백질의 경우 소포체에서 기본적인(core) 당쇄가 만들어진다. 이어 세포 내 당질화 공장인 골지체로 이동하여 세포 내·외부의 여러 자극과 신호에 따라 여러 당쇄가 부가되는데 잘 알려진 당쇄 가지와 이를 촉매하는 당전이효소를 표현한 것이 도 1이다. 외부 영향에 의해 특정 암 유전자 ras, raf, 전사인자 ets 등의 신호전달을 거쳐 도 1의 여러 당전이효소가 활성화된다. 여러 효소 중 N-연결형 당쇄의 아스파라긴(Asn)에 가까운 쪽으로 퓨코스(fucose)를 부가하는 당전이효소 FUT8은 최근에 정제된 효소로서 암의 전이와 연관되어 부각되고 있다. 당단백질 중 퓨코실레이션(fucosylation)과 연관하여 암의 발전단계에 따라 발현이 증가하거나 당질부위의 변화를 보여주는 표식 인자로 α-피토프로테인(α-fetoprotein;"AFP"), 안티트립신(antitrypsin) 등이 이미 알려져 있다(Miyoshi, E., Ko, J. H. et al. (1999) Biochim. Biophys. Acta 1473:9-20). 최근에 이 퓨코실레이션에 관여하는 효소 FUT8이 일본의 다니구치(N. Taniguchi) 등에 의해 정제되고 그 cDNA 서열이 밝혀졌으며 특히 α1,6-FucT의 과발현 세포주(hepatoma Hep3B-FT)를 면역결핍 생쥐(athymic nude mice)의 비장(spleen)에 주사하여 간 조직에서 암전이 정도를 검증한 결과 놀랍게도 대조군 세포(Hep3B)에 비하여 암 조직이 거의 발견되지 않았다(Miyoshi,E., Ko, J. H. et al. (1999) Cancer Research 59:2237-2243). 이 N-연결형 당쇄의 안쪽에 붙은 퓨코스(fucose)는 렉틴 LCA(Lens culinaris agglutinin)에 의해 인식되는데 그 특이성은 높지 않아 렉틴 Con A처럼 N-연결형 당쇄의 코어 부분을 확인하는데 주로 쓰인다.

한편, 당전이효소 GnT-V는 당단백질의 기본적인 당쇄에 N-아세틸글루코사민 을 β1,6의 위치로 부가하는 반응을 촉매하는 효소로 암의 침윤(invasion)과 전이(metastasis)에 직접 연관성이 있는 것으로 알려져 있다(Dennis et al ., 1987, Science, 236:582-5853). 일반적으로 당단백질은 단백질이 합성된 후 소포체(endoplasmic reticulum)에서 아주 기본적인 당쇄가 만들어진 후 골지체로 이동하여 세포의 다양한 생명현상의 결과로 여러 당전이효소에 의해 당의 부가가 이루어지는데 1차적으로 만들어지는 N-아세틸글루코사민 당전이효소 여섯가지(I-Ⅵ)가 촉매하여 얻어지는 당쇄들을 도 1에서 보여주고 있으며, 이중 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄를 만드는 GnT-V가 암의 발생과 전이에 가장 많이 관여한다고 알려져 있다. GnT-V 효소는 골지체에 위치하며, 목표 단백질들은 당쇄에 변화를 받아 세포 표면이나 밖으로 분비된다. 이때 당단백질은 대상세포의 표면 단백질과 인식(recognition), 접착(adhesion)하여 암을 유발하게 된다.

1987년 데니스 등이 이런 β1,6의 가지가 암 조직이나 암이 전이가 일어날 때 높은 정도로 나타남을 보고하면서 GnT-V의 생물학적 의미가 부각되었다(Dennis, et al ., 1987, Science, 236:582-5853). 세포 표면 단백질인 gp130이 GnT-V의 주목표 단백질 중의 하나인데 β1,6 N-아세틸글루코사민 부가된 단백질이 높은 전이 활성이 있음이 밝혀졌으며, 또한 GnT-V가 적중(결손, knock-out)된 배아줄기세포(embryonic stem; "ES") 세포주를 생쥐에서 구축하고, 상기 생쥐에 폴리오마바이러스(polyomavirus)의 중간(middle) T 항원(이하 "PyMT"라 약칭함) 바이러스성 암유전자를 도입하여 암을 유발시키면 정상 생쥐에 PyMT만을 과발현시킨 생쥐에 비하여 PyMT에 의해 유도되는 암의 성장과 전이가 크게 억제됨을 확인하였고(Granovsky et al ., 2000, Nature Med ., 6:306-312), 동물 내에서 β1,6의 가지화가 쥐 유방암에서 높은 전이성을 보여주었다. 최근의 연구에서 33가지 유형의 검증된 간암(hepatocellular carcinoma, HCC) 조직에 대해 GnT-V의 활성을 분석한 결과 정상조직에 비하여 50배, 암 주변조직에 비하여는 4배의 높은 효소 활성이 관찰되었다(Yao et al., 1998, J Cancer Res . Clin . Oncol., 124:27-307). 이렇듯 GnT-V는 조직에 관계없이 암의 전이 과정에 관여하여 높은 전이 활성을 보이는 것으로 예측되고 있다. GnT-V 효소는 사람의 폐암세포 및 쥐의 신장에서 정제된 이래, cDNA 클로닝, 게놈상의 구조 및 프로모터 영역의 해석이 이루어졌다(Gu et al ., 1993, J Biochem, 113:614-619; Soreibah et al ., 1993, J Biol . Chem ., 268:15381-15385; Kang et al ., 1996, J. Biol . Chem ., 271:26706-26712). 본 발명자들도 전사인자인 ets-1이 GnT-V의 발현에 크게 관여함을 보고하였다(Ko, et al ., 1999, J. Biol . Chem., 274(33):22941-22948).

대장암의 경우는 동양인의 식생활이 서구화되면서 발병률이 높아가는 암으로서 대장 내시경 등의 어려운 진단 방법을 이용하고 있어 진단과 예방의 측면에서 혈액이나 뇨 등에서 간단히 검출해낼 수 있는 진단방법이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 암이 유발된 세포에서 당전이효소 GnT-V에 의해 β1,6-N-아세틸글루코사민이 부가된 당단백질을 검출하고 이를 질량분석기로 아미노산 서 열을 분석하여 당쇄 변화를 나타내는 여러 당단백질을 발견하고, 이중 TIMP-1의 잘못된 당질화가 암의 전이에 결정적 요소라는 데이터를 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단하는 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 암 발생 및 전이에 관여하는 당단백질의 당쇄 변화를 측정하여 암 진단 키트에 유용한 당단백질을 선별하였다.

상기 암은 특별히 제한이 있는 것은 아니나, 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며 모든 종류의 암이 본 발명의 대상이 될 수 있다.

본 발명은 정상세포와 비교하여 암세포 및 전이된 세포에서 N-연결형 당단백질의 β 1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화를 측정하는 방법 및 상기 당쇄 가지의 변화를 측정할 수 있는 킷트를 제공한다. β1,6 N-아세틸글루코사민 당쇄를 만드는 GnT-V 효소는 조직에 관계없이 암의 발생과 전이에 관여하고, 상기 GnT-V에 의해 부가되는 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄는 렉틴 피토해마글루티닌(Phytohaemagglutinin)-L₄(이하 "L₄-PHA"라 약칭한다)에 의해 검출된다.

본 발명은 대조구 및 분석구 세포에 여러 당단백질에 대한 항체를 가하여 면역화학염색법으로 이 당단백질을 분석하는 방법 및 이 방법을 이용한 킷트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 대조구 및 분석구의 세포 배양액에 당단백질에 대한 항체를 가하여 면역화학염색법으로 이 당단백질들을 분석하는 방법 및 킷트에 관한 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 방법들에 렉틴 L₄-PHA 또는 LCA를 첨가하여 렉틴 염색법(lectin blotting)을 수행함으로써 당단백질들을 좀더 정밀하게 분석하는 방법에 관한 것이다.

(ⅰ) 기질의 대조구 및 분석구에 암 발생 및 전이에 관여하는 α-1-안티트립신(antitrypsin), 안지오텐시노겐(Angiotensinogen), β-헥소사미니다제(hexosaminidase) β 사슬 전구체(precursor), 카뎁신 D 프리프로테인(Cathepsin D preproprotein), 카뎁신 X 전구체, 이뮤노글로불린 G1 H 체인, 다이펩티딜 아미노펩티다제(Dipeptidyl aminopeptidase) II, 디스코이딘 수용체 티로신 키나제 아이소폼(isoform) b, 디스트로글리칸(Dystroglycan) 1 전구체, 그래뉼린(Granulins) 전구체, 열충격 단백질 8(70kDa) 아이소폼 1, 열충격 단백질 1(90kDa) β, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(Heparan sulfate proteoglycan perlecan), 헥소사미니다제 A 프리프로테인, Ig κ(kappa) 체인 V-III 단백질, IgG Fc 결합 단백질, 라미닌 수용체-유사 단백질 5, 레구마인(Legumain) 전구체, Met 프로토-옹코진 전 구체(Met proto-oncogene precursor) , N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 네오제닌 유사체 1(Neogenin homolog 1), 프롤릴 4-하이드록실라제(Prolyl 4-hydroxylase), 프로사포신(Prosaposin), β-갈락토시다제 보호 단백질(Protective protein for β-galactosidase), 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6), 단백질 티로신 키나제 7(Protein tyrosine kinase 7), 리보뉴클라제 T2 전구체(Ribonuclease T2 precursor), 세린 프로테아제 22, 종양 결합 칼슘 신호 전달인자 1 전구체(Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor), 종양 거절 항원-1(Tumor rejection antigen-1), Zn-α-2-글리코프로테인(Zn-α-2-glycoprotein)으로 구성되는 단백질 군 중 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 각각의 항체를 흡착시키는 단계;

(ⅱ) 상기 항체가 흡착된 각각의 대조구 및 분석구에 시료를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;

(ⅲ) 상기 시료가 첨가된 각각의 대조구에는 상기 단백질에 대한 동일항체를 첨가하고 상기 시료가 첨가된 각각의 분석구에는 리간드로 표지된 N-연결형 당쇄 변화 측정용 렉틴을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;

(ⅳ) 상기 동일항체가 첨가된 각각의 대조구에는 발색효소가 결합된 2차항체를 첨가하고, 리간드로 표지된 렉틴이 첨가된 각각의 분석구에는 발색효소가 결합된 리간드 수용체를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; 및,

(ⅴ) 상기 각각의 대조구 및 분석구에 발색 기질액을 첨가하여 발색시킨 다 음, 분광광도계로 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 암 발생 및 암 전이에 관여하는 하나 또는 그 이상의 단백질의 당쇄변화의 측정방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 당단백질로서 α-1-안티트립신(antitrypsin), 안지오텐시노겐(Angiotensinogen), β-헥소사미니다제(hexosaminidase) β 사슬 전구체(precursor), 카뎁신(Cathepsin) D 프리프로테인(preproprotein), 카뎁신 X 전구체, 이뮤노글로불린 G1 H 체인, 다이펩티딜 아미노펩티다제(Dipeptidyl aminopeptidase) II, 디스코이딘(Discoidin) 수용체 티로신 키나제 아이소폼(isoform) b, 디스트로글리칸(Dystroglycan) 1 전구체, 그래뉼린(Granulins) 전구체, 열충격 단백질 8(70kDa) 아이소폼 1, 열충격 단백질 1(90kDa) β, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(Heparan sulfate proteoglycan perlecan), 헥소사미니다제 A 프리프로테인, Ig κ(kappa) 체인 V-III 단백질, IgG Fc 결합 단백질, 라미닌 수용체-유사 단백질 5, 레구마인(Legumain) 전구체, Met 프로토-옹코진 전구체(Met proto-oncogene precursor) , N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 네오제닌 유사체 1(Neogenin homolog 1), 프롤릴 4-하이드록실라제(Prolyl 4-hydroxylase), 프로사포신(Prosaposin), β-갈락토시다제 보호 단백질(Protective protein for β-galactosidase), 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6), 단백질 티로신 키나제 7(Protein tyrosine kinase 7), 리보뉴클라제 T2 전구체(Ribonuclease T2 precursor), 세린 프로테아제 22, 종양 결합 칼슘 신호 전달인자 1 전구체(Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor), 종양 거절 항원- 1(Tumor rejection antigen-1)(gp96), Zn-α-2-글리코프로테인(Zn-α-2-glycoprotein) 중에서 선택된 1종 이상의 당단백질에 대한 항체가 흡착된 기질, 당단백질에 대한 동일 항체, 리간드가 결합된 렉틴, 발색 효소로 표지된 2차 항체 및 발색 효소로 표지된 상기 리간드의 수용체를 포함하는 암 진단용 킷트에 관한 것이다.

