DE69919048T2

DE69919048T2 - Pränataler Nachweis einer Chromosomabnormalität

Info

Publication number: DE69919048T2
Application number: DE69919048T
Authority: DE
Inventors: Ritsu Nishi-ku Yamamoto; Shinji Chuo-ku Satomura
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd
Current assignee: Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2019-02-03
Also published as: US20040082006A1; DK0933637T3; DE69919048D1; EP0933637A1; US6677123B1; EP0933637B1; ES2221308T3

Description

Die vorliegende Erfindung gewährt ein einfacheres Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie, ausgewählt aus einer autosomalen Anomalie und einer geschlechtschromosomalen Anomalie, und betrifft speziell ein einfacheres Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos für das fetale Down-Syndrom.
Das Down-Syndrom ist als ein Syndrom der Chromosomenanomalie weit bekannt. Die Chromosomenanomalie im Fall des Down-Syndroms ist eine autosomale Anomalie und wird in einem 21-Trisomie-Typ eingeteilt, der drei 21. Chromosomen hat, der Typ der 21. Chromosomen-Translokation und dem Mosaik-Typ. Die prozentuale Aufteilung dieser Typen beträgt 95%, 4% bzw. 1%. Die klinischen Symptome des Down-Syndroms sind oftmals ein typisches und charakteristisches Gesicht, eine verzögerte physische Entwicklung und eine schwerwiegende geistige Behinderung.
Für die pränatale Diagnose des Down-Syndroms wird in der Regel beispielsweise eine Methode zur Ausführung der Fruchtwasserpunktion in der 10. bis 20. Schwangerschaftswoche eingesetzt, eine Analyse der Chromosomen der Zellen und damit eine Diagnose, ob der Fetus eine 21-Trisomie hat oder nicht. Die Fruchtwasserpunktion, die eine hohe diagnostische Effizienz hat, hat jedoch einen Nachteil insofern, dass sie mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,5 bis 1% zu Abort führt. Es gibt jedoch auch Methoden, wie beispielsweise die Ultraschalldiagnose und die Villus-Untersuchung, bei denen es jedoch zu Problemen kommt, wie beispielsweise geringe Zuverlässigkeit bzw. die Möglichkeit einer Verletzung des Fetus. Darüber hinaus sind verschiedene Screening-Methoden entwickelt worden, die auf der Grundlage der Messung mütterlicher Blutkomponenten beruhen. Insbesondere findet eine Methode weit verbreiteten Einsatz, die die Berechnung des Risikogrades anhand des Alters der Mutter und der Konzentrationen an α-Fetoprotein (AFP), Human-Choriongonadotropin (HCG) und unkonjugiertes Estriol (uE3) im mütterlichen Blut (Wald NJ., Densem JW., Smith D., Klee GG.: Four-Marker Serum Screening For Down's syndroms", Prenat. Diagn., 1994; 14: 707–716) umfassen. Darüber hinaus offenbart beispielsweise die Japanische Patentanmeldung Kohyo Nr. 8-500181 ein Verfahren, welches das Trocknen des mütterlichen Bluts einer schwangeren Frau und anschließendes Vergleichen des HCG-Spiegels mit einem Referenz-Standardwert umfasst und einen Prozess der gleichzeitigen Verwendung eines Wertes des AFP-Spiegels. Die Japanische Patentschrift Nr. 2525474 offenbart ein Verfahren zum Messen der Gehalte an uE3, Progesteron, 16α-Hydroxydehydroepiandrosteron und dergleichen in einer Probe des mütterlichen Serums, worin auch das AFP gemessen wird. Die JP-A-2-5895 offenbart beispielsweise ein Verfahren zum Messen der Konzentration von SOD-1 in einem extrazellulären Körper flüssigkeit, wie beispielsweise dem Serum, Fruchtwasser oder dergleichen einer schwangeren Frau. Allerdings treten bei den vorgenannten Prozessen beispielsweise die folgenden Probleme auf: die Analyse der Messergebnisse ist schwierig, die Empfindlichkeit ist noch mit 60 bis 70% gering und die Messergebnisse scheinen von dem Zustand der Mutter beeinflusst zu werden, wie beispielsweise Körpergewicht, Kontraktion von Diabetes, Rauchgewohnheiten, usw.
Die CHEMICAL ABSTRACTS, Bd. 117, Nr. 15, 12. Oktober 1992, Columbus, Ohio, US; Referat Nr. 146666, beschreiben ebenfalls, dass die Messung von AFP-Konzentrationen im Fruchtwasser und in mütterlichem Serum zur Einschätzung von fetalen Chromosomenanomalien verwendet werden können. Bei diesem Dokument wird jedoch nicht in Betracht gezogen, dass die Analyse der Zuckerkettenstrukturen von AFP verwendet werden könnte, ein erhöhtes Risiko einer fetalen Chromosomenanomalie nachzuweisen.
K. Taketa, et al.: "A collective study for the evaluation of Lektin-reactive alpha-fetoproteins in early detection of hepatozellular carcinoma" (("eine Gemeinschaftsstudie für die Auswertung von Lektin-reaktiven α-Fetoproteinen in der Früherkennung von hepatozellulärem Karzinom")) CANCER RESEARCH, Bd. 53, Nr. 22, 1993, S. 5419–5423, offenbart die Analyse der Gesamtserumspiegel und Lektin-reaktiven Fraktionen von AFP unter Anwendung der Lektin-Affinitätselektrophorese gekoppelt mit Antikörper-Affinitäts-Blotting unter Verwendung von AFP-Differentiations-Kits L und P. Die Kits L und P enthalten Lens culinaris-Agglutinin-A (LCA-A) bzw. Erythroagglutinations-Phytohämagglutinin (E₄-PHA) als die Reaktionskomponenten, die sich speziell an Zuckergruppen binden. Es werden Proben auf Gele aufgebracht, die LCA-A oder E₄-PHA enthalten. Nach der Elektrophorese werden separierte AFP-Bande auf Nitrocellulosemembranen geblottet, die mit Antikörpern auf Human-AFP vorbeschichtet wurden.
Die CLINICA CHEMICA ACTA, Bd. 254, 1996, S. 23–40 beziehen sich ebenfalls auf den Vergleich von Kohlenhydrat-Strukturen von Serum-AFP mit Hilfe der Lektin-Affinitätselektrophorese. Die Beziehung zwischen den AFP-Kohlenhydratstrukturen und Lebererkrankungen wurden nachgewiesen.
H. Kathoh, et al.: "Analytical method for sugar chain structures involving Lektins and membrane ultrafiltration" (("Analytische Methode für Zuckerkettenstrukturen unter Beteiligung von Lektinen und einer Membran-Ultrafiltration")) JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, Bd. 113, Nr. 1, 1993, S. 118–122, offenbaren eine Methode für die Strukturidentifikation von Zuckerketten. Zunächst werden Lektine, z.B. Concanavalin A (ConA) an den Zuckermolekülen gebunden und sodann die ungebundenen Zuckerketten entfernt. Das Lektin gebundene Molekül wird mit Hilfe der HPLC analysiert.
Die EP-A-0 653 640 offenbart eine Methode zur Trennung und Analyse von AFP's auf der Grundlage der Unterschiede ihrer Zuckerkettenstruktur unter Verwendung einer Kombination von Lens culinaris-Lektin-Antikörper, der an allen AFP's bindet, wird jedoch vom Binden an AFP's abgehalten, die daran LCA-A angebracht aufweisen. Es kann auch ein zweiter monoklonaler Antikörper eingesetzt werden, der eine Antigen-Erkennungsstelle hat, die von derjenigen des ersten Antikörpers verschieden ist und in der Lage ist, sich an sämtlichen AFP-Analyten zu binden und einschließlich solchen AFP's, die über ein LCA-A daran angebracht verfügen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Gewährung eines Verfahrens zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie, das in Bezug auf seine Ungefährlichkeit für ein schwangere Frau und ihren Fetus hervorragend ist und über eine hohe Zuverlässigkeit im Bezug auf die Untersuchungsergebnisse verfügt, sowie die Gewährung eines Reagens oder Kits, die in dem Verfahren zur Anwendung gelangen.
