CN108251370A - 非细胞来源的多肽致敏的dc-cik细胞、其构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非细胞来源的多肽致敏的DC‑CIK细胞、其构建方法及应用。在一些较为典型的实施例中，所述构建方法包括：采集外周血，分离获得单个核细胞；分离单个核细胞，获得单核细胞和淋巴细胞；诱导单核细胞分化为成熟的多肽致敏的DC；淋巴细胞诱导分化成CIK细胞；DC与CIK细胞共培养获得多肽致敏的DC‑CIK细胞。本发明制备的DC‑CIK细胞不仅增殖活性高，而且可特异性杀伤肿瘤、杀瘤活性高，并且其制备工艺对设备要求低，工序简单，条件易控，适于大规模实施。

Description

非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞、其构建方法及应用
技术领域
本发明特别涉及一种非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞、其构建方法及应用，属于生物技术领域。
背景技术
细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)最初是指在正常人的外周血中存在的一类CD3+CD56+的T淋巴细胞，正常含量约为1％-5％。其在肝脏中也有分布，且分布最多，其次才为外周血，但在人的骨髓细胞中至今未发现该细胞的存在。1991年schmidt-wolf等首次报道体外在人外周血淋巴细胞中加入一些列细胞因子可诱导出大量的杀伤免疫活性细胞，即CIK细胞。CIK细胞表面同时表达CD3和CD56双阳性分子，所以兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和自然杀伤性细胞的非主要组织相容性复合物限制性杀瘤特点，它的主要效应细胞为CD3+CD56+、CD3+CD8+的异质性细胞群。通过对CIK细胞表面标志物研究发现，CIK细胞的主要效应细胞CD3+CD56+细胞群，主要来源于CD3+CD56-的T淋巴细胞，而不是CD3-CD56+的NK细胞。此外，CIK细胞的另一重要来源是CD4-CD8+T淋巴细胞群。CD4-CD8-T淋巴细胞经过长时间的细胞因子诱导培养后，也有56％的T细胞可同时表达CD3+CD56+，说明CD4-CD8-T淋巴细胞也是CIK细胞的来源。
CIK细胞具体的抗肿瘤机制至今仍未完全清楚，目前认为的机制可能为：①CIK细胞可被淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)有关识别结构激活，或可因表面CD3受体结合而激活，从而使胞浆毒性颗粒(颗粒酶或穿孔素)释放，杀伤肿瘤细胞。Ortado等用过氧化酶免疫染色法，发现CD3+CD56+CIK细胞能分泌穿孔蛋白(PFP)，该蛋白与靶细胞溶解有关。②CIK细胞可产生大量炎性细胞因子(如干扰素γ、TNF-α、IL-2等)，提高免疫效应细胞的细胞毒作用或调节肿瘤细胞对CIK的敏感性，所以对肿瘤细胞有直接杀伤作用或调节机体免疫系统间接杀伤肿瘤细胞。③CIK能够诱导肿瘤细胞产生凋亡，主要是CIK活化肿瘤细胞的凋亡基因，使FLIP、Bcl-2、Bcl-xL、DADI和survivin基因表达上调。CIK细胞表达FasL(II型跨膜糖蛋白)，通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(I型跨膜糖蛋白)结合，也可诱导肿瘤细跑调亡。
树突状细胞(DC)是由Steinman和Cohn于1973年首先在小鼠脾脏中发现，因其成熟时细胞表面伸出膜状或刺状突起而得名。DC的前体细胞为CD34+或CD14+细胞，其主要存在于人骨髓、脐血或外周血中。在体外可通过添加一系列细胞因子将前体细胞诱导成为成熟的DC。DC是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞，表面具有丰富的分子，如主要组织相容性复合物Ⅰ、Ⅱ类分子，共刺激分子CD80、CD86，淋巴细胞功能相关抗原1、3(LFA-1、LFA-3)，细胞间粘附分子1、3(ICAM-1、ICAM-3)等，这些分子能帮助抗原呈递能，有效的激活初始T细胞，引发机体产生抗肿瘤反应。
