CN103827311B - 用于神经退行性病症的生物化学标志物 - Google Patents

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Abstract

用于对与神经退行性病症相关的肽片段进行定量的生物测定方法，所述肽片段包含由分泌酶(例如ADAM10)切割Tau蛋白所形成的新表位，所述方法包括将来源于血液的样品与对所述新表位有特异性的抗体相接触，以及测定所述免疫结合伴侣与所述样品中的肽片段的结合水平。发现含新表位的肽的水平与认知功能负相关。

Description

用于神经退行性病症的生物化学标志物
本发明涉及神经退行性病症或神经退行的生物标志物的开发，更具体地涉及用于检测生物化学标志物的测定，所述生物化学标志物在阿尔茨海默氏病的诊断应用中和疾病发展的预后中有价值，其包括指示对治疗方案的应答的生物化学标志物。
阿尔茨海默氏病(AD，通常被称为阿尔茨海默(Alzheimer’s))是进行性且最终致命的神经性病症，其主要影响65岁以上的人群。据估算在世界范围内AD已影响3.56亿的人口(2009)，且预测这个数字会每20年翻倍。仅在美国，每年AD的花费就合计超过1480亿美元，且在世界范围内这个数字超过3200亿美元[3]，经比较，与痴呆症(其中AD占病例的50-75％)看护相关的花费显然超出了与癌症和心脏病看护相关的花费，这突显出对于个人以及卫生保健二者AD都是严峻的社会负担。虽然阿尔茨海默氏病的病程存在个体差异，但有一些共同症状，这些症状中最早的通常是认知性的，其往往被错误地认为是由年龄增长或压力造成的[37]。早期症状包括短期记忆衰退，如果怀疑患病，进行行为评估和认知测试以及如果可行的话进行脑部MR扫描以进一步确认诊断[37]。随着疾病进展，包括一系列神经性问题的症状(例如思维混乱、易怒和有攻击性、语言障碍、长期记忆缺失)导致个体变得性格内向[2]。最终，身体功能开始衰退，最终导致死亡，并且确诊后的平均预期寿命约为七年[2；28]。
与更好地治疗和了解AD相关的主要问题是，该疾病的早期发生隐蔽，因此AD通常经过若干年发展后才充分表现出来并导致确诊[13]。此外，在大多数病例中，通常只有在其它造成AD症状的可能原因都被排除的情况下具有AD症状的个体才被诊断为该疾病的“可能”患者。虽然诊断标准已通过使用智力功能测试而标准化，但普遍接受的仍然是AD仅可通过尸检来最终确诊[27]。
近期的研究表明使用生物化学标志物以及成像技术取得了一些进展，但这些方法仍需进一步鉴定和确认，且通常因在发病早期阶段缺乏敏感度而受局限[24；33；34；38；39]。
目前使用的治疗提供了小的姑息性作用；并且能够减缓或抑制进展的治疗是被热切追寻的目标，这通过以下事实说明：已进行超过500个临床试验来鉴定AD的可行疗法，但目前仍没有能明确鉴定到可行疗法[1]。这些数据以及已建立的AD生物标志物的缺乏性都清楚地说明投入开发这样的生物标志物的必要性，即可以更准确地反映AD的重要方面(例如疾病的发作、进展及对治疗的应答)的生物标志物。
除涉及APOEε4变体的病例外，评估阿尔茨海默氏病的风险几乎是不可能的[8]。此外，虽然可以监测试验药物的疗效，但这种监测通常直接与药物的作用方式而非AD的整体病理学相关[8]。
来自AD个体的脑组织的分析突出了细胞外基质重塑的紊乱[12]，主要显示了两个重要的现象，即含有β淀粉样蛋白(Aβ)的斑块的形成，和含有Tau蛋白的经修饰形式的神经元纤维缠结的形成[10]。这两种过程都与疾病的进展高度相关，并且有趣的是，Aβ在斑块的沉积要先于实际的神经元损伤[30]，但参与触发神经元纤维缠结的形成[32]，后者似乎是神经元细胞死亡的主要原因[5；18]。APP是在许多组织中表达并且集中在神经元突触的整合膜蛋白。APP的主要功能未知，最经常将其作为β淀粉样蛋白(Aβ，39至42个氨基酸的肽)的前体分子来研究，当以淀粉样蛋白纤维形式存在时，其是淀粉样蛋白斑块的主要组分[10]。Aβ由两种蛋白水解切割产生，第一种切割通过β-分泌酶(BACE-1)进行并且第二种切割通过γ-分泌酶进行。这些连续的生物化学事件对Aβ的形成至关重要[10]。此外，APP的其它酶促切割(例如通过ADAM10(解整合素和金属蛋白酶10，A Disintegrin AndMetalloproteinase10)和早老素-1的酶促切割)以及其它类型的翻译后修饰产生了临床意义仍未完全阐明(尽管预计他们与疾病进展相关)的经修饰肽片段[10；11；19；25；40]。
Tau蛋白是微管稳定蛋白，其在中枢神经系统的神经元内高度富集，而在CNS之外是罕见的，在AD中Tau是神经元纤维缠结形成的重要组分[10]。此外，Tau突变与一系列神经退行性疾病(被称为Tau病变(Tauopathies))相关；而迄今AD是与Tau蛋白改变相关的最常见疾病[10；17]。已证实翻译后修饰(例如磷酸化以及酶促切割)调节Tau稳定微管的能力从而使得形成神经元纤维缠结以及潜在地形成毒性小蛋白积累，这可以造成神经元死亡以及由此引起的疾病进展[10；19]。编码tau蛋白的MAPT(微管相关蛋白Tau)基因位于染色体17q21处，其包含16个外显子。人脑中的主要tau蛋白由11个外显子编码。第2、3和10个外显子通过选择性剪接产生六种组合(2-3-10-；2+3-10-；2+3+10-；2-3-10+；2+3-10+；2+3+10+)。因此，在人脑中，tau蛋白形成具有352到441个氨基酸的六种同种型的家族。它们的区别为在N端部分有0个、1个或2个29个氨基酸的插入(第2和3个外显子)，以及在C端部分外显子10缺失造成的3个或者4个重复区域。所以，在CNS中最长的同种型具有4个重复(R1、R2、R3和R4)以及两个插入(共441个氨基酸)，而最短的同种型具有3个重复(R1、R3和R4)且没有插入(共352个氨基酸)[20]。MAPT基因具有H1和H2这两种单倍群(haplogroup)，其中基因以反向出现。单倍群H2仅在欧洲或者欧洲人为祖先的人群中常见。单倍群H1似乎与某些痴呆症(例如阿尔茨海默氏病)的可能性提高相关。所有这些同种型都被发现于神经元中；然而不同的同种型在阿尔茨海默氏病病理学中起作用的程度仍不清楚[20]。
与Tau加工相关的酶包括胱天蛋白酶、凝血酶，以及其它与神经元组织转化高度相关的蛋白酶，例如MMP[4；10；10；14；15；19；26；29；31]。而本发明则涉及另一种酶类型，即分泌酶。
分泌酶以α、β和γ分泌酶这三种类型存在[10]。被称作分泌酶的酶在传统上与蛋白质的细胞外切割相关，在阿尔茨海默的情况下分泌酶主要与淀粉样前体蛋白(APP)的切割相关，该切割导致生成淀粉样蛋白β，其是形成淀粉样斑块的主要决定因素[10]。这些分类是依据其切割APP的蛋白质中的位点来定义的，而对于病理学相关性，已知这三类分泌酶中任何一类的功能紊乱均导致阿尔茨海默样的病理[10；11；35；36]。
酶的列表包括：
α-分泌酶包括：ADAM9、10、17(TACE)、19和BACE2，
β-分泌酶包括：BACE1和2
