WO2007113451A2 - Procede d'extraction de molecules de nacre, compositions et utilisation - Google Patents

Procede d'extraction de molecules de nacre, compositions et utilisation Download PDF

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WO2007113451A2
WO2007113451A2 PCT/FR2007/051080 FR2007051080W WO2007113451A2 WO 2007113451 A2 WO2007113451 A2 WO 2007113451A2 FR 2007051080 W FR2007051080 W FR 2007051080W WO 2007113451 A2 WO2007113451 A2 WO 2007113451A2
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composition
pearl
bone
mother
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Benjamin Reynier
Laurent Bedouet
Evelyne Lopez
Denis Duplat
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Societe D'innovation Et De Recherche Appliquee S A(Siere S A )
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Definitions

  • the present invention relates to molecules extracted from the nacre of molluscs and their extraction process. It also relates to a composition, in particular an edible composition, comprising molecules extracted from mother-of-pearl.
  • the edible composition according to the invention is more particularly intended to promote the maintenance of bone capital, the hydration of the skin and the restructuring of the epidermis and dermis.
  • Mother-of-pearl is a calcified structure forming the inner shiny layer of the shell of certain molluscs. It is composed of calcium carbonate crystals and organic compounds, mainly represented by proteins and polysaccharides and has an exceptional microscopic structure and a high mechanical resistance.
  • mother-of-pearl is composed of molecules that are pharmacologically or aesthetically active.
  • mother-of-pearl has been used since Antiquity in aesthetics and in traditional pharmacopoeias.
  • nacre is known for its regenerative properties of bones.
  • the mother-of-pearl powder, as well as its water-soluble matrix have demonstrated their biological compatibility in vivo and in vitro, as well as their ability to promote osteogenesis by promoting the activity of osteoblasts and their precursors (see the PCT application). WO 97/24133).
  • Pinctada's mother-of-pearl implants placed in bone or bone marrow induce the formation of new bone.
  • mother-of-pearl implants after various examinations have a slight alteration of their surface which is necessary for their good integration into the bone.
  • Recent microscopic analyzes have shown the presence of osteoclasts at the bone / mother-of-pearl interface. It is recognized that the limited resorption of mother-of-pearl by osteoclasts is responsible for the release of molecules that act on bone-forming cells and their precursors.
  • Mother-of-pearl fragments from Pinctada bivalve are able to induce a biological response when implanted into the bones of dogs, sheep, or humans. This response corresponds to local osteogenic activity and integration of mother-of-pearl in the host bone without inflammatory reaction.
  • the inventors have developed a new method for extracting active molecules from mother-of-pearl. Surprisingly, the latter have been able to show that the molecules extracted according to the method of the present invention may have, in an individual, important applications in maintaining its beauty capital for the skin and / or its bone capital.
  • osteoporosis represents a major public health problem. It does not concern only the menopausal woman, it can occur very early in the life of a person, in particular under the effect of traumatisms related to the sport, a bad hygiene of life and / or the stress. It is generally accepted that bone loss is greater in older women than in men of the same age. Although it accelerates when menopause is installed, the most significant bone loss is observed during the peri-menopausal period. During this period, there is in fact an imbalance between formation and bone resorption, to the detriment of the formation, which leads to an acceleration of the renewal of the bone. The resorption prevails over the formation and ultimately the bone formed is of poor quality, it shows a disordered microarchitecture.
  • osteoblasts a type of cells
  • osteoclasts bone resorption cells
  • the good quality of a bone results from this balance which leads to a physiologically optimal bone mass. Controlled and limited resorption of bone by osteoclasts is necessary for the activation of osteoblast-forming bone cells.
  • the skin is an active interface between the body and the outside, it is subject to the cumulative effects of pollution, exposure to the sun or an unhealthy lifestyle (tobacco, alcohol, etc.).
  • the components of the skin envelope, the dermis and the epidermis change in the face of these different aggressions.
  • the skin consists of 2 main cell layers, the epidermis composed of keratinocytes that differentiate into corneocytes, and the dermis which consists mainly of fibroblasts dispersed in an extracellular matrix that they make.
  • the embryonic origins of these two types of The cells are different: the keratinocytes are of ectodermal origin, while the fibroblasts are derived from the mesoderm. Fibroblasts and keratinocytes have specific activities, but there is close communication between these cells.
  • the dermis and the epidermis do not function separately but they are closely associated and supported by a third layer that supports the first two, the hypodermis.
  • the epidermis is made by a layer of active cells (germinal stem cells) located in contact with the dermis. These cells differentiate into keratinized special cells that make up the stratum corneum. This differentiation is made from the dermal-epidermal junction, where we distinguish mainly the germinal layer and then the granular layer and the stratum corneum.
  • the dynamic functioning of this process is fundamental for the construction of a young and solid epidermis well attached to the dermis. It is the result of the effect of many messages that pass through molecules involved in cellular activity. In a dynamized skin, epidermis and dermis constantly communicate and it is the dermis that "talks" to the epidermis notably via molecular messengers of the growth factors type.
  • Fibroblasts become less active and produce less extracellular matrix and microcirculation is also reduced.
  • the epidermis disintegrates and the dermis loses its tone, the hypodermis infiltrates fat cells.
  • compositions preferably edible, intended for to promote the maintenance of bone capital, the hydration of the skin and / or the restructuring of the epidermis and dermis.
  • An object of the invention relates to a process for extracting biologically active molecules from nacre of the shell of a mollusc.
  • Another subject of the invention relates to an extract of biologically active molecules of nacre obtainable by the above method.
  • the present invention also relates to a composition, in particular an edible composition, containing an extract of mother-of-pearl molecules that can be obtained by the process according to the invention.
  • the present invention also relates to the use of the extract according to the invention or the composition, in particular edible, containing said extract in the protection of bone mass.
  • the present invention also relates to the use of the extract according to the invention or the composition, in particular edible, containing said extract in the hydration of the skin and the restructuring of the epidermis and / or dermis.
  • the present invention also relates to an extract of mother-of-pearl molecules obtainable by the above method, used as a medicament.
  • the present invention further relates to the use of an extract of mother-of-pearl molecules obtainable by the process of the present invention, for the preparation of a medicament for the treatment of disorders related to an imbalance of renewal. bone tissue, especially for the treatment of osteoporosis.
  • Figure 1 Protocol for obtaining a mother-of-pearl powder with a particle size of 128 microns.
  • FIG. 2 Effect of the concentration of extract according to the invention (20-650 ⁇ g protein / ml) on the number of adherent osteoclasts (A) and bone resorption (B) after 48 hours of culture at 37 ° C. and 5% CO 2 . (* p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001).
  • Figure 3 Flow chart showing the chronological sequence of a study of the effect of the extract of mother-of-pearl molecules according to the invention on bone remodeling.
  • Figure 4 Effects of the molecules extracted from mother-of-pearl on the improvement of the dermal-epidermal junction. Study on skin explants at J2.
  • Epidermis E. Papillary dermis (D). Dermo-epidermal junction ⁇ > -). GX630.
  • the epidermis is thin and flat with an opaque keratinized layer thick (- ⁇ ) and flattened. The different cell layers of the epidermis are absent. The cells of the germinal cell layer or stem cells are not very active (>) and this layer is not anchored in the dermis.
  • the epidermis (E) is thicker than that of the control without care and the regular keratinized layer has a relief (->).
  • the different epidermal cell layers are not distinguished.
  • Stem cells are active (>).
  • the dermo-epidermal junction (> -) is slightly scalloped.
  • the dermis (D) is poorly irrigated.
  • the epidermis (E) is thicker than in the case of both controls.
  • the keratinized layer is no longer opaque and conforms to the cutaneous microreliefs.
  • Figure 5 Effects of molecules extracted from nacre on cellular respiration 1: J2.
  • the present inventors have identified a method for extracting mother-of-pearl molecules from nacreous molluscs, in particular Pinctada margaritifera, which makes it possible to promote the maintenance of bone capital, to improve and / or protect the structure of the skin, in particular to promote or maintain the hydration of the skin or promote the restructuring of the epidermis and / or dermis.
  • An object of the invention therefore relates to a method for extracting biologically active molecules from the nacre of the shell of a nacreous mollusc, which method comprises the following steps:
  • the mother-of-pearl layer of the shell of the mollusc is reduced to a powder with a particle size of between 1 and 200 ⁇ m, preferably between 50 and 130 ⁇ m;
  • said powder is mixed in a water-based solution of polar organic solvent, the volume ratio of polar organic solvent: water varies from 1: 99 to 99: 1; and (iii) the aqueous fraction of the resulting slurry is separated from the insoluble fraction.
  • the nacre used in the process can be obtained from shells of nacreous molluscs (molluscs capable of forming mother-of-pearl), in particular from oysters and more specifically from oysters of the genus Pinctada and more particularly from the genus Pinctada margaritifera species.
  • molluscs capable of forming mother-of-pearl
  • oysters and more specifically from oysters of the genus Pinctada and more particularly from the genus Pinctada margaritifera species.
  • the separation of mother-of-pearl from the remainder of the shell may be carried out by any means known per se and in particular by grinding.
  • the reduction of mother-of-pearl into a powder of suitable particle size will be carried out by any means suitable for the starting material, in particular by grinding, crushing and / or grinding.
  • the spraying of mother-of-pearl can in particular be carried out in several stages, in particular initially by crushing, then possibly by different grinding techniques. Preferably, one proceeds to a grinding by the technique "Jarre + Ball corundum" to avoid any metal contamination.
  • Nacre can be used without prior decontamination.
  • the mother-of-pearl in particular before being reduced to powder, may advantageously be decontaminated, in particular by washing (s) decontaminant (s), for example in a solution of sodium hypochlorite, then by drying.
  • the mother-of-pearl can also be sterilized, before, during or after having been reduced to powder, by any method known per se. In particular, the sterilization is carried out by irradiation (gamma ray irradiation) or by hot irradiation
  • step (ii) is carried out at a temperature between 15 and 40 0 C, preferably at room temperature (between about 18 and 25 ° C) optionally with stirring.
  • the mother-of-pearl powder is preferably mixed with the solvent in step (ii) for a period of 30 minutes to 20 hours, preferably for about 12 hours.
  • step (ii) of the process of the invention an extraction is carried out in a solution comprising water and a polar organic solvent.
  • the polar organic solvent is chosen from alcohols, halogenated hydrocarbons, esters, ketones, aldehydes, ethers, dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), acetonitrile, nitrobenzene and tetrahydrofuran.
  • the alcohols, halogenated hydrocarbons, esters, ketones, aldehydes and / or ethers are compounds containing 1 to 6 carbon atoms, even more preferably 1 to
  • the alcohols are chosen from monoalcohols comprising from 1 to 6 carbon atoms, even more preferably from 1 to 4.
  • monoalcohol designates a saturated or unsaturated, linear, branched or cyclic aliphatic chain substituted by a single hydroxyl group.
  • monoalcohols there may be mentioned, for example, methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, tert-butanol, n-butanol, etc.
  • the polar organic solvent is chosen from methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, tert-butanol, n-butanol, acetone, acetonitrile and acetone.
  • the extraction solution is a mixture of water and several polar organic solvents as defined above, the volume ratio of polar organic solvents: water is in the range 1: 99 - 99: 1.
  • the polar organic solvent used is ethanol.
  • the volume ratio polar organic solvent: water is preferably between 20:80 and 80:20 and more preferably this volume ratio is 50:50.
  • step (iii) of the process according to the invention the aqueous fraction of the suspension obtained in step (N) separated from the insoluble fraction advantageously corresponds to the desired extract.
  • This separation is carried out by any means known per se, and in particular by centrifugation and / or filtration, preferably by centrifugation and then by filtration. More specifically, the suspension obtained at the end of the mixing step is centrifuged for 20 minutes at 40 ° C. at 20,000 g, and then the supernatant is filtered on 0.22 ⁇ m hydrophilic membranes.
  • the filtrate obtained can be concentrated, preferably by evaporation, and in particular by evaporation under vacuum at 30 ° C.
  • an additional step of dissolving and lyophilizing the wet organic extract can be carried out.
  • the insoluble fraction removed in step (iii) of the above process comprises calcium carbonate.
  • the method according to the invention may further comprise the reintroduction of calcium carbonate, in particular the calcium carbonate removed in step (iii) of the process, before using the extract such as than obtained above.
  • the invention also relates to the molecules that can be extracted by this method. More specifically, the extract obtainable by the process of the present invention essentially comprises a mixture of proteins, peptides and organic molecules whose mass is between 50 and 1000 Da.