DC作为体内功能强大的专职抗原递呈细胞，在T细胞的活化、分化工程中发挥着重要作用。所以，将CIK细胞与DC联合起来治疗肿瘤，不仅有助于避免T细胞对部分肿瘤细胞的免疫无能现象，还能发挥协同抗肿瘤作用。具体的有以下生物学特性的变化：①CIK增殖活性更高；有研究表明，将DC与CIK共培养后产生的细胞与同源单独培养的CIK细胞相比，具有更高的增殖活性。并且共培养后有利于DC与CIK两者的成熟。②具有更高的肿瘤杀伤活性；DC、CIK共培养后，细胞毒性显著增强。Tong等用荧光原位杂交技术(FISH)检测发现，DC-CIK能更有效杀伤骨髓瘤细胞。③释放更大量的细胞因子；有研究报道，DC、CIK共培养后，其细胞上清液中IL-12、IFN-γ的分泌量明显比同条件下单独培养CIK的多。而抗原负载的DC可使CIK的增殖速度进一步提高，能够刺激CIK细胞进一步活化，具有更高的杀瘤活性。但是，目前体外致敏DC所使用的抗原主要是已知的肿瘤特异性抗原、肿瘤细胞株裂解物或者病人肿瘤标本裂解物。但是由于很多肿瘤缺乏特异性抗原或者特异性抗原尚不明确，限制了肿瘤抗原致敏的DC-CIK细胞的体内抗肿瘤效果。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞、其构建方法与应用，以克服现有技术中的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞的构建方法，其包括：
采集外周血，分离获得单个核细胞；
分离单个核细胞，获得单核细胞和淋巴细胞；
诱导单核细胞分化为成熟的多肽致敏的DC；
淋巴细胞诱导分化成CIK细胞；
DC与CIK共培养获得多肽致敏的DC-CIK细胞。
进一步的，所述构建方法可以包括：
(1)将单个核细胞培养后，分离获得贴壁细胞和悬浮细胞；
(2)采用包含细胞因子GM-CSF、IL-4的DC细胞培养试剂培养所述贴壁细胞，之后依次加入选定多肽和促成熟因子TNF-α并继续培养，收获多肽致敏的成熟DC细胞，所述选定多肽为靶向选定肿瘤细胞的多肽；
(3)采用包含细胞因子IFN-γ的CIK细胞培养试剂培养所述悬浮细胞，之后加入CD3单克隆抗体及IL-2并继续培养，之后补充细胞因子IL-2、IL-15并继续培养，收获CIK细胞；
(4)将所述多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞混合，并以包含细胞因子IL-2、IL-15的共培养试剂进行培养，获得非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞。
进一步的，前述步骤(1)包括：从外周血分离出单个核细胞进行培养，并分离获得贴壁细胞和悬浮细胞。
进一步的，前述步骤(2)包括：采用包含细胞因子GM-CSF、IL-4的DC细胞培养试剂培养所述贴壁细胞，每2～3天半量换液，并补充新的细胞因子GM-CSF、IL-4，培养的第3～5天加入选定多肽，第5～6天加入促成熟因子TNF-α，第7～8天收获多肽致敏的成熟DC细胞。
在一些较佳实施方案中，在步骤(2)中，细胞因子GM-CSF、IL-4于DC细胞培养体系内的终浓度分别为500～1000U/ml、500～1000U/ml。
在一些较佳实施方案中，在步骤(2)中，所述选定多肽于DC细胞培养体系内的终浓度为10～40μg/ml。
进一步的，前述选定多肽是针对人(或者动物)的某种肿瘤的靶向多肽。例如针对人肺癌细胞系A549的A1多肽可以是来自专利号ZL201110340669.1的发明专利中所述的靶向多肽，其诱导DC成熟的浓度为3～50μg/ml。
在一些较佳实施方案中，在步骤(2)中，所述促成熟因子TNF-α于DC细胞培养体系内的终浓度为500～1000U/ml。
进一步的，前述步骤(3)包括：采用包含细胞因子IFN-γ的CIK细胞培养试剂培养所述悬浮细胞，24h之后加入CD3单克隆抗体及IL-2并继续培养，每2～3天半量换液，之后补充细胞因子IL-2、IL-15并继续培养，培养到第7～8天后收获CIK细胞。
在一些较佳实施方案中，在步骤(3)中，所述细胞因子IFN-γ于CIK细胞培养体系内的终浓度为500～1000U/ml。
在一些较佳实施方案中，在步骤(3)中，所述CD3单克隆抗体终浓度为50～100ng/ml。
在一些较佳实施方案中，在步骤(3)中，所述细胞因子IL-2、IL-15于CIK细胞培养体系内的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml。
进一步的，前述步骤(4)包括：将所述多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞混合，并以包含细胞因子IL-2、IL-15的共培养试剂进行培养7～8天，获得非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞。
在一些较佳实施方案中，在步骤(4)中，所述多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞的数量比为1：(5～10)。
在一些较佳实施方案中，在步骤(4)中，所述细胞因子IL-2、IL-15于DC细胞与CIK细胞共培养体系内的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml。
在一些较为具体的实施方案中，所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞的构建方法包括：
从来源于健康人体的外周血中分离出单个核细胞；
对分离获得的单个核细胞进行培养，并收集贴壁细胞和悬浮细胞；
