CN109456941A

CN109456941A - 一种负载肿瘤细胞外泌体的dc-cik细胞的培养方法

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Publication number: CN109456941A
Application number: CN201811409250.5A
Authority: CN
Inventors: 张权
Original assignee: See More Vision (beijing) Technology Co Ltd
Current assignee: See More Vision (beijing) Technology Co Ltd
Priority date: 2018-11-23
Filing date: 2018-11-23
Publication date: 2019-03-12

Abstract

本发明涉及DC‑CIK细胞培养领域，特别涉及一种负载肿瘤细胞外泌体的DC‑CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养，培养65‑75小时后，添加IL‑2，以培养液的体积算，添加的IL‑2的量为1000‑1500IU/mL，继续培养65‑75小时，即得；用CIK培养基进行培养：GT‑T581培养基、自体血浆和IL‑2，自体血浆为GT‑T581培养基体积的5％±0.5％，IL‑2 1000±100IU/mL。该培养方法通过CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞以一定的方式进行培养，得到的负载肿瘤细胞外泌体的DC‑CIK细胞具有良好的杀伤力。

Description

一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及DC-CIK细胞培养领域，具体而言，涉及一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法。

背景技术

细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)是一群在体外经IL-1α、IL-2、IFN-γ及抗CD3单克隆抗体等诱导而成的以CD3⁺CD56⁺细胞为主的CD4⁺和CD8⁺效应T细胞群，兼具有T细胞强大的杀瘤活性以及NK细胞的非主要组织相容性复合体(MHC)限制性杀瘤的优点。

与其他过继免疫治疗细胞相比，CIK具有增殖速度快、杀伤活性高、杀瘤谱广以及副作用小等特点，对正常骨髓造血功能影响甚微，被临床认为是一种有效的肿瘤免疫治疗手段。广泛应用于肾癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌和白血病等多种恶性肿瘤的治疗。

CIK可通过多种途径发挥抗肿瘤作用。CIK对肿瘤细胞有直接杀伤作用，通过分泌颗粒酶和穿孔素穿透靶细胞膜，直接导致肿瘤细胞破裂；CIK具有较强的细胞毒活性，可分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等多种细胞因子进一步提高免疫效应细胞的细胞毒作用，不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用，还可通过调节免疫系统间接杀伤瘤细胞，诱导肿瘤细胞凋亡。

现有DC细胞负载肿瘤抗原的方法多位裂解肿瘤细胞或者肿瘤组织，提取其中的蛋白后进行负载。提取的蛋白成分复杂，含有需要胞内抗原，激活DC后，DC进入体内提呈给T细胞，但该抗原表达于肿瘤细胞的胞内，因为无法起到特异性杀伤作用。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

树突状细胞(Dendritic cells，DCs)是体内最有效的抗原提呈细胞，表面表达B7、MHC-Ⅱ类分子、ICAM-1等多种共刺激分子，激活辅助T细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，传递特异性抗原信号，最终活化细胞毒性T细胞，因此，DC细胞在体内起到启动一系列免疫反应的关键作用，在机体的免疫功能以及肿瘤的免疫治理中有重要意义。

大多数DC细胞来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身各组织中，DC广泛分布于除脑以外的全身各脏器，但数量极少，仅占外周血单个核细胞的1％以下。DC前体细胞随血液分布到肠道、心、肝等各非淋巴器官后，发育为未成熟DC细胞。此时，DC细胞具有较强的抗原摄取加工能力，而激活T细胞的能力低下。处于各种非淋巴组织中的未成熟DC细胞摄取抗原后，到达淋巴结、脾脏，此后DC细胞摄取抗原加工的能力减弱直至消失，而致敏T淋巴细胞、启动免疫反应的能力增强，成为成熟DC细胞。

