CN115040542B

CN115040542B - 外泌体与视黄醛的混合物作为制备治疗皮肤橘皮组织药物上的应用

Info

Publication number: CN115040542B
Application number: CN202210971106.0A
Authority: CN
Inventors: 牟晓东; 甘元善; 戴晓伟; 李栋
Original assignee: Shandong Zhuodong Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Zhuodong Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-08-15
Filing date: 2022-08-15
Publication date: 2022-11-18
Anticipated expiration: 2042-08-15
Also published as: CN115040542A

Abstract

本发明涉及外泌体囊泡的应用领域，具体涉及外泌体与视黄醛的混合物作为制备治疗皮肤橘皮组织药物上的应用。本发明利用肌肉干细胞外泌体让来自肌肉干细胞的活性物质影响到真皮层和皮下组织的肌肉细胞的健康，提升肌肉纤维的结构强度和功能，从而直接有效地缓解橘皮组织产生的主要问题。同时结合视黄醛的方法也可有效提升皮肤内各种细胞的活力和功能。

Description

外泌体与视黄醛的混合物作为制备治疗皮肤橘皮组织药物上的应用

技术领域

本发明涉及外泌体的应用领域，具体涉及外泌体与视黄醛的混合物作为制备治疗皮肤橘皮组织的药物上的应用。

背景技术

皮肤作为一个器官其结构包括表皮层、真皮层、和皮下组织层（主要是脂肪层）。皮肤内还有许多毛发、皮脂腺、小汗腺、大汗腺、血管、肌肉及神经等。皮下组织层的内部通常有一层由平滑肌组成的肌肉筋膜（肌膜），是皮肤能量的储备层。平滑肌并不控制主动运动，而骨骼肌肉的强大再生能力并没有被平滑肌肉所复制。平滑肌的修复较缓慢和困难并且容易产生纤维化，像是皮肤组织损伤后的疤痕的产生和皮下组织层中平滑肌层肌膜的组织纤维化有直接关联。皮下肌膜的萎缩松弛已被研究发现会导致皮肤皱纹的产生，而进一步的研究证明，皮下肌膜的异常也会导致橘皮组织的产生。橘皮组织（cellulite）是皮肤上出现的一种出现凹陷的橘皮现象，又被称之为是蜂窝组织。这是一种常见的主要好发于青春期后女性的皮肤状态，其成因比较复杂。一般出現在大腿根部、手臂内侧和屁股或别的人体脂肪沉积很大的地区，但橘皮组织并不是一种疾病或是肥胖体质特有的问题。橘皮组织会影响大部分青春发育期后的女士（约85%~95%）。因其影响美观，如何治疗和缓解皮肤橘皮组织越来越受到女性人群和皮肤科医师的关注。现有的与治疗橘皮组织相关的皮肤修复和保护产品和方法主要是针对表皮细胞的保护和滋养，而对真皮层和皮下肌肉细胞没有作用效果；而实际上皮下肌肉组织的萎缩和功能失常是导致橘皮组织产生的主要原因，因此现有的方法并不能高效地阻止和修复橘皮组织。

传统观点认为，橘皮组织是由皮肤表层正下方不匀称的脂肪团堆积造成的，人体脂肪堆积会造成凹痕的皱纹。但是橘皮组织并不是仅由人体脂肪原因造成，即便最瘦的女士也常常身患橘皮纹。它事实上是由人体脂肪和肌肉结缔组织的相互功效造成的。尤其是最近的研究揭示，皮肤相连的肌肉层的萎缩和功能退化是导致脂肪组织位移和橘皮组织产生的主要原因。体育锻炼可以有限地缓解橘皮组织的发生，然而体育锻炼锻炼的是骨骼肌，而并不能直接锻炼到皮下肌肉层（平滑肌）。此外，虽然目前皮肤橘皮组织的所谓先进治疗方式多种多样，包括各种外用制剂药膏的治疗，基于能量或物理按摩的治疗，电刺激或声波疗法等等，但由于缺乏准确的对皮下肌肉层的针对性，这些治疗方法疗效果非常有限甚至是无效。

