KR20240068867A

KR20240068867A - 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 용도

Info

Publication number: KR20240068867A
Application number: KR1020220148691A
Authority: KR
Inventors: 모상현; 이정훈; 장성주; 이삭; 백승혜; 조애랑; 허경연
Original assignee: 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2022-11-09
Filing date: 2022-11-09
Publication date: 2024-05-20

Abstract

본 발명은 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따라 포피라334를 식물 유래 세포외소포체에 봉입한 경우 포피라334 또는 세포외소포체 단독 처리에 비해 피부 주름 개선,　피부 장벽 강화를 통한 보습 개선, 피부 재생 및 상처 치유 효과가 현저하게 증가하므로, 이를 화장료 조성물 또는 상처 치유용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

포피라334가 봉입된 세포외소포체의 용도{Use of porphyra334-encapsulated extracellular vesicles}

본 발명은 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 용도에 관한 것이다.

인간의 피부는 외부 환경에서 유래하는 다양한 자극으로부터 인체를 보호하는 일차 방어막이다. 또한 생체 활성을 유지하기 위해 절대적으로 필요한 체내 수분이 외부로 빠져나가는 것을 막아주는 방어막이기도 하다. 인체는 대부분의 시간을 불가피하게 피부에 비해 상대적으로 건조한 환경에 노출되어 있는데, 이 때문에 피부, 특히, 각질층에는 수분을 저장하고 증발을 막는 다양한 물질들이 있어, 체내 수분 유지에 매우 중요한 기능을 담당하고 있다. 각질층의 보습 기능에 가장 중요한 두 가지 인자로는, 먼저, 각질 세포내 지질층(intercellular lamellar lipids)이 수분의 증발을 막는 필름으로써 작용하며, 다른 하나의 인자로서 각질 세포내 필라그린(filaggrin)의 분해 산물들로 주로 구성된 자연 보습 인자(natural moisturizing factor)가 수분을 각질층 내에 붙잡아 두는 기능을 하고 있다. 다양한 피부질환이나, 노화된 피부에서는 이 두 가지 주요 인자의 기능이 떨어지고 피부의 보습 상태가 악화되어 건조증이 쉽게 발생할 수 있는데, 이 경우 건조증으로 인한 소양증이나 기타 피부이상증을 완화하는데 보습제는 매우 중요한 치료 수단이 될 수 있다. 또한 각질층 내 수분은 여러가지 생리활성을 지니는 효소들의 활성유지에 도움이되어 피부장벽을 건강한 상태로 유지시키는 역할을 할 수 있으므로, 보습제는 건조증이 있는 피부뿐만 아니라 정상인의 피부를 건강하게 유지하는 역할을 할 수 있다. 노화는 비가역적인 현상으로서 인간 개체의 전체적인 노화와 평행하게 진행되는 형태적, 생화학적, 생리학적 변화 과정이다. 신체 다른 장기나 기관의 노화 현상과는 다르게 피부 노화는 유전적으로 결정되어 있는 노화의 과정인 내인성노화(Intrinsic aging) (Braverman IM 등: J. Invest. Dermatol., 78, 434-443(1982)) 이외에도 자외선이나 흡연 및 기타 생활 습관과 연관되는 외적인자들에 의한 외인성노화(Extrinsin aging) 과정을 포함한다 (Gilchrest BA: J. Am. Acad. Dermatol.,21, 610-613(1989)). 외인성 및 내인성 노화에 의한 피부 노화 현상은 일광 탄력 섬유증(solar elastosis)이나 색소이상증(dyschromatosis) 및 거칠기 증가, 피부 주름 형성 등의 임상 양상으로 나타난다. 피부 미용 영역의 항노화 치료는 이와 같은 피부 노화의 개별 현상들에 대한 개선에 그 초점이 맞춰져 있는데, 의학적 시술이나 수술적 치료 외에도 최근 화장품 영역에서 주로 기능성 제품들의 항노화 기전도 그 맥락을 같이한다고 볼 수 있다. 화장품에 의한 주름 개선 효과는 보습인자들에 의한 보습에 의한 일시적 효과 이외에도 다양한 유효 성분들에 의한 진피층 개선 효과를 그 기전으로 하며 대표적인 주름 개선 화장품의 원료들인 레티놀, 비타민C, EGF 등의 성장 인자 성분들은 인간 진피 섬유아 세포로부터 콜라겐 신생성을 증가시킴으로써 주름 개선 효능을 보이는 것으로 잘 알려져 있다. 피부는 탄력성을 지닌 고체(solid)의 성질뿐만 아니라 점성을 갖는 유체(fluid)의 성질을 동시에 지니며, 이와 같은 피부의 기계적 특성을 점탄성(viscoelasticity)이라고 한다. 피부탄력(elasticity)의 경우 콜라겐(collagen)과 탄력소(elastin) 간의 연결체 구조들에 의해 발생되며, 점성(viscosity)의 경우 하이알루론산 등을 포함하는 세포외 기질들에 의해 구성되는 유체 성분에 의해 발생된다. 피부의 점탄성은 탄력에 의한 피부 변형에 부가적인 움직임을 제공함으로써 외력에 대해 좀 더 효과적으로 피부를 보호할 수 있게 한다.