向所述贴壁细胞加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，并加入细胞因子GM-CSF、IL-4，使GM-CSF、IL-4的终浓度分别为500～1000U/ml、500～1000U/ml，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，每2～3天半量换液，补充新的细胞因子GM-CSF、IL-4，培养的第3～5天加入选定多肽，使选定多肽的终浓度为10～40μg/ml，培养的第6～7天加入促成熟因子TNF-α，使TNF-α的终浓度为500～1000U/ml，培养的第7～8天收获多肽致敏的成熟DC细胞；
将所述悬浮细胞接种入新鲜的RPMI-1640完全培养基，并加入IFN-γ，使IFN-γ的终浓度为500～1000U/ml，培养24h后，加入CD3单克隆抗体和IL-2，并使CD3单克隆抗体、IL-2的终浓度分别为50～100ng/ml、300～1000U/ml，继续培养，每2～3天半量换液，补充细胞因子IL-2、IL-15，使细胞因子IL-2、IL-15的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml，培养到第7～8天后收获CIK细胞；
将所述的多肽致敏的成熟DC细胞与所述的CIK细胞共培养，使多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞的数量比为1：(5～10)，并添加细胞因子IL-2、IL-15，使IL-2、IL-15的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml，继续培养7～8天后收获成熟的多肽致敏的DC-CIK细胞。
在一些更为具体的实施方案中，所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞的构建方法包括：
(1)外周血单个核细胞的分离：抽取健康志愿者的外周血，利用Ficoll密度梯度离心使血液分层获得白膜层(单个核细胞层)，小心地吸取白膜层到新的离心管，加入大于白膜层体积的PBS溶液，移液管轻轻吹打几次，离心，弃上清，重复PBS清洗2～3次，采用含有1％双抗、10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为1～4×106个/ml。
(2)DC细胞的分离培养：将分离获得的单个核细胞接种于12孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2～3小时后，收集悬浮细胞，孔板中重新加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，并加入细胞因子GM-CSF、IL-4，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。每2～3天半量换液，补充新的细胞因子。培养的第3～5天加入多肽，第6～7天加入促成熟因子TNF-α，第7～8天收获多肽致敏的成熟DC细胞。
(3)CIK细胞的体外培养：将DC培养过程中收集的悬浮细胞离心后用RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1～4×106个/ml，接种于25cm2培养瓶中，并加入IFN-γ，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，24小时后，加入CD3单克隆抗体及IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。每2～3天半量换液，补充细胞因子IL-2、IL-15。培养到第7～8天后收获CIK细胞。
(4)CIK与DC细胞的共培养：将收获的成熟多肽致敏DC细胞与第7～8天收获的CIK细胞共培养，并添加细胞因子IL-2、IL-15，置于37℃、5％CO2培养箱中培养7～8天后收获多肽致敏的DC-CIK细胞。
进一步的，前述步骤2具体包括：将分离获得的单个核细胞接种于12孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱中孵育2～3小时后，收集悬浮细胞，孔板中重新加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，并加入细胞因子GM-CSF、IL-4，使其终浓度分别为500～1000U/ml、500～1000U/ml，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。每2～3天半量换液，补充新的细胞因子。培养的第3～5天加入终浓度为10～40μg/ml的多肽。第6～7天加入促成熟因子TNF-α，使其终浓度为500～1000U/ml。第7～8天收获多肽致敏的成熟DC细胞。