在体外培养淋巴细胞的过程中，为了最大程度活化T细胞，需要加入成熟的DC细胞以致敏T细胞。DC细胞的体外培养，通常以外周血单个核细胞作为前体细胞诱导未成熟的DC的细胞。DC细胞促成熟过程非常复杂，涉及到多种因子的共同作用，诸如GM-CSF、TNF、IL-6、IL-4、IL-1β、PGE2、polyI:C、CD40L等等。

外泌体(exosomes)，是一种脂质分子膜包裹的小囊泡。电镜下观察呈杯状，直径约为40-100nm，密度约为1.13-1.19g/mL。外泌体含有来源细胞的胞质和脂质包膜成分，外泌体内部包含有丰富的mRNA，microRNA和蛋白质成分。

外泌体形成是通过多囊泡胞内体(MVE)的细胞区室向内出芽的形式形成，内囊泡内含有蛋白质、microRNA及mRNA。当MVE与细胞膜融合时，内囊泡就被释放到细胞外成为外泌体，释放出来的外泌体能够运行到距离较远的组织而影响细胞的行为和生理上的改变。

在肿瘤发生发展的过程中，外泌体参与细胞间的信息传递，进而促进肿瘤血管的生成和实体瘤的转移，肿瘤来源的外泌体已经成为肿瘤分子生物研究的热点之一。恶性肿瘤细胞通过其细胞环境的改变来调节自身的发生、发展和转移，且这种调节可以通过外泌体和肿瘤细胞分泌因子发生。

肿瘤细胞来源外泌体既可帮助肿瘤细胞逃逸免疫监视，也可激活肿瘤特异性免疫应答。肿瘤来源外泌体内包含肿瘤特异性抗原，可以在体外产生MHCⅠ类限制性T细胞克隆，且肿瘤来源外泌体可以在体内驱动依赖T细胞的交叉保护作用对抗同源和异源肿瘤。肿瘤细胞所释放的外泌体表面携带有MHC分子和抗原肽，可以增强DC-CIK的细胞毒活性，刺激产生特异性的抗瘤T细胞，并得到具有特异性和非特异性双重抗瘤作用的DC-CIK细胞，对未来肿瘤的治疗提供了一种不同以往的方法。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法，包括以下步骤：

CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养，培养65-75小时后，添加IL-2，以培养液的体积算，添加的IL-2的量为1000-1500IU/mL，继续培养65-75小时，得到负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞；

其中，培养以及添加的培养基均为CIK培养基，所述CIK培养基的组分为：GT-T581培养基、自体血浆和IL-2，所述自体血浆的含量为所述GT-T581培养基体积的5％±0.5％，所述IL-2终浓度为1000±100IU/mL。

本发明提供的负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法，通过CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞以一定的方式进行培养，得到的负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞具有良好的杀伤力。

进一步地，CIK细胞和负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞共同培养时，所用的培养容器以T175培养瓶计，添加的CIK培养基的体积为80±10mL。

进一步地，培养65-75小时后还包括扩大培养的步骤，具体为：细胞转移到培养袋中培养，添加的CIK培养基的体积为400±50mL，培养65-75小时后，添加IL-2。

进一步地，所述CIK细胞通过以下方法制备：

所述CIK细胞通过以下方法制备：

培养容器表面包被后，接入PBMC进行培养，其中，培养所用的培养液为含4％～6％自体血浆的VIVO培养基，在其中加入IFN-γ，IFN-γ在培养液中的终浓度为1000±100U/mL；

培养20-24小时后，在培养液中加入IL-2、IL-12、IL-15和CD16，其中，在培养液中，IL-2浓度为1000±100U/mL、IL-12浓度为2.5±0.2ng/mL、IL-15浓度为10±2ng/mL，CD16浓度为2±0.2μg/mL继续培养；

培养65-75小时后，细胞转移到新的培养容器，在所述CIK培养基中培养，得到所述CIK细胞。

进一步地，所述培养液的组分包括VIVO培养基、自体血浆，所述自体血浆的含量为所述VIVO培养基体积的5％±0.5％。

进一步地，所述包被采用包被液进行，所述包被液的组分包括D-PBS、CD3和CD28，所述CD3的终浓度为500±50ng/mL，所述CD28的终浓度为500±50ng/mL。

