KR20210133391A - 진주 추출에 의해 진주층의 모든 성분을 포함하는조성물이용하여 얻은 조성물,및 화장품 및 피부 의학에서의 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 a) 진주층을 입자 크기 분포가 약 1∼약 300㎛인 분말로 분해시키는 단계, b) 얻은 진주층 분말을 하나 이상 의 콜라겐, 하나 이상의 프로테오글리칸 또는 이들의 혼합물로 된 글리콜 수용액 형태의 추출제와 밀접하게 접촉시키는 단계, 및 c) 밀접하게 접촉시켜 형성되고, 원하는 조성물을 이루는 추출 혼합물을 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징 으로 하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 조성물은 피부 및/또는 피부 부속 기관에 대하여 매우 재미있는 특성, 특히 예를 들면 상처 치유를 향상시킬 수 있는 조직 재생 특성, 및 피부 및/또는 피부 부속 기관의 노화에 관련된 작용 을 예방하고/하거나 눈에 보이게 감소시키기 위한 노화 방지 특성을 갖고 있다.

Description

진주 추출에 의해 진주층의 모든 성분을 포함하는조성물이용하여 얻은 조성물,및 화장품 및 피부 의학에서의 이의 용도{Method for preparing a composition by mother-of-pearlextraction, comprising integrally mother-of-pearlcomponents, composition obtained by said method anduse thereof in cosmetics and dermatology}

본 발명은 진주층의 모든 성분, 하나 이상의 콜라겐 및 하나 이상의 프로테오글리칸을 포함하는 조성물의 제조방법, 상 기 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 조성물, 및 약제 및 미용 분야, 특히 피부 및/또는 표층 피부 성장의 노화 작용에 대 항하기 위한 조성물의 용도에 관한 것이다.

포유동물은 여러 층으로 구성되는 고도로 구성된 조직이지만 체외 환경의 변화로 인한 공격에 민감한 피부로 이루어지 는 배리어에 의해 외부 환경으로부터 보호된다. 이러한 상황은 어류와 개구리가 점액을 분비하기 때문에 동물계에 있어 서 유일하며, 조류는 깃털로 커버되고, 사람과의 동물을 제외하고는, 서브포유동물 및 포유동물의 척주동물은 털로 커 버되어 있다.

사람은 이러한 보호 속성을 잃어 버렸다: 사람은 공격 및 노화에 대항하는 것을 돕도록 보호되어야 하고 자극될 수 있는 피부를 갖고 있다.

특히, 노화는 특히 피부를 얇게 하고 탄력을 잃게 하는 생리적 현상으로, 특히 약간의 깊은 주름을 생기게 하는 것으로 알려져 있다. 피부면의 느슨함이나 건조 및 무질서한 색소 침착도 관찰될 수 있다.

피부는 3개의 층, 표피, 진피 및 깊은 하피로 구성된다.

진피를 기밀하게 커버하는 피부의 최외 보호 외피, 표피는 표면에서 각질층으로 구성되어 있다. 각질층은 2개의 층: 표 면에서 박리 특성을 나타내는 박탈층 및 배리어 역할을 하는 가장 깊은 치밀층. 표면에 있기 때문에 육안으로 관찰하기 용이한 표피는 많은 연구 대상이었다. 공지된 반응은 체외 환경의 특정 시약으로 인한 것이나 다양한 발생원의 활성물 질의 사용으로 인한 것이다. 표피 세포는 표피와 진피를 분리하는 기저막에 위치하는 기저층 세포의 활성에서 유래된 것이다.

진피는 섬유 아세포의 생합성 활성으로 유래한 것으로, 세포외 기질의 성분을 생산한다. 세포외 기질은 4개의 주요 고 분자 패밀리로 구성된다: 콜라겐, 엘라스틴, 구조 글리코프로테인 및 프로테오글리칸. 진피는 표피에 의해 주어진 신호 에 응답할 능력을 갖고, 또한 이에 응하여 표피에 신호를 보낸다. 일반적으로, 이러한 여러 진피층 및 표피층 사이에 교 환이 일어나는데, 세포 재생, 및 외층의 유착 및 보습을 확보하기 위한 것이다.

많은 활성제가 노화 작용을 예방하거나 지연시키기 위해 제안되어 있다.

학 및 통상적인 약전의 초기 이래 진주층이 사용되어 왔다. 또한, 진주층은 이의 골격 재생 특성 이 있는 것으로 알려져 있다.

특히, 진주층 또는 패각을 가진 아라고나이트(aragonite)가 생물성 광물 생성물인 것으로 알려져 있고, 이는 전체 질량 (참조문헌: Taylor et al, Bulletin of the British Museum(Natural history) Zoology. Suppl. 3125pp. +29 Pla tes, 1969)의 약 1.7∼2%를 나타내는 섬유상 물질 및 비섬유상 물질로 된 유기 기질과, 미량원소(나트륨, 마그네슘, 란탄, 아연, 브롬, 세슘, 철, 망간, 염소, 구리, 칼륨, 칼슘, 스트론튬 및 황)과 결합된 아라고나이트로 명명되는 사방정 계 형태로 결정화된 탄산칼슘으로 구성된다. 보다 구체적으로는, 진주층의 전체 유기상은 특히 히드록시프롤린 및 히드 록시리신이 결핍된 원종 콜라겐으로 이루어지는 섬유상 프로테인 및 비섬유상 프로테인으로 구성되는 유기 기질 형태 이다. 약 50%의 진주층의 유기 기질은 수용성을 나타내고, 나머지 50%는 다만 탈석회 반응후에 얻어질 수 있다.

그러나, 예를 들면 WO 97/23231호에 기술된 바와 같이, 진주층 분말을 분말체, 불활성 희석제 또는 부형제와 혼합하 여 얻어진 종래기술의 제품은 분말 형태의 진주층의 존재로 인해 바람직하지 않은 피부 자극 현상을 일으킨다(특히, 이

의 주성분, 아라고나이트 또는 CaCO 3 ). 따라서, 이 제품 중의 진주층의 함량이 이러한 자극 현상을 피하도록 극히 한

정되어야 한다는 것이다

이러한 바람직하지 않은 자극 현상은 특히 피부와 접촉하는 지나치게 염기성인 이들 공지의 제품의 pH로 인한 것이다. 또한, 진주층 분말을 기제로 하는 공지의 제품은 특히 안정성(에멀젼의 파괴) 및 염기도가 덜한 값으로 pH를 조정하는 특이적 제형 문제점을 갖고 있다.