γ-分泌酶复合物：早老素1和/或2、呆蛋白(Nicastrin)、Aph-1a、Aph1b和Pen-2。
由于将他们的功能描述为分泌酶，所以从未评估这些酶降解Tau的能力。而公知Tau在阿尔茨海默氏病的进展中被大程度加工[14；15；17；26；29]。已知切割Tau并由此被认为参与诱导神经元死亡的酶包括胱天蛋白酶家族和钙蛋白酶，用这些酶处理Tau导致产生一系列被良好描述的片段，推测所述片段导致神经元细胞死亡[10；32]。
我们目前探索了由分泌酶介导的Tau切割导致产生可被用作阿尔茨海默氏病之生物化学标志物的片段的可行性。
在第一方面，本发明现在提供了用于对肽片段进行定量的生物测定方法，所述肽片段包含由分泌酶切割蛋白质所形成的新表位，所述方法包括将包含所述肽片段的样品与对所述新表位有特异结合能力的免疫结合伴侣(immunological binding partner)相接触，以及测定所述免疫结合伴侣与所述样品中的肽片段的结合水平，其中所述蛋白质是Tau蛋白。
Tau蛋白可来源于任何哺乳动物，包括啮齿动物，例如小鼠或大鼠，也包括狗或者猴，但优选来源于人。
所述新表位优选不是由胱天蛋白酶家族和/或钙蛋白酶切割Tau所形成的新表位。
任选地，所述免疫结合伴侣对包含Tau蛋白C端新表位的肽片段具有特异结合亲和力。或者，所述免疫结合伴侣对包含Tau蛋白N端新表位的肽片段具有特异结合亲和力。
所述蛋白质可以是Tau-A或Tau家族的任何其它成员。所述新表位可以是两个或更多个或全部Tau蛋白共有的。
新表位可优选地由ADAM10或BASE-1切割Tau蛋白而形成。其可以经多于一种分泌酶形成。
所述免疫结合伴侣优选对包含由蛋白酶切割Tau蛋白所形成之新表位的肽片段具有特异结合亲和力，所述切割产生以下人Tau部分序列中的任意一种(表1)：
Figure BDA0000452547100000051
Figure BDA0000452547100000061
Figure BDA0000452547100000071
Figure BDA0000452547100000081
其中M表示氧化的甲硫氨酸。
所述免疫结合伴侣可以对在肽N端的任意以下序列有特异结合亲和力(表2)：
Figure BDA0000452547100000091
Figure BDA0000452547100000101
Figure BDA0000452547100000111
其中M表示氧化的甲硫氨酸；
或者所述免疫结合伴侣可以与在肽C端的任意以下序列有特异结合亲和力(表3)：
Figure BDA0000452547100000112
Figure BDA0000452547100000121
Figure BDA0000452547100000131
其中M表示氧化的甲硫氨酸。
优选地，所述免疫结合伴侣对肽N端的序列TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO246)有特异结合亲和力。
所述免疫结合伴侣可以是具有特异结合亲和力的单克隆抗体片段或者单克隆抗体。
所述方法可以以竞争性免疫测定的方式进行，其中在所述样品的存在下孵育所述免疫结合伴侣和竞争剂，竞争剂与样品中的肽片段竞争与免疫结合伴侣的结合。所述竞争剂可以是合成肽，或者是通过切割所述表位所来源的蛋白质以显露所述新表位而形成的经纯化天然肽，特别可以是包含N端序列TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO246)的肽。
所述样品可以是哺乳动物的样品，例如小鼠、大鼠、狗或猴的样品，但尤其是人脑脊液、尿液、血清、血液、血浆或唾液。所述样品可以是来源于患者的样品，所述方法还包括将测定的所述肽片段的所述结合的水平与数值相比较，所述数值是(a)可相比较的健康个体和/或(b)病理性神经退行性病症(特别是阿尔茨海默)的特征性数值。可以将测量水平与之前从同一患者获得的测量相比较。
在另一方面，本发明包括针对分泌酶切割Tau蛋白所形成的C端或N端新表位的免疫结合伴侣。所述免疫结合伴侣可以与表2的任意一种氨基酸序列的N端或表3的任意一种氨基酸序列的C端有特异的免疫反应性。
所述免疫结合伴侣可以是单克隆抗体或其结合片段。本发明包括产生这样的单克隆抗体或结合片段的细胞系。
在另一方面，本发明包括肽，所述肽包含C端或N端新表位，所述新表位通过分泌酶在任一种表1示出的所述Tau蛋白部分序列的末端处切割Tau蛋白而形成。所述肽可以作为半抗原与载体缀合以产生对所述肽的免疫应答，或固定至固体表面或与可检测标记缀合以用于免疫测定。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸分子，其编码包含C端或N端新表位的肽，所述新表位通过分泌酶在任一种表1示出的所述Tau蛋白部分序列处切割所述Tau蛋白而形成。
在又一方面，本发明提供了包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含表达信号和编码序列，所述编码序列编码包含C端或N端新表位的肽的表达，所述新表位通过分泌酶在任一种表1示出的所述蛋白部分序列处切割所述Tau蛋白而形成。
在又一方面，本发明提供用上述载体转化并表达所述肽的宿主细胞。
在又一方面，本发明提供了免疫测定试剂盒，其包含所述免疫结合伴侣和结合所述免疫结合伴侣的竞争剂，以及任选的一种或更多种的清洗试剂、缓冲剂、中止试剂、酶标记、酶标记底物、校正标准品、抗小鼠抗体和使用所述试剂盒进行测定的说明。
本发明通过参考附图进一步解释和说明，在附图中：
图1示出使用浓度为0、0.782、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50和100ng/mL的选择肽(selection peptide)或延长肽(elongated peptide)的标准曲线的示例。
图2示出在来自对照或Tg4510小鼠(阿尔茨海默氏病模型)的提取的脑中测量的竞争性ELISA测试结果。
图3示出比较wt和Tg4510小鼠的脑提取物的Western印迹。右：用识别完整Tau的抗体(MAB3420Chemicon)进行的western印迹。右：用自制抗体(NB191)进行的western印迹。
图4示出CSF和血清样品中ADAM10产生的Tau片段的水平的相关性，显示其在两种样品中均可被监测。
图5示出Tau片段与年龄的相关性，但其不与BMI相关。
图6示出Tau片段水平跟随女性中严重阿尔茨海默进展的能力。
图7A-F示出表征和提供Tau-A测定的生物学验证的实施例2结果。
A)浓度为0、0.59、1.17、2.34、4.69、9.38、18.75、37.5、75、150和300ng/ml的选择肽或延长肽的标准曲线。B)测量在Tau体外消化中的Tau-A片段。C)所提取组织的Western印迹，D)在存在或不存在ADAM10的情况下脑提取物的ELISA测量。E)使用ELISA测量从对照或Tg4510小鼠(阿尔茨海默氏病模型)提取的脑中的Tau-A水平。F)比较野生型和Tg4510小鼠的脑提取物的Western印迹。左：使用识别完整Tau的抗体(MAB3420Chemicon)进行的western印迹。右：用自制抗体(NB191)进行的western印迹。