肌肉组织占人体很大比重，而体育运动和肌肉的锻炼可以直接或间接地提升人体整体健康状态。而且因为从健康肌肉细胞分泌大量良性因子，肌肉组织会直接影响体内的其他组织，比如骨骼、血管和皮肤等等。健康肌纤维细胞及肌肉干细胞所分泌的活性因子会直接影响着皮肤细胞的生长微环境和功能。类似于运动后肌纤维细胞生长因子 (MGF) 对肌肉再生修复的直接功效，肌纤维细胞生长因子（MGF）也可以直接作用于皮肤细胞，促进皮肤血管新生，使皮肤内萎缩、堵塞或消失的毛细血管内皮细胞新生，血管网增多，血流增加，皮肤营养充足，从而使皮肤充满活力；MGF也可以调节皮肤基质中胶原酶、透明质酸的含量和活性，平衡水分和电解质代谢，改善萎缩细胞的缺水状态，使皮肤滋润光泽保持弹性。因此肌纤维细胞生长因子（MGF）具有修复表皮、抗衰老、平复皱纹之功效。人体中肌纤维细胞生长因子 (MGF) 的含量多少直接决定着皮肤的年轻程度。而肌纤维细胞生长因子(MGF)也是是肌肉干细胞外泌体所携带的成分之一。

除了皮下肌肉层，肌肉细胞也存在于皮肤真皮层中。人体皮肤存在大量的毛发，而立毛肌（ Arrector pili muscle）则伴随着毛发的存在而普遍存在。立毛肌是可以控制毛发的平滑肌，一端连接毛囊中侧部位的结缔组织，另一端与真皮的乳头层直接相连。血管壁平滑肌细胞或立毛肌细胞的退化将对真皮内细胞微环境造成负面的影响，导致皮肤组织的加速衰老。此外，人体的皮肤组织层的内部紧贴的基本都是骨骼肌肌肉组织，而与皮肤组织层直接接触最多的组织就是骨骼肌肌肉组织。因此，肌肉组织的健康其实和皮肤组织的健康紧密相关。常见例子是，随着年龄的增长，面部皮肤皱纹会随着面部肌肉组织的萎缩和松弛而增长。而对面部肌肉组织功能和健康的提升会明显减少面部皱纹的产生。

乙醛脱氢酶（ALDH）是醛脱氢酶的一种，在多种细胞谱系干细胞和祖细胞中高效表达，包括造血细胞、乳腺细胞、内皮细胞、间充质细胞和神经细胞等。ALDH已经被广泛应用为一种干细胞的标记性功能蛋白。ALDH在人体内催化有毒性的乙醛转化为无毒性的羧酸，从而来保持细胞内稳态，这对于干细胞的存活和自我更新尤为重要。研究也发现，肌肉干细胞中ALDH活性更高的那些细胞也具有更高的干细胞活性和功能，例如更强的抗氧化抗炎症因子能力和分化为肌肉纤维的能力等。因此，高活性肌肉干细胞可以通过运用流式细胞仪来筛选ALDH高表达的细胞来获得。ALDH的主要功能也包括将维生素A(retinol)和视黄醛(retinal)等通过氧化转化为视黄酸。而视黄酸(retinoic acid)能够发挥提高皮肤细胞分泌的胶原蛋白产量和质量的作用，正是目前广泛用于去除皮肤皱纹的外用制剂产品中常见的一种成分。然而，相比较于视黄酸(retinoic acid)对皮肤细胞的直接使用的效果，视黄醛的使用因为需要ALDH的激活而具有效果更柔和更持久等优点。