进一步的，前述步骤(3)具体包括：将DC培养过程中收集的悬浮细胞离心后用RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1～4×106个/ml，接种于25cm2培养瓶中，并加入终浓度为500～1000U/ml的IFN-γ，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，24小时后，加入终浓度为50～100ng/ml的CD3单克隆抗体及终浓度为300～1000U/ml的IL-2，置于37℃、5％CO2的培养箱中继续培养，每2～3天半量换液，补充终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml的细胞因子IL-2、IL-15。培养到第7～8天后收获CIK细胞。
进一步的，前述步骤(4)具体包括：将收获的成熟多肽致敏DC与第7～8天收获的CIK共培养，所加入的致敏成熟DC与CIK共培养数量比为DC：CIK＝1：(5～10)，并添加终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml的细胞因子IL-2、IL-15，置于37℃、5％CO2培养箱中培养7～8天后收获多肽致敏的DC-CIK细胞。
本发明实施例还提供了由前述任一种方法构建的非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞。
本发明实施例还提供了所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞的用途。
例如，所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞于制备肿瘤细胞杀伤制剂中的用途。或者，所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞于制备细胞治疗组合物中的用途。或者，所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞于制备抗肿瘤药物组合物中的用途。
例如，在一些较为具体的应用方案中，可以利用所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞对结合该多肽的肿瘤细胞进行特异杀伤，具体包括如下步骤：
a)靶细胞：选取生长状态良好处于对数生长期的可与该多肽特异结合的肿瘤细胞，胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔板，100μl/孔，每个实验组设置3个复孔，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养4～5h至靶细胞贴壁。接种效应细胞前靶细胞孔每孔加入该多肽，与靶细胞孵育后弃去含有该多肽的培养基，并小心地用PBS缓冲液清洗2次，弃去，加入新的培养基。
b)效应细胞：实验组选取培养至第11～19天的多肽致敏的DC-CIK细胞，对照组选取培养至同天的CIK细胞，调整细胞密度为6.7×105个/ml，弃去96孔板中靶细胞的原有培养基，接种效应细胞，150μl/孔，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养24h。
c)24h后，每孔加入新鲜的RPMI-1640完全培养基50μl，以及20μl的CCK-8溶液，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养60～80min，然后用酶标仪在450nm波长处测定溶液OD值。根据公式计算效应细胞对肿瘤细胞的杀伤率。
进一步的，前述步骤a)包括：选取生长状态良好处于对数生长期的与该多肽结合的肿瘤细胞，胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔板，100μl/孔，每个实验组设置3个复孔，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养4～5h至靶细胞贴壁。接种效应细胞前靶细胞孔每孔加入5～10μg该多肽，与靶细胞孵育40min后弃去含有该多肽的培养基，并小心地用PBS缓冲液清洗2次，弃去，加入新的培养基。
与现有技术相比，本发明提供的非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞不仅增殖活性高，而且可特异性杀伤肿瘤、杀瘤活性高，同时其制备方法设备要求低，工序简单，条件易控，适于批量化生产。
附图说明
图1是本发明一典型实施方案中一种非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞的构建工艺流程示意图。
图2是本发明实施例1-实施例2中培养至第7天DC细胞，A1-DC细胞以及HCBP1-DC细胞的表型表达情况图。
图3是本发明实施例1-实施例2中CIK细胞与DC细胞，A1-DC细胞以及HCBP1-DC细胞共培养7天后(即第14天)的表型表达情况图。