한편, 세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외소포체는 동물세포, 식물세포, 박테리아 및 고세균 (Archaea)에서도 분비한다고 알려져 있어 세포외소포체는 분비 현상은 모든 생물에서 진화적으로 보존된 현상으로 생각된다. 세포외소포체는 세포로부터 유래하는 다양한 종류의 막 구조로서, 엔도좀 시스템(endosomal system)에서 유래하는 엑소좀 (exosome)과 원형질막(plasma membrane)에서 유래하는 마이크로베시클 (microvesicle)으로 이루어진다고 알려져 있다. 이를 세포외소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀(exosome) 등으로도 지칭된다.

본 발명의 목적은 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 상처 치유용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 목적은 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 포피라334가 봉입된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 포피라334가 봉입된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따라 포피라334를 식물 유래 세포외소포체에 봉입한 경우 포피라334 또는 세포외소포체 단독 처리에 비해 피부 주름 개선,　피부 장벽 강화를 통한 보습 개선, 피부 재생 및 상처 치유 효과가 현저하게 증가하므로, 이를 화장료 조성물 또는 상처 치유용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 식물 유래 세포외소포체 내부에 포피라334를 내포하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 방사무늬돌김으로부터 포피라334를 제조하는 과정을 나타낸 도이다.
도 3은 TEM 분석을 통해 확인한 포피라 334+엑소좀 구조를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 세포독성을 확인한 도이다.
도 5는 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 주름 개선 효과를 확인한 도이다.
도 6은 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 피부장벽 개선 효과를 확인한 도이다.
도 7은 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 피부 재생 효과를 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 포피라334(porphyra334)가 봉입된 세포외소포체(Extracellular Vesicles)를 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 세포외소포체는 식물 유래 세포외소포체일 수 있으며, 식물 세포 또는 식물 배양근 유래 세포외소포체일 수 있고, 식물 세포 배양액 또는 식물 배양근 배양액 유래 세포외소포체일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 식물은 인삼일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 재생용, 피부 주름 개선용 또는 보습용일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 화장료 조성물은 프로콜라겐(Procollagen Type I C-Peptide, PIP)의 생합성량을 증가시킬 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 화장료 조성물은 FLG(Filaggrin)의 발현양을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상술한 본 발명의 유효성분들의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "화장품학적 유효량"은 상술한 본 발명의 조성물의 미백, 주름 개선 또는 보습 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 포피라334가 봉입된 세포외소포체 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 포피라334가 봉입된 세포외소포체와 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 포피라334가 봉입된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상처는 비-치유 외상성 상처, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 열상 (laceration), 결출상 (avulsion), 관통상 (penetrated wound), 총상 (gunshot wound), 절상, 동상, 타박상 (contusion or bruise), 피부궤양, 피부건조, 피부 각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부 사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 상처, 각막상처 등의 상처, 욕창, 와창, 당뇨성피부 미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 상처, 부인과적 상처, 화학적 상처 또는 여드름일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 피부 국소 도포용일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 조성물은 베라파밀의 치료적 유효량 및, 약학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있으며, 담체는 거즈, 붕대, 밴드, 필름, 접착 패치 및 미접착 패치로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본원발명의 약학적 조성물의 투여로 상처를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 정상 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 (a) 식물 유래 세포외소포체를 제조하는 단계; (b) 세포외소포체에 포피라334를 혼합하는 단계; (c) 파쇄하는 단계; 및 (d) 인큐베이션하는 단계를 포함하는 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 제조방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 식물 유래 세포외소포체는 식물 세포 배양액 또는 식물 배양근 배양액을 여과 및 농축하여 제조할 수 있다.

