FR2899478A1 - Procede d'extraction de molecules de nacre, compositions et utilisation - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des molécules extraites de la nacre de mollusques et leur procédé d'extraction. Elle concerne également une composition, en particulier comestible, comprenant des molécules extraites de la nacre. La composition comestible selon l'invention est plus particulièrement destinée à favoriser le maintien du capital osseux, l'hydratation de la peau et/ou la restructuration de l'épiderme et du derme.

Description

PROCEDE D'EXTRACTION DE MOLECULES DE NACRE, COMPOSITIONS ET UTILISATION.

La présente invention concerne des molécules extraites de la nacre de mollusques et leur procédé d'extraction. Elle concerne également une composition, en particulier comestible, comprenant des molécules extraites de la nacre. La composition comestible selon l'invention est plus particulièrement destinée à favoriser le maintien du capital osseux, l'hydratation de la peau et la restructuration de l'épiderme et du derme.

INTRODUCTION

La nacre est une structure calcifiée formant la couche brillante interne de la coquille de certains mollusques. Elle est composée de cristaux de carbonate de calcium et de composés organiques, représentés principalement par des protéines et des polysaccharides et présente une exceptionnelle structure microscopique et une résistance mécanique importante.

On sait que la nacre est composée de molécules actives sur le plan pharmacologique ou esthétique. Par exemple, la nacre a été utilisée depuis l'Antiquité en esthétique et dans les pharmacopées traditionnelles. Par ailleurs, la nacre est connue pour ses propriétés régénératrices des os. En effet, la poudre de nacre, de même que sa matrice hydrosoluble ont démontré leur compatibilité biologique in vivo et in vitro, ainsi que leur capacité à promouvoir l'ostéogenèse en favorisant l'activité des ostéoblastes et de leurs précurseurs (voir la demande PCT WO 97/24133). Ainsi, des implants en nacre de Pinctada placés dans des os ou dans la moelle osseuse induisent la formation d'os nouveau. Ces implants en nacre après différents examens présentent une faible altération de leur surface qui est nécessaire à leur bonne intégration dans l'os. Des analyses microscopiques récentes ont montré la présence d'ostéoclastes à l'interface os/nacre. II est admis que la résorption limitée de la nacre par des ostéoclastes est à l'origine de la libération de molécules qui agissent sur les cellules formatrices d'os et leurs précurseurs. Des fragments de nacre provenant du bivalve Pinctada sont capables d'induire une réponse biologique lorsqu'ils sont implantés dans l'os du chien, du mouton, ou de l'homme. Cette réponse correspond à une activité ostéogénique locale et une intégration de la nacre dans l'os de l'hôte sans réaction inflammatoire.

Il est donc souhaitable de pouvoir isoler les substances biologiquement actives présentes dans la nacre. Dans la demande de brevet WO 97/24133, il a été décrit un procédé permettant d'extraire un ensemble de molécules biologiquement actives à partir de la nacre. Cependant, ce procédé ne permet pas d'obtenir l'extrait d'intérêt de la nacre.

Dans la présente demande, les inventeurs ont mis au point un nouveau procédé permettant d'extraire des molécules actives de la nacre. De manière surprenante, ces derniers ont pu montrer que les molécules extraites selon le procédé de la présente invention peuvent avoir, chez un individu, des applications importantes dans le maintien de son capital beauté pour la peau et/ou de son capital osseux.

A ce titre, l'ostéoporose représente un problème de santé publique majeur. Elle ne concerne pas que la femme ménopausée, elle peut survenir très tôt dans la vie d'une personne, notamment sous l'effet de traumatismes liés au sport, à une mauvaise hygiène de vie et/ou au stress. Il est généralement admis que la perte osseuse est plus importante chez la femme âgée que chez l'homme du même âge. Bien qu'elle s'accélère lorsque la ménopause est installée, la perte osseuse la plus significative est observée pendant la période de péri-ménopause. Au cours de cette période, il existe en fait un déséquilibre entre formation et résorption osseuses, au détriment de la formation, qui conduit à une accélération du renouvellement de l'os. La résorption l'emporte sur la formation et in fine l'os formé est de mauvaise qualité, il montre une microarchitecture désordonnée. De manière générale, la perte de la masse osseuse commence dès l'âge de 25 ans chez une personne, et durant toute sa vie, il est souhaitable de préserver son capital osseux.

La littérature indique que, tous âges confondus, l'apport alimentaire de calcium joue un rôle positif sur la masse osseuse ou la réduction du risque de fracture dans la plupart des études (50 résultats positifs sur 52 études analysées). L'apport de calcium chez la femme ménopausée semble avoir des effets variables selon l'ancienneté de la ménopause. Dans les cinq premières années de la ménopause, la perte osseuse au niveau du radius est ralentie sans être stoppée complètement par l'apport calcique avec un effet maximal pour les apports de 1000 mg de calcium élément environ. L'effet du calcium sur la perte osseuse vertébrale semble inexistant pendant cette période. Pour les ménopauses plus anciennes, un apport calcique de 800 mg/j semble ralentir la perte osseuse au niveau du radius et partiellement au niveau du rachis. Un apport de 1000 mg/j de calcium semble également ralentir la perte osseuse de la tête fémorale.

Physiologiquement, le fonctionnement du tissu osseux sain est la conséquence de l'activité de 2 types de cellules : les cellules formatrices d'os, les ostéoblastes, et des cellules de la résorption de l'os, les ostéoclastes. La bonne qualité d'un os résulte de cet équilibre qui conduit à une masse osseuse physiologiquement optimale. La résorption contrôlée et limitée de l'os par les ostéoclastes est nécessaire à l'activation des cellules formatrices d'os que sont les ostéoblastes. II est ainsi souhaitable d'identifier des principes actifs qui permettent de préserver cet équilibre afin de favoriser le maintien du capital osseux d'un sujet.

La peau constitue une interface active entre le corps et l'extérieur, elle est soumise notamment aux effets cumulatifs de la pollution, de l'exposition au soleil ou d'une mauvaise hygiène de vie (tabac, alcool, etc.). Les composants de l'enveloppe cutanée, le derme et l'épiderme changent face à ces différentes agressions.

La peau est constituée de 2 couches cellulaires principales, l'épiderme composé de kératinocytes qui se différencient en cornéocytes, et le derme qui est constitué principalement de fibroblastes dispersés dans une matrice extracellulaire qu'ils fabriquent. Les origines embryonnaires de ces 2 types de cellules sont différentes : les kératinocytes sont d'origine ectodermique, tandis que les fibroblastes dérivent du mésoderme. Les fibroblastes et les kératinocytes ont des activités spécifiques, mais il existe entre ces cellules une communication étroite. Le derme et l'épiderme ne fonctionnent pas séparément mais ils sont étroitement associés et soutenus par une troisième couche qui sert de support aux deux premières, l'hypoderme.

L'épiderme est fabriqué par une couche de cellules actives (cellules souches germinales) situées au contact du derme. Ces cellules se différencient pour aboutir à des cellules spéciales kératinisées qui constituent la couche cornée. Cette différenciation se fait à partir de la jonction dermo-épidermique, où l'on distingue principalement la couche germinale puis la couche granuleuse et la couche cornée. Le fonctionnement dynamique de ce processus est fondamental pour la construction d'un épiderme jeune et solide bien attaché sur le derme. II est le résultat de l'effet de nombreux messages qui passent par des molécules impliquées dans l'activité cellulaire. Dans une peau dynamisée, épiderme et derme communiquent constamment et c'est le derme qui "parle" à l'épiderme notamment par l'intermédiaire de messagers moléculaires de type facteurs de croissance.

Au cours du vieillissement, les différentes couches de la peau s'amincissent. Les fibroblastes deviennent moins actifs et produisent moins de matrice extracellulaire et la microcirculation se réduit également. L'épiderme se déstructure et le derme perd sa tonicité, l'hypoderme s'infiltre de cellules graisseuses.

L'identification de molécules utilisables dans le maintien de l'aspect de la peau permettrait d'éviter ou de retarder l'apparition d'une telle perte de tonicité et de toutes les conséquences du vieillissement de la peau. Les molécules extraites grâce au procédé de la présente invention peuvent être comprises dans des compositions, de préférence comestibles, destinées à30 favoriser le maintien du capital osseux, l'hydratation de la peau et/ou la restructuration de l'épiderme et du derme. RESUME DE L'INVENTION Un objet de l'invention concerne un procédé d'extraction de molécules biologiquement actives à partir de la nacre de la coquille d'un mollusque.

Un autre objet de l'invention concerne un extrait de molécules biologiquement 10 actives de nacre susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus.

La présente invention concerne également une composition, en particulier comestible, contenant un extrait de molécules de nacre susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de l'extrait selon l'invention ou de la composition, en particulier comestible, contenant ledit extrait dans la protection de la masse osseuse.

20 La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de l'extrait selon l'invention ou de la composition, en particulier comestible, contenant ledit extrait dans l'hydratation de la peau et la restructuration de l'épiderme et/ou du derme.

La présente invention a également pour objet un extrait de molécules de nacre 25 susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus, utilisé à titre de médicament.

La présente invention à en outre pour objet l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre susceptible d'être obtenu par le procédé de la présente invention, pour la préparation d'un médicament pour le traitement des désordres 30 liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu osseux, en particulier pour le traitement de l'ostéoporose. 15 LEGENDE DES FIGURES

Figure 1: Protocole d'obtention d'une poudre de nacre de granulométrie de 128 pm.

Figure 2: Effet de la concentration en extrait selon l'invention (20-650 pg protéine/ml) sur le nombre d'ostéoclastes adhérant (A) et sur la résorption osseuse (B) après 48 h de culture à 37 C et 5% de CO2. (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).

Figure 3: Organigramme représentant le déroulement chronologique d'une étude de l'effet de l'extrait de molécules de nacre selon l'invention sur le remodelage osseux.