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie, wie es in dem hierin beigefügten Patentanspruch 1 festgelegt ist.
Die vorliegende Erfindung gewährt ebenfalls die Verwendung eines Reagens in dem vorgenannten Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie, wobei das Reagens ein Protein aufweist, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der AFP's in der Lage ist und zum Separieren der AFP's verwendet wird.
Die vorliegende Erfindung gewährt außerdem die Verwendung eines Kits in dem vorgenannten Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie, wobei das Kit aufweist: (1) ein Lektin, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der AFP's in der Lage ist, und (2) einen Anti-AFP-Antikörper.
Der Anti-AFP-Antikörper, den das Kit aufweist, ist in der Lage zum Binden aller AFP's unabhängig davon, ob das Lektin an den AFP's bindet oder nicht. Ebenfalls enthalten in dem Kit ist ein Anti-AFP-Antikörper, der über eine geringe Reaktivität mit AFP verfügt, an dem das Lektin gebunden ist, der jedoch über eine hohe Reaktivität mit einem AFP verfügt, an dem das Lektin nicht bindet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die in Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse: (a) und (b) zeigen die Verteilungen der AFP-Gesamtmenge bzw. den prozentualen Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion in jeder der Serumproben, die von normalen schwangeren Frauen oder schwangeren Frauen genommen wurden, bei denen sich bestätigt hatte, dass sie einen Fetus mit fetalem Down-Syndrom haben.
2 zeigt mit einem Receiver erhaltene Kennlinien, die auf der Grundlage der in Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse erhalten wurden: (a) zeigt eine mit einem Receiver erhaltene Kennlinie, die auf der Grundlage der Ergebnisse der Messung der AFP-Gesamtmenge erhalten wurde, und (b) zeigt eine mit einem Receiver erhaltene Kennlinie, die auf der Grundlage der Ergebnisse der Messung des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion erhalten wurde.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Um zu einem Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie zu gelangen, das keinen unerwünschten Einfluss auf eine schwangere Frau und ihren Fetus hat, eine hohe Zuverlässigkeit der Untersuchungsergebnisse hat und einfach ist, haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung eingehende Untersuchungen ausgeführt, um solche Ergebnisse zu erzielen, mit denen ein erhöhtes Risiko einer fetalen Chromosomenanomalie mit hoher Zuverlässigkeit nachgewiesen werden kann, indem ein oder mehrere AFP's mit einer spezifischen Zuckerkettenstruktur gemessen wird/werden, die in der Körperflüssigkeit einer schwangeren Frau vorhanden sind, so dass man auf der Grundlage dieser Ergebnisse zu der vorliegenden Erfindung gelangte.
AFP ist eine carzinoembryonales Glykoprotein, das in der fetalen Leber oder in malignen Tumoren erzeugt wird, wie beispielsweise in hepatozellularen Karzinomen und Dottersacktumor, und das oftmals als ein wichtiger Hinweis bei Diagnosen verschiedener Lebererkrankungen verwendet wird.
Im Allgemeinen hat das AFP pro Molekül einen Asparagin-gekoppelten Typ (N-Glykosid-Typ), biantennarem Komplex-Typ der Zuckerkette. Daher lassen sich zwei oder mehrere Formen von AFP's als AFP's mit unterschiedlichen Zuckerketten mit Hilfe einer Methode separieren, in denen die AFP-Bande mit Hilfe der Affinitätselektrophorese unter Verwendung eines Lektins separiert sind, das über unterschiedliche Affinitäten zu verschiedenen Oligosacchariden verfügt, die mit Hilfe einer Methode des Antikörper-Affinitäts-Blottings detektiert werden. Wenn beispielsweise Concanavalin A (Con A) zur Anwendung gelangt, werden AFP's als AFP-C1 und AFP-C2 auf der Grundlage der Beschaffenheiten ihrer Zuckerketten separiert. Sofern Lens Culinaris-Agglutinin (LCA) zur Anwendung gelangt, werden die AFP's als AFP-L1, AFP-L2 und AFP-L3 separiert. Sofern erythroagglutinierendes Phytohämagglutinin-E4 (PHA-E4) zur Anwendung gelangt, werden die AFP's zu AFP-P1 bis AFP-P5 separiert, wobei AFP-P3f, das eine schnellere Mobilität als AFP-P3 hat, ebenfalls erscheint. Sofern Coleopteron grub-Agglutinin (alloA) zur Anwendung gelangt, werden die AFP's als AFP-A1, AFP-A2 und AFP-A3 separiert, wobei AFP-A1s, das eine langsamere Mobilität hat als AFP-A1, in einigen Fällen ebenfalls erscheint. Sofern Ricinus communis-Agglutinin (RCA-120) zur Anwendung gelangt, werden die AFP's als AFP-R1, AFP-R2 und AFP-R3 separiert, wobei in einigen Fällen AFP-R1f, das eine schnellere Mobilität als AFP-R1 hat, ebenfalls erscheint. Sofern Datura stramonium-Agglutinin (DSA) zur Anwendung gelangt, werden die AFP's als AFP-D1 bis AFP-D6 separiert. Sofern Aleuria aurantia-Agglutinin (AAL) zur Anwendung gelangt, werden die AFP's als AFP-AA1 bis AFP-AA4 (Kazuhisa Taketa "Clinical Examination", Bd. 39, Nr. 1, S. 66–70 (1995), Shimizu K., Clin. Chim. Acta., 254, 23–40 (1996)) separiert.
Es ist bekannt, dass während der Schwangerschaft das Fruchtwasser und das mütterliche Serum hohe AFP-Werte haben. Dieses ist darauf zurückzuführen, dass in der unentwickelten fetalen Leber AFP's erzeugt werden. Das bedeutet, dass in dem ersten fetalen Leben in der Leber in relativ großen Mengen ein AFP erzeugt wird, das einen fucosylierten Kern-N-Acetylglucosamin (GlcNAc)-Rest hat und ein Monosialo-AFP, das an der Mannose (Man) α1→6-Seitenkette einen exponierten Galactose (Gal)-Rest hat. In den Frühstufen der Schwangerschaft erscheint im Fruchtwasser ein AFP, das einen biantennaren Typ von GlcNAc hat. Mit dem Wachstum des Fetus und der Entwicklung der Leber nimmt die Menge der erzeugten AFP's ab. Andererseits wird vermutet, da die Serum-AFP-Konzentration eines Erwachsenen in der Regel 10 ng/ml oder weniger beträgt, dass ein großer Teil der AFP's, die während der Schwangerschaft in dem mütterlichen Serum auftreten, vom Fetus erzeugt wird.
Bevorzugte Beispiele der AFP(s), die in der vorliegenden Erfindung untersucht worden sind, sind solche, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen. In die spezifische Zuckerkettenstruktur sind beispielsweise die Folgenden einbezogen:
1. Ein zweiteiliger Komplex-Typ der Zuckerkette der Formel [1]:
2. Zuckerkettenstrukturen, die durch die Umwandlung des biatenaren Komplex-Typs der Zuckerkette gebildet werden:

(1) Zuckerkettenstrukturen, die durch die Hinzufügung eines Zuckers gebildet werden. i) Zuckerkettenstrukturen, die durch Hinzufügen von Fucose zu GlcNAc an dem reduzierenden Ende durch eine α1→6-Verknüpfung gebildet werden. Ein spezielles Beispiel dafür ist eine Zuckerkettenstruktur der Formel [2]:
ii) Zuckerkettenstrukturen, die durch Hinzufügen von GlcNAc zu Man, das über α1→6-, α1→3- und β1→4-Verknüpfungen verfügt, durch eine β1→4-Verknüpfung gebildet werden. Ein spezielles Beispiel dafür ist eine Zuckerkettenstruktur der Formel [3]:
iii) Dreifache oder vierfache Kettenstrukturen, die durch Hinzufügung einer Zuckerkette an Man, das über β1→2- und α1→6-Verknüpfungen verfügt, und/oder Man, das über β1→2- und α1→3-Verknüpfungen verfügt, gebildet werden.