图4a是本发明实施例1中效应细胞CIK及A1-DC-CIK对A549细胞的杀伤作用图。
图4b是本发明实施例1中效应细胞CIK及HCBP1-DC-CIK对H460克隆球细胞的杀伤作用图。
具体实施方式
鉴于现有技术中的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案。如下将结合附图及实施例对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。
实施例1：A1-DC-CIK细胞的培养(可参阅图1所示)
1、单个核细胞的分离
1)抽取健康志愿者外周血20ml，肝素抗凝，400～600g室温条件下离心20～40min。
2)离心后，用移液枪小心吸取上层液体，离包含单个核细胞的白膜层约0.5cm时停止，弃上层液。
3)用移液枪小心转移白膜层到一个新的离心管，向离心管加入适量的PBS，且加入的液体量大于白膜层液体量。200～300g离心5～10min。
4)吸弃上清液，用5～10ml PBS重悬细胞，用移液枪轻轻的吹吸清洗，200～300g离心5～10min。
5)重复4)，弃上清，用含有1％双抗、10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为1～4×106/ml。
2、DC细胞的分离培养
1)将分离获得的单个核细胞，按1～4×106/ml接种于12孔板中的四个孔，标为A、B、C、D，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
2)1～3h后，轻轻摇晃12孔板，收集未贴壁的细胞，获得贴壁细胞。
3)用PBS清洗贴壁细胞两次，加入含有500～1000U/ml GM-CSF、500～1000U/mlIL-4的RPMI-1640完全培养基，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
4)每隔2～3天，培养基半量换液并补充新鲜的细胞因子GM-CSF和IL-4。
5)第4天，向12孔板的A、B孔中加入A1多肽10～40μg/ml。其中，A1多肽是通过细菌展示技术筛选出的一种特异性结合肿瘤细胞系A549的13肽，具有分子量小、免疫反应弱，更易穿透细胞膜等特点。
6)第6天，向12孔板的B、D孔中加入500～1000U/ml的TNF-α因子以促进DC细胞的成熟分化。
7)第7天，收获成熟各组DC细胞，并取样用于流式细胞仪检测细胞表型。
结果如图2所示，多肽致敏的A1-DC组，其共刺激分子CD80+表达为72％～78％，未致敏DC组为56％～62％，A1-DC组与DC组相比，共刺激分子CD80+表达明显增加。与文献中报道的，抗原致敏的DC细胞，其共刺激分子表达增加相一致，证明A1多肽可作为抗原致敏DC细胞。
3、CIK细胞的分离培养
1)取DC培养中收集的未贴壁细胞，用RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1～4×106个/ml，接种于25cm2培养瓶中，同时加入终浓度为500～1000U/ml的IFN-γ，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
2)24h后，向培养瓶中添加CD3单克隆抗体及IL-2细胞因子，使其终浓度分别为50～100ng/ml和300～1000U/ml，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
3)每隔2～3天半量换液，补充新鲜的细胞因子IL-2，以及添加新的细胞因子IL-15，使终浓度为50～100ng/ml，并调整细胞密度为1～4×106/ml。
4)细胞培养到第14天后收获。
5)第14天取适量细胞用于流式细胞仪检测细胞表型。
4、A1-DC与CIK细胞的共培养
将收获的成熟A1-DC细胞与第7天的CIK细胞按数量比A1-DC：CIK＝1：(5～10)将A1-DC与CIK共同培养，每两天半量换液并补充新鲜的IL-2、IL-15因子，使其终浓度分别为500～1000U/ml、50～100ng/ml，共培养至第14天，收获A1-DC-CIK细胞，并取适量细胞用于流式细胞仪检测细胞表型。
结果如图3所示，单独培养的CIK细胞，其CD3+CD8+的表型表达为85％～89％，CD3+CD56+的表型表达为14％～16％，A1-DC-CIK组CD3+CD8+为82％～85％，CD3+CD56+为23％～26％，A1-DC-CIK的主要效应细胞群CD3+CD56+相对于单独培养的CIK的主要效应细胞群表达率明显提高。证明DC可将A1多肽呈递给CIK细胞，提高CIK的分化，增强CIK的杀伤活性。
5、A1-DC-CIK对肿瘤的特异杀伤作用
应用CCK-8法检测A1-DC-CIK细胞对肺癌细胞系A549细胞的杀伤作用。