또한, WO 97/24133에는 진주층 분말을 순수, 재증류수 또는 비발열성 물 중에서 선택되고, 임의로 염이 보충되는 수 용매와 접촉시킨 다음에, 수용성 분획만을 회수하도록 분리되므로, 진주층의 수불용성 유기상 및 무기 성분이 실제로 결핍되는 진주층으로부터 생물 활성 물질을 제조하는 방법이 기재되어 있다. 따라서, 이 방법에 의해서는, 특히 진주층 의 성분 전체, 특히 진주층의 전체 유기상을 포함하는 조성물을 제조할 수 없다.

상당히 의외로, 특수 방법의 이행으로 적어도 진주층의 모든 성분은 물론, 특히 피부 및/또는 표층체(superficial bod y) 성장의 노화에 관한 작용을 예방하고/하거나 눈에 보이게 감소시키기 위해, 적어도 진주층의 성분의 활성을 가능하 게 하거나, 심지어는 상승 작용을 제공할 수 있는 특정 화합물과의 유리한 결합을 포함하는 신규한 조성물을 얻을 수 있 음을 주목해야 한다.

발명의 목적은 a) 진주층을 입자 크기가 약 1∼약 300㎛인 분말로 분해시키는 단계, b) 이렇게 하여 얻은 진주층 분말을 하나 이상의 콜라겐, 하나 이상의 프로테오글리칸 또는 이들의 혼합물로 된 글리콜 수용액 형태의 추출 제와 밀접하게 접촉시키는 단계, 및 c) 밀접하게 접촉시킨 결과로서 형성되고, 원하는 조성물을 이루는 추출 혼합물을 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조방법이다.

본 발명의 방법에 의해, 단계 b)에서 얻은 추출 혼합물 형태의 조성물을 얻을 수 있다.

본 발명의 방법의 이행시에 사용되는 진주층은 진주양 연체동물 및 몇몇 두족류의 동물(예를 들면 앵무조개)의 껍질로 부터 얻어질 수 있다. 특히, 핀크타다 맥시마(Pinctada maxima) 등의 굴로부터 얻어진다.

다른 다당류 및 방해석이 풍부한 껍질 원소를 함유하지 않는 생 진주층이 사용된다. 출발물질은 백색 진주층인 것이 바 람직하고, 그렇지 않으면 과민성을 유발할 수 있는 색소를 제거하는 단계가 제공되어야 한다.

이것은 입수용이한 원료로, 이의 사용은 자연 집단에 부정적인 영향을 주지 않는다. 실제로는, 대부분의 굴 또는 기타 진주양 연체동물이 양식된다.

또한, 추가 이점은 원료가 진주를 생산하는 굴 껍질로부터 얻어질 수 있는 사실에 기인하는 것으로, 구체적으로는 진주 조개는 두꺼운 층으로 된 우수한 품질(등급 A)의 진주층을 가지고 있지만, 기껏해야 3개의 진주가 연속하여 생성된 후 에 생산 풀로부터 제거된다. 따라서, 본 발명은 진주 양식의 진주층 다운스트림을 사용하기 위한 특별한 기회를 제공한 다.

본 발명의 방법을 수행하는데 사용되는 진주층의 입자 크기는 사별(sieving) 기술 및/또는 레이저 판독 기술 등과 같은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 범위내의 통상적인 수단으로 측정된 바와 같이, 약 1∼약 300㎛이다.

본 발명의 방법에 대한 특정한 실시형태에 따르면, 진주층은 입자 크기가 약 50∼약 100㎛인 분말로 분해된다.

본 발명의 방법에 대한 또 하나의 실시형태에 따르면, 입자 크기가 약 15∼약 50㎛인 분말로 분해되는데, 이는 결정 단 위(예를 들면, 핀크타다 맥시마 유래의 진주층의 원소 단위는 바이오크리스탈, 9∼12㎛로 된 아라고나이트의 매우 부 피가 큰 육각형 결정이다)의 크기와 거의 같게 함으로써 수율을 향상시킬 수 있다.

하기 절차는 특히 본 발명의 방법의 단계 a)에 따라 진주층을 분말로 분해시키도록 수행된다.

제 1 상에서, 껍질(페리오스트라쿰(periostracum))의 외부는 분쇄 또는 다른 비변성법에 의해 생 진주층으로부터 제 조된다.

그 다음에, 진주층 시트는 분쇄에 의해 미분화를 수행할 수 있도록 단편으로 분해된다. 미분화하도록 사용된 단편은 길 이가 약 2∼5㎝인 것이 바람직하고, 두께가 약 0.3㎝이다.

제 2 상에서, 단편은 미분화된다.

진주층은 사전에 오염 제거를 하지 않고서도 사용될 수 있다. 사전의 오염 제거인 경우에는, 활성 염소(12° ) 6.6%의 하이포아염소산나트륨 용액 중에 단편을 침지시키지 않고서 매우 신속한 오염 제거 워시가 수행된다. 건조는 모든 물 흔적량을 제거하도록 일시적으로 행해져야 한다.

다만 이를 위해 보관되어 있는 지르코늄 자(jar)에서 건조 상태에서 분쇄가 행해지고, 세정하며(표백제를 함유하는 물 로 헹군 다음, 증류수로 세정), 사전에 고온 살균해야 한다. 파쇄는 그 자체가 멸균된 지르코늄 볼로 행해진다.

분말로 분해된 진주층 원료는 2개의 상이한 방식으로 멸균될 수 있다:

2.5M㎭의 γ 선을 조사하여 멸균,

100℃의 오토클레이브에서 1∼2시간 고온 멸균. 진주층은 약 250℃이후(참조문헌: Balmain, Hannoyer and Lopez, " Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and X-ray diffraction analyses of mineral and organic m atrix during heating of Mother of Pearl (nacre) from the shell of the mollusc Pinctada Maxima" , J. Biome d. Mater. Res. (Appl. Biomater.), vol. 48(5): 749-754, 1999)에만 분해된다(무기 기질 및 유기 기질). 따라서, 이와 같은 멸균은 이의 여러 성분을 파괴하지 않는다.

본 발명의 방법의 단계 b)는 상술한 진주층 분말을 하나 이상의 콜라겐, 하나 이상의 프로테오글리칸 또는 이들의 혼합 물로 된 글리콜 수용액 형태의 추출제와 밀접하게 접촉시키는 것이다.

본 발명에 따라, 용어 " 글리콜 수용액" 은 글리콜 수용매, 즉 일반적으로 물과 하나 이상의 글리콜의 혼합물 형태의 용 매를 사용하여 얻어진 콜라겐과 프로테오글리칸의 용액을 의미하는 것으로 쓰인다.

용어 " 글리콜" 은 공지된 방법으로 2개의 알콜 작용기를 갖는 화합물을 의미하는 것으로 사용된다. 특히, 사용될 수 있 는 글리콜은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.