  • the extract furthermore comprises any substances that are soluble in the solvent used, in particular organic water-soluble substances or polar lipids.
  • the invention relates not only to the mixture obtainable by the method described above, but also the various substances purified by fractionation from the mixture, and in particular from the complete soluble product.
  • the mother-of-pearl molecules extracted by the process according to the invention have proved to be usable as a component of a composition, in particular an edible composition.
  • the present invention also relates to a composition, in particular an edible composition, comprising molecules extracted from mother-of-pearl that can be obtained by the method described above.
  • composition according to the invention is particularly useful for promoting the maintenance of the bone capital of a subject. More specifically, the subject has, or is likely to present, a bone mass altered by trauma, disorder or pathology and in particular osteoporosis or any other intrinsic or extrinsic factor that can cause demineralization with loss of bone mass.
  • the mother-of-pearl molecules extracted by the process according to the invention also make it possible to protect the bone mass of an individual throughout his life.
  • the present inventors have thus been able to demonstrate that the molecules extracted from mother-of-pearl obtained by the method described above are biologically active in that they have an influence on the degradation of bone tissue by osteoclasts.
  • the molecules extracted from the mother-of-pearl therefore represent a great interest for the protection of the bone mass (bone capital) and especially for the reported osteoporosis, such as postmenopausal osteoporosis, osteopenia due to aging, immobilization osteopenia, and others.
  • the bone becomes sensitive to fractures because its degradation is more important than its formation and the organic matrix becomes less able to mineralize.
  • compositions, in particular edible may be useful to protect, strengthen the bone capital or promote the restoration of the bone capital of a subject.
  • the compositions, preferably edible, according to the invention can be used to protect the bone mass during the life of an individual.
  • Such compositions may also be used during the growth of an individual for the purpose of promoting his skeletal balance or also during the practice of a sport.
  • the extract according to the invention has proved to be usable as a component of a composition, in particular an edible composition, improving or maintaining the hydration of the skin and / or restructuring the epidermis and the dermis of the skin. a subject.
  • the present inventors have thus been able to demonstrate that the extract that can be obtained by the process according to the invention has biological effects that stimulate the regulation of cell proliferation and tissue activity of the skin, in particular fibroblasts. and / or keratinocytes.
  • In vivo tests have also made it possible to show that the active molecules extracted from the nacre according to the invention have properties on the hydration of the skin and / or promote the densification of the dermis by stimulating the fibroblast synthesis activity. .
  • the molecules extracted from mother-of-pearl are therefore of great interest for improving the appearance of the skin or for its protection.
  • the cellular stimulation observed under the effect of the molecules extracted from the nacre according to the present invention can, in particular, contribute to draining and blurring the bags and / or the rings.
  • the inventors have indeed also observed that the molecules extracted from the mother-of-pearl according to the invention act directly at the level of the hypoderm that stores fat and water.
  • the extract or the composition according to the invention in particular edible, can also be used to increase or preserve the "skin capital" (or "beauty capital") of a person.
  • the extract according to the invention or the compositions, preferably edible, according to the invention can be used to drain or fade the bags and / or dark circles or prevent their appearance, preserve or improve hydration, firmness , the softness of the skin or the complexion of the face or body.
  • These same compositions, in particular edible may be used for the purpose of protecting the skin against free radicals (harmful to the skin) or against the attacks of the sun or more generally any attack of intrinsic or extrinsic factors harmful to the skin ( tobacco, alcohol, pollution, ).
  • the extract or the composition, particularly edible, according to the invention can also promote, in particular stimulate in a controlled manner, microcirculation and oxygenation of the skin, thus allowing better elimination of toxins.
  • the extract or the composition according to the invention may also be used for reducing wrinkles and / or fine lines or preventing their appearance, for preventing or treating aging of the skin and in particular aging due to age, the sun or other.
  • the extract or the composition according to the invention also makes it possible to prevent pigmentation defects (brown spots and white spots) and / or to attenuate them.
  • the extract or the composition according to the invention may be for therapeutic use or not.
  • the extract or the composition according to the invention is advantageously administered orally, such as in the case of an edible composition.
  • compositions in particular edible compositions, according to the invention can advantageously be administered orally.
  • the term "edible composition” means a food or nutraceutical composition whose constituents are intended to be ingested in whole or in part.
  • the composition according to the invention can be prepared for example in the form of biscuits, food bars, powders for dilution, chewing dough, dairy products such as as a yoghurt, or in the form of food supplements such as tablets or swallow capsules, effervescent tablets, syrups, beverages, soft gums, oily suspensions or capsules.
  • compositions according to the invention comprise, in addition to the extract, compounds conventionally used in the fields under consideration, in particular for oral administration.
  • compounds conventionally used in the fields under consideration in particular for oral administration.
  • the person skilled in the art determines, with his knowledge, the most suitable compounds for the intended use, as well as their quantity.
  • such compounds include borage oil, beta-carotene, selenium, calcium carbonate, soy lecithin, evening primrose oil, vitamins E, C, and / or D (in the form of calcipotriol), lycopene, fish oil (EPA / DHA), or their mixture.
  • compositions, particularly edible, according to the invention are of a non-binding use and a subject may consume such compositions to derive all the benefits described above in a pleasant and easy manner.
  • compositions in particular edibles, of the present invention.
  • use of such compositions according to the invention prevents pigmentation defects (brown spots and white spots) and / or attenuates them.
  • compositions of the present invention may also contain calcium carbonate. More particularly, said calcium carbonate is the calcium carbonate recovered after precipitation from the mother-of-pearl powder in step (iii) of the process described above.
  • dietary calcium intake plays a positive role in bone mass or reduced risk of fracture.
  • the subject of the invention is also the use of an extract of mother-of-pearl molecules obtained according to the method described above as a medicament.
  • Another subject of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising molecules extracted according to the present invention, in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Such a pharmaceutical composition may be useful in the treatment of disorders related to an imbalance of bone turnover, in particular of osteoporosis, and more specifically postmenopausal osteoporosis, osteopenia due to aging, osteopenia of immobilization and others.
  • the subject of the invention is also the use of the extract according to the invention in the preparation of a pharmaceutical composition, in particular dermatological to be administered orally, intended to moisturize the skin and to restructure the epidermis and the dermis.
  • the subject of the invention is also the use of an extract of mother-of-pearl molecules as described above for the preparation of a medicinal product intended to treat disorders related to an imbalance in bone turnover.
  • the invention furthermore comprises the use of an extract of mother-of-pearl molecules as described above for the preparation of a medicament intended to treat cutaneous disorders related to a lack of hydration of the skin or to a structure altered epidermis and / or dermis.
  • the present invention also relates to a method for preserving or improving the hydration, the firmness, the softness of the skin or the complexion of the skin. face, comprising the administration, preferably oral, of a therapeutically effective amount of a nacre extract as defined above.
  • the invention also relates to a method for treating disorders of bone turnover, in particular osteoporosis, and more specifically postmenopausal osteoporosis, osteopenia due to aging, osteopenia immobilization or drug (e.g., cortisone treatment) and the like, comprising administering to a mammal, particularly to a human, a therapeutically effective amount of a mother-of-pearl extract as defined above.
  • a mammal particularly to a human, a therapeutically effective amount of a mother-of-pearl extract as defined above.
  • the invention finally relates to a method for treating cutaneous disorders related to a lack of hydration of the skin or to an altered structure of the epidermis and / or dermis comprising the administration to a mammal, in particular to a human, a therapeutically effective amount of a nacre extract as defined above.
  • Mother-of-pearl powder with a particle size of 128 ⁇ m is obtained by means of the protocol shown schematically in FIG.
  • the mother-of-pearl powder (200 g) is mixed in 200 ml of a mixture of water and ethanol (50:50) for 12 hours at room temperature and with internal magnetic stirring.
  • the suspension is centrifuged for 20 min at 20,000 g and at 4 ° C.
  • the supernatant is filtered on a Stericup® type sterilization unit to remove the particles of powder in suspension.
  • the filtrate is evaporated under vacuum at 30 ° C. in order to remove the ethanol used for the extraction.
  • the aqueous solution is frozen and freeze-dried. This solution is used in the following examples.
  • the osteoclasts are isolated from rabbit femurs for 10 days, then they are deposited on strips of beef bone 100 microns thick. In the culture medium are added different concentrations of the extract as obtained in Example 1. The concentration of the nacre extract added to the culture medium varies between 40 and 2600 ⁇ g / ml. Thapsigargin (1 ⁇ M) was chosen as a positive control for inhibition of bone resorption. The cells are then cultured for 48 hours at 37 ° C. under an atmosphere of 5% CO 2 .
  • Food supplement A (mother-of-pearl extract): Each capsule contains 399 mg of calcium carbonate, 1 mg of the extract of Example 1, and 210 mg of sunflower oil. Placebo product: the capsules contain sunflower oil.
  • the soft capsule tunics of dietary supplement A and placebo are identical and contain starch, fish gelatin, glycerin, water and Candurin as a dye.
  • the consumption of the products consists of the daily intake of 2 capsules / day (at breakfast) during the 3 months of the study. Since he This is a double-blind test, neither the patient nor the doctor knows which product is consumed by each volunteer.
  • the main parameter of evaluation is the evolution of the CTX.
  • the mean values observed in postmenopausal women with the proposed Cross Laps Nordic Bioscience Diagnostics are 3634 pmol / L, with a standard deviation of 1833 pmol / L.
  • the calculation of the number of subjects was made by taking two hypotheses of decreasing this parameter (35% and 55%), considered as the minimum and maximum values making it possible to predict a positive response of the bone mineral density.
  • the one-sided alpha risk was set at 0.05 and the beta risk at 0.20 or 0.10. The result of this calculation is shown in Table 1 below.
  • the initial number of subjects was therefore set at 25, which corresponded to the intermediate hypothesis.
  • the main efficacy criterion is the evolution of the serum concentration of CTX.
  • the influence of the treatment on the concentration of this parameter was evaluated by a non-parametric Wilcoxon test comparing the values obtained after three months of treatment (V2) in the group corresponding to treatment 1, to those obtained during the same period in the group corresponding to treatment 2.
  • the same analysis was performed by comparing the evolution between V1 and V2 in each treatment group.
  • the secondary efficacy criteria are alkaline bone phosphatase, osteocalcin, serum calcium, phosphatemia and lipid parameters, evaluated according to the same method.
  • the evaluation of the tolerance was carried out on the analysis of the biochemical parameters of the hepatic evaluation, the creatinine and the possible occurrence of undesirable events during the experimentation.
  • the clinical values are comparable for each of the study groups, except for the Systolic Blood Pressure value for which a significant difference is observed.
  • V2 The values obtained at V2 are compared in raw values and in% calculated as follows: (V2-V1 / V1) * 100, by a non-parametric Wilcoxon test.
  • CTX Collagen type I cross-linked C-telopeptide
  • NTX Collagen type I cross-linked N- telopeptide
  • V2 As predicted in the statistical analysis, the values obtained at V2 are compared in raw values and in% calculated as follows: (V2-V1 / V1) * 100, by a non-parametric Wilcoxon test.
  • V2 and V1 are also compared in intra-group by a matched Wilcoxon test, they are summarized in the table below.
  • a histological study was performed on skin explants from a mammoplasty of a 49-year-old woman.
  • the explants are kept in culture and treated with molecules extracted from mother-of-pearl according to the invention at 0.015
  • % associated with a basic binder (percentage by weight relative to the total weight of the extract and the base binder).
  • the binder serves as a placebo control.
  • the comparisons are made in kinetics at times D2, 4, 6 and 8.
  • the histological study is made by Masson's trichrome staining and microscopic observation in transmitted light.
  • Fig.4.1 For the control skin, the dermal-epidermal junction is flat (Fig.4.1). There is no evidence of epidermal renewal. The papillary dermis is poorly irrigated. The skin is sluggish and shows real signs of aging. Treatment with placebo resulted in no signs of activation (Fig.4.2).
  • the dermal-epidermal junction With a treatment at 2 mg / cm 2 of extract as obtained in Example 1 (Fig. 4.3), the dermal-epidermal junction has a festooned relief, it plunges deep into the dermis. Deep crypts are very rich in active cells and in contact with micro-vessels. This region is the seat of increased cellular respiration.
  • the activity at the dermal-epidermal junction is greater than with the lower dose.
  • a restructuring of the epidermal sequence is observed, with the various cell layers resulting in a keratinized layer of juvenile appearance.
  • An improvement in the anchoring (indented aspect) of the germinal layer in the dermis is clearly noted.