1)靶细胞：选取生长状态良好处于对数生长期的肺癌细胞系A549，胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔板，100μl/孔，每个实验组设置3个复孔，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养4～5h至靶细胞贴壁。接种效应细胞前靶细胞孔每孔加入5～10μg A1多肽，与靶细胞孵育40min后弃去含有A1多肽的培养基，并小心地用PBS缓冲液清洗2次，弃去，加入新的培养基。
2)效应细胞：实验组选取培养至第14天的A1-DC-CIK细胞，对照组选取培养至第14天的CIK细胞，调整细胞密度为6.7×105个/ml，弃去96孔板中靶细胞的原有培养基，接种效应细胞，150μl/孔，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养24h。
3)24h后，每孔加入新鲜的RPMI-1640完全培养基50μl，以及20μl的CCK-8溶液，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养60～80min，然后用酶标仪在450nm波长处测定溶液OD值。根据公式计算效应细胞对肿瘤细胞的杀伤率。杀伤率(％)＝1-[(实验组OD值-效应对照组OD值)/(靶细胞对照组OD值-空白组OD值)]×100％。
结果如图4a所示，A1-DC-CIK细胞对A549细胞(已与A1多肽结合)的杀伤率为65％～68％，CIK对A549细胞(已与A1多肽结合)的杀伤率为37％～46％，A1-DC-CIK细胞对A549细胞的杀伤作用明显强于CIK对A549细胞的杀伤作用。
实施例2：HCBP1-DC-CIK细胞的培养(参阅图1所示)
1、单个核细胞的分离
1)抽取健康志愿者外周血20ml，肝素抗凝，400～600g室温条件下离心20～40min。
2)离心后，用移液枪小心吸取上层液体，离包含单个核细胞的白膜层约0.5cm时停止，弃上层液。
3)用移液枪小心转移白膜层到一个新的离心管，向离心管加入适量的PBS，且加入的液体量大于白膜层液体量。200～300g离心5～10min。
4)吸弃上清液，用5～10ml PBS重悬细胞，用移液枪轻轻的吹吸清洗，200～300g离心5～10min。
5)重复4)，弃上清，用含有1％双抗、10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞密度为1～4×106/ml。
2、DC细胞的分离培养
1)将分离获得的单个核细胞，按1～4×106/ml接种于12孔板中的四个孔，标为A、B、C、D，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
2)1～3h后，轻轻摇晃12孔板，收集未贴壁的细胞，获得贴壁细胞。
3)用PBS清洗贴壁细胞两次，加入含有500～1000U/ml GM-CSF、500～1000U/mlIL-4的RPMI-1640完全培养基，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
4)每隔2～3天，培养基半量换液并补充新鲜的细胞因子GM-CSF和IL-4。
5)第4天，向12孔板的A、B孔中加入HCBP1多肽10～40μg/ml。其中，HCBP1多肽是通过细菌展示技术筛选出的一种能够特异性结合非小细胞肺癌H460细胞系中的肺癌干细胞，而不与正常的肺细胞、其他肺癌细胞及正常干细胞结合的多肽。
6)第6天，向12孔板的B、D孔中加入500～1000U/ml的TNF-α因子以促进DC细胞的成熟分化。
7)第7天，收获成熟各组DC细胞，并取样用于流式细胞仪检测细胞表型。
结果如图2所示，多肽致敏的HCBP1-DC组，与未加入多肽的DC组相比，共刺激分子CD80+表达明显增加(HCBP1-DC组为68％～70％，未致敏DC组为57％～60％)。与文献中报道的，抗原致敏的DC细胞，其共刺激分子表达增加相一致，证明HCBP1多肽可作为抗原致敏DC细胞。
3、CIK细胞的分离培养
1)取DC培养中收集的未贴壁细胞，用RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1～4×106个/ml，接种于25cm2培养瓶中，同时加入终浓度为500～1000U/ml的IFN-γ，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
2)24h后，向培养瓶中添加CD3单克隆抗体及IL-2细胞因子，使其终浓度分别为50～100ng/ml和300～1000U/ml，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养。
3)每隔2～3天半量换液，补充新鲜的细胞因子IL-2，以及添加新的细胞因子IL-15，使终浓度为50～100ng/ml，并调整细胞密度为1～4×106/ml。
4)细胞培养到第14天后收获。