包被液包被时，以T25培养瓶计，加入3mL包被液，置于培养箱中包被2h；倒去包被液，即可得到培养容器表面包被的培养容器。

之后，以T25培养瓶计，接种的PBMC个数为0.5×10⁷-2.0×10⁷；接种后，加10±2mL上述的培养液即CIK初始培养基，同时加入IFN-γ使其终浓度为1000±100U/mL，进行培养。

进一步地，细胞转移到新的培养容器，一般是T75培养瓶，加入CIK培养基20±5mL进行培养。

本发明中，对培养条件未特别说明的话，培养条件均为37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

进一步地，所述负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞通过以下方法制备：

(a)PBMC细胞贴壁培养，去除培养液，洗涤细胞；

(b)然后加入DC培养基，培养64-80h；

(c)拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮，补加DC培养基和肿瘤细胞外泌体，培养40-50h；

(d)将细胞悬浮后收集，得到细胞，将细胞转移到已采用自体血浆包被的培养容器中，加入DC成熟培养基，培养45-55h，得到负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞。

本发明提供的负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法，肿瘤细胞外泌体能够促进DC细胞的成熟，DC细胞功能表型CD11c/CD83、CD11c/CD86、HLA-DR/CD40优于未负载外泌体的DC。

进一步地，所述DC成熟培养基，以AIM-V培养基为基准，按以下含量添加以下组分：自体血浆体积百分数为1％±0.2％，GM-CSF 50±2ng/mL，IL-4 50±2ng/mL，TNF-α10±2ng/mL，PGE-2 1±0.2μg/mL。

本发明提供的DC成熟培养基，为DCs成熟提供良好的基础。

进一步地，步骤(a)中，所述PBMC细胞贴壁培养具体步骤为：

以T175培养瓶计，接入PBMC细胞1×10⁸-1.5×10⁸个，同时加入AIM-V培养基50-60mL和自体血浆，所述自体血浆的体积为所述AIM-V培养基体积的0.1％，贴壁培养2-3h。

进一步地，步骤(a)中，采用AIM-V培养基洗涤细胞2-3次。

进一步地，步骤(b)中，以T175培养瓶计，所述DC培养基的添加体积为30-40mL。

进一步地，步骤(c)中，以T175培养瓶计，补加的DC培养基的体积为15-20mL，添加的肿瘤细胞外泌体的体积为80-150μL。

进一步地，步骤(d)中，将细胞悬浮后收集的步骤包括：

拍打培养瓶，使细胞悬浮，将细胞液收集；

此时，培养瓶中有大量细胞贴壁，向培养瓶中加PBS，低温静置，拍打，收集细胞液，重复该步骤；

收集的细胞液离心，去上清，得到所述细胞。

进一步地，收集的细胞液离心的参数为：1400-1500rpm，3-5min。

进一步地，所述肿瘤细胞外泌体通过以下方法制备：

培养肿瘤细胞至细胞长至5％±10％融合时进行传代；

传代培养20-30h，吸走培养液和未贴壁的细胞，并进行清洗，然后加入外泌体专用完全培养液进行培养；

45-50h后收集培养液到离心管中，得到富含肿瘤细胞外泌体的培养液；

其中，所述外泌体专用完全培养液的组分为：无酚红RPMI-1640培养液和无外泌体FBS，所述无外泌体FBS的添加量为所述无酚红RPMI-1640培养液体积的10％±2％；