상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

상기 발색효소는 퍼옥시데이즈, 알칼라인 포스파테이즈 등을 들 수 있다.

또한, 상기 리간드와 리간드 수용체의 일례로서 리간드는 바이오틴이고, 리간드 수용체는 아비딘을 들 수 있다.

또한, 상기 ELISA 키트에는 ABTS[2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-Phenylenendiamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)와 같은 발색 기질액을 추가적으로 포함시킬 수 있다.

본 발명은

(ⅰ) 기질의 대조구 및 분석구에 시료를 가하여 기질에 단백질을 흡착시키는 단계;

(ⅱ) 상기 단백질이 흡착된 각각의 대조구에는 암 발생 및 전이에 관여하는 α-1-안티트립신(antitrypsin), 안지오텐시노겐(Angiotensinogen), β-헥소사미니다제(hexosaminidase) β 사슬 전구체(precursor), 카뎁신 D 프리프로테인 (Cathepsin D preproprotein), 카뎁신 X 전구체, 이뮤노글로불린 G1 H 체인, 다이펩티딜 아미노펩티다제(Dipeptidyl aminopeptidase) II, 디스코이딘 수용체 티로신 키나제 아이소폼(isoform) b, 디스트로글리칸(Dystroglycan) 1 전구체, 그래뉼린(Granulins) 전구체, 열충격 단백질 8(70kDa) 아이소폼 1, 열충격 단백질 1(90kDa) β, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(Heparan sulfate proteoglycan perlecan), 헥소사미니다제 A 프리프로테인, Ig κ(kappa) 체인 V-III 단백질, IgG Fc 결합 단백질, 라미닌 수용체-유사 단백질 5, 레구마인(Legumain) 전구체, Met 원종양 유전자 전구체(Met proto-oncogene precursor) , N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 네오제닌 유사체 1(Neogenin homolog 1), 프롤릴 4-하이드록실라제(Prolyl 4-hydroxylase), 프로사포신(Prosaposin), β-갈락토시다제 보호 단백질(Protective protein for β-galactosidase), 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6), 단백질 티로신 키나제 7(Protein tyrosine kinase 7), 리보뉴클라제 T2 전구체(Ribonuclease T2 precursor), 세린 프로테아제 22, 종양 결합 칼슘 신호 전달인자 1 전구체(Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor), 종양 거절 항원-1(Tumor rejection antigen-1), Zn-α-2-글리코프로테인(Zn-α-2-glycoprotein)으로 구성되는 단백질 군 중 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 항체를 첨가하고, 상기 각각의 분석구에는 리간드로 표지된 N-연결형 당쇄 변화 측정용 렉틴을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;

(ⅲ) 상기 항체가 첨가된 각각의 대조구에는 발색효소가 결합된 2차항체를 첨가하고, 리간드로 표지된 렉틴이 첨가된 각각의 분석구에는 발색효소가 결합된 리간드 수용체를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; 및,

(ⅳ) 상기 각각의 대조구 및 분석구에 발색 기질액을 첨가하여 발색시킨 다음, 분광광도계로 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 암 발생 및 전이에 관여하는 하나 또는 그 이상의 단백질의 당쇄변화의 측정방법에 관한 것이다.

상기 본 발명자들이 밝혀낸 암 발생 및 전이에 관여하여 당쇄 가지 변화를 나타내는 단백질들은 당단백질로 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오기 때문에, 혈액이나 소변 등의 체액에 존재하는 상기 단백질들의 발현 및 N-연결형 당쇄 변화를 측정하여 암을 진단할 수 있다.

상기 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질을 이용하여 암을 진단하는 방법은 환자로부터 시료를 채취하는 단계(단계 1) 및 상기 시료를 대상으로 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 발현 및 N-연결형 당쇄 변화를 측정하는 단계(단계 2)로 이루어진다.

단계 1의 시료는 혈액 또는 소변으로부터 채취하고, 바람직하게는 일반적인 혈청 분리방법을 통해 시료를 채취한다. 상기 진단 방법의 단계 2에서 이용되는 구체적인 측정방법으로는 항원-항체 결합을 원리로 하는 모든 분석방법이 사용될 수 있다. 그 중에서도, 항원-항체 결합의 분석에 흔히 사용되는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법과 면역 블럿(Immunoblot) 방법이 바람직하다.

본 발명자들은 바람직한 실시예로서 암을 진단하기 위하여 상기 밝혀낸 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질에 대한 항체를 생산하고, 상기 항체를 이용하여 ELISA 방법을 수행하여 단백질의 발현 정도 및 N-연결형 당쇄 변화를 측정하는 방법을 제공한다.

ELISA 방법을 이용하여 단백질의 발현 정도 및 N-연결형 당쇄 변화를 측정하는 방법 중 한 가지는

1) 기질에 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질에 대한 항체를 흡착시키는 단계;

2) 상기 기질에 시료 예컨대, 검체의 혈청을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;

3) 표지된 동일 항체 또는 표지된 L₄-PHA를 첨가하여 반응시키는 단계;

4) 상기 기질을 세척한 후 발색효소 또는 형광물질이 결합된 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및

5) 발색기질액을 첨가하여 발색시킨 후 ELISA 판독기로 흡광도를 측정하는 단계로 구성된다.

단계 1의 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있다.

단계 3에서 표지는 바이오틴(biotin) 등과 같은 화합물을 사용할 수 있고, 바이오틴-표지된 동일 항체에 의해서는 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 발현 을 정량 분석 또는 정성 분석할 수 있고, 바이오틴-표지된 L₄-PHA에 의해서는 N-연결형 당쇄 변화인 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화를 측정할 수 있다.

단계 4에서 항체에 결합된 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있다.

단계 5에서 발색기질액은 ABTS[2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있으며, 본 발명에서는 상기 퍼옥시데이즈에 의해 발색되는 OPD를 사용하였다.

본 발명의 암 진단 방법에서는, 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하여 대량으로 시료를 분석할 수 있다.

또한, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 상기 단백질의 발현 또는 당쇄변화를 측정하여 암을 진단하는 킷트를 제공한다. 상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으며 반드시 여기에 포함되는 것은 아니며, 모든 종류의 암이 본 발명의 대상이 될 수 있다.

상기 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질은 정상세포에 비하여 암 세포 및 전이된 세포에서 당쇄변화를 일으키는 단백질 즉, α-1-안티트립신(antitrypsin), 안지오텐시노겐(Angiotensinogen), β-헥소사미니다제(hexosaminidase) β 사슬 전구체(precursor), 카뎁신(Cathepsin) D 프리프로테인(preproprotein), 카뎁신 X 전 구체, 이뮤노글로불린 G1 H 체인, 다이펩티딜 아미노펩티다제(Dipeptidyl aminopeptidase) II, 디스코이딘(Discoidin) 수용체 티로신 키나제 아이소폼(isoform) b, 디스트로글리칸(Dystroglycan) 1 전구체, 그래뉼린(Granulins) 전구체, 열충격 단백질 8(70kDa) 아이소폼 1, 열충격 단백질 1(90kDa) β, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(Heparan sulfate proteoglycan perlecan), 헥소사미니다제 A 프리프로테인, Ig κ(kappa) 체인 V-III 단백질, IgG Fc 결합 단백질, 라미닌 수용체-유사 단백질 5, 레구마인(Legumain) 전구체, Met 원종양 유전자 전구체(Met proto-oncogene precursor) , N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 네오제닌 유사체 1(Neogenin homolog 1), 프롤릴 4-하이드록실라제(Prolyl 4-hydroxylase), 프로사포신(Prosaposin), β-갈락토시다제 보호 단백질(Protective protein for β-galactosidase), 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6), 단백질 티로신 키나제 7(Protein tyrosine kinase 7), 리보뉴클라제 T2 전구체(Ribonuclease T2 precursor), 세린 프로테아제 22, 종양 결합 칼슘 신호 전달인자 1 전구체(Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor), 종양 거절 항원-1(Tumor rejection antigen-1)(gp96), Zn-α-2-당단백질(Zn-α-2-glycoprotein)로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질이다.

알파-1-안티트립신(AAT)은 세린계 단백질 분해 효소의 저해제로 잘 알려진 당단백질이다. 고형암의 미세 환경에서 폐암세포주 HCC에 다핵성 호중구(polymorphonuclear neutrophile leukocytes; PMN)를 무혈청 배지, 알파-1-안티트 립신, 그리고 이 단백질의 c-말단 펩타이드(C-36)와 함께 배양하고 세포의 분화나 이동의 정도를 조사하였다. 그 결과, 알파-1-안티트립신(AAT)을 가한 경우, 3.7배로 혈관내피세포성장인자(VEGF)가 높게 나타났지만, 세포의 분화나 침윤은 다소 저하되는 것으로 나타나 외부에서 가해준 알파-1-안티트립신이 세포의 발암 전이를 어느 정도 조절하고 있음을 확인하였다(Zelvyte I et al. (2004) Cancer Cell Int., 4, 7).

안지오텐신(Angiotensin) II는 활성화된 트립신에 의하여 산성 조건에서 안지오텐시노겐(angiotensinogen)으로부터 만들어지는데 이 안지오텐신 II와 안지오텐신 전환 효소(ACE)의 활성을 정상 췌장, 췌장관암, 대장암, 간암에서 조사하였다. 안지오텐신 II는 췌장관암에서 여타의 정상 췌장, 대장암, 간암에 비하여 높게 나온 반면 안지오텐신 전환효소의 활성의 차이는 없었다. 따라서 췌장간암에는 안지오텐신 전환효소 이외의 전환효소가 존재하여 높은 혈관 신생효과를 보여 주었다(Ohta T et al (2003) Int J Oncol 23, 593-8).

대장암의 형태적으로 불규칙한 용종(ACF)은 예비 종양 손상으로 생각된다. 이 용종의 길이 직경 넓이와 헥소사미니다제(hexosaminidase; "Hex")의 상관관계를 조사한 결과 비정상적 용종에서 정상에 비해 Hexa와 Hexb가 심대하게 낮아져(P<0.002) ACF에서 예비암 단계를 예측하는 근거가 될 수 있다(Tsukamoto T et al (2001) Jpn J Cancer Res, 92, 109-18).