研究表明干细胞外泌体可以作为细胞治疗的有利工具在组织损伤性疾病中发挥重要作用。肌肉干细胞也可通过分泌的外泌体（exosome）来影响和调节周围其他的细胞。外泌体是近年来发现的细胞间信号通讯的重要途径，它是一种由胞内质膜性细胞器内质网和高尔基复合体主动合成并分泌到细胞外环境的直径在30-120nm左右的微型质膜囊体结构，是除细胞可溶性细胞因子外的重要旁分泌形式，exosome的特征主要有：（1）直径为30-100nm；（2）具有来源细胞的胞质和脂质膜成分；（3）含有来源细胞特异性蛋白以及相关蛋白CD63，CD9，CD81等。（4）成分主要包括：microRNA、mRNA和蛋白等生物活性物质，具有减少细胞凋亡、减轻炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能。肌肉干细胞也可分泌大量具有修复功能的外泌囊泡体 (exosome)，其中包含各种蛋白，多肽，核酸和其他活性因子。肌肉干细胞分泌的exosome具有许多优势：（1）exosome通过细胞内吞作用摄入细胞，可以保证外泌体内的一些生物大分子被细胞膜通道阻挡不被吸收的问题，具有生物活性高，作用效率高的优点；（2）exosome可以在-80 ℃与-196 ℃环境中长期稳定保存，能够在细胞的冻存过程中进行持续性的保护作用，不易被破坏；（3）易于掌握临床应用时间，亦易于控制使用浓度、剂量及途径；（4）普遍耐受性良好，由于其体积小避免了强烈的免疫排斥等并发症。间充质干细胞MSCs等类型干细胞来源的exosome已被广泛研究和应用。然而肌肉干细胞来源的外泌体相关研究和应用尚且很少。在衰老肌肉组织中，肌肉干细胞数量经常快速衰竭，其生长分化功能和抗氧化能力等干细胞特性大幅度减弱，因此，从衰老个体提取的肌肉干细胞难以进行培养扩增和直接进行组织修复等方面的临床应用。

发明内容

现有的与治疗橘皮组织相关的皮肤修复和保护产品和方法主要是针对表皮细胞的保护和滋养，而对真皮层和皮下肌肉细胞没有作用效果，从而并不能真正解决橘皮组织产生的真正原因。本发明利用肌肉干细胞外泌体让来自肌肉干细胞的活性物质影响到真皮层和皮下组织的肌肉细胞的健康，提升肌肉纤维的结构强度和功能，从而直接有效地缓解橘皮组织产生的主要问题。同时，外泌体结合视黄醛的方法也可有效提升皮肤内各种细胞的活力和功能。

为实现上述目的，本发明公开了一种利用肌肉干细胞外泌体和视黄醛混合物来减少皮肤橘皮组织产生的应用方法，具体方案如下：

外泌体与视黄醛的混合物作为制备治疗皮肤橘皮组织药物上的应用。

优选地，所述的外泌体为高活性肌肉干细胞的外泌体。

优选地，所述的高活性肌肉干细胞的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

（1）筛选获得高功能活性的肌肉干细胞：提取并培养来自健康年轻个体的肌肉干细胞，运用流式细胞仪对有较高的ALDH1酶活性的细胞进行筛选，并进行常规2D表面的培养；

（2）获得高活性肌肉干细胞的外泌体：将处于对数生长期的第4到6代的ALDH1高表达肌肉干细胞导入传代培养3D培养系统进行传代培养，连续培养72h后低温超高速离心获得外泌体。

优选地，高活性肌肉干细胞的外泌体与视黄醛的混合物的制备过程为：提取获得外泌体重新悬浮溶解于PBS 中，加入视黄醛，在 37℃ 摇动温育1-2h；

所述的视黄醛与外泌体的质量比为：1:4-6。

优选地，所述的视黄醛为全反式视黄醛。

本发明的肌肉干细胞外泌体作为一种来自年轻个体的ALDH1高活性的肌肉干细胞的细胞来源物质，富含对细胞抗凋亡、抗炎症、抗氧化和抗衰老等有益的微小RNA（miRNA）、生长因子和热休克蛋白等细胞因子，而且肌肉干细胞外泌体富集液具有非常弱的免疫原性，异体细胞对其无任何排斥作用，可以安全有效的对衰老个体的肌肉干细胞起到保护和功能提升作用；外泌体可以迅速的与衰老个体的肌肉干细胞膜融合，通过胞吞或胞饮方式将微小RNA、生长因子和热休克蛋白等送入靶细胞，起效迅速；肌肉干细胞外泌体区别于化学合成药物，可以被细胞自行吸收降解，对细胞无任何损伤。同时视黄醛可由ALDH1转化为视黄酸，从而发挥对肌肉和皮肤各种细胞的良性作用。针对肌肉细胞的治疗可以改善皮下肌肉细胞和纤维的结构和功能，从而有效缓解橘皮组织的产生发展。