所述富含肿瘤细胞外泌体的培养液经分离得到所述肿瘤细胞外泌体。

本发明提供的肿瘤细胞外泌体培养和分离方法，方法简便，得到的肿瘤细胞外泌体含量高，并且其中未检出其他种类的外泌体，纯度高。

本发明中，无外泌体FBS可通过现有方法制备，也可以通过以下方法制备：FBS于100000g-120000g的转速离心8-14h；

吸取上层澄清血清，并用0.22μm滤膜过滤，滤液即为无外泌体FBS。

进一步地，所述传代按照扩培3-5倍的比例进行。也就是说，一瓶细胞传代得到3-5瓶细胞。

进一步地，所述肿瘤细胞的培养采用肿瘤细胞普通完全培养基进行，所述肿瘤细胞普通完全培养基的组分为：RPMI-1640培养液和FBS，所述FBS的添加量为所述RPMI-1640培养液体积的10％±2％。

进一步地，用PBS清洗2-3次。清洗是为了进一步去除未去除的残液以及其他碎片。

进一步地，每个培养瓶中添加4％-6％体积的外泌体专用完全培养液。

如T75细胞培养瓶(250mL)中，加入10-15mL的外泌体专用完全培养液，如T75细胞培养瓶(250mL)中可以为10mL、12mL、15mL等等。

进一步地，所述富含肿瘤细胞外泌体的培养液经分离得到所述肿瘤细胞外泌体的步骤如下：

所述富含肿瘤细胞外泌体的培养液低温离心，去除死细胞和碎片，然后过滤去除囊泡；

得到的液体进行超速离心，弃上清，得到肿瘤细胞外泌体。

本发明提供的肿瘤细胞外泌体分离方法，通过特定的方法处理肿瘤细胞，得到富含肿瘤细胞外泌体的培养液，然后对其进行分离，得到浓度较高、纯度较高的肿瘤细胞外泌体。

进一步地，所述低温离心为4±2℃下以2000-2200g离心。通过该速率进行离心，去除死细胞和碎片。

进一步地，所述离心的时间为5-10min。

进一步地，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.22μm。通过过滤，去除较大囊泡。

进一步地，得到的液体进行超速离心步骤中，离心的转速为100000-120000g，离心时间为2-3h。

通过超速离心，外泌体沉淀下来。

进一步地，所述弃上清后还包括将离心容器管壁上的液体去除，离心容器底部的物质即为肿瘤细胞外泌体。

通过去除液体，得到更纯净的肿瘤细胞外泌体。

离心容器一般为离心管。

进一步地，所述分离方法还包括以下步骤：得到的肿瘤细胞外泌体用PBS重悬，保存。

如可在-20℃进行保存。

即得到的容器底部的肿瘤细胞外泌体加入PBS重悬，保存。

对本发明分离得到的肿瘤细胞外泌体进行检测，如电镜下以及表面标记蛋白的检测，均符合肿瘤细胞外泌体的特性，说明本发明分离得到的肿瘤细胞外泌体是稳定可靠的。

另外，推算，以传代接种的肿瘤细胞计算，外泌体的得率为155.32±34.3μg/1×10⁷cells。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供的肿瘤细胞外泌体的分离方法，以传代接种的肿瘤细胞计算，外泌体的得率为155.32±34.3μg/1×10⁷cells。

(2)本发明通过肿瘤细胞外泌体含有大量肿瘤相关抗原，能够高效激活DC，促进DC细胞成熟，使得T细胞在后续起到精准抗肿瘤作用。

(3)本发明提供的负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法，以接种1.5×10⁸个细胞计算，收获的成熟DC细胞数为1.0×10⁸个细胞左右，成熟DC细胞得率均在65％以上，具有非常高的得率。

(4)CIK扩增效果好，且活化的CIK占比更高、T-reg细胞占比更低。

(5)本发明提供的负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法，得到的负载外泌体的DC-CIK细胞对相应的肿瘤细胞具有良好的抑制率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例2的细胞进行流式表型CD11c/CD14检测图；