5)第14天取适量细胞用于流式细胞仪检测细胞表型。
4、HCBP1-DC与CIK细胞的共培养
将收获的成熟HCBP1-DC细胞与第7天的CIK细胞按数量比HCBP1-DC：CIK＝1：(5～10)将HCBP1-DC与CIK共同培养，每两天半量换液并补充新鲜的IL-2、IL-15因子，使其终浓度分别为500～1000U/ml、50～100ng/ml，共培养至第14天，收获HCBP1-DC-CIK细胞，并取适量细胞用于流式细胞仪检测细胞表型。
结果如图3所示，单独培养的CIK细胞，其CD3+CD8+的表型表达为85％～89％，CD3+CD56+的表型表达为14.5％～16.5％，HCBP1-DC-CIK组CD3+CD8+为82％～85％，CD3+CD56+为20.5％～23.5％，HCBP1-DC-CIK的主要效应细胞群CD3+CD56+相对于单独培养的CIK的主要效应细胞群表达率明显提高。证明DC可将HCBP1多肽呈递给CIK细胞，提高CIK的分化，增强CIK的杀伤活性。
5、HCBP1-DC-CIK对肿瘤的特异杀伤作用
应用CCK-8法检测HCBP1-DC-CIK细胞对肺癌干细胞H460克隆球的杀伤作用。
1)靶细胞：选取生长状态良好处于对数生长期的肺癌细胞H460克隆球细胞，胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种于96孔板，100μl/孔，每个实验组设置3个复孔，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养4～5h。接种效应细胞前靶细胞孔每孔加入5～10μg HCBP1多肽，与靶细胞孵育40min后离心弃去含有HCBP1多肽的培养基，并小心地用PBS缓冲液清洗2次，离心弃去，加入新的培养基。
2)效应细胞：实验组选取培养至第14天的HCBP1-DC-CIK细胞，对照组选取培养至第14天的CIK细胞，调整细胞密度为6.7×105个/ml，弃去96孔板中原有培养基，接种效应细胞，150μl/孔，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养24h。
3)24h后，每孔加入新鲜的RPMI-1640完全培养基50μl，以及20μl的CCK-8溶液，置于37℃，CO2浓度为5％的饱和湿度环境的培养箱中培养60～80min，然后用酶标仪在450nm波长处测定溶液OD值。根据公式计算效应细胞对肿瘤细胞的杀伤率。杀伤率(％)＝1-[(实验组OD值-效应对照组OD值)/(靶细胞对照组OD值-空白组OD值)]×100％。
结果如图4b所示，HCBP1-DC-CIK细胞对H460克隆球细胞(已与HCBP1多肽结合)的杀伤率为67％～73％，CIK对H460克隆球细胞(已与HCBP1多肽结合)的杀伤率为10％～37％，HCBP1-DC-CIK细胞对H460克隆球的杀伤作用明显强于CIK对H460克隆球细胞的杀伤作用。
应当理解，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (16)

1.一种非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞的构建方法，其特征在于包括：
(1)将单个核细胞培养后，分离获得贴壁细胞及悬浮细胞；
(2)采用包含细胞因子GM-CSF、IL-4的DC细胞培养试剂培养所述贴壁细胞，之后依次加入选定多肽和促成熟因子TNF-α并继续培养，收获多肽致敏的成熟DC细胞，所述选定多肽为靶向选定肿瘤细胞的多肽；
(3)采用包含细胞因子IFN-γ的CIK细胞培养试剂培养所述悬浮细胞，之后加入CD3单克隆抗体及IL-2并继续培养，之后补充细胞因子IL-2、IL-15并继续培养，收获CIK细胞；
(4)将所述多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞混合，并以包含细胞因子IL-2、IL-15的共培养试剂进行培养，获得非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括：从外周血分离出单个核细胞进行培养，并分离获得贴壁细胞和悬浮细胞。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)包括：采用包含细胞因子GM-CSF、IL-4的DC细胞培养试剂培养所述贴壁细胞，每2～3天半量换液，并补充新的细胞因子GM-CSF、IL-4，培养的第3～5天加入选定多肽，第5～6天加入促成熟因子TNF-α，第7～8天收获多肽致敏的成熟DC细胞。
4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于：在步骤(2)中，细胞因子GM-CSF、IL-4于DC细胞培养体系内的终浓度分别为500～1000U/ml、500～1000U/ml。