本发明的有益效果：

本发明提供一种利用高活性肌肉干细胞外泌体和视黄醛组合物产品对皮下肌肉细胞和纤维进行处理而提升其活性和功能的方法。本发明使用的组合物通过提升皮下萎缩肌肉纤维的结构强度和功能，达到良好的抑制橘皮组织产生的效果。本发明制备的产品与肌肉干细胞无直接相关，无任何活细胞成分，便于运输和储存，可以在冰箱中长期保存，用于提升皮下萎缩肌肉细胞的活性和功能，具有极佳的针对橘皮组织的临床实验应用价值。

临床治疗皮肤橘皮组织时，理论上针对皮下肌肉组织层健康和功能的治疗方法将是最有效的。本申请的混合物可以直接有效而且快速的提升皮下肌肉层纤维的强度、功能和健康状态，从而加强对皮下脂肪层的有效的位置控制和减少橘皮组织的产生。

附图说明

图1为衰老的非健康皮肤伴随有肌肉纤维的萎缩现象。（A）皮肤橘皮组织产生和皮下肌肉纤维的萎缩现象之间的关联性；（B）比较正常小鼠和早衰小鼠（Zmpste24-/-）的皮肤组织。

图2为衰老的非健康皮肤被本申请的复合物处理后的变化。（A）H．E 染色比较外泌体注射前后衰老皮肤及皮下组织中肌肉细胞层的厚度和健康状态的变化；（B）对血管内皮细胞的CD31表面标记物进行免疫荧光染色比较外泌体注射前后衰老皮肤的变化。

图3为对皮肤内干细胞的CD34表面标记物进行免疫荧光染色，比较衰老的非健康皮肤被本申请的复合物处理后皮肤和毛囊的健康状态。

具体实施方式：

下面将结合具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一、高活性肌肉干细胞的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

1. 筛选获得高功能活性的肌肉干细胞：提取并培养来自健康年轻个体的肌肉干细胞（hMPC），将原代的肌肉干细胞初步培养扩增到约5x10⁴细胞数量后，根据其ALDH1的活性运用流式细胞仪进行分离筛选，分离出约15%的ALDH1活性最高的细胞；

2. 高效地获得高活性肌肉干细胞的外泌体：分离出约15%的ALDH1活性最高的细胞，经培养扩增至第4时，转入3D的胶原蛋白制成的组织工程细胞骨架（约1x10⁵细胞/CM³）进行立体细胞培养；基础培养液是DMEM细胞培养基，其它添加剂质包括胎牛血清最终体积分数为20%，鸡胚胎精华提取物(chicken embryo essential extracts/CEE) 最终体积分数为1%；细胞培养基的总体积约是10mL培养液/CM³细胞骨架；连续培养48h后，加入终浓度为0.1ng/ml的γ-干扰素（IFN-γ），作用24h后，外泌体在细胞培养液中的最终浓度为3mg/ml；低温超高速离心获得外泌体，获得的外泌体经BCA方法测定蛋白含量后冻存于-80℃冰箱。

二、外泌体和视黄醛的复合物的制备：将25mg外泌体重新悬浮溶解于1mLPBS中，加入5mg的视黄醛(全反式视黄醛，all-trans retinal)，将混合物在 37℃ 摇动温育 2h。

实施例2

外泌体和视黄醛的复合物的制备：将20mg外泌体重新悬浮溶解于1mLPBS中，加入5mg的视黄醛(全反式视黄醛，all-trans retinal)，将混合物在 37℃ 摇动温育 2h。

其余过程同实施例1。

实施例3

外泌体和视黄醛的复合物的制备：将30mg外泌体重新悬浮溶解于1mLPBS中，加入5mg的视黄醛(全反式视黄醛，all-trans retinal)，将混合物在 37℃ 摇动温育 2h。

其余过程同实施例1。

实施效果例

外泌体对衰老皮肤进行注射处理的方法和步骤：将外泌体和视黄醛的复合物以50mg/mL悬浮溶解于生理盐水中，通过注射方法进入早衰小鼠(Zmpste24-/-)的皮下组织肌膜层附近；每天处理1次，持续处理10天。提取皮肤组织进行生理/ 病理学观测。主要为采用H.E staining（hematoxylin and eosin staning）来鉴定小鼠皮肤组织内各种细胞的健康情况和免疫细胞在皮肤组织的请入情况，以及免疫荧光染色法鉴定皮肤细胞内毛细血管的丰度和干细胞的数量等。