글리콜 수용매를 형성하도록 사용될 수 있는 물은 순수, 재증류수 또는 탈염수, 아니면 탈이온수일 것이다.

글리콜 수용매 중의 물:글리콜 중량비는 약 1:100∼약 100:1인 것이 바람직하고, 특히 바람직하게는 약 1:1∼약 20: 1이다.

추출제는 하나 이상의 콜라겐으로 된 글리콜 수용액인 것이 바람직하다.

본 발명에 따라 글리콜 수용액에 사용될 수 있는 콜라겐은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 동물계에서 이용할 수 있는 결합조직 의 세포내 물질을 구성하는 모든 콜라겐일 수 있다.

특히, 해수 콜라겐, 해초 등의 해수원 유기체로부터 유도된 콜라겐으로 된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 해수 콜라겐은 어류의 결합조직의 주성분으로, 피부, 근육, 힘줄 및 인대의 조직에 불가결한 역할을 이행한다.

특히, 해수 콜라겐 " 판코젠(PANCOGENE) R 마린(MARIN)" (the company 제, Saint Priest, France), IN

CI 명: " 솔루블(Soluble) 콜라겐" (referencimg in Japan: " water soluble collagen" ; MHV: 20800CZY001000 0)을 들 수 있다. 분류 텔레오스테이(Teleostei)에 속하는 온난한 해수의 어류의 비보호종의 피부에서 추출된 콜라겐 이다.

특히, 해수 콜라겐 " 콜라젠 나티프 마린(COLLAGENE NATIF MARIN)-코드 690" (the company Laboratoire In dustriel de Biologie(Soisy Sous Montmorency, France)제, CTFA 명: " 아미노 콜라겐 아미노산" 을 들 수 있다. 어류 피부에서 추출된 수용성 산 콜라겐이다.

바람직하게는, 사용되는 콜라겐 농도는 추출제의 전체 중량에 대하여, 약 0.0001∼약 50중량%이고, 특히 약 0.01∼약 15중량%이다.

추출제는 또한 하나 이상의 프로테오글리칸으로 된 글리콜 수용액이다.

본 발명에 따라 추출제의 글리콜 수용액에 사용될 수 있는 프로테오글리칸은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 프로 테오글리칸, 특히 황을 함유하지 않는 프로테오글리칸일 수 있다.

특히, 프로테오글리칸은 히알루론산, 콘드로이틴술페이트, 더마탄(dermatan)술페이트, 헤파란술페이트, 케라탄술페이 트 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹 중에서 선택된다.

히알루론산은 가장 바람직하다(the company Laboratoire Industriel de Biologie(Soisy Sous Montmorency, Fra nce) 제).

사용되는 프로테오글리칸은 추출제의 전체 중량에 대하여, 바람직하게는 약 0.0001∼약 40중량%이고, 특히 약 0.01 ∼약 10중량%이다.

물론, 추출제로는 또한 후술되는 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 제조된 조성물의 가능 용도를 고려하거나 추출단계 자체에 적합한 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 추가 화합물을 들 수 있다. 따라서, 추출제는 예를 들면 EDTA(에 틸렌디아민테트라아세트산) 등의 착물화제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 의하면, 진주층 분말은 전체 중량에 대하여, 상술한 바와 같이, 단계 a)에서 얻어 진 진주층 분말 약 20∼약 60중량% 및 상술한 바와 같이 추출제로서의 잔여부를 포함하도록, 진주층 분말 및 추출제로 이루어지는 혼합물을 제조함으로써 단계 b)에 따라 추출제와 밀접하게 접촉된다.

진주층 분말은 진주층 입자의 추출 코팅을 행하도록, 특히 격렬하게 균질하게 기계적으로 교반하면서 추출제에 진주층 분말을 현탁시킴으로써 본 발명의 방법의 단계 b)에 따라 추출제와 밀접하게 접촉될 수 있다.

예를 들면, 주변온도, 즉 약 20℃에서 약 1시간 동안 행해지나, 기간 및 온도는 특히 진주층 분말의 출발 입자 크기에 따라 당해 기술분야의 숙련가에 의해 조정될 수 있다.

또 하나의 실시형태에 따르면, 접촉시키기 위한 단계 b)는 압력하에 추출제를 고정된 진주층을 통과시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 고정은 임의로 예를 들면 추출제를 양호하게 확산시키고 진주층의 치밀화를 피하게 하는 충전제와의 혼합물에 HPLC 타입의 컬럼을 사용하여 행해질 수 있다.

그러나, 특수 이론에 결부시키지 않고, 추출제 중의 콜라센 및 프로테오콜라겐, 특히 해수 콜라겐 및 히알루론산 콜라겐 의 존재는 친화도의 물리화학적 현상을 통해 진주층에 존재하는 관련 화합물의 추출을 향상시키고, 그리하여 진주층으 로부터 추출되는 성분의 효과의 상승 작용을 향상시키는 것으로 추정된다. 특히, 진주층의 원종 콜라겐의 추출이 해수 콜라겐의 존재에 의해 향상되고, 유착 프로테인(데코린 및 사이토킨) 및 진주층의 프로테오콜라겐이 선택된 프로테오 글리칸의 존재에 의해 향상되는 것으로 추정된다.

아무튼, 실제로 완전한 추출을 이루기에 충분한 기간 동안에 소정 온도에서 밀접한 접촉이 일어나는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, 용어 " 실제로 완전한 추출" 은 추출제와 접촉할 때에 진주층으로부터 모든 추출가능한 성분의 추출 을 의미하는 것으로 나타낸다.

즉, 수용성 글리콜 액체상 중의 콜라겐이나 프로테오글리칸의 전체 농도에 대한 평형은 상기 " 실제로 완전한 추출" 의 달성에 해당한다.

따라서, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 범위내에서, 예를 들면 수용성 글리콜 액체상 중의 이들 전체 콜라겐이나 프로테오글리칸 농도를 일정하게 측정함으로써, 이러한 추출의 " 실제로 완전한" 특성을 결정하는 것이다.

아무튼, 접촉시키는 단계는 이를 종료하기 전에, 추출제 중의 진주층 분말의 현탁액이 정치되는(교반이 억제되는) 기간 을 포함할 것이다.

접촉시키는 단계 b)의 종료시에, 접촉시킨 결과로서 형성되는 추출 혼합물이 회수된다.

글리콜 현탁액 형태의 이러한 조성물은 사용전에 현 상태로 저장될 수 있다. 후속 이행(저장, 운반, 제형화 등)의 실제 이유로는, 이러한 조성물의 액체상을 고체상과 분리할 수 있다.