图8示出Tau-A水平的病理学相关改变，证明Tau-A与Mattis痴呆评定等级(MattisDementia Rating Scale，MDRS)的负相关。
以下实施例进一步解释和说明本发明。
实施例1.
体外切割
通过活化的ADAM10或BACE1切割重组的TAU。蛋白酶切割按照下述实施：将100μg和1μg酶(ADAM10或BACE1)混合于分泌酶缓冲液(100mM醋酸钠，pH4.0)中维持3天。最终通过使用
Figure BDA0000452547100000151
银染试剂盒(cat.no.LC6100，Invitrogen，Carlsbad，Ca，USA)按制造商的说明书进行可视化来确认切割。
肽鉴定
经体外切割的样品中的肽片段使用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)和与电喷雾电离(ESI)偶联的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)来鉴定。MALDI-TOF样品按照说明书使用C18zip-tips(cat.no.ZTC18SO24，Millipore，Billerica，MA，USA)纯化，0.1μg物质被洗脱到MTP384抛光钢靶板(Bruker-Daltonics，Bremen，Germany)上。MALDI串联质谱经由Bruker ultraflex MALDI-TOF/TOF质谱仪(Bruker-Daltonics，Bremen，Germany)以阳离子反射器模式记录。质谱使用由胰蛋白酶消化牛β乳球蛋白产生的肽外部校准到m/z范围在800-4000。m/z软件“Flexanalysis”(Bruker-Daltonics，Bremen，Germany)被用来分析光谱。超滤LCMS样品去除大于10kDa的蛋白质，用甲酸调节pH为2.0，通过LC-MS/MS分析4μL的样品。在nanoACQUITY UPLCBEH C18柱(Waters，Milford，MA，USA)上使用甲酸/乙腈梯度进行LC。在SynaptHigh Definition四极杆飞行时间MS(QUAD-TOF；Waters，Milford，MA，USA)进行MS和MS/MS，MS接收范围为350-1600m/z，MS/MS为50-2000m/z。“ProteinLynxGlobal SERVER(PLGS)”软件(Waters，Milford，MA，USA)用以分析光谱和生成峰列表。使用具有MALDI-TOF/TOF或ESI-QUAD-TOF设置的Mascot2.2(Matrix Science，Boston，MA，USA)软件将MS和MS/MS数据针对Tau(FASTA)蛋白质数据库进行检索，以鉴定肽。
鉴定到以下肽片段：
M表示氧化的甲硫氨酸
Tau+BACE1
肽
Figure BDA0000452547100000161
Figure BDA0000452547100000171
Tau+ADAM10
肽
Figure BDA0000452547100000172
Figure BDA0000452547100000181
Figure BDA0000452547100000191
Figure BDA0000452547100000201
用于免疫接种的肽的选择
经MS鉴定之序列的各游离端的前六个氨基酸被认为是由所研究蛋白酶产生的新表位。分析所有获得的由蛋白酶产生的序列的同源性以及与其他切割位点的距离，之后使用NPS@：网络蛋白质序列(network protein sequence)分析进行blast以分析同源性。
试剂和肽
所有试剂均为标准的高品质化学品，来自例如Merck和Sigma Aldrich公司。用于单克隆抗体产生和验证的合成肽为：(a)免疫原性肽TPRGAAPPGQ-GGC-KLH(SEQ ID NO248-KLH)(钥孔血蓝素，Keyhole-Limpet-Hemocyanin)，(b)筛选肽TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO246)，(c)去选择肽ATPRGAAPPGQ(SEQ ID NO247)，其N端延长了一个氨基酸，购买自ChinesePeptide Company，Beijing，China。肽缀合试剂由Pierce(Thermofisher，Denmark)生产。
用于ELISA的缓冲剂
用于溶解包被肽的缓冲剂由以下构成：(150mM Trizma，1％BSA，0.05％Tween-20，0，36％Bronidox L5，pH8.0(Tris-BTB)，反应中止缓冲剂由0.1％H2SO4构成。
用于测定显色的ELISA板是链霉亲和素包被的Roche cat.：11940279。所有ELISA板使用Molecular Devices，SpectraMax M(CA，USA)的ELISA读板器分析。
ELISA的制备
单克隆抗体的制备方法如之前所述([6]。简言之，4-6周龄的Balb/C小鼠经皮下免疫200μl乳化的抗原和50μgTPRGAAPPGQ-GGC-KLH(SEQ ID NO248-KLH)。以两周为间隔在弗氏不完全佐剂中进行连续免疫接种，直到血清效价水平达到稳定，从第二次免疫开始从小鼠采血。每次采血时，检测血清效价，选择具有最高抗血清效价的小鼠用以融合。选定小鼠经过一个月的休息后使用100μl0.9％氯化钠溶液中的50μgTPRGAAPPGQ-GGC-KLH(SEQ IDNO248-KLH)进行静脉内加强(boost)，三天后分离脾进行细胞融合。
融合
如前述[16]采用SP2/0骨髓瘤细胞进行融合操作。将融合细胞以半固体培养基法在35-mm细胞培养皿上克隆，将所述皿在CO2孵育箱中孵育。之后，克隆被铺板到16块96孔微量滴定板上维持三天，然后筛选培养上清液。
抗体筛选
上清液在竞争性ELISA设定中进行筛选。肽TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO246)被用作选择肽，ATPRGAAPPGQ(SEQ ID NO247)被用作延长肽。选择对选择肽有特异性且对延长肽没有交叉反应性的细胞系，之后抗体被纯化。
Tau-A ELISA方法
在预实验中，我们通过进行几次棋盘分析(checkerboard analyses)优化了试剂、其浓度和孵育时间。Tau-A ELISA按以下制备：在20℃通过以300rpm恒定摇动将经链霉亲和素预包被的96孔ELISA板进一步用溶解于Tris-BTB缓冲液中的6ng/ml合成肽TPRGAAPPGQ-生物素(SEQ ID NO246-生物素)包被30分钟。用清洗缓冲液清洗板5次后加入20μl样品，然后加入100μl缀合了过氧化物酶的抗人mAb-Tau-A溶液(50ng/ml)。在20℃下在100mM Tris-BTB缓冲液中孵育板1小时，期间以300rpm摇动板。