(2) Zuckerkettenstrukturen, die durch die Entfernung eines Zuckerrestes gebildet werden. i) Zuckerkettenstrukturen, die frei von dem terminalen Sialinsäure-Rest sind. Spezielle Beispiele dafür sind Zuckerkettenstrukturen der folgenden Formeln [4] bis [7]:
ii) Zuckerkettenstrukturen, die frei sind von GaI an den nicht reduzierenden Ende. Ein spezielles Beispiel dafür ist eine Zuckerkettenstruktur der Formel [8]:
(3) Zuckerkettenstrukturen, die durch die Hinzufügung eines Zuckers und die Entfernung eines Zuckerrestes gebildet werden. Ein spezielles Beispiel dafür ist eine Zuckerkettenstruktur der Formel [9]:
(4) Zuckerkettenstruktur, die durch eine Änderung in der Art des Bindens des terminalen Sialinsäure-Restes gebildet werden (die Änderung der üblichen Hinzufügung durch eine α1→6-Verknüpfung zur Hinzufügung durch eine α1→3-Verknüpfung). Ein spezielles Beispiel dafür ist eine Zuckerkettenstruktur der Formel [10]:

In das AFP mit einer spezifischen Zuckerkettenstruktur, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren gemessen wird, sind AFP's einbezogen, die unter Verwendung verschiedener Lektine separiert werden können. Spezielle Beispiele dafür sind: AFP-C1 und AFP-C2, die unter Verwendung von Con A separiert werden können; AFP-L1, AFP-L2 und AFP-L3, die unter Verwendung von LCA separiert werden können; AFP-P1, AFP-P2, AFP-P3, AFP-P4, AFP-P5 und AFP-P3f, die unter Verwendung von PHA-E4 separiert werden können; AFP-A1, AFP-A2, AFP-A3 und AFP-A1s, die unter Verwendung von alloA separiert werden können; AFP-R1, AFP-R2, AFP-R3, AFP-R1f und AFP-R3f, die unter Verwendung von RCA-120 separiert werden können; AFP-D1, AFP-D2, AFP-D3, AFP-D4, AFP-D5, AFP-D6 und AFP-D7, die unter Verwendung von DSA separiert werden können; sowie AFP-AA1, AFP-AA2, AFP-AA3 und AFP-AA4, die unter Verwendung von AAL separiert werden können. Die AFP's und Lektine sind auf diese nicht beschränkt.
Wenn die Separation unter Verwendung eines Lektins erfolgt, wird ein AFP, das über den biantennaren Komplex-Typ der Zuckerkette der Formel [1] als eine Zuckerkettenstruktur verfügt, beispielsweise separiert als: AFP-C2, AFP-L2, AFP-P2, AFP-A3, AFP-R1 oder dergleichen. Ein AFP, das über die Zuckerkettenstruktur der Formel [2] verfügt, wird separiert als: AFP-C2, AFP-L3, AFP-P2, AFP- A3, AFP-R1 oder dergleichen. Ein AFP, das über eine beliebige der Zuckerkettenstrukturen der Formeln [3], [4] und [9] verfügt, wird separiert als: AFP-C1, AFP-P5, AFP A3, AFP-R3 oder dergleichen. Ein AFP, das über die Zuckerkettenstruktur der Formel [5] verfügt, wird separiert als: AFP-C2, AFP-P4, AFP-A3, AFP-R2 oder dergleichen. Ein AFP, das über die Zuckerkettenstruktur der Formel [6] verfügt, wird separiert als: AFP-C2, AFP-P4 oder dergleichen. Ein AFP, das über eine beliebige der Zuckerkettenstrukturen der Formeln [7] und [8] verfügt, wird separiert als: AFP-C2, AFP-P3, AFP-A oder dergleichen. Ein AFP, das über die Zuckerkettenstruktur der Formel [10] verfügt, wird separiert als: AFP-C2, AFP-P5, AFP-A3, AFP-R1 oder dergleichen. Sofern die Separation unter Verwendung eines anderen Lektins als die vorstehend exemplifizierten Lektine erfolgt, werden die AFP's als verschiedene Fraktionen in Abhängigkeit von den Eigenschaften des zur Anwendung gelangenden Lektins separiert.
Wenn die AFP's, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, gemessen werden, so lassen sich die AFP's nach ihrer vorangegangenen Behandlung mit Glykosylhydrolase messen, wie beispielsweise Sialidase, N-Acetylhexosaminidase, Galactosidase, Fucosidase oder dergleichen.
Wenn beispielsweise eine autosomale Anomalie (z.B. 18-Trisomie oder 21-Trisomie = Down-Syndrom) detektiert wird, so sind bevorzugte Beispiele der AFP's, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, solche AFP's, die sich unter Verwendung eines Lektins separieren lassen, wie beispielsweise LCA, PHA-E4, Con A oder dergleichen unter den vorstehend exemplifizierten AFP's, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen. Speziellere Beispiele dafür sind: AFP-L2, AFP-L3, AFP-P4, AFP-P5, AFP-C1, usw. Wenn eine geschlechtschromosomale Anomalie detektiert wird, sind bevorzugte Beispiele der AFP's, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, solche AFP's, die sich unter Verwendung von LCA oder dergleichen separieren lassen, wobei mehr bevorzugte Beispiele dafür AFP-L2, AFP-L3, usw. sind.
Als die für die Messung in der vorliegenden Erfindung als Probe verwendete mütterliche Körperflüssigkeit können Fruchtwasser, Plasma, Serum, usw., exemplifiziert werden. Als die mütterliche Körperflüssigkeit wird in der Regel eine Körperflüssigkeit verwendet, die von einer schwangeren Frau in den Wochen 10 bis 20 der Schwangerschaft genommen wurde.
Für das Protein, das zum Erkennen der Zuckerkettenstruktur oder ihrer Nähe zu den AFP's, die über die spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, in der Lage ist, lassen sich Lektine, Antikörper, usw. exemplifizieren. Die Lektine schließen beispielsweise ein: Con A, LCA, alloA, RCA 120, DSA, AAL, PHA E4, Pisum sativum Agglutinin, Arachis hypogaca-Agglutinin, Triticum vulgaris-Agglutinin, usw. Diese Lektine werden in Abhängigkeit von der spezifischen Zuckerkettenstruktur der AFP's, die gemessen werden sollen, entsprechend ausgewählt. Unter ihnen sind LCA, PHA-E4 und Concanavalin A bevorzugt.