따라서, 한 변형체에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 b)의 종료시에, 원하는 조성물로 구성되는 밀접하게 접촉시킨 결과 로서 형성된 추출 혼합물이 회수되고, 조성물의 액체상이 한외여과 수단, 접선 여과 수단 등과 같은 당해 기술분야의 숙 련가에게 공지된 수단에 의해 고체상과 분리되는 것을 특징으로 한다.

이렇게 하여 분리된 고체상과 액체상이 함께 상술한 바와 같이 제조된 조성물을 구성하는 것으로 인지된다. 따라서, 이 러한 조성물을 약제학적으로 또는 미용상 적절한 부형제와 함께 사용하는 후속 제형화시에, 조성물이 제형화의 편의 도 모상의 이유로 동시에 또는 시간에 걸쳐 분리하여 각각의 고체상과 액체상을 첨가함으로써 제형화 단계시에 재구성될 있는 것으로 추정된다. 상기와 같이 주어지면, 본 발명의 주제가 상술한 분리단계의 종료시에 얻어진 것과 같은 액체상 인 것으로 여겨진다. 유사하게, 본 발명의 주제는 상술한 분리단계의 종료시에 얻어진 것과 같은 고체상이다.

본 발명의 주제는 상술한 바와 같은(상술한 바와 같은 분리단계를 포함하거나 포함하지 않는 고체상과 액체상을 포함) 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 신규 조성물이다.

- 6 -

-----------------------------------------------------Page 6-----------------------------------------------------

?

공개특허 특2002-0047214

특히, 이 조성물은 적어도 아라고나이트(CaCO 3 ); 나트륨, 마그네슘, 란탄, 아연, 브롬, 세슘, 철, 망간, 염소, 구리, 칼

륨, 칼슘, 스트론튬, 황 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 미량원소; 진주층, 특히 추출제의 해수 콜라 겐과 관련된 진주층의 원종 콜라겐 유래의 섬유상 프로테인(후술하는 도 1 참조); 비섬유상 프로테인, 특히 데코린 등 의 유착 콜라겐과 관련된 프로테인(후술하는 도 2 참조); 진주층에서 유도되지 않은 하나 이상의 콜라겐 및/또는 진주 층에서 유도되지 않은 하나 이상의 프로테오글리칸을, 액체상과 고체상의 글리콜 현탁액 형태로 포함하는 것을 특징으 로 한다.

물론, 본 발명에 따르면, 용어 " 진주층에서 유도되지 않은 콜라겐" 및 " 진주층에서 유도되지 않은 프로테오글리칸" 은 각각 본 발명의 방법의 단계 b)의 추출제용으로 사용되는 콜라겐 및 프로테오글리칸을 의미하는 것으로 사용된다. 유사 하게는, 용어 " 글리콜 현탁액" 은 본 발명의 조성물이 가용성 성분(글리콜 현탁액 중의) 뿐만 아니라, 불용성 성분(특 히 아라고나이트)도 포함할 있다는 사실에 의해 설명된다.

또한, 본 발명의 방법에 대하여 상술한 내용이 물론 이 조성물에 우선적으로 적용된다.

따라서, 특히, 본 발명의 조성물 중의 진주층에서 유도되지 않은 콜라겐은 해수 콜라겐인 것이 바람직하고, 특히 " 판코

젠 R 마린" , " 콜라젠 나티프 마린-코드 690" 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 해수 콜라겐인 것이

바람직하다. 유사하게는, 진주층에서 유도되지 않은 프로테오글리칸은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 프로테오글 리칸, 특히 황을 함유하지 않는 프로테오글리칸일 수 있고, 특히 히알루론산, 콘드로이틴술페이트, 더마탄술페이트, 헤 파란술페이트, 케라탄술페이트 및 이들의 혼합물로 구성되는 그룹 중에서 선택되며, 히알루론산이 가장 바람직하다.

후술하는 실시예에서 더욱 상세히 나타낸 바와 같이, 이 조성물은 예를 들면 향상된 상처 치유를 가져오고, 피부 및/또 는 표층체 성장의 노화에 관련된 작용을 예방하고/하거나 눈에 띠게 감소시킬 수 있는 노화방지를 가져오는 피부 및/또 는 표층체 성장, 특히 조직 재생 특성에 관하여 매우 유리한 특성을 갖는다. 피부의 여러 세포종에 대한 이의 작용은 이 의 각종 성분간의 생리적 평형의 수복 및 조절 중의 하나이다. 특히, 이의 유기 및 무기 성분은 특히 케라티노사이트 대 사에 대하여 여러 레벨로 작용한다. 이 조성물에 의해, 표피를 재구성하여, 가장 깊은 층의 우수한 보호에 기여한다. 표 피는 진피보다 저항성이 크고 깊으며, 진피와 연속적으로 상호작용한다. 또한, 이 조성물에 의해, 엘라스틴 및 콜라겐이 풍부해진다. 피부는 더욱 탄력있고 단단하다. 저항성을 나타내고 이의 성분은 지속된 리듬에서 재생된다. 최종적으로, 이 조성물은 완전히 무해하고, 항염증성의 이점을 가지므로, 진정 효과를 나타낸다.

따라서, 본 발명의 주제는 또한 본 발명의 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 유효성분으로서의 신규 조 성물 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약제 조성물이다.

약제학적으로 허용가능한 부형제는 피부 의학용으로 적합한 부형제인 것이 바람직하다.

본 발명의 주제는 피부 및/또는 표층체 성장의 조직 재생 질환 치료용으로 사용되는 의약품을 제조하기 위한, 상술한 바 와 같은 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 신규 조성물의 용도이다.

또한, 본 발명의 주제는 피부 및/또는 노화에 관련된 표층체 성장의 질환 치료용으로 사용되는 의약품을 제조하기 위한, 상술한 바와 같은 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 신규 조성물의 용도이다.

최종적으로, 본 발명의 주제는 염증성 피부 증상의 치료용으로 사용되는 의약품을 제조하기 위한, 상술한 바와 같은 방 법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 신규 조성물의 용도이다.

본 발명의 주제는 본 발명의 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 미용상 유효성분으로서의 신규 조성물 및 미용상 허용가능한 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 미용 조성물이다.

당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 미용상 부형제가 사용될 수 있다.

물론, 본 발명의 미용 조성물은 또한 보습제, 연화제 또는 화학 또는 유기 발연제 등의 당해 기술분야의 숙련가에게 공 지된 미용 타입의 성분을 함유할 수 있다.