图2为本发明实施例2的细胞进行流式表型CD11c/CD83检测图；

图3为本发明实施例2的细胞进行流式表型CD11c/CD86检测图；

图4为本发明实施例2的细胞进行流式表型HLA-DR/CD40检测图；

图5为本发明实施例2的细胞进行流式表型HLA-DR/CD80检测图；

图6为本发明实施例2的对比例的细胞进行流式表型CD11c/CD14检测图；

图7为本发明实施例2的对比例的细胞进行流式表型CD11c/CD83检测图；

图8为本发明实施例2的对比例的细胞进行流式表型CD11c/CD86检测图；

图9为本发明实施例2的对比例的细胞进行流式表型HLA-DR/CD40检测图；

图10为本发明实施例2的对比例的细胞进行流式表型HLA-DR/CD80检测图；

图11为本发明实施例3培养得到的CIK细胞表面标志物进行检测的结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

肿瘤细胞外泌体的制备

1、培养基

肿瘤细胞普通完全培养基的组分为：RPMI-1640培养液和FBS，FBS的添加量为RPMI-1640培养液体积的10％。

外泌体专用完全培养液的组分为：无酚红RPMI-1640培养液和无外泌体FBS，无外泌体FBS的添加量为无酚红RPMI-1640培养液体积的10％。

2、无外泌体FBS制备

无菌条件下将FBS倒入专用超离离心管中，每管38.6mL，4管，确认配平后，放入超速离心机中，120000g，过夜离心。

第二天，小心吸取上层澄清血清到新的无菌离心管中，0.22μm滤膜过滤至另一离心管中，确保血清的无菌状态，封口，备用。

3、肿瘤细胞外泌体培养方法

T75细胞培养瓶，普通完全培养基培养肿瘤细胞，待细胞长至80％融合时，按照1:4进行传代。

第二天，小心吸走普通完全培养基和未贴壁的细胞，用PBS小心清洗3次，每瓶加入10mL外泌体专用完全培养基。

48h后收集培养基到离心管中，即得到富含肿瘤细胞外泌体的培养基。

4、肿瘤细胞外泌体分离方法

提前打开普通低温离心机和超速离心机，预冷至4℃。

富含肿瘤细胞外泌体的培养基的离心管于2000g，离心10min，去除死细胞和碎片。

0.22μm滤膜过滤去除较大囊泡。

滤液转至超速离心管中，用PBS配平，120000g，离心2h。

弃去上清，用无菌滤纸小心吸走管壁残留液体，管底即为肿瘤细胞外泌体。称量外泌体的重量，推算，以传代接种的肿瘤细胞计算，外泌体的得率为167μg/1×10⁷cells。

得到的管底的肿瘤细胞外泌体用1mL PBS将各管外泌体重悬，混合，-80℃保存。

实施例2

一种负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞培养方法，包括以下内容：

1、外周血DC细胞培养基

1)DC培养基

以AIM-V培养基为基准，按以下含量添加以下组分：自体血浆体积百分数为1％±0.2％，GM-CSF浓度50ng/mL，IL-4浓度50ng/mL。

2)DC成熟培养基

以AIM-V培养基为基准，按以下含量添加以下组分：自体血浆体积百分数为1％±0.2％，GM-CSF浓度50ng/mL，IL-4浓度50ng/mL，TNF-α浓度10ng/mL，PGE-2浓度1μg/mL。

2、外周血DC细胞培养方法

培养第0天，取1个T175培养瓶，将得到的PBMC细胞加到培养瓶中，每瓶细胞数1.5×10⁸，加入AIM-V培养基50mL，加500μL自体血浆，培养箱贴壁培养2h。

2)培养2h后，取出培养瓶，倒去上清液，加入30mL AIM-V培养基洗培养瓶，洗2次。加入配好的DC培养基30mL，培养箱培养。

3)第3天，取出培养瓶，拍打培养瓶，使贴壁细胞漂浮。补加DC培养基20mL和肿瘤细胞外泌体100μL，培养箱培养。

4)第4天取1个新的T75培养瓶，加入7mL自体血浆，置于培养箱中包被过夜。

5)第5天，取出DC培养瓶，拍打培养瓶，使细胞悬浮，将细胞液收集到50mL离心管内。此时观察有大量细胞贴壁，向培养瓶中加15mL PBS，置于4℃15min。取出培养瓶，拍打，大部分细胞漂浮。将PBS倒出，再加入15mL PBS，置于4℃5min。5min后，取出培养瓶，拍打，细胞基本漂浮，将PBS倒入50mL离心管，离心，1400rpm，5min，离心后，倒去上清。取出第4天包被的T75培养瓶，倒去包被液。将细胞转移到T75培养瓶内，加入20mL成熟培养基。