대장암 환자에서 카뎁신(Cathepsin) B, D,H 그리고 L에 대하여 암의 각 단계별로 그 mRNA의 수준을 확인해 보려 실시간 정량 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과 카 뎁신 B, D와 L이 일차 종양에 비하여 전이적 손상단계에서 아주 높게 나타났다. 이는 대장암의 발병과 전이과정에서 카뎁신들이 중요하게 작용하는 것으로 보인다(Tsukamoto T et al (2006) Cancer 106, 1489-97).

시스테인 단백질분해효소 카뎁신 X에 대하여 악성(malignant)과 비악성 전립선 암조직에서 분석하였다. 남성 수술환자 56명 유래의 조직에 대하여 단백질 분석으로는 웨스턴 블럿팅, 면역 조직화학검사를, mRNA 수준은 정량 RT-PCR과 인시투 하이브리디제이션(in situ hybridization0으로 조사하였다. 전립선 내선 이상증식(prostatic intraepithelial neoplasias; PINs)과 전립선암에서는 정상에 비하여 카뎁신 X가 아주 진하게 염색되었다. 반면에 카뎁신 F, B, 그리고 L에 대해서는 약하게 나타났다. 이러한 정도는 웨스턴 블럿에서도 확인되었다. 반면에 mRNA 수준에서는 커다란 차이를 보이지 않았다. 따라서 PIN과 침윤성 선암(adenocarcinoma)에서 카뎁신 X의 높은 발현은 전립선암의 초기 단계에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 추정된다(Nagler DK, et al (2004) Prostate 60, 109-19).

용해성 단일쇄 TCR을 IgG1 H 사슬의 C(constant) 도메인과 융합하여 p53(aa 264-272)를 인식하도록 구현한 결과 IgG1 H 사슬이 효과를 높이는 (effector) 기능을 보여주었다(Mosquera LA et al (2005) J Immunol. 174, 4381-8).

암세포에 대한 마커 효소로서의 가능성을 타진하기 위해 다이펩티딜 아미노펩티다제(dipeptidyl aminopeptidase; DPP)의 활성을 HeLa, KB, K-44 세포주에 대해 조사하였다. 즉 Gly-Pro-MCA(methylcoumarinamide)을 기질로 하고 여러 pH에서 사람의 피브로블라스트(human fibroblast; HF)를 대조군으로 하여 비교분석하였다. 그 결과 DPP II의 활성은 사람 피브로블라스트에 비하여 암세포에서 6배에서 24배까지 증가하였다. 따라서 이 효소 활성이 악성화에 대한 좋은 마커가 될 수 있다(Komatsu M et al, (1987) J Natl Cancer Inst. 78, 863-8).

티로신 키나제 수용체(tyrosine kinase receptor) DDR1은 다양한 콜라겐에 의해 활성화되는데 이는 대장암 세포주에서 다양한 형태로 나타나며 막 상에 존재한다(Alves F. et al (2001) FASEB J, 15, 1321-1323).

디스트로글리칸(Dystroglycan; "DG")은 비-인테그린 접착분자로서 디스트로핀-당단백질(dystrophin-glycoprotein) 복합체의 주 구성성분으로서 골격 근육에서 발현되는데 다양한 조직에서 기저막과 세포막 사이에 존재한다. 최근의 결과는 이 디스트로글리칸의 비정상적 발현이 사람의 종양에서 빈번하게 발생되어 암의 전개과정과 악성 표현형의 유지에 중요한 역할을 수행한다는 사실을 제시하였다(Sgambato A. (2005) J Cell Physiol. 205, 163-9).

그래뉼린 전구체(Granulin precursor; GEP)는 새로운 성장인자로서 cDNA 마이크로어레이(microarray)를 이용하여 분석한 결과 간암에서 높게 발현되는 것을 확인하고, 이를 임상시료에서 구체적으로 조사해 보았다. 110쌍의 간암과 그 주변 비암 조직과 22개의 정상 간 조직에 대하여 정량 RT-PCR과 면역조직화학 검사를 통해 위치를 확인하였다. GEP의 RNA 수준은 정상에 비해 아주 높게(P<0.001) 나타났고 암의 세포질에 위치하는 것을 알 수 있었다. 단백질 수준에서도 높게 나타났으며, Hep3B 세포주에 도입하여 조사한 결과 성장속도, 침윤 능력, 누드 마우스에서의 암 형성능력에 크게 기여하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 GEP는 간암에서 침윤과 전이에 관여하여 종양마커와 치료표적의 좋은 예가 된다(Cheung ST et al. (2004) Clin Cancer Res. 10, 7629-36).

유방암의 프로게스테론 수용체(PR) 복합체를 분리하고 열충격 단백질 90과 열충격 단백질 70에 대한 단일 클론 항체로 성분을 조사한 결과 PR-A, PR-B와 함께 열충격 단백질 90과 열충격 단백질 70이 같이 존재함을 확인하였다(Lemoisson E (1994) Ann Biol Clin 52, 433-42).

뇌종양이나 전립선암의 가족력으로 유전적 소인을 조사한 결과 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(perlecan)이 CAPB 위치(locus)에 대한 유력한 유전자로 떠올랐다(Datta MW (2006) Mol Cancer 5, 9).

정상이나 비악성 질병 환자의 혈청에 대해 암환자의 혈청에서 β-헥소사미니다제(hexosaminidase)의 변종들이 있는지를 조사하였다. 일단 혈청에서 이 효소의 활성을 비교한 결과 환자나 정상에서 큰 차이를 보이지 않았다. 다른 분석 방법으로 등전점 전기영동을 실시한 결과 108명 환자의 80%, 정상 18명의 대조군의 11%에서 변종 β-헥소사미니다제(hexosaminidase)가 나타나 환자에서 크게 변종이 많음을 보여주었다(Plucinsky MC (1986) Cancer 58, 1484-7). 이는 당질화의 차이 즉 시알산이 결합하는가의 차이에 기인하는 것으로 보이는데 당시에는 이런 당생물학적 지식이 없어 규명해 내지 못했을 것이다.

72살된 여자 골수종 환자에서 이 골수종이 면역 글로불린(Ig) G-카파가 여럿 있는 미엘로마(MM)임을 확인하였다(Haegelen C et al (2006) J Neurosurg 104, 608-10).

전립선암(CaP)은 핵내인자 카파B 리간드(RANKL)의 수용체 결합으로 활성화되는데 용해성 쥐의 RANK-Fc(sRANK-Fc)는 이 RANKL에 효과적인 저해제임을 확인하였다(Zhang J et al (2003) Cancer Res., 63, 7883-90).

사람의 MCF-7 유방암 세포는 그 표면에, 막의 기저에 존재하는 당단백질인 라미닌에 대하여 높은 친화도를 갖는(Kd=2 nM) 수용체와 유사한 부분을 지니고 있다. 라미닌은 type IV 콜라겐에 붙어 특이적으로 MCF-7를 자극(8배)하는 반면, 피브로넥틴은 type I 콜라겐에 대하여 달라붙는 정도가 2배에 지나지 않는다. ZR-75-1 세포주의 경우는 라미닌에 대하여 4배, 피브로넥틴에 대하여 5배의 자극을 보이는 반면, T47-D 세포의 접착은 라미닌에 대하여 2배, 피브로넥틴에 대하여 7배의 자극 정도를 보인다. 이러한 암세포의 표면에 대한 라미닌의 수용체는 초기 혈관의 기저막에서 라미닌을 경유하여 초기 상호작용을 이룸으로서 침윤과 이어지는 전이의 전개를 용이하게 한다(Terranova V.P., (1983) Proc.Natl. Acad. Sci 80, 444-8).

고등동물의 아스파라긴 엔도펩티다제(asparaginyl endopeptidase; "AEP") 혹은 레구마인(legumain)은 라이소좀 시스테인 단백질 분해효소로서 아스파라긴 다음을 자른다. 유방암에서 프로게스틴은 암의 발생과 전개에 관여하는 반면, 글루티코르티코이드는 유방암의 성장억제에 관여하는 것으로 알려져 있다. 덱사메타손(dexamethasone)(100nM)과 프로게스테론(100nM)을 시간별로 처리하고 실시간 RT-PCR을 실시한 결과 시스테인 1(레구마인)이 전이와 관련된 유전자로서 프로게스테론에 의해 현저하게 발현이 억제됨을 확인하였다 (Davies S et al (2006) Gynecol Oncol 101, 62-70).

원종양 유전자(proto-oncogene) c-Met은 머리와 목에 존재하는 비늘모양 세포의 종양의 전개에 관여하는 것으로 알려져 있다. 구강 비늘모양 세포 종양(Oral squamous cell carcinoma; OSCC) 에서 c-Met의 발현정도를 알아보고 이런 환자들의 예후를 예측할 수 있는 마커가 되는지를 조사하였다. 코호트 연구로 84명의 OSCC 환자에 대해 c-Met의 발현을 보고 면역조직화학 검사를 실시하여 세포 내의 위치를 조사하였다. 69명 환자(82.2%)의 경우는 주로 막에 발현되고 세포질에 퍼진 형태의 면역 양성을 보인 반면, 15명 환자(17.8%)는 c-Met이 나타나지 않았다. 양성을 보인 그룹에서 잘 분화된 경우는 세포질에 거의 없거나 나타나지 않은 반면 덜 분화된 경우는 막과 세포질에 잘 나타났다. 예후 분석에서 c-Met의 발현이 전체 생존율(p=0.036)과는 독립적으로 나타나는 것으로 보아 c-Met은 초기 마커로서의 가능성이 있다(Lo Muzio L et al (2006) Tumor Biol. 27, 115-121).

뮤코다당침착증(Mucopolysaccharidosis) type IV A(Morquio A)는 N-아세틸글루코사민-6-황산(acetylgalactosamine -6-sulfate)과 갈락토스-6-황산(galactose-6-sulfate) 둘다에서 황산기를 분해하는 N-아세틸글루코사민-6-설파타제(N-acetylgalactosamine-6-sulfatase; GALNS) 효소의 결핍에 기인한다. 2세대에 걸친 가계를 조사한 결과 갈락토스-6-설파타제(Galactose-6-sulfatase; GALS)의 활성은 백혈구와 섬유아세포에서 분명하게 결손이 되어 있었고 GALNS의 분자 유전학 조사에서도 두 군데에 변이가 일어난 것을 확인하였다(Tylki-Szymanska A et al (1998) Clin. Genet. 53, 369-74).

뮤코다당침착증(Mucopolysaccharidosis) type III D는 샌필리포(Sanfilippo) 증후군의 4가지 아형 중 아주 희귀한 질병으로 헤파란 설페이트(heparan sulfate)가 분해되는데 관여하는 효소 N-아세틸글루코사민-6-설파타제(N-acetylglucosamine-6-sulphatase)의 결핍에 기인한다. 샌필리포(Sanfilippo) D 질병을 앓는 환자의 유전자를 조사한 결과 단일 염기가 결손됨(c1169delA)으로 인하여 단백질이 덜 성숙된 짧은 형태가 이루어짐을 확인하였다(Beesley CE et al (2003) 40, 192-4).

네오제닌(Neogenin)은 가슴의 줄기세포 혹은 선구세포로 알려진 cap 세포에서 발현된다. 네오제닌의 암화와 관련하여 여러 유방암 세포에서 비교한 결과 비교적 정상인 가슴 조직에서는 네오제닌의 발현이 높은 반면 암세포에서는 거의 나타나지 않았으며, 조직 어레이에서 비교한 결과 정상(8/8)은 높게 검출된 반면, 93.5%(43/46)의 유방암 조직에서는 네오제닌의 발현이 거의 나타나지 않거나 적정한 정도로만 검출되었다(Lee JE et al (2005) BMC Cancer, 5, 154).