15 Figure 4: Effets des molécules extraites de la nacre sur l'amélioration de la jonction dermo-épidermique. Etude sur des expiants de peau à J2. 1 : Témoin sans soin. Epiderme (E). Derme papillaire (D). Jonction dermoépidermique (-). Gx630. L'épiderme est peu épais et plat avec une couche kératinisée opaque épaisse (4) et aplatie. Les différentes couches cellulaires de 20 l'épiderme sont absentes. Les cellules de la couche cellulaire germinative ou cellules souches sont peu actives (D) et cette couche n'est pas ancrée dans le derme. 2 : Témoin soin placebo. L'épiderme (E) est plus épais que celui du témoin sans soin et la couche kératinisée régulière présente un relief (4). On ne distingue pas 25 les différentes couches cellulaires épidermiques. Les cellules souches sont actives (D). La jonction dermo-épidermique (-) est légèrement festonnée. Le derme (D) est peu irrigué. 3 : Soin à 2 mglcm2 : L'épiderme (E) est plus épais que dans le cas des deux contrôles. La couche kératinisée n'est plus opaque et épouse les microreliefs 30 cutanés. On distingue toutes les couches cellulaires épidermiques : - couche germinative avec cellules très actives (D) ; couche des cellules claires de Malpighi (*), couche granuleuse (n), couche kératinisée (4). 4 : Soin à 4 mglcm2 : La couche germinale dermo-épidermique est plus 6 10 profondément ancrée dans le derme et les micro-vaisseaux du derme papillaire en contact sont plus abondants et dilatés (k).

Figure 5: Effets des molécules extraites de la nacre sur la respiration cellulaire 1 : J2. Témoin, sans soin : Aucun marquage d'une activité respiratoire. Situation cohérente avec une peau atone, vieillie. Jonction dermo-épidermique (-). Couche kératinisée de l'épiderme (-t). 2 : J2. Témoin, placebo : Légère activité respiratoire localisée au niveau de la couche des cellules germinales (marron). 3 : J2. Soin avec la formulation à base de molécules extraites de la nacre : 4 mg/cm2 : Activité respiratoire intense en périphérie des cellules germinales souches (marron) avec une localisation spécifique au pôle basal (D) témoignant des communications avec la matrice extracellulaire dermique. 4 : J4. Soin avec la formulation à base de molécules extraites de la nacre : 4 mg/cm2 : même résultat que pour J 2. L'effet sur la respiration cellulaire est durable.

Figure 6: Effet de la poudre de nacre sur la stimulation des fibroblastes 1 : Section montrant chez le rat, l'implant de nacre (N) entre le derme et l'hypoderme. Les fibroblastes sont organisés autour de la nacre et sont activés (-p). Ils montrent une morphologie de cellules actives : un noyau clair avec de nombreux nucléoles. Ils ont synthétisés une matrice extracellulaire (-) qui devient métachromatique après coloration au bleu de toluidine démontrant la présence de protéoglycannes. Une microvascularisation et des capillaires sanguins sont présents dans le derme entourant les fragments de nacre (*). Barre = 50 pm. 2 : Coupe montrant la nacre implantée (N) qui se dissout progressivement. Le marquage immunologique de la collagènase (coloration brune) est située sur les fragments de nacre (ù>). Les fibroblastes activés ont synthétisé une matrice extracellulaire (-). Le site d'implantation est bien vascularisé au moyen de capillaires sanguins (*). Barre = 50 pm. 3 : Capillaires sanguins (*) développés au niveau du derme 2 semaines après l'implantation. Erythrocytes (-*). Une inflammation chronique n'est pas observée. Barre = 50 pm. Coloration au bleu de toluidine. 4 : La nacre (N) implantée dans le derme provoque un recrutement des fibroblastes. Par chimiotactisme la nacre induit la formation de clusters de fibroblastes activés (-). L'activité des fibroblastes est stimulée, comme le montre les divisions cellulaires (). Microvacularisation (*). Coloration au bleu de toluidine. Barre = 50 pm Figure 7: Effet de la poudre de nacre sur la stimulation des fibroblastes (suite) 1 : Section au niveau de l'implant montrant un réseau dense riche en collagène de type I (-) après immunomarquage (coloration brune). Capillaires sanguins (*). Contre coloration au bleu de toluidine. Barre = 50 pm. 2 : Immunomarquage du collagène de type III (coloration brune) 2 semaines après l'implantation dans le derme (-). Le collagène de type III, un collagène juvénile, est produit par les fibroblastes activés en contact étroit avec les fragments de Nacre (N). Matrice extracellulaire métachromatique synthétisée par les clusters de fibroblastes activés (e). Microvascularisation M. Contre coloration au bleu de toluidine. Barre = 50 pm. 3 : Section au niveau du site de l'implantation. Immunomarquage intense de la décorine (coloration brune) qui forme un réseau dense (-). La décorine entoure les fibroblastes activés (-*). Matrice extracellulaire métachromatique (*). Contre coloration au bleu de toluidine. Barre = 100 pm.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Les présents inventeurs ont identifié un procédé permettant d'extraire des molécules de la nacre de mollusques nacriers, en particulier de Pinctada margaritifera, permettant de favoriser le maintien du capital osseux, d'améliorer et/ou protéger la structure de la peau, en particulier pour favoriser ou maintenir l'hydratation de la peau ou favoriser la restructuration de l'épiderme et/ou du derme.

Un objet de l'invention concerne donc un procédé d'extraction de molécules biologiquement actives à partir de la nacre de la coquille d'un mollusque nacrier, lequel procédé comprend les étapes suivantes : (i) la couche de nacre de la coquille du mollusque est réduite en poudre d'une granulométrie comprise entre 1 et 200 pm, de préférence entre 50 et 130 pm ; (ii) ladite poudre est mélangée dans une solution à base d'eau de solvant organique polaire dont le rapport volumique solvant organique polaire:eau varie de 1:99 à 99:1 ; et (iii) la fraction aqueuse de la suspension résultante est séparée de la fraction insoluble.

La nacre utilisée dans le procédé peut être obtenue à partir de coquilles de mollusques nacriers (mollusques capables de former de la nacre), en particulier à partir d'huîtres et plus spécifiquement des huîtres du genre Pinctada et plus particulièrement du genre Pinctada espèce margaritifera.

La séparation de la nacre du reste de la coquille peut être réalisée par tout moyen connu en soi et en particulier par meulage.

La réduction de la nacre en une poudre de granulométrie adéquate sera réalisée par tout moyen adapté au matériau de départ, notamment par broyage, concassage et/ou meulage. La pulvérisation de la nacre peut notamment être réalisée en plusieurs étapes, notamment dans un premier temps par concassage, puis éventuellement par différentes techniques de broyage. De manière préférentielle, on procède à un broyage par la technique Jarre + Bille de corindon afin d'éviter toute contamination métallique.

La nacre peut être utilisée sans décontamination préalable. Toutefois, la nacre, en particulier avant d'être réduite en poudre, peut être avantageusement décontaminée, notamment par lavage(s) décontaminant(s), par exemple dans une solution d'hypochlorite de sodium, puis par séchage.

La nacre peut également être stérilisée, avant, pendant ou après avoir été réduite en poudre, par toute méthode connue en soi. En particulier, la stérilisation est mise en oeuvre par irradiation (irradiation aux rayons gamma) ou à chaud (chaleur sèche ou humide) (Atlan G., Delattre O., Berland S., Le Faou A., Nabias G., Cot D., Lopez E., Interface between bone and Nacre implants in sheep, Biomaterials, 1999, 20 : 1017-1022 ; Balmain J., Hannoyer B., Lopez E., Fourier transform infrared spectroscopy (FITR) and X-Ray diffraction analyses of minerai and organic matrix during heating of mother of pearl (Nacre) from the shell of the mollusc Pinctada maxima, J. Biomed. Mater. Res. Applied Mat., 1999, 48 (5) : 749-754).

De préférence, l'étape (ii) est réalisée à une température comprise entre 15 et 40 C, de préférence à température ambiante (entre environ 18 et 25 C) éventuellement sous agitation. La poudre de nacre est de préférence mélangée au solvant à l'étape (ii) pendant une durée de 30 min à 20 h, de préférence pendant environ 12 heures.

A l'étape (ii) du procédé de l'invention, une extraction est réalisée dans une 20 solution comprenant de l'eau et un solvant organique polaire. En particulier, le solvant organique polaire est choisi parmi les alcools, hydrocarbones halogénés, esters, cétones, aldéhydes, éthers, le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (DMSO), l'acétonitrile, le nitrobenzène, le tétrahydrofurane (THF), la pyridine et le N-méthylformamide. De manière préférée, les alcools, 25 hydrocarbones halogénés, esters, cétones, aldéhydes, et/ou éthers sont des composés contenant 1 à 6 atomes de carbone, encore plus préférentiellement 1 à 4 atomes de carbone. Préférentiellement, le solvant organique polaire est choisi parmi le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le n-propanol, le tert-butanol, le nbutanol, l'acétone, l'acétonitrile et l'acétone. Dans un mode de réalisation 30 particulier, la solution d'extraction est un mélange d'eau et de plusieurs solvants organiques polaires tels que définis ci-dessus, dont le rapport volumique solvants organiques polaires:eau est compris dans l'intervalle 1:99 -- 99:1. Dans un mode15 particulièrement préféré de réalisation, le solvant organique polaire utilisé est l'éthanol.

Dans une variante de réalisation, le rapport volumique solvant organique polaire:eau est, de préférence, compris entre 20:80 et 80:20 et de manière plus préférée ce rapport volumique est de 50:50.

A l'étape (iii) du procédé selon l'invention, la fraction aqueuse de la suspension obtenue à l'étape (ii) séparée de la fraction insoluble correspond avantageusement à l'extrait désiré. Cette séparation est réalisée par tout moyen connu en soi, et en particulier par centrifugation et/ou filtration, de préférence par centrifugation puis par filtration. Plus spécifiquement, la suspension obtenue à l'issue de l'étape de mélange est centrifugée pendant 20 minutes à 4 C à 20 000 g, puis le surnageant est filtré sur des membranes hydrophiles de 0,22 pm.

Selon une variante de réalisation, le filtrat obtenu peut être concentré, de préférence par évaporation, et en particulier par évaporation sous vide à 30 C.

Dans un mode de réalisation du procédé d'extraction selon l'invention, une étape supplémentaire de dissolution et de lyophilisation de l'extrait organique humide peut être mise en oeuvre.