6)第7天，收获细胞，流式表型检测。

对比例：与实施例2不同的是，不添加肿瘤细胞外泌体。

实施例2和对比例1得到的细胞的流式表型检测如图1-10所示。

图1-5为实施例2的细胞测定的流式表型图，图6-10为对比例的细胞测定的流式表型图。

图1-10的结果比较如表1所示。

表1结果比较

负载肿瘤细胞外泌体以后，CD14表型更低，更多的单个核细胞分化为DC细胞，说明肿瘤细胞外泌体能够促进DC细胞的成熟，DC细胞功能表型CD11c/CD83、CD11c/CD86、HLA-DR/CD40优于未负载外泌体的DC。

实施例3

一、溶液

1、包被液：D-PBS，CD3单抗浓度500ng/mL，CD28浓度500ng/mL。

2、CIK初始培养基：VIVO培养基(含5％自体血浆)。

3、CIK培养基：GT-T581培养基(含5％自体血浆)，IL-2浓度1000IU/mL。

二、CIK细胞培养方法

1)培养第0天，取T25培养瓶，加入3mL包被液，置于培养箱中包被2h，备用。取出包被好的T25培养瓶，倒去包被液，取制备好的PBMC1.0×10⁷，接种到T25培养瓶内，加10mLCIK初始培养基，加入IFN-γ终浓度为1000U/mL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2)培养第1天，取出培养瓶，加IL-2使其终浓度为1000U/mL，加IL-12使其终浓度为2.5ng/mL，加IL-15使其终浓度为10ng/mL，加CD16使其终浓度为2μg/mL，将培养瓶重新置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3)培养第4天，将细胞全部转移到T75，加CIK培养基20mL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

4)培养第7天，得到CIK细胞，进行流式检测，结果如图11所示。

对比例1

胎盘血CIK培养细胞方法

1)培养第0天，取制备好的胎盘血单核细胞1.0×10⁷，接种到T25培养瓶(未经过包被)内，加10mLCIK初始培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中。

2)培养第1天，取出培养瓶，加入和IL-2，终浓度为1000U/mL；加入CD3单抗浓度500ng/mL，CD28抗体浓度500ng/mL；将培养瓶重新置于37℃、5％CO₂培养箱中。

其余步骤同实施例3中CIK细胞培养方法。

对比例2

CIK细胞培养基替换为：

1)CIK初始培养基：RPM1-1640培养基(含5％自体血浆)，IFN-γ1000U/mL。

2)CIK培养基：RPM1-1640培养基(含5％自体血浆)，IL-2浓度1000IUmL。

其余培养条件同实施例3中CIK细胞培养方法。

实验例

在收取实施例3及对比例1、2的CIK细胞后，进行细胞计数，并通过流式细胞术对表型进行鉴定。每组重复六次，结果如表2和表3所示。

表2细胞数目

组别	细胞数
		实施例3	6.2×10<sup>8</sup>
对比例1	5.9×10<sup>8</sup>
		对比例2	2.4×10<sup>8</sup>*

*p＜0.05，vs实施例3。

表3细胞表型鉴定结果

*p＜0.05，vs实施例3。

从上述结果可以看出，在本发明的培养体系下，RPM1-1640培养基并不能很好地促进细胞的增殖，但其对CIK的分化无明显影响；

而预先包被培养瓶，可以让后期接种的细胞完全接触到激活诱导因子，达到更好的激活诱导效果，因而能够得到更多的CD3+CD56+细胞；并通过控制分化时机，降低T-reg细胞的比例。