Die Antikörper sind nicht speziell beschränkt und es kann jeder beliebige Antikörper so lange verwendet werden, wie er ein Antikörper gegen die spezifische Zuckerkettenstruktur oder Nähe davon der AFP's ist. Die Antikörper können entweder polyklonal oder monoklonal sein und lassen sich einzeln oder in geeigneter Kombination verwenden. In Anbetracht der Spezifität eines Antikörpers, der über gleichförmige Eigenschaften verfügt, ist ein monoklonaler Antikörper einem polyklonalen Antikörper zu bevorzugen. Nach Erfordernis können diese Antikörper verwendet werden, nachdem sie mit einem Enzym, wie beispielsweise Pepsin oder Papain, zu F(ab')2, Fab' oder Fab aufgeschlossen wurden. Die Antikörper können nach ihrer Einführung in beliebige verschiedene Substanzen verwendet werden, wie beispielsweise Substanzen zum Markieren, wie beispielsweise Enzyme [z.B. alkalische Phosphatasen, β-Galactosidase, Peroxidase, Mikroperoxidase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Acetylcholinesterase, Maleatdehydrogenase, Luciferase, usw., die beispielsweise im Enzym-Immunoassay (EIA) verwendet werden], Radioisotope [z.B. ^99mTc, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹⁴C, ³H, usw., die beispielsweise im Radioimmunoassay (RIA) verwendet werden], Substanzen, die Fluoreszenz emittieren können [z.B. Fluorescein, Dansyl-Rest, Fluorescamin, Cumarin, Naphthylamin, Derivate davon, usw., die beispielsweise im Fluoroimmunoassay (FIA) verwendet werden], Lumineszenz-Substanzen [z.B. Luciferin, Isoluminol, Luminol, Bis(2,4,6-Trifluorphenyl)-oxalat, usw.], Substanzen, die ein UV-Licht absorbieren können [z.B. Phenol, Naphthol, Anthracen, Derivate davon, usw.] und Substanzen, die über Eigenschaften als Spinmarker verfügen, die durch Verbindungen repräsentiert werden, die eine Oxyl-Gruppe haben [z.B. 4-Amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl, 3-Amino-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidin-1-oxyl, 2,6-Di-tert-Butyl-a-(3,5-di-tert-butyl-4-oxo-2,5-cyclohexadien-1-yliden)-p-tolyloxyl, usw.], sowie Substanzen, die über eine solche Eigenschaft verfügen, dass bei der Trennung eines Antigen-Antikörper-Komplexes mit Hilfe der Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) oder dergleichen die Substanzen eine genauere Separation des Komplexes von anderen Komponenten durch Veränderung der Eigenschaften des Komplexes ermöglichen, wie beispielsweise Molmasse, Hydrophobie, der isoelektrische Punkt, usw. (wobei die Substanzen nachfolgend abgekürzt werden als "Separation-verbessernde Substanzen"), wobei spezielle Beispiele für die Separation-verbessernde Substanz Proteine sind (z.B. α-Chymotrypsinogen, β-Galactosidase, Lysozym, Cytochrom c, Trypsin-Inhibitor, usw.), Peptide, die Aminosäuren enthalten, wie beispielsweise Phenylalanin, Prolin, Arginin, Lysin, Asparagin säure, Glutaminsäure, usw., Halogenatome [z.B. Brom, Chlor, Iod, usw.], synthetische Polymere [z.B. Polyethylenglykol, usw.], Polyaminsäuren [z.B. Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Polylysin, Polyarginin, Polyphenylalanin, Polytyrosin, usw.], wobei die Polypeptide über mindestens 3 Reste verfügen, die von einer starken Säure deriviert sind, wie beispielsweise Schwefelsäure, Phosphorsäure oder dergleichen, die z.B. in der JP-A-9-301995 offenbart wurden, Alkylketten mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen, Fettsäuren (z.B. Palmitinsäure, Oleinsäure, Stearinsäure, usw.) sowie chemische Substanzen, die über eine reaktionsfähige Gruppe verfügen, die zum Binden an dem vorgenannten Antikörper in der Lage sind und über Hydrophobie oder Ionogenität verfügen [z. B. N-(ε-Maleimidocaproyloxy)succinimid (EMCS), N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat, Bismaleimidohexan (BMH), Octylamin, usw.].
Spezielle Beispiele für Methoden zum Messen von einem oder mehreren AFP's, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, sind Methoden unter Verwendung eines Proteins, das zum Erkennen der spezifischen Zuckerkettenstruktur an mindestens einem der AFP's in der Lage ist (z.B. ein Lektin oder ein Antikörper). Speziellere Beispiele dafür sind eine konventionelle Methode der Lektin-Affinitätselektrophorese unter Verwendung eines Anti-AFP-Antikörpers und eines Lektins als ein Protein, das zum Erkennen der spezifischen Zuckerkettenstruktur an mindestens einem der AFP in der Lage ist, sowie eine Methode unter Verwendung einer Affinitätssäulenchromatographie auf Lektin, eine Methode unter Verwendung einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), usw. Da sich zahlreiche Kits für diese konventionellen Methoden auf dem Markt befinden, lässt sich die Messung unter Verwendung eines beliebigen dieser Kits ausführen.
Die Methode der Lektin-Affinitätselektrophorese wird beispielsweise wie folgt ausgeführt. Erstens wird eine Probe auf einem Gel einer Elektrophorese unterworfen, welches das Lektin enthält, das zum Erkennen der spezifischen Zuckerkettenstruktur mindestens eines der AFP in der Lage ist, um Fraktionen von AFP's zu erhalten. Anschließend wird das Gel mit dem Anti-AFP-Antikörper und einem Enzym-markierten Antikörper gegen den Anti-AFP-Antikörper behandelt. Nach der Behandlung durch Waschen wird das Gel mit einer Lösung behandelt, die Substrate) des Enzyms enthält, das/die einen Farbstoff durch Reaktion mit dem Enzym erzeugt/erzeugen. Anschließend wird das Gel einer Behandlung durch Waschen unterworfen und die Absorption jeder Fraktion mit einem Densitometer oder dergleichen gemessen. Der prozentuale Anteil der Peak-Fläche jeder AFP-Fraktion bezogen auf die Gesamtpeak-Fläche der AFP-Fraktionen wird als prozentualer Anteil der AFP-Fraktion (%) berechnet.
Die Methode unter Anwendung der HPLC wird beispielsweise wie folgt ausgeführt. Es werden ein Lektin und Antikörper verwendet, die in der AFP-Erkennungsstelle verschieden sind und die über eine Markierungssubstanz (z.B. ein Enzym) bzw. eine Separation-verbessernde Substanz verfügen, die daran angebracht ist. Erstens, wird eine Probe mit einem Lektin umgesetzt, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkettenstruktur von mindestens einem der AFP in der Lage ist, und dem Antikörper, der zum Binden aller AFP in der Lage ist, und zwar unabhängig davon, ob das Lektin an den AFP's bindet oder nicht, und der über die daran angebrachte Markierungssubstanz verfügt, wobei mit dem Antikörper, der über eine geringe Reaktivität mit den AFP's verfügt, die daran gebunden sind, die jedoch über eine hohe Reaktivität mit AFP's verfügen, an denen das Lektin nicht bindet und an denen die Separation-verbessernde Substanz gebunden ist. Danach wird die HPLC ausgeführt, um Fraktionen von AFP's zu erhalten. Die markierende Substanz wird gemessen und der prozentuale Anteil der Peak-Fläche jeder AFP-Fraktion bezogen auf die Gesamtpeak-Fläche der AFP-Fraktionen als prozentualer Anteil der AFP-Fraktion (%) berechnet.
Ein Überblick über die Messmethode unter Anwendung der Lektin-Affinitätselektrophorese wird nachfolgend konkret erläutert, indem beispielsweise der Fall einer Methode zum Messen von AFP-L3 unter Verwendung von AFP-L3-Test-Wako (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) als ein Kit zum Messen von AFP-L3 angenommen wird.