  • the dermal-epidermal junction is activated and well irrigated.
  • a restoration of the relief of the dermo-epidermal junction, of indented young appearance, is obtained after treatment with a formulation containing molecules extracted from mother-of-pearl.
  • the epidermis-dermis contact is more important with better anchoring, which represents a factor of skin tone, elasticity and volume.
  • Cellular respiration especially at the dermal-epidermal junction, a site of intense exchange and cellular production, ensures the enzymatic exchanges and especially the oxygenation necessary for the physiological functioning of the whole of the dermis and the epidermis.
  • Cutaneous respiration was detected on skin explants cultured in vitro by immunological staining carried out with a specific antibody directed against glucose-6-phosphate dehydrogenase, an enzyme important in this physiological function.
  • the positive regions react giving a brown color.
  • the cuts are made at the kryostat.
  • Example 1 With an application of the mother-of-pearl formulation as obtained in Example 1 at the dose of 4 mg / cm 2 , the respiratory activity of the germinal cells is stimulated, especially in their pole in contact with the microvessels. and the extracellular dermal matrix. This effect is durable
  • the cellular stimulation observed under the effect of molecules extracted from the mother of pearl can contribute to draining and fading bags and dark circles.
  • Mother-of-pearl powder was implanted between the hypodermis and the dermis in the rat.
  • the mother-of-pearl powder has a diameter of between 50 and 100 ⁇ m.
  • the powder is sterilized by irradiation with ⁇ -radiation (2.5 Mrad).
  • ⁇ -radiation 2.5 Mrad.
  • the mother-of-pearl powder is mixed with autologous blood.
  • calcium carbonate (CaCOa) is also mixed with autologous blood.
  • calcium carbonate serves as a negative control.
  • Implants are inserted at the ventral surface at the junction of the thorax and abdomen in Wistar rats weighing between 260 and 280 g. The implants are placed between the dermis and the hypodermis. After 2 weeks, implantation sites are retrieved for histology analysis.
  • mother-of-pearl implantations no necrotic tissue or inflammation is observed.
  • the fragments of mother-of-pearl have even undergone an important dissolution.
  • a vascularization is observed, blood capillaries are organized in concentric networks located at a distance from the implant but converging towards it.
  • fibroblast recruitment and cell activation ( Figure 6.1, 6.2, 6.3, 6.4).
  • Fibroblasts have the appearance of active cells (large nucleus and numerous nucleoli). Cell divisions are observed on the periphery of the mother-of-pearl, indicating an activation of the proliferation.
  • a protein-based food supplement has been prepared, "Beauty supplement A", its composition is as follows:
  • the objective was to evaluate the activity of the food supplement in an objective and subjective way.
  • the objective evaluation of the activity of the food supplement was carried out at the end of the study (J56) on the biomechanical properties of the skin with the DTM (Dermal Torque Meter).
  • the volunteers included in the study come from the general "voluntary" panel of the company carrying out the clinical study. Each volunteer must, to be registered in the panel, undergo a medical examination with the recruiting physician of the center.
  • the test is monocentric, open and comparative between D1, D28 and D56. It comprises :
  • the biomechanical properties of the skin were measured on the forearm with the DTM, at the beginning of the study and at the end of the study.
  • the force used was 6 milliNewton. Three parameters are measured:
  • - Ue corresponds to the extensibility of the skin
  • - Uv corresponds to the viscoelastic deformation and represents the cutaneous elasticity
  • - Ur corresponds to the angle of deformation of the skin after relaxation of the torsion force and represents the cutaneous tonicity.
  • the dermatologist had the following criteria:
  • Table 8 shows the averages and percentages of variation of the forearm parameters according to the randomization table. The analysis was performed on 21 volunteers.
  • Table 9 summarizes the averages obtained on D1 and D56 for all the items, on 22 volunteers, except the evaluation on the legs carried out on 21 volunteers, without the volunteer n ° 8.
  • the threshold of significance is set at 0.05. Any p less than 0.05 indicates a statistically significant difference between J1 and J56. After 56 days, the investigator noted an improvement in cutaneous hydration on the legs and forearms.
  • Table 10 summarizes the averages obtained on D1 and D28 for all items.
  • the threshold of significance is set at 0.05. Any p less than 0.05 indicates a statistically significant difference between J1 and J28.
  • Table 11 Subjective evaluation of effectiveness by the volunteer at D1 and D56

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Abstract

La présente invention concerne des molécules extraites de la nacre de mollusques et leur procédé d'extraction. Elle concerne également une composition, en particulier comestible, comprenant des molécules extraites de la nacre. La composition comestible selon l'invention est plus particulièrement destinée à favoriser le maintien du capital osseux, l'hydratation de la peau et/ou la restructuration de l'épiderme et du derme.

Description

PROCEDE D'EXTRACTION DE MOLECULES DE NACRE, COMPOSITIONS ET UTILISATION.
La présente invention concerne des molécules extraites de la nacre de mollusques et leur procédé d'extraction. Elle concerne également une composition, en particulier comestible, comprenant des molécules extraites de la nacre. La composition comestible selon l'invention est plus particulièrement destinée à favoriser le maintien du capital osseux, l'hydratation de la peau et la restructuration de l'épiderme et du derme.
INTRODUCTION
La nacre est une structure calcifiée formant la couche brillante interne de la coquille de certains mollusques. Elle est composée de cristaux de carbonate de calcium et de composés organiques, représentés principalement par des protéines et des polysaccharides et présente une exceptionnelle structure microscopique et une résistance mécanique importante.
On sait que la nacre est composée de molécules actives sur le plan pharmacologique ou esthétique. Par exemple, la nacre a été utilisée depuis l'Antiquité en esthétique et dans les pharmacopées traditionnelles. Par ailleurs, la nacre est connue pour ses propriétés régénératrices des os. En effet, la poudre de nacre, de même que sa matrice hydrosoluble ont démontré leur compatibilité biologique in vivo et in vitro, ainsi que leur capacité à promouvoir l'ostéogenèse en favorisant l'activité des ostéoblastes et de leurs précurseurs (voir la demande PCT WO 97/24133). Ainsi, des implants en nacre de Pinctada placés dans des os ou dans la moelle osseuse induisent la formation d'os nouveau. Ces implants en nacre après différents examens présentent une faible altération de leur surface qui est nécessaire à leur bonne intégration dans l'os. Des analyses microscopiques récentes ont montré la présence d'ostéoclastes à l'interface os/nacre. Il est admis que la résorption limitée de la nacre par des ostéoclastes est à l'origine de la libération de molécules qui agissent sur les cellules formatrices d'os et leurs précurseurs. Des fragments de nacre provenant du bivalve Pinctada sont capables d'induire une réponse biologique lorsqu'ils sont implantés dans l'os du chien, du mouton, ou de l'homme. Cette réponse correspond à une activité ostéogénique locale et une intégration de la nacre dans l'os de l'hôte sans réaction inflammatoire.
Il est donc souhaitable de pouvoir isoler les substances biologiquement actives présentes dans la nacre. Dans la demande de brevet WO 97/24133, il a été décrit un procédé permettant d'extraire un ensemble de molécules biologiquement actives à partir de la nacre. Cependant, ce procédé ne permet pas d'obtenir l'extrait d'intérêt de la nacre.
Dans la présente demande, les inventeurs ont mis au point un nouveau procédé permettant d'extraire des molécules actives de la nacre. De manière surprenante, ces derniers ont pu montrer que les molécules extraites selon le procédé de la présente invention peuvent avoir, chez un individu, des applications importantes dans le maintien de son capital beauté pour la peau et/ou de son capital osseux.
A ce titre, l'ostéoporose représente un problème de santé publique majeur. Elle ne concerne pas que la femme ménopausée, elle peut survenir très tôt dans la vie d'une personne, notamment sous l'effet de traumatismes liés au sport, à une mauvaise hygiène de vie et/ou au stress. Il est généralement admis que la perte osseuse est plus importante chez la femme âgée que chez l'homme du même âge. Bien qu'elle s'accélère lorsque la ménopause est installée, la perte osseuse la plus significative est observée pendant la période de péri-ménopause. Au cours de cette période, il existe en fait un déséquilibre entre formation et résorption osseuses, au détriment de la formation, qui conduit à une accélération du renouvellement de l'os. La résorption l'emporte sur la formation et in fine l'os formé est de mauvaise qualité, il montre une microarchitecture désordonnée.
De manière générale, la perte de la masse osseuse commence dès l'âge de 25 ans chez une personne, et durant toute sa vie, il est souhaitable de préserver son capital osseux. La littérature indique que, tous âges confondus, l'apport alimentaire de calcium joue un rôle positif sur la masse osseuse ou la réduction du risque de fracture dans la plupart des études (50 résultats positifs sur 52 études analysées). L'apport de calcium chez la femme ménopausée semble avoir des effets variables selon l'ancienneté de la ménopause.
Dans les cinq premières années de la ménopause, la perte osseuse au niveau du radius est ralentie sans être stoppée complètement par l'apport calcique avec un effet maximal pour les apports de 1000 mg de calcium élément environ. L'effet du calcium sur la perte osseuse vertébrale semble inexistant pendant cette période. Pour les ménopauses plus anciennes, un apport calcique de 800 mg/j semble ralentir la perte osseuse au niveau du radius et partiellement au niveau du rachis. Un apport de 1000 mg/j de calcium semble également ralentir la perte osseuse de la tête fémorale.
Physiologiquement, le fonctionnement du tissu osseux sain est la conséquence de l'activité de 2 types de cellules : les cellules formatrices d'os, les ostéoblastes, et des cellules de la résorption de l'os, les ostéoclastes. La bonne qualité d'un os résulte de cet équilibre qui conduit à une masse osseuse physiologiquement optimale. La résorption contrôlée et limitée de l'os par les ostéoclastes est nécessaire à l'activation des cellules formatrices d'os que sont les ostéoblastes.
Il est ainsi souhaitable d'identifier des principes actifs qui permettent de préserver cet équilibre afin de favoriser le maintien du capital osseux d'un sujet.
La peau constitue une interface active entre le corps et l'extérieur, elle est soumise notamment aux effets cumulatifs de la pollution, de l'exposition au soleil ou d'une mauvaise hygiène de vie (tabac, alcool, etc.). Les composants de l'enveloppe cutanée, le derme et l'épiderme changent face à ces différentes agressions. La peau est constituée de 2 couches cellulaires principales, l'épiderme composé de kératinocytes qui se différencient en cornéocytes, et le derme qui est constitué principalement de fibroblastes dispersés dans une matrice extracellulaire qu'ils fabriquent. Les origines embryonnaires de ces 2 types de cellules sont différentes : les kératinocytes sont d'origine ectodermique, tandis que les fibroblastes dérivent du mésoderme. Les fibroblastes et les kératinocytes ont des activités spécifiques, mais il existe entre ces cellules une communication étroite. Le derme et l'épiderme ne fonctionnent pas séparément mais ils sont étroitement associés et soutenus par une troisième couche qui sert de support aux deux premières, l'hypoderme.
L'épiderme est fabriqué par une couche de cellules actives (cellules souches germinales) situées au contact du derme. Ces cellules se différencient pour aboutir à des cellules spéciales kératinisées qui constituent la couche cornée. Cette différenciation se fait à partir de la jonction dermo-épidermique, où l'on distingue principalement la couche germinale puis la couche granuleuse et la couche cornée. Le fonctionnement dynamique de ce processus est fondamental pour la construction d'un épiderme jeune et solide bien attaché sur le derme. Il est le résultat de l'effet de nombreux messages qui passent par des molécules impliquées dans l'activité cellulaire. Dans une peau dynamisée, épiderme et derme communiquent constamment et c'est le derme qui "parle" à l'épiderme notamment par l'intermédiaire de messagers moléculaires de type facteurs de croissance.
Au cours du vieillissement, les différentes couches de la peau s'amincissent. Les fibroblastes deviennent moins actifs et produisent moins de matrice extracellulaire et la microcirculation se réduit également. L'épiderme se déstructure et le derme perd sa tonicité, l'hypoderme s'infiltre de cellules graisseuses.
L'identification de molécules utilisables dans le maintien de l'aspect de la peau permettrait d'éviter ou de retarder l'apparition d'une telle perte de tonicité et de toutes les conséquences du vieillissement de la peau.
Les molécules extraites grâce au procédé de la présente invention peuvent être comprises dans des compositions, de préférence comestibles, destinées à favoriser le maintien du capital osseux, l'hydratation de la peau et/ou la restructuration de l'épiderme et du derme.
