PT1092767E - Anticorpo monoclonal específico de protease de serina e sua utilização - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

ANTICORPO MONOCLONAL ESPECÍFICO DE PROTEASE DE SERINA

E SUA UTILIZAÇÃO ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais ligando-se especificamente a uma determinada protease de serina, i. e., neurosina. Refere-se igualmente a um seu processo de produção e um método para diagnosticar várias doenças utilizando os anticorpos monoclonais.

DIVULGAÇÃO DA TÉCNICA ANTERIOR

Em geral, as proteases são biossintetizadas como precursores inactivos. Submetem-se a hidrólise limitada em moléculas para se converterem em proteases de tipo activado. Na medida em que as enzimas são proteases, possuem uma actividade para hidrolisarem uma ligação peptídica. Todavia, os seus modos de acção são variados de acordo com os tipos de proteases. De acordo com tipos específicos de sítios catalíticos, as proteases são divididas em proteases de serina, proteases de cisteína, proteases de aspartato, proteases metálicas, e semelhantes. Proteases de cada tipo possuem uma variedade de propriedades tais como, desde possuírem propriedades digestivas gerais até possuírem diversos domínios regulatórios e especificidade de substrato estrita, hidrolisando, desse modo, especificamente apenas proteínas características. 0 intervalo de pH óptimo de proteases de serina é de neutro a fracamente alcalino e, em geral, muitas delas possuem um peso molecular de cerca de 30000 ou inferior. Todas as proteases de coagulação sanguínea, fibrinólise e sistemas do complemento que possuem um grande peso molecular pertencem às proteases de serina semelhantes a tripsina. Possuem muitos 1 domínios reguladores e formam uma cascata de protease que é da maior importância para reacções num organismo vivo.

De acordo com a sua estrutura primária, as proteases de serina podem ser divididas na família subtilisina e na família quimotripsina. Aquelas da família subtilisina são produzidas apenas pelo Bacillus subtilis, enquanto aquelas da família quimotripsina encontram-se difundidas em microrganismos, animais e plantas. His-57, Asp-102 e Ser-195 (NoS. de quimotripsina) estão envolvidos na sua actividade catalítica e, em geral, são inactivados por fluorofosfato de diisopropilo (DFP). Para exibirem a sua actividade, é requerida uma tríade catalítica, em que His influenciada por Asp priva a Ser-195 do seu protão para activar a Ser. Para além disso, liga-se a um substrato para causar a polarização do grupo carbonilo, e o átomo de oxigénio forma o anião oxi. A tripsina possui Asn-189 neste sítio e interage com a carga positiva de um aminoácido básico, tal como Lys, Arg ou semelhantes. Por outro lado, o sítio correspondente de quimotripsina é Ser-189, e pode igualmente ligar-se neste um aminoácido aromático, tal como Tyr, Phe, Trp ou semelhantes, ou Leu ou Met. Em analogia com a quimotripsina, a esterase possui a Ser-189 e interage com um aminoácido não aromático, tal como Ala ou semelhantes. Como outras enzimas pertencendo à família quimotripsina, existem protease Achromobacter, plasmina, medulasina, acrosina, protease V8, catepsina G, quimase, endopeptidase específica de prolina, protease A da glândula submaxilar, Xlla, Xla, calicreina plasmática, IXa, Xa, α-trombina, Vila, proteína C, activador do plasminogénio tecidular, urocinase, Clr, Cls, C2, B, D, I, γ-seminoproteína, calicreina tecidular, factores C e B de células sanguíneas de Limulus polyphemus, enzimas de coagulação sanguínea e semelhantes.

Recentemente, sequências de ADNc e aminoácidos de muitas novas proteases foram determinadas por PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos para sequências consenso de 2 foram proteases de serina. De acordo com este método, encontradas novas proteases por diversos investigadores, tais como Yamamura et al. (Yamanura, Y et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun., 239, 386, 1997), Gschwend, et al. (Gschwend, T. P. et ai., Mol. Ceii. Neurosci., 9. 207, 1997), Chen et al. (Chen, Z-L, et al., <J. Neurosci., 15, 5088, 1995) e outros. A SEQ ID N°. : 3 do documento JP 9-149790 A divulga a neurosina como uma nova protease de serina. A neurosina foi igualmente referida na Biochimica et Byophysica Acta, 1350, 11-14, 1997. Neurosina possuindo não mais de 30% de identidade com proteases de serina conhecidas foi obtida em consequência do reconhecimento da actividade de protease de serina num sobrenadante de cultura de células COLO201 do cancro do cólon humanas e isolamento de todos os genes de protease de serina. Assim, é proporcionado um método para produção em massa de neurosina utilizando o gene da protease de serina e um método para o rastreio de inibidores especificos utilizando a enzima.

Adicionalmente, demonstrou -se que o método de rastreio é útil para o rastreio de medicamentos para o tratamento de diversas doenças. Presentemente, ainda se desconhecem as funções da neurosina. Todavia, visto que a neurosina é expressa abundantemente no cérebro, é presumível que desempenhe um papel importante na manutenção de funções cerebrais. Para além disso, existe uma possibilidade que novas funções detalhadas possam ser elucidadas pela utilização de proteína recombinante. O documento JP 6-62855 A divulga uma nova protease de serina, Zima, e esta é igualmente referida por J. Biol. Chem., 272(40), 25135-2514, 1997. As sequências de ADNc e de aminoácidos de Zima foram determinadas por amplificação de PCR de sequências consenso possuindo actividade semelhante a quimotripsina para construir uma biblioteca de ADNc pela utilização do ARNm do cérebro de um doente com doença de 3

Alzheimer. 0 ARNm codificando Zima é reconhecido em diversos mamiferos. Para além disso, embora Zima seja expressa abundantemente no cérebro, rim e glândulas salivares, quanto ao cérebro, não é expressa no cérebro fetal, mas é expressa apenas no cérebro adulto. Para além disso, Zima possui um gene no cromossoma 19ql3.3, e esta região foi revelada como sendo uma parte associada ao inicio tardio da doença de Alzheimer de familia. Por conseguinte, é considerado que Zima seria útil para a elucidação de caracteristicas de doenças neurais, tais como doença de Alzheimer e sindromas de Down.

Os documentos WO 98/11238 e EP-A 1 0 576 152 divulgam uma nova protease, Protease M (também chamada Zima), e esta é igualmente referida em Molecular Medicine, 2(5) , 624-636, 1996. É obtido ADNc da protease M a partir da linha celular 76 N epitelial mamária humana normal e possui uma sequência muito semelhante à calicreina, Antigénio Especifico da Próstata (PSA) e tripsina. E, o gene da Protease M está presente no cromossoma 19ql3.3. A Protease M é considerada um marcador útil no adenocarcinoma primário da mama e cancro primário dos ovários porque, embora seja negativamente regulada na linha celular de cancro da mama matastático, o seu ARNm é fortemente expresso na linha celular de cancro primário da mama, tecido de cancro dos ovários e linha celular de cancro.

Embora as origens destas neurosina, Zima e Protease M sejam diferentes, as suas sequências de ADNc e sequências de aminoácidos, e ainda as posições na conformação do cromossoma dos genes codificando-as são completamente idênticas umas às outras. Visto que existe uma elevada possibilidade que estas substâncias sejam a mesma substância, o nome "neurosina" é aqui utilizado para se referir a elas como um todo. Como acima descrito, esta protease de serina foi descoberta por diferentes grupos de investigadores quase ao mesmo tempo, e foram estudadas as suas actividades farmacológicas. Por conseguinte, é esperado que a sua importância seja elucidada 4 em diversas ocasiões no futuro. Por exemplo, Games et al. (Games, D. et al. , Nature, 373, 523, 1995) e Hsiao et al. (Hsiao, K, et al., Science, 274, 99, 1996) tiveram êxito na expressão de uma grande quantidade de proteína precursora β-amilóide (βΑΡΡ), e produção de murganhos transgénicos nos quais foi observada a deposição de proteína amilóide β (Αβ) em 1995 e 1996, respectivamente. Por conseguinte, o papel da protease de serina acima na doença de Alzheimer e semelhantes será posteriormente elucidado no futuro.

Como divulgado no documento JP 6-62855 A, Zima (i. e., neurosina) desempenha um papel importante na doença de Alzheimer e nas síndromas de Down. Embora tenha sido proposto que a doença de Alzheimer devia ser dividida na doença de Alzheimer pré-senil e demência senil de tipo Alzheimer manifestando-se em senescência do ponto de vista patológico, o termo "doença de Alzheimer" é aqui utilizado para referir-se a eles como um todo.

Clinicamente, a doença de Alzheimer é caracterizada por declínio progressivo de várias funções de reconhecimento e a principal observação neuropatológica é encontrar estruturas anómalas, tais como placa senil e alteração neurofibrilar para além de degenerescência e deficiência de neurónios (Trojanowski, J. Q. et al., In Current Neruology, 16, 93, 1996). Entre eles, embora a placa senil também apareça no caso de envelhecimento normal, aparece muito mais frequentemente no caso da doença de Alzheimer e é uma observação patológica possuindo elevada especificidade de doença. Para além disso, pode dizer-se que a β-amiloidogénese é um assunto muito importante a ser elucidado do ponto de vista patogénico porque, por exemplo, a deposição de Αβ que é um componente constituinte da placa senil é a primeira observação patológica no cérebro da doença de Alzheimer, e foi descoberta nova doença de Alzheimer de família possuindo mutação pontual no gene βΑΡΡ que é o precursor de Αβ. 5

Nas síndromas de Down em que o 21° cromossoma possuindo βΑΡΡ é uma trissomia, é encontrada a mesma observação patológica no cérebro como aquela da doença de Alzheimer em todos os casos após a idade de trinta. Teller et al. (Teller, J. K. et al.r Nature Med. , 2, 93, 1996) referiram que Αβ 42 solúvel aumenta em proporção com a idade e densidade de placa senil com base nos resultados da determinação de Αβ solúvel extraída de cérebros de fetos até doentes de sessenta anos com síndromas de Down, por imunoprecipitação e transferência de western. Adicionalmente, sugeriram que o aumento em Αβ solúvel relaciona-se com produção excessiva de βΑΡΡ e formação de placa senil porque Αβ solúvel é encontrada até em casos de síndromas de Down juvenis em que não está presente placa senil, ao passo que não é observado num grupo de controlo. Para além disso, Tokuda et al. (Tokuda, T. et al., Ann. Neurol., 41, 271, 1997) referiram que o aumento significativo tanto em Αβ1-40 como em Αβ1-42 plasmático (43) é encontrado num grupo com síndromas de Down em comparação com aquele de um grupo de controlo. Em consideração destes factos, existe uma possibilidade que a neurosina possua uma determinada acção sobre as síndromas de Down.

Para além disso, considera-se também que a neurosina possui uma determinada acção sobre a demência pugilística e doença dos corpos de Lewy difusos que estão intimamente relacionadas com a doença de Alzheimer. A placa senil é uma estrutura de mancha possuindo 50 a 200 ym de diâmetro que surge principalmente no córtex cerebral do cérebro com doença de Alzheimer. Após passagem do tempo, a placa senil possui um núcleo amilóide no centro e observa-se à sua volta acumulação de axónios degenerados e células da glia reactivas. Αβ é polimerizada na forma de uma estrutura de folha β para formar fibra amilóide. Em geral, considera-se que a Αβ amilóide polimerizada extracelularmente é tóxica para os neurónios (Yankner, B. A. et al., Science, 6 250, 279, 1990; Siminons, L. K. et al. , Mol. Pharmacol. , 45, 373, 1994). A Αβ é um componente principal do núcleo amilóide o qual possui um peso molecular de cerca de 4 KDa e é composta por cerca de 42 aminoácidos. Para além da placa senil, acumula-se em vasos sanguineos pequenos na meninge e córtex para formar angiose amilóide. Kang et al. (Kang et al.,

Nature, 325, 733, 1987) demonstraram que Αβ é derivada do precursor maior, βΑΡΡ, por clonagem com base na informação da sequência de aminoácidos de Αβ revelada por Glenner et al. (Glenner, G. G. e Wong, C. W., Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 185, 1984). βΑΡΡ é uma glicoproteina possuindo uma estrutura semelhante àquela de um receptor transmembranar e possuindo um peso molecular de 120000 a 130000. Αβ está integrada na região desde o domínio transmembranar até ao domínio extracelular de βΑΡΡ. Presentemente, foram identificadas 6 classes de βΑΡΡ. Assim como a identificada βΑΡΡ que está envolvida na deposição amilóide, existe a βΑΡΡ659 que é expressa predominantemente no cérebro (Kang, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 82, 4245, 1985), βΑΡΡ751 que possui uma região de aminoácidos composta por 56 aminoácidos homólogos a um inibidor de protease de serina da família Kuntiz, βΑΡΡ770 que possui uma região de aminoácidos composta por 19 aminoácidos homólogos ao antigénio MRC X-2, e semelhantes. βΑΡΡ751 e βΑΡΡ770 são expressas predominantemente em órgãos corporais completos. Visto que todas elas possuem a parte Αβ no 99° aminoácido a partir da extremidade C-terminal, considera-se que estão envolvidas na formação amilóide no cérebro.