Zunächst wird eine Probe einer Elektrophorese beispielsweise auf Agarose-Gel unterworfen, das LCA enthält, um Fraktionen von AFP's zu erhalten. Das Agarose-Gel wird mit einem Film abgedeckt, auf dem zuvor ein Anti-Human-(Maus)-monoklonaler Antikörper aufgetragen wurde, um die Antigen-Antikörper-Reaktion auszuführen. Sodann werden die AFP-Fraktionen auf den mit Antikörper vorbeschichteten Film übertragen. Der mit Antikörper vorbeschichtete Film wird von dem Agarose-Gel abgezogen und gewaschen. Anschließend wird der Film in einen Anti-Human-AFP-(Kaninchen)-Antikörper getaucht, um eine Immunreaktion hervorzurufen. Danach wird der Film nach der Waschbehandlung in eine mit Peroxidase (POD)-markierte Anti-(Kaninchen)-IgG-(Ziege)-Antikörper-Lösung eingetaucht. Nach Beendigung der Reaktion und der nächsten Waschbehandlung wird der mit Antikörper vorbeschichtete Film in eine farberzeugende Reagenslösung zum Anfärben getaucht. Nach dem Anfärben und der nächsten Waschbehandlung wird die Absorption des Films bei einer Messwellenlänge von 550 bis 650 nm mit einem Densitometer gemessen. Der prozentuale Anteil der AFP-L3-Fraktion (%) wird errechnet, indem die Fläche des jeweiligen Peaks aus einem Densitogramm berechnet wird und der prozentuale Anteil der Peak-Fläche der AFP-L3-Fraktion im Bezug auf die Gesamtpeak-Fläche der AFP-Fraktionen berechnet wird.
Speziell wird die Messmethode unter Anwendung der HPLC beispielsweise wie das in der JP-A-9-301 995 offenbarte Verfahren ausgeführt, dessen Offenbarung hiermit als Fundstelle einbezogen ist. Die Messmethode wird nachfolgend unter Annahme des Falles einer Methode zum Messen von AFP-L3 erläutert. Es wird eine Substanz zum Markieren, wie beispielsweise ein Enzym (z.B. POD) oder eine Separation-verbessernde Substanz, wie beispielsweise 4-(p-Maleimidophenyl)butyryl-Ala-(Tyr(SO₃H))₅ oder 4-(p-Maleimidophenyl)butyryl-ala-(Tyr(SO₃H))₈ in Fab' eingeführt, das von jedem der drei monoklonalen Anti-AFP-Antikörper erhalten wurde, die in der AFP-Erkennungsstelle unterschiedlich sind, um Fab'-1-POD, Fab'-2-Ala-(Tyr(SO₃H))₅ und Fab'-3-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ zu erzeugen. Es wird eine Probe mit Fab'-1-POD und LCA umgesetzt und anschließend mit Fab'-2-Ala-(Tyr(SO₃H))₅ und Fab'-3-Ala-(Tyr(SO₃H))₈. Von diesen Fab'-Fragmenten verfügt das Fab'-3 über eine geringe Reaktivität mit einem AFP, das über daran gebundenes LCA verfügt, hat jedoch eine hohe Reaktivität mit einem AFP, zu dem die LCA keine Affinität hat (an dem die LCA nicht bindet). Fab'-1 und Fab'-2 verfügen über eine Reaktivität zum Binden an allen AFP's unabhängig davon, ob LCA an den AFP's gebunden ist oder nicht. Daher werden in der Reaktionslösung zwei Immun-Komplexe erzeugt, d.h. ein Immun-Komplex eines AFP, auf den die LCA eine Affinität hat, Fab'-2-Ala-(Tyr(SO₃H))₅ und Fab'-1-POD, und ein Immun-Komplex von einem AFP, zu dem die LCA keine Affinität hat (an der LCA nicht bindet), Fab'-2-Ala-(Tyr(SO₃H))₅, Fab'-3-Ala-(Tyr(SO₃H))₈ und Fab'-1-POD. Anschließend werden die zwei Komplexe auf der Grundlage der Zahl der Sulfat-Reste, die darin enthalten sind, mit Hilfe einer Anionenaustauschchromatographie separiert und die POD-Aktivität jedes Peaks gemessen. Da die Gesamtfläche der Peaks in Folge der zwei Immun-Komplexe der AFP-Gesamtmenge entspricht, kann der prozentuale Anteil der AFP-L3-Fraktion (%) berechnet werden, indem die Peak-Fläche des AFP, zu dem die LCA Affinität hat, durch die Gesamtpeak-Fläche der AFP-Fraktionen dividiert wird.
Die Zahl der zu messenden AFP's kann entweder eines oder zwei oder mehr sein.
Zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie wird die Messung unter Verwendung von Proben ausgeführt, die von schwangeren Frauen (normalen Frauen) erhalten werden, die im Wesentlichen das gleiche Alter hatten und in der gleichen Zahl der Schwangerschaftswochen waren wie diejenigen schwangeren Frauen, die detektiert werden sollten und bei denen nachgewiesen wurde, dass die Feten keine Anomalie hatten, indem eine Fruchtwasserpunktion unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurde, das das Separieren von AFP's umfasst, die in der Körperflüssigkeit einer schwangeren Frau vorhanden sind, und zwar auf der Grundlage des Unterschieds zwischen oder unter ihren Zuckerkettenstrukturen, indem ein Protein verwendet wurde, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der AFP in der Lage ist sowie Messen von einem oder mehreren der AFP's, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen. Unter Verwendung der so erhaltenen Menge(n) von spezifischen AFP(s) als Referenzstandard wurde/wurden die Menge(n) von spezifischen AFP(s), die von einer zu detektierenden Probe in der gleichen Weise wie vorstehend erhalten wurden mit der Menge des Referenzstandards verglichen. Sofern es zwischen diesen zwei Mengen eine signifikante Differenz gab, wurde die Diagnose gestellt, dass es sich bei der Probe um eine positive handelte.
Beim Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie wurde die Messung auch unter Verwendung von Proben ausgeführt, die von schwangeren Frauen (normale schwangere Frauen) erhalten wurden, die im Wesentlichen das gleiche Alter hatten und sich in der gleichen Schwangerschaftswoche befanden wie diejenigen schwangeren Frauen, die detektiert werden sollten und von deren Feten bestätigt worden war, dass sie keine Chromosomenanomalie hatten, indem eine Fruchtwasserpunktion unter Anwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurde, welches das Separieren von AFP's umfasst, die in der Körperflüssigkeit einer schwangeren Frau vorhanden sind, und zwar auf der Grundlage der Differenz zwischen oder unter deren Zuckerkettenstrukturen, indem ein Protein verwendet wurde, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der AFP's in der Lage ist, sowie Messen des Anteils von einem oder mehreren der AFP's, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, im Vergleich zu den Gesamt-AFP's. Unter Verwendung des auf diese Weise erhaltenen prozentualen Wertes (Anteil) der Fraktion eines vorbestimmten AFP als Referenzstandard wurde ein prozentualer Wert der Fraktion des zu bestimmenden AFP aus einer Probe erhalten, die in der gleichen Weise wie vorstehend detektiert werden sollte und mit dem Wert des Referenzstandards verglichen wurde. Sofern es zwischen diesen zwei Werten eine signifikante Differenz gab, wurde die Diagnose gestellt, dass es sich bei der Probe um eine positive handelte (eine mit einem erhöhten Risiko einer fetalen Chromosomenanomalie). Ein höherer oder geringerer prozentualer Wert einer Fraktion der vorbestimmten AFP als der Wert des Referenzstandards wurde als ein Hinweis auf positiv betrachtet, was von der Art der AFP(s) abhängt, die gemessen werden sollen, sowie von der Art der Probe. Wenn beispielsweise die Situation eines erhöhten Risikos eines fetalen Down- Syndroms auf der Grundlage des prozentualen Anteils der AFP(L2+L3)-Fraktion ausgeführt wird, ist der prozentuale Anteil im Serum und dem Fruchtwasser eines Patienten deutlich höher als in solchen der normalen Gruppe. Wenn die Detektion auf der Grundlage des prozentualen Anteils der AFP-C1-Fraktion ausgeführt wird, ist der prozentuale Anteil in dem Serum des Patienten deutlich niedriger als in dem der normalen Gruppe. Wenn die Detektion auf der Grundlage des prozentualen Anteils der AFP(P4+P5)-Fraktion oder AFP-P4-Fraktion ausgeführt wird, ist der prozentuale Anteil in dem Fruchtwasser des Patienten deutlich niedriger als in dem der normalen Gruppe. Wenn die Detektion eines erhöhten Risikos einer geschlechtschromosomalen Anomalie auf der Grundlage des prozentualen Anteils der AFP(L2+L3)-Fraktion ausgeführt wird, ist der prozentuale Anteil in dem Fruchtwasser eines Patienten deutlich niedriger als in dem der normalen Gruppe.