再清洗板5次，然后加入100μl四甲基联苯胺(TMB)(Kem-En-Teccat.438OH)。在黑暗条件下孵育板15分钟并以300rpm摇动。加入100μl中止溶液(95-97％H2SO4，MerckCat.No.：1.00731)以中止反应，用ELISA读板器在450nm处分析板，用650nm作为参照。
标准品
通过连续稀释TPRGAAPPGQ-生物素(SEQ ID NO246-生物素)制作标准曲线。标准浓度为0、0.782、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50和100ng/ml。
测试抗体的天然反应性的样品
在测定的开发和验证中使用了来自不同年龄和性别的健康成体的血清。血清样品获得自23-45岁的年轻健康志愿者。我们也测试了来自不同物种(包括小鼠和大鼠)的血清样品以测定种间交叉反应性的水平。最后，我们也测试了脑脊液(CSF)和血浆样品。
动物样品
来自5个野生型和5个Tg4510Tau病变的5月龄小鼠的速冻脑[9]经由下述方法提取：
使用Bessman粉碎机粉碎组织然后称重。使用250mg组织/mL的提取缓冲液(50mMTris-HCl，50mM HEPES，15％甘油，1mM EDTA，0.5％去氧胆酸钠，Roche蛋白酶抑制剂(cat#05056489001)，最终pH8.3)提取组织。裂解物经由超声处理使其澄清，在4℃/5分钟/10000rpm的条件下离心后收集上清液。使用BioRad的DC蛋白质测定测定蛋白质浓度。
Western印迹
将100μg的每种提取物上样到SDS-PAGE胶。如[23]所述跑胶并将样品转移到硝酸纤维素膜上。Tau-A片段和总Tau蛋白的水平通过使用在含脱脂乳粉的TBS-T中稀释至100ng/mL的第一抗体孵育来检测[22]。之后使用了识别小鼠IgG的缀合了辣根过氧化物酶的第二抗体，最后如之前所述[21]使用增强的化学发光对印迹进行可视化。
人样品
使用了两组人样品。一组(51个样品)为来自骨关节炎研究的血清样品集合，这个研究囊括年龄为18-75岁的参与者，而且有身体质量指数数据(Body Mass Index data)[7]。
第二组样品为来自严重阿尔茨海默氏病患者的成对的血清和CSF样品。这些样品包含基线和随访(18个月后)时从相同个体采集的样品的亚组。
统计分析
为了验证测定，将四参数逻辑性回归应用到校准曲线来将光密度对分析物浓度进行拟合。对于所有标准品和样品计算平均值、标准偏差、变异系数的百分比(％CV)和与理论值的差异。使用GraphPad Prism5(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)对定量数据进行分析。均值间的显著差异使用student双尾未配对t检验(没有假定高斯分布)确定。使用线性回归分析血清Tau值和所研究的其他变量的关联。数据表示成平均值±平均值的标准误差，0.05或更小的p水平被认为有显著差异。
结果
ELISA技术说明
从脾细胞和骨髓瘤细胞融合后产生的产生抗体的克隆中选出在测定中具有最佳天然反应性、亲和力和稳定性的抗体。选择用于抗体纯化和随后的ELISA制备的克隆为针对TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO246)产生的NB191-3C4。
标准曲线和回归率(recovery)
图1展示了典型的标准曲线，显示了选定的标准品和用于测定样品浓度的4参数拟合方程(基于以下肽浓度：0、0.782、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50和100ng/mL)。此外，通过与相同浓度的完全不反应的延长肽比较来显示抗体的特异性。
线性或回归率通过稀释不同的样品测定，其结果如下。从1+1，1+2，1+3，1+4，1+5，1+6和1+7稀释的样品反算至未稀释样品确定的平均回归率接近100％，在推荐的±10％内(数据未显示)。
来自阿尔茨海默氏病小鼠及其对照的脑的差异
通过在NB191-3C4ELISA设定中测量从Tg4510小鼠及其相应对照提取的脑来对其进行评估。如图2所示，显示非常清晰的差异，其中Tg4510的Tau-A水平为相应对照的10倍。此外，进行了western印迹，如图3所示，即使蛋白质上样量相同，Tg4510小鼠显示非常高水平的Tau-A，而对照小鼠显示的非常低(数据未显示)。另一方面，使用针对总Tau的抗体再探查印迹显示几乎相同水平的总Tau，尽管Tg4510的高分子量条带强度更强，这与该病理中Tau聚集有关。
CSF和血清的Tau-A水平的关联性
我们在33对CSF和血清样品中研究了在这两种分析物中Tau-A水平是否存在关联性。如图4所示，在两种分析物均检测到了可用水平的Tau-A，发现存在即使不显著也适度的关联性。
Tau-A与年龄相关，但与身体质量指数不相关
在来自OA研究的血清样品中，我们将Tau-A水平作为年龄和身体质量指数的函数对其进行了评估。在此(图5)，我们发现了与年龄正相关的趋势，但未发现与BMI的相关性。这些数据说明Tau-A随着年龄增加而增加，这是作为阿尔茨海默的标记物应有的。
疾病进展的指示
将在基线时和18个月之后采集的样品作为来自阿尔茨海默组的血清样品的亚组。虽然这些数据只来自女性，但是图6显示出在这7名女性中，有强烈迹象表明Tau-A的水平从基线到随访有增加，因此表明Tau-A随着疾病进展而增加，如众所周知的，阿尔茨海默的进展是连续的过程。
实施例2
测试抗体的天然反应性的样品
为了测定开发和验证，使用了来自15位健康成年志愿者(年龄在23-45岁，两种性别都有)的血清和血浆。我们也测试了来自小鼠和大鼠的血清样品以测定种间交叉反应性的水平。
动物样品
从5只6月龄的Sprague Dawley大鼠分离包括脑、肝脏、肌肉、结肠、肾脏、肺、皮肤和胰腺的组织，各5个野生型或Tg4510小鼠的脑被在液氮中速冻并用Bessman粉碎机粉碎。“粉末”被转移到小瓶并称重。以1mL缓冲液/250mg组织添加提取缓冲液(50mM Tris-HCl，50mMHEPES，1mM EDTA，0.5％脱氧胆酸钠，15％甘油，蛋白酶抑制剂混合物(Roche cat#05056489001)，pH8.3)。裂解物经由超声处理澄清。超声处理后，剩余物在4℃/5分钟/10000rpm条件下离心，收集上清液并储存在-80℃直到下次使用。通过DC蛋白质分析(Biorad)测定蛋白质浓度。
组织的体外切割
蛋白酶切割如下进行：将100μg组织提取物和1μg MMP缓冲液(100mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM CaCl2，2mM醋酸锌，pH8，0)中的ADAM10混合并孵育7天。最后，通过western印迹和ELISA分析验证切割。
Western印迹
将20μg各大鼠组织提取物和100μg各小鼠组织提取物上样到SDS-PAGE凝胶。如之前所述跑胶后将样品转移到硝酸纤维素膜15。然后使用丽春红染色确认等量的蛋白质被上样到膜上。Tau-A片段和总Tau蛋白的水平通过使用在含脱脂乳粉的TBS-T中稀释至100ng/mL的第一抗体孵育来检测15。之后加入识别小鼠IgG的缀合了辣根过氧化物酶的第二抗体，最终如之前所述使用增强的化学发光使印迹可视化15。