Embora as funções fisiológicas de βΑΡΡ sejam ainda desconhecidas, foi referido que βΑΡΡ expressa na superfície das células, ou βΑΡΡ solúvel que são clivadas no domínio Αβ e libertadas de células actua extracelularmente como uma molécula de adesão celular (Schubert, D. e Behl, C., Brain

Res., 629, 275, 1993), ou como um determinado factor de 7 nutrimento (Saitoh, T. et al., Cell, 58, 615, 1989). Por outro lado, presume-se que βΑΡΡ é transportada até à extremidade do axónio com um fluxo axonal, seguido por expressão na membrana sináptica, desempenhando assim um papel importante na formação sináptica ou sua manutenção nos neurónios (Schubert, W. et al., Brain Res., 563, 184, 1991).

Quanto ao metabolismo de βΑΡΡ, em geral, presumem-se duas vias. Isto é, uma é uma via de secreção em que o dominio Αβ é clivado no seu centro com a chamada β-secretase e o seu produto N-terminal é libertado para o exterior das células. A outra é uma via endossomal-lisossomal em que βΑΡΡ é incorporada nas células directamente ou após uma vez expressas na superfície das células e, finalmente, é decomposta nos lisossomas. Embora a região em que a Αβ é produzida durante estas vias de metabolismo de βΑΡΡ seja ainda desconhecida, uma possibilidade que pode ser presumida é que a Αβ é cortada imediatamente após incorporação de βΑΡΡ em vesícula endocítica e é imediatamente libertada para o exterior das células (Koo, E. H. e Squazzo, S. L., J. Biol. Chem. , 269, 17386, 1994) .

Após a descoberta de Αβ, considerou-se que o corte de Αβ era causado apenas num estado de doença. Todavia, os últimos estudos revelaram que a Αβ é produzida fisiologicamente e está presente no estado solúvel num sobrenadante de cultura (Haass, C. et al., Nature, 359, 322, 1992/ Shoji, M. et al., Science, 258, 126, 1992) ou no líquido cefalorraquidiano (Shoji, M. et al., Science, 258, 126, 1992; Seubert, P. et al., Nature, 359, 325, 1992) . Para cortar a Αβ da βΑΡΡ, são requeridas uma enzima para a clivagem do lado N-terminal de Αβ (β-secretase) e uma enzima para a clivagem do lado C-terminal de Αβ (γ-secretase) (Haass, C. et al.; Cell, 75, 1039, 1993). Embora estas secretases de Αβ não estejam ainda identificadas, foi revelado, recentemente, que a clivagem com β-secretase depende estritamente da sequência de aminoácidos (Citron, M. et al.,

Neuron, 14, 661, 1995) .

Presentemente, por exemplo, a catepsina B que é uma protease de cisteína (Tagawa, K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177, 377, 1991) e a metaloprotease possuindo um peso molecular de 105 a 120 KDa (McDermott, J. R. et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 179, 1148, 1991) são referidas como candidatas para a α-secretase. A prolil endopeptidase (Ishiura, S. et al. , FEBS Lett. , 260, 131, 1990) é referida como candidata para a γ-secretase A clipsina (Nelson, R. B. et ai., J. Biol. Chem., 265, 3836, 1990) e a ingensina (Ishiura, S. et al., FEBS Lett., 257, 388, 1989) são referidas como candidatas para a β-secretase.

Nestas circunstâncias, verificou-se a neurosina como uma nova protease de serina que cliva o lado N-terminal de βΑΡΡ entre Met596 e Asp597 para produzir Αβ. Como acima descrito, para conduzir estudos mais detalhados de Αβ e βΑΡΡ bem como da doença de Alzheimer e síndromas de Down, requere-se essencialmente um sistema de medição de neurosina.

Hoje em dia, em geral, o diagnóstico clinico da doença de Alzheimer é conduzido com base em diagnósticos padrão de DSM-IIIR e NINCDS-ADRDA (Mckhann, G. et al., Neurology, 34. 939, 1994) ou o diagnóstico padrão de DSM-IV (American

Psychiatric Association; Diagnostic and statistical manuais of mental disorders, 4a ed., Washington DC, American Psychiatric Association, 1994) . Todavia, estes perfis estão condicionados por declinio de funções de reconhecimento que causam uma grave deficiência no dia-a-dia ou na vida social. Por conseguinte, é realçado que o diagnóstico é menos objectivo cientificamente porque o diagnóstico pode ser influenciado pelo nivel de vida social de um indivíduo e ainda a especialidade e experiência de um médico que diagnostica estados específicos. Adicionalmente, o diagnóstico definitivo da doença de Alzheimer é conduzido por análises pato-histológicas e, neste aspecto, é realçada inconsistência considerável entre diagnós- 9 tico clínico e diagnóstico de autópsia.

Presentemente, é empregue diagnóstico de imagem como um meio suplementar no diagnóstico clínico do diagnóstico de Alzheimer e é possível analisar por PET e SPECT funções cerebrais, por exemplo, declínio do metabolismo e atrofia em locais específicos tais como hipocampo, lobo parietal do córtex cerebral e semelhantes gue são específicos da doença de Alzheimer (Fukuyama, H. et al. , J. Nucl. Med. , 35, 1, 1994). Embora seja difícil analisar muitos casos por PET, existe um relatório mostrando que é observada em cerca de 80% dos casos de doença de Alzheimer diminuição de um fluxo sanguíneo do lobo parietal para o lobo temporal com base em dados de SPECT de observações de fluxo sanguíneo em muitos casos (Haruo HANYUU, et al. , Gazoshindan of Alzheimer's Disease, Nippon Ronen Igaku Zasshi, 31, 683, 1994). Todavia, definir a doença de Alzheimer com base na diminuição de um fluxo sanguíneo do lobo parietal para o lobo temporal é muito perigoso e deve ser notado que, a diminuição de um fluxo sanguíneo no lobo frontal é encontrada em alguns casos restantes. Quanto a estas observações, é de importância distinguir a doença de Alzheimer da atrofia cerebral degenerativa tal como a doença de Pick e afasia progressiva bem como paralisia supranuclear progressiva, e a única forma segura disponível presentemente é o diagnóstico patológico.

Para além disso, enquanto observações úteis para serem utilizadas no tumor maligno, angiopatia, doenças com alterações metabólicas são obtidas por análise MRS (Espectroscopia de Ressonância Magnética) , encontram-se poucos relatórios em relação a doentes com demência incluindo a doença de Alzheimer. Em particular, presentemente, uma observação característica de demência não pode ser detectada por 1H-MRS em virtude da sobreposição com a observação de encefalotorofia tal como a diminuição no pico de NAA (N-acetil-aspartato) (Pettegrew, J. W. et al., J. Neuropa- 10 thol., Exp., Neurol., 46, 419, 1987; Barany, M. et al., Lancet, i, 517, 1985; Smith, L. et al., Book of Abstracts,

Society of Magnetic Resonance in Medicine 1986, Vol. 4, Berkeley, Society of Magnetic Resonance, 1386, 1986).

Além disso, é utilizado o diagnóstico de imagem CT-MRI. Através de CT, pode observar-se atrofia localizada ponderada no lobo temporal e lobo parietal, e atrofia generalizada progressiva, bem como alargamento ventricular e baixa densidade periventricular (PVL) ou alteração de substância branca em volta do ventriculo chamada leucoaraiose em paralelo com atrofia. Todavia, lesões da substância branca tais como atrofia do cérebro, PVL e semelhantes não são caracteristicas especificas da demência de tipo Alzheimer. Para além disso, é referida a progressão de atrofia do cérebro com o envelhecimento (Barron, S. A. et al., Neurology, 26, 1011, 1976; Zatz, L. M. et al., AJNR, 3, 1, 1982). Por conseguinte, estas observações não são verificadas necessariamente na demência de tipo Alzheimer. O MRI é muito útil porque, em especial, pode ser observado cada local do cérebro em qualquer plano de imagiologia e pode confirmar a presença de microangiopatia e semelhantes as quais não podem ser verificadas por CT de raios X Quanto à doença de Alzheimer, quando se procede à imagiologia de uma secção axial e uma secção sagitada bem como de uma secção coronal, podem ser obtidas observações que não são vistas por CT. Em primeiro lugar, verificou-se que a atrofia do corpo caloso pode ser observada por imagiologia numa secção sagitada a partir de uma fase precoce da doença e foi possível conduzir observação detalhada do lobo temporal incluindo hipocampo por imagiologia de secção coronal. Para além disso, na observação do parênquima cerebral, o cinéreo pode ser prontamente diferenciado da substância branca através de uma imagem ponderada em densidade de protões. Todavia, visto que uma imagem obtida por MRI varia de acordo com a 11 intensidade de um campo magnético, desempenho de um equipamento e condições de imagiologia, dados numéricos obtidos em diferentes instalações não podem ser comparados uns com os outros excepto a alteração atrófica. Adicionalmente, existe um limite à medição da imagem. Embora a medição de área seja considerada mais sensivel que a linear e a medição de volume é considerada mais sensivel que medição de área, é difícil conduzir tais medições rotineiramente. Para além disso, o alargamento do ventrículo pode ser reconhecido em casos de demência vascular e existem casos em que a atrofia do hipocampo é observada após isquemia da artéria basilar.

Nestas circunstâncias, muitos investigadores procuraram desenvolver marcadores de diagnóstico biológicos como um meio para proporcionar maior rigor e objectividade no diagnóstico clínico da doença de Alzheimer. Ao mesmo tempo, serão esperadas no futuro as seguintes funções importantes: 1) Sistema de avaliação objectivo do efeito de medicamentos para o tratamento da doença de Alzheimer. 2) Detecção da doença de Alzheimer antes de um padrão de diagnóstico ser detectado ou se manifestem estados de doença.

Para além disso, os dados obtidos em diferentes instalações podem ser comparados uns com os outros pela utilização do mesmo marcador de diagnóstico. Por conseguinte, o desenvolvimento de marcadores de diagnóstico biológicos é reconhecido como um campo muito importante de entre os campos de estudo da doença de Alzheimer e serão esperadas as suas perspectivas futuras.

Em geral, até agora as abordagens para o desenvolvimento de marcadores de diagnóstico biológicos estão divididas naquelas baseadas em componentes constituintes de alterações patológicas características da doença de Alzheimer tais como 12 placa senil e alteração neurofibrilar, e numa abordagem baseada em outras medidas. Exemplos da primeira incluem proteína tau do líquido cefalorraquidiano, Αβ e seu precursor, βΑΡΡ. Exemplos da segunda incluem o teste midríase com fármaco colilítico, Apo E e outros genes relativos à doença de Alzheimer. Todavia, não se obtiveram bons resultados.

Os presentes requerentes esperaram que, a partir de agora, várias doenças cerebrais (e. g., doença de Alzheimer, síndromas de Down, etc) podem ser identificadas pela utilização de secreção de neurosina, cuja expressão é reconhecida no cérebro, no líquido cefalorraquidiano que é uma amostra útil em estudos fisiológicos do cérebro, e que secreção de neurosina pode ser utilizada como um marcador de diagnóstico biológico eficaz mesmo numa fase precoce de doenças cerebrais. Para isso, um sistema de medição de neurosina é igualmente essencial.

Como descrito no documento W098/11238, a Protease M (i. e., neurosina) desempenha igualmente um papel importante em células cancerosas. A razão pela qual a exterminação do cancro por tratamento cirúrgico ou irradiação tópica de raio radioactivo é difícil é a capacidade metastática do cancro. Para propagação de células tumorais sólidas num corpo, elas devem perder a sua adesão a células adjacentes originais, seguido por separação de um tecido original, passar através de outros tecidos para alcançar o vaso sanguíneo ou nodo linfático, entrar no sistema circulatório através do estrato basal e camada endotelial do vaso, sair do sistema circulatório em qualquer parte no corpo, e sobreviver e proliferar num novo ambiente. Embora a adesão a células epidérmicas adjacentes seja perdida quando a expressão de caderina que é uma molécula de adesão intracelular do epitélio é parada, considera-se que irromper através de tecidos depende de enzimas proteolíticas que decompõem uma matriz extracelular. Como enzimas que decompõem a matriz conhecem-se, 13 sobretudo, proteases metálicas (Rha, S. Y. et al., Breast Câncer Research Treatment, 43, 175, 1997) e proteases de serina. Cooperam para decompor proteínas de matriz tais como colagénio, laminina e fibronectina. De entre as proteases de serina conhecidas por estarem envolvidas na decomposição da matriz existe, em particular, o activador do plasminogénio de tipo urocinase (U-PA) (Kinojo, M. et al. , Br. J. Câncer, 39, 15, 1979; Danl, K. et al., Adv. Câncer Res., 44, 146, 1985; Nakanishi, K. et al. ,, Câncer, 82, 724, 1998; Shiba, E . et al., J. Câncer Res. Clin. Oncology, 123, 555, 1997) . 0 U-PA possui um papel de activador específico de uma reacção em cadeia de decomposição de proteínas. 0 seu alvo directo é o plasminogénio. Encontra-se presente em abundância no sangue e é um precursor de uma protease de serina inactiva que se acumula em locais reconstruídos de tecidos tais como locais feridos e tumores bem como locais inflamatórios. Adicionalmente, foram conhecidos como proteases que estão envolvidas em metástase e infiltração de cancros, por exemplo, um factor tecidular (Kinjo, M. et al., Br. J. Câncer, 39, 15, 1979), hidrolase de tipo lisossomal (Sloane, b. f. et al., Câncer Res., 42, 980, 1982) e colagenase (Mignatti, P. et al., Cell, 47, 487, 1986).