상술한 약제 및 미용 조성물은 특히 크림, 연고, 겔, 로션, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼 형태이거나, 리포솜 등의 약제학적으로나 미용상 허용가능한 벡터와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명의 주제는 피부 및/또는 표층체 성장의 조직 재생의 미용 치료용으로 사용되는 미용 조성물을 제조하기 위 한, 본 발명의 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 신규 조성물의 용도이다.

또한, 본 발명의 주제는 피부 및/또는 표층체 성장의 노화와 관련된 변이의 미용 치료용으로 사용되는 미용 조성물을 제 조하기 위한, 본 발명의 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 신규 조성물의 용도이다.

최종적으로, 본 발명의 주제는 본 발명의 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 신규 조성물이 피부 및/또 는 표층체 성장에 사용되는 것을 특징으로 하는 피부 및/또는 표층체 성장의 조직 재생의 미용 치료 방법이다.

또한, 본 발명의 주제는 본 발명의 방법을 이용하여 얻어질 수 있는 상술한 바와 같은 신규 조성물이 피부 및/또는 표층 체 성장에 사용되는 것을 특징으로 하는 피부 및/또는 표층체 성장의 노화에 관련된 변이의 미용 치료 방법이다.

도면의 간단한 설명

도 1 및 도 2는 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 조성물의 웨스턴 블롯을 나타내고,

도 3은 본 발명의 방법을 이용하여 제조된 조성물의 프로테인 상에 대한 전체 아미노산 조성의 히스토그램을 나타내며,

도 4 및 도 5는 사람 케라티노사이트에 의한 사이토케라틴 합성에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효과를 예시하 는 사진이고,

도 6 및 도 7은 에스트라디올이 사용 중지된 배양의 사람 케라티노사이트에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효과 를 예시하는 사진이며,

도 8 및 도 9는 에스트라디올이 사용 중지된 배양의 사이토케라틴 합성에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효과를 예시하는 사진이고,

도 10 및 도 11은 사람 섬유 아세포에 의해 엘라스틴 합성에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효과를 예시하는 사 진이며,

도 12 및 도 13은 사람 섬유 아세포에 대한 에스트로겐의 효과를 나타내는 사진이고,

도 14 및 도 15는 에스트라디올이 사용 중지된 사람 섬유 아세포에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효과를 예시 하는 사진이며,

도 16은 조성물의 존재하에 배양된 케라티노사이트에 의해 차지된 멜라닌의 양의 변화를 통해, 멜라노사이트에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효과를 나타내는 히스토그램이고,

도 17 및 도 18은 배양된 사람 케라티노사이트에 의해 차지된 멜라닌의 양에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효 과를 나타내는 사진이며,

도 19는 HL 60 전골수세포에 의해 인터루킨 1(IL-1)에 대한 본 발명에 따라 제조된 조성물의 효과를 예시하는 히스 토그램이고,

도 20은 본 발명에 따라 제조된 조성물의 비세포독성의 연구를 예시하는 히스토그램이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 쓰여진 것이나, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 본원발명에 따른 조성물의 제조방법

사용된 재료는 진공상태, 완전밀폐, 바람직하게는 스테인레스 스틸 타입의 재료이다. 세균오염의 위험을 피하기 위해서 사전에 세척하고 린스 하였다.

1.1) 껍질의 바깥쪽부분(페리오스트라쿰(periostracum))이 이미 제거되고, 불규칙한 조각으로 만들어진 핑크타다 막 시마(Pinctada Maxima)의 진주층을 사용하였다(파리 75012,rue de Charonne, 10, 의 Pharma Futura 회사로 부터 제공되었다). 조각의 크기는 길이가 2 내지 5 센티미터이고, 두께는 0.3 센티미터이었다.

조각은 6.6%의 활성염소(12° )의 하이포아염소산나트륨(sodium hypo-chlorite)용액에서 담그지 않고 빠르게 오염 제거 세척을 하고 남은 물기를 제거하기 위해 즉석에서 건조시켰다.

미분화를 위한 제분은 이 목적을 위해서 세척(표백제 + 린스제 + 증류수를 함유한 세척제)되고, 사전에 열 멸균된 지 르코니움 쟈(zirconium jars)내에서 행해졌다. 제분은 멸균된 지르코니움 볼을 사용하여 수행하였다.

얻어진 미분화된 진주층 분말은 입자크기가 50 내지 150 ㎛ 이었다. 이는 2.5 Mrad 의 γ -선에 조사하여 멸균하였다.

제조된 미분화된 진주층 분말은 하기와 같은 특성을 가진다.

- 외관분말

- 색흰색

- 냄새진주층 특유의 냄새

- 비소〈 1 ppm

- 중금속〈 10 ppm

세균학적 분석 :

- 호기성 미생물의 수1550/g

- 습도 0.3%

1.2) 다음의 혼합물이 준비된다: 상기한 바의 미분화된 400g의 핑크타다 막시마 진주층 분말(입자크기가 50 내지 15

0㎛)을 추출제 총 중량에 대하여 0.18중량%의 해수 콜라겐 " PANCOGENE R MARIN" (Gattefosse회사에 의해 시판

됨; Saint Priest, France; INCI name " 가용성 콜라겐" ; 일본에서의 참조:" 물에 녹을수 있는" ; MHV: 20800CZY 0010000)과 0.2중량%의 히알루론산(hyaluronic acid)(프랑스, Soisy Sous Montmorency, Laboratoire Industr iel de Biologie 회사에서 시판됨)을 포함하는 수용성-글리콜 용액(물, 에틸렌글리콜 각각이 10:1의 중량비)형태인 600㎖의 추출제에 대략 20℃ 온도에서 대략 4000rpm으로 교반하면서 천천히 첨가하였다. 상기와 같이 첨가된 후, 교 반과 온도는 60분간 유지시켰다. 교반은 혼합물의 모든 입자가 서로 접촉하도록 하고 추출코팅을 허용하도록 하기 위해 서 활발하고, 균일하게 행하였다.

혼합물은 6시간동안 두었다.

상기와 같이하여 얻어진 조성물은 pH가 대략 8, 액체상에서 현탁상태로, 회색 미립자의 고체상으로 구성되어있다.

상기 조성물은 하기와 같이 구성된다:

- 아라고나이트(CaCO 3 );

- 해수 미량 원소 : 나트륨, 마그네슘, 란탄, 아연, 브롬, 세슘, 철, 망간, 염소, 구리, 칼륨, 칼슘, 스트론튬, 황 ( 하기 의 표 1 참조 )

- 섬유상 프로테인 : 진주층 유래의 조상 콜라겐으로 간주되는 해수 콜라겐과 관련된 여러가지 타입의 프로테인과 해

수 프로테인 " PANCOGENE R MARIN" .