La fraction insoluble écartée à l'étape (iii) du procédé ci-dessus comprend du carbonate de calcium. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention peut en outre comprendre la réintroduction de carbonate de calcium, en particulier du carbonate de calcium retiré à l'étape (iii) du procédé, avant utilisation de l'extrait tel qu'obtenu ci-dessus.

L'invention concerne également les molécules susceptibles d'être extraites par ce procédé. Plus spécifiquement, l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé de la présente invention comprend essentiellement un mélange de protéines, de peptides et de molécules organiques dont la masse est comprise entre 50 et 1000 Da. L'extrait comprend en outre toutes substances solubles dans le solvant utilisé, en particulier des substances hydrosolubles organiques ou encore des lipides polaires.

L'invention concerne non seulement le mélange susceptible d'être obtenu par le procédé décrit ci-dessus, mais également les diverses substances purifiées par fractionnement à partir du mélange, et en particulier à partir du produit soluble complet.

Les molécules de nacre extraites par le procédé selon l'invention se sont révélées être utilisables en tant que composant d'une composition, en particulier comestible. Ainsi, La présente invention concerne également une composition, en particulier comestible, comprenant des molécules extraites de la nacre susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus.

La composition selon l'invention est particulièrement utile pour favoriser le maintien du capital osseux d'un sujet. Plus spécifiquement, le sujet présente, ou est susceptible de présenter, un capital osseux altéré par un traumatisme, un désordre ou une pathologie et notamment l'ostéoporose ou tout autre facteur intrinsèque ou extrinsèque pouvant provoquer une déminéralisation avec perte de masse osseuse. En favorisant le maintien du capital osseux, les molécules de nacre extraites par le procédé selon l'invention permettent également de protéger la masse osseuse d'un individu tout au long de sa vie.

Les présents inventeurs ont ainsi pu démontrer que les molécules extraites de la nacre obtenues par le procédé décrit ci-dessus sont biologiquement actives en ce sens qu'elles ont une influence sur la dégradation du tissu osseux par les ostéoclastes. Les molécules extraites de la nacre représentent donc un grand intérêt pour la protection de la masse osseuse (capital osseux) et notamment au moment d'une ostéoporose déclarée, comme par exemple l'ostéoporose post- ménopausique, l'ostéopénie due au vieillissement, l'ostéopénie d'immobilisation et autres. Dans ces désordres osseux, l'os devient sensible aux fractures car sa dégradation est plus importante que sa formation et la matrice organique devient moins apte à minéraliser.

Une telle composition, en particulier comestible, peut être utile pour protéger, renforcer le capital osseux ou favoriser la restauration du capital osseux d'un sujet. En particulier, les compositions, de préférence comestibles, selon l'invention peuvent être utilisées pour protéger la masse osseuse au cours de la vie d'un individu. De telles compositions peuvent également être utilisées au cours de la croissance d'un individu dans le but de favoriser son équilibre squelettique ou bien également lors de la pratique d'un sport.

De plus, l'extrait selon l'invention s'est révélé être utilisable en tant que composant d'une composition, en particulier comestible, améliorant ou maintenant l'hydratation de la peau et/ou restructurant l'épiderme et le derme d'un sujet. Les présents inventeurs ont ainsi pu démontrer que l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention présente des effets biologiques de stimulation de la régulation de la prolifération cellulaire et de l'activité tissulaire de la peau, en particulier des fibroblastes et/ou des kératinocytes. Des tests in vivo ont aussi permis de montrer que les molécules actives extraites de la nacre selon l'invention possèdent des propriétés sur l'hydratation de la peau et/ou favorisent la redensification du derme en stimulant l'activité de synthèse des fibroblastes.

Les molécules extraites de la nacre représentent donc un grand intérêt pour l'amélioration de l'aspect de la peau ou pour sa protection.

La stimulation cellulaire observée sous l'effet des molécules extraites de la nacre selon la présente invention peut, en particulier, contribuer à drainer et estomper les poches et/ou les cernes. Les inventeurs ont en effet également observé que les molécules extraites de la nacre selon l'invention agissent directement au niveau de l'hypoderme qui stocke la graisse et l'eau.

L'extrait ou la composition selon l'invention, en particulier comestible, peut également être utilisé pour augmenter ou préserver le capital cutané (ou capital beauté ) d'une personne. En particulier, l'extrait selon l'invention ou les compositions, de préférence comestibles, selon l'invention peuvent être utilisés pour drainer ou estomper les poches et/ou les cernes ou empêcher leur apparition, préserver ou améliorer l'hydratation, la fermeté, la douceur de la peau ou encore le teint du visage ou du corps. Ces mêmes compositions, en particulier comestibles, peuvent être utilisées dans le but de protéger la peau contre les radicaux libres (néfastes pour la peau) ou encore contre les agressions du soleil ou plus généralement toute attaque de facteurs intrinsèques ou extrinsèques néfastes à la peau (tabac, alcool, pollution,

.). L'extrait ou la composition, en particulier comestible, selon l'invention peuvent aussi favoriser, en particulier stimuler de manière régulée, la microcirculation et l'oxygénation de la peau, permettant ainsi une meilleure élimination des toxines...DTD: L'extrait ou la composition selon l'invention peut également être utilisé pour diminuer les rides et/ou ridules ou prévenir leur apparition, pour prévenir ou traiter le vieillissement de la peau et en particulier le vieillissement dû à l'âge, au soleil ou autre. L'extrait ou la composition selon l'invention permettent aussi de prévenir les défauts de pigmentation (taches brunes et taches blanches) et/ou de les atténuer.

Les compositions, en particulier comestibles, selon l'invention peuvent avantageusement être administrées par voie orale. Ainsi, on entend par composition comestible une composition alimentaire ou nutraceutique dont les constituants sont destinés à être ingérés en tout ou partie. Avantageusement, la composition selon l'invention peut être préparée parexemple sous la forme de biscuits, barres alimentaires, poudres à diluer, pâte à mâcher, produits laitiers tels qu'un yaourt, ou encore sous la forme de compléments alimentaires tels que comprimés ou capsules à avaler, comprimés effervescents, sirops, boissons, gommes tendres, suspensions huileuses ou gélules.

Les compositions selon l'invention comprennent, outre l'extrait, des composés classiquement utilisés dans les domaines considérés, en particulier pour une administration par voie orale. L'homme du métier détermine, avec ses connaissances, les composés les plus adaptés à l'utilisation envisagée, ainsi que leur quantité. A titre d'exemple, non limitatif, de tels composés, on peut citer l'huile de bourrache, béta-carotène, le sélénium, le carbonate de calcium, la lécithine de soja, l'Huile d'Onagre, les vitamines E, C, et/ou D (sous forme de calcipotriol), le lycopène, de l'huile de poisson (EPA/DHA), ou leur mélange.

Ainsi, les compositions, en particulier comestibles, selon l'invention sont d'un 5 emploi non contraignant et un sujet peut consommer de telles compositions pour en tirer tous les bénéfices décrits ci-dessus de manière agréable et aisée.

Par exemple, des effets positifs sur le teint, mais aussi une amélioration de la pigmentation qui est régulée et unifiée, de la fermeté et de la douceur cutanées du 10 visage, des jambes ou encore des bras peuvent être obtenus en consommant les compositions, en particulier comestibles, de la présente invention. De plus, l'utilisation de telles compositions selon l'invention permet de prévenir les défauts de pigmentation (taches brunes et taches blanches) et/ou les atténue.

15 Avantageusement, les compositions de la présente invention peuvent aussi contenir du carbonate de calcium. Plus particulièrement, ledit carbonate de calcium est le carbonate de calcium récupéré après précipitation à partir de la poudre de nacre à l'étape (iii) du procédé décrit ci-dessus. Comme spécifié précédemment, l'apport alimentaire de calcium joue un rôle positif sur la masse 20 osseuse ou la réduction du risque de fracture. Ces propriétés seront donc avantageusement mises à profit dans une composition contenant à la fois du carbonate de calcium, qui joue un rôle sur la reconstruction du tissu osseux, et les molécules extraites par le procédé décrit ci-dessus, dont l'effet porte principalement sur la prévention de la dégradation de ce même tissu osseux. 25 L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre obtenu selon le procédé décrit ci-dessus à titre de médicament.

Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique 30 comprenant des molécules extraites selon la présente invention, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique.5 Une telle composition pharmaceutique peut être utile dans le traitement de désordres liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu osseux, en particulier de l'ostéoporose, et plus spécifiquement l'ostéoporose post-ménopausique, l'ostéopénie due au vieillissement, l'ostéopénie d'immobilisation et autres. L'invention a également pour objet l'utilisation de l'extrait selon l'invention dans la préparation d'une composition pharmaceutique, en particulier dermatologique à administrer par voie orale, destinée à hydrater la peau et restructurer l'épiderme et le derme. 10 L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des désordres liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu osseux.

15 L'invention comprend en outre l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des désordres cutanés liés à un défaut d'hydratation de la peau ou a une structure altérée de l'épiderme et/ou du derme.

20 La présente invention concerne également un procédé pour préserver ou améliorer l'hydratation, la fermeté, la douceur de la peau ou encore le teint du visage, comprenant l'administration, de préférence orale, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait de nacre tel que défini précédemment.

25 L'invention a également pour objet une méthode de traitement des désordres du renouvellement du tissu osseux, en particulier l'ostéoporose, et plus spécifiquement l'ostéoporose post-ménopausique, l'ostéopénie due au vieillissement, l'ostéopénie d'immobilisation ou médicamenteuse (par exemple, traitement à la cortisone) et autres, comprenant l'administration à un mammifère, 30 en particulier à un être humain, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait de nacre tel que défini précédemment.

L'invention a enfin pour objet une méthode de traitement des désordres cutanés liés à un défaut d'hydratation de la peau ou a une structure altérée de l'épiderme et/ou du derme comprenant l'administration à un mammifère, en particulier à un être humain, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait de nacre tel que défini précédemment.

D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre illustratif et non limitatif.