일 구현예에서, 세포외소포체 4.48 X 10⁸ 내지 10¹⁰ particles/mL에 포피라334를 5 내지 100 mg 혼합할 수 있다.

일 구현예에서, 파쇄는 균질화기를 이용하여 3,000 내지 40,000 rpm으로 5 내지 60분 동안 수행함으로써 유도하는 물리적인 파쇄일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 물리적 파쇄를 통해 세포외소포체의 내부에 포피라334가 봉입될 수 있다.

일 구현예에서, 인큐베이션은 상온에서 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 단계 (b) 이전에 포피라334(porphyra334)를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 포피라334(porphyra334)의 분리 및 정제

건조된 방사무늬돌김 5 kg에 물을 원재료의 40배 (w/v)로 첨가한 뒤, 40 ℃에서 1시간 동안 교반하며 추출하였다. 추출액을 7,000 rpm으로 1시간 동안 원심분리한 후 셀룰로스 아세테이트(Cellulose acetate) 막여과지 (pore size 0.45 μm)로 여과하고 농축 및 감압 건조시켜 김 추출물 파우더를 회수하였다. 김 추출물 파우더에 물을 첨가하여 완전히 녹인 후 분리용 레진 (Daisogel RP18, 10 μm, Osaka Soda, Japan)이 충진된 대용량 정제용 HPLC를 이용하여 포피라334 피크 부분만 분획하였다. 분획액을 동결건조하여 약 15 g의 포피라334 파우더를 수득하였다 (도 2).

실시예 2. 식물 유래 세포외소포체 제조

2-1. 인삼 유래 식물세포, 배양근 및 배양액 준비

인삼의 잎을 70 % 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하였고, 이를 다시 소독액 (30 % 락스 + Tween 20)으로 20분간 소독한 후 멸균수로 3회 세척하였다. 1 mg/L 2,4-D, 3 % Sucrose 및 8 g/L agar가 함유된 MS(Murashige and Skoog) 배지 (Duchefa 社, Cat No. M0221)의 pH를 1 N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8로 조정한 후 굳혀서 초기 식물세포를 배양하기 위한 고체 배지를 제작하였다. 상기에서 멸균 및 수세한 인삼 잎에서 초기 인삼 식물세포 및 배양근을 유도하기 위해 날카로운 칼을 이용하여 잎에 단번에 상처를 낸 후 준비된 상기 고체 배지에서 25 ℃ 및 상대습도 70 %의 조건으로 암배양하였다. 고체 상태에서의 계대배양은 2주 마다 진행하였고, 8주 후 식물세포와 배양근이 유도되었다. 인삼 식물세포 및 배양근 유도 후에는 식물세포와 배양근을 따로 분리하여 배양하였다. 이들 각각의 배양액을 제조하기 위해, 온도 조건 23±2 ℃ 및 습도 70 %의 조건으로 20 L 생물반응기(Bioreactor) (㈜삼성과학社)에서 공기공급량 0.1 vvm 정도로 5주간 액상 대량 배양하여 인삼 식물세포 배양액 및 인삼 배양근 배양액을 준비하였다.