RESUME DE L'INVENTION
Un objet de l'invention concerne un procédé d'extraction de molécules biologiquement actives à partir de la nacre de la coquille d'un mollusque.
Un autre objet de l'invention concerne un extrait de molécules biologiquement actives de nacre susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus.
La présente invention concerne également une composition, en particulier comestible, contenant un extrait de molécules de nacre susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de l'extrait selon l'invention ou de la composition, en particulier comestible, contenant ledit extrait dans la protection de la masse osseuse.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation de l'extrait selon l'invention ou de la composition, en particulier comestible, contenant ledit extrait dans l'hydratation de la peau et la restructuration de l'épiderme et/ou du derme.
La présente invention a également pour objet un extrait de molécules de nacre susceptible d'être obtenu par le procédé ci-dessus, utilisé à titre de médicament.
La présente invention à en outre pour objet l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre susceptible d'être obtenu par le procédé de la présente invention, pour la préparation d'un médicament pour le traitement des désordres liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu osseux, en particulier pour le traitement de l'ostéoporose. LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Protocole d'obtention d'une poudre de nacre de granulométrie de 128 μm.
Figure 2: Effet de la concentration en extrait selon l'invention (20-650 μg protéine/ml) sur le nombre d'ostéoclastes adhérant (A) et sur la résorption osseuse (B) après 48 h de culture à 37°C et 5% de CO2. (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 ).
Figure 3: Organigramme représentant le déroulement chronologique d'une étude de l'effet de l'extrait de molécules de nacre selon l'invention sur le remodelage osseux.
Figure 4: Effets des molécules extraites de la nacre sur l'amélioration de la jonction dermo-épidermique. Etude sur des explants de peau à J2.
1 : Témoin sans soin. Epiderme (E). Derme papillaire (D). Jonction dermo- épidermique { >-). Gx630. L'épiderme est peu épais et plat avec une couche kératinisée opaque épaisse (-^) et aplatie. Les différentes couches cellulaires de l'épiderme sont absentes. Les cellules de la couche cellulaire germinative ou cellules souches sont peu actives (>) et cette couche n'est pas ancrée dans le derme.
2 : Témoin soin placebo. L'épiderme (E) est plus épais que celui du témoin sans soin et la couche kératinisée régulière présente un relief (->). On ne distingue pas les différentes couches cellulaires épidermiques. Les cellules souches sont actives (>). La jonction dermo-épidermique ( >-) est légèrement festonnée. Le derme (D) est peu irrigué.
3 : Soin à 2 mg/cm2 : L'épiderme (E) est plus épais que dans le cas des deux contrôles. La couche kératinisée n'est plus opaque et épouse les microreliefs cutanés. On distingue toutes les couches cellulaires épidermiques : - couche germinative avec cellules très actives ([>) ; couche des cellules claires de Malpighi (¥), couche granuleuse (-Φ-), couche kératinisée (->).
4 : Soin à 4 mg/cm2 : La couche germinale dermo-épidermique est plus profondément ancrée dans le derme et les micro-vaisseaux du derme papillaire en contact sont plus abondants et dilatés (-Φ-).
Figure 5: Effets des molécules extraites de la nacre sur la respiration cellulaire 1 : J2. Témoin, sans soin : Aucun marquage d'une activité respiratoire. Situation cohérente avec une peau atone, vieillie. Jonction dermo-épidermique ( >-).
Couche kératinisée de l'épiderme (->).
2 : J2. Témoin, placebo : Légère activité respiratoire localisée au niveau de la couche des cellules germinales (marron). 3 : J2. Soin avec la formulation à base de molécules extraites de la nacre : 4 mg/cm2 : Activité respiratoire intense en périphérie des cellules germinales souches (marron) avec une localisation spécifique au pôle basai (>) témoignant des communications avec la matrice extracellulaire dermique.
4 : J4. Soin avec la formulation à base de molécules extraites de la nacre : 4 mg/cm2 : même résultat que pour J 2. L'effet sur la respiration cellulaire est durable.
Figure 6: Effet de la poudre de nacre sur la stimulation des fibroblastes
1 : Section montrant chez le rat, l'implant de nacre (N) entre le derme et l'hypoderme. Les fibroblastes sont organisés autour de la nacre et sont activés
(->). Ils montrent une morphologie de cellules actives : un noyau clair avec de nombreux nucléoles. Ils ont synthétisés une matrice extracellulaire (^) qui devient métachromatique après coloration au bleu de toluidine démontrant la présence de protéoglycannes. Une microvascularisation et des capillaires sanguins sont présents dans le derme entourant les fragments de nacre (*). Barre = 50 μm.
2 : Coupe montrant la nacre implantée (N) qui se dissout progressivement. Le marquage immunologique de la collagènase (coloration brune) est située sur les fragments de nacre (→). Les fibroblastes activés ont synthétisé une matrice extracellulaire (^). Le site d'implantation est bien vascularisé au moyen de capillaires sanguins (*). Barre = 50 μm. 3 : Capillaires sanguins (*) développés au niveau du derme 2 semaines après l'implantation. Erythrocytes (→). Une inflammation chronique n'est pas observée. Barre = 50 μm. Coloration au bleu de toluidine.
4 : La nacre (N) implantée dans le derme provoque un recrutement des fibroblastes. Par chimiotactisme la nacre induit la formation de clusters de fibroblastes activés (^). L'activité des fibroblastes est stimulée, comme le montre les divisions cellulaires (→). Microvacularisation (*). Coloration au bleu de toluidine. Barre = 50 μm
Figure 7: Effet de la poudre de nacre sur la stimulation des fibroblastes (suite)
1 : Section au niveau de l'implant montrant un réseau dense riche en collagène de type I (^- ) après immunomarquage (coloration brune). Capillaires sanguins (*). Contre coloration au bleu de toluidine. Barre = 50 μm.
2 : Immunomarquage du collagène de type III (coloration brune) 2 semaines après l'implantation dans le derme (^). Le collagène de type III, un collagène juvénile, est produit par les fibroblastes activés en contact étroit avec les fragments de Nacre (N). Matrice extracellulaire métachromatique synthétisée par les clusters de fibroblastes activés (•=>). Microvascularisation (*). Contre coloration au bleu de toluidine. Barre = 50 μm. 3 : Section au niveau du site de l'implantation. Immunomarquage intense de la décorine (coloration brune) qui forme un réseau dense (^). La décorine entoure les fibroblastes activés (→). Matrice extracellulaire métachromatique (*). Contre coloration au bleu de toluidine. Barre = 100 μm.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Les présents inventeurs ont identifié un procédé permettant d'extraire des molécules de la nacre de mollusques nacriers, en particulier de Pinctada margaritifera, permettant de favoriser le maintien du capital osseux, d'améliorer et/ou protéger la structure de la peau, en particulier pour favoriser ou maintenir l'hydratation de la peau ou favoriser la restructuration de l'épiderme et/ou du derme. Un objet de l'invention concerne donc un procédé d'extraction de molécules biologiquement actives à partir de la nacre de la coquille d'un mollusque nacrier, lequel procédé comprend les étapes suivantes :
(i) la couche de nacre de la coquille du mollusque est réduite en poudre d'une granulométrie comprise entre 1 et 200 μm, de préférence entre 50 et 130 μm ;
(ii) ladite poudre est mélangée dans une solution à base d'eau de solvant organique polaire dont le rapport volumique solvant organique polaire:eau varie de 1 :99 à 99:1 ; et (iii) la fraction aqueuse de la suspension résultante est séparée de la fraction insoluble.
La nacre utilisée dans le procédé peut être obtenue à partir de coquilles de mollusques nacriers (mollusques capables de former de la nacre), en particulier à partir d'huîtres et plus spécifiquement des huîtres du genre Pinctada et plus particulièrement du genre Pinctada espèce margaritifera.
La séparation de la nacre du reste de la coquille peut être réalisée par tout moyen connu en soi et en particulier par meulage.
La réduction de la nacre en une poudre de granulométrie adéquate sera réalisée par tout moyen adapté au matériau de départ, notamment par broyage, concassage et/ou meulage. La pulvérisation de la nacre peut notamment être réalisée en plusieurs étapes, notamment dans un premier temps par concassage, puis éventuellement par différentes techniques de broyage. De manière préférentielle, on procède à un broyage par la technique « Jarre + Bille de corindon » afin d'éviter toute contamination métallique.
La nacre peut être utilisée sans décontamination préalable. Toutefois, la nacre, en particulier avant d'être réduite en poudre, peut être avantageusement décontaminée, notamment par lavage(s) décontaminant(s), par exemple dans une solution d'hypochlorite de sodium, puis par séchage. La nacre peut également être stérilisée, avant, pendant ou après avoir été réduite en poudre, par toute méthode connue en soi. En particulier, la stérilisation est mise en œuvre par irradiation (irradiation aux rayons gamma) ou à chaud
(chaleur sèche ou humide) (Atlan G., Delattre O., Berland S., Le Faou A., Nabias G., Cot D., Lopez E., Interface between bone and Nacre implants in sheep,
Biomaterials, 1999, 20 : 1017-1022 ; Balmain J., Hannoyer B., Lopez E., Fourier transform infrared spectroscopy (FITR) and X-Ray diffraction analyses of minerai and organic matrix during heating of mother of pearl (Nacre) from the shell of the mollusc Pinctada maxima, J. Biomed. Mater. Res. Applied Mat., 1999, 48 (5) : 749-754).
De préférence, l'étape (ii) est réalisée à une température comprise entre 15 et 400C, de préférence à température ambiante (entre environ 18 et 25°C) éventuellement sous agitation.
La poudre de nacre est de préférence mélangée au solvant à l'étape (ii) pendant une durée de 30 min à 20 h, de préférence pendant environ 12 heures.
A l'étape (ii) du procédé de l'invention, une extraction est réalisée dans une solution comprenant de l'eau et un solvant organique polaire. En particulier, le solvant organique polaire est choisi parmi les alcools, hydrocarbones halogènes, esters, cétones, aldéhydes, éthers, le diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxyde (DMSO), l'acétonitrile, le nitrobenzène, le tétrahydrofurane
(THF), la pyridine et le N-méthylformamide. De manière préférée, les alcools, hydrocarbones halogènes, esters, cétones, aldéhydes, et/ou éthers sont des composés contenant 1 à 6 atomes de carbone, encore plus préférentiellement 1 à
4 atomes de carbone. Préférentiellement, les alcools sont choisis parmi les monoalcools comprenant de 1 à 6 atomes de carbones, encore plus préférentiellement 1 à 4. Le terme « monoalcool » désigne une chaîne aliphatique saturée ou insaturée, linéaire, ramifiée ou cyclique substituée par un seul groupement hydroxyle. Parmi les monoalcools préférés, on peut citer, par exemple, le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le n-propanol, le tert-butanol, le n- butanol, etc. Préférentiellement, le solvant organique polaire est choisi parmi le méthanol, l'éthanol, l'isopropanol, le n-propanol, le tert-butanol, le n-butanol, l'acétone, l'acétonitrile et l'acétone. Dans un mode de réalisation particulier, la solution d'extraction est un mélange d'eau et de plusieurs solvants organiques polaires tels que définis ci-dessus, dont le rapport volumique solvants organiques polaires:eau est compris dans l'intervalle 1 :99 - 99:1. Dans un mode particulièrement préféré de réalisation, le solvant organique polaire utilisé est l'éthanol.
Dans une variante de réalisation, le rapport volumique solvant organique polaire:eau est, de préférence, compris entre 20:80 et 80:20 et de manière plus préférée ce rapport volumique est de 50:50.
A l'étape (iii) du procédé selon l'invention, la fraction aqueuse de la suspension obtenue à l'étape (N) séparée de la fraction insoluble correspond avantageusement à l'extrait désiré. Cette séparation est réalisée par tout moyen connu en soi, et en particulier par centrifugation et/ou filtration, de préférence par centrifugation puis par filtration. Plus spécifiquement, la suspension obtenue à l'issue de l'étape de mélange est centrifugée pendant 20 minutes à 40C à 20 000 g, puis le surnageant est filtré sur des membranes hydrophiles de 0,22 μm.
Selon une variante de réalisation, le filtrat obtenu peut être concentré, de préférence par évaporation, et en particulier par évaporation sous vide à 30°C.
Dans un mode de réalisation du procédé d'extraction selon l'invention, une étape supplémentaire de dissolution et de lyophilisation de l'extrait organique humide peut être mise en oeuvre.