- 비섬유상 프로테인 : 진주층 유래의 히알루론산 및 추출제를 포함하는 프로테오글리칸과, 진주층 유래의 부착 프로테 인 ( 데코린rp 및 사이토킨 rp; " rp" 는 " 관련된 펩티드 또는 프로테인" 의 뜻이다. 즉, 각각이 데코린과 사이토킨에 관련된 펩티드 또는 프로테인으로서 후자 분자에 대한 항체에 의해서 인지되는 것을 의미한다.)

본원 발명에 관련하여 펩티드와 프로테인을 확인하는데 사용되는 기술은 하기의 논문에 기술되어 있다.

- electrophoresis - SDS-Page method: Laenli method, Nature 1970, 227 680-682;

- immunotransfer: Western blot according to Towbin H. et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(9): 4 350-4354 and Burnette W. N. 1981, Analytical Biochemistry 112: 195-203.

상응하는 웨스턴블랏(Western blot)은 도 1과 도 2에 나타내었다.

프로테인상의 아미노산분석으로 아스파르트산, 트레오닌, 세린, 글루탐산, 글리신, 알라닌, 프롤린, 발린, 메티오닌, 이 소류신, 류신, 티로신, 페닐알라닌, 히스티딘, 리신, 아르기닌이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 도 3은 전체 아미노산 조성 의 히스토그램을 나타낸다.

상기방법에 의하여 얻어진 조성물은 이하 " 조성물A" 라고 명명한다.

(표 1) 조성물 A에 포함된 미량 원소의 정량분석

[표 1]

원소 평균농도(㎍/g) 원소 평균농도(㎍/100g)

황마그네슘란탄아연브롬세슘철망 0.0220.280.41.785.513.6502

칼슘 38.8

간염소구리칼륨스트론튬나트륨 9614358210005420

실시예 2 : 조성물A의 활성 연구

인 비보 동물모델 또는 사람 세포 배양을 사용하며, 현미경사용과 면역학과 면역세포화학으로 물질을 탐지하는 가장 현 대적인 기술의 사용에 의하여, 조직학적 세포학적 학술연구를 세포수준에서 수행하였으며, 상기 조성물 A의 활성물질 을 조사하기 위해서 연구를 수행하였다.

상기 연구는 필수적으로 피부 조직의 구조, 기능 및 색소에 주요한 역할을 하는 것으로 알려진 세가지 타입의 세포 즉 케라티노사이트, 섬유 아세포, 멜라노사이트에 관련되었다. 케라티노사이트와 섬유 아세포 세포 타입 모두 조성물A의 활성물질에 대하여, 특히 최저 피부층까지 도달하는 메시지 케스케이드를 일으키는 진주층안에 존재하는 모든 성분에 대하여 특이적인 수용체를 가지고 있다.

- 10 -

-----------------------------------------------------Page 10-----------------------------------------------------

?

공개특허 특2002-0047214

연구는 세포의 외부형태뿐아니라 그들의 합성활성 및 재생능력을 반영하는 주요성분, 핵, 세포질의 반응에 관한 것이었 다. 활성물질과 분비된 구조 프로테인의 존재도 확인하였다.

1.1) 케라티노사이트에 대한 조성물A의 활성: 조성물 A의 존재하에 배양된 사람 케라티노사이트 세포에 의한 사이토 케라틴의 합성.

1.1.1) 방법

케라티노사이트는 신체의 최외부 세포이다. 상기 세포는 우리 신체에서 최초 보호막을 구성한다. 케라티노사이트는 수 동적으로 또는 능동적으로 조정한다. 상기 세포는 방패역할을 하는 장벽을 구성함으로써 수동보호를 한다. 상기 방패는 무핵의 건조된 세포로부터 만들어진다. 상기 세포들은 강한 부착으로 인해 매우 균일한 시스템을 제공할 수 있다. 케라 티노사이트는 상기 장벽 구조를 제공하기 위해 세포질에서 유지되는 사이토케라틴이라는 물질을 합성한다. 상기 사이토 케라틴은 케라티노사이트의 내부 골격을 구성한다. 상기 내부 골격은 상기 세포들이 그들의 부피를 가지도록 하며, 세 포들간 상호 정보교환 능력을 증가시키고, 멜라닌 흡수를 촉진시킨다. 표피에 사이토케라틴이 풍부할수록 더욱 효과적 이고 피부가 더욱 젊게 보인다. 세포들간의 접촉을 촉진시킴으로서 사이토케라틴은 NMS(세라미드, 콜레스테롤 또는 지방산과 같은 자연 가습 인자(Natural Moisturizing Factors))의 손실을 방지한다.

피부의 능동 보호는 케라티노사이트가 신체에서 외부와 접촉하는 최초의 세포라는 사실과 관련된다. 따라서 상기 세포 는 주변 환경 조건의 가능한 변화를 신체에 알려주는 구성성분들을 발달시켰다. 이를 위하여, 상기 세포들은 진피 하층 에 있는 세포(섬유 아세포)를 자극하는 성장인자 특히, 주로 케라티노사이트에 의해 합성되고, 세포분화인자로 알려져 있는 PTH 관련 펩티드(PTHrp)를 합성할 수 있는 능력이 있다.

방법은 하기와 같다. 세포질에 존재하는 분비 프로테인 각각의 수준을 판단할 수 있는 신속한 반정량(semiquantitati ve)기술을 포함한다.

4 × 10 4 의 세포들을 챔버(8-챔버 슬라이드, NUNC) 0.9 ㎠ 마다 시드하였다. HBSS 버퍼로 린스한후 1%의 조성물

A를 함유한 배양액 또는 콘트롤 배양액(0%의 조성물 A를 함유)를 첨가하였다(챔버당 450㎕). 48시간 동안 인큐베이 션 하였다. 상등액을 제거한 후 배양액을 린스하고, 세포들을 파라포름알데히드로 4℃에서 30분간 고정시키고, PBS 버 퍼로 린스하였다.

200 ㎕의 항-사이토케라틴 1차 항체를 첨가하였다. 30분간 실온에서 반응시켰다. 상등액을 제거하고 PBS버퍼로 세포 들을 린스하였다. 1차 항체를 인지할 수 있고, 본 실시예의 경우는 플루오레신(fluorescein)인 형광표지와 결합된 2차 항체 200 ㎕를 첨가하였다. 30분간 상온에서 반응시킨후 상등액을 제거하고 PBS 버퍼로 세포들을 린스하였다. 슬라이 드들을 역 형광 현미경으로 검사하였다.(면역-형광에 의해 세포질내의 사이토케라틴을 검출)

세포에 의해 합성되어 표지된 사이토케라틴 프로테인의 양은 면역표지로부터의 결과인 형광의 세기와 비례한다.