Presentemente, o cancro é a causa mais importante de morte no Japão e mais de 200000 pessoas morrem por ano. Por conseguinte, substâncias específicas que podem ser utilizadas como marcadores para diagnóstico e terapia ou profilaxia do cancro são estudadas intensivamente. Tais substâncias específicas são referidas como marcadores tumorais ou biomarcadores relativos a marcadores tumorais. São utilizadas no auxílio de diagnóstico antes do tratamento do cancro, para presunção de órgão carcinogéneo e tipo de tecido patológico, para monitorização do efeito do tratamento, para descobrir a recorrência precocemente, para presunção de prognóstico, e semelhantes. Presentemente, os marcadores tumorais são essen- 14 ciais em análises clinicas. Entre eles, são mundialmente utilizados a alfa-fetoproteina (AFP) que possui elevada especificidade para o carcinoma hepatocelular e tumor do saco vitelino (Taketa K. et al., Tumour Biol., 9, 110, 1988), e o antigénio carcinoembriónico (CEA). No futuro, serão requeridos cada vez mais marcadores tumorais, e é desejável desenvolver, por exemplo, marcadores específicos de órgãos e marcadores específicos de células tumorais os quais constituem um diagnóstico serológico altamente seguro de cancro.

Até agora, a calicreina glandular humana (hK2) que é uma protease de serina expressa nas células epiteliais prostáticas humanas foi referida como um marcador para cancro prostático. E, a hK2 possui 78% de homologia com a sequência do antigénio prostático especifico (PSA) e o PSA é igualmente utilizado mundialmente como um marcador bioquímico de cancro prostático (Mikolaj czyk, S. d. et al., Prostate, 34, 44, 1998; Pannek, J. et al., Oncology , 11, 1273, 1997; Chu, T. M. et al., Tumour Biology, 18, 123, 1997; Hsieh, M. et al., Câncer Res., 57, 2651, 1997) . Para além disso, refere-se que a hK2 é útil como um marcador não apenas para o cancro prostático mas também para o cancro do estômago (Cho, J. Y. et al. Câncer, 7 9, 878, 1997) .

Além do mais, refere-se que CYFRA (CYFRA 21-1) para medição do fragmento de citoqueratina 19 no soro é útil para o cancro do pulmão (Sugiyama, Y. et al. , Japan J. Câncer Res., 85, 1178, 1994) . Refere-se que o precursor do peptídeo de libertação de gastrina (ProGRP) é útil como um marcador tumoral (Yamaguchi, K. et al., Japan, J. Câncer Res., 86, 698, 1995) . Por conseguinte, é esperado que a combinação de CYFRA e ProGRP possa tornar-se num meio muito útil no auxilio do diagnóstico precoce do cancro do pulmão.

Em particular, os marcadores tumorais são frequentemente utilizados no diagnóstico do cancro ovariano porque, por exemplo, o cancro ovariano é dificil de descobrir numa fase 15 precoce, em muitos casos é descoberto no seu estado progredido, possui muitas variedades de tipos de tecidos, é difícil presumir o tipo de tecido apenas por diagnóstico de imagem, raramente é tumor ovariano benigno, e é requerido diferenciar-se do maligno. Presentemente, por exemplo, o CA125 que é um antigénio relativo à cadeia de açúcar é utilizado clinicamente como um marcador tumoral do cancro ovariano. Todavia, foi revelado que o valor médio de CA125 de uma pessoa saudável diminui com o envelhecimento ou após a menopausa. Por conseguinte, é requerido e desejado desenvolver um marcador que reforce a fraqueza de CA125. Adicionalmente, para o cancro da mama, por exemplo, são utilizados CEA, TPA, e CA15-3. Todavia, estão longe de ser marcadores excelentes em consideração da sensibilidade e especificidade e são insuficientes para o diagnóstico precoce.

Nestas circunstâncias, foi descoberta uma protease de serina, neurosina, que pode ser utilizada como um marcador no inicio do cancro da mama e no inicio do cancro ovariano. Como acima descrito, um sistema de medição da protease de serina, i. e., neurosina é essencial em estudos posteriores detalhados de metástase e mecanismo de infiltração do cancro. Adicionalmente, a partir de agora, é esperado que seja um marcador de diagnóstico biológico que possa identificar precocemente o cancro ovariano e precocemente o cancro da mama, bem como possa diagnosticá-los eficazmente. Para isso, um sistema de medição de neurosina é igualmente desejado.

Além disso, embora os documentos W098/11238 e EP-A10576152 descrevam um anticorpo monoclonal, de facto, na realidade não é produzido nenhum hibridoma e na realidade não é obtido nenhum anticorpo monoclonal possuindo especificidade para uma protease de serina. Ainda que estes documentos divulguem que o anticorpo monoclonal pode ser produzido por técnicas conhecidas, é incerto se um hibridoma produzindo um anticorpo monoclonal ligando-se especificamente a uma protease 16 de serina pode ser obtido numa etapa de rastreio de hibridomas, ou não.

OBJECTIVOS DA INVENÇÃO

Em consideração das circunstâncias acima, os presentes requerentes empreenderam a produção de um anticorpo monoclonal ligando-se especificamente a uma protease de serina.

Deste modo, o principal objectivo da presente invenção é proporcionar um anticorpo monoclonal ligando-se especifi-camente a neurosina o qual pode ser utilizado para medição da protease de serina, neurosina em que o referido anticorpo monoclonal é produzido pelas estirpes de Hibridoma 282-6 (FERM P-16843) ou S2E5 (FERM P-16844) aqui descritas.

Este objectivo bem como outros objectivos e vantagens da presente invenção tornar-se-ão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição seguinte com referência para as figuras acompanhantes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 é um mapa genético do plasmideo de expressão pSecTag/neurosina. A Fig. 2 ilustra a comparação dos resultados da transferência western do anticorpo monoclonal da presente invenção (fotografia electroforética). A Fig. 3 é uma curva de calibração de uma neurosina recombinante. A Fig. 4 é um gráfico ilustrando a correlação entre a concentração de substâncias co-existentes e densidade óptica que mostra que substâncias co-existentes não possuem influência substancial na determinação de neurosina por um sistema ELISA. 17 A Fig. 5 ilustra a comparação da correlação entre transferência western e um sistema ELISA de espécimes de doentes (fotografia electroforética). A Fig. 6 são perfis de electroforese de neurosina derivada de CSF humano e isolada e purificada por uma coluna de permuta catiónica. A Fig. 7 ilustra os resultados de sequenciação de aminoácidos N-terminais de neurosina derivada de CSF humano. A Fig. 8 ilustra os resultados da análise de imuno-transferência utilizando um tecido cerebral obtido de um doente neurologicamente normal. As pistas W, C e M são os resultados obtidos pela utilização de uma fracção de homogenato, fracção de citosol e fracção de membrana, respectivamente. A Fig. 9 ilustra os resultados de imunocoloração de tecidos cerebrais com um anticorpo anti-neurosina. A e B são aqueles obtidos pela utilização de tecidos cerebrais neurologicamente normais. C - F são aqueles obtidos pela utilização de tecidos cerebrais de doentes com a doença de Alzheimer. A: Os núcleos de neurónios presentes no cinéreo do lobo parietal e possuindo axónios foram corados de modo semelhante a outras células. B: Os núcleos de células da glia foram corados na substância branca do lobo parietal. C, D: Apenas alguns neurónios presentes no lobo parietal e possuindo axónios foram corados no caso de cérebro com doença de Alzheimer. Os núcleos e 18 nucléolos dos neurónios eram manchas (indicados pela ponta de seta). A placa senil foi igualmente corada com anticorpo anti-neurosina (indicado pela seta). E: Células cone presentes na região CA4 do hipocampo e possuindo axónios foram células positivas à neurosina. F: Região de alteração neurofibrilar extracelular presente na região CAI do hipocampo foi positiva à neurosina. A Fig. 10 ilustra os resultados de imunocoloração de tecidos cerebrais com anticorpo anti-neurosina. A e B são aqueles obtidos pela utilização de tecidos cerebrais neurologicamente normais. C e D são aqueles obtidos pela utilização de tecidos do mesencéfalo de doentes com a doença de Parkinson. A: Muitos neurónios presentes no nervo oculomotor foram positivos à neurosina de modo semelhante às células da glia. B: Algumas das células contendo melanina foram positivas à neurosina. C: No cérebro com doença de Parkinson, o número de células contendo melanina tornou-se muito escasso e um pequeno número de neurónios restantes foram positivos à neurosina. A Fig. 11 é uma curva-padrão de ELISA melhorado. A Fig. 12 é o nivel de neurosina no soro determinado pelo ELISA melhorado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes requerentes estudaram intensivamente para 19 proporcionar um método para a determinação de neurosina possuindo especificidade excelente e boa sensibilidade. Como resultado, verificou-se que um anticorpo monoclonal como aqui descrito possuindo excelente especificidade pode ser obtido pela utilização de neurosina recombinante como um antigénio. Deste modo, a presente invenção foi completada. A presente invenção proporciona pelo menos um anticorpo monoclonal como aqui descrito o qual pode ser utilizado para a determinação de neurosina num espécime.

Para além disso, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica para diagnosticar a doença de Alzheimer e um método de diagnóstico da mesma utilizando o anticorpo monoclonal da presente invenção. A presente invenção proporciona igualmente uma composição farmacêutica para diagnosticar a doença de Parkinson e um método de diagnóstico da mesma.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, foram obtidos anticorpos monoclonais contra a neurosina produzidos por duas variedades de hibridomas, a estirpe celular 2B2-6 e estirpe celular S2E5. Estes hibridomas foram depositados no National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH), Agency of Industrial Science & Technology Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão com os números de acesso de FERM P-1684 e FERM P-16844, respectivamente, desde 17 de Junho de 1998. Ambos os anticorpos monoclonais produzidos por estes hibridomas estirpe celular 2B2-6 e estirpe celular S2E5 possuem o isotipo de IgGl para a cadeia H de IgGl e κ para a cadeia L. A presente invenção inclui mutantes de transição de classe dos anticorpos acima, por exemplo, mutantes pertencendo ao isotipo IgG3, IgGl, IgG2b, IgG2a e outras subclasses de imunoglobulinas, e tais mutantes podem ser produzidos de acordo com o método de Marin et al. (Coco, Martin et al., 20 J. Immunol. Methods, 145, 1118, 1991).

Para produção de um anticorpo contra a neurosina, é requerida neurosina para ser utilizada como um antigénio imunogénico. Neurosina derivada naturalmente como um antigénio pode ser mais altamente purificada pela submissão a, por exemplo, cromatografia de afinidade utilizando um anticorpo policlonal. Para além da derivada naturalmente, de um modo preferido, a neurosina pode ser obtida por células cultivadas, por exemplo, células produtoras de neurosina. Exemplos de células produtoras de neurosina incluem células derivadas de cérebro humano, células derivadas de glândulas salivares humanas, células derivadas de rim humano, células cancerosas e semelhantes. Estas células produtoras de neurosina podem ser cultivadas por um meio de cultura e um método de cultivo conhecido neste campo da técnica ou pelos substancialmente idênticos. A neurosina produzida num sobrenadante de cultura pode ser purificada por, por exemplo, cromatografia de permuta iónica e/ou cromatografia de afinidade utilizando um anticorpo policlonal.

Adicionalmente, pode ser utilizada neurosina recombinante. Especificamente, células hospedeiras são transformadas por um vector recombinante contendo um fragmento genético possuindo uma sequência nucleotidica codificando a sequência de aminoácidos de neurosina, seguido por cultivo do transformante resultante para produzir um polipeptideo contendo a sequência de aminoácidos de neurosina e utilizando--a como um antigénio. Um vector recombinante contendo ADNc de neurosina pode ser construido por técnicas convencionais de recombinação genética, por exemplo, inserção num vector plasmidico. Exemplos do vector a ser utilizado incluem virus tais como vírus vaccinia, baculovírus e semelhantes para além de plasmídeos e fagos.