人样品
获取来自阿尔茨海默患者(n＝21)的血清样品。表征参数：发病年龄70(+/-7)，女性/男性(16/6)，基线MDRS评分112(+/-12)，完整tau水平849(+/-1009)。
Tau-A ELISA测定的表征
选择识别ADAM10产生的Tau切割序列(TPRGAAPPGQ，SEQ ID NO246)的抗体用以开发ELISA(Tau-A)。如图7所示，该测定对切割位点特异，延长该序列一个氨基酸导致失去反应性。进一步的验证采用ADAM10降解的重组tau或脑提取物进一步验证特异性确认了其对切割的tau的特异性(图7B-C)。此外，组织谱分析确认了Tau主要来源于脑。确定检测下限(LLOD)为2.9ng/mL，检测上限(ULOD)为226.3ng/mL。该测定在技术上稳定并且能够检测稀释范围在1+2到1+6的小鼠和大鼠血清以及人血清和血浆(数据未显示)。此外，上述稀释范围获得了线性加标回归(linear spiking recovery)(数据未显示)。测定内变异系数为5.8％，而测定间CV％为12.6％。连续5次冻融循环后没有观测到反应性的丧失。
Tau-A ELISA的生物学验证
使用ELISA的分析显示了Tg4510小鼠脑中Tau-A的水平为相应wt对照的10倍(图7E)。Western印迹也显示了Tg4510小鼠的Tau-A水平非常高，而对照小鼠非常低(图7F)。使用针对总Tau的抗体再探查印迹显示总Tau水平几乎相同，尽管Tg4510中高分子量条带强度更强。
Tau-A水平与MDRS评分相关
为了研究是否能够鉴定标记物与AD疾病阶段的关系，我们将AD患者的Tau-A水平与用Mattis痴呆评定等级10获得的评分相关联，发现MDRS和Tau-A之间有显著的(p＝0.003)的负相关(图8)。在该组中未能观察到与其它参数(如CSF中的完整Tau或年龄)的关联(数据未显示)。
讨论
已广泛地研究了用于AD的基于血清和/或血浆的潜在标志物，但与认知功能相关的单一生物标志物在之前仍有待被鉴定1-3。据我们所知，这是监测血清中Tau的蛋白分解加工(其似乎是AD病理的关键引发物9)的第一个生物化学标志物。这也是与认知功能相关的脑特异性蛋白的第一个单一血清生物标志物。虽然AD的新表位被广泛研究，例如Aβ42和磷酸化的Tau的测量被报告为由于疾病而形成的新表位4，但是先前未针对体外产生的Tau片段而选择性筛选血清。
本工作中选择的ADAM10和Tau的组合基于这样的新假设，即在AD的进展中，Tau在脑中直接地或以由其他脑蛋白酶产生的片段的形式暴露于分泌酶介导的切割，然后在其进入循环时被再次加工；然而，这需要进一步研究。我们能够在血清中检测到特异的ADAM10产生的Tau肽片段，并且在Tg4510小鼠脑中检测到其水平的高度提高。这些结果显示在AD的神经元死亡中Tau的ADAM10加工是相关的过程，尽管确切的作用机理仍需确认。
总之，我们开发了第一个检测Tau的病理性片段的基于血清的测定。该片段与认知功能有直接的负相关。该测定为诊断神经元损失提供了可用且实用的工具，并且可以用于监测AD的治疗功效和进展。
本说明书中，除非特别另行指明，否则用语“或”以在满足任意一个或同时满足两个所示条件时返回真值的算符的意义使用，而不以要求仅满足一个条件的算符“异或(exclusive or)”的意义使用。用语“包含/括”用以表示“包含/括”而不是表示“由......组成”。所有现有教导对上述认可并且通过参考并入本文。本文中对任何现有技术发表文件的引用不应被认为是承认或表示在本文的日期时其教导在澳大利亚或其他地方为常规知识。
参考文献列表
1.Al zheimer′s Disease Clinical Trials.2010.US National Institutes ofHealth＆http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results？term＝al zheimer.Ref Type：Generic
2.Understanding stages and symptoms of Alzheimer′sdisease.2010.www.nia.nih.gov/Al zheimers/Publications/stages.htm.Ref Type：Generic
3.World Al zheimer Report2009.2010.Al zheimer′s DiseaseInternational.Ref Type：Generic
4.Arai T，Guo JP，McGeer PL(2005)Proteolysis of non-phosphorylated andphosphorylated tau by thrombin.J.Biol.Chem.280：5145-5153
5.Arriagada PV，Growdon JH，Hedley-Whyte ET，Hyman BT(1992)Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severityof Al zheimer′s disease.Neurology42：631-639
6.Barascuk N，Veidal SS，Larsen L，Larsen DV，Larsen MR，Wang J，Zheng Q，Xing R，Cao Y，Rasmussen LM，Karsdal MA(2010)A novel assay for extracellularmatrix remodeling associated with liver fibrosis：An enzyme-linkedimmunosorbent assay(ELISA)for a MMP-9proteolytically revealed neo-epitope oftype III collagen.Clin.Biochem.43：899-904
7.Bay-Jensen AC，Liu Q，Byrjalsen I，Li Y，Wang J，Pedersen C，Leeming DJ，Dam EB，Zheng Q，Qvist P，Karsdal MA(2011)Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISAs)for metalloproteinase derived type II collagen neoepitope，CIIM--increased serum CIIM in subjects with severe radiographicosteoarthritis.Clin.Biochem.44：423-429
8.Cummings JL(2011)Biomarkers in Alzheimer′s disease drugdevelopment.Alzheimers.Dement.7：e13-e44