1.1.2) 결과

도 4, 도 5에 나타난 바와 같이, 0.5%의 조성물A 케라티노사이트 배양액에 첨가한 경우에 사이토케라틴 합성이 증가 하는 효과가 있다. 조성물A는 노화피부유래의 케라티노사이트의 활성과 케라티노사이트에 의한 사이토케라틴의 분비 를 회복시켰다. (에스트라디올 투여중지된 케라티노사이트에 대한 작용; 도 6, 7 및 8, 9 참조)

부가하여, 조성물A가 존재하는 경우에 케라티노사이트에 의한 칼슘 의존적인 PTHrp의 합성이 촉진되었다. 케라티노 사이트에 의해 주로 합성되는 PTHrp는 조성물A에 의해서 제공되는 칼슘이온의 존재하에 특히 활성을 가지며, 조성물 A에 존재하는 진주층 완전 유기 기질의 사이토카인과 함께 상승적으로 작용한다.

피부 재생에 있어서 주요 부착 프로테인인 데코린(Decorin) 또한 조성물A의 존재하에 촉진된다.

- 11 -

-----------------------------------------------------Page 11-----------------------------------------------------

?

공개특허 특2002-0047214

칼슘 의존적 부착 프로테인인 케드히린(Cadherins) 또한 접착 원인 프로테인이다. 상기 프로테인도 조성물 A 가 존재 하면 촉진된다.

1.2) 조성물A의 섬유 아세포에 대한 활성, 엘라스틴(Elastin)합성

1.2.1) 조성물A의 존재하에 배양된 사람 섬유 아세포에 의한 엘라스틴 합성

방법은 1.1.1)단락에 기술된 케라티노사이트에 대한 연구의 것과 동일하다.

도 10 과 도 11에 나타난것과 같이, 1% 농도의 조성물A는 사람 섬유 아세포에 의한 엘라스틴 합성을 강력히 촉진하였 다.

1.2.2) 에스트로겐과 바이오크리스탈 맥시마 엠.의 사람 섬유 아세포 배양세포에 대한 효과상의 비교 (도 12, 13, 14 및 15).

비교적 비활성인 성숙 섬유 아세포는 길고 편평한 형태이고 농후한 핵을 가진다. 활성 섬유 아세포는 활발한 합성과정 을 반영하는 큰 부피의 핵인을 가지는 크고 둥근핵을 가진다. 활성 섬유 아세포 타입은 호르몬 교체치료를 진행하고 있 는 50세의 여성으로부터 채취한 피부 체외이식조직에서 관찰하였다.

배양액에서 에스트로겐의 결핍으로 세포가 급격하게 비활성되었다. 상기 세포는 더이상 부착성 또는 유착성을 갖지 않 고, 일부는 핵농축(pyknosis)를 일으켰다.

도 12와 도 14는 대체치료중인 50세 폐경기(따라서 에스트로겐 분비가 감소됨) 여성유래의 체외이식조직의 사람 섬유 아세포에 대한 조성물A의 효과를 도시하고 있다.

도 13과 도 15는 대체치료중인 50세 폐경기 여성유래의 체외이식조직의 에스트라디올이 중지된 사람 섬유 아세포에 대한 조성물A의 효과를 도시하고 있다.

도 12 내지 도 15에서 나타난 바와 같이 배양액에 1%의 조성물A를 첨가하므로서 중지된 섬유 아세포의 활성을 완전히 회복하였다. 조성물A의 작용은 주목할만하다: 섬유 아세포는 두드러진 핵인을 가진, 잘 발달되고 매우 맑은 핵을 형성 하였다. 방추상 세포체는 동일한 방향으로 정렬되었고, 서로 합류하여 세포간 교환을 가능하게 하였다. 어린 피부의 체 외이식조직의 세포에 대해 실험이 행해졌을때에도 유사한 결과를 얻었다.

1.3) 멜라노사이트에 대한 조성물A의 활성 : 조성물A의 존재하에 배양된 케라티노사이트에 의해 흡수되는 멜라닌 양 의 변화.

1.3.1) 방법

멜라노사이트는 멜라닌합성을 담당하는 색소세포이고, 멜라닌은 피부색의 원인이 되는 색소이다. 멜라노사이트 세포는 전체 피부세포의 대략 2 내지 4 %를 차지한 다. 균일한 피부색은 분비세포(멜라노사이트)로부터 이를 흡수하는 이웃 케라티노사이트로 멜라노좀의 형태로 멜라닌이 이동함에 의해 색소가 피부전체표면에 걸쳐 고르게 분포하기 때문이다.

방법은 케라티노사이트/멜라노사이트 공동배양과 멜라닌 분석으로 구성된다.

케라티노사이트와 멜라노사이트는 모두 표피에 존재하는 세포들이다. 상기 세포는 진피를 제거하고 표피를 효소처리한 샘플로부터 얻었다. 분리된 표피세포들은 콜터카운터(Coulter Counter(Coutronics))에서 카운팅한후 글루타민, 스트 렙토마이신/페니실린 및 10%의 페탈 카프 시럼(fetal calf serum)이 추가된 변형된 둘베코 타입(Dulbeco type(eag le medium))의 통상의 배양액에서 배양하였다. 백분율을 얻어진 결과의 함수로 조정하였다. 상기 배양액에서 멜라노 사이트와 케라티노사이트가 성장하였다.

- 12 -

-----------------------------------------------------Page 12-----------------------------------------------------

?

공개특허 특2002-0047214

조성물A의 존재하에 4일 동안 배양한 후, 세포들은 NaOH/DMSO 혼합물로 처리하고 원심분리후 상등액을 제거하였다. 470nm에서 측정하였다.

1.3.2) 결과

결과는 하기 표 2와 도 16의 히스토그램에 나타나 있다.