Exemplos do hospedeiro a ser utilizado incluem proca-riotas tais como E. coli, Bacillus subtilis e actinomicetas, 21 bem como eucariotas tais como diversas células, por exemplo, células animais e estirpes celulares disponíveis comercialmente, e. g., células CHO, e ainda, células de plantas e células de insectos. Exemplos do promotor a ser utilizado para procariotas incluem o operão sintase triptofano, operão lactose e semelhantes. Exemplos do promotor a ser utilizado para eucariotas incluem promotor de virus, promotor da álcool desidrogenase, promotor da enzima da via glicolitica e semelhantes. Adicionalmente, podem também ser utilizados vectores disponíveis comercialmente e plasmídeos possuindo sítio de multiclonagem, promotor, gene de resistência, origem de replicação, terminador, sítio de ligação do ribossoma e semelhantes. 0 gene de resistência inclui aguele contra a tetraciclina, ampicilina, neomicina ou semelhante. A neurosina assim preparada pode ser posteriormente convertida num conjugado antigénico, ou pode ser utilizada como está para imunizar um animal misturando-a com um adjuvante adequado.

Deste modo, o antigénio pode ser obtido a partir de vários materiais de partida, por exemplo, matérias-primas produtoras de antigénios tais como células cultivadas, tecido cultivado e células transformantes purificando de acordo com um método conhecido, por exemplo, salificação tal como precipitação de sulfato de amónio, filtração gel com Sefadex ou semelhante, cromatografia de permuta iónica, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de pigmento gel, electroforese, diálise, ultrafiltração, cromatografia de afinidade, ou cromatografia líquida de alta resolução.

Para além disso, a neurosina pode ser um seu produto fragmentado, ou um fragmento polipeptídico obtido por clonagem e determinação de uma sequência de ADNc de neurosina, dedução da sequência de aminoácidos, selecção de uma região de sequência característica com base na sequência de aminoácidos para conceber um polipeptídeo e depois sintetizar quimicamente o polipeptídeo concebido. 0 fragmento pode ser ligado a várias 22 proteínas transportadoras por meio de um agente de condensação para formar imunoconjugados hapteno-proteína. Este pode ser utilizado para conceber um anticorpo monoclonal o gual pode reconhecer apenas uma sequência específica. Para facilitar a preparação de um conjugado imunogénico, podem ser adicionados resíduos de cisterna ou semelhantes a um polipeptídeo para ser concebido de antemão.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado pelo menos um anticorpo monoclonal como aqui descrito o qual se liga especificamente à neurosina. 0 anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser produzido por etapas tais como imunização de animal com neurosina recombinante como um imunogénio, seguido por fusão celular de células de mieloma e células produtoras de anticorpos, selecção e monoclonagem de um hibridoma, produção do anticorpo monoclonal e, se necessário, recolha de ascite. É necessário preparar células de mieloma antes da fusão celular. Uma estirpe de células tumorais a serem utilizadas antes da fusão celular podem ser seleccionadas a partir daquelas que não produzem imunoglobulina.

Exemplo de um adjuvante a ser utilizado juntamente com o antigénio inclui adjuvante completo de Freund, adjuvante RIBI, adjuvante de tosse convulsa, BCG, lipossoma, hidróxido de alumínio, sílica gel e semelhantes. Para imunização de um animal, por exemplo, podem ser utilizados murganhos tais como murganho Balb/c, murganho F1 e semelhantes.

Por outro lado, de acordo com a presente invenção, é possível produzir um anticorpo policlonal contra a neurosina pela utilização de neurosina recombinante. 0 anticorpo pode ser um anti-soro. Pode ser um anticorpo posteriormente purificado. A fusão celular de células produtoras de anticorpos e células de mieloma pode ser efectuada como se segue. Removem--se células do baço ou células do nodo linfático de um animal 23 imunizado para se obter uma suspensão celular. A suspensão celular e células de mieloma resultante são colocadas em meio de cultura MEM, DMEM ou RPMI-1640 e é adicionado a esta um agente promotor de fusão tal como polietilenoglicol ou semelhante. Se necessário, é adicionada uma pequena quantidade de dimetilsulfóxido para promover adicionalmente a fusão celular.

Os hibridomas assim obtidos podem ser seleccionados pela utilização de um meio de cultura tal como meio de cultura MEM ou meio de cultura RPMI-1640 contendo hipoxantina, aminopterina e timidina e ainda FCS. Sobrenadantes de cultura dos hibridomas são submetidos a rastreio por, por exemplo, radioimunoensaio, ELISA, FIA ou citometria de fluxo utilizando neurosina ou o seu fragmento peptídico como um antigénio, ou anticorpo anti-murganho marcado para separar o hibridoma desej ado. 0 hibridoma assim clonado é cultivado e utilizado para a produção do anticorpo monoclonal. 0 hibridoma pode ser cultivado num meio de cultura adequado tal como meio de cultura MEM ou meio de cultura RPMI-1640 contendo FCS, e o anticorpo monoclonal desejado pode ser obtido a partir do sobrenadante da cultura. Para obter uma grande quantidade do anticorpo monoclonal, o hibridoma pode ser recolhido na ascite. Nesse caso, cada hibridoma pode ser transplantado intraperitonealmente num animal possuindo histocompatibilidade com o animal do qual as células de mieloma são derivadas e proliferadas neste, ou cada hibridoma pode ser implantado num murganho atimico ou semelhante, seguido por recolha do anticorpo monoclonal produzido na ascite. Pristano ou semelhante é administrado ao animal intraperitonealmente antes da transplantação do hibridoma. 0 fluido ascitico pode ser utilizado como está, ou pode ser purificado por um método convencional. Por exemplo, pode ser purificado por salificação tal como precipitação de sulfato de amónio, filtração em gel 24 com Sephadex ou semelhante, cromatografia de permuta iónica, electroforese, diálise, ultrafiltração, cromatografia de afinidade, ou cromatografia liquida de alta resolução.

Exemplos de uma substância a ser utilizada para marcação do anticorpo incluem enzima, substrato de enzima, coenzima, precursor enzimático, apoenzima, substância fluorescente, substância de pigmento, composto quimico luminescente, substância luminosa, substância produtora de cor, substância magnética, partícula metálica, substância radioactiva e semelhantes. Para marcação do anticorpo, por exemplo, pode ser utilizada a reacção de grupo tiol com grupo maleimido, aquela do grupo piridilsulfanetil com grupo tiol, ou aquela de grupo amino com grupo aldeído.

Como formas de realização da presente invenção, o anticorpo da presente invenção pode ser utilizado em imunocoloração, por exemplo, coloração de tecidos ou células imunologicamente, imunoprecipitação, imunotransferência, imunoensaio, por exemplo, imunoensaio competitivo ou não competitivo, radioimunoensaio, ELISA, aglutinação em látex, purificação de proteína, coluna de afinidade e semelhantes. No caso de ELISA, é preferido um ensaio de tipo sanduíche. 0 imunoensaio inclui todos os métodos tais como estudos imunohistológicos, imunotransferência, e métodos que utilizam reacções imunológicas, por exemplo, imunoprecipitação e semelhantes.

Espécimes e amostras às quais o anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser aplicado podem ser em qualquer forma incluindo soluções, fluidos coloidais e amostras não fluidas. De um modo preferido, são amostras derivadas de corpos vivos, tais como sangue, soro, líquido de articulação, líquido cefalorraquidiano, saliva, líquido amniótico, urina, outros líquidos corporais, líquido de cultura de células, líquido de cultura de tecidos, homogenato de tecido, amostra de biopsia, células, tecido, tecido cerebral, linha celular 25 linha celular derivada de cérebro, linha de neurónios, derivada de fibra nervosa, linha celular derivada de dobra mamária, tecido de dobra mamária, linha celular derivada de ovário, tecido ovariano, células cancerosas, tecido de cancro e semelhantes.

Conformemente, a presente invenção proporciona também tal estirpe celular de hibridoma, um imunoensaio e um kit de ensaio. Para além disso, a presente invenção proporciona o anticorpo monoclonal que reconhece especificamente a neurosina, um imunoensaio para detecção e determinação quantitativa de neurosina caracterizado pela utilização deste anticorpo e um kit de ensaio para realizar este imunoensaio.

Adicionalmente, como visto do Exemplo 4 a seguir, o anticorpo monoclonal obtido pela presente invenção não apresenta reactividade cruzada com IgG, albumina e tripsinogénio e possui elevada especificidade para neurosina. Por conseguinte, é muito útil na detecção e determinação quantitativa de neurosina.

Para além disso, como visto do Exemplo 5 a seguir, o anticorpo monoclonal da presente invenção possui imuno-reactividade não apenas com neurosina de tipo maduro mas também a sua forma pro.

Em geral, após tradução, as proteínas passam por vários tipos de processamento para produzir proteínas de tipo activo. Primeiramente, muitas proteínas secretoras são sintetizadas nos ribossomas numa célula na forma de proteínas de tipo precursor inactivo (forma pro). Tal forma pro inactiva possui um peptídeo (sinal de secreção) que está envolvido na secreção e é composto por, normalmente, cerca de 15 a 60 resíduos de aminoácidos na extremidade N-terminal da proteína de tipo activo correspondente. Este grupo peptídico refere-se a um mecanismo para passagem da proteína através da membrana celular e, em quase todos os casos, é clivado e removido por uma enzima específica após passar através da membrana para 26 formar a proteína de tipo maduro correspondente. Um sinal de secreção possui uma ampla região hidrofóbica composta por aminoácidos hidrofóbicos no seu centro e possui igualmente um resíduo de aminoácido básico num sítio próximo da sua extremidade N-terminal. Para além disso, existe uma determinada proteína que possui um sinal de secreção adicional na extremidade N-terminal de uma proteína de tipo precursor inactiva (forma pro) e uma tal proteína é referida como uma proteína prepro (forma prepro).

Por exemplo, a tripsina existe na forma prepro imediatamente após tradução em aminoácidos e, após secreção da célula, existe na forma pro. Em seguida, passa por decomposição limitada com enteropeptidase ou tripsina ela mesma no duodeno para se converter em tripsina de tipo activo. 0 termo "parte pro" aqui utilizado significa a parte de uma forma pro do qual a proteína de tipo activo correspondente é removida. 0 termo "parte pre" aqui utilizado significa a parte de uma forma prepro do qual a forma pro correspondente é removida. 0 termo "parte prepro" aqui utilizado significa a parte de uma forma prepro do qual a proteína de tipo activo correspondente é removida.

Sem excepção, a neurosina é igualmente traduzida na forma prepro. Em seguida, é convertida na sua forma pro e a parte pro é removida para formar neurosina activa.

Como acima descrito, verificou-se que o anticorpo monoclonal da presente invenção possui imunoreactividade não apenas com neurosina de tipo maduro mas também a sua forma pro. Isto é, verificou-se que a neurosina presente no líquido cefalorraquidiano está na forma pro e que o anticorpo monoclonal obtido pela presente invenção possui imunoreactividade não apenas com a neurosina recombinante activa mas também neurosina que ocorre naturalmente. 0 anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser utilizado para o diagnóstico da doença de Alzheimer e da doen- 27 ça de Parkinson.

Existe um relato que proteases de serina no cérebro estão envolvidas numa fase de desenvolvimento, plasticidade sináptica e doenças neurológicas incluindo doença de Alzheimer. Recentemente, Davies et al. relataram que o activador do plasminogénio tecidular (RNK-Met-1) bem como BSP1 e BSP2 que são proteases de serina do cérebro são altamente expressas no hipocampo cerebral do rato (Davis, B. J. et al., J. Biol. Chem., 273, 23004-23011, 1998). BSP1 e BSP2 são novas proteases semelhantes a tripsina e BSP1 foi definida como neuropsina (Chen, Z. -L. et al., J. Neurosci., 15, 5083-5097, 1995) .

Recentemente, foi clonada uma nova protease de serina semelhante a tripsina altamente expressa no cérebro e definida como neurosina (Yamashiro, K. et al., Biochem. Biophys. Acta, 1350, 11-14, 1997). A neurosina é composta por 244 aminoácidos e é semelhante à familia de protease de serina. Para além disso, a neurosina possui 28,4% de homologia com o tripsinogénio 1 humano, 26,3% de homologia com o tripsinogénio 2 humano, 22,9% de homologia com a calicreina humana, 13,8% de homologia com o factor X humano e 12,5% de homologia com o quimotripsinogénio humano. Todavia, não cliva substratos de trombina, quimotripsina e plasmina. Em consideração disto, considera-se que a neurosina desempenha no cérebro um papel semelhante à tripsina.

Para além disso, como mostrado nos Exemplos 6 e 7 a seguir, em consequência de imunocoloração de uma fatia de tecido cerebral com o anticorpo monoclonal da presente invenção, todos os núcleos presentes no cérebro foram corados. Adicionalmente, quanto a neurónios, foram corados o seu citoplasma nervoso, núcleos do neurónio e axónios. Ao contrário, axónios presentes num local de distúrbio do cérebro de um doente com doença de Alzheimer mal foram corados. A presença de neurosina foi confirmada na placa senil, região de 28 alteração neurofibrilar extracelular e corpos de Lewy. Em consideração disto, considerou-se a neurosina envolvida na decomposição de proteina tal como β-amilóide.