9.de CA，Spires-Jones TL，Pitstick R，Carlson GA，Hyman BT(2009)Tangle-bearing neurons survive despite disruption of membrane integrity in a mousemodel of tauopathy.J.Neuropathol.Exp.Neurol.68：757-761
10.De SB(2010)Proteases and proteolysis in Al zheimer disease：amultifactorial view on the disease process.Physiol Rev.90：465-494
11.De SB，Annaert W(2000)Proteolytic processing and cell biologicalfunctions of the amyloid precursor protein.J.Cell Sci.113(Pt11)：1857-1870
12.Fillit H，Leveugle B(1995)Disorders of the extracellular matrix andthe pathogenesis of senile dementia of the Alzheimer′s type.Lab Invest72：249-253
13.Forstl H，Kurz A(1999)Clinical features of Al zheimer′sdisease.Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.249：288-290
14.Gamblin TC，Chen F，Zambrano A，Abraha A，Lagalwar S，Guillozet AL，LuM，Fu Y，Garcia-Sierra F，LaPointe N，Miller R，Berry RW，Binder LI，Cryns VL(2003)Caspase cleavage of tau：linking amyloid and neurofibrillary tangles in Alzheimer′s disease.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A100：10032-10037
15.Garcia-Sierra F，Mondragon-Rodriguez S，Basurto-Islas G(2008)Truncation of tau protein and its pathological significance in Alzheimer′sdisease.J.Al zheimers.Dis.14：401-409
16.Gefter ML，Margulies DH，Scharff MD(1977)A simple method forpolyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myelomacells.Somatic.Cell Genet.3：231-236
17.Goedert M，Spillantini MG，Jakes R，Rutherford D，Crowther RA(1989)Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau：sequences andlocalization in neurofibrillary tangles of Alzheimer′s disease.Neuron3：519-526
18.Gomez-Isla T，Hollister R，West H，Mui S，Growdon JH，Petersen RC，Parisi JE，Hyman BT(1997)Neuronal loss correlates with but exceedsneurofibrillary tangles in Al zheimer′s disease.Ann.Neurol.41：17-24
19.Haass C，Selkoe DJ(2007)Soluble protein oligomers inneurodegeneration：lessons from the Alzheimer′s amyloid beta-peptide.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.8：101-112
20.Hanger DP，Wray S(2010)Tau cleavage and tau aggregation inneurodegenerative disease.Biochem.Soc.Trans.38：1016-1020
21.Henriksen K，Gram J，Schaller S，Dahl BH，Dziegiel MH，Bollerslev J，Karsdal MA(2004)Characterization of osteoclasts from patients harboring aG215R mutation in ClC-7causing autosomal dominant osteopetrosis type II.Am JPathol164：1537-1545
22.Henriksen K，Gram J，Schaller S，Dahl BH，Dziegiel MH，Bollerslev J，Karsdal MA(2004)Characterization of osteoclasts from patients harboring aG215R mutation in ClC-7causing autosomal dominant osteopetrosis type II.Am JPathol164：1537-1545
23.Henriksen K，Gram J，Schaller S，Dahl BH，Dziegiel MH，Bollerslev J，Karsdal MA(2004)Characterization of osteoclasts from patients harboring aG215R mutation in ClC-7causing autosomal dominant osteopetrosis type II.Am JPathol164：1537-1545
24.Hoglund K，Hansson O，Buchhave P，Zetterberg H，Lewczuk P，Londos E，Blennow K，Minthon L，Wiltfang J(2008)Prediction of Al zheimer′s disease usinga cerebrospinal fluid pattern of C-terminally truncated beta-amyloidpeptides.Neurodegener.Dis.5：268-276