5.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述选定多肽于DC细胞培养体系内的终浓度为10～40μg/ml。
6.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述促成熟因子TNF-α于DC细胞培养体系内的终浓度为500～1000U/ml。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)包括：采用包含细胞因子IFN-γ的CIK细胞培养试剂培养所述悬浮细胞，24h之后加入CD3单克隆抗体及IL-2并继续培养，每2～3天半量换液，之后补充细胞因子IL-2、IL-15并继续培养，培养到第7～8天后收获CIK细胞。
8.根据权利要求1或7所述的构建方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述细胞因子IFN-γ于CIK细胞培养体系内的终浓度为500～1000U/ml。
9.根据权利要求1或7所述的构建方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述CD3单克隆抗体终浓度为50～100ng/ml。
10.根据权利要求1或7所述的构建方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述细胞因子IL-2、IL-15于CIK细胞培养体系内的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml。
11.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)包括：将所述多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞混合，并以包含细胞因子IL-2、IL-15的共培养试剂进行培养7～8天，获得非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞。
12.根据权利要求1或11所述的构建方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞的数量比为1：(5～10)。
13.根据权利要求1或11所述的构建方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述细胞因子IL-2、IL-15于DC细胞与CIK细胞共培养体系内的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml。
14.一种非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞的构建方法，其特征在于包括：
从来源于健康人体的外周血中分离出单个核细胞；
对分离获得的单个核细胞进行培养，并收集贴壁细胞和悬浮细胞；
向所述贴壁细胞加入新鲜的RPMI-1640完全培养基，并加入细胞因子GM-CSF、IL-4，使GM-CSF、IL-4的终浓度分别为500～1000U/ml、500～1000U/ml，置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养，每2～3天半量换液，补充新的细胞因子GM-CSF、IL-4，培养的第3～5天加入选定多肽，使选定多肽的终浓度为10～40μg/ml，培养的第5～6天加入促成熟因子TNF-α，使TNF-α的终浓度为500～1000U/ml，培养的第7～8天收获多肽致敏的成熟DC细胞；
将所述悬浮细胞接种入新鲜的RPMI-1640完全培养基，并加入IFN-γ，使IFN-γ的终浓度为500～1000U/ml，培养24h后，加入CD3单克隆抗体和IL-2，并使CD3单克隆抗体、IL-2的终浓度分别为50～100ng/ml、300～1000U/ml，继续培养，每2～3天半量换液，补充细胞因子IL-2、IL-15，使细胞因子IL-2、IL-15的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml，培养到第7～8天后收获CIK细胞；
将所述的多肽致敏的成熟DC细胞与所述的CIK细胞共培养，使多肽致敏的成熟DC细胞与CIK细胞的数量比为1：(5～10)，并添加细胞因子IL-2、IL-15，使IL-2、IL-15的终浓度分别为300～1000U/ml、50～100ng/ml，继续培养7～8天后收获成熟的多肽致敏的DC-CIK细胞。
15.由权利要求1-14中任一项所述方法构建的非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞。
16.权利要求15所述非细胞来源的多肽致敏的DC-CIK细胞于制备肿瘤细胞杀伤制剂、细胞治疗组合物或抗肿瘤药物组合物中的用途。
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