Além disso, de acordo com a presente invenção, demonstrou-se que a neurosina está presente em vários tipos de células no cérebro.

Em contraste com as células da glia em que a neurosina está presente especificamente nos seus núcleos, quanto aos neurónios, são positivos à neurosina o citoplasma, núcleos, nucléolos e seus axónios. A neurosina mal está contida nos neurónios de um local de distúrbio de um doente com doença de Parkinson ou doença de Alzheimer. No cérebro com doença de Alzheimer, a neurosina está presente em diversas placas senis e região de alteração neurofibrilar. A proteina precursora amilóide (APP) é dividida em três tipos (APP695, APP751 e APP770) de acordo com o número de aminoácidos. APP751 e APP770 contêm 56 aminoácidos possuindo funções de inibidor de protease de serina do tipo Kunitz (KPI). Recentemente, Moir et al. relataram que o cérebro de um doente com doença de Alzheimer possui uma proporção significativamente mais elevada de espécies de APP incluindo KPI em comparação com cérebro normal (Moir, R. d. et al., J. Boiol. Chem., 273, 5013-5019, 1988). Sugeriram que, na fase tardia da doença de Alzheimer, um aumento destes produtos produtores de amilóide está envolvido na precipitação amilóide. A isoforma segregada contendo o domínio KPI é a mesma que a protease nexina 2 (PN-2) . A PN-2 é conhecida por ser um inibidor de proteases de serina tal como tripsina (Kitaguchi, N. et al., Nature, 331, 530-532, 1988/ Sinha, S. et al., J. Biol. Chem., 265, 8983-8985, 1990), quimotripsina (Kitaguchi, N. et al., Nature, 331, 530-532, 1988, Sinha, S. et al., J. Biol. Chem., 265, 8983-8985, 1990), Factor IXa (Schmaier, A. H. et al., J. Clin. Invest., 92, 2540-2543, 29 1993), Xa (Mahdi, F. et al., J. Biol. Chem., 270, 23468-23474, 1995) e Xla (Van Nostrand, W. E. et al., J. Biol. Chem., 265, 9591-9594, 1990) . Existem relatórios mostrando que a tripsina (Smith, M. a. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 27, 145-154, 1996/ Wiegan, U. et al., Gene, 136, 167-175, 1993), Factor Xa (Hass, C. et al., Bioch. Biophys. Acta, 1343, 85-94, 1997), Xla (Saportito-Irwin, S. M. et al., <J. Biol. Chem., 270, 26265-26269, 1995), outras proteases de serina e trombina (Igarashi, K. et al., Biochem. Biophysic. Res. Com., 185, 1000-1004, 1992), e nova enzima semelhante a quimotripsina (Little, S. P. et al., J. Biol., Chem., 272, 25135-25142, 1998) são enzimas envolvidas no processamento de APP. Para além disso, demonstrou-se que a trombina (Akiyama, H. et al., Neurosci. Lett., 146, 142-154, 1992) e tripsina (Smith, Μ. A. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 27, 145-154, 1996) estão localizadas no local de precipitação β-amilóide do cérebro com doença de Alzheimer.

Os presentes requerentes demonstraram que a neurosina é uma enzima envolvida na precipitação amilóide porque está localizada na placa senil. Para além disso, existe um relato que APP se liga a uma membrana e é clivada com uma secretase (Roberts, S. B. et al., J. Biol. Chem., 269, 3111-3116, 1994;

Vassilacopoulou, D. et al., J. Neurochem., 64, 2140-2146, 1995). Considera-se que a neurosina está envolvida no processamento de APP porque está presente igualmente numa fracção de membrana. Considera-se que a neurosina é segregada dos nervos e desempenha um determinado papel na proteólise de estrutura tecidular patogénica porque a alteração neurofibrilar extracelular é corada pelo anticorpo anti--neurosina. Foi já referido que a tripsina está presente numa região de alteração neurof ibrilar (Smith, Μ. A. et al., Mol. Chem. Neuropathol., 27, 145-154, 1996). Existe uma possibilidade que a neurosina possua função proteolitica de estrutura agregada porque está presente nos corpos de Lewy. 30

Isto é, considera-se que a neurosina está envolvida na doença de Alzheimer e doença de Parkinson e, por conseguinte, é possivel diagnosticar uma doença em que a neurosina está envolvida pela detecção e determinação da quantidade expressa de neurosina.

Adicionalmente, embora os Exemplos 6 e 7 a seguir sejam sistemas experimentais utilizando o anticorpo monoclonal contra a neurosina, pode esperar-se o mesmo efeito que aquele, destes sistemas experimentais pela utilização de um sistema experimental que tem como alvo o ARNm de neurosina. Por conseguinte, as doenças acima podem também ser diagnosticadas pela utilização de ARNm obtido de uma amostra ou espécime.

Para além disso, visto que dois anticorpos monoclonais obtidos na presente invenção possuem especificidade diferente para neurosina, pode ser obtida especificidade posteriormente melhorada combinando-os, e por conseguinte o diagnóstico das doenças acima pode ser conduzido com elevada sensibilidade.

Além disso, quando o anticorpo monoclonal da presente invenção é administrado a um ser humano para diagnóstico ou tratamento de uma doença relacionada com neurosina, pode empregar-se um método para minimizar a antigenicidade contra o ser humano. Isto é, este pode ser conduzido pela conversão do anticorpo monoclonal da presente invenção num anticorpo quimera ou um anticorpo humanizado de acordo com um método conhecido. 0 anticorpo monoclonal da presente invenção inclui estes anticorpos que diminuem a sua antigenicidade contra um ser humano. A seguir, será ilustrado um método para a produção do anticorpo. 0 termo "anticorpo quimera" significa uma molécula quimera de um anticorpo de murganho e um anticorpo humano. Do ponto de vista ético, é impossivel produzir um anticorpo pela imunização de um ser humano com qualquer antigénio. Por conseguinte, um murganho é imunizado e uma região variável do anticorpo (região V) que se liga a um antigénio é cortada de 31 um gene de um anticorpo monoclonal de murganho, unindo-o de seguida a um gene da região constante de um anticorpo (região C) derivado de um tumor ósseo humano para produzir um gene quimera. Um anticorpo monoclonal murganho-humano pode ser produzido pela expressão do gene quimera numa célula hospedeira. Visto que o anticorpo quimera possui menos antigenicidade contra um ser humano, pode ser utilizado como o anticorpo monoclonal para administração a um ser humano para tratar um doença ou para conduzir diagnóstico de imagem. Como técnicas relativas a anticorpos quimera conhecidos, existem aquelas descritas nos documentos JP 5-304989 A, JP 4-33-295, WO91/06649, JP 63-036786 A, JP 6-98021 e semelhantes.

Todavia, recentemente, desenvolveu-se um anticorpo humanizado que é mais útil que um anticorpo quimera. Um anticorpo humanizado é obtido pelo transplante de apenas uma sequência genética de um sitio de ligação de antigénio (CDR: região determinante complementar) numa molécula de anticorpo num gene de anticorpo humano (enxerto CDR) para humanizar toda a molécula excepto a CDR da molécula de anticorpo. Visto que uma parte de anticorpo de murganho neste anticorpo é menor que aquele num anticorpo quimera murganho--humano, diz-se que este anticorpo possui menos antigenicidade e maior segurança que o anticorpo quimera murganho-humano. No Japão, presentemente, está a conduzir-se um teste clinico de um anticorpo humanizado contra leucemia de células T de adulto. Pedidos de patente direccionados aos processos de produção de anticorpos humanizados e técnicas relacionadas foram requeridos por uma companhia dos E. U., Genentech documentos (W092/22653, W098/45332, WO94/04679, W098/37200, WO94/04679), uma companhia do R. U., Celltech documentos (W094/29451, W094/29351, WO94/13805, WO93/06231, W092/01059, W091/16927, W091/16928, WO91/09967, WO89/01974, WO89/01783), e semelhantes. 32

Existe perigo na administração de um anticorpo monoclonal de murganho porque o anticorpo é uma proteína estranha para um ser humano e é susceptível de causar efeitos secundários. Por conseguinte, é desejável um anticorpo monoclonal humano. Todavia, até agora, a eficiência de fusão era insuficiente e era difícil obter um hibridoma que produzisse um anticorpo de maneira estável. Não obstante, presentemente, um avanço na tecnologia torna possível produzir um anticorpo monoclonal humano.

Como um processo de produção de um anticorpo monoclonal humano, para além de uma técnica de fusão celular, existem, por exemplo, transformação com vírus Epstein-Barr (EBV), fusão de células obtidas transformadas com o referido vírus com células-mãe, e um método para a produção de um anticorpo quimera e um anticorpo humanizado pela utilização de engenharia genética. Um anticorpo quimera é um anticorpo obtido pela ligação de fragmentos genéticos de imunoglobulina de animais de espécies diferentes entre si. Um anticorpo humanizado é um anticorpo obtido pela modificação de um anticorpo heterogéneo para um ser humano tal como um anticorpo de murganho para substituir a sua estrutura primária à excepção de CDR da cadeia H e cadeia L com a correspondente estrutura primária de um anticorpo humano. Quando a estirpe SHM-D 33 (ATCC CRL 1668) ou a estirpe RF-S1 que é um heteromieloma de ser humano/murganho é utilizada como células--mãe para produzir um anticorpo monoclonal humano, pode obter--se a mesma elevada eficiência de fusão que aquela utilizando células-mãe de murganho. Um hibridoma obtido pela utilização destas células-mãe pode ser clonado sem células alimentadoras. Por conseguinte, um anticorpo de tipo IgG pode ser produzido em grande quantidade de maneira relativamente estável. Para cultivar as células-mãe, é utilizado meio de cultura ERDF suplementado com 15% de FCE e o outro procedisso é idêntico àquele do murganho. Adicionalmente, para produzir um anticorpo 33 monoclonal humano de tipo IgG, é preferido utilizar linfócitos humanos recolhidos de sangue periférico os guais são suficientemente sensibilizados com um antigénio. Quando linfócitos suficientemente sensibilizados com um antigénio quase não estejam disponíveis, a sensibilização com um antigénio pode ser conduzida in vitro.

Pela utilização do método acima, o anticorpo da presente invenção pode ser humanizado e é muito útil para administração a um ser humano.

Os Exemplos seguintes ilustram adicionalmente a presente invenção em detalhe mas não são construídos para limitar o seu âmbito.

Exemplo 1

Produção de anticorpo monoclonal anti-neurosina.

Um anticorpo monoclonal anti-neurosina foi produzido de acordo com o processo seguinte. (a) Preparação de antigénio (produção de células que expressam a proteina recombinante neurosina)

De acordo com maneira idêntica àquela descrita no documento JP 9-14790 A ou Biochim. Biophys. Acta, 1350, 11, 1997, foi preparado ARNm a partir de células COL0201, seguido pela síntese de ADNc e clonagem pSPORT/neurosina.

Uma região de tradução da proteína madura foi obtida a partir de pSPORT/neurosina por PCR e esta foi introduzida no pSecTagB (fabricado por Invitrogen) para construir um plasmídeo de expressão. Primeiramente, foram adicionadas sequências reconhecidas pela enzima de restrição BamHI às extremidades 5' e 3' da região de tradução de neurosina para preparar iniciadores. São indicados pelas SEQ ID NOS: 1 e 2. 34

SEQ ΙΌ N°.: 1: CGCGGATCCTTGGTGCATGGCGGACCC

SEQ IN N°.: 2: CGCGGATCCTCACTTGGCCTGAATGGT

Amplificação por PCR foi efectuada pela utilização destes iniciadores e pSPORT/neurosina como um molde para obter uma sequência reconhecida por BamHI adicionada à região traduzida de neurosina. Este produto de PCR e pSecTagB foram digeridos com a enzima de restrição BamHI e ligados pela utilização de um kit de ligação Ver. 1 (fabricado por Takara) para transformar em E. coli JM109 (fabricado por Takara) . De entre as colónias transformadas, uma colónia contendo o gene neurosina foi confirmada por PCR para obter um plasmideo de expressão pSecTag/neurosina. 0 seu mapa genético é apresentado na Fig. 1.

Uma proteína recombinante neurosina foi produzida pela utilização do plasmideo expresso pSecTag/neurosina e células CHO. Células CHO (1 x 106 células) foram semeadas numa placa de cultura de 10 cm de diâmetro (fabricada por Corning) . No dia seguinte, as células foram enxaguadas com Opti-MEM™ (Meio Mínimo Essencial, 5 mL) (fabricado por GIBCO), seguido por adição de Opti-MEM™ fresco (5 mL) e cultivado a 37 °C durante 2 horas. Em seguida, pSecTag/neurosina (1 yg) e Lipofectamine™ (fabricado por GIBCO BRL) (10 yL) foram adicionados ao sobrenadante da cultura e o sobrenadante foi cultivado a 37 °C durante 6 horas. Após cultura, as células foram lavadas com 10% de soro bovino fetal com α-MEM adicionado e cultivadas num balão de vidro em forma de T de 25 cm2. Após introdução do gene, Zeosin™ (fabricado por Invitrogen) foi adicionado ao meio e apenas células nas quais o plasmideo fora introduzido foram seleccionadas por selecção com fármaco. O meio foi mudado duas vezes numa semana e a cultura foi continuada até as células se tornarem confluentes. Células assim cultivadas até que se tornaram confluentes, foram removidas do balão de vidro e sub- 35 cultivadas .