고등동물은 외부의 산소 변화에 대하여 저산소증-유도 인자(hypoxia-inducible factor; HIF)를 이용한 잘 보존된 경로를 통해 이를 극복한다. 정상 산소하에서 HIF의 수산화된 프롤린을 인지하는 유비퀴틴-라이게이즈(ligase)에 의해 HIF의 알파 서브유닛이 분해되는데 이 HIF 프롤릴-4-하이드록실라제(HIF proyly-4-hydoxylase; HPH)효소가 규명되었다. HIF는 고형암과 같은 저산소증(hypoxia) 상태에서는 이 HPH가 작동하지 않아 암이 가속화되는 것으로 알려져 있다(Bruick RK et al (2001) Science 294, 1337-40).

프로사포신(Prosaposin; PSAP)은 안드로젠-비의존성(AI) 전립선암에서 발현되는 분비 단백질로서 향정신성 분자이다. 이 분자의 결핍이나 과발현은 사람이나 생쥐에서 죽음에 이르게 한다고 알려져 있다. 따라서 서던 블럿, 정량 실시간 RT-PCR, SNP 등을 AI 전립선암 세포주에서 조사한 결과, 암세포의 성장, 이동, 침윤 등에 이 단백질이 관여함을 확인하였다(Koochekpour S et al (2005) Genes Chromosomes Cancer 44, 351-64).

갈락토시알리도시스(Galactosialidosis)는 상염색체 열성 질병으로서 보호단백질/카뎁신A(protective protein/cathepsin A; PPCA)의 문제로 인하여 라이소좀 β-갈락토시다제(lysosomal beta-galactosidase)와 뉴라미니데이즈(neuraminidase)가 결합된 복잡한 활성결핍에 기인한다. 2명의 네덜란드인 태아 갈락토시알리도시스에 대하여 조사한 결과 뇨, 백혈구와 섬유아세포에 활성이 다소 감소하였다. 여러 조사를 한 결과 PPCA의 DNA상의 변이가 이런 질병을 유발함을 확인하였다(Groener J(2003)78, 222-8).

특이한 엑토도메인(ectodomain)을 지닌 새로운 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6)가 클론되었다. 수용체의 N-말단 150 아미노산은 전형적인 인지질-결합 부위를 보유하고 있는데 이는 뇌의 A5 항원과 응집 인자 V와 VIII과 같은 세포접착 분자에서 발견된다. 따라서 이 키나제는 새로운 세포-세포 간 상호작용에 관여하는 수용체에 속한다(Perez JL et al (1994) Oncogene 9, 211-9).

대장암 키나제 4(CCK 4; Protein tyrosine kinase 7) 암유전자는 하나의 막 관통 도메인(TMD)에 GxxG라는 진화적으로 보존된 영역을 지니고 있다. 이는 새로운 수용체 티로신 키나제 패밀리로서 TMD 영역에서 수용체와 결합하여 신호전달 경로를 거치는 것으로 알려져 있다(Kobus FJ (2005) Biochemistry 44, 1464-70).

세포유전학적 기능연구를 통해 사람 게놈의 6q27의 영역에는 한두 개의 암 억제 유전자가 있는 것으로 추정되고 있다. RNASET2(Ribonuclease T2 전구물질)은 난소암 유래의 암화 잠재력을 없애는 것으로 알려져 있는데. 분비되는 당단백질이기도 하다. 특히 난소암 유래 세포주 HEY3MET2에서 높은 침윤성의 전이 잠재성이 이 단백질은 영향을 준다. 그런데 RNA 분해 활성부위에 변이를 주어도 그 암억제 성능이 줄지 않는 것으로 보아 RNAse 활성에 기인하는 것으로 보이지는 않는다(Acquati F et al (2005) Int J Oncol. 26, 1159-68).

프로제민(Prosemin; Serine protease 22)이라는 새로운 세린 단백질 분해효소가 클로닝되었다. 이 단백질 분해효소는 프로스타틴(prostatin), 감마-트립타제(gamma-tryptase)와 테스타틴(testatin)과 높은 상동성을 지니고 있으며 췌장에서 높게 발현되고 전립선과 소뇌에서 약하게 발현되었다. 특히 난소암의 정점에서 면역조직화학검사에서 잘 발견되는 것으로 보아 종양 마커로서 유력해 보인다(Mitsui S. et al (2005) FEBS J 272, 4911-23).

암-관련 칼슘 신호전달자-1 전구물질(Tumor-associated calcium signal transducer 1-precursor)은 세포표면 항원으로서 상피 당단백질인데 단일클론 항체 HEA125에 의해 규명되었고 주로 상피세포의 세포막에 존재한다. 대장암의 cDNA들을 COS 세포주에 과발현시키고 HEA125 단일클론 항체를 이용하여 검출한 결과 이 당단 백질이 나왔다. 이 단백질의 서열은 암-관련 항원 GA733과도 유사하며, 세포-메트릭스간 인식 접착에도 관여하는 것으로 알려져 있다(Simon B et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci 87, 2755-9).

종양 거절 항원-1(Tumor rejection antigen-1; 다른 이름으로 gp96)은 소포체에 존재하는 당단백질로서 MHC class I 분자에 의해 펩타이드를 운반하는 데 관여하는 항원으로 알려져 있다. 따라서 다양한 펩타이드에 대하여 세포의 항원성을 보여주는 단백질로서 항원 포로세싱과정에서 펩타이드에 대한 샤페론으로 작용한다(Demine R. et al (2005) J Biol. Chem. 280, 17573-8).

Zn-α- 2-당단백질은 유방의 포낭액에 들어있는 단백질로 혈액 내보다 약 30-50배 정도 이상으로 발견된다. 이 단백질에 대하여 비-가슴 조직, 암 조직, 그리고 정상, 양성 종양 악성 가슴 조직에 대하여 조사하였다. 침윤성 암조직에서 33의 시료 중 16에서 그리고 이중 15개가 HE 염색에서 잘 발견되었고 비-가슴 조직과 암에서 먼 쪽의 조직에서는 거의 발견되지 않았다. 따라서 Zn-α- 2-당단백질은 아포크린 세포의 분화에 대한 믿을만한 면역 조직화학적 마커가 될 수 있다(Bundred NJ et al(1987)Histopathology 11, 603-10).

이상의 참고문헌을 보면 대부분의 본 발명에서 진단킷트의 마커로 선택된 단백질은 여러 암에서 암이 발변하거나 전이성이 늘어감에 따라 발현의 변화를 보여주고 있지만 어디까지나 DNA, mRNA 혹은 단백질의 수준에서 조사한 것으로 그 단백질의 당질화에 대한 연구는 거의 되어있지 않은 상태이다. 따라서 당단백질로서 당질 변화를 측정하여 암 진단의 마커로서 유용성을 규명한 본 발명은 신규성과 진보 성을 갖춘 발명이라 하겠다.

본 발명의 진단킷트는 상기 단백질의 발현을 정량 분석 또는 정성 분석하거나, N-연결형 당쇄 변화인 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지 변화를 측정하며, 상기 분석을 위하여 ELISA 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 단백질에 대한 항체를 제조하여 표면에 코팅시킨 96 웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 ELISA를 수행하도록 상기 진단킷트를 제공할 수 있다.

본 발명의 진단킷트는 상기 단백질에 대한 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, 당쇄 가지 변화를 측정하기 위하여 L₄-PHA 또는 LCA를 포함한다.

상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 암을 진단하기 위해 생물학적 마이크로 칩을 이용한 자동화된 분석 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 암 발생 및 전이에 관여하 여 당쇄 변화를 나타내는 단백질들을 글래스 슬라이드 등의 표면에 고정화시켜 단백질 칩을 제작하고, 이들 단백질의 당쇄변화를 동시에 측정하도록 진단킷트를 구성할 수 있다. 이와 같은 진단킷트는 상기 단백질, 적당한 완충용액 및 L₄-PHA등을 포함한다.

암의 전이는 세포 간의 인식(recognition), 접착(adhesion)에 의한 것이며, 인식과 접착에 관여하는 당단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태이므로, 암을 진단할 수 있는 초기 표식 인자들은 혈액이나 소변 등의 체액의 진단을 통해서 암 진단이 가능하다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서 대장암 특이적인 종양표식 인자를 찾아내기 위하여 GnT-V 발현이 상대적으로 낮은 대장암 세포주 WiDr을 대조구로 사용하였으며, GnT-V를 과발현하는 세포주인 WiDr:GnT-V을 대장암의 모델 시스템으로 보고 세포주 수준에서 글리코믹스(Glycomics)를 수행하였다. 본 발명에서는 전이된 암세포 배양액에 대하여 2차원 전기영동을 통한 분석을 시도하고, 각각 2장의 겔을 확보한 다음 한 장은 쿠마지 브릴리언트 블루(도면에서 "CBB"로 약칭됨)와 비교하여 암 세포 및 전이된 세포에서 당쇄 변화를 일으키는 단백질을 선별하였다(도 4 참조). β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 렉틴 블럿을 수행한 결과 대조군에 비하여 암세포의 경우 몇 군데에서 진한 강도의 스팟이 나타났는데, 상기 스팟에 해당하는 단백질이 당쇄 변화를 통해 암 발생 및 전이에 관여하리라고 예상하는 후보단백질이다.

겔 상에서 해당하는 스팟을 잘라내고, 단백질을 절단한 후 절단된 펩타이드를 ESI(Electrospray Ionization)/Q-TOF(Quadrupole Time of Flight) 질량 분석기로 아미노산 서열을 결정하고, 기존의 단백질 데이터베이스와 비교하여 정확한 단백질의 이름을 동정하였고, 각각의 서열과 분자량, 등전점 등을 분석하였다(표 1).

Accession gi NO.	Identities	Peptides matched	Sequence Coverage^a (%)	Total Score^b	Mr/pI^c
177836	α-1-antitrypsin	8	31.1	380	46.7/5.5
532198	Angiotensinogen	5	14.6	237	53.2/5.8
123081	β-hexosaminidase β-chain precursor	3	5.0	104	63.1/6.3
4503143	Cathepsin D preproprotein	8	23.5	459	44.6/6.1
3650498	Cathepsin X precursor	7	28.0	291	33.9/7.1
230581	Chain H, Immunoglobulin G1	6	17.9	314	49.7/8.5
21617867	Dipeptidyl aminopeptidase II	4	8.9	169	54.3/5.9
38327632	Discoidin receptor tyrosine kinase isoform b	2	3.1	96	97.2/6.1
4758116	Dystroglycan 1 precursor(proephithelin) (PEPI)	2	3.0	140	97.6/8.7
77416865	Granulins precursor	4	7.4	182	63.5/6.4
5729877	Heat shock 70 kDa protein 8 isoform 1	9	17.0	278	70.9/5.4
20149594	Heat shock 90kDa protein 1, beta	7	11.3	229	83.3/5.0
11602963	Heparan sulfate proteoglycan perlecan	5	2.2	175	466.6/6.0
4504371	Hexosaminidase A preproprotein	8	17.0	470	60.7/5.0
106586	Ig kappa chain V-III	2	10.7	124	23.1/5.8
1944352	IgG Fc binding protein	5	3.2	242	572.1/5.1
14583014	laminin receptor-like protein 5	2	9.2	116	33.0/4.8
2842759	Legumain precursor	3	10.4	110	49.4/6.1
4557747	Met proto-oncogene precursor	11	9.1	512	155.5/7.0
4503899	N-acetylgalactosamine-6-sulfatase	5	14.9	309	58.0/6.3
4504061	N-acetylglucosamine-6-sulfatase	9	17.2	469	62.0/8.6
4505375	Neogenin homolog 1	5	4.7	248	160.0/6.1
32485152	Prolyl 4-hydroxylase	5	15.2	247	84.8/5.3
11386147	Prosaposin	8	19.9	392	58.1/5.1
4505989	Protective protein for β -galactosidase	3	6.7	127	54.5/6.2
729008	Protein tyrosine kinase 6	3	5.1	76	101.1/6.4
15826840	Protein tyrosine kinase 7	9	11.5	477	118.4/6.7
5231228	Ribonuclease T2 precursor	5	22.6	247	29.5/6.7
11545839	Serine protease 22	2	11.0	117	33.7/7.6
135850	Tissue inhibitor of metalloproteinase-1	2	7.2	102	24.2/8.5
120749	Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor	2	11.8	163	34.9/7.4
4507677	Tumor rejection antigen-1 (gp96)	15	19.3	440	92.5/4.8
38026	Zn--2-glycoprotein	10	40.4	361	34.7/5.7

a; 단백질을 구성하는 전체 아미노산 중 질량분석기로 서열이 확인된 아미노산의 비율을 의미한다.

b; 전체 값(Total score)은 각 개별 펩타이드에서 얻어진 스코어 값의 합이며 각 스코어는 -10xLog(P)이다. 여기서 P는 NCBInr 데이터베이스에 대해서 블라스트(blast)하였을 때의 결과가 우연의 사건일 확률을 의미한다.

c; 상기 표 1에서 분자량 및 등전점 pI는 글리칸(glycan) 잔기를 계산에서 고려하지 않았을 때의 이론값이다.