2-2. 세포외소포체(Extracellular Vesicles) 분리 및 정제

상기 실시예 2-1에서 대량 배양한 인삼 식물세포 배양액을 25 μm 필터백(filter bag)을 이용하여 식물세포와 배양액을 분리하였다. 배양액을 5 μm, 1 μm 및 0.22 μm 필터를 이용하여 순차적으로 여과하고, MWCO 300 kDa cross flow Filter system (Cytiva사, akta flux)를 이용하여 1/10 내지 1/50 정도의 부피가 될 때까지 농축하였다. 상기와 같은 방법으로 인삼 식물세포 배양액 유래 세포외소포체를 생산하였고, 인삼 배양근 배양액 유래 세포외소포체도 생산하였다.

실시예 3. 포피라334를 내포하는 세포외소포체 제조

상기 실시예 2의 인삼 식물세포 배양액 또는 배양근 배양액 유래 세포외소포체 함유액 100 mL (농도: 4.48 X 10⁸ 내지 10¹⁰particles/mL)에 상기 실시예 1의 포피라334를 10 mg 녹인 후, 균질기(homogenizer)를 이용하여 10,000 rpm으로 물리적인 파쇄를 유도하였다. 이 때, 약 5 내지 10분 후면 세포외소포체를 둘러쌓고 있는 인지질 이중막이 일부 열리거나 틈이 생겨, 혼합된 포피라334가 세포외소포체의 인지질 막 안으로 들어가게 되므로, 포피라334가 식물 유래 세포외소포체 내부에 충분히 들어가도록 균질기를 이용하여 물리적인 파쇄를 총 15 내지 30분간 유도하였다. 이 후 실온에서 인큐베이션하여 수상인 배양액 내에서 유상인 인지질막이 다시 닫히도록 유도하여 내부에 포피라334를 내포한 세포외소포체를 제작하고 (도 2), 이의 구조를 TEM 이미지로 확인하였다 (도 3).

실시예 4. 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 독성 확인

상기 실시예에서 제조한 포피라334를 내포하는 세포외소포체가 피부세포에 독성이 있는지 확인하기 위해, 이의 처리 농도별 세포생존률을 MTT 분석으로 확인하였다. 구체적으로, HaCaT 세포 (keratinocyte, 각질형성세포) 및 Detroit 세포 (fibroblast, 섬유아세포)를 각각 10 % FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1 % 항생제-항진균제(Antibiotic-Antimycotic)가 함유된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium)과 함께 96-웰 플레이트에 분주하고, 5 % CO₂ 및 37 ℃의 조건인 항온기에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후 정제수를 처리한 대조군, 시험물질로 포피라334 단독, 세포외소포체 단독 및 포피라334를 내포하는 세포외소포체를 각각 세포에 처리하고 (표 1), 24시간 동안 추가 배양하였다. 이 후, 5 mg/mL MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 각 웰에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하여 반응시킨 뒤, 배양액을 제거하였다. 그 후, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액을 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

	농도	각질형성세포 세포생존률 (%)	섬유아세포 세포생존률 (%)
대조군	-	100	100
포피라334(P) (ppm)	1	98.83	97.70
	5	97.34	96.65
	10	95.06	93.04
세포외소포체(EV) (%)	1	98.36	99.60
	5	92.7	100.3
	10	92.53	93.33
포피라334를 내포하는 세포외소포체	1 ppm P +1 % EV	101.27	101.27
	5 ppm P +5 % EV	105.53	107.86
	10 ppm P +10 % EV	107.36	110.36

그 결과, 본 발명의 1 내지 10 ppm 포피라334(P) 및 1 내지 10 % 세포외소포체(EV)를 포함하는, 포피라334를 내포하는 세포외소포체는 2종의 세포 모두에서 대조군 대비 세포생존률이 모두 90 % 이상으로 나타나, 피부세포에 독성을 일으키지 않는 것으로 확인되었다 (도 4 및 표 1).