EXEMPLES

Exemple 1 : Préparation d'un extrait de molécules de nacre

De la poudre de nacre de granulométrie 128 pm est obtenue grâce au 15 protocole schématisé sur la figure 1.

La poudre de nacre (200 g) est mélangée dans 200 ml d'un mélange eau:éthanol (50:50) pendant 12 heures à température ambiante et sous agitation magnétique interne. La suspension est centrifugée pendant 20 min à 20 000 g et à 20 4 C. Le surnageant est filtré sur une unité de stérilisation type Stericup pour éliminer les particules de poudre en suspension. Le filtrat est évaporé sous vide à 30 C afin d'éliminer l'éthanol ayant servi à l'extraction. La solution aqueuse est congelée puis lyophilisée. C'est cette solution qui est utilisée dans les exemples qui suivent. 25 De la même manière, une extraction de molécules de nacre a été réalisée dans un mélange eau:isopropanol (50:50), eau:acétone (50:50), ou eau:butanol (50:50). Une analyse chromatographique a montré que les extraits obtenus par ces différents procédés d'extraction présentent un profil moléculaire similaire. Exemple 2 : Essais biologiques in vitro 30 . Protocole Des expériences ont été entreprises in vitro dans le but de comprendre les relations qui existent entre les extraits selon l'invention et les ostéoclastes.

Les ostéoclastes sont isolés de fémurs de lapin de 10 jours, puis ils sont déposés sur des lamelles d'os de boeuf de 100 dam d'épaisseur. Dans le milieu de culture, sont ajoutées différentes concentrations de l'extrait tel qu'obtenu à l'exemple 1. La concentration de l'extrait de nacre ajouté au milieu de culture varie entre 40 et 2600 pg /ml. La thapsigargine (1 pM) a été choisie comme témoin positif d'inhibition de la résorption osseuse. Les cellules sont ensuite cultivées pendant 48 heures à 37 C sous une atmosphère de 5 % de CO2.

Pour évaluer le nombre d'ostéoclastes présents sur les lamelles d'os, les cellules ont été fixées puis colorées par un marqueur ostéoclastique spécifique, la phosphatase acide resistante au tartrate ("Tartrate Resistant Acid Phosphatase" ou TRAP). Les cellules multinucléées avec un nombre de noyaux supérieur ou égal à 3 et TRAP positives (colorées en violet) ont été considérées comme étant des ostéoclastes (Figure 2 A).

Pour évaluer la résorption, les lamelles d'os ont été débarrassées de leurs ostéoclastes et colorées par une solution de bleu de toluidine permettant la visualisation des lacunes de résorption en microscopie optique. Le pourcentage de surface résorbée par rapport à la surface totale a été quantifié en utilisant un logiciel d'analyse d'image couplé à un microscope optique (Figure 2 B). 2. Résultats Même si l'extrait selon l'invention n'a pas d'effet significatif sur l'adhésion des ostéoclastes, excepté pour la concentration maximale de 2600 pg d'extrait/mi (ainsi que pour le témoin positif thapsigargine), ce dernier diminue la résorption osseuse de façon dose dépendante.

Ces expériences in vitro montrent que les extraits selon l'invention agissent sur l'activité de résorption osseuse due aux ostéoclastes. Les extraits selon 18 l'invention diminuent la résorption osseuse par les ostéoclastes. Ces extraits n'affectent pas l'adhésion des ostéoclastes à la surface des lamelles d'os.

Exemple 3: Essais biologiques in vivo Pour confirmer ces résultats obtenus in vitro une étude clinique a été réalisée. L'objectif de cette étude était de comparer l'influence de l'apport quotidien de 798 mg de carbonate de calcium et 2 mg d'extrait tel qu'obtenu à l'exemple 1 à celle d'un placebo sur les paramètres biochimiques du remodelage osseux de la femme ménopausée, sur une durée totale de trois mois.

1. Conditions de l'étude (figure 3)

Il s'agissait d'une étude en double aveugle, randomisée, multicentrique, avec bénéfice individuel direct potentiel, réalisée sur des femmes ménopausées. Après signature du consentement éclairé et vérification des critères de sélection, les volontaires ont été randomisées en deux groupes. L'un a reçu deux capsules du complément alimentaire apportant chacune 399 mg de carbonate de calcium et 1 mg de l'extrait selon l'invention, l'autre a reçu deux capsules placebo. Chaque groupe était traité sur une durée de 3 mois. Un prélèvement sanguin a été effectué juste au moment de la randomisation et à l'issue des trois mois de traitement afin d'évaluer l'effet du traitement sur les marqueurs biochimiques du remodelage osseux et sur les paramètres du bilan lipidique. Un appel téléphonique a été réalisé par les médecins afin d'évaluer les 25 éventuels effets secondaires ressentis.

Les critères d'inclusion étaient les suivants : - Sujets de sexe féminin ne souffrant d'aucune pathologie grave - Age 45-60 ans 30 - BMI >27 kg/m2 - Ménopause datant de plus d'un an et de moins de six ans - Ne souffrant pas de pathologie hépatique (ASAT et ALAT < 1,5 fois la limite supérieure des valeurs normales), ni de troubles gastrointestinaux - Ne souffrant pas de pathologie rénale (créatinine dans les limites des valeurs normales) - Ne souffrant pas de pathologie osseuse connue - Avec ou sans traitement hormonal de substitution pour la ménopause ou traitement équivalent - Ne recevant pas de traitement susceptible de modifier le métabolisme osseux depuis plus d'un an - Ne recevant pas de traitement susceptible d'affecter le métabolisme lipidique, sauf si aucune variation de ce traitement n'est susceptible d'intervenir pendant la période de l'essai - Ne souffrant pas de dyslipidémie modérée, même traitée, (LDL-cholestérol > 1.30 g/L et/ou triglycérides > 1,50 g/L) - Ne souffrant pas de dysthyroïdie (TSH dans les limites des valeurs normales avec ou sans traitement hormonal) - Ne souffrant d'aucune allergie alimentaire connue - FSH > 30 Ul/mL Estradiol < 50 pg/ml Ont été exclues de l'étude, les femmes présentant au moins l'un des critères suivants : - Age < 45 ans ou > 60 ans BMI > 27 kg/m2 -Ménopause datant de moins d'un an ou de plus de six ans - ASAT et/ou ALAT > 1,5 fois la limite supérieure des valeurs normales - Créatinine à la limite supérieure des valeurs normales - Antécédents de pathologie osseuse - Traitement susceptible de modifier le métabolisme osseux depuis moins d'un an (A l'exception du THS ou autre traitement équivalent de la ménopause) - Traitement affectant le métabolisme lipidique susceptible d'être modifié pendant la période de l'essai LDL-Cholestérol > 2,20 g/L et/ou triglycérides > 2,50 g/L - TSH < à la limite inférieure des valeurs normales ou > à la limite supérieure des valeurs normales -Traitement hormonal de substitution pour la fonction thyroïdienne mal équilibré - Anti-thyroïdiens de synthèse - Antécédents d'allergie alimentaire - FSH <30 Ul/mL - Estradiol > 50 pg/ml - Plus généralement toute condition susceptible d'empêcher la participation à l'essai dans de bonnes conditions et sans risque pour la patiente. 2. Produits à l'étude Complément alimentaire A (extrait de nacre) : chaque capsule contient 399 mg de carbonate de calcium, 1 mg de l'extrait de l'exemple 1, et 210 mg d'huile de tournesol. Produit placebo : les capsules contiennent de l'huile de tournesol.

Les tuniques des capsules molles du complément alimentaire A et du placebo sont identiques et contiennent de l'amidon, de la gélatine de poisson, de la glycérine, de l'eau et le Candurin comme colorant. La consommation des produits consiste en la prise quotidienne de 2 capsules/jour (au petit déjeuner) pendant les 3 mois de l'étude. Etant donné qu'il s'agit d'un essai en double aveugle, ni la patiente, ni le médecin ne sait quel produit est consommé par chacune des volontaires. 3. Description de la population étudiée Nombre de sujets Le paramètre principal d'évaluation est l'évolution du CTX. Les valeurs moyennes observées chez la femme ménopausée avec la méthode de dosage envisagée (Cross Laps Nordic Bioscience Diagnostics) sont de 3634 pmol IL, avec un écart-type de 1833 pmol/L. Le calcul du nombre de sujets a été effectué en prenant deux hypothèses de diminution de ce paramètre (35% et 55%), considérées comme les valeurs minimales et maximales permettant de prédire une réponse positive de la densité minérale osseuse. Le risque alpha unilatéral a été fixé à 0,05 et le risque béta à 0,20 ou 0,10. Le résultat de ce calcul est présenté dans le tableau 1 ci-dessous.

Tableau 1 Diminution du CTX Alpha 0,05/Béta 0,10 Alpha 0,05/Béta 0,20 35% 35 25 55% 14 10 Le nombre initial de sujets a donc été fixé à 25, ce qui correspondait à 10 l'hypothèse intermédiaire. L'essai a débuté en juin 2003, sur 40 sujets, nombre qui au vu du calcul statistique ci-dessus, reste significatif sur le plan clinique.

Cinquante sept femmes ont été pré-incluses dans l'étude, 14 n'ont pas été 15 incluses dans l'étude, 43 ont été randomisées et mises sous traitement, 6 ont abandonné entre V1 et V2. Conformément au protocole, les volontaires incluses pour cette étude étaient tous de sexe féminin, d'âge compris entre 45 et 60 ans et présentant une ménopause datant de plus d'un an et de moins de six ans. Nombre de sujets à vo : 57 20 Nombre de sujets à V1 : 43 Nombre de sujets à V2 : 37 Parmi les abandons, 5 sujets n'ont pas souhaité poursuivre, 1 sujet a été perdu de vue.

25 Description de la méthodologie statistique La comparabilité des valeurs biologiques et cliniques de base (à V1) a été déterminée par un test non paramétrique de Wilcoxon. Le même test a permis de comparer les résultats obtenus dans chaque groupe à V2, sur les valeurs absolues et les variations entre V1 et V2 ((Valeur V2-ValeurV1)/valeur V1, en %). 30 Les critères descriptifs de la population (traitements concomitants et antécédents médicochirurgicaux) sont comparés par un test du X2 .