Das Reagens, das in dem Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie nach der vorliegenden Erfindung verwendet wird, enthält ein Protein, das zum Erkennen der spezifischen Zuckerkettenstruktur von mindestens einem AFP in der Lage ist, wie beispielsweise einem Antikörper oder einem Lektin. Bevorzugte Eigenschaften und spezielle Beispiele der Bestandteile des Reagens wurden vorstehend beschrieben.
Das Kit zur Verwendung in dem Verfahren zum Detektieren einer fetalen Chromosomenanomalie nach der vorliegenden Erfindung enthält: (1) ein Lektin, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der AFP's in der Lage ist, und (2) einen Anti-AFP-Antikörper.
Das Kit enthält außerdem: (1) ein Lektin, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der AFP in der Lage ist, (2) einen Anti-AFP-Antikörper, der zum Binden an allen AFP's unabhängig davon in der Lage ist, ob das Lektin an den AFP's bindet oder nicht, und (3) einen Anti-AFP-Antikörper, der über eine geringe Reaktivität mit einem AFP verfügt, an denen das Lektin gebunden ist, der jedoch über eine hohe Reaktivität mit einem AFP verfügt, an dem das Lektin nicht gebunden ist.
Speziellere Beispiele dafür sind Kits für die Lektin-Affinitätselektrophorese, die ein Agarose-Gel enthalten, das ein vorbestimmtes Lektin enthält, einen Film mit darauf vorbeschichtetem Anti-Human-AFP-Antikörper, eine Lösung, die einen anderen Anti-AFP-Antikörper enthält (einen zweiten Anti-AFP-Antikörper), eine Lösung eines Antikörpers gegen den zweiten Anti-Human-AFP-Antikörper, der mit einem Enzym markiert worden ist, wie beispielsweise POD; eine eine Färbung erzeugende Reagenslösung (z.B. eine reduzierte Form von β-Nicotinamidadenindinucleotid und Nitrotetrazolium Blue (Nitro-TB) in einem solchen Fall, wo das markierende Enzym POD ist), eine wässrige Wasserstoffperoxidlösung, eine Waschflüssigkeit, usw.; und Kits zum Messen von einem oder mehreren AFP's unter Verwendung einer Säule, die ein Agarose-Gel enthält, das ein Lektin enthält, wie beispielsweise LCA, einen Anti-AFP-Antikörper-1 mit einer Separation-verbessernden Substanz [z.B. Ala-(Tyr(SO₃H))₅ oder Ala-(Tyr(SO₃H))₈], die darin eingeführt ist, einen Anti-AFP-Antikörper-2, der mit einem Enzym markiert ist, wie beispielsweise POD, einen Anti-AFP-Antikörper-3 mit einer Substanz, die daran bindet, eine Separation-verbessernde Substanz, die von derjenigen verschieden ist, die an dem Anti-AFP-Antikörper-1 gebunden ist, eine Substratlösung (mit einem Gehalt von 4-Acetamidophenol, einer wässrigen Wasserstoffperoxidlösung, usw. im Fall der Verwendung von POD als die Antikörpermarkierende Substanz), worin der Anti-AFP-Antikörper-1 und der Anti-AFP-Antikörper-2 eine Reaktivität zum Binden an allen AFP's unabhängig davon haben, ob das Lektin an den AFP's gebunden ist oder nicht, und wobei der Anti-AFP-Antikörper-3 eine geringe Reaktivität mit AFP(s) hat, an dem/denen das Lektin gebunden ist, jedoch eine hohe Reaktivität mit AFP(s) hat, zu dem/denen das Lektin keine Affinität hat (bei dem/denen das Lektin nicht bindet).
Bevorzugte Eigenschaften und spezielle Beispiele für die Bestandteile der Kits wurden vorstehend beschrieben.
Die in den vorstehend exemplifizierten Kits enthaltenen Reagenzien können andere Reagenzien enthalten, die üblicherweise auf dem Gebiet zur Anwendung gelangen, wie beispielsweise Puffersubstanzen, Reaktionsbeschleuniger, Zuckersubstanzen, Proteine, Salze, Stabilisiermittel (z.B. Tenside), Antiseptika, usw., die die Stabilität zusammen mit ihnen vorliegenden Reagenzien weder beeinträchtigen noch die Reaktion des/der AFP(s) mit dem Lektin (oder Antikörper) inhibieren. Die Konzentrationen der anderen Reagenzien können in geeigneter Weise in Konzentrationsbereichen gewählt werden, die üblicherweise auf dem Gebiet zur Anwendung gelangen.
Es ist gut bekannt, dass Metall-Ionen, wie beispielsweise Magnesium-Ionen, die Aktivität und Stabilität von Lektinen beeinflussen können. Die Kits können derartige Metall-Ionen enthalten.
Als die Puffersubstanzen, die in dem Reagens oder dem Kit verwendbar sind, lassen sich alle Puffersubstanzen exemplifizieren, die üblicherweise in der Immunoturbidimetrie verwendet werden, der Immunonephelometrie, dem Radioimmunoassay und dem Enzymimmunoassay, wie beispielsweise Tris-Puffer, Phosphat-Puffer, Veronal-Puffer, Borat-Puffer, Good's-Puffer, usw. Der pH-Wert bei der Reaktion zur Messung ist nicht so lange speziell beschränkt, wie er die Antigen-Antikörper-Reaktion nicht hemmt. In der Regel wird ein pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 6 bis 10 gewählt.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend detaillierter unter Bezug auf die "Beispiele" erläutert, die in keiner Weise eine Beschränkung darstellen, sondern nur zur Veranschaulichung präsentiert werden.
Beispiel 1
AFP's in mütterlichem Serum und Fruchtwasser im Fall eines fetalen Down-Syndroms
(1) Proben
Es wurden Seren und Fruchtwasserproben in den Schwangerschaftswochen 15 bis 19 von 17 schwangeren Frauen im Alter von 27 bis 44 Jahren verwendet, bei denen mit Hilfe der Fruchtwasserpunktion bestätigt worden war, dass sie einen Fetus mit Down-Syndrom haben.
Als Referenzproben wurden die Seren und Fruchtwasserproben von 20 normalen schwangeren Frauen verwendet, die sich im gleichen Alter und in der gleichen Schwangerschaftswoche befanden wie diejenigen schwangeren Frauen, die den Fetus mit Down-Syndrom hatten und bei denen durch Fruchtwasserpunktion bestätigt worden war, dass sie einen Fetus ohne Chromosomenanomalie hatten.
(2) Messung der AFP-Gesamtmenge
Es wurde die AFP-Gesamtmenge unter Verwendung eines IMx-AFP-Assaysystems (Abbot Laboratories, IL., USA) nach der in dem beigefügten Dokument beschriebenen Standardprozedur gemessen.