(표 2) 케라티노사이트에 의해 흡수된 멜라닌㎍

[표 2]

샘플1 샘플2 샘플3 평균 표준편차

콘트롤 0.150 0.149 0.148 0.149 0.001 조성물A(0.5%) 0.150 0.132 0.140 0.141 0.009 조성물A(1%) 0.139 0.137 0.143 0.140 0.003

1%의 조성물A의 존재로 인해 케라티노사이트에 의하여 흡수되는 멜라닌이 국부적으로 농축되지 않는 분포상의 중대한 변화가 발생하였다.(도 17 과 도 18 참조)

1.4) 조성물A에 의한 섬유 아세포와 케라티노사이트의 자극의 면역세포화학적 증명

1.4.1)방법

이는 세포질내에 존재하는 프로테인(사이토케라틴과 엘라스틴)각각의 수준을 측정할 수 있는 신속한 반정량적(semiq

uantitative)기술이다. 4 × 10 4 세포들을 챔버 (8-챔버 슬라이드, NUNC) 0.9㎠ 마다 시드하고 밤샘배양하였다. HB

SS 버퍼로 린스한후 1%의 조성물A를 함유한 배양액 또는 콘트롤 배양액(0%의 조성물 A를 함유)를 첨가하였다.(챔버 당 450㎕) 이를 48시간 동안 배양하였다. 상등액을 제거한 후 린스하고, 세포들을 파라포름알데히드로 4℃에서 30분 간 고정시키고 PBS 버퍼로 린스하였다. 200 ㎕의 항-사이토케라틴 및/또는 항-엘라스틴 1차 항체를 첨가하였다. 30 분간 실온에서 반응시켰다. 상등액을 제거하고 PBS버퍼로 세포들을 린스하였다. 플루오레신(fluorescein)과 결합된 200 ㎕의 2차 항체를 첨가하였다. 30분간 반응시킨후 상등액을 제거하고 PBS 버퍼로 세포들을 린스하였다. 슬라이드 들을 역 형광 현미경으로 검사하였다. 세포에 의해 합성된 엘라스틴 또는 사이토케라틴의 양은 형광의 세기와 비례한다.

1.4.2) 결과

1%의 조성물A를 케라티노사이트 배양액에 첨가함으로써 표피의 케라티노사이트 세포에 의해 사이토케라틴 합성이 증 가하는 효과가 있었다. 상기 자극은 0.5%의 조성물A 로부터도 상당하게 관찰되었다.

조성물A의 존재(1%)하에 인 비트로에서 섬유 아세포를 배양했을때 48시간후에 형광의 세기에 있어 매우 주목할만한 증가가 관찰되었으며, 이는 피부 섬유 아세포에 의한 엘라스틴 합성의 자극을 반영하는것이다.

1.5) 조성물A의 항염증 활성 : 조성물A로 처리한 HL60 전골수 (promyelocytic) 세포에 의해 분비되는 인터루킨1( IL-1)의 분석

염증 단계동안 많은 수의 염증세포들이 주변의 혈액으로부터 염증부위로 이동하는 것이 최초로 관찰되고 상기 부위에 서 상당한 양의 사이토카인 특히 IL-1의 분비가 뒤따른다. 후자가 주요한 역할을 하는 것으로 간주된다.

본 연구에서, IL-1분비는 조성물A의 존재하에 세포주 HL-60 을 이용하여 측정하였다.

강력한 IL-1분비 자극제인 피토헤마글루티닌(PHA, phytohemaglutinin)을 배양액에 첨가하여 IL-1의 생산을 증폭 시켰다. IL-1은 사람 IL-1 특이적 항체를 사용한 통상적인 ELISA 면역분석법으로 정량하였다.

- 13 -

-----------------------------------------------------Page 13-----------------------------------------------------

?

공개특허 특2002-0047214

1.5.2) 결과

결과는 하기 표 3과 도 19의 히스토그램에 나타내었다.

(표 3) 전골수 세포에 의해 분비되는 인터루킨-1

(IL-1, 피코그램 단위)의 생산에 대한 조성물A의 영향의 증명

[표 3]

샘플1 샘플2 샘플3 평균 표준편차

콘트롤 0.703 0.685 0.654 0.681 0.025 조성물A(1%) 0.689 0.664 0.570 0.641 0.063 조성물A(0.5%) 0.494 0.615 0.527 0.545 0.063

1%의 조성물A가 존재하는 경우, IL-1의 합성이 상당히 감소하였으며 이는 조성물A의 주목할 만한 항염증효과를 반 영한다. 상기 인 비트로(in vitro) 효과는 인 비보(in vivo)로 쥐(rat)에게 이식 실험을 행한 경우에서도 나타났다.

1.6) 독성 테스트. 조성물A의 비세포독성의 증명: 미토콘드리아 활성의 MTT 테스트

1.6.1) 방법

본 실험은 간 세포(liver cell) 미토콘드리아 NADPH 환원효소(NADPH reductase)에 의해 테트라졸리움 염(MTT, tetrazolium)이 환원되어 청자색의 포르마잔(formazan)생성물을 형성하는 것에 기초한 컬러테스트이다.

200㎕의 배양액의 2 × 10 4 세포들을 각각의 웰 (96-웰 플레이트, NUNC)에 시드하고, 세포들이 플라스틱에 적절하게

부착되도록 밤샘 인큐베이션하였다. 시럼(serum)이 없는 배양액으로 세포들을 린스한 후 상이한 농도의 조성물A를 포 함하는 배양액(1%, 0,5% 및 0.1%)과 콘트롤(0%의 조성물A)배양액을 웰당 200㎕씩 첨가하였다.

48시간 인큐베이션 한후 상등액을 제거하고 HBSS버퍼로 린스하였다. 20%의 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2- yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide; " Thiazolyl Blue" )용액을 함유한 100㎕의 배양액을 각 웰에 첨가하였

다. 반응은 37℃, 5% CO 2 하에서 2시간 동안 진행시켰다. 포르마잔(formazan)결정을 더 잘 용해시키기 위하여 0.04

N HCl 이소프로판올을 100㎕ 첨가하였다. 컬러반응은 파장 570nm에서 마이크로 플레이트 리더로 측정하였다. 측정 수치는 흡광도로 나타냈다.

1.6.2) 결과

결과는 표 4와 도 20의 히스토그램에 나타냈다.

(표 4) 흡광도 측정수치

Claims (4)

1. a) 진주층을 입자 크기가 약 1∼약 300㎛인 분말로 분해시키는 단계, b) 이렇게 하여 얻은 진주층 분말을 하나 이상의 콜라겐, 하나 이상의 프로테오글리칸 또는 이들의 혼합물로 된 글리콜 수용액 형태의 추출제와 밀접하게 접촉시키는 단 계, 및 c) 밀접하게 접촉시킨 결과로서 형성되고, 원하는 조성물을 이루는 추출 혼합물을 회수하는 단계를 포함하는 것 을 특징으로 하는 조성물의 제조방법.
   
2. 제 1 항에 있어서, 진주층은 입자 크기가 약 50∼약 100㎛인 분말로 분해되는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조방법.
   
3. 제 1 항에 있어서, 진주층은 입자 크기가 약 15∼약 50㎛인 분말로 분해되는 것을 특징으로 하는 조성물의 제조방법.
   
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 추출제의 글리콜 수용매는 물:글리콜 중량비가 약 1:100∼약 100:1인 것을 특징으로 하는 조성물의 제조방법.