따라서, 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체 조성물이 피부세포에 자극 유발 가능성이 낮고 무독함을 확인하였다.

실시예 5. 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 주름 개선 효과 확인

본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체 조성물의 주름 개선 효과를 살펴보기 위하여, 콜라겐의 합성의 전구체인 프로콜라겐(Procollagen Type I C-Peptide, PIP)의 생합성량을 측정하였다. 구체적으로, Detroit551 세포를 48-웰 플레이트에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군, 양성대조군 (TGF-β1 5ng/mL, 200nM), 포피라334 단독, 세포외소포체 단독 및 포피라334를 내포하는 세포외소포체를 각각 세포에 처리하고 (표 2), 48시간 동안 추가 배양하였다. 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA Kit(Takara, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이 후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

	농도	PIP Contents (%)
대조군	-	100
양성 대조군	TGF-β1 5 ng/mL	133.66
포피라334(P) (ppm)	1	101.92
	5	108.29
	10	108.76
세포외소포체(EV) (%)	1	105.82
	5	109.65
	10	83.00
포피라334를 내포하는 세포외소포체	1 ppm P +1 % EV	105.63
	5 ppm P +5 % EV	114.33
	10 ppm P +10 % EV	113.63

그 결과, 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체를 처리한 경우 모든 농도에서 대조군, 양성대조군, 포피라334 단독 처리군, 세포외소포체 단독 처리군에 비해 PIP 합성양이 현저히 증가한 것으로 나타나 (도 5 및 표 2), 주름 개선 효과가 있을 것으로 확인하였다.

실시예 6. 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 피부장벽 개선 효과 확인

본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체 조성물의 보습 및 피부장벽 개선 효능을 확인하기 위해, 자연보습인자로 알려진 FLG(Filaggrin)의 발현양 변화를 알아보았다. 구체적으로, HaCaT 세포를 96-웰 플레이트에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군, 양성대조군 (Glyceryl glucoside 1 %), 포피라334 단독, 세포외소포체 단독 및 포피라334를 내포하는 세포외소포체를 각각 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. FLG의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 분석을 수행하였다. Real-time PCR 분석을 위해, SuperPrep^TM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하여 RNA을 분리하고 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분 및 95 ℃ 5분의 조건으로 cDNA를 합성하였다. Thunderbird^TM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Cat. QPS-201)를 이용하여 합성한 cDNA를 주형으로 Real-time PCR 분석을 95 ℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 총 40 사이클의 조건으로 진행하였다. 이 때 사용한 프라이머는 Qiagen사의 QuantiTect　primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, FLG; Cat. QT02448138)이며 시료의 FLG mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다.

	농도	상대적 FLG mRNA 발현 수준
대조군	-	100
양성 대조군	Glyceryl glucoside 1 %	3.13
포피라334(P) (ppm)	1	1.18
	5	1.62
	10	2.92
세포외소포체(EV) (%)	1	1.27
	5	1.41
	10	2.77
포피라334를 내포하는 세포외소포체	1 ppm P +1 % EV	1.15
	5 ppm P +5 % EV	2.25
	10 ppm P +10 % EV	3.24

그 결과, 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체를 처리한 경우 모든 농도에서 대조군, 양성대조군, 포피라334 단독 처리군, 세포외소포체 단독 처리군에 비해 FLG의 mRNA 발현양이 현저히 증가한 것으로 나타나 (도 6 및 표 3), 피부장벽 개선에 효과가 있는 것을 확인하였다.