La fraction insoluble écartée à l'étape (iii) du procédé ci-dessus comprend du carbonate de calcium. Aussi, dans un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention peut en outre comprendre la réintroduction de carbonate de calcium, en particulier du carbonate de calcium retiré à l'étape (iii) du procédé, avant utilisation de l'extrait tel qu'obtenu ci-dessus. L'invention concerne également les molécules susceptibles d'être extraites par ce procédé. Plus spécifiquement, l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé de la présente invention comprend essentiellement un mélange de protéines, de peptides et de molécules organiques dont la masse est comprise entre 50 et 1000 Da. L'extrait comprend en outre toutes substances solubles dans le solvant utilisé, en particulier des substances hydrosolubles organiques ou encore des lipides polaires.
L'invention concerne non seulement le mélange susceptible d'être obtenu par le procédé décrit ci-dessus, mais également les diverses substances purifiées par fractionnement à partir du mélange, et en particulier à partir du produit soluble complet.
Les molécules de nacre extraites par le procédé selon l'invention se sont révélées être utilisables en tant que composant d'une composition, en particulier comestible. Ainsi, La présente invention concerne également une composition, en particulier comestible, comprenant des molécules extraites de la nacre susceptibles d'être obtenues par le procédé décrit ci-dessus.
La composition selon l'invention est particulièrement utile pour favoriser le maintien du capital osseux d'un sujet. Plus spécifiquement, le sujet présente, ou est susceptible de présenter, un capital osseux altéré par un traumatisme, un désordre ou une pathologie et notamment l'ostéoporose ou tout autre facteur intrinsèque ou extrinsèque pouvant provoquer une déminéralisation avec perte de masse osseuse. En favorisant le maintien du capital osseux, les molécules de nacre extraites par le procédé selon l'invention permettent également de protéger la masse osseuse d'un individu tout au long de sa vie.
Les présents inventeurs ont ainsi pu démontrer que les molécules extraites de la nacre obtenues par le procédé décrit ci-dessus sont biologiquement actives en ce sens qu'elles ont une influence sur la dégradation du tissu osseux par les ostéoclastes. Les molécules extraites de la nacre représentent donc un grand intérêt pour la protection de la masse osseuse (capital osseux) et notamment au moment d'une ostéoporose déclarée, comme par exemple l'ostéoporose post- ménopausique, l'ostéopénie due au vieillissement, l'ostéopénie d'immobilisation et autres. Dans ces désordres osseux, l'os devient sensible aux fractures car sa dégradation est plus importante que sa formation et la matrice organique devient moins apte à minéraliser.
Une telle composition, en particulier comestible, peut être utile pour protéger, renforcer le capital osseux ou favoriser la restauration du capital osseux d'un sujet. En particulier, les compositions, de préférence comestibles, selon l'invention peuvent être utilisées pour protéger la masse osseuse au cours de la vie d'un individu. De telles compositions peuvent également être utilisées au cours de la croissance d'un individu dans le but de favoriser son équilibre squelettique ou bien également lors de la pratique d'un sport.
De plus, l'extrait selon l'invention s'est révélé être utilisable en tant que composant d'une composition, en particulier comestible, améliorant ou maintenant l'hydratation de la peau et/ou restructurant l'épiderme et le derme d'un sujet. Les présents inventeurs ont ainsi pu démontrer que l'extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention présente des effets biologiques de stimulation de la régulation de la prolifération cellulaire et de l'activité tissulaire de la peau, en particulier des fibroblastes et/ou des kératinocytes. Des tests in vivo ont aussi permis de montrer que les molécules actives extraites de la nacre selon l'invention possèdent des propriétés sur l'hydratation de la peau et/ou favorisent la re- densification du derme en stimulant l'activité de synthèse des fibroblastes.
Les molécules extraites de la nacre représentent donc un grand intérêt pour l'amélioration de l'aspect de la peau ou pour sa protection.
La stimulation cellulaire observée sous l'effet des molécules extraites de la nacre selon la présente invention peut, en particulier, contribuer à drainer et estomper les poches et/ou les cernes. Les inventeurs ont en effet également observé que les molécules extraites de la nacre selon l'invention agissent directement au niveau de l'hypoderme qui stocke la graisse et l'eau. L'extrait ou la composition selon l'invention, en particulier comestible, peut également être utilisé pour augmenter ou préserver le « capital cutané » (ou « capital beauté ») d'une personne. En particulier, l'extrait selon l'invention ou les compositions, de préférence comestibles, selon l'invention peuvent être utilisés pour drainer ou estomper les poches et/ou les cernes ou empêcher leur apparition, préserver ou améliorer l'hydratation, la fermeté, la douceur de la peau ou encore le teint du visage ou du corps. Ces mêmes compositions, en particulier comestibles, peuvent être utilisées dans le but de protéger la peau contre les radicaux libres (néfastes pour la peau) ou encore contre les agressions du soleil ou plus généralement toute attaque de facteurs intrinsèques ou extrinsèques néfastes à la peau (tabac, alcool, pollution, ...). L'extrait ou la composition, en particulier comestible, selon l'invention peuvent aussi favoriser, en particulier stimuler de manière régulée, la microcirculation et l'oxygénation de la peau, permettant ainsi une meilleure élimination des toxines.
L'extrait ou la composition selon l'invention peut également être utilisé pour diminuer les rides et/ou ridules ou prévenir leur apparition, pour prévenir ou traiter le vieillissement de la peau et en particulier le vieillissement dû à l'âge, au soleil ou autre. L'extrait ou la composition selon l'invention permettent aussi de prévenir les défauts de pigmentation (taches brunes et taches blanches) et/ou de les atténuer.
Ainsi, l'extrait ou la composition selon l'invention peut être à usage thérapeutique ou non. En particulier, lorsque l'utilisation est non thérapeutique, l'extrait ou la composition selon l'invention est avantageusement administré par voie orale, tel que dans le cas d'une composition comestible.
Les compositions, en particulier comestibles, selon l'invention peuvent avantageusement être administrées par voie orale. Ainsi, on entend par « composition comestible » une composition alimentaire ou nutraceutique dont les constituants sont destinés à être ingérés en tout ou partie. Avantageusement, la composition selon l'invention peut être préparée par exemple sous la forme de biscuits, barres alimentaires, poudres à diluer, pâte à mâcher, produits laitiers tels qu'un yaourt, ou encore sous la forme de compléments alimentaires tels que comprimés ou capsules à avaler, comprimés effervescents, sirops, boissons, gommes tendres, suspensions huileuses ou gélules.
Les compositions selon l'invention comprennent, outre l'extrait, des composés classiquement utilisés dans les domaines considérés, en particulier pour une administration par voie orale. L'homme du métier détermine, avec ses connaissances, les composés les plus adaptés à l'utilisation envisagée, ainsi que leur quantité. A titre d'exemple, non limitatif, de tels composés, on peut citer l'huile de bourrache, béta-carotène, le sélénium, le carbonate de calcium, la lécithine de soja, l'Huile d'Onagre, les vitamines E, C, et/ou D (sous forme de calcipotriol), le lycopène, de l'huile de poisson (EPA/DHA), ou leur mélange.
Ainsi, les compositions, en particulier comestibles, selon l'invention sont d'un emploi non contraignant et un sujet peut consommer de telles compositions pour en tirer tous les bénéfices décrits ci-dessus de manière agréable et aisée.
Par exemple, des effets positifs sur le teint, mais aussi une amélioration de la pigmentation qui est régulée et unifiée, de la fermeté et de la douceur cutanées du visage, des jambes ou encore des bras peuvent être obtenus en consommant les compositions, en particulier comestibles, de la présente invention. De plus, l'utilisation de telles compositions selon l'invention permet de prévenir les défauts de pigmentation (taches brunes et taches blanches) et/ou les atténue.
Avantageusement, les compositions de la présente invention peuvent aussi contenir du carbonate de calcium. Plus particulièrement, ledit carbonate de calcium est le carbonate de calcium récupéré après précipitation à partir de la poudre de nacre à l'étape (iii) du procédé décrit ci-dessus. Comme spécifié précédemment, l'apport alimentaire de calcium joue un rôle positif sur la masse osseuse ou la réduction du risque de fracture. Ces propriétés seront donc avantageusement mises à profit dans une composition contenant à la fois du carbonate de calcium, qui joue un rôle sur la reconstruction du tissu osseux, et les molécules extraites par le procédé décrit ci-dessus, dont l'effet porte principalement sur la prévention de la dégradation de ce même tissu osseux.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre obtenu selon le procédé décrit ci-dessus à titre de médicament.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant des molécules extraites selon la présente invention, dans un support acceptable sur le plan pharmaceutique.
Une telle composition pharmaceutique peut être utile dans le traitement de désordres liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu osseux, en particulier de l'ostéoporose, et plus spécifiquement l'ostéoporose post-ménopausique, l'ostéopénie due au vieillissement, l'ostéopénie d'immobilisation et autres.
L'invention a également pour objet l'utilisation de l'extrait selon l'invention dans la préparation d'une composition pharmaceutique, en particulier dermatologique à administrer par voie orale, destinée à hydrater la peau et restructurer l'épiderme et le derme.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des désordres liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu osseux.
L'invention comprend en outre l'utilisation d'un extrait de molécules de nacre tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des désordres cutanés liés à un défaut d'hydratation de la peau ou a une structure altérée de l'épiderme et/ou du derme.
La présente invention concerne également un procédé pour préserver ou améliorer l'hydratation, la fermeté, la douceur de la peau ou encore le teint du visage, comprenant l'administration, de préférence orale, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait de nacre tel que défini précédemment.
L'invention a également pour objet une méthode de traitement des désordres du renouvellement du tissu osseux, en particulier l'ostéoporose, et plus spécifiquement l'ostéoporose post-ménopausique, l'ostéopénie due au vieillissement, l'ostéopénie d'immobilisation ou médicamenteuse (par exemple, traitement à la cortisone) et autres, comprenant l'administration à un mammifère, en particulier à un être humain, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait de nacre tel que défini précédemment.
L'invention a enfin pour objet une méthode de traitement des désordres cutanés liés à un défaut d'hydratation de la peau ou a une structure altérée de l'épiderme et/ou du derme comprenant l'administration à un mammifère, en particulier à un être humain, d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un extrait de nacre tel que défini précédemment.
D'autres aspects et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent, fournis à titre illustratif et non limitatif.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation d'un extrait de molécules de nacre
De la poudre de nacre de granulométrie 128 μm est obtenue grâce au protocole schématisé sur la figure 1.
La poudre de nacre (200 g) est mélangée dans 200 ml d'un mélange eau:éthanol (50:50) pendant 12 heures à température ambiante et sous agitation magnétique interne. La suspension est centrifugée pendant 20 min à 20 000 g et à 40C. Le surnageant est filtré sur une unité de stérilisation type Stericup® pour éliminer les particules de poudre en suspension. Le filtrat est évaporé sous vide à 300C afin d'éliminer l'éthanol ayant servi à l'extraction. La solution aqueuse est congelée puis lyophilisée. C'est cette solution qui est utilisée dans les exemples qui suivent.
De la même manière, une extraction de molécules de nacre a été réalisée dans un mélange eau:isopropanol (50:50), eau:acétone (50:50), ou eau:butanol (50:50). Une analyse chromatographique a montré que les extraits obtenus par ces différents procédés d'extraction présentent un profil moléculaire similaire.
Exemple 2 : Essais biologiques in vitro
1. Protocole
Des expériences ont été entreprises in vitro dans le but de comprendre les relations qui existent entre les extraits selon l'invention et les ostéoclastes. Les ostéoclastes sont isolés de fémurs de lapin de 10 jours, puis ils sont déposés sur des lamelles d'os de boeuf de 100 μm d'épaisseur. Dans le milieu de culture, sont ajoutées différentes concentrations de l'extrait tel qu'obtenu à l'exemple 1. La concentration de l'extrait de nacre ajouté au milieu de culture varie entre 40 et 2600 μg /ml. La thapsigargine (1 μM) a été choisie comme témoin positif d'inhibition de la résorption osseuse. Les cellules sont ensuite cultivées pendant 48 heures à 37 0C sous une atmosphère de 5 % de CO2.
Pour évaluer le nombre d'ostéoclastes présents sur les lamelles d'os, les cellules ont été fixées puis colorées par un marqueur ostéoclastique spécifique, la phosphatase acide résistante au ("Tartrate Résistant Acid Phosphatase" ou TRAP). Les cellules multinucléées avec un nombre de noyaux supérieur ou égal à 3 et TRAP positives (colorées en violet) ont été considérées comme étant des ostéoclastes (Figure 2 A).