As células que expressam neurosina assim obtidas foram cultivadas num meio isento de soro e foi obtida a neurosina recombinante a partir do sobrenadante da cultura. Em seguida, o sobrenadante da cultura foi centrifugado a 15000 r.p.m. durante 15 minutos, dialisado pela utilização de um tampão MES (Dozin), e passado através de duas resinas de permuta catiónica (Hitrap-SP™ e Mono-S™ fabricadas por Pharmacia) equilibradas com o mesmo tampão. A seguir, foi purificado pela passagem através de uma coluna de filtração em gel (Sephacril S-200” fabricada por Pharmacia) com PBS (Solução Salina tamponada com Fosfatos) para obter uma solução de antigénio.

Por exemplo, no caso de utilização de outro vector não possuindo sinal de secreção, as células são precipitadas com PBS contendo Triton-X 100™ ou Tween-20™ e as células precipitadas são rebentadas para obter neurosina recombinante. Alternativamente, as células são rebentadas mecanicamente com, por exemplo, um homogenator ou um sonicador para obter neurosina recombinante. Pode também ser utilizado um sobrenadante de uma fracção solúvel que é purificado pelo método acima após centrifugação das células rebentadas.

Adicionalmente, um plasmideo de expressão, pdKCR/Trp59, é construído de acordo com o método descrito no documento JP 9-14790 A ou Biochim. Biophys. Acta, 1350, 11, 1997 e células CHO são transformadas pela introdução do plasmideo nestas. As células CHO transformadas são cultivadas de acordo com o método acima descrito e neurosina recombinante é purificada a partir do sobrenadante da cultura. Este pode também ser utilizado como uma solução de antigénio.

Para além disso, neurosina humana que ocorre naturalmente pode ser purificada a partir de um sobrenadante de cultura (10 L) de uma estirpe celular cultivada isenta de proteína de elevada produção de neurosina natural, HPC-Y3, por filtração em gel, coluna de permuta iónica, cromatografia hidrofóbica, 36 electroforese preparativa de acrilamida e semelhantes. Esta pode também ser utilizada como um imunogénio. (b) Imunização A solução de antigénio para imunização preparada em (a) acima, foi misturada com adjuvante completo de Freund (fabricado por DIFCO) na razão de 1:1 e a mistura foi emulsionada. A emulsão foi injectada em cinco murganhos Balb/c fêmea (8 semanas de idade, cerca de 100 yg/murganho de proteina neurosina) subcutaneamente. Em seguida, conduziu-se a imunização de reforço (cerca de 100 yg/murganho de proteina neurosina) três vezes com intervalos de cerca de 2 semanas por injecção subcutânea de uma mistura emulsionada da solução de antigénio para imunização e adjuvante incompleto de Freund (fabricado por DIFCO) na razão de 1:1. Três dias depois do terceiro reforço, foi recolhida uma amostra de sangue da veia da cauda e o titulo de anticorpo no soro foi medido de seguida por ELISA. Duas semanas depois do terceiro reforço, foi administrada aos murganhos uma solução da solução de antigénio para imunização em solução salina fisiológica (cerca de 100 yg/murganho de proteina neurosina) intraperitonealmente. Três dias depois da administração, foram preparadas células do baço a partir dos murganhos imunizados para utilizá-las na fusão celular a seguir. (c) ELISA (método de fase sólida directo)

Uma solução de proteina neurosina preparada de maneira idêntica àquela da preparação do antigénio de imunização foi ajustada para 5 yg/mL com PBS e a solução (50 yL/poço) foi adsorvida por uma placa de ELISA durante 2 horas. A placa foi bloqueada por uma diluição quádrupla de Blockace” (fabricada por Snow Brand Milk Products) em PBS. Após lavagem da placa, uma diluição de 5000 vezes (50 yL/poço) do soro obtido em (b) 37 acima, num tampão de diluição de soro (PBS contendo 5% de FBS) foi adicionado a cada poço da placa e reagiu à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem da placa, uma diluição de 2000 vezes (50 pL/poço) de anticorpo IgG de murganho marcado com fosfatase alcalina (fabricado por ICN/Cappel) foi adicionado a cada poço da placa e reagiu a temperatura ambiente durante 1 hora. Fosfato de p-nitrofenilo dissódico (tabelas de substrato de fosfatase SIGMA 104) foi dissolvido numa mistura de reacção de substrato (9,6% de tampão de dietanolamina contendo cloreto de magnésio a 0,5 mM, pH 9,7) à concentração de 2 mg/mL para preparar uma solução de substrato. A placa foi lavada 7 vezes com água purificada e a solução de substrato (50 pL/poço) foi adicionada a esta. Após reacção com a solução de substrato, NaOH a 3 N (50 pL) foi adicionado para parar a reacção e foi medida a absorvência a 405 nm. (d) Fusão celular e produção de hibridoma

Três dias depois da última imunização, os baços foram excisados dos três murganhos que mostraram um aumento no titulo de anticorpo contra a proteina neurosina como os resultados do ELISA acima e foram preparadas células do baço, de acordo com um método convencional. As células-mãe a serem fundidas eram da estirpe celular SP de mieloma derivada de murganho Balb/c que confirmou ser de antemão uma estirpe deficiente em hipoxantina guanina-fosforibosil transferase (HGPRT) por selecção com um meio de cultura contendo 8-azaguanina (20 pg/mL). Células SP2 (2 x 107 células) e células do baço (1 x 103 células) foram combinadas e a fusão celular foi conduzida de acordo com um modo convencional pela utilização de polietilenoglicol 4000 (PEG4000™, fabricado por

Merck) como um promotor de fusão celular. Após conclusão da fusão celular, as células foram suspendidas num meio de 38 cultura (meio HAT) preparado pela adição de hipoxantina, aminopterina e timidina a meio Esclone™ (fabricado por Sanko Pure Chemicals) na concentração de 3,0 x 108 células/mL em termos de células do baço, e distribuídas numa microplaca de 96 poços (fabricada por Corning) (100 yL/poço). As células fundidas foram cultivadas num incubador de C02 (37 °C, 5% de C02) com mudança de metade do meio a cada 3 a 5 dias. Apenas os hibridomas que sobreviveram no meio foram seleccionados e cultivados. (e) Rastreio de hibridoma

Relativamente aos poços cuja formação de colónias foi confirmada, efectuou-se o rastreio pelo mesmo ELISA como aquele de (c) acima, para confirmar a presença de um anticorpo contra a proteína neurosina no sobrenadante da cultura. Foram utilizadas duas variedades de placas às quais a neurosina e tripsinogénio foram adsorvidos, respectivamente, e colónias que reagiram fortemente com a proteína neurosina foram seleccionadas e clonadas. (f) Rastreio de hibridoma A clonagem de hibridomas que produziram anticorpos que se ligam à proteína neurosina foi repetida três vezes por diluição limitada para obter duas variedades de hibridomas, estirpe celular 2B2-6 e estirpe celular S2E5 que produziram anticorpos que se ligam especificamente à proteína neurosina e possuíam capacidade de proliferação estável. Estes hibridomas foram depositados no National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH), Agency of Industrial Science & Technology of Higashi 1-1-3, 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,

Japão a 17 de Junho de 1998 com os números de acesso de FERM P-16843 e FERM P-16844, respectivamente. 39 (g) Tipagem de anticorpo monoclonal 0 isotipo foi examinado pela utilização de sobrenadantes de cultura (0,5 mL cada) dos dois hibridomas acima obtidos, estirpe celular 2B2-6 e estirpe celular S2E5 com o Kit” de

Isotipagem de Anticorpo de Murganho (fabricado por Gibco BRL). Ambos os isotipos de anticorpos monoclonais produzidos pelos hibridomas da estirpe celular 2B2-6 e estirpe S2E5 eram idênticos. Nomeadamente, a cadeia H era IgGl e cadeia L era k. (h) Preparação e purificação de anticorpo monoclonal

Foi administrado Pristano (0,5 mL/murganho) a murganhos Balb/c fêmea (8 semanas de idade) intraperitonealmente e, dez dias depois da administração, dois hibridomas da estirpe celular 2B2-6 e estirpe celular S2E5 obtidos na clonagem de (d) acima, (cerca de 107 células/0,5 mL/murganho, respectivamente) foram injectados intraperitonealmente. Desde cerca dos 10 dias, foi observada hipertrofia abdominal dos murganhos. Em seguida, foi recolhida ascite com uma agulha de injecção 18G. A ascite recolhida foi centrifugada a 1000 r.p.m. a 4 °C durante 10 minutos e o sobrenadante foi deixado em repouso a 37 °C durante 30 minutos. Para além disso, foi deixado em repouso a 4 °C de um dia para o outro. Após centrifugação a 12000 r.p.m. a 4 °C durante 10 minutos, o sobrenadante resultante foi submetido a uma coluna de afinidade com Proteína A™ Sepharose (fabricada por Pharmacia

Bioteck) para purificar o respectivo anticorpo monoclonal. A absorvência de uma solução de anticorpo foi medida a 260, 280 e 320 nm e a concentração de anticorpo foi determinada pelo método de Werbulg-Christian. (i) Transferência de western A expressão da proteína recombinante neurosina foi con- 40 firmada como se segue. cultura das

Após recuperação do sobrenadante da respectivas células clonadas, foi misturado com uma quantidade igual de tampão de carregamento 2 x SDS (fabricado por Daiichi Kagaku) e a mistura foi aquecida num banho em ebulição durante 5 minutos. Esta foi utilizada como uma solução de amostra. A solução de amostra foi submetida a uma electroforese num gel de poliacrilamida a 10 a 20% (fabricado por Daiichi Kagaku) pela utilização de um aparelho de electroforese de SDS (fabricado por Daiichi Kagaku) e tampão Tris-glicina (fabricado por Daiichi Kagaku). Por outro lado, para transferência, durante a electroforese duas folhas de papel de filtro 3MM (fabricado por Whattman) foram mergulhadas em tampão A (fabricado por Daiichi Kagaku), uma folha do papel de filtro foi mergulhada em tampão B (fabricado por Daiichi Kagaku) e três folhas do papel de filtro foram mergulhadas em tampão C (fabricado por Daiichi Kagaku). Para além disso, uma membrana de polifluoreto de vinilideno (membrana PVDF, fabricada por Milipore) foi mergulhada em metanol e depois em água para adaptá-la à água. A transcrição da proteina para a membrana de PVDF foi efectuada pela retirada do gel do aparelho depois da electroforese, e colocando 2 folhas do papel de filtro mergulhadas em tampão A, uma folha do papel de filtro mergulhada em tampão B, membrana PVDF, o gel e 3 folhas do papel de filtro mergulhados em tampão C num aparelho de transferência (fabricado por Pharmacia) a partir do lado do seu cátodo por esta ordem e aplicando uma voltagem de 8 mV durante 1,5 horas. Após transcrição, a membrana PVDF foi bloqueada agitando-a juntamente com Blockace” (fabricado por Snow Brand Milk Products) à temperatura ambiente durante 1 hora. A membrana foi reagida com uma diluição de anticorpo policlonal anti-neurosina de coelho preparado no Exemplo 2 a seguir com 5% de soro bovino fetal adicionado PBS a 4°C de 41 um dia para o outro. Em seguida, foi adicionado anticorpo IgG de murganho marcado com fosfatase alcalina a esta e, a pós reacção à temperatura ambiente durante 1 hora, foi desenvolvida cor por solução NBT-BCIP para confirmar a expressão de proteina recombinante neurosina no sobrenadante da cultura.

Exemplo 2

Produção de anticorpo policlonal anti-neurosina (a) Imunização

Proteina neurosina purificada produzida por técnicas de recombinação genética (104 yg) foi misturada com adjuvante completo de Freund, e foi efectuada a imunização inicial de coelhos com a mistura. Em seguida, foi efectuada a imunização de reforço em intervalos de 2 semanas de acordo com o mesmo modo de imunização. Ao todo, foram efectuadas guatro imunizações de reforço. (b) Purificação de antisoro

Anti-soros de coelho obtidos a partir dos coelhos imunizados acima foram purificados por uma coluna de afinidade com Proteina A™ Sepharose (fabricada por Pharmacia Biotech) para obter uma fracção IgG. (c) Preparação de coluna de antigénio de neurosina e purificação de anticorpo

Uma resina transportadora de afinidade activada gue tinha sido dilatada com água (0,3 g, FMP: 2-fluoro-l-metilpiridinio tolueno-4-sulfonato, fabricada por Seikagaku Kogyo) foi preenchida numa coluna e lavada com água purificada (10 mL) . Proteina neurosina purificada obtida por técnicas de recombinação genética (10 yg) foi dissolvida num tampão de ligação (tampão de carbonato de sódio-bicarbonato de sódio a 50 mM, pH 8,5). O antigénio dissolvido no tampão de ligação 42 foi preenchido na coluna e ambas as extremidades da coluna foram seladas com películas de parafina. A coluna foi invertida e misturada a 4 °C de um dia para o outro. Em seguida, a coluna foi lavada com o tampão de ligação (5 mL) . Para além disso, a coluna foi lavada com um tampão de bloqueamento (20 mL) e o tampão de bloqueamento (10 mL) foi adicionado à coluna. Ambas as extremidades da coluna foram seladas com películas de parafina e a coluna foi invertida e misturada à temperatura ambiente durante 3 horas. Em seguida, a coluna foi lavada com água purificada (20 mL), Gly-HCl a 1 M (pH 2,5, 20 mL) e em seguida água purificada (20 mL). A fracção de IgG purificada em (b) acima, foi purificada por esta coluna de antigénio neurosina de acordo com um processo convencional.