그 중 단백질 TIMP-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase -1; 이하 “TIMP-1”)은 매트릭스 메탈로 단백질분해효소의 저해제로 알려진 당단백질이다. 즉 세포 밖의 기질(매트릭스)을 부수어 세포의 이동(migration), 침윤(invasion)에 관여하는 매트릭스 메탈로 단백질분해효소의 활성을 저해함으로써 정상적인 상태를 이루어 주는 단백질이다. 따라서 이 TIMP-1에 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지가 붙으면서 ‘비정상적인 당질화’ 즉 ‘잘못된 당질화’가 일어나면 본래의 매트릭스 메탈로 단백질분해효소의 활성 저해 능력을 상실하게 된다. 이를 증명하기 위하여 본 발명은 다음의 실시예를 통해 TIMP-1에 ‘잘못된 당질화’가 대장암 세포주 WiDr이나 동물, 사람 조직에서 암의 발생과 전이에 결정적임을 제시하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니며 표 1에 나와 있는 모든 당단백질은 이와 유사한 방식으로 암의 발생과 전이에 관여한다.

< 실시예 1> 무혈청 배지 유래의 당단백질 정제, 2차원 전기영동

위와 같은 배경에서 WiDr:GnT-V 세포주를 대장암의 모델 시스템으로 보고 세포주 수준에서의 프로테오믹스(Proteomics)를 시도하였다. 즉 도 3에 나타나 있듯이 원래 세포주(WiDr:mock) 자체는 GnT-V의 발현이 낮으나 GnT-V를 과발현한 세포주(WiDr:GnT-V)는 계란의 배장요막(CAM)을 이용한 암전이 활성 조사에서 대단히 높은 혈관신생(암전이 효과)을 보여 주었다(Ko J. H. et al, 미공개 결과). 암의 전이는 세포 간의 인식(recognition), 접착(adhesion)에 의한 것이며, 인식과 접착에 관여하는 당단백질은 세포의 표면에 있거나 분비되어 나오는 형태이므로 무혈청 배지 배양액에 대하여 집중적으로 2차원 전기영동을 통한 분석을 시도하였다. 이는 암을 진단하는 초기 표식 인자들은 혈액이나 소변 등 체액의 검사를 통해서만 인식 가능하기 때문에 세포 밖으로 분비되어 나오는 단백질에 집중하였다. 대조구(WiDr:Mock) 세포주와 WiDr:GnT-V 과발현 세포주를 10%의 송아지 혈청(FCS)을 포함하는 RPMI1640(Gibco BRL사) 배지에서 성장시켰다. GnT-V를 과발현하는 세포주는 미국의 ATCC(American Type Tissue Culture)사에서 구입한 대장암 세포주 WiDr에 진핵세포 과발현 플라스미드(Ko, et al., 1999, J Biol Chem ., 274(33):22941-22948)와 여기에 당전이효소 GnT-V 유전자를 도입한 후 세포에 감염(transfection)시키고 350㎍/㎖ 농도로 G418을 처리한 후 생성된 콜로니로부터 RNA를 분리하여 GnT-V 단편 cDNA를 이용한 노던 블럿으로 탐색, GnT-V 과발현 세포주를 확립하였다. 배양 2-3일 후 CO₂ 배양기(incubator)에서 80% 정도 세포가 바닥을 덮었을 때(confluent) PBS(phosphate buffered saline)로 2회 이상 씻어 잔존 혈청을 제거하였다. 이어 혈청을 포함하지 않는 RPMI 배지를 넣고 48시간 배양한 후 배양액을 수거하였다. 이를 1ml 이내로 농축한 후, 10% TCA(trichloroacetic acid)를 포함하는 아세톤을 최종 80%가 되게 가하여 단백질만을 침전시켰다. 아세톤으로 3회 이상 씻어 잔류 TCA를 제거하고 말린 다음 겔 로딩 완충용액{8M 우레아, 4% CHAPS, 1mM DTT, 0.2% 운반용 엠폴라이트(carrier ampholyte), 브로모페놀블루(Bromophenol Blue)}을 가하여 녹였고, 1차원 전기영동 장치(Multiphor-II, Pharmarcia사)를 이용하여 1차원 전기영동을 실시하였다(13cm drystrip pH 3-10). 상기 전개된 1차원 전기영동 겔을 SDS와 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)을 포함하는 평형 완충용액으로 평형화시킨 후 2차원 전기영동 장치(Protean Ⅱ, Bio-Rad사)를 이용하여 12% 폴리아크릴아미드에서 2차원 전기영동을 실시하였다. 각각 2장의 겔을 확보한 다음 한 장은 바이오세이프(Biosafe, Bio-Rad사) 염색액을 이용하여 쿠마지 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue; CBB) 염색하였다(도 4). 또 다른 한 장은 반건조 이동장치(Semi-Dry transfer, Bio-Rad사)를 이용하여 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켰다. β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 바이오틴(Biotin) 표지된 L₄-PHA 렉틴을 가하여 이 가지를 지닌 당단백질에 붙도록 한 후 HRP 표지된 스트렙타비딘(Streptoavidin)을 붙이고 ECL 형광반응을 이용하여 필름에 감광시켰다. 대조구(WiDr:Mock)와의 직접적인 비교를 위하여 동일 조건에서 1차원(등전점 분리) 전기영동을 시도하고 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색한 것이 제4도이며, 겔의 단백질을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막으로 이동시켜 GnT-V의 산물 특이적인 렉틴 L₄-PHA로 블럿팅을 수행하였다.

< 실시예 2> ESI /Q- TOF 질량 분석기를 이용한 단백질의 서열분석

도 4의 렉틴 블럿, 즉 엑스레이(x-ray) 필름에 감광되고 난 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막을 다시 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색하여 감광된 필름에 붙여 스팟(spot)의 정확한 위치를 확인하고 처음부터 쿠마지 브릴리언트 블루로 염색된 겔 상에서 해당하는 스팟을 잘라내었다. 30%의 메탄올과 100% 아세토나이트릴을 이용하여 탈색 후 10U의 트립신(Promega사)을 가하여 밤새 37℃에서 절단하였다. 절단된 펩타이드를 아세토나이트릴로 추출한 후 원심 동결 건조기로 건조하고 ESI(Electrospray Ionization)/Q-TOF (Quadruple Time of Flight) 질량 분석기로 아미노산 서열을 결정하였다. ESI는 각 펩타이드를 분리해주는 효과가 있으며 연속질량 분석(tandem mass)은 서열분석이 가능하도록 구성된 장치이다. 제5도는 동정된 TIMP-1의 예로서 정확하게 아미노산 서열이 어떻게 분석되는지를 제시하고 있다. 결정된 서열은 단백질의 데이터베이스와 비교하여 정확한 단백질의 이름을 동정하였으며, 앞의 표 1은 각 단백질의 분자량(MW), 등전점(pI) 그리고 들어맞은 펩타이드의 수 등을 제시하고 있다. 이때 체계상의 잘못된 동정을 방지하고자 최소한 2개 이상의 펩타이드가 일치하고 높은 전체값(Total score)을 보일 때만 선정하였다.

< 실시예 3> TIMP -1과 암의 전이

동정한 단백질 중 하나를 선정하여 본 발명의 기본 원리가 작동하는 지를 확인하려 TIMP-1을 선정하였다. 도 6에 보여주는 바와 같이 1997년도 학술지 Nature에 실린 논문에서 이미 TIMP-1의 구조가 밝혀졌고, 당질화의 위치가 매트릭스 메탈로 단백질분해효소(MMP)-3의 활성부위와 아주 근접해 있는 사실이 알려져 있다. 또한 TIMP-1은 도 7에서 보는 바와 같이 여러 TIMP 단백질군중 유일하게 당단백질이라는 사실도 밝혀졌다. 또한, TIMP-1의 발현량의 증가가 발암 및 전이에 긍정적이라는 보고와 함께 부정적이라는 다수의 논문도 발표된 바 있어 이에 대한 규명도 필요한 실정이었다. 매트릭스 메탈로 단백질분해효소(MMP)는 도 8에 보듯이 매트릭스(기질)를 부수는 역할을 수행하며, 현재까지 약 30여종이 알려져 있다.

< 실시예 4> TIMP -1 과발현 세포주와 당쇄 변이주의 구축

암세포 내에서 당전이 효소 GnT-V에 의해 유도된 TIMP-1의 N-글리칸 당쇄의 역할을 알아보기 위하여 도 9에 보여 주듯이 Asn30과 Asn78위치를 하나씩 혹은 둘 다 위치-지향 변이(site-directed mutagenesis)를 통해 PCR 방법으로 변이시켜 각각 T-N30Q, T-N78Q, 그리고 T-N30/78Q를 구축하였다. 즉 Asn30과 Asn78위치를 메가프라이머(Megaprimer) 방법을 통해 Gln으로 바꾼 다음 대조구 TIMP-1 유전자나 변이주를 pcDNA3.1 hygro(+) 플라스미드(Invitrogen)에 클로닝하고, WiDr;mock나 WiDr:GnT-V 세포주에 도입하였다. 이때 반복적인 트랜스펙션(transfection) 방법을 이용하였는데 이는 변이주에서 원래 있던 TIMP-1의 영향을 최소화하고 분비되는 TIMP-1의 양을 극대화하여 변이주 간의 분비량의 차이에 의한 영향을 최소화하려 한 것이다. TIMP-1 과발현 세포주는 웨스턴 블럿 방법으로 확인하였다(도 10). 원래 있던 TIMP-1의 분비 정도는 WiDr:GnT-V세포주에서는 rTIMP-1에 비해 18.4±0.8%이고 WiDr;Mock에서는 거의 무시될 수준이었다. TIMP-1의 분자량은 약 28.5kDa로 N-연결형 글리칸은 이 중 약 8kDa에 해당하였다(Caterina, N.C. et al (1998) Biochim. Biophys . Acta 14, 21-34). 각각 하나씩 바꾼 변이주(즉, T-N30Q, T-N78Q)의 rTIMP-1은 4kDa 정도의 차이를 보임으로서 각 변이주가 잘 구축되었음을 확인하였다.