Le critère principal d'efficacité est l'évolution de la concentration sérique du CTX. L'influence du traitement sur la concentration de ce paramètre a été évaluée par un test non paramétrique de Wilcoxon comparant les valeurs obtenues après trois mois de traitement (V2) dans le groupe correspondant au traitement 1, à celles obtenues à la même période dans le groupe correspondant au traitement 2. La même analyse a été effectuée en comparant l'évolution entre VI et V2 dans chaque groupe de traitement. Les critères secondaires d'efficacité sont les phosphatases alcalines osseuses, l'ostéocalcine, la calcémie, la phosphatémie et les paramètres du bilan 10 lipidique, évalués selon la même méthode. L'appréciation de la tolérance a été réalisée sur l'analyse des paramètres biochimiques du bilan hépatique, la créatinine et l'éventuelle survenue d'évènements indésirables au cours de l'expérimentation.

15 Afin d'observer le rôle du traitement sur les différentes valeurs biologiques, la régression multiple suivante a été réalisée en prenant chaque variable biologique comme variable expliquée et les paramètres traitement (1 : Complément alimentaire A et 0 : placebo), le numéro de visite et le numéro de sujet comme variable explicatives. L'ensemble de l'analyse statistique a été 20 réalisé sur le logiciel SAS, version 8.2 (SAS Institute, Cary NC, USA).

4. Résultats Valeurs cliniques 25 Comparaison des valeurs cliniques au début de l'expérimentation Tableau 2 Variable Placebo Produit A P Poids (Kg) 60,67 11,73 (n=15) 60,59 9,68 (n=22) 0,8856 Min - Max 44,7 û 95, 3 42,8 - 84 Masse grasse (Kg) 19,96 7,78 (n=18) 20,14 9,05 (n=20) 0, 7258 Min - Max 8,9 - 45 5 - 41,4 Masse sèche (Kg) 40,06 6,72 (n=18) 38,99 6,95 (n=20) 0,5986 Min - Max 19 - 50 18,8 - 48 IMC (Kg/m2) 23,15 4,06 (n=19) 23,14 2,64 (n=22) 0,8241 Min - Max 15,84 - 35 19,05 - 28,29 P. artérielle Systolique (mm Hg) 120,5 12,49 (n=20) 127,29 12,06 (n=21) 0,0352* Min - Max 100-150 95-148 P. artérielle diastolique (mm Hg) 76,15 7,56 (n=20) 76,10 7,44 (n=21) 0,8715 Min - Max 60 - 85 60 Fréquence Cardiaque (s) 69,15 8,18 (n=20) 71,95 7,95 (n=21) 0,2828 Min - Max 55 - 88 57 - 88 * p<0,05 Comparaison des valeurs cliniques pour les deux populations avant la prise des traitements à l'étude Les valeurs cliniques sont comparables pour chacun des groupes à l'étude, excepté au niveau de la valeur de Pression artérielle Systolique pour laquelle une différence significative est observée.

Analyse des résultats obtenus à l'issue de la V2

Les valeurs obtenues à V2 sont comparées en valeurs brutes et en % calculés de la façon suivante : (V2-V1/V1)*100, par un test de Wilcoxon non paramétrique.

Les différences obtenues entre V2 et V1 sont par ailleurs comparées en intragroupe par un test de Wilcoxon apparié. Tableau 3 Placebo Produit A Différence Différence entre entre Traitements Traitements Valeur (V2-V1N1)% absolue (p) (p) _ 61,32 11,52 (n=19) 58,49 8,12 (n=17) 0,5262 0,3469 Poids (Kg) Comp. Intragroupe (p) 0,08 0,79 Masse grasse (Kg) 20,32 9,33 (n=17) 20,11 9,94 (n=15) 0,7769 0,3851 Comp. Intragroupe (p) 0,9677 0,3558 Masse sèche (Kg) 40,91 7,9 (n=17) 38,05 9,56 (n=15) 0,4615 0,2916 Comp. Intragroupe (p) 0,2836 0,3785 IMC (Kg/m2) 23,40 3, 89 (n=19) 22,84 2,75 (n=17) 0,6920 0,3469 Comp. Intragroupe (p) 0,0934 0,7752 P. art. Systolique (mm Hg) 124,7 10,75 (n=20) 127,71 13,24 (n=17) 0,2062 0,5701 Comp. Intragroupe (p) 0,0898 0,8123 P. art. diastolique (mm Hg) 76,75 7,81 (n=20) 75,35 9,99 (n=17) 0,5299 0,6120 Comp. Intragroupe (p) 0,6015 0,7134 Fréquence Cardiaque (s) 71,85 8,22 (n=20) 71,53 12,31 (n=17) 0,8664 0,1135 Comp. Intragroupe (p) 0,1805 0,8313 Moyenne écart type Aucune différence significative n'est observée entre les 2 groupes à l'issue de la visite V2, c'est à dire à l'issue de la prise du complément nutritionnel ou du placebo par les volontaires. Aucune différence significative n'est par ailleurs observée sur ces critères cliniques à l'intérieur d'un même groupe.

Analyse par régression multiple Une régression multiple a été réalisée sur les données cliniques obtenues pour déterminer l'influence du traitement indépendamment des autres facteurs. Le modèle a inclus les paramètres suivants : le temps, le sujet, le traitement. Aucun rôle significatif du traitement n'est observé pour ces paramètres cliniques.

Synthèse Aucune influence du traitement n'est observée sur l'évolution des critères cliniques observés que sont le poids total, l'IMC, la masse grasse et la masse sèche ainsi que les critères de pression artérielle et de fréquence cardiaque.

Valeurs biologiques Comparaison des valeurs biologiques au début de l'expérimentation

Pour le suivi des thérapeutiques visant à réduire l'ostéoporose, il est actuellement recommandé par l'International Osteoporosis Foundation (10F) de suivre un marqueur de résorption et un marqueur de formation osseuse. Les marqueurs de résorption les plus utilisés sont actuellement le CTX ( Collagen type I cross-linked C-telopeptide : C-terminal télopeptide à liaison croisée du collagène de type I ), le NTX ( Collagen type I cross-linked N-telopeptide : N-terminal télopeptide à liaison croisée du collagène de type I), dosés dans l'urine ou le sérum (pour le CTX) ou la désoxypyridinoline urinaire.

Les valeurs de base pour chacune des variables biologiques d'intérêt et pour chaque traitement, sont présentées dans le tableau ci-après. Aucune différence significative n'est observée. Les valeurs biologiques de base sont donc comparables pour chacun des 2 groupes à l'étude, sauf pour la créatinine, le calcium et l'ostéocalcine pour lesquels nous observons une différence entre les 2 groupes.

La comparaison des valeurs biologiques pour les 2 populations avant la prise des traitements à l'étude est montrée ci-dessous : Tableau 4 Traitement 0 : produit Traitement 1 : produit A Différence entre placebo (n=20) (n=17) Traitements (p) Calcium (mmol/L) 2,44 0,10 2,38 0,05 0,0086* Cholesterol (g/L) 2,31 0,35 2,29 0,34 0,3810 Créatinine (pmol/L) 73,55 13,3 65,65 6,97 0,0315* CTX (pmol/L) 5264,75 2483 4181,71 2016 0,2531 HDL (g/L) 0,71 0,16 0,76 0,16 0,3445 LDL (g/L) 1, 42 0,32 1,35 0,27 0,4831 Ostéocalcine (ng/ml) 14,61 5,28 1,57 5,2 0,0397* PALos (pg/L) 10,14 2,52 9,82 3,45 0,7837 Phosphore (mmol/L) 1,26 0,12 1,19 0,2 0,2283 Protéines totales (g/L) 73,35 3,83 72,53 4,11 0,5293 Triglycérides (g/L) 0,90 0,40 0,90 0,41 0,9757 TGO (UI/L) 0,32 0,07 0,33 0,09 0,7483 TGP (UI/L) 0,32 0,11 0,33 0,15 0,8907 Analyse non paramétrique: test de Wilcoxon Moyenne écart type Analyse des résultats obtenus à l'issue de la V220 Tel que cela était prévu dans l'analyse statistique, les valeurs obtenues à V2 sont comparées en valeurs brutes et en % calculés de la façon suivante : (V2-V1 N1)*100, par un test de Wilcoxon non paramétrique. Les différences obtenues entre V2 et V1 sont par ailleurs comparées en 5 intra-groupe par un test de Wilcoxon apparié, elles sont résumées dans le tableau ci-dessous. Tableau 5 Traitement 0 : produit Traitement 1 : produit Différence Différence placebo (n=20) A (n=17) entre entre Traitements Traitements Valeur (V2-V1 /V1)% absolue (p) (p) Calcium (mmol/L) 2,40 0,09 2,38 0,09 0,1695 0,1395 Comp. Intragroupe (p) 0,0730 0,8840 Cholesterol (g/L) 2,27 0,39 2,33 0,28 0,3182 0,1843 Comp. Intragroupe (p) 0,5787 0,5158 Créatinine (pmol/L) 68,80 11,37 65,59 6,90 0,1464 0,0696 Comp. Intragroupe (p) 0,0559 0,9633 CTX (pmol/L) 5508,75 1962 3831,24 1714 0,0060* 0,0782 Comp. Intragroupe (p) 0,5127 0,3772 HDL (g/L) 0,71 0,12 0,78 0,17 0,0949 0,3687 Comp. Intragroupe (p) 1 0,8813 0,3494 LDL (g/L) 1,39 0,31 1,38 0,23 0,4878 0,2276 Comp. Intragroupe (p) 0,4339 0,6426 Ostéocalcine (ng/ml) 15,28 5,17 12,62 6,12 0,0412* 0,4575 Comp. Intragroupe (p) 0,5709 0,4811 PALos (pg/L) 10,05 2,67 9,92 3,43 0,4937 0,3999 Comp. Intragroupe (p) 0,9150 0,6984 Phosphore (mmol/L) 1,18 0,16 1,18 0,16 0,3977 0,2631 Comp. Intragroupe (p) 0,8896 0,8896 Protéines totales (g/L) 72,31 3,59 72,31 3,59 0,2711 0,0448* Comp. Intragroupe (p) 0,3879 0,3879 Triglycérides (g/L) 0,89 0,59 0,89 0,59 0,2761 0,1803 Comp. Intragroupe (p) 0,9184 0,9184 TGO (UI/L) 0,32 0,05 0,32 0,05 0,4094 0,2711 Comp. Intragroupe (p) 0,6498 0,6498 TGP (UI/L) 0,33 0,09 0,33 0,09 0,3401 0,4274 Comp. Intragroupe (p) 0,8950 0,8950 Test de Wilcoxon -Moyenne écart type *p<0,05 Comparaison des valeurs biologiques pour les 2 populations après traitement (résultats à V2) Dans les tableaux 4 et 5, les abréviations suivantes ont été utilisées : CTX û Collagen Type I cross-linked C-telopeptide (ou C-télopeptide à liaison croisée du collagène de type I) ; HDL û High Density Lipoprotein (ou lipoprotéines de haute densité); LDL û Low Density Lipoprotein (ou lipoprotéines de basse densité); PALos û Pal Osseuse ; TGO û Transaminase Glutamate Oxaloacétate ; TGP û Transaminase Glutamate Pyruvate. Analyse des résultats par régression multiple Afin d'observer le rôle du traitement sur les différentes valeurs biologiques, la régression multiple suivante a été réalisée en prenant chaque variable biologique comme variable expliquée et les paramètres traitement (1 : complément alimentaire A et 0 : placebo), le numéro de visite et le numéro de sujet comme variable explicatives.