Exemplo 3

Desenvolvimento de um sistema ELISA utilizando anticorpo anti-neurosina O anticorpo monoclonal obtido no Exemplo 1 foi diluído com PBS para a concentração de 5 pg/mL. Cada porção de 100 pL deste foi adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços (fabricada por Corning) e reagiu à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem 5 vezes com água purificada, a placa foi bloqueada com uma diluição quádrupla de Blockace™ (fabricado por Snow Brand Milk Products) em PBS (300 pL) . A solução de bloqueamento foi descartada, cada porção de 100 pL de proteína neurosina purificada produzida por técnicas de recombinação genética e diluída com PBS à concentração adequada (0 a 1000 ng/mL) foi adicionada a esta, seguido por reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem 5 vezes com água purificada, o antisoro de coelho obtido no Exemplo 2 foi diluído com um tampão de diluição de soro (PBS contendo 5% de FBS) à concentração de 5 pg/mL e cada 43 porção de 100 pL da diluição foi adicionada a cada poço e a reacção foi efectuada à temperatura ambiente durante 2 horas. A placa foi lavada e depois cada porção de 100 pL de uma diluição de 2000 vezes de um anticorpo IgG de coelho marcado com fosfatase alcalina (fabricado por ICN/Cappel) foi adicionada a esta, seguido por reacção à temperatura ambiente durante 1 hora. Uma solução de substrato foi preparada pela dissolução de fosfato de p-nitrofenilo dissódico (tabelas de substrato de fosfatase SIGMA 104) numa solução de reacção de substrato (9,6% de tampão de dietanolamina contendo cloreto de magnésio a 0,5 mM, pH 9,7) à concentração de 2 mg/mL. A placa foi lavada 7 vezes com água purificada e a solução de substrato (100 pL/poço) foi adicionada a esta. Após reacção com a solução de substrato durante 30 minutos, NaOH a 3 N (100 pL) foi adicionado a esta para parar a reacção e foi medida a absorvência a 405 nm. (b) Influência de materiais co-existentes no imunoensaio enzimático em sanduíche

Foram examinadas a influência por albumina humana, imunoglobulina humana (IgG) e tripsinogénio

De acordo com o mesmo modo que aquele descrito em relação ao ELISA acima, foi efectuado o mesmo ensaio excepto que, quando foi efectuada a reacção com o antigénio, à proteína neurosina (200 ng/mL, 50pL) foram adicionadas albumina humana à concentração adequada (0 a 2000 pg/mL), imunoglobulina humana (IgG) à concentração adequada (0 a 20000 pg/mL) e tripsinogénio à concentração adequada (0 a 40 pg/mL), respectivamente.

Exemplo 4

Medição de espécime do doente (a) Especificidade de anticorpo monoclonal

Para estudar a reactividade específica dos anticorpos 44 monoclonais estabelecidos pela presente invenção, 2B2-6 e S2E5 para neurosina, foi efectuada transferência de western. Os resultados são apresentados na Fig. 2 (perfil de electroforese). Estes resultados mostram que 2B2-6 e S2E5 reconhecem a neurosina recombinante. Para além disso, verificou-se que 2B2-6 e S2E5 são específicos para a neurosina porque não se ligam ao tripsinogénio o qual possui homologia elevada para neurosina. Adicionalmente, ao mesmo tempo, um sobrenadante de cultura de uma estirpe celular natural HPC-Y3 de cancro do pâncreas e ainda liquido cefalorraquidiano (CSF) foram reagidos do ponto de vista de uma possível diferença entre neurosina recombinante e a que ocorre naturalmente. Como resultado, foram confirmadas bandas possuindo o mesmo tamanho. (b) Preparação de curva de calibração

Embora uma curva de calibração de ELISA possa ser preparada pelo anticorpo monoclonal estabelecido, primeiro, foi preparada uma curva de calibração de neurosina recombinante para controlo positivo. Quando uma curva de calibração é boa, pode ser obtida uma curva sigmóide. Os resultados são apresentados na Fig. 3. Na Fig. 3, a abcissa representa concentração de neurosina, (ng/mL) e a ordenada representa densidade óptica (a 405 nm) . Como visto pelos resultados, foi obtida uma curva sigmóide dentro da amplitude de concentração de neurosina de 5 a 1000 ng/mL e foi obtida linearidade dentro da amplitude de 10 a 500 ng/mL.

Nomeadamente, um espécime pode ser determinado quantitativamente dentro desta amplitude. Para além disso, a sensibilidade pode ser melhorada por adição de uma quantidade adequada de BSA e. g., 5 pg/mL). (c) Estudo de influência de materiais co-existentes

No ELISA para determinação de amostras humanas, existem demasiados materiais co-existentes que influenciam numa 45 reacção antigénio-anticorpo. Por conseguinte, foi estudada a influência de materiais co-existentes no ensaio da presente invenção utilizando um sistema ELISA pela utilização do método descrito no Exemplo 3 acima. De entre as proteínas, considera--se gue albumina e anticorpos causam problemas. Por conseguinte, a determinação quantitativa foi efectuada misturando-os com uma determinada quantidade de neurosina. Para além disso, embora tripsinogénio possuindo elevada homologia também fosse misturado, não foi reconhecida nenhuma influência. Os resultados são apresentados nas Figs. 4A a 4C. Nestas figuras, as abcissas representam concentração (yg/mL) dos materiais co-existentes, IgG, albumina e tripsinogénio, respectivamente. As ordenadas representam densidade óptica (a 405 nm). Como visto destes resultados, pode concluir-se que uma quantidade exacta de neurosina pode ser determinada sem influência substancial de materiais co-existentes pelo método de ensaio da presente invenção utilizando um sistema ELISA.

(d) Determinação de neurosina em CSF

Espécimes de liquido cefalorraquidiano (CFS) obtidas de doentes com várias doenças incluindo doença de Alzheimer foram efectivamente comparados uns com os outros por transferência western e ELISA. No ELISA, espécimes de CFS foram diluidos 1/10.

Os resultados são apresentados na Fig. 5 (perfil de electroforese). Como visto nos resultados, os mesmos resultados são obtidos por transferência de western e ELISA. Para além disso, encontra-se variação nas quantidades de neurosina nos espécimes dos doentes. Por conseguinte, é possível provar a relação com cada doença pela determinação da quantidade de neurosina. 46

Exemplo 5

Purificação de neurosina em CSF (a) Preparação de coluna de anticorpo 0 anticorpo (S2E5, 10 mg) purificado por uma coluna de

Proteina A foi dialisado com hidrogenocarbonato de sódio a 0,2 M contendo cloreto de sódio a 0,5 M (pH 8,3). O anticorpo dialisado foi adicionado a uma Sepharose High Performer* (Pharmacia) activada com NHS activada de antemão com ácido clorídrico a 1 mM e a reacção foi efectuada à temperatura ambiente durante 3 horas. A coluna foi lavada com 6 vezes o volume de uma solução de lavagem A (solução de etanolamina a 0,5 M contendo cloreto de sódio a 0,5 M, pH 8,3) e ainda com 6 vezes o volume de uma solução de lavagem B (solução de ácido acético a 0,1 M contendo cloreto de sódio a 0,5 M, pH 4,0). De novo, a coluna foi lavada com 6 vezes o volume da solução de lavagem A e a coluna enchida com a solução de lavagem A deixou-se em repouso à temperatura ambiente durante 1 hora. Em seguida, a coluna foi lavada com 6 vezes o volume da solução de lavagem B. A lavagem com as soluções de lavagem A e B foi repetida uma vez e, finalmente, a coluna foi equilibrada com PBS.

(b) Purificação de neurosina em CSF

Após centrifugação de CSF (10 mL) a 15000 r.p.m. durante 20 minutos, o sobrenadante foi dialisado com PBS. O CSF dialisado foi aplicado numa coluna de anticorpo S2E5 que foi equilibrada de antemão com PBS. A coluna foi eluída com tiocianato de sódio a 5 M e PBS. Em seguida, a fracção eluída foi dialisada com tampão MES a 20 mM (pH 6,0) . A fracção dialisada foi adicionada a uma coluna de permuta catiónica (High Trap SP™, Pharmacia) que tinha sido equilibrada de antemão com tampão MES a 20 mM (pH 6,0). A coluna foi submetida a um gradiente de eluição om cloreto de sódio 47 (0 a 0,2 Μ) . A totalidade das etapas de purificação foram efectuadas a 4 °C. (c) Electroforese e transferência de western de fracção eluída A fracção eluída com cloreto de sódio foi submetida a SDS-PAGE como apresentado no Exemplo 1 e o gel foi corado por coloração de prata. Para além disso, foi efectuada electroforese e depois, de acordo com o mesmo modo como acima descrito, foi efectuada transferência western, seguida por imunocoloração com anticorpo monoclonal S2E5 utilizado na coluna de anticorpo. Os resultados são apresentados na Fig. 6. Como visto da Fig. 6, foi detectada uma única banda (A) em torno de um marcador de peso molecular de cerca de 30000 por coloração de prata. Esta banda foi encontrada na fracção eluída em torno de 0,15 M de cloreto de sódio. Para além disso, quando esta fracção foi submetida a imunocoloração com anticorpo monoclonal S2E5, a mesma banda (B) foi detectada. (d) Análise de estrutura primária de neurosina derivada de CNF purificada A sequência de aminoácidos N-terminal de neurosina derivada de CSF purificada foi analisada pela utilização de um sequenciador de aminoácidos (Applied Biosystems, Modelo 473A). A fracção eluída com cloreto de sódio a 0,15 M foi purificada651 pela coluna de permuta catiónica, concentrada e adsorvida sobre membrana PVDF com ProSorb™ (Pharmacia) e aplicada no sequenciador de aminoácidos. Como resultado, uma sequência de aminoácidos de sítio N-terminal foi confirmada. A sequência de aminoácidos corresponde à sequência de aminoácidos da forma pro deduzida a partir de uma sequência nucleotídica de neurosina. Por conseguinte, verificou-se que o anticorpo monoclonal da presente invenção possui imunoreactividade com a forma pro de neurosina (Fig. 7). 48

Exemplo 6

Transferência de western de tecido cerebral

Em relação a especificidade imunológica de anticorpo anti-neurosina, foi efectuada análise de imunotransferência pela utilização de tecidos de cérebro obtidos de dois cérebros normais e dois cérebros com doença de Alzheimer. Cada espécime do lobo parietal foi homogenato com 5 vezes o volume de um tampão (Tris-HCl a 20 mM (pH = 7,4), EGTA a 1 mM, EDTA a 1 mM, leupeptina a 10 μΜ, pepstatina a 1 μΜ e aprotinina a 0,3 μΜ) e o homogenato foi centrifugado a 15000 r.p.m. a 4 °C durante 30 minutos. O sobrenadante foi recolhido como uma fracção coloidal celular bruta. O precipitado foi dissolvido de novo no tampão de homogeneização para utilizar como uma fracção de membrana. Um espécime parcial contendo proteínas (50 pg) de cada fracção foi submetido a electrof orese em gel de poliacrilamida-SDS (gel de 15% de poliacrilamida) sob condições reduzidas, seguido por transcrição sobre uma membrana de nitrocelulose pela utilização de tampão Tris-glicina a 25 mM contendo 20% de etanol (pH = 8,3) . A membrana de nitrocelulose utilizada foi pré-tratada com Tris a 25 mM contendo NaCl a 150 mM (TBS) (pH = 7,4) e 5% de leite em pó desnatado e reagiu com o anticorpo anti-neurosina (2B2-6) diluido para 1/1000 com TBS contendo 2% de leite em pó desnatado a 4 °C durante 18 horas. A membrana inteira foi lavada com TBS contendo 0,1% de Tween 20 e reagiu com anticorpo anti-murganho ligando fosfatase alcalina em TBST contendo 1% de leite em pó desnatado à temperatura ambiente durante 2 horas. Em seguida, a membrana foi lavada com um tampão de substrato de fosfatase alcalina (Tris-HCl a 0,1 M contendo tetrazólio nitroazul a 0,33 mg/mL (BRL), ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfórico a 0,44 mg/mL (BRL), NaCl a 0,1 M e MgCl2 a 50 mM). 49

Os resultados são apresentados na Fig. 8. Como visto da Fig. 8, em relação à fracção de homogenato (W) e da fracção de membrana (M) , foi confirmada uma única banda com o anticorpo anti-neurosina, ao passo que não foi observada na fracção solúvel celular (C). Por conseguinte, foi provado que a neurosina está presente numa fracção de membrana em tecido cerebral.