用实施例1制备的外泌体和视黄醛的复合物对衰老动物的皮肤进行处理后，衰老动物皮下肌肉的健康状态得到明显提升,其衰老率和免疫细胞聚集度都得到有效降低。以未添加干细胞外泌体处理的动物皮肤组织作为对照组。

图1给出了健康或年轻状态下和不健康或衰老状态下，橘皮组织形成相关的皮肤结构状态的比较示意图，包括表皮真皮层，皮下脂肪层，和皮下肌肉层的状态（图1A）。如图可见，橘皮组织的形成与皮下肌肉层内肌肉纤维的萎缩紧密相关。然后采用 H．E(hematoxylin and eosin) 染色比较了我们研究体系中正常年轻小鼠和衰老小鼠皮肤及皮下组织中肌肉细胞层的厚度和健康状态（图1B），结果显示：早衰小鼠体现有明显的的皮肤褶皱、脂肪缺失和脂肪细胞结构紊乱、和肌肉纤维的萎缩和结构紊乱；表明衰老皮肤的皮下肌肉层的加速萎缩。

图2通过H．E 染色，比较了外泌体注射前后衰老皮肤及皮下组织中肌肉细胞层的厚度和健康状态的变化，结果显示：早衰小鼠（Zmpste24-/-）皮下脂肪和肌肉纤维层的厚度都得到增加，紊乱的细胞结构得到改善；表明本申请的混合物注射后衰老皮肤的皮下肌肉层得到恢复和再生（图2A）。同时对血管内皮细胞的CD31表面标记物进行免疫荧光染色，结果显示：早衰小鼠皮肤真皮层和皮下组织中的毛细血管结构（CD31+）增加，而可以促进皮肤细胞生长分化的Wnt3信号也得到增强；表明了本申请的混合物注射后皮肤组织内毛细血管的丰度增加（图2B）。

图3展示了对皮肤内干细胞的CD34表面标记物进行免疫荧光染色的结果，并对Ki67这一反映细胞生长的标记物进行了免疫荧光共染色，结果显示：外泌体处理明显增加了毛囊中CD34+干细胞在毛囊根部的数量，也增加了正在增殖的细胞的数量（Ki67+）；表明了本申请的复合物注射后皮肤组织内干细胞数量和细胞生长状态的增加；显示了皮肤和毛囊的再生活力的增强。

由上可知，本发明制备的外泌体和视黄醛的复合物，对衰老动物皮下组织相关的肌肉纤维细胞发挥显著的改善功能的作用，从而预期可有效去除橘皮组织的产生。

Claims

1.外泌体与视黄醛的混合物在制备治疗皮肤橘皮组织药物上的应用，其特征在于，所述的外泌体为高活性肌肉干细胞的外泌体；

所述的视黄醛与外泌体的质量比为：1:4-6；

所述的高活性肌肉干细胞的外泌体的制备方法，包括以下步骤：

（1）筛选获得高功能活性的肌肉干细胞：提取并培养来自健康年轻个体的肌肉干细胞，将原代的肌肉干细胞初步培养扩增到5x10⁴细胞数量后，根据其ALDH1的活性运用流式细胞仪进行分离筛选，分离出15%的ALDH1活性最高的细胞；

（2）高效地获得高活性肌肉干细胞的外泌体：分离出15%的ALDH1活性最高的细胞，经培养扩增至第4时，转入3D的胶原蛋白制成的组织工程细胞骨架，按照1x10⁵细胞/CM³进行立体细胞培养；基础培养液是DMEM细胞培养基，其它添加剂质包括胎牛血清最终体积分数为20%，鸡胚胎精华提取物最终体积分数为1%；细胞培养基的总体积是10mL培养液/CM³细胞骨架；连续培养48h后，加入终浓度为0.1ng/ml的γ-干扰素，作用24h后，外泌体在细胞培养液中的最终浓度为3mg/ml；低温超高速离心获得外泌体，获得的外泌体经BCA方法测定蛋白含量后冻存于-80℃冰箱；

所述的视黄醛为全反式视黄醛。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，外泌体与视黄醛的混合物的制备过程为：提取获得外泌体重新悬浮溶解于PBS 中，加入视黄醛，在 37℃ 摇动温育1-2h。