25.Jin S，Agerman K，Kolmodin K，Gustafsson E，Dahlqvist C，Jureus A，LiuG，Falting J，Berg S，Lundkvist J，Lendahl U(2010)Evidence for dimeric BACE-mediated APP processing.Biochem.Biophys.Res.Commun.393：21-27
26.Kim B，Backus C，Oh S，Hayes JM，Feldman EL(2009)Increased tauphosphorylation and cleavage in mouse models of type1andtype2diabetes.Endocrinology150：5294-530127.McKhann G，Drachman D，Folstein M，Katzman R，Price D，Stadlan EM(1984)Clinical diagnosis of Alzheimer′s disease：report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department ofHealth and Human Services Task Force on Alzheimer′s Disease.Neurology34：939-944
28.Mol sa PK，Marttila RJ，Rinne UK(1986)Survival and cause of death inAl zheimer′s disease and multi-infarct dementia.Acta Neurol.Scand.74：103-107
29.Park SY，Tournell C，Sinjoanu RC，Ferreira A(2007)Caspase-3-andcalpain-mediated tau cleavage are differentially prevented by estrogen andtestosterone in beta-amyloid-treated hippocampal neurons.Neuroscience144：119-127
30.Polvikoski T，Sulkava R，Haltia M，Kainulainen K，Vuorio A，VerkkoniemiA，Niinisto L，Halonen P，Kontula K(1995)Apolipoprotein E，dementia，and corticaldeposition of beta-amyloid protein.N.Engl.J.Med.333：1242-1247
31.Rametti A，Esclaire F，Yardin C，Terro F(2004)Linking alterations intau phosphorylation and cleavage during neuronal apoptosis.J.Biol.Chem.279：54518-54528
32.Reifert J，Hartung-Cranston D，Feinstein SC(2011)Amyloid{beta}-Mediated Cell Death of Cultured Hippocampal Neurons Reveals Extensive TauFragmentation without Increased Full-length TauPhosphorylation.J.Biol.Chem.286：20797-20811
33.Schroeter ML，Stein T，Maslowski N，Neumann J(2009)Neural correlatesof Alzheimer′s disease and mild cognitive impairment：a systematic andquantitative meta-analysis involving1351patients.Neuroimage.47：1196-120634.Takeda S，Sato N，Rakugi H，Morishita R(2010)Plasma beta-amvloidaspotential biomarker of Al zheimer disease：possibility of diagnostic toolfor Al zheimer disease.Mol.Biosyst.
35.Vassar R，Kandalepas PC(2011)The beta-secretase enzyme BACEl as atherapeutic target for Al zheimer′s disease.Al zheimers.Res.Ther.3：20
36.Vincent B，Checler F(2011)alpha-Secretase in Alzheimer′s Diseaseand Beyond：Mechanistic，Regulation and Function in the Shedding of MembraneProteins.Curr.Alzheimer Res.
37.Waldemar G，Dubois B，Emre M，Georges J，McKeith IG，Rossor M，ScheltensP，Tariska P，Winblad B(2007)Recommendations for the diagnosis and managementof Alzheimer′s disease and other disorders associated with dementia：EFNSguideline.Eur.J.Neurol.14：e1-26
38.Zetterberg H(2008)Biomarkers reflecting different facets of Alzheimer′s disease.Eur.J.Neurol.15：1143-1144
39.Zetterberg H，Andreasson U，Hansson O，Wu G，Sankaranarayanan S，Andersson ME，Buchhave P，Londos E，Umek RM，Minthon L，Simon AJ，Blennow K(2008)Elevated cerebrospinal fluid BACEl activity in incipient Alzheimerdisease.Arch.Neurol.65：1102-1107
40.Zhang S，Salemi J，Hou H，Zhu Y，Mori T，Giunta B，Obregon D，Tan J(2010)Rapamycin promotes beta-amyloid production via ADAM-10inhibition.Biochem.Biophys.Res.Commun.