Pour évaluer la résorption, les lamelles d'os ont été débarrassées de leurs ostéoclastes et colorées par une solution de bleu de toluidine permettant la visualisation des lacunes de résorption en microscopie optique. Le pourcentage de surface résorbée par rapport à la surface totale a été quantifié en utilisant un logiciel d'analyse d'image couplé à un microscope optique (Figure 2 B).
2. Résultats Même si l'extrait selon l'invention n'a pas d'effet significatif sur l'adhésion des ostéoclastes, excepté pour la concentration maximale de 2600 μg d'extrait/ml (ainsi que pour le témoin positif thapsigargine), ce dernier diminue la résorption osseuse de façon dose dépendante.
Ces expériences in vitro montrent que les extraits selon l'invention agissent sur l'activité de résorption osseuse due aux ostéoclastes. Les extraits selon l'invention diminuent la résorption osseuse par les ostéoclastes. Ces extraits n'affectent pas l'adhésion des ostéoclastes à la surface des lamelles d'os.
Exemple 3: Essais biologiques in vivo
Pour confirmer ces résultats obtenus in vitro une étude clinique a été réalisée. L'objectif de cette étude était de comparer l'influence de l'apport quotidien de 798 mg de carbonate de calcium et 2 mg d'extrait tel qu'obtenu à l'exemple 1 à celle d'un placebo sur les paramètres biochimiques du remodelage osseux de la femme ménopausée, sur une durée totale de trois mois.
1. Conditions de l'étude (figure 3)
II s'agissait d'une étude en double aveugle, randomisée, multicentrique, avec bénéfice individuel direct potentiel, réalisée sur des femmes ménopausées. Après signature du consentement éclairé et vérification des critères de sélection, les volontaires ont été randomisées en deux groupes. L'un a reçu deux capsules du complément alimentaire apportant chacune 399 mg de carbonate de calcium et 1 mg de l'extrait selon l'invention, l'autre a reçu deux capsules placebo. Chaque groupe était traité sur une durée de 3 mois. Un prélèvement sanguin a été effectué juste au moment de la randomisation et à l'issue des trois mois de traitement afin d'évaluer l'effet du traitement sur les marqueurs biochimiques du remodelage osseux et sur les paramètres du bilan lipidique.
Un appel téléphonique a été réalisé par les médecins afin d'évaluer les éventuels effets secondaires ressentis.
Les critères d'inclusion étaient les suivants :
- Sujets de sexe féminin ne souffrant d'aucune pathologie grave
- Age 45-60 ans
- BMI >27 kg/m2 - Ménopause datant de plus d'un an et de moins de six ans
- Ne souffrant pas de pathologie hépatique (ASAT et ALAT < 1 ,5 fois la limite supérieure des valeurs normales), ni de troubles gastro-intestinaux
- Ne souffrant pas de pathologie rénale (créatinine dans les limites des valeurs normales) - Ne souffrant pas de pathologie osseuse connue
- Avec ou sans traitement hormonal de substitution pour la ménopause ou traitement équivalent
- Ne recevant pas de traitement susceptible de modifier le métabolisme osseux depuis plus d'un an - Ne recevant pas de traitement susceptible d'affecter le métabolisme lipidique, sauf si aucune variation de ce traitement n'est susceptible d'intervenir pendant la période de l'essai
- Ne souffrant pas de dyslipidémie modérée, même traitée, (LDL-cholestérol > 1.30 g/L et/ou triglycérides > 1 ,50 g/L) - Ne souffrant pas de dysthyroïdie (TSH dans les limites des valeurs normales avec ou sans traitement hormonal)
- Ne souffrant d'aucune allergie alimentaire connue
- FSH > 30 UI/mL
- Estradiol < 50 pg/ml
Ont été exclues de l'étude, les femmes présentant au moins l'un des critères suivants : - Age < 45 ans ou > 60 ans
- BMI > 27 kg/m2
- Ménopause datant de moins d'un an ou de plus de six ans
- ASAT et/ou ALAT > 1 ,5 fois la limite supérieure des valeurs normales - Créatinine à la limite supérieure des valeurs normales
- Antécédents de pathologie osseuse
- Traitement susceptible de modifier le métabolisme osseux depuis moins d'un an (A l'exception du THS ou autre traitement équivalent de la ménopause)
- Traitement affectant le métabolisme lipidique susceptible d'être modifié pendant la période de l'essai
- LDL-Cholestérol > 2,20 g/L et/ou triglycérides > 2,50 g/L
- TSH < à la limite inférieure des valeurs normales ou > à la limite supérieure des valeurs normales
- Traitement hormonal de substitution pour la fonction thyroïdienne mal équilibré - Anti-thyroïdiens de synthèse
- Antécédents d'allergie alimentaire
- FSH <30 UI/mL
- Estradiol > 50 pg/ml
- Plus généralement toute condition susceptible d'empêcher la participation à l'essai dans de bonnes conditions et sans risque pour la patiente.
2. Produits à l'étude
Complément alimentaire A (extrait de nacre) : chaque capsule contient 399 mg de carbonate de calcium, 1 mg de l'extrait de l'exemple 1, et 210 mg d'huile de tournesol. Produit placebo : les capsules contiennent de l'huile de tournesol.
Les tuniques des capsules molles du complément alimentaire A et du placebo sont identiques et contiennent de l'amidon, de la gélatine de poisson, de la glycérine, de l'eau et le Candurin comme colorant.
La consommation des produits consiste en la prise quotidienne de 2 capsules/jour (au petit déjeuner) pendant les 3 mois de l'étude. Etant donné qu'il s'agit d'un essai en double aveugle, ni la patiente, ni le médecin ne sait quel produit est consommé par chacune des volontaires.
3. Description de la population étudiée
Nombre de sujets
Le paramètre principal d'évaluation est l'évolution du CTX. Les valeurs moyennes observées chez la femme ménopausée avec la méthode de dosage envisagée (Cross Laps Nordic Bioscience Diagnostics) sont de 3634 pmol /L, avec un écart-type de 1833 pmol/L. Le calcul du nombre de sujets a été effectué en prenant deux hypothèses de diminution de ce paramètre (35% et 55%), considérées comme les valeurs minimales et maximales permettant de prédire une réponse positive de la densité minérale osseuse. Le risque alpha unilatéral a été fixé à 0,05 et le risque béta à 0,20 ou 0,10. Le résultat de ce calcul est présenté dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Diminution du CTX Alpha 0,05/Béta 0,10 Alpha 0,05/Béta 0,20
35% 35 25 55% 14 10
Le nombre initial de sujets a donc été fixé à 25, ce qui correspondait à l'hypothèse intermédiaire.
L'essai a débuté en juin 2003, sur 40 sujets, nombre qui au vu du calcul statistique ci-dessus, reste significatif sur le plan clinique.
Cinquante sept femmes ont été pré-incluses dans l'étude, 14 n'ont pas été incluses dans l'étude, 43 ont été randomisées et mises sous traitement, 6 ont abandonné entre V1 et V2. Conformément au protocole, les volontaires incluses pour cette étude étaient tous de sexe féminin, d'âge compris entre 45 et 60 ans et présentant une ménopause datant de plus d'un an et de moins de six ans. Nombre de sujets à VO : 57 Nombre de sujets à V1 : 43 Nombre de sujets à V2 : 37
Parmi les abandons, 5 sujets n'ont pas souhaité poursuivre, 1 sujet a été perdu de vue.
Description de la méthodologie statistique
La comparabilité des valeurs biologiques et cliniques de base (à V1) a été déterminée par un test non paramétrique de Wilcoxon. Le même test a permis de comparer les résultats obtenus dans chaque groupe à V2, sur les valeurs absolues et les variations entre V1 et V2 ((Valeur V2-ValeurV1)/valeur V1 , en %). Les critères descriptifs de la population (traitements concomitants et antécédents médicochirurgicaux) sont comparés par un test du X2.
Le critère principal d'efficacité est l'évolution de la concentration sérique du CTX. L'influence du traitement sur la concentration de ce paramètre a été évaluée par un test non paramétrique de Wilcoxon comparant les valeurs obtenues après trois mois de traitement (V2) dans le groupe correspondant au traitement 1 , à celles obtenues à la même période dans le groupe correspondant au traitement 2. La même analyse a été effectuée en comparant l'évolution entre V1 et V2 dans chaque groupe de traitement.
Les critères secondaires d'efficacité sont les phosphatases alcalines osseuses, l'ostéocalcine, la calcémie, la phosphatémie et les paramètres du bilan lipidique, évalués selon la même méthode.
L'appréciation de la tolérance a été réalisée sur l'analyse des paramètres biochimiques du bilan hépatique, la créatinine et l'éventuelle survenue d'événements indésirables au cours de l'expérimentation.
Afin d'observer le rôle du traitement sur les différentes valeurs biologiques, la régression multiple suivante a été réalisée en prenant chaque variable biologique comme variable expliquée et les paramètres traitement (1 : Complément alimentaire A et 0 : placebo), le numéro de visite et le numéro de sujet comme variable explicatives. L'ensemble de l'analyse statistique a été réalisé sur le logiciel SAS, version 8.2 (SAS Institute, Cary NC, USA). 4. Résultats
Valeurs cliniques Comparaison des valeurs cliniques au début de l'expérimentation
Tableau 2
Figure imgf000025_0001
p<0,05
Comparaison des valeurs cliniques pour les deux populations avant la prise des traitements à l'étude
Les valeurs cliniques sont comparables pour chacun des groupes à l'étude, excepté au niveau de la valeur de Pression artérielle Systolique pour laquelle une différence significative est observée.
Analyse des résultats obtenus à l'issue de la V2
Les valeurs obtenues à V2 sont comparées en valeurs brutes et en % calculés de la façon suivante : (V2-V1/V1 )*100, par un test de Wilcoxon non paramétrique.
Les différences obtenues entre V2 et V1 sont par ailleurs comparées en intra- groupe par un test de Wilcoxon apparié. Tableau 3
Figure imgf000026_0001
Moyenne ± écart type
Aucune différence significative n'est observée entre les 2 groupes à l'issue de la visite V2, c'est à dire à l'issue de la prise du complément nutritionnel ou du placebo par les volontaires.
Aucune différence significative n'est par ailleurs observée sur ces critères cliniques à l'intérieur d'un même groupe.
Analyse par régression multiple
Une régression multiple a été réalisée sur les données cliniques obtenues pour déterminer l'influence du traitement indépendamment des autres facteurs. Le modèle a inclus les paramètres suivants : le temps, le sujet, le traitement. Aucun rôle significatif du traitement n'est observé pour ces paramètres cliniques. Synthèse
Aucune influence du traitement n'est observée sur l'évolution des critères cliniques observés que sont le poids total, l'IMC, la masse grasse et la masse sèche ainsi que les critères de pression artérielle et de fréquence cardiaque.
Valeurs biologiques Comparaison des valeurs biologiques au début de l'expérimentation
Pour le suivi des thérapeutiques visant à réduire l'ostéoporose, il est actuellement recommandé par l'International Osteoporosis Foundation (IOF) de suivre un marqueur de résorption et un marqueur de formation osseuse. Les marqueurs de résorption les plus utilisés sont actuellement le CTX (« Collagen type I cross-linked C-telopeptide » : C-terminal télopeptide à liaison croisée du collagène de type I), le NTX (« Collagen type I cross-linked N-telopeptide » : N- terminal télopeptide à liaison croisée du collagène de type I), dosés dans l'urine ou le sérum (pour le CTX) ou la désoxypyridinoline urinaire.
Les valeurs de base pour chacune des variables biologiques d'intérêt et pour chaque traitement, sont présentées dans le tableau ci-après. Aucune différence significative n'est observée. Les valeurs biologiques de base sont donc comparables pour chacun des 2 groupes à l'étude, sauf pour la créatinine, le calcium et l'ostéocalcine pour lesquels nous observons une différence entre les 2 groupes.
La comparaison des valeurs biologiques pour les 2 populations avant la prise des traitements à l'étude est montrée ci-dessous :
Tableau 4
Figure imgf000028_0001
Ana yse non param trique: test de coxon Moyenne ± cart type
Analyse des résultats obtenus à l'issue de la V2
Tel que cela était prévu dans l'analyse statistique, les valeurs obtenues à V2 sont comparées en valeurs brutes et en % calculés de la façon suivante : (V2- V1/V1 )*100, par un test de Wilcoxon non paramétrique.