실시예 7. 포피라334를 내포하는 세포외소포체의 피부 재생 효과 확인

본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체 조성물의 피부 세포 재생 효과를 살펴보기 위하여, Wound healing assay을 수행하여 세포의 증식 및 이동 촉진 여부를 확인하였다. 구체적으로, HaCaT 세포를 24-웰 플레이트에 분주한 후, 인서트(insert)와 함께 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 양성대조군 (EGF, 200 ng/ml). 포피라334 단독, 세포외소포체 단독 및 포피라334를 내포하는 세포외소포체를 각각 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 물질 처리 후 0 시간대에 세포 이미지를 현미경 사진으로 찍고 37 ℃ 및 5% CO₂의 조건으로 배양하였다. 물질처리 18-20 시간 후 배지를 제거하고 고정 용액(fixing solution) (4% paraformaldehyde)을 처리하고 15분간 상온에서 인큐베이션한 뒤, PBS로 3번 세척하였다. 고정된 세포를 현미경으로 촬영하여 상처 치유(Wound healing) 정도를 Image J 프로그램으로 정량하였다.

	농도	Healing area (%)
대조군	-	15.75
양성 대조군	EGF 200ng/mL	30.52
포피라334(P) (ppm)	1	21.98
	5	24.26
	10	28.86
세포외소포체(EV) (%)	1	21.2
	5	24.33
	10	30.6
포피라334를 내포하는 세포외소포체	1 ppm P +1 % EV	21.2
	5 ppm P +5 % EV	26.4
	10 ppm P +10 % EV	34.86

그 결과, 본 발명의 포피라334를 내포하는 세포외소포체를 처리한 경우 모든 농도에서 대조군, 포피라334 단독 처리군, 세포외소포체 단독 처리군에 비해 healing area가 증가한 것으로 나타나 (도 7 및 표 4), 포피라334를 내포하는 세포외소포체가 피부세포 재생 효과가 있는 것을 확인하였다.

Claims

포피라334(porphyra334)가 봉입된 세포외소포체(Extracellular Vesicles, EV)를 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 세포외소포체는 식물 유래 세포외소포체인, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 세포외소포체는 식물 세포 또는 식물 배양근 유래 세포외소포체인, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 세포외소포체는 식물 세포 배양액 또는 식물 배양근 배양액 유래 세포외소포체인, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 피부 재생용, 피부 주름 개선용 또는 보습용인, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, 프로콜라겐(Procollagen Type I C-Peptide, PIP)의 생합성량을 증가시키는, 화장료 조성물.
제 1항에 있어서, FLG(Filaggrin)의 발현양을 증가시키는, 화장료 조성물.
포피라334가 봉입된 세포외소포체를 유효성분으로 포함하는 상처 치유용 약학적 조성물.
제 8항에 있어서, 상처는 비-치유 외상성 상처, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상 (abrasion), 골괴저, 열상 (laceration), 결출상 (avulsion), 관통상 (penetrated wound), 총상 (gunshot wound), 절상, 동상, 타박상 (contusion or bruise), 피부궤양, 피부건조, 피부 각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부 사상균증에 의한 통증, 수술상, 혈관질환 상처, 각막상처, 욕창, 와창, 당뇨성피부 미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 상처, 부인과적 상처, 화학적 상처 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 상처인, 상처 치유용 약학적 조성물.
(a) 식물 유래 세포외소포체를 제조하는 단계;
(b) 세포외소포체에 포피라334를 혼합하는 단계;
(c) 파쇄하는 단계; 및
(d) 인큐베이션하는 단계를 포함하는 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 제조방법.
제 10항에 있어서, 식물 유래 세포외소포체는 식물 세포 배양액 또는 식물 배양근 배양액을 여과 및 농축하여 제조하는, 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 제조방법.
제 10항에 있어서, 세포외소포체 4.48 X 10⁸ 내지 10¹⁰ particles/mL에 포피라334를 5 내지 100 mg 혼합하는, 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 제조방법.
제 10항에 있어서, 파쇄는 3,000 내지 40,000 rpm으로 5 내지 60분 동안 균질화기로 수행되는, 포피라334가 봉입된 세포외소포체의 제조방법.