实施例4

实施例2收获的细胞，离心，去除培养基，得到负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞与实施例3制得的CIK细胞共同培养，得到负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞，具体步骤如下：

1)实施例3得到的CIK细胞与实施例2得到的负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞同时转移到T175中，加CIK培养基80mL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2)培养第3天，将细胞转移到细胞培养袋中加入400mLCIK培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。

3)培养第6天，加IL-2，50万IU。

4)培养第9天，收获细胞，得到负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞。

按照实施例1的方法提取肺肿瘤细胞A549的外泌体，按照实施例2和3的方法负载DC-CIK后，与A549细胞共培养，进行体外杀伤实验。结果如表4所示。

表4体外杀伤实验结果

通过CCK8检测，计算得到负载外泌体的CIK对肿瘤细胞的抑制率高于未负载的CIK13％以上。

需要说明的是，本发明未提及的培养条件均为37℃、5％CO₂，饱和湿度。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种负载肿瘤细胞外泌体的DC-CIK细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述CIK细胞通过以下方法制备：

培养65-75小时后，细胞转移到新的培养容器，在所述CIK培养基中培养，得到所述CIK细胞；

进一步地，所述培养液的组分包括VIVO培养基、自体血浆，所述自体血浆的含量为所述VIVO培养基体积的5％±0.5％；

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞通过以下方法制备：

(a)PBMC细胞贴壁培养，去除培养液，洗涤细胞；

(b)然后加入DC培养基，培养64-80h；

(d)将细胞悬浮后收集，得到细胞，将细胞转移到已采用自体血浆包被的培养容器中，加入DC成熟培养基，培养45-55h，得到负载肿瘤细胞外泌体的外周血DC细胞；

4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤(a)中，所述PBMC细胞贴壁培养具体步骤为：

以T175培养瓶计，接入PBMC细胞1×10⁸-1.5×10⁸个，同时加入AIM-V培养基50-60mL和自体血浆，所述自体血浆的体积为所述AIM-V培养基体积的0.1％，贴壁培养2-3h；

进一步地，步骤(a)中，采用AIM-V培养基洗涤细胞2-3次；

进一步地，步骤(b)中，以T175培养瓶计，所述DC培养基的添加体积为30-40mL；

进一步地，步骤(c)中，以T175培养瓶计，补加的DC培养基的体积为15-20mL，添加的肿瘤细胞外泌体的体积为80-150μL；

进一步地，步骤(d)中，将细胞悬浮后收集的步骤包括：

拍打培养瓶，使细胞悬浮，将细胞液收集；

收集的细胞液离心，去上清，得到所述细胞；

进一步地，收集的细胞液离心的参数为：1400-1500rpm，3-5min。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述肿瘤细胞外泌体通过以下方法制备：

培养肿瘤细胞至细胞长至85％±10％融合时进行传代；

6.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述传代按照扩培3-5倍的比例进行；

进一步地，肿瘤细胞的培养采用肿瘤细胞普通完全培养基进行，所述肿瘤细胞普通完全培养基的组分为：RPMI-1640培养液和FBS，所述FBS的添加量为所述RPMI-1640培养液体积的10％±2％。

7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，用PBS清洗2-3次；

8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述富含肿瘤细胞外泌体的培养液经分离得到所述肿瘤细胞外泌体的步骤如下：

得到的液体进行超速离心，弃上清，得到肿瘤细胞外泌体。

9.根据权利要求8所述的肿瘤细胞外泌体分离方法，其特征在于，所述低温离心为4±2℃下以2000-2200g离心；

进一步地，所述离心的时间为5-10min；

进一步地，过滤去除囊泡所用的滤网的孔径为0.22μm。

10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，得到的液体进行超速离心步骤中，离心的转速为100000-120000g，离心时间为2-3h；

进一步地，所述弃上清后还包括将离心容器管壁上的液体去除，离心容器底部的物质即为肿瘤细胞外泌体；