Cette analyse a permis de confirmer le rôle du "complément alimentaire A" sur l'abaissement du CTX de façon significative et ceci indépendamment des facteurs temps et sujet (facteur = -2.03, p=0.046).

En revanche, aucun rôle significatif du traitement, du temps ou du sujet n'est observé par cette analyse sur les autres paramètres biologiques qui restent stables. 5. Discussion Les deux populations étudiées, traitement "complément alimentaire A" et traitement placebo sont comparables à V1 pour les critères d'intérêt excepté la créatinine, le calcium et l'ostéocalcine ainsi que pour les critères d'observation clinique.

En ce qui concerne les critères secondaires d'efficacité, aucune différence significative n'est observée à V2, que ce soit en valeur absolue ou sur les % de variations. De même à l'intérieur d'une population, les variations observées entre V1 et V2 restent non significatives. Les différences initiales pour la créatinine et le calcium n'existent plus à V2, l'analyse par régression multiple montre que cette évolution n'est pas imputable au traitement.

La différence persiste en ce qui concerne l'ostéocalcine et aucune conclusion ne peut être avancée. Cette différence est cependant gommée lorsque l'on étudie les pourcentages de variations. La régression multiple ne met par ailleurs pas en évidence d'effet du traitement sur ce paramètre.

Enfin, notons qu'une différence significative apparaît pour les Protéines totales entre les deux groupes et en intra-groupe pour le groupe placebo. A ce niveau également, l'analyse par régression multiple permet de montrer que cette évolution n'est pas explicable par le produit consommé, ni le temps, ni le sujet. Pour les transaminases, aucune variation significative n'est à noter entre les valeurs de base et les valeurs obtenues à V2.

En ce qui concerne le critère principal d'efficacité qu'est la CTX, on observe une différence significative entre V2 et V1 quand on compare les 2 groupes en valeur absolue (p=0,060) et ceci dans un sens favorable au "Complément A" puisque le groupe sous traitement affiche une diminution très nette des valeurs de CTX.

L'analyse par régression multiple confirme que ce rôle positif dans le métabolisme phosphocalcique est effectivement dû au complément alimentaire A. Sa consommation quotidienne diminue la résorption osseuse et ainsi la quantité circulante des fragments du collagène de type I. 6. Conclusion Cette étude randomisée en double aveugle versus placebo a permis de vérifier la bonne tolérance de la consommation du complément alimentaire A chez des femmes ménopausées. Les résultats comparés entre les deux populations ont permis de mettre en évidence une variation du CTX favorable au complément alimentaire A et significative par rapport au bras placebo. Dans les exemples suivants, la capacité des molécules extraites de nacre à 5 stimuler l'activité métabolique des fibroblastes et des kératinocytes a été examinée in vitro sur des expiants de peau maintenus en survie, mais aussi in vivo sur le derme du rat.

Exemple 4 : Effets des protéines extraites de la nacre sur la jonction dermo-10 épidermique Une étude histologique a été réalisée sur des expiants de peau provenant d'une plastie mammaire d'une femme de 49 ans.Les expiants sont maintenus en culture et traités par des molécules extraites de la nacre selon l'invention à 0,015 15 % associées à un liant de base (pourcentage en poids par rapport au poids total de l'extrait et du liant de base). Le liant sert de témoin placebo. Les comparaisons sont faites en cinétique aux temps J2, 4, 6 et 8. L'étude histologique est faite par une coloration au trichrome de Masson et observation au microscope en lumière transmise. 20 Pour la peau témoin, la jonction dermo-épidermique est plate (Fig.4.1). On n'observe aucun signe de renouvellement épidermique. Le derme papillaire est peu irrigué. La peau est atone et présente de réels signes de vieillissement. Le traitement avec le placebo, n'entraîne aucun signe d'activation (Fig.4.2). 25 Avec un traitement à 2 mg/cm2 d'extrait tel qu'obtenu dans l'exemple 1 (Fig. 4.3), la jonction dermo-épidermique présente un relief festonné, elle plonge profondément dans le derme. Les cryptes profondes sont très riches en cellules actives et en contact avec des micro-vaisseaux. Cette région est le siège d'une 30 respiration cellulaire accrue. A 4 mg/cm2 d'extrait selon l'invention (Fig. 4.4), l'activité à la jonction dermo-épidermique est plus importante qu'avec la dose plus faible.

Une restructuration de la séquence épidermique est observée, avec les différentes couches cellulaires aboutissant à une couche kératinisée d'aspect juvénile. Une amélioration de l'ancrage (aspect indenté) de la couche germinale dans le derme est clairement notée. La jonction dermo-épidermique est activée et bien irriguée.

Une restauration du relief de la jonction dermo-épidermique, d'aspect indenté jeune, est obtenue après traitement par une formulation contenant des molécules extraites de la nacre. Le contact épiderme-derme est plus important avec un meilleur ancrage, ce qui représente un facteur de tonus cutané, d'élasticité et de volume.

Exemple 5 : Effet des molécules extraites de la nacre sur la respiration cellulaire (figure 5) La respiration cellulaire, notamment à la jonction dermo-épidermique, site d'échange intense et de production cellulaire, assure les échanges enzymatiques et surtout l'oxygénation nécessaire au fonctionnement physiologique de l'ensemble du derme et de l'épiderme.

La respiration cutanée a été détectée sur des explants de peau cultivés in vitro par un marquage immunologique effectué avec un anticorps spécifique dirigé contre la glucose-6-phosphate déshydrogénase, enzyme importante dans cette fonction physiologique. Les régions positives réagissent en donnant une couleur brune. Les coupes sont réalisées au kryostat.

Avec une application de la formulation à base de nacre telle qu'obtenue dans l'exemple 1 à la dose de 4 mg/cm2, l'activité respiratoire des cellules germinales est stimulée, notamment dans leur pôle en contact avec les micro-vaisseaux et la matrice extracellulaire dermique. Cet effet est durable (observations des jours J2 à J8).

La stimulation cellulaire observée sous l'effet des molécules extraites de la nacre peut contribuer à drainer et estomper poches et cernes.

Exemple 6 : Etude in vivo de l'activité de la poudre de nacre sur l'épiderme du rat, démonstration de la stimulation des fibroblastes par des implantations sous-cutanées à la limite derme-épiderme.

De la poudre de nacre a été implantée entre l'hypoderme et le derme chez le rat. La poudre de nacre a un diamètre compris entre 50 et 100 pm. Avant l'implantation, la poudre est stérilisée par irradiation aux rayons y (2,5 Mrad). (Lopez E., A. Le Faou, S. Borzeix, S. Berland. Stimulation of rat cutaneous fibroblasts and their synthetic activity by implants of powdered nacre (mother of pearl). Tissue and Cell, 2000, 32 (1) : 95-101)

La poudre de nacre est mélangée à du sang autologue. Comme témoin, le carbonate de calcium (CaCO3) est également mélangé à du sang autologue. 15 Dans cette expérience, le carbonate de calcium sert de témoin négatif.

Les implants sont insérés au niveau de la face ventrale à la jonction du thorax et de l'abdomen chez des rats Wistar d'un poids compris entre 260 et 280 g. Les implants sont placés entre le derme et l'hypoderme. Après 2 semaines, les 20 sites d'implantation sont récupérés pour être analysés par histologie.

Au niveau des implantations de nacre, il n'est pas observé de tissu nécrosé ou d'inflammation. Les fragments de nacre ont même subit une dissolution importante. Une vascularisation est observée, des capillaires sanguins sont 25 organisés en réseaux concentriques situés à distance de l'implant mais convergeant vers lui.

La nacre exerce également un recrutement des fibroblastes et leur activation cellulaire (Figure 6.1, 6.2, 6.3, 6.4) . Les fibroblastes possèdent l'aspect 30 de cellules actives (noyau volumineux et nucléoles nombreux). Des divisions cellulaires sont observées à la périphérie de la nacre, indiquant une activation de la prolifération.

Sous l'effet de la nacre, une synthèse importante des composants de la matrice extracellulaire par les fibroblastes est observée : un réseau dense de collagène I (Fig. 7.1) et III (Fig. 7.2) s'organise, avec une synthèse importante de protéoglycannes (coloration métachromatique) dont la décorine (Fig. 7.3).

L'implantation de poudre de Nacre, chez le rat, entre derme et épiderme, stimule la production de matrice extracellulaire par les fibroblastes notamment les collagènes de type I et III et la décorine qui est une molécule importante dans la communication et l'adhésion cellulaires. Exemple 7 : Etude clinique A la vue des résultats préliminaires obtenus sur les explants de peau et chez le rat, une étude clinique sur une composition comestible comprenant des 15 molécules extraites de la nacre et plus particulièrement des protéines était envisageable.