Les différences obtenues entre V2 et V1 sont par ailleurs comparées en intra-groupe par un test de Wilcoxon apparié, elles sont résumées dans le tableau ci-dessous.
Tableau 5
Figure imgf000029_0001
Test de Wilcoxon - Moyenne ± écart type p<0,05 Comparaison des valeurs biologiques pour les 2 populations après traitement (résultats à V2) Dans les tableaux 4 et 5, les abréviations suivantes ont été utilisées : CTX - Collagen Type I cross-linked C-telopeptide (ou C-terminal télopeptide à liaison croisée du collagène de type I) ; HDL - High Density Lipoprotein (ou lipoprotéines de haute densité); LDL - Low Density Lipoprotein (ou lipoprotéines de basse densité); PALos - Pal Osseuse ; TGO - Transaminase Glutamate Oxaloacétate ; TGP - Transaminase Glutamate Pyruvate. Analyse des résultats par régression multiple
Afin d'observer le rôle du traitement sur les différentes valeurs biologiques, la régression multiple suivante a été réalisée en prenant chaque variable biologique comme variable expliquée et les paramètres traitement (1 : complément alimentaire A et 0 : placebo), le numéro de visite et le numéro de sujet comme variable explicatives.
Cette analyse a permis de confirmer le rôle du "complément alimentaire A" sur l'abaissement du CTX de façon significative et ceci indépendamment des facteurs temps et sujet (facteur = -2.03, p=0.046).
En revanche, aucun rôle significatif du traitement, du temps ou du sujet n'est observé par cette analyse sur les autres paramètres biologiques qui restent stables.
5. Discussion
Les deux populations étudiées, traitement "complément alimentaire A" et traitement placebo sont comparables à V1 pour les critères d'intérêt excepté la créatinine, le calcium et l'ostéocalcine ainsi que pour les critères d'observation clinique.
En ce qui concerne les critères secondaires d'efficacité, aucune différence significative n'est observée à V2, que ce soit en valeur absolue ou sur les % de variations. De même à l'intérieur d'une population, les variations observées entre V1 et V2 restent non significatives.
Les différences initiales pour la créatinine et le calcium n'existent plus à V2, l'analyse par régression multiple montre que cette évolution n'est pas imputable au traitement.
La différence persiste en ce qui concerne l'ostéocalcine et aucune conclusion ne peut être avancée. Cette différence est cependant gommée lorsque l'on étudie les pourcentages de variations. La régression multiple ne met par ailleurs pas en évidence d'effet du traitement sur ce paramètre. Enfin, notons qu'une différence significative apparaît pour les Protéines totales entre les deux groupes et en intra-groupe pour le groupe placebo. A ce niveau également, l'analyse par régression multiple permet de montrer que cette évolution n'est pas explicable par le produit consommé, ni le temps, ni le sujet.
Pour les transaminases, aucune variation significative n'est à noter entre les valeurs de base et les valeurs obtenues à V2.
En ce qui concerne le critère principal d'efficacité qu'est la CTX1 on observe une différence significative entre V2 et V1 quand on compare les 2 groupes en valeur absolue (p=0,060) et ceci dans un sens favorable au "Complément A" puisque le groupe sous traitement affiche une diminution très nette des valeurs de
CTX.
L'analyse par régression multiple confirme que ce rôle positif dans le métabolisme phosphocalcique est effectivement dû au complément alimentaire A. Sa consommation quotidienne diminue la résorption osseuse et ainsi la quantité circulante des fragments du collagène de type I.
6. Conclusion
Cette étude randomisée en double aveugle versus placebo a permis de vérifier la bonne tolérance de la consommation du complément alimentaire A chez des femmes ménopausées. Les résultats comparés entre les deux populations ont permis de mettre en évidence une variation du CTX favorable au complément alimentaire A et significative par rapport au bras placebo.
Dans les exemples suivants, la capacité des molécules extraites de nacre à stimuler l'activité métabolique des fibroblastes et des kératinocytes a été examinée in vitro sur des explants de peau maintenus en survie, mais aussi in vivo sur le derme du rat. Exemple 4 : Effets des protéines extraites de la nacre sur la jonction dermo- épidermique
Une étude histologique a été réalisée sur des explants de peau provenant d'une plastie mammaire d'une femme de 49 ans. Les explants sont maintenus en culture et traités par des molécules extraites de la nacre selon l'invention à 0,015
% associées à un liant de base (pourcentage en poids par rapport au poids total de l'extrait et du liant de base). Le liant sert de témoin placebo. Les comparaisons sont faites en cinétique aux temps J2, 4, 6 et 8. L'étude histologique est faite par une coloration au trichrome de Masson et observation au microscope en lumière transmise.
Pour la peau témoin, la jonction dermo-épidermique est plate (Fig.4.1). On n'observe aucun signe de renouvellement épidermique. Le derme papillaire est peu irrigué. La peau est atone et présente de réels signes de vieillissement. Le traitement avec le placebo, n'entraîne aucun signe d'activation (Fig.4.2).
Avec un traitement à 2 mg/cm2 d'extrait tel qu'obtenu dans l'exemple 1 (Fig. 4.3), la jonction dermo-épidermique présente un relief festonné, elle plonge profondément dans le derme. Les cryptes profondes sont très riches en cellules actives et en contact avec des micro-vaisseaux. Cette région est le siège d'une respiration cellulaire accrue. A 4 mg/cm2 d'extrait selon l'invention (Fig. 4.4), l'activité à la jonction dermo-épidermique est plus importante qu'avec la dose plus faible. Une restructuration de la séquence épidermique est observée, avec les différentes couches cellulaires aboutissant à une couche kératinisée d'aspect juvénile. Une amélioration de l'ancrage (aspect indenté) de la couche germinale dans le derme est clairement notée. La jonction dermo-épidermique est activée et bien irriguée.
Une restauration du relief de la jonction dermo-épidermique, d'aspect indenté jeune, est obtenue après traitement par une formulation contenant des molécules extraites de la nacre. Le contact épiderme-derme est plus important avec un meilleur ancrage, ce qui représente un facteur de tonus cutané, d'élasticité et de volume.
Exemple 5 : Effet des molécules extraites de la nacre sur la respiration cellulaire (figure 5)
La respiration cellulaire, notamment à la jonction dermo-épidermique, site d'échange intense et de production cellulaire, assure les échanges enzymatiques et surtout l'oxygénation nécessaire au fonctionnement physiologique de l'ensemble du derme et de l'épiderme.
La respiration cutanée a été détectée sur des explants de peau cultivés in vitro par un marquage immunologique effectué avec un anticorps spécifique dirigé contre la glucose-6-phosphate déshydrogénase, enzyme importante dans cette fonction physiologique. Les régions positives réagissent en donnant une couleur brune. Les coupes sont réalisées au kryostat.
Avec une application de la formulation à base de nacre telle qu'obtenue dans l'exemple 1 à la dose de 4 mg/cm2, l'activité respiratoire des cellules germinales est stimulée, notamment dans leur pôle en contact avec les micro- vaisseaux et la matrice extracellulaire dermique. Cet effet est durable
(observations des jours J2 à J8).
La stimulation cellulaire observée sous l'effet des molécules extraites de la nacre peut contribuer à drainer et estomper poches et cernes.
Exemple 6 : Etude in vivo de l'activité de la poudre de nacre sur l'épiderme du rat, démonstration de la stimulation des fibroblastes par des implantations sous-cutanées à la limite derme-épiderme.
De la poudre de nacre a été implantée entre l'hypoderme et le derme chez le rat. La poudre de nacre a un diamètre compris entre 50 et 100 μm. Avant l'implantation, la poudre est stérilisée par irradiation aux rayons γ (2,5 Mrad). (Lopez E., A. Le Faou, S. Borzeix, S. Berland. Stimulation of rat cutaneous fibroblasts and their synthetic activity by implants of powdered nacre (mother of pearl). Tissue and CeII, 2000, 32 (1 ) : 95-101 )
La poudre de nacre est mélangée à du sang autologue. Comme témoin, le carbonate de calcium (CaCOa) est également mélangé à du sang autologue. Dans cette expérience, le carbonate de calcium sert de témoin négatif.
Les implants sont insérés au niveau de la face ventrale à la jonction du thorax et de l'abdomen chez des rats Wistar d'un poids compris entre 260 et 280 g. Les implants sont placés entre le derme et l'hypoderme. Après 2 semaines, les sites d'implantation sont récupérés pour être analysés par histologie.
Au niveau des implantations de nacre, il n'est pas observé de tissu nécrosé ou d'inflammation. Les fragments de nacre ont même subit une dissolution importante. Une vascularisation est observée, des capillaires sanguins sont organisés en réseaux concentriques situés à distance de l'implant mais convergeant vers lui.
La nacre exerce également un recrutement des fibroblastes et leur activation cellulaire (Figure 6.1 , 6.2, 6.3, 6.4) . Les fibroblastes possèdent l'aspect de cellules actives (noyau volumineux et nucléoles nombreux). Des divisions cellulaires sont observées à la périphérie de la nacre, indiquant une activation de la prolifération.
Sous l'effet de la nacre, une synthèse importante des composants de la matrice extracellulaire par les fibroblastes est observée : un réseau dense de collagène I (Fig. 7.1) et III (Fig. 7.2) s'organise, avec une synthèse importante de protéoglycannes (coloration métachromatique) dont la décorine (Fig. 7.3).
L'implantation de poudre de Nacre, chez le rat, entre derme et épiderme, stimule la production de matrice extracellulaire par les fibroblastes notamment les collagènes de type I et III et la décorine qui est une molécule importante dans la communication et l'adhésion cellulaires. Exemple 7 : Etude clinique
A la vue des résultats préliminaires obtenus sur les explants de peau et chez le rat, une étude clinique sur une composition comestible comprenant des molécules extraites de la nacre et plus particulièrement des protéines était envisageable.
Un complément alimentaire à base de protéines a été préparé, "complément Beauté" A, sa composition est la suivante :
0,38 mg d'extrait de nacre tel que préparé à l'exemple 1 ,
410 mg d'huile de bourrache,
4,8 mg de béta-carotène,
75 mg de sélénium, 149,62 mg de carbonate de calcium,
7 mg de lécithine de soja.
Conditions de l'étude clinique 22 femmes volontaires âgées de 40 à 65 ans, avec la peau sèche sur le corps et le visage, devaient ingérer matin et soir une gélule du complément alimentaire A pendant 56 jours.
L'objectif a été d'évaluer l'activité du complément alimentaire de manière objective et subjective. L'évaluation objective de l'activité du complément alimentaire a été effectuée en fin d'étude (J56) sur les propriétés biomécaniques de la peau avec le DTM (Dermal Torque Meter).
L'étude de certaines propriétés biomécaniques de la peau après utilisation d'une crème ou d'un complément alimentaire, a recours au twistomètre ou DTM, dont la tête rotative imprime une légère torsion aux couches superficielles de l'épiderme : l'analyse du temps de retour à l'état initial permet de mesurer la souplesse et l'élasticité de la peau L'évaluation subjective de l'activité du complément alimentaire a été effectuée à J28 et J56, par évaluation par le volontaire, et à J56 par le dermatologue.
Dans les conditions de l'essai, l'analyse des résultats ' des différentes méthodes utilisées pour mettre en évidence l'activité cosmétique du complément alimentaire à base de protéines extraites de nacre a pu montrer une amélioration de l'hydratation cutanée mesurée de manière objective et après évaluation du volontaire et du dermatologue.
Les volontaires inclus dans l'étude sont issus du panel général « volontaires » de la société réalisant l'étude clinique. Chaque volontaire doit, pour être inscrit dans le panel, subir un examen médical avec le médecin recruteur du centre.
A partir de ce panel, les volontaires qui correspondent aux critères d'inclusion ont été sélectionnés, puis définitivement admis dans l'étude au terme de la visite initiale. 22 volontaires ont été inclus dans l'étude.
Les critères suivants devaient être remplis pour permettre d'inclure un volontaire dans l'essai :
- Volontaires adultes âgés de plus de 40 ans et de moins de 65 ans,
- Sexe féminin,
- Normalité de l'examen clinique préalable,
- Volontaires ayant la peau sèche sur le visage et le corps,
- Phototype II ou III, - Indemne d'antécédents allergiques aux produits cosmétiques ou d'usage ménager et d'atopie,
- Volontaires ayant signé un consentement écrit, libre, éclairé et express,
- Volontaires capables de comprendre les exigences de l'essai.