Exemplo 7

Imunocoloração de tecido cerebral (a) Preparação de tecido cerebral

Tecidos cerebrais foram obtidos de 7 doentes neurologicamente normais sem a doença de Alzheimer, 6 doentes com doença de Alzheimer e 5 doentes com doença de Parkinson e foram utilizados nesta experiência. A doença de Alzheimer foi diagnosticada de acordo com o padrão do National Institute of Aging (Khachaturian, Z. S. et al., Arch. Neurol., 42, 1097-1105, 1985). A doença de Parkinson foi diagnosticada de acordo com o padrão de Calne et al. (Calne, D. B. et al., Ann.

Neurol., 32, S125-127, 1992) . Os 3 homens e 4 mulheres doentes neurologicamente normais tinham 60 a 82 anos de idade. Dois homens e 4 mulheres doentes com doença de Alzheimer tinham 67 a 82 anos de idade. Dois homens e 3 mulheres doentes com doença de Parkinson tinham 70 a 75 anos de idade. Cada tecido cerebral foi obtido em 2 a 12 horas após a morte do doente. (b) Imunocoloração

Amostras de tecido foram excisadas do respectivo lobo parietal, hipocampo e tecidos de mesencéfalo e fixados num tampão de fosfato contendo 4% de paraformaldeido durante 2 dias. Em seguida, foram armazenados em tampão de fosfato a 0,1 M contendo 15% de sacarose (pH = 7,4) sob condições de temperatura baixa a 4 °C até serem utilizados na experiência. Quando utilizada na experiência, cada amostra de tecido era 50 congelada e cortada em fatias de 20 pm de espessura com um micrótomo e era corada por técnicas imuno-histológicas (McGeer, P. L. et al. , , Can. J. Neurol. Sei. , 16, 516-526, 1989). 0 anticorpo anti-neurosina (S2E5) foi diluido 1/1000 vezes e o anticorpo primário e a fatia de tecido foram reagidas a temperatura baixa durante 48 horas, seguido por lavagem com PBS contendo 0,3% de Triton X-100 (PBST) . Em seguida, foi adicionalmente reagido com complexo HRP avidina--biotina (Vector), seguido por reacção adicional com anticorpo IgG anti-murganho ligando biotina (Vector) à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem com PBST, o marcador peroxidase foi visualizado com uma solução contendo 0,001% de 3,3'-diaminobenzidina, 0,6% de niquelosulfato de amónio, 0,05% de imidazole e 0,0003% de H202. Quando foi observado o desenvolvimento da cor púrpura escura, a reacção foi parada. A fatia foi lavada, montada numa lamela de vidro, desidratada com álcool e depois protegida com enteran. (c) Resultados

Os resultados obtidos pela utilização dos tecidos cerebrais dos doentes com doença de Alzheimer são apresentados na Fig. 9. e aqueles obtidos pelos tecidos cerebrais dos doentes com doença de Parkinson são apresentados na Fig. 10.

Na coloração imuno-histoquímica com o anticorpo anti-neurosina, todos os núcleos de neurónios no cérebro utilizaram um controlo ficaram corados (Fig. 9) . E, os outros componentes dos neurónios tais como nucléolos, axónios e citoplasma também ficaram corados (Figs. 9A e 9B) . Os resultados idênticos foram obtidos em relação à coloração de núcleos em todos os cérebros utilizados na experiência.

Nos cérebros dos doentes com doença de Alzheimer, os neurónios possuindo axónios ficaram escassamente corados na região danificada tal como lobo parietal (Fig. 9C) e região CAI do hipocampo (Fig. 9F). Nesta região apenas os núcleos de 51 neurónios ficaram corados. Todavia, todos os componentes do neurónio ficaram distintamente corados na região CA4 do hipocampo (Fig. 9E). Várias placas senis ficaram coradas (Figs. 9C and 9D) e a região de alteração fibrilar nervosa extracelular foi igualmente positiva à neurosina (Fig. 9F) . A região de alteração fibrilar nervosa intracelular foi negativa à neurosina.

No tecido de mesencéfalo dos doentes com doença de Parkinson, todos os neurónios nos núcleos do oculomotor foram positivos à neurosina (Fig. 10A) . No cérebro controlo, vários neurónios contendo melanina na substância negra foram positivos à neurosina (Fig. 10B) . No cérebro com doença de Parkinson, mal se observaram neurónios positivos à neurosina e contendo melanina (Fig. 10C) . Corpos de Lewy foram positivos à neurosina (Fig. 10D).

Como visto das Figs. 9 e 10, entre os tecidos cerebrais dos doentes com doença de Alzheimer, doença de Parkinson e os doentes normais, os resultados da imunocoloração, com o anticorpo anti-neurosina são diferentes uns dos outros. Por conseguinte, estas doenças podem ser diagnosticadas por um teste imuno-histológico.

Exemplo 8

Melhoramento de ELISA (a) ELISA melhorado (método sanduíche) O anticorpo monoclonal (S2E5) obtido no Exemplo 1 foi diluido com PBS para 5 yg/mL. Cada porção de 100 yL deste foi adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços (fabricada por Corning), seguida por reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem com PBS 5 vezes, a placa foi bloqueada com uma diluição quádrupla de Blockace™ (fabricado por Snow Brand Milk Products) em PBS (300 yL). A solução bloqueante foi descartada e, de novo, lavada com PBS contendo 0,05% de Tween 52 20™ (PBS-T). Em seguida, a proteína recombinante neurosina produzida e purificada no Exemplo 1, foi diluída com PBS contendo 0,5% de BSA (PBS-B) para concentração adequada (0 a 1000 ng/mL). Cada porção de 100 pL desta foi adicionada a cada poço, seguida por reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem 5 vezes com PBS-T, cada porção de 100 μΐ do antisoro obtido no Exemplo 2 e diluído para 5 pg/mL com PBS-B foi adicionada a cada poço, seguida por reacção à temperatura ambiente durante 2 horas. Após lavagem da placa com PBS-T, cada porção de 100 pL de uma diluição de 5000 vezes de anticorpo IgG de coelho marcado com fosfatase alcalina (fabricado por Biochem) em PBS-B foi adicionada a cada poço, seguida por reacção à temperatura ambiente durante 1 hora. Fosfato de p-nitrofenilo dissódico (tabelas de substrato de fosfatase SIGMA 104) foi dissolvido numa mistura de reacção de substrato (9,6% de tampão de dietanolamina contendo cloreto de magnésio a 0,5 mM, pH 9,7) à concentração de 2 mg/mL para preparar uma solução de substrato. A placa foi lavada 7 vezes com PBS-T e a solução de substrato (100 pL/poço) foi adicionada à placa. Após reacção com a solução de substrato durante 20 minutos, NaOH a 3N (100 pL) foi adicionada para parar a reacção e foi medida a absorvência a 405 nm. A curva-padrão do ELISA após melhoramento é apresentada na Fig. 11. Na Fig. 11, a abcissa representa a concentração de neurosina, (ng/mL) e a ordenada representa a densidade óptica (a 405 nm) . Como visto a partir destes resultados, a linearidade foi obtida no intervalo de concentração de neurosina de 1 a 30 ng/mL e a sensibilidade foi aumentada significativamente pela utilização do ELISA melhorado acima. (b) Medição de neurosina no soro Níveis de neurosina no soro de pessoas normais e doentes (com doença de Alzheimer, doença de Parkinson e várias outras 53 doenças) foram medidos pelo ELISA melhorado acima. No ELISA, o soro foi diluido para 1/200 e submetido à medição. Como resultado, verificou-se que o nivel de neurosina no soro poderia ser medido com elevada sensibilidade mesmo à concentração de 80 ng/mL pela utilização do sistema de ELISA experimental. Como visto da Fig. 12, de entre 50 espécimes medidos, 48 espécimes mal continham neurosina nos soros, ao passo que 2 espécimes possuíam elevados níveis de neurosina no soro. (c) Correlação entre várias doenças e nivel de neurosina

no CSF O nível de neurosina no CSF de um doente foi medido pelo ELISA acima. Como resultado, o nível de neurosina no CSF de um doente com uma doença nervosa periférica diferente de uma doença nervosa central (um grupo controlo para doenças nervosas centrais) foi aumentado à medida que o doente envelheceu. E, demência de doenças nervosas centrais foi dividida em três grupos, i. e., demência degenerativa, demência vascular e demência de tipo Alzheimer e foram medidos os seus níveis de neurosina no CSF. Como resultado, no grupo de demência degenerativa, analogamente ao grupo de controlo, como o nível de neurosina no CSF aumentou a medida que o doente envelheceu e estava distribuída na zona de maior concentração. Por outro lado, no grupo de demência vascular, não foi observada correlação entre idade e nível de neurosina no CSF. Em particular, o nível de neurosina no CSF de um doente com doença de Alzheimer estava distribuído na zona de menor concentração. Este resultado suporta os resultados de imunocoloração tecidular.

Como acima descrito, de acordo com a presente invenção, é proporcionado o anticorpo monoclonal possuindo especificidade para neurosina. O anticorpo anti-neurosina da presente inven- 54 ção torna possível detectar neurosina numa amostra (e. g., CSF).

Adicionalmente, o anticorpo monoclonal da presente invenção não apresenta qualquer reactividade cruzada com IgG, albumina e tripsinogénio que são considerados contaminantes num espécime ou amostra. Por conseguinte, pode ser estabelecido um sistema ELISA possuindo boa sensibilidade.

Pode dizer-se que um novo diagnóstico foi estabelecido pela presente invenção porque um nível de neurosina relaciona--se com várias doenças.

Além disso, por exemplo, fatias de cérebro podem ser coradas por imunocoloração utilizando o anticorpo anti-neurosina da presente invenção. Por conseguinte, possibilita a análise de várias doenças imunohistologicamente.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM TEXTO LIVRE SEQ ID N°.: 1

Iniciador oligonucleotídico concebido para amplificar o gene neurosina SEQ ID N°.: 2

Iniciador oligonucleotídico concebido para amplificar o gene neurosina

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Katsuya, Kominami et al.; Fuso Yakuhin Kogyo

Kabushikigaisya <120> Anticorpos monoclonais específicos de protease de serina e sua utilização <130> 661405 <150> JP 10/187506 55 <151> 1998-07-02 < 16 0 > 2

<210> 1 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> para <223> Iniciador oligonucleotidico concebido amplificar o gene neurosina <4 0 0> 1 27

CGCGGATCCT TGGTGCATGG CGGACCC

<210> 2 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <22 0> para <223> Iniciador oligonucleotidico concebido amplificar o gene neurosina <400> 2 27

CGCGGATCCT CACTTGGCCT GAATGGT

Lisboa, 24 de Novembro de 2006 56

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal ligando-se selectivamente à neuro-sina e/ou seu precursor, em que o referido anticorpo monoclonal é produzido pela estirpe 2B2-6 de Hibridoma (FERM P-16843) ou estirpe S2E5 de Hibridoma (FERM P-16844) .
2. 2. Hibridoma que é a estirpe 2B2-6 de Hibridoma (FERM P-16843), ou a estirpe S2E5 de Hibridoma (FERM P-16844).
3. 3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 que não apresenta reactividade cruzada com IgG, albumina e tripsinogénio.
4. 4. Anticorpo contra a neurosina obtenível pelo aperfei çoamento do anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 3 de forma a diminuir a sua antigenicidade contra um ser humano.
5. 5. Método para determinação quantitativa de neurosina e/ou seu precursor contido numa amostra a ser testada que compreende a utilização do anticorpo de acordo com as reivindicações 1, 3 e/ou 4.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que o método é utilizado num sistema de ELISA.
7. 7. Método de teste imuno-histológico para confirmação da presença de neurosina e/ou seu precursor num tecido que compreende a utilização do anticorpo de acordo com as reivindicações 1, 3 e/ou 4.
8. 8. Método in vitro para o diagnóstico da doença de Alzheimer ou de Parkinson que compreende a utilização do anticorpo de acordo com as reivindicações 1, 3 e/ou 4. 1
9. 9. Medicamento para o diagnóstico da doença de Alzheimer ou de Parkinson que compreende o anticorpo de acordo com as reivindicações 1, 3 e/ou 4.
10. 10. Utilização do anticorpo de acordo com as reivindicações 1, 3 e/ou 4 na preparação de um medicamento para o diagnóstico da doença de Alzheimer ou de Parkinson.
11. 11. Medicamento compreendendo o anticorpo de acordo com as reivindicações 1, 3 e/ou 4. Lisboa, 24 de Novembro de 2006 2