Un complément alimentaire à base de protéines a été préparé, "complément Beauté" A, sa composition est la suivante : 20 0,38 mg d'extrait de nacre tel que préparé à l'exemple 1, 410 mg d'huile de bourrache, 4,8 mg de béta-carotène, 75 mg de sélénium, 149,62 mg de carbonate de calcium, 25 7 mg de lécithine de soja.

Conditions de l'étude clinique 22 femmes volontaires âgées de 40 à 65 ans, avec la peau sèche sur le 30 corps et le visage, devaient ingérer matin et soir une gélule du complément alimentaire A pendant 56 jours. L'objectif a été d'évaluer l'activité du complément alimentaire de manière objective et subjective. 10 L'évaluation objective de l'activité du complément alimentaire a été effectuée en fin d'étude (J56) sur les propriétés biomécaniques de la peau avec le DTM (Dermal Torque Meter). L'étude de certaines propriétés biomécaniques de la peau après utilisation d'une crème ou d'un complément alimentaire, a recours au twistomètre ou DTM, dont la tête rotative imprime une légère torsion aux couches superficielles de l'épiderme : l'analyse du temps de retour à l'état initial permet de mesurer la souplesse et l'élasticité de la peau L'évaluation subjective de l'activité du complément alimentaire a été 10 effectuée à J28 et J56, par évaluation par le volontaire, et à J56 par le dermatologue.

Dans les conditions de l'essai, l'analyse des résultats des différentes méthodes utilisées pour mettre en évidence l'activité cosmétique du complément 15 alimentaire à base de proteines extraites de nacre a pu montrer une amélioration de l'hydratation cutanée mesurée de manière objective et après évaluation du volontaire et du dermatologue. Les volontaires inclus dans l'étude sont issus du panel général volontaires 20 de la société réalisant l'étude clinique. Chaque volontaire doit, pour être inscrit dans le panel, subir un examen médical avec le médecin recruteur du centre. A partir de ce panel, les volontaires qui correspondent aux critères d'inclusion ont été sélectionnés, puis définitivement admis dans l'étude au terme de la visite initiale. 22 volontaires ont été inclus dans l'étude. 25 Les critères suivants devaient être remplis pour permettre d'inclure un volontaire dans l'essai : Volontaires adultes âgés de plus de 40 ans et de moins de 65 ans, Sexe féminin, 30 Normalité de l'examen clinique préalable, Volontaires ayant la peau sèche sur le visage et le corps, Phototype Il ou III, Indemne d'antécédents allergiques aux produits cosmétiques ou d'usage ménager et d'atopie, Volontaires ayant signé un consentement écrit, libre, éclairé et express, Volontaires capables de comprendre les exigences de l'essai. N'étaient pas inclus dans l'essai les sujets répondant à un ou plusieurs des critères suivants : - Volontaires adultes de moins de 40 ans et de plus de 65 ans, 10 - Volontaires ayant appliqué dans les 48 heures précédant le début de l'essai, un produit cosmétique de soin ou un produit pharmaceutique sur les zones cutanées étudiées, Pathologie cutanée évolutive, Prise de traitement anti-histaminique ou/et tout traitement pouvant interférer 15 avec le métabolisme cutané, - Sujet en période d'exclusion entre deux essais, - Intolérance ou allergie alimentaire avérée.

Pendant toute la durée de l'étude, il a été demandé aux volontaires de ne pas 20 utiliser de nouveaux produits cosmétiques et/ou pharmaceutiques, de ne pas utiliser de complément alimentaire autre que celui à l'étudeä

L'essai est monocentrique, ouvert et comparatif entre JI, J28 et J56. Il comporte :

Un bilan initial permettant de vérifier les critères d'inclusion et de non inclusion ; Une période de traitement pendant 56 jours (1 gélule matin et soir) ; Une visite intermédiaire à J28. Visite à JI

tù30 mn: - Informer le volontaire sur le déroulement de l'étude. 35 -Recueillir le consentement éclairé et écrit du volontaire. 25 30 Enregistrer, dans le cahier d'observation, les données démographiques et l'examen clinique de la zone cutanée et les traitements éventuellement pris par le volontaire. Vérifier le respect des critères d'inclusion et de non inclusion. Si le volontaire répond à ces critères, il est éligible pour suivre l'étude et est inclus. Attribuer successivement le numéro du volontaire selon l'ordre croissant d'arrivée dans l'étude et randomiser les sites d'application. Conditionnement du volontaire pendant 30 minutes. tO : Mesures des propriétés biomécaniques cutanées sur l'avant-bras avec le DTM. Prise du produit par les volontaires à domicile (2 gélules par jour : 1 le matin et 1 le soir).

Visite à J28 Consultation intermédiaire. Evaluation de l'efficacité par le volontaire. Prise du produit par les volontaires à domicile (2 gélules par jour : 1 le matin et 1 le soir). Visite à J56 Mesures des propriétés biomécaniques cutanées sur l'avant-bras avec le DTM. 30 Auto-évaluation de l'efficacité par le volontaire et le dermatologue. Evaluation de la tolérance générale. Evaluation de l'acceptabilité.

Critères d'évaluation 25 35 Evaluation objective de l'activité du complément alimentaire sur les propriétés biomécaniques de la peau par mesures de la fermeté cutanée

Les propriétés biomécaniques de la peau ont été mesurées sur l'avant-bras 5 avec le DTM, en début d'étude et en fin d'étude. La force utilisée a été de 6 milliNewton. Trois paramètres sont mesurés : Ue : correspond à l'extensibilité de la peau, Uv : correspond à la déformation viscoélastique et représente l'élasticité cutanée, 10 Ur : correspond à l'angle de déformation de la peau après relâchement de la force de torsion et représente la tonicité cutanée.

A partir de ces mesures, il est possible de calculer : La fermeté de la peau qui est le rapport Ur/Ue. L'augmentation de ce 15 rapport traduit le raffermissement de la peau ; La déformation globale de la peau Uf qui est définie comme la somme de Uv et de Ue. Son augmentation illustre l'amélioration de la souplesse de la peau.

20 Des mesures répétées des paramètres de déformation (Ue, Uv, Ur, Ur/Ue et Uf) donnent ainsi la possibilité d'évaluer objectivement l'effet des produits cosmétiques sur l'état de fermeté de la peau par comparaison à une zone sans produit et à différents temps de mesure (Tableau 6).

25 Tableau 6 Effet tenseur pur Ur augmente Ue diminue Effet hydratant pur Ue augmente Uf augmente Effet plus tenseur qu'hydratant Ur augmente Ur/Ue augmente Augmentation de Ue < 10 % Effet plus hydratant que tenseur Ue augmente Uf augmente Ur augmente Ur/lie z-- 0 Evaluation subjective de l'activité du complément alimentaire Pour évaluer l'efficacité du produit, en début d'étude (J1), en cours d'étude (J28) et fin d'étude (J56), le volontaire a coté les items suivants de 0 à 9 ; le 5 dermatologue a coté les mêmes items sauf le confort de peau à J56 : Au niveau du visaqe : Hydratation cutanée : (0 = pas hydratée ; 9 = très hydratée) Teint lumineux éclatant : (0 = pas lumineux ; 9 = très lumineux) - Peau douce : (0 = pas douce ; 9 = très douce) 10 Peau souple : (0 = pas souple ; 9 = très souple) Confort de peau : (0 = pas confortable ; 9=très confortable) * Seul, le volontaire a coté cet item. 15 Au niveau des bras : Hydratation cutanée : (0 = pas hydratée ; 9 = très hydratée) Coloration cutanée : (0 = pas lumineux ; 9 = très lumineux) Fermeté cutanée : (0 = pas ferme ; 9 = très ferme) - Douceur cutanée : (0 = pas doux ; 9 = très doux) 20 Au niveau des iambes : - Hydratation cutanée : (0 = pas hydratée ; 9 = très hydratée) - Coloration cutanée : (0 = pas lumineux ; 9 = très lumineux) Fermeté cutanée : (0 = pas ferme ; 9 = très ferme) 25 - Douceur cutanée : (0 = pas doux ; 9 = très doux)

Pour l'examen dermatologique sur le visage et les jambes, le dermatologue disposait des critères suivants : érythème, 30 oedème, sécheresse, desquamation, aspect gras, papules, pustules, démangeaisons, tiraillements. Chaque critère est noté de 0 à 3 (0 = absent, 1 = léger, 2 = modéré, 3= important).

Il note aussi toutes les manifestations d'inconfort ressenties par le volontaire en indiquant la date de début, la date de fin, la durée, l'intensité, la fréquence, la nécessité ou non d'un traitement correcteur et l'imputabilité. Le rythme des mesures est schématisé dans le tableau 7 ci-dessous : Tableau 7 Dates J1 J28 J56 Mesures des propriétés X X biomécaniques cutanées par DTM Evaluation subjective de l'efficacité X X X par le volontaire Evaluation subjective de l'efficacité X X par le Dermatologue Acceptabilité et tolérance par le X volontaire Les évaluations ont été réalisées par la même personne tout au long de l'essai. 20 Analyse des données de DTM

Le tableau 8 présente les moyennes et les pourcentages de variation des paramètres sur l'avant-bras selon le tableau de randomisation. L'analyse a été effectuée sur 21 volontaires. 25 Tableau 8 : Valeurs du DTM à JI avant l'application et à J56 Paramètres Avant Après 56 jours Pourcentage de W de Wilcoxon* application d'application variation de JI J56 chaque paramètre Ue : extensibilité cutanée 0,595 0,760 27,83 % p < 0,05 (S) Uv : élasticité cutanée 0,903 0,872 - 3,42 % p > 0,05 (NS) Ur: tonicité cutanée 0,413 0,455 10,13 % p > 0,05 (NS) Ur/Ue: fermeté cutanée 0,711 0,694 - 2,37 % p > 0,05 (NS) Uf : souplesse cutanée 1, 497 1,632 8,99 % p > 0,05 (NS) S = significatif ; NS = non significatif * le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre JI et J56. L'analyse statistique des paramètres globaux des propriétés biomécaniques cutanées à l'aide du DTM du produit "Complément Beauté" A a mis en évidence une augmentation significative de l'extensibilité cutanée de l'ordre de 27,83 %.