N'étaient pas inclus dans l'essai les sujets répondant à un ou plusieurs des critères suivants :
- Volontaires adultes de moins de 40 ans et de plus de 65 ans, - Volontaires ayant appliqué dans les 48 heures précédant le début de l'essai, un produit cosmétique de soin ou un produit pharmaceutique sur les zones cutanées étudiées,
- Pathologie cutanée évolutive, - Prise de traitement anti-histaminique ou/et tout traitement pouvant interférer avec le métabolisme cutané,
- Sujet en période d'exclusion entre deux essais,
- Intolérance ou allergie alimentaire avérée.
Pendant toute la durée de l'étude, il a été demandé aux volontaires de ne pas utiliser de nouveaux produits cosmétiques et/ou pharmaceutiques, de ne pas utiliser de complément alimentaire autre que celui à l'étude.
L'essai est monocentrique, ouvert et comparatif entre J1 , J28 et J56. Il comporte :
- Un bilan initial permettant de vérifier les critères d'inclusion et de non inclusion ;
- Une période de traitement pendant 56 jours (1 gélule matin et soir) ; - Une visite intermédiaire à J28.
Visite à J1 t - 30 mn : - Informer le volontaire sur le déroulement de l'étude.
- Recueillir le consentement éclairé et écrit du volontaire.
- Enregistrer, dans le cahier d'observation, les données démographiques et l'examen clinique de la zone cutanée et les traitements éventuellement pris par le volontaire. - Vérifier le respect des critères d'inclusion et de non inclusion. Si le volontaire répond à ces critères, il est éligible pour suivre l'étude et est inclus.
- Attribuer successivement le numéro du volontaire selon l'ordre croissant d'arrivée dans l'étude et randomiser les sites d'application. - Conditionnement du volontaire pendant 30 minutes.
tO :
- Mesures des propriétés biomécaniques cutanées sur l'avant-bras avec le
DTM.
- Prise du produit par les volontaires à domicile (2 gélules par jour : 1 le matin et 1 le soir).
Visite à J28
- Consultation intermédiaire.
- Evaluation de l'efficacité par le volontaire. - Prise du produit par les volontaires à domicile (2 gélules par jour : 1 le matin et 1 le soir).
Visite à J56 - Mesures des propriétés biomécaniques cutanées sur l'avant-bras avec le
DTM.
- Auto-évaluation de l'efficacité par le volontaire et le dermatologue.
- Evaluation de la tolérance générale.
- Evaluation de l'acceptabilité.
Critères d'évaluation
Evaluation objective de l'activité du complément alimentaire sur les propriétés biomécaniques de la peau par mesures de la fermeté cutanée
Les propriétés biomécaniques de la peau ont été mesurées sur l'avant-bras avec le DTM, en début d'étude et en fin d'étude. La force utilisée a été de 6 milliNewton. Trois paramètres sont mesurés :
- Ue : correspond à l'extensibilité de la peau, - Uv : correspond à la déformation viscoélastique et représente l'élasticité cutanée, - Ur : correspond à l'angle de déformation de la peau après relâchement de la force de torsion et représente la tonicité cutanée.
A partir de ces mesures, il est possible de calculer :
- La fermeté de la peau qui est le rapport Ur/Ue. L'augmentation de ce rapport traduit le raffermissement de la peau ;
- La déformation globale de la peau Uf qui est définie comme la somme de Uv et de Ue. Son augmentation illustre l'amélioration de la souplesse de la peau.
Des mesures répétées des paramètres de déformation (Ue, Uv, Ur, Ur/Ue et Uf) donnent ainsi la possibilité d'évaluer objectivement l'effet des produits cosmétiques sur l'état de fermeté de la peau par comparaison à une zone sans produit et à différents temps de mesure (Tableau 6).
Tableau 6
Figure imgf000039_0001
Evaluation subjective de l'activité du complément alimentaire
Pour évaluer l'efficacité du produit, en début d'étude (J1 ), en cours d'étude (J28) et fin d'étude (J56), le volontaire a coté les items suivants de 0 à 9 ; le dermatologue a coté les mêmes items sauf Ie « confort de peau » à J56 :
Au niveau du visage :
- Hydratation cutanée : (0 = pas hydratée ; 9 = très hydratée)
- Teint lumineux éclatant : (0 = pas lumineux ; 9 = très lumineux) - Peau douce : (0 = pas douce ; 9 = très douce)
- Peau souple : (0 = pas souple ; 9 = très souple)
- Confort de peau * : (0 = pas confortable ; 9=très confortable) * Seul, le volontaire a coté cet item. Au niveau des bras :
- Hydratation cutanée : (0 = pas hydratée ; 9 = très hydratée)
- Coloration cutanée : (0 = pas lumineux ; 9 = très lumineux)
- Fermeté cutanée : (0 = pas ferme ; 9 = très ferme)
- Douceur cutanée : (0 = pas doux ; 9 = très doux) Au niveau des jambes :
- Hydratation cutanée : (0 = pas hydratée ; 9 = très hydratée)
- Coloration cutanée : (0 = pas lumineux ; 9 = très lumineux)
- Fermeté cutanée : (0 = pas ferme ; 9 = très ferme)
- Douceur cutanée : (0 = pas doux ; 9 = très doux)
Pour l'examen dermatologique sur le visage et les jambes, le dermatologue disposait des critères suivants :
- érythème,
- œdème, - sécheresse, desquamation, aspect gras,
- papules,
- pustules, - démangeaisons,
- tiraillements.
Chaque critère est noté de 0 à 3 (0 = absent, 1 = léger, 2 = modéré, 3= important).
Il note aussi toutes les manifestations d'inconfort ressenties par le volontaire en indiquant la date de début, la date de fin, la durée, l'intensité, la fréquence, la nécessité ou non d'un traitement correcteur et l'imputabilité.
Le rythme des mesures est schématisé dans le tableau 7 ci-dessous : Tableau 7
Figure imgf000041_0001
Les évaluations ont été réalisées par la même personne tout au long de l'essai.
Analyse des données de DTM
Le tableau 8 présente les moyennes et les pourcentages de variation des paramètres sur l'avant-bras selon le tableau de randomisation. L'analyse a été effectuée sur 21 volontaires.
Tableau 8 : Valeurs du DTM à J1 avant l'application et à J56
Figure imgf000041_0002
S = significatif ; NS = non significatif * le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre J 1 et J56. L'analyse statistique des paramètres globaux des propriétés biomécaniques cutanées à l'aide du DTM du produit "Complément Beauté" A a mis en évidence une augmentation significative de l'extensibilité cutanée de l'ordre de 27,83 %.
Au total, après 56 jours d'utilisation, le "Complément Beauté" A a provoqué une augmentation statistiquement significative de l'extensibilité cutanée. La variation de l'extensibilité cutanée reflète directement le niveau d'hydratation, plus la peau est hydratée, plus l'extensibilité augmente.
Evaluation de l'efficacité par le Dermatologue à J56 Le tableau 9 récapitule les moyennes obtenues à J1 et J56 pour tous les items, sur 22 volontaires, sauf l'évaluation sur les jambes effectuée sur 21 volontaires, sans le volontaire n° 8.
Figure imgf000042_0001
p : test W de Wilcoxon; S = significatif (p < 0,05); NS = non significatif (p > 0,05).
* le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre J1 et J56. Après 56 jours, l'investigateur a noté une amélioration de l'hydratation cutanée sur les jambes et les avant-bras.
Evaluation de l'efficacité par le volontaire
Le tableau 10 récapitule les moyennes obtenues à J1 et J28 pour tous les items.
Tableau 10 : Evaluation subjective de l'efficacité par le volontaire à J1 et J28
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000043_0002
p : test W de Wilcoxon; S = significatif (p < 0,05); NS = non significatif (p > 0,05).
* le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre J1 et J28.
A J28, les volontaires ont noté une amélioration significative de l'hydratation cutanée et du confort cutané sur le visage, de l'hydratation cutanée et de la fermeté cutanée sur le corps. Le tableau 11 récapitule les moyennes obtenues à J1 et J56 pour tous les items.
Tableau 11 : Evaluation subjective de l'efficacité par le volontaire à J1 et J56
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000044_0002
p : test W de Wilcoxon; S = significatif (p < 0,05); NS = non significatif (p > 0,05). * le seuil de significativité est fixé à 0,05. Tout p inférieur à 0,05 indique une différence statistiquement significative entre J1 et J56.
Après 56 jours, les volontaires ont noté une amélioration de l'hydratation cutanée sur le visage, les avant-bras et les jambes. Un effet positif sur le teint a aussi été ressenti. Une amélioration significative de la coloration, de la fermeté et de la douceur cutanées a été ressentie sur les jambes et les avant-bras.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'extraction de molécules biologiquement actives à partir de la nacre de la coquille d'un mollusque nacrier, lequel procédé comprend les étapes suivantes :
(i) la couche de nacre de la coquille du mollusque est réduite en poudre d'une granulométrie comprise entre 1 et 200 μm ;
(ii) ladite poudre est mélangée dans une solution d'extraction à base d'eau et de solvant organique polaire dont le rapport volumique solvant organique polaire : eau varie de 1 :99 à 99:1 ; et (iii) la fraction aqueuse de la suspension résultante est séparée de la fraction insoluble.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel le rapport solvant organique polaire : eau est compris entre 20:80 et 80:20.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, dans lequel l'étape (ii) est réalisée à une température de 15-400C, éventuellement sous agitation.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la poudre de nacre est mélangée dans la solution d'extraction pendant une durée de 30 min à 20 h.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le solvant organique polaire est l'éthanol.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la séparation de ladite fraction aqueuse de la suspension est réalisée par centrifugation et/ou filtration.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le filtrat obtenu après l'étape (iii) est concentré, de préférence par évaporation sous vide à 3O0C.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, lequel procédé comprend une étape supplémentaire dans laquelle ledit extrait est dissous puis lyophilisé.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, lequel procédé comprend une étape supplémentaire dans laquelle du carbonate de calcium retiré à l'étape (iii) est réintroduit dans l'extrait obtenu.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit mollusque est l'huître Pinctada margaήtifera.
11. Extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Composition, caractérisée en ce qu'elle comprend des molécules extraites de la nacre de mollusques nacriers selon la revendication 11.
13. Composition selon la revendication 12, ladite composition étant une composition comestible.
14. Composition selon la revendication 13, ladite composition étant un produit lacté, en particulier un yaourt.
15. Composition selon la revendication 12, ladite composition étant un complément alimentaire.
16. Composition selon l'une des revendications 11 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre du carbonate de calcium.
17. Composition selon l'une des revendications 12 à 16, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre de l'huile de bourrache, béta-carotène, sélénium, la lécithine de soja, l'Huile d'Onagre, les vitamines E, C, et/ou D (sous forme de calcipotriol), le lycopène, l'huile de poisson (EPA/DHA), ou leur mélange.
18. Utilisation non thérapeutique d'un extrait selon la revendication 11 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, pour favoriser le maintien du capital osseux d'un sujet.
19. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 18, pour favoriser la restauration du capital osseux d'un sujet.
20. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 18, pour protéger la masse osseuse au cours de la vie d'un sujet.
21. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 20, pour favoriser l'équilibre squelettique pendant la croissance.
22. Extrait susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, à titre de médicament.
23. Utilisation de l'extrait susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter des désordres liés à un déséquilibre du renouvellement du tissu osseux.
24. Utilisation selon la revendication 23, pour la préparation d'un médicament destiné à traiter l'ostéoporose.
25. Utilisation non thérapeutique d'un extrait selon la revendication 11 ou d'une composition selon l'une quelconque des revendications 12 à 17 pour améliorer et/ou protéger la structure de la peau.
26, Utilisation non thérapeutique selon la revendication 25, pour améliorer ou préserver l'hydratation, la fermeté ou la douceur de la peau, le teint du visage ou du corps ou la structuration de l'épiderme et du derme.
27. Utilisation non thérapeutique selon la revendication 25 ou 26, pour protéger la peau contre les radicaux libres, les agressions du soleil ou tout autre effet délétère intrinsèque ou extrinsèque, tel que la pollution, la consommation d'alcool ou de tabac.
28. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à
27, pour favoriser la microcirculation et l'oxygénation de la peau.
29. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à
28, pour diminuer les rides et/ou ridules ou prévenir leur apparition.
30. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à
29, pour prévenir ou traiter le vieillissement de la peau.
31. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à 30, pour drainer ou estomper des poches ou des cernes ou en empêcher leur apparition.
32. Utilisation non thérapeutique selon l'une quelconque des revendications 25 à
30, pour diminuer ou prévenir les défauts de pigmentation (taches brunes ou taches blanches).
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