(3) Messung der prozentualen Anteile von AFP-Fraktionen
Auf einem 1%-Agarose-Gel mit einer Dicke von 1 mm, das eine vorbestimmte Konzentration eines vorbestimmten Lektins enthielt, wurden 2 μl der jeweiligen Serumprobe oder der jeweiligen Fruchtwasserprobe verdünnt mit physiologischer Kochsalzlösung bis zu einer AFP-Gesamtkonzentration von etwa 50 ng/ml aufgebracht und eine Elektrophorese unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen ausgeführt, um eines oder mehrere der AFP's zu separieren, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügten (ein solches AFP wird nachfolgend abgekürzt als "Marker"). Sofern als ein Lektin DSA oder RCA-120 verwendet wurden, wurde jede Probe mit Sialidase behandelt und anschließend auf den Agarosefilm aufgetragen. Bedingungen der Elektrophorese:

Temperatur 7°C

Elektrophorese-Dauer 50 min

Pufferlösung 25 mM Barbital/NaOH, pH 8,6

Spannung Konstantspannung von 200 V
Tabelle 1 zeigt ein Lektin das zum Separieren jedes Markers verwendet wurde, und dessen Konzentration in dem Agarose-Gel.
Tabelle 1
Die separierten AFP-Fraktionen wurden auf ein Nitrocellulosefilm übertragen, das mit einem Anti-AFP-(Maus)-monoklonalen Antikörper vorbeschichtet war, und wurden nach der Waschbehandlung weiter umgesetzt mit einem polyklonalen Anti-AFP-(Kaninchen)-Antikörper und einem POD-markierten Anti-(Kaninchen)-IgG-Ziege-Antikörper. Nach der Waschbehandlung wurden die Reaktionsprodukte mit Nitrotetrazolium Blue, NADH, Phenol und Wasserstoffperoxid zur Reaktion gebracht um die AFP-Fraktionen anzufärben. Die Peak-Fläche jeder Fraktion wurde mit einem Densitometer (580 nm) gemessen und der prozentuale Anteil der Fraktion mit Hilfe der folgenden Gleichung berechnet:
prozentualer Anteil der Fraktion (%) = (Peak-Fläche jeder Fraktion/Gesamtpeak-Fläche der Fraktionen) × 100
(4) Ergebnisse
Tabelle 2 zeigt für jeden Marker den Mittelwert ± SD, die von jeder der Gruppe mit fetalem Down-Syndrom und der normalen Gruppe erhalten wurden, sowie die signifikante Differenz darin zwischen den zwei Gruppen. Als ein signifikanter Test wurde der Student's t-Test eingesetzt.
Tabelle 2
Wie aus Tabelle 2 klar ersichtlich ist, hatte im Serum die Gruppe mit dem fetalen Down-Syndrom einen deutlich geringeren Wert der AFP-Gesamtmenge und einen deutlich höheren Wert des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion, als dies bei der normalen Gruppe der Fall war. Die signifikante Differenz zwischen dieser Gruppe und der Normalgruppe in dem prozentualen Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion ist größer als derjenige in der AFP-Gesamtmenge. Obgleich es darüber hinaus keine signifikante Differenz in dem prozentualen Anteil der AFP-C1-Fraktion gab, da die Zahl der Proben klein war, wurde stark angenommen, dass die Gruppe mit dem fetalen Down-Syndrom einen geringeren Wert des prozentualen Anteils der AFP-C1-Fraktion zu haben schien, als dies bei der normalen Gruppe der Fall war.
In ähnlicher Weise hatte die Gruppe mit dem fetalen Down-Syndrom im Bezug auf das Fruchtwasser einen deutlich höheren Wert des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion, einen deutlich geringeren Wert des prozentualen Anteils der AFP (P4+P5)-Fraktion und einen deutlich niedrigeren Wert des prozentualen Anteils der AFP-P4-Fraktion, als dies bei der normalen Gruppe der Fall war. Die signifikanten Differenzen zwischen dieser Gruppe und der normalen Gruppe in allen prozentualen Anteilen der AFP (L2+L3)-Fraktion der prozentualen Anteile der AFP (P4+P5)-Fraktion und der prozentualen Anteile der AFP-P4-Fraktion waren größer als die in der AFP-Gesamtmenge.
Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Berechnung der Empfindlichkeit, der Spezifität und der diagnostischen Effizienz unter Verwendung des Mittelwertes + 2SD oder Mittelwertes – 2SD als Grenzwert für den Fall, dass jeder Marker eine signifikante Differenz in Tabelle 2 zeigt.
Tabelle 3
Aus Tabelle 3 ist klar ersichtlich, dass die diagnostische Effizienz der AFP (L2+L3)-Fraktion in jedem Serum und jeder Fruchtwasserprobe 73% betrug, was am höchste war. Damit bestätigt sich, dass die AFP (L2+L3)-Fraktion sehr nützlich zum Detektieren eines erhöhten Risikos des fetalen Down-Syndroms ist. Mit anderen Worten wurde bestätigt, dass die AFP's, denen Fucose zu GlcNAc am reduzierenden Ende der Zuckerkette durch eine α1→6-Verknüpfung zugefügt wurde, für die Detektion des erhöhten Risikos bei fetalem Down-Syndrom wirksam sind.
Beispiel 2
Der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion in mütterlichen Seren und Fruchtwasserproben einer Gruppe mit fetaler Chromosomenanomalie und einer normalen Gruppe
(1) Proben
Es wurden die Seren unter Fruchtwasserproben von schwangeren Frauen im Alter von 24 bis 44 Jahren in den Schwangerschaftswochen 15 bis 19 untersucht, bei denen sich anhand einer Fruchtwasserpunktion bestätigt hatte, dass sie einen Fetus mit 21-Trisomie oder 18-Trisomie-autosomaler Anomalie oder einer geschlechtschromosomalen Anomalie hatten.
Als Referenzproben wurden die Seren und Fruchtwasserproben normaler schwangerer Frauen verwendet, die sich im gleichen Alter und der gleichen Schwangerschaftswoche befanden wie diejenigen schwangeren Frauen, die den Fetus mit 21-Trisomie oder 18-Trisomie hatten und bei denen sich mit Hilfe der Fruchtwasserpunktion bestätigt hatte, dass sie einen Fetus ohne Chromosomenanomalie hatten.
(2) Messung des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion
Es wurden AFP-Fraktionen unter Verwendung von AFP-L3 Test Wako (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) nach der in dem beigefügten Dokument beschriebenen Standardprozedur separiert. Die Peak-Fläche jeder AFP-Fraktion wurde mit einem Densitometer (580 nm) gemessen und der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion in der gleichen Weise berechnet, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde.
(3) Ergebnisse
Tabelle 4 zeigt den Mittelwert ± SD, die aus jeder Gruppe erhalten wurden, sowie die signifikante Differenz darin aus der normalen Gruppe. Als ein signifikanter Test wurde der Student's t-Test eingesetzt.
Tabelle 4
Aus Tabelle 4 ist klar ersichtlich, dass in der Gruppe mit 21-Trisomie (Down-Syndrom) der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion in jedem Serum und jeder Fruchtwasserprobe signifikant hoch ist. In der Gruppe mit geschlechtschromosomaler Anomalie ist der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion im Fruchtwasser signifikant gering.
Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse der Berechnung der Empfindlichkeit, Spezifität und diagnostischen Effizienz unter Verwendung des spezifischen Anteils von AFP (L2+L3) als Grenzwert, wodurch die diagnostische Effizienz auf ein Maximum für den Fall gebracht werden kann, dass die jeweilige Gruppe eine signifikante Differenz in Tabelle 4 zeigt.
Tabelle 5
Wie aus Tabelle 5 klar ersichtlich ist, wurde die Nützlichkeit des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion in jedem der Seren und der Fruchtwasserproben, mit anderen Worten die Nützlichkeit der AFP's, die über den GlcNAc am reduzierenden Ende der Zuckerkette durch α1→β6-Verknüpfung hinzugefügte Fucose verfügten, in der Detektion eines erhöhten Risikos der 21-Trisomie oder geschlechtschromosomalen Anomalie bestätigt.