Au total, après 56 jours d'utilisation, le "Complément Beauté" A a provoqué une augmentation statistiquement significative de l'extensibilité cutanée. La variation de l'extensibilité cutanée reflète directement le niveau d'hydratation, plus la peau est hydratée, plus l'extensibilité augmente.

Evaluation de l'efficacité par le Dermatologue à J56 Le tableau 9 récapitule les moyennes obtenues à JI et J56 pour tous les items, sur 22 volontaires, sauf l'évaluation sur les jambes effectuée sur 21 volontaires, sans le volontaire n 8.

Tableau 9 : Evaluation subjective de l'efficacité par le Dermatologue à JI et J56 VISAGE Hydratation cutanée Teint lumineux, Peau douce Peau souple éclatant J1 J56 J1 J56 J1 J56 JI J56 Moyenne 6,27 7,09 5,64 6,68 5,82 6,09 6,00 6,45 5 Ecart 1,45 1,19 0,73 0,57 1,26 1,15 0,69 0,60 type %de 13,04 % 18,55 % 4,69 % 7,58 % variation p* NS NS NS NS AVANT- Hydratation cutanée Coloration cutanée Fermeté cutanée Douceur cutanée BRAS J1 J56 JI J56 J1 J56 J1 J56 Moyenne 4,68 5,59 5,23 5,50 5,09 5,73 4,32 4,50 Ecart 1,46 1,01 1,11 1,01 1,51 0,63 1,76 1,30 type % de 19,42 % 5,22 % 12,50 % 4,21 % variation p* S NS NS NS JAMBES Hydratation cutanée Coloration cutanée Fermeté cutanée Douceur cutanée J1 J56 JI J56 J1 J56 J1 J56 Moyenne 3,52 4,33 4,67 4,48 5,38 5,71 4,00 4,00 Ecart 1,54 1,24 1,56 1,12 1,40 1,15 1,73 1,58 type % de 2297% -4,08% 6,19% 0,00% variation p* S NS NS NS p : test W de Wilcoxon; S = significatif (p < 0,05); NS = non significatif (p > 0,05). * le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre J1 et J56. Après 56 jours, l'investigateur a noté une amélioration de l'hydratation cutanée sur les jambes et les avant-bras.

Evaluation de l'efficacité par le volontaire 10 Le tableau 10 récapitule les moyennes obtenues à JI et J28 pour tous les items.

Tableau 10 : Evaluation subjective de l'efficacité par le volontaire à JI et J28 VISAGE Hydratation Teint lumineux, Peau douce Peau souple Confort cutanée éclatant cutané J1 J28 J1 J28 J1 J28 JI J28 JI J28 Moyenne 3,29 4,43 3,90 4,19 5,67 5,29 4,95 4,81 3,81 4,67 Ecart type 1,65 1,91 1,67 1,83 1,96 1,85 1,86 1,83 1,25 1,85 % de 34,78 % 7,32 % - 6,72 % - 2,88 % 22,50 % variation p* S NS NS NS S 15 10 AVANT- Hydratation Coloration cutanée Fermeté cutanée Douceur BRAS cutanée cutanée J1 J28 J1 J28 J1 J28 JI J28 Moyenne 3,19 4,10 3,95 4,19 3,57 4,24 4,90 5,05 Ecart type 1,54 1,81 1,63 2,02 1,75 1,67 1,76 1,91 % de 28,36 % 6,02 % 18,67 % 2,91 % variation p* S NS S NS JAMBES Hydratation Coloration cutanée Fermeté cutanée Douceur cutanée cutanée JI J28 J1 J28 JI J28 JI J28 Moyenne 2,24 3,43 3,14 3,29 3,90 3,90 4,38 4,00 Ecart type 1,18 1,78 1,46 1,68 1,95 1,81 1,69 2,02 % de 53,19% 4,55% 0,00% -8,70% variation p* S NS NS NS p : test W de Wilcoxon; S = significatif (p < 0,05); NS = non significatif (p > 0,05). * le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre J1 et J28.

A J28, les volontaires ont noté une amélioration significative de l'hydratation cutanée et du confort cutané sur le visage, de l'hydratation cutanée et de la fermeté cutanée sur le corps. Le tableau 11 récapitule les moyennes obtenues à JI et J56 pour tous les items. Tableau 11 : Evaluation subjective de l'efficacité par le volontaire à J1 et J56 VISAGE Hydratation Teint lumineux, Peau douce Peau souple Confort cutanée éclatant cutané J1 J56 JI J56 J1 J56 J1 J56 JI J56 Moyenne 3,27 4,86 3,86 4,73 5,59 5,68 4,91 5,55 3,82 4,77 Ecart type 1,61 2,12 1,64 1,98 1,94 2,12 1,82 2,09 1,22 2,54 % de 48,61 % 22,35 % 1,63 % 12,96 % 25,00 % variation p* S S NS NS AVANT-BRAS Hydratation Coloration cutanée Fermeté cutanée Douceur cutanée cutanée J1 J56 J1 _ JI J56 J1 J56 J56 Moyenne 3, 23 4,82 3,95 4,77 3,59 4,95 4,86 5,73 Ecart type 1,51 1,89 1,59 1,57 1,71 1,36 1,73 1,67 % de variation 49,30 % 20,69 % 37,97 % 17,76 % p* S S S S JAMBES Hydratation Coloration cutanée Fermeté cutanée Douceur cutanée cutanée J1 J56 J1 J56 JI J56 JI J56 Moyenne 2,27 4,14 3,14 4,32 3,91 5,00 4,32 5,00 Ecart type 1,16 2,21 1,42 2,06 1,90 1,95 1,67 2,16 % de variation 82,00 % 37,68 % 27,91 % 15,79 % p* S S S S p : test W de Wilcoxon; S = significatif (p < 0,05); NS = non significatif (p > 0,05). * le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre J1 et J56.

Après 56 jours, les volontaires ont noté une amélioration de l'hydratation cutanée sur le visage, les avant-bras et les jambes. Un effet positif sur le teint a aussi été ressenti. Une amélioration significative de la coloration, de la fermeté et de la douceur cutanées a été ressentie sur les jambes et les avant-bras.

Claims (32)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'extraction de molécules biologiquement actives à partir de la nacre 5 de la coquille d'un mollusque nacrier, lequel procédé comprend les étapes suivantes : (i) la couche de nacre de la coquille du mollusque est réduite en poudre d'une granulométrie comprise entre 1 et 200 pm ; (ii) ladite poudre est mélangée dans une solution d'extraction à base 10 d'eau et de solvant organique polaire dont le rapport volumique solvant organique polaire : eau varie de 1:99 à 99:1 ; et (iii) la fraction aqueuse de la suspension résultante est séparée de la fraction insoluble. 15

2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le rapport solvant organique polaire : eau est compris entre 20:80 et 80:20.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape (ii) est réalisée à une température de 15-40 C, éventuellement sous agitation.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la poudre de nacre est mélangée dans la solution d'extraction pendant une durée de 30 min à 20 h. 25

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le solvant organique polaire est l'éthanol.

6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la séparation de ladite fraction aqueuse de la suspension est réalisée par 30 centrifugation et/ou filtration. 20

7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le filtrat obtenu après l'étape (iii) est concentré, de préférence par évaporation sous vide à 30 C.

8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, lequel procédé comprend une étape supplémentaire dans laquelle ledit extrait est dissous puis lyophilisé.

9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, lequel procédé 10 comprend une étape supplémentaire dans laquelle du carbonate de calcium retiré à l'étape (iii) est réintroduit dans l'extrait obtenu.

10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit mollusque est l'huître Pinctada margaritifera.

11. Extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.

12. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend des molécules extraites de 20 la nacre de mollusques nacriers selon la revendication 11.

13. Composition selon la revendication 12, ladite composition étant une composition comestible. 25

14. Composition selon la revendication 13, ladite composition étant un produit lacté, en particulier un yaourt.

15. Composition selon la revendication 12, ladite composition étant un complément alimentaire.

16. Composition selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre du carbonate de calcium. 15 30 5

17. Composition selon l'une des revendications 11 à 16, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre de l'huile de bourrache, béta-carotène, sélénium, la lécithine de soja, l'Huile d'Onagre, les vitamines E, C, et/ou D (sous forme de calcipotriol), le lycopène, l'huile de poisson (EPA/DHA), ou leur mélange.

18. Utilisation non thérapeutique d'un extrait selon la revendication 11 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, pour favoriser le maintien du capital osseux d'un sujet. 10

19. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 18, pour favoriser la restauration du capital osseux d'un sujet.

20. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 18, pour protéger la masse osseuse au cours de la vie d'un sujet.

21. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 20, pour favoriser l'équilibre squelettique pendant la croissance.

22. Extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des 20 revendications 1 à 10, à titre de médicament.

23. Utilisation de l'extrait susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des désordres liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu 25 osseux.

24. Utilisation selon la revendication 23, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter l'ostéoporose. 30

25. Utilisation non thérapeutique d'un extrait selon la revendication 11 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 17 pour améliorer et/ou protéger la structure de la peau. 15

26. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 25, pour améliorer ou préserver l'hydratation, la fermeté ou la douceur de la peau, le teint du visage ou du corps ou la structuration de l'épiderme et du derme.

27. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 25 ou 26, pour protéger la peau contre les radicaux libres, les agressions du soleil ou tout autre effet délétère intrinsèque ou extrinsèque, tel que la pollution, la consommation d'alcool ou de tabac.

28. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à 27, pour favoriser la microcirculation et l'oxygénation de la peau.

29. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à 28, pour diminuer les rides et/ou ridules ou prévenir leur apparition.

30. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à 29, pour prévenir ou traiter le vieillissement de la peau.

31. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à 20 30, pour drainer ou estomper des poches ou des cernes ou en empêcher leur apparition.

32. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à 30, pour diminuer ou prévenir les défauts de pigmentation (taches brunes ou 25 taches blanches).15