< 실시예 5> GnT -V에 의해 변화된 TIMP -1 당쇄의 구조 예측

TIMP-1의 잘못된 당질화로 인한 당쇄 구조를 간접적으로 알아내기 위하여 원래의 TIMP-1을 WiDr;Mock과 WiDr:GnT-V세포주에서 정제하였다. 즉, TIMP-1 모노 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 CNBr에 의해 활성화된 세파로스 4B에 37℃에서 네 시간 동안 반응시켜 항체 컬럼을 만들었다. 이 IgG_anti _- _TIMP _-1-결합된 세파로스 4B 컬럼을 이용하여 TIMP-1을 정제하였다. 이때 TIMP-1의 단백질 농도는 몰라 상수 26,500M^-1cm-1을 이용하여 계산하였다. 정제된 TIMP-1에 대하여 2차원 전기영동을 수행하고 이어 TIMP-1 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을, L₄-PHA와 DSA(Datura stramonium agglutinin; 이하 "DSA")를 이용하여 렉틴블럿을 수행하였다(도 11). 도 12에 제시한 바와 같이 L₄-PHA는 GnT-V의 산물인 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 인식하는 렉틴이며, DSA는 락토사민(lactosamine)을 인식하는 렉틴이다. 도 11에서 WiDr;mock에서 유래한 야생의 TIMP-1은 염기성 쪽에 하나의 큰 스팟과 산성쪽에 작은 두 개의 스팟으로 나타나 작은 부분이 시알산과 같은 산성 당쇄를 보유하지만 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지나 락토사민은 보유하지 않는 반면, WiDr:GnT-V에서 유래한 TIMP-1은 대부분이 β1,6 N-아세틸글루코사민 가지를 보유하고 폴리락토사민(polylactosamine)으로 확장되어 있음을 알 수 있다. 특히 2차원 겔상에서 여러 스팟으로 나타나 다양한 형태를 지니고 있고 Mock 세포주 유래의 TIMP-1에 비해 분자량이 약 2kDa가 증가한 것으로 보아 약 10개 또는 그 이상의 단당류가 부가되었음을 확인하였다.

< 실시예 6> TIMP -1의 ‘잘못된 당질화 ’가 세포의 이동과 침윤에 미치는 영향

수많은 연구 결과는 GnT-V의 활성 증가가 암세포의 높은 침윤/전이 활성과 연관되어 있다고 보고하였으므로 대장암에서 이 TIMP-1의 ‘잘못된 당질화’가 구체적으로 어떤 영향을 주는지 조사할 필요가 있다. 이를 위해, 각 TIMP-1 변이주에대한 ‘이동(migration)'과 ’침윤(invasion)'을 인비트로(in vitro)에서 조사하였다. 도 13에서 보여주듯이 이동에 대한 활성은 8μm-크기의 구멍이 있는 폴리카보네이트 재질 12-웰 트랜스웰 챔버(Corning Inc.)에서 조사하였다(Guo, H.-B. et al (2002) Cancer Res . 62, 6837-6845). 이동은 삽입물 막의 아래쪽을 메탄올로 고정시키고 톨루이딘 블루로 염색한 다음, 400배의 현미경에서 숫자를 세었다. 즉, 도 13과 같이 폴리카보네이트막을 관통하여 아래쪽으로 이동한 세포수를 세어 비교하는 것이 세포의 ‘이동’을 조사하는 방법이다. 전체적으로 Mock에 비하여 GnT-V가 세포의 이동에 관여함은 분명하나 이는 TIMP-1에 의존적으로 나타나지는 않았다. 즉, TIMP-1의 당쇄 변이 상태에 따라 세포이동이 달라진다고 보기도 어렵다. 이는 세포의 이동성이 GnT-V에 의한 것임은 알 수 있지만 TIMP-1이 아닌 다른 단백질이나 신호전달에 기인하는 것으로 추측된다.

한편, 8μm-크기의 구멍을 세포밖 매트릭스(Extracellular Matrix: ECM)로 코팅한 웰에서 세포가 이 ECM 막을 관통하여 ‘침윤(invasion)'하는 능력을 조사해 보았다. 도 14에 보여주는 바와 같이 TIMP-1의 당쇄 부분은 세포의 침윤에 결정적 영향을 주었다. T-N30/78Q:GnT-V 세포주는 T-WT:GnT-V에 비하여 놀랄 정도로 침윤이 느려짐을 보여주었고, T-N30Q와 T-N78Q는 그 중간 정도를 보여주었다. 그러나 WiDr:Mock 세포의 변이주들 사이에서는 거의 차이가 없었다. 결과적으로 이 데이터는 TIMP-1의 당쇄 자체가 아니라 '잘못된 당질화'가 인비트로에서 세포의 침윤에 영향을 주고 있음을 제시하고 있다.

인비트로에서의 세포의 침윤은 8μm의 코팅된 기저막(basement membrane)을 가수분해하고, 이어 구멍을 관통하여 이동하는 2단계의 특징적인 과정을 거친다. 세포의 이동에서는 큰 차이를 보이지 않았으므로(도 13), 침윤의 다양한 양상은 기저막의 가수분해의 차이에서 기인하고 있음을 알 수 있다. 젤라티네이즈(MMP-2 및 MMP-9) 저해제를 처리했을 때 WiDr 세포주의 침윤은 거의 완벽하게 억제되었으므로 이 가수분해가 MMP-2나 MMP-9에 의한 것으로 보인다(Garbett, E.A. et al (1999) Mol Pathol. 52, 140-145; Ogiwara, K. et al (2005) Proc . Natl . Acad . Sci . USA . 102, 8442-8447). TIMP-1 변이 Mock 세포주 들의 경우, 세포의 침윤이 거의 비슷한 것으로 보아 N-연결형 당쇄의 당쇄 제거에 의한 TIMP-1의 젤라티네이즈 저해 활성은 침윤의 원인에서 일단 배제된다. 심지어 N-글리코시데이즈 F(PNGase F)를 처리하여 TIMP-1의 당쇄를 제거했을 때, 이 저해활성에서의 큰 차이를 보이지도 않았다 (Caterina, N.C. et al(1998) Biochim . Biophys . Acta 14, 21-34). 또한 WiDr:Mock와 WiDr:GnT-V 세포주에서의 이동, 침윤 활성의 차이가 MMP-2나 MMP-9의 발현량의 차이에 기인하지도 않았고(도 15), 심지어 TIMP-1이나 변이주를 트랜스펙션해도 젤라티네이즈의 발현양상에는 변화가 없었다(데이터 제시 생략). 이상의 결과를 종합하면 TIMP-1의 당질의 변화가 젤라티네이즈에 대한 저해 활성의 변화를 가져오고 이는 마트리겔(Matrigel) 코팅된 막을 가수분해하는 속도를 변화시키는데, 이 가수분해 속도의 증가가 WiDr 세포주의 침윤효과를 높인다는 결론에 도달한다.

< 실시예 7> 형광 기질 사용 방법: TIMP -1의 ‘잘못된 당질화 ’가 젤라티네이 즈 활성 억제에 미치는 영향

TIMP-1의 ‘잘못된 당질화’가 젤라티네이즈 활성 억제에 어떤 영향을 주는 지를 조사하기 위해 다양한 젤라티네이즈 저해제의 존재 하에서 그 효소활성을 측정하였다. 우선 proMMP-2(Calbiochem)를 활성화하기 위하여 동일농도 비율의 활성형 MMP-3(Sigma)와 37℃에서 4시간 반응시키고, proMMP-9(Calbiochem)을 활성화하기 위하여 1mM APMP(p-aminophenymercuric acetate)를 37℃에서 2시간 반응시켰다. 활성화된 젤라티네이즈를 젤라틴-세파로스 컬럼을 이용하여 정제하였다(Fridman, R. et al (1992) J. Biol . Chem. 267, 15398-15405). 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, 0.1mM ZnCl₂, 0.02% Brij-35를 포함하는 50mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5)에서 젤라티네이즈(50ng)과 동일한 몰비로 TIMP-1, 혹은 MMP 억제제와 기질 DABCYL-GABA-PQGL-E(EDANS)-AK-NH₂(Calbiochem) 8μM를 넣고 4℃에서 한 시간 반응시켰다. 도 16에서 보는 바와 같이, 형광을 띠지 못하는 기질 DABCYL-GABA-PQGL-E(EDANS)-AK-NH₂은 젤라티네이즈에 의해 잘리면 형광을 띠는 DABCYL-GABA-PQG가 만들어지므로 이를 형광 광도계 LS45(PerkinElmer)를 이용하여 흥분파장 338nm, 방출파장 495nm로 측정하였다. 젤라티네이즈를 동일분자 비율로 TIMP-1과 미리 반응시키면, 가수분해 반응은 거의 0차 카이네틱스 유형의 초기 반응 속도를 보인다(도 17의 안쪽 작은 도표). 이때 형광 산물의 형성에 대한 기울기를 젤라티네이즈의 상대 활성으로 결정하였다. 앞선 연구(Caterina, N.C. et al, (1998) Biochim . Biophys . Acta 14, 21-34; Stricklin, G.P. (1986) Coll . Relat . Res . 6, 219-228)와 일치하는 이 결과는 TIMP-1의 제거된 N-연결형 당쇄가 젤라티네이즈의 저해 활성에 거의 아무런 영향을 주지 못함을 보여주었다(도 17, 도 18). 잘못된 당질화로 인한 당쇄가 젤라티네이즈의 완화된 저해활성을 담당하고 있는 것으로 보인다. WiDr:Mock 세포주에서 정제한 rTIMP-1과 변이단백질들은 야생의 수준에서 저해활성을 보이는 반면, WiDr:GnT-V 유래의 T-WT는 젤라티네이즈 억제활성이 유의하게 감소되는 결과를 보여주었다.

< 실시예 8> 자이모그래피 방법: TIMP -1의 ‘잘못된 당질화 ’가 젤라티네이즈 활성 억제에 미치는 영향

TIMP-1에 의한 젤라티네이즈 억제 활성을 자이모그래피(zymography) 방법으로도 살펴보았다(도 19). 즉, MMP-2와 MMP-9의 프로형과 활성형에 대하여 다양한 억제제의 존재 하에서 젤라틴 분해능력을 조사하였다. 0.5%(w/v) 젤라틴이 들어 있는 12% SDS-PAGE에 5μg/ml의 rTIMP-1이나 변이 단백질을 가하고 전개하였다. 이때 젤라티네이즈와 재조합 단백질이 겔 상에서 결합하도록 4℃에서 밤새 반응시킨 후 이어 젤라틴이 가수분해되도록 37℃에서 150mM NaCl, 5mM CaCl₂, 0.1 mM ZnCl₂, 0.02% (w/v) Brij-35를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 7.5)완충용액에서 12시간 반응시켰다. 이런 일련의 연구는, 만일 TIMP-1이 젤라틴 함유 겔에 공유결합방식으로 들어간다면 젤상에서 이웃하고 있는 젤라티네이즈와 결합함으로 젤라틴의 가수분해를 막을 것이라 가정하였다. 도 19의 결과를 보면 WiDr:Mock에서 유래한 TIMP-1은 프로형이건 활성형이건 MMP-9의 활성을 억제하고 있는 반면, T-TW:GnT-V의 TIMP-1은 MMP-9의 젤라틴 분해 활성을 강력하게 억제하지 못하고 있다. TIMP-1에 의한 MMP-2의 억제 유형은 침윤 활성 조사나 형광 기질을 이용한 방법과 다소 달랐는데 이는 TIMP-1과 MMP-2 간의 겔 상의 제한된 상호작용에 기인해 보인다. 그럼에도 불구하고 T-TW:GnT-V 유래의 TIMP-1은 T-N30/78Q:Mock 유래보다 MMP-2에 대해 더 완화된 저해 정도를 보여주고 있다. 이상의 결과는 잘못 부착된 당쇄가 TIMP-1의 젤라티네이즈 활성 억제를 방해하고 있음을 제시하고 있다.