Figure IDA0000452547150000011
Figure IDA0000452547150000021
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Claims (16)

1.免疫结合伴侣在制备用于对来源于患者的样品中Tau蛋白之肽片段进行测定的试剂盒中的用途，所述肽片段包含由ADAM10切割Tau蛋白而形成的N端新表位，其中
所述免疫结合伴侣对所述由ADAM10切割Tau蛋白而形成的N端新表位有特异性结合亲和力，并且
所述测定包括使所述样品与所述免疫结合伴侣相接触，以及检测所述免疫结合伴侣对所述由ADAM10切割Tau蛋白而形成的N端新表位的结合，其中所述N端新表位由所述ADAM10切割所述Tau蛋白以产生在肽N端的以下序列而形成：TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO 246)。
2.权利要求1的用途，其中所述免疫结合伴侣是有特异性结合亲和力的单克隆抗体片段或者单克隆抗体。
3.权利要求1的用途，其中所述测定以竞争免疫测定的方式进行，在所述竞争免疫测定中在所述样品的存在下孵育所述免疫结合伴侣和竞争剂，并且所述竞争剂与所述样品中的肽片段竞争结合所述免疫结合伴侣。
4.权利要求3的用途，其中所述竞争剂是合成的肽，或者是通过切割所述表位所来源的蛋白质以显露所述N端新表位而形成的经纯化天然肽。
5.权利要求3的用途，其中所述竞争剂包含肽，所述肽包含N端序列TPRGAAPPGQ(SEQ IDNO 246)。
6.权利要求1的用途，其中所述样品是尿液、血清、血液、血浆或唾液样品。
7.权利要求1的用途，其中所述样品是来源于患者的样品，所述测定还包括将所测定的所述肽片段的结合水平与数值相比较，所述数值是a)可比较的健康个体和/或(b)病理性神经退行性病症的特征性数值。
8.免疫结合伴侣，其针对由ADAM10切割Tau蛋白所形成的N端新表位，其与N端序列TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO 246)有特异性结合亲和力。
9.权利要求8的免疫结合伴侣，其为单克隆抗体或其结合片段。
10.细胞系，其产生权利要求9所述的单克隆抗体。
11.肽，其中所述肽为TPRGAAPPGQ(SEQ ID NO 246)。
12.权利要求11的肽，其作为半抗原缀合至载体以用于产生对所述肽的免疫应答，或者固定至固体表面或缀合至可检测标记以用于免疫测定。
13.编码权利要求11所述的肽的分离的核酸分子。
14.包含核酸序列的载体，所述核酸序列包含表达信号和编码权利要求11所述肽的表达的编码序列。
15.宿主细胞，其用权利要求14所述的载体转化并表达所述肽。
16.免疫测定试剂盒，其包含权利要求8或9所述的免疫结合伴侣和结合所述免疫结合伴侣的竞争剂，以及任选的以下一种或更多种：清洗试剂、缓冲剂、中止试剂、酶标记、酶标记底物、校正标准品、抗小鼠抗体和使用所述试剂盒进行测定的说明书。
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Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2538221A3 (en) * 2007-11-05 2013-04-24 Nordic Bioscience A/S Biochemical markers for CVD risk assessment
JP6457263B2 (ja) 2011-05-20 2019-01-23 オリゴメリックス インコーポレイテッド タウプロテアーゼ組成物および使用方法
RU2668159C2 (ru) 2012-07-03 2018-09-26 Вашингтон Юниверсити Антитела против тау
BR112015003326A2 (pt) 2012-08-16 2017-07-04 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma tauopatia
JP6674888B2 (ja) * 2013-03-13 2020-04-01 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ免疫療法
GB201319761D0 (en) * 2013-11-08 2013-12-25 Nordic Bioscience As Biomarkers of disease progression
CA2938152A1 (en) * 2014-02-10 2015-08-13 Merck Sharp & Dohme Corp. Antibodies that bind to human tau and assay for quantifying human tau using the antibodies
US10400018B2 (en) 2014-02-14 2019-09-03 Ipierian, Inc. Tau peptides, anti-tau antibodies, and methods of use thereof
TWI664190B (zh) 2014-06-27 2019-07-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗－ｔａｕ抗體
JP6438573B2 (ja) * 2014-09-09 2018-12-12 ユーロ−ディアグノスティカ アーベーＥｕｒｏ−Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＡＢ 補体成分Ｃ４ｄに対して特異的な抗体、およびその使用
US20180050097A1 (en) * 2015-03-25 2018-02-22 Stc. Unm Immunotherapy compositions and methods for treatment of tauopathy and transgenic mouse
FI3452507T3 (fi) 2016-05-02 2022-12-15 Tau-immuunihoito
EA201892417A1 (ru) 2016-05-02 2019-05-31 Протена Биосайенсис Лимитед Антитела, распознающие тау
KR102533675B1 (ko) 2016-05-02 2023-05-22 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
EP3242134A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-08 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG Assay for the diagnosis of a neurological disease
CN106124770A (zh) * 2016-06-14 2016-11-16 同济大学 一种高灵敏度可回收纳米生物传感器及其制备方法与应用
WO2018152359A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Denali Therapeutics Inc. Anti-tau antibodies and methods of use thereof
CN110881274A (zh) 2017-05-02 2020-03-13 普罗塞纳生物科学有限公司 识别tau的抗体
AU2019232630A1 (en) 2018-03-05 2020-09-24 Janssen Pharmaceutica Nv Assays to detect neurodegeneration
PE20211709A1 (es) * 2019-02-08 2021-09-01 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau
BR112021016947A2 (pt) 2019-03-03 2021-11-03 Prothena Biosciences Ltd Anticorpos que reconhecem tau
CN114989313B (zh) * 2022-06-28 2024-04-02 福建亿彤生物科技有限公司 p-tau181抗原表位肽及其在阿尔茨海默病检测中的用途
CN115894659B (zh) * 2022-10-19 2023-11-10 上海优宁维生物科技股份有限公司 微管相关蛋白Tau抗原及其制备方法和应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993003369A1 (en) * 1991-08-01 1993-02-18 Voorheis Paul H Diagnostic method for alzheimer's disease
EP0673418B1 (en) * 1992-12-14 1998-05-06 N.V. Innogenetics S.A. Monoclonal antibodies directed against the microtubule-associated protein tau, hybridomas secreting these antibodies, antigen recognition by these monoclonal antibodies and their applications
GB9506197D0 (en) * 1995-03-27 1995-05-17 Hoffmann La Roche Inhibition of tau-tau association.
ATE342509T1 (de) * 2000-01-24 2006-11-15 Innogenetics Nv Diagnose von tauopathien durch bestimmung des verhältnisses von tau/phospho-tau
KR100428998B1 (ko) * 2001-09-10 2004-04-28 한국과학기술원 모체 단백질과는 크기와 서열이 다른 단백질의 변이집단을생산하는 방법
US8012936B2 (en) * 2006-03-29 2011-09-06 New York University Tau fragments for immunotherapy
EP2538221A3 (en) * 2007-11-05 2013-04-24 Nordic Bioscience A/S Biochemical markers for CVD risk assessment
WO2010021755A2 (en) * 2008-08-20 2010-02-25 Oligomerix, Inc. Tau protease compositions and methods
ES2635494T3 (es) * 2009-03-30 2017-10-04 Nordic Bioscience A/S Ensayo de biomarcador de fibrosis
CN106390107B (zh) * 2009-06-10 2019-12-31 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
EP2478360B1 (en) * 2009-09-14 2018-06-27 Banyan Biomarkers, Inc. Autoantibody markers for diagnosis of traumatic brain injury

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cleavage of Tau by calpain in Alzheimer’s disease: the quest for the toxic 17 kD fragment;Sarika Garga等;《Neurobiology of Aging》;20110101;第32卷(第1期);1-14 *
Proteasomal degradation of tau protein;Della C. David等;《Journal of Neurochemistry》;20021001;第83卷(第1期);176-185 *

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