Beispiel 3
Die AFP-Gesamtmenge und der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion in mütterlichem Serum im Fall des fetalen Down-Syndroms
(1) Proben
Es wurden die Seren von 18 schwangeren Frauen im Alter von 27 bis 44 Jahren in der 15. bis 19. Schwangerschaftswoche verwendet, bei denen sich anhand der Fruchtwasserpunktion bestätigt hatte, dass sie einen Fetus mit Down-Syndrom hatten.
Als Referenzproben wurden die Seren von 70 normalen schwangeren Frauen verwendet, die sich im gleichen Alter und der gleichen Schwangerschaftswoche befanden, wie diejenigen schwangeren Frauen, die den Fetus mit Down-Syndrom hatten und bei denen mit Hilfe der Fruchtwasserpunktion bestätigt worden war, dass sie einen Fetus ohne chromosomaler Anomalie hatten.
(2) Messung der AFP-Gesamtmenge
Die AFP-Gesamtmenge wurde unter Verwendung eines Imx AFP-Assaysystems (Abbott Laboratories, IL., USA) nach der in dem beigefügten Dokument beschriebenen Standardprozedur gemessen.
(3) Messung des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion
Es wurden AFP-Fraktionen unter Verwendung von AFP-L3-Test Wako (verfügbar bei Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) nach der in dem beigefügten Dokument beschriebenen Standardprozedur separiert. Die Peak-Fläche jeder AFP-Fraktion wurde mit einem Densitometer (580 nm) gemessen und der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion in der gleichen Weise berechnet, wie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Als ein signifikanter Test wurde der Student's-t-Test eingesetzt.
(4) Ergebnisse
1(a) und 1(b) zeigen die Verteilungen der AFP-Gesamtmenge und des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion in mütterlichem Serum in der jeweiligen normalen Gruppe und der Gruppe mit Down-Syndrom.
Aus den in diesen Figuren gezeigten Ergebnissen kann entnommen werden, dass es sowohl in der AFP-Gesamtmenge als auch in dem prozentualen Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion eine signifikante Differenz zwischen der Gruppe mit fetalem Down-Syndrom und der normalen Gruppe gab.
Tabelle 6 zeigt die Empfindlichkeit, Spezifität und diagnostische Effizienz der AFP-Gesamtmenge und des prozentualen Anteils der AFP (L2+L3)-Fraktion, die unter Annahme der Grenzwerte der AFP-Gesamtmenge und des prozentualen Anteils von AFP (L2+L3)-Fraktion als 24 ng/ml bzw. 42% berechnet wurden.
Tabelle 6
2(a) und (b) zeigen mit einem Receiver erhaltene Kennlinien (ROC) für den Fall der AFP-Gesamtmenge und dem prozentualen Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion.
Auf der Grundlage der 2(a) und (b) wurden die AUC-Werte ("area under the curve", Fläche unterhalb der Kurve) mit 0,700 bzw. 0,835 im Fall der AFP-Gesamtmenge bzw. der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion berechnet. Aus den vorgenannten Fakten kann entnommen werden, dass der prozentuale Anteil der AFP (L2+L3)-Fraktion für die Detektion des erhöhten Risikos des Down-Syndroms nützlicher ist als die AFP-Gesamtmenge und eine genauere Diagnose erlaubt als die AFP-Gesamtmenge.
Die vorliegende Erfindung gewährt ein Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie, ausgewählt aus einer autosomalen Anomalie und einer geschlechtschromosomalen Anomalie, das keinerlei unerwünschten Einfluss auf eine schwangere Frau und ihren Fetus hat, eine hohe Zuverlässigkeit der Untersuchungsergebnisse gewährt und einfach ist.

Claims

Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie, ausgewählt aus einer autosomalen Anomalie und einer geschlechtschromosomalen Anomalie, welches Verfahren umfasst: (a) Separieren von in einer Probe einer Körperflüssigkeit vorhandenen α-Fetoproteinen auf der Grundlage des Unterschiedes zwischen oder unter deren Zuckerkettenstruktur unter Verwendung eines Proteins, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der α-Fetoproteinen in der Lage ist, wobei die Probe der Körperflüssigkeit von einer zu diagnostizierenden schwangeren Frau erhalten wird; (b) Messen der Menge von oder im Verhältnis zu den separierten Gesamt-α-Fetoproteinen des Anteils von einem oder mehreren α-Fetoprotein(en) das/die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, die in der Probe der Körperflüssigkeit vorliegen; (c) Vergleichen der auf diese Weise erhaltenen Menge(n) oder des/der Anteils/Anteile von spezifischen α-Fetoproteinen gegen einen Bezugsstandard, wobei der Bezugsstandard die Menge(n) oder der/die Anteile) der spezifischen α-Fetoproteinen ist/sind, die unter Einsatz der vorgenannten Verfahrensschritte (a) und (b) erhalten wurde(n), indem eine Probe der Körperflüssigkeit verwendet wurde, die von einer schwangeren Frau mit weitgehend dem gleichen Alter und der Zahl der Schwangerschaftswochen die zu diagnostizierende schwangere Frau und von deren Fetus mit Hilfe der Fruchtwasserpunktion bestätigt worden ist, dass sie keine Chromosomenanomalie hat; und (d) Ermitteln eines erhöhten Risikos auf der Grundlage einer Differenz zwischen der/den gemessenen Menge(n) oder Anteils/Anteile und dem Referenzstandard.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die α-Fetoproteine, die über eine spezifische Zuckerkettenstruktur verfügen, solche sind, die einen biantennaren Typ der Zuckerkette haben oder eine Zuckerkette, die durch Umwandlung der Zuckerkette vom biantennaren Komplex-Typ gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem das Protein, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette in der Lage ist, Lens culinaris-Agglutinin, erythroagglutinierendes Phytohämagglutinin-E4 oder Concanavalin A ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Körperflüssigkeit Fruchtwasser, Plasma oder Serum ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei welchem die Körperflüssigkeit von einer schwangeren Frau in der 10. bis 20. Woche der Schwangerschaft abgenommen wird.
Verwendung eines Reagens in einem Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie nach Anspruch 1, wobei das Reagens ein Protein aufweist, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette mindestens eines der α-Fetoproteine in der Lage ist.
Verwendung nach Anspruch 6, worin die spezifische Zuckerkette von α-Fetoproteinen eine Zuckerkette vom biantennaren Komplex-Typ ist oder eine Zuckerkette ist, die durch Umwandlung der Zuckerkette des biantennaren Komplex-Typs erzeugt wird.
Verwendung nach Anspruch 6, worin das Protein, das zum Erkennen einer spezifischen Kette in der Lage ist, Lens culinaris-Agglutinin, erythroagglutinierendes Phytohämagglutinin-E4 oder Concanavalin A ist.
Verwendung eines Kits in einem Verfahren zum Detektieren eines erhöhten Risikos einer fetalen Chromosomenanomalie nach Anspruch 1, wobei das Kit aufweist: (1) ein Lektin, das zum Erkennen einer spezifischen Zuckerkette von mindestens einem der α-Fetoproteine in der Lage ist, und (2) einen Anti-α-Fetoprotein-Antikörper.
Verwendung nach Anspruch 9, worin der Anti-α-Fetoprotein-Antikörper ein Anti-α-Fetoprotein-Antikörper ist, der zum Binden an allen α-Fetoproteinen unabhängig davon in der Lage ist, ob das Lektin an α-Fetoproteinen bindet oder nicht, und wobei das Kit ebenfalls einen Anti-α-Fetoprotein-Antikörper enthält, der über eine geringe Reaktivität mit α-Fetoprotein(en) verfügt, an denen das Lektin gebunden ist, der jedoch über eine hohe Reaktivität mit α-Fetoprotein(en) verfügt, an denen das Lektin nicht bindet.
Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, worin das Lektin Lens culinaris-Agglutinin ist, erythroagglutinierendes Phytohämagglutinin-E4 oder Concanavalin A.