< 실시예 9> 결합 카이네틱스를 이용한 확인: TIMP -1의 ‘잘못된 당질화 ’가 젤라티네이즈 억제 활성에 미치는 영향

왜 TIMP-1의 잘못된 당질화가 젤라티네이즈 억제 효과의 손실을 가져오는지를 알아보기 위해 TIMP-1과 젤라티네이즈의 결합성질에 대해 조사하였다. TIMP-1/젤라티네이즈 상호작용의 카이네틱 변수(k _on, k _off, K _i)는 이미 알려진 방법(Olson, M.W. et al (1997) J. Biol . Chem. 272, 29975-29983)을 이용하였다. 간단히 설명하면, 1차 결합 상수(k)는 다음의 조건에서 결정하였다. 활성형 젤라티네이즈 1nM을 8μM의 형광기질과 TIMP-1이 들어있는 반응 혼합물에 넣었다. TIMP-1:Mock과 TIMP-1:GnT-V는 각각 0-6nM과 0-25nM 범위에서 양을 바꾸어 넣어 주었다. 반응곡선은 37℃에서 LS45 형광광도계(PerkinElmer)를 이용하여 구하였다. 곡선은 다음의 수학식 1에 맞추었다.

[P]= v _s t+(v ₀ - v _s )(1-e ^- ^kt )/k

[P]는 반응물의 농도, v ₀ 와v _s 는 평형상태의 속도, k는 저해의 슈도(pseudo)- 1차 속도상수이며, v _s 와 k는 시그마 플롯(Sigma Plot; SPSS Science, Inc.)을 이용하여 계산하였다. 2차 속도상수(k _on)는 k를 TIMP-1 농도에 대한 함수로 직선 회귀법을 이용하여 계산하였다. k _off 값은 젤라티네이즈 TIMP-1 복합체의 시간에 따른 해리정도를 이용하여 측정하였다. 복합체는 동일 몰라의 젤라티네이즈와 TIMP-1을 37℃에서 한 시간 반응시켜 만들었다. 복합체의 해리는 기질을 포함하는 큐벳 안에서 1000배 희석하여 구현하였다. 평형에 도달한 후 기록된 시간과 반응 곡선을 수식 1에 맞추었다. 얻어진 값에 마이너스를 붙여 k _off로 하였다. 저해 상수(K _i )는 K _i =k _off/k _on으로 결정하였다.

결합은 느린, 밀착결합(tight-binding) 경쟁적 억제를 보여주었고, 시간의존형 억제를 보였으며 결과적으로 젤라티네이즈 활성은 시간에 따라 진행 곡선에 대하여 커비리니어(Curvilinear) 함수로 나타났다. 도 20과 도 21은 각각 다양한 농도의 TIMP-1:Mock과 TIMP-1:GnT-V의 존재 하에서 시간에 따른 MMP-2의 활성을 보여주고 있으며, 도 22는 이를 하나의 그림에서 비교하여 보여주고 있다. 도 23, 도 24, 그리고 도 25에서 보듯이 MMP-9의 카이네틱 유형도 MMP-2와 유사하였다. TIMP-1에 의한 젤라티네이즈 활성 억제의 카이네틱 변수(k _on, k _off, K _i)는 다음의 표에 제시하고 있다. 잘못된 당쇄를 보유한 TIMP-1은 활성형 젤라티네이즈에 대하여 느슨하게 결합(낮아진 k _on)하고 더 효과적으로 해리(높아진 k _off)되었다. ‘잘못된’ TIMP-1/젤라티네이즈 상호작용에 대한 K _i는 야생의 TIMP-1/MMP-2에 비하여 7.2배나 높았다. 저해 상수의 증가는 TIMP-1/MMP-9에서 더 놀랍게 높아 11.4배나 되었다. 이러한 결과는 복합체에서 ‘잘못된 당질화’가 TIMP-1/젤라티네이즈 상호작용에 대한 평형을 해리되는 방향으로 진행시킴을 의미한다. 결과적으로 TIMP-1에 의한 활성형 젤라티네이즈의 단단한 결합과 조절이 느슨해져 복합체를 이루지 않고, 저해를 받지않는 자유로운 젤라티네이즈를 양산하게 되는 것이다.

< 실시예 10> 마우스를 이용한 TIMP -1의 ‘잘못된 당질화 ’의 효과

암세포의 증식이 야생의 생쥐에 비하여 MMP-9 결손 생쥐에서 줄어든다고 보고되었고(Coussens LM et al (2000) Cell 103: 481-490), MMP-2의 발현이 유전적으로 결손된 생쥐에서 흑색종의 전이나 혈관신생이 줄어든다고 알려져(Itoh T et al (1998) Cancer Res 58 1048-1051) 암의 전개에서 젤라티네이즈의 활성이 중요함을 알 수 있다. 이 젤라티네이즈에 대한 TIMP-1의 변형된 저해가 인 비보(in vivo)의 면역 결핍 생쥐에서 암세포의 증식에 어떤 연관이 있는지를 조사하였다. 우선 6주령의 C.By.Cg-Foxn1 ^nu (면역 결핍) 생쥐를 병원성이 없는 상태에서 키우고, 유지하였다. 멸균된 상용먹이(Harlan, Indiana)와 물을 공급하고, 100μl의 PBS에 들어있는 2x10⁶ 세포들을 대퇴골의 피하에 이식하였다. 그룹당 4 혹은 10마리의 생쥐를 매일 관찰하고 주당 세 번에 걸쳐 암의 크기를 측정하였다. 암의 부피는 길이 x (폭)²/2으로 계산하였다. 조직병리학적으로 관찰하기 위해, 쥐를 희생한 다음 피하의 암을 절개하여 10%의 중성 완충 포르말린으로 고정시켰다. 고정 후, 일반적인 과정으로 표본을 다루어 파라핀으로 싸고 헤마토실린과 에오신(H&E)으로 염색하였다. 각 TIMP-1 변이주는 이식 후 2주가 지나자 도 26과 같이 암이 형성되었다. 동일한 수의 세포를 이식했을 때, 암의 형성속도는 T-N30/78Q:GnT-V에 비하여 T-WT:GnT-V에서 놀랄 정도로 빠르게 형성되었는데(도 27), 이는 앞서 수행한 인비트로 결과와 일치한다. 한편 TIMP-1의 변이주들이 들어있는 WiDr:mock 세포주들의 경우는 거의 변화가 없었다(도 28). 형성된 암에 대한 조직병리학적 분석은 도 29에서 점선 안에 강물처럼 골격근육 섬유(검정 화살표)와 싸고 있는 엔도미시엄(투명화살표)으로 침윤해 들어와 있는데 이들의 주성분은 콜라겐이다. 생쥐의 숫자를 각각 10마리로 늘여, T-WT:GnT-V, T-N30/78Q:GnT-V, T-WT:Mock 과 원래의 WiDr세포주에 대하여 암의 형성 정도를 측정하였다. 도 30에 제시하듯이 예상대로, T-N30/78Q:GnT-V가 이식된 생쥐에서 가장 낮은 암 형성률을 보였고, 정반대로 T-WT:GnT-V에서 가장 높은 암의 형성 정도를 확인하였다. 원 WiDr 세포주의 경우, T-WT:Mock 보다 높았는데 (p<0.01) 이는 T-WT:Mock세포주가 야생의 TIMP-1을 더 많이 보유하고 있어 젤라틴 분해 저해 능력이 더 크기 때문으로 보인다.

< 실시예 11> 대장암 환자 조직을 이용한 TIMP -1의 ‘잘못된 당질화 ’의 효과

일련의 인비트로 실험과 인비보 데이터는 과연 대장암 환자 조직에서 이러한 TIMP-1의 ‘잘못된 당질화’가 어떤 양상을 보이는지에 대한 의문을 제기한다. 이런 의문에 대한 답을 얻기 위해 대장암 환자 중 정상과 암환자 조직을 확보하고 TIMP-1의 발현 수준과 당질화 정도를 조사하였다.

도 31에 보여 주듯이 TIMP-1의 발현 수준이 곧 대장암의 진행 정도를 의미하진 않았다. 대장암 조직에서 TIMP-1의 발현은 대응하는 정상 조직에 비하여 거의 모든 단계에서 높게 나타났으며 이는 지금까지 보고된 결과와도 일치하고 있으나(Egeblad, M. et al (2002) Nature Rev . 2, 161-174; Heppner, K.J. et al (1996) Am . J. Pathol. 149, 273-282; Baker, E.A. et al (2000) Br . J. Surg . 87, 1215-1221; Yoshikawa, T. et al (2001) Cancer 91, 1739-1744; Huang, L.W. et al (2000) Gynecol Oncol . 77, 369-376), 그 정도는 일반적으로 전이 변수로 인정되고 대장암 전개 인덱스인 Astler-Coller 대장암 단계와는 무관하였다. 어쩌면 세포의 침윤과 근접 조직으로 퍼져나간 상태를 나타내는 Astler-Coller 단계 C와 D에서는 조사한 조직의 70%이상에서 ‘잘못된 당질화’를 보이는 TIMP-1을 발견하였고 이는 그룹 1에서와는 사뭇 다른 결과이다. 재미있게도, RT-PCR을 이용하여 GnT-V의 전사 수준을 조사하였더니 이는 단계 의존형으로 증가하였고 TIMP-1의 잘못된 당질화도 수반하였다. 도 32는 대표적인 조직 10개의 경우에 대한 결과이다. 케이스 1, 4와 5는 TIMP-1에 놀랄만한 β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄 가지의 증가를 보여주고 있으며 이는 도 11의 결과와도 일치한다. 도 32에서 GnT-V의 전사 수준이 높은 경우는 상대적으로 높은 암의 단계를 보여주고 먼 위치까지 특히 림프절로 전이가 되는 높은 암의 침윤상태를 보여주었다. 이상의 결과들을 종합하면 GnT-V에 의해 유도되는 TIMP-1의 잘못된 당질화는 대장암에서 높은 침윤/전이 포텐셜과 깊은 연관이 있음을 제시하고 있다. 이를 하나의 모식도로 제시하면 도 33에서 보듯이 정상상태에서는 TIMP-1이 MMP의 활성을 잘 저해하고 있어 그 상태를 유지하다가 외부 환경의 변화로 당전이효소 GnT-V의 발현이 증가하여 TIMP-1에 ‘잘못된 당질화’를 일으키게 되고 잘못된 TIMP-1이 궁극적으로 MMP의 활성을 저해하지 못함으로 인하여 암의 발생과 전이가 일어난다고 예측할 수 있다.

TIMP-1의 역할을 여러 보고들을 통해 정리해 보면 모순되는 이중적 의미를 갖고 있다. 한 가지는 TIMP-1이 MMP들의 활성을 저해하여 암의 전개를 저해하는 것이고, 또 다른 한 가지는 암세포의 성장과 생존에 MMP-의존형 또는 비의존형으로 관여한다는 것이다. 실제로 흑색종에서 TIMP-1의 과발현은 암의 성장과 전이를 저해하였고(Khokha, R. (1994) J. Natl . Cancer . Inst. 86, 299-304), 위암(Watanabe, M. et al (1996) Cancer 77, 1676-1680)과 구강 비늘 모양 세포 종양(Nii, M. et al (2000) Int . J. Oncol . 16, 119-124)에서 전이활성을 억제하였다. 그러나 이는 많은 암의 유형에서 TIMP-1이 올라가고(Egeblad, M. et al (2002) Nature Rev . 2, 161-174; Heppner, K.J. et al (1996) Am . J. Pathol. 149, 273-282; Baker, E.A. et al (2000) Br . J. Surg . 87, 1215-1221; Yoshikawa, T. et al (2001) Cancer 91, 1739-1744; Huang, L.W. et al (2000) Gynecol Oncol . 77, 369-376), TIMP-1의 높은 수준이 나쁜 예후와 관련이 있다는 보고(Coussens, L.M. et al (1996) Chem . Biol. 3, 895-904; Reed, J.C. (2001) Curr . Opin . Oncol. 11, 68-75)와는 모순이 된다. 더구나 수술 전 혈청 내 높은 TIMP-1의 수준이 대장암(Holten-Andersen, M.N. et al (2000) Clin . Cancer . Res. 6, 4292-4299), 폐암( Ylisirnio, S. et al (2000) Anticancer Res . 20, 1311-1316)과 위암(Yoshikawa, T. et al (2000) Cancer Lett . 151, 81-86) 환자에게서 짧은 생존율과 관련 있다고 보고되었다. 따라서 본 발명은 이러한 모순이 TIMP-1의 ‘양’ 즉 발현의 정도로만 설명하려 했기 때문에 발생하는 것으로 '양'과 함께 '질'에 해당하는 "잘못된 당질화"의 영역까지 함께 보아야만 제대로 설명됨을 제시하고 있다.

위에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질 TIMP-1의 양과 그 당쇄 변화를 동시에 측정하면 더 정교하게 효과적으로 대장암을 진단해 낼 수 있는 중요한 단서를 제공한다. 이는 비단 TIMP-1에만 한정되는 것이 아니며 도 34와 같이 표적 단백질의 양을 항체로, 표적 단백질의 ‘잘못된 당질화’를 렉틴으로 검색함으로써 더 차원 높은 진단의 방법을 제공하고 있으며 이미 보고된 여러 문헌에서 표 1에 제시한 많은 단백질이 뇌, 신장, 간, 위, 비장, 전립선, 난소 등에서 폭넓게 발현되는 단백질이므로 대장암 외 다른 암의 진단에 확대적용할 수 있을 것이다.

Claims

(ⅰ) 기질의 대조구 및 분석구에 암 발생 및 전이에 관여하는 α-1-안티트립신(antitrypsin), 안지오텐시노겐(Angiotensinogen), β-헥소사미니다제(hexosaminidase) β 사슬 전구체(precursor), 카뎁신 D 프리프로테인(Cathepsin D preproprotein), 카뎁신 X 전구체, 이뮤노글로불린 G1 H 체인, 다이펩티딜 아미노펩티다제(Dipeptidyl aminopeptidase) II, 디스코이딘 수용체 티로신 키나제 아이소폼(isoform) b, 디스트로글리칸(Dystroglycan) 1 전구체, 그래뉼린(Granulins) 전구체, 열충격 단백질 8(70kDa) 아이소폼 1, 열충격 단백질 1(90kDa) β, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(Heparan sulfate proteoglycan perlecan), 헥소사미니다제 A 프리프로테인, Ig κ(kappa) 체인 V-III 단백질, IgG Fc 결합 단백질, 라미닌 수용체-유사 단백질 5, 레구마인(Legumain) 전구체, Met 프로토-옹코진 전구체(Met proto-oncogene precursor) , N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 네오제닌 유사체 1(Neogenin homolog 1), 프롤릴 4-하이드록실라제(Prolyl 4-hydroxylase), 프로사포신(Prosaposin), β-갈락토시다제 보호 단백질(Protective protein for β-galactosidase), 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6), 단백질 티로신 키나제 7(Protein tyrosine kinase 7), 리보뉴클라제 T2 전구체(Ribonuclease T2 precursor), 세린 프로테아제 22, 종양 결합 칼슘 신호 전달인자 1 전구체(Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor), 종양 거절 항원-1(Tumor rejection antigen-1), Zn-α-2-글리코프로테인(Zn-α-2-glycoprotein)으로 구성되는 단백질 군 중 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 각각의 항체를 흡착시키는 단계;

(ⅱ) 상기 항체가 흡착된 각각의 대조구 및 분석구에 시료를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;

(ⅲ) 상기 시료가 첨가된 각각의 대조구에는 상기 단백질에 대한 항체를 첨가하고 상기 시료가 첨가된 각각의 분석구에는 리간드로 표지된 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화 또는 N-연결형 α1,6 퓨코스의 당쇄 가지 변화 측정용 렉틴을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;

(ⅳ) 상기 항체가 첨가된 각각의 대조구에는 발색효소가 결합된 2차항체를 첨가하고, 상기 리간드로 표지된 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화 또는 N-연결형 α1,6 퓨코스의 당쇄 가지 변화 측정용 렉틴이 첨가된 각각의 분석구에는 발색효소가 결합된 리간드 수용체를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; 및,

(ⅴ) 상기 각각의 대조구 및 분석구에 발색 기질액을 첨가하여 발색시킨 다음, 분광광도계로 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 암 발생 및 암 전이에 관여하는 하나 또는 그 이상의 단백질의 당쇄변화의 측정방법.
(ⅰ) 기질의 대조구 및 분석구에 시료를 가하여 기질에 단백질을 흡착시키는 단계;

(ⅱ) 상기 단백질이 흡착된 각각의 대조구에는 암 발생 및 전이에 관여하는 α-1-안티트립신(antitrypsin), 안지오텐시노겐(Angiotensinogen), β-헥소사미니다제(hexosaminidase) β 사슬 전구체(precursor), 카뎁신 D 프리프로테인(Cathepsin D preproprotein), 카뎁신 X 전구체, 이뮤노글로불린 G1 H 체인, 다이펩티딜 아미노펩티다제(Dipeptidyl aminopeptidase) II, 디스코이딘 수용체 티로신 키나제 아이소폼(isoform) b, 디스트로글리칸(Dystroglycan) 1 전구체, 그래뉼린(Granulins) 전구체, 열충격 단백질 8(70kDa) 아이소폼 1, 열충격 단백질 1(90kDa) β, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(Heparan sulfate proteoglycan perlecan), 헥소사미니다제 A 프리프로테인, Ig κ(kappa) 체인 V-III 단백질, IgG Fc 결합 단백질, 라미닌 수용체-유사 단백질 5, 레구마인(Legumain) 전구체, Met 원종양 유전자 전구체(Met proto-oncogene precursor) , N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 네오제닌 유사체 1(Neogenin homolog 1), 프롤릴 4-하이드록실라제(Prolyl 4-hydroxylase), 프로사포신(Prosaposin), β-갈락토시다제 보호 단백질(Protective protein for β-galactosidase), 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6), 단백질 티로신 키나제 7(Protein tyrosine kinase 7), 리보뉴클라제 T2 전구체(Ribonuclease T2 precursor), 세린 프로테아제 22, 종양 결합 칼슘 신호 전달인자 1 전구체(Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor), 종양 거절 항원-1(Tumor rejection antigen-1), Zn-α-2-당단백질(Zn-α-2-glycoprotein)로 구성되는 단백질 군 중 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 항체를 첨가하고, 상기 각각의 분석구에는 리간드로 표지된 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화 또는 N-연결형 α1,6 퓨코스의 당쇄 가지 변화 측정용 렉틴을 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계;

(ⅲ) 상기 항체가 첨가된 각각의 대조구에는 발색효소가 결합된 2차항체를 첨가하고, 상기 리간드로 표지된 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화 또는 N-연결형 α1,6 퓨코스의 당쇄 가지 변화 측정용 렉틴이 첨가된 각각의 분석구에는 발색효소가 결합된 리간드 수용체를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; 및,

(ⅳ) 상기 각각의 대조구 및 분석구에 발색 기질액을 첨가하여 발색시킨 다음, 분광광도계로 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 암 발생 및 전이에 관여하는 하나 또는 그 이상의 단백질의 당쇄변화의 측정방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 시료는 혈액 또는 소변으로부터 채취되는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 렉틴은 L₄-PHA 및 LCA(Lens culinaris agglutinin) 중 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
암 발생 및 전이에 관여하는 α-1-안티트립신(antitrypsin), 안지오텐시노겐(Angiotensinogen), β-헥소사미니다제(hexosaminidase) β 사슬 전구체(precursor), 카뎁신 D 프리프로테인(Cathepsin D preproprotein), 카뎁신 X 전구체, 이뮤노글로불린 G1 H 체인, 다이펩티딜 아미노펩티다제(Dipeptidyl aminopeptidase) II, 디스코이딘 수용체 티로신 키나제 아이소폼(isoform) b, 디스트로글리칸(Dystroglycan) 1 전구체, 그래뉼린(Granulins) 전구체, 열충격 단백질 8(70kDa) 아이소폼 1, 열충격 단백질 1(90kDa) β, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 펄리칸(Heparan sulfate proteoglycan perlecan), 헥소사미니다제 A 프리프로테인, Ig κ(kappa) 체인 V-III 단백질, IgG Fc 결합 단백질, 라미닌 수용체-유사 단백질 5, 레구마인(Legumain) 전구체, Met 원종양 유전자 전구체(Met proto-oncogene precursor) , N-아세틸갈락토사민-6-설파타제(sulfatase), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 네오제닌 유사체 1(Neogenin homolog 1), 프롤릴 4-하이드록실라제(Prolyl 4-hydroxylase), 프로사포신(Prosaposin), β-갈락토시다제 보호 단백질(Protective protein for β-galactosidase), 단백질 티로신 키나제 6(Protein tyrosine kinase 6), 단백질 티로신 키나제 7(Protein tyrosine kinase 7), 리보뉴클라제 T2 전구체(Ribonuclease T2 precursor), 세린 프로테아제 22, 종양 결합 칼슘 신호 전달인자 1 전구체(Tumor-associated calcium signal transducer 1 precursor), 종양 거절 항원-1(Tumor rejection antigen-1)(gp96), Zn-α-2-당단백질(Zn-α-2-glycoprotein)로 구성되는 단백질 군 중 하나 또는 그 이상의 단백질에 대한 각각의 항체가 흡착된 기질, 상기 단백질에 대한 각각의 항체, 리간드가 결합된 N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화 또는 N-연결형 α1,6 퓨코스의 당쇄 가지 변화 측정용 렉틴, 발색효소로 표지된 2차 항체 및 발색효소로 표지된 상기 리간드의 수용체를 포함하는 암 진단용 킷트.
제7항에 있어서, 상기 암은 대장암, 위암, 폐암, 간암, 자궁암, 유방암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 킷트.
제7항에 있어서, 상기 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐 수지로 합성된 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 킷트.
제7항에 있어서, 상기 발색효소는 퍼옥시데이즈, 알칼라인 포스파테이즈로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암 진단용 킷트.
제7항에 있어서, 리간드는 바이오틴이고, 리간드 수용체는 아비딘인 것을 특징으로 하는 암 진단용 킷트.
제7항에 있어서, 발색기질액을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 진단용 킷트.
제7항에 있어서, N-연결형 β1,6 N-아세틸글루코사민의 당쇄 가지 변화 또는 N-연결형 α1,6 퓨코스의 당쇄 가지 변화 측정용 렉틴은 L₄-PHA 및 LCA(Lens culinaris agglutinin) 중 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 암 진단용 킷트.