KR102376516B1 - 수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents
수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 세포 파쇄에 의해 수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 미생물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 미생물 유래 세포 외 소포체 제조 방법은 항염증, 피부 미백 등의 기능적 활성이 우수한 세포 외 소포체를 대량으로 수득할 수 있어, 피부 상태 개선용 조성물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포 파쇄에 의해 수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 Pro와 Biotics의 합성어로서, Pro는 '~를 위한'을 의미하고, 'Biotics'는 생명을 뜻한다. 세계보건기구(WHO)는 프로바 이오틱스를 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균으로 정의하고 있다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로, 일반적으로 식품, 건강기능식품, 또는 의약품으로 섭취되고 있다. 화장품 산업에서도 프로바이오틱스 미생물을 배양하여 얻은 배양액을 이용하여 피부 상태를 개선하고자 하는 시도가 있어 왔다. 그러나, 균주 배양액에는 균주가 분비하는 다양한 단백질, 사이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 균주가 성장하면서 분비한 노폐물 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 있다. 따라서, 균주 배양액을 이용하기 위해서는 노폐물이나 각종 위험 성분을 제거하기 위한 별도의 공정이 필요하고 이에 따라 비용이 많이 들게 된다.
세포 외 소포체는 세포간 정보교환을 위해 세포에서 분비하는 막 구조의 소포체의 총칭으로, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로소포체(microvesicle), 마이크로입자 (microparticle), 세포자멸체(apoptotic body) 등을 포함한다. 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 인지질 이중막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 cytokine, growth factor, miRNA, DNA, 단백질 등이 포함되어 있으며, 분비하는 기원 세포(공여 세포)의 상태를 반영하므로 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다.
엑소좀은 다양한 종류의 체액, 예를 들어 침, 소변, 혈장, 혈청, 양수로부터 분리할 수 있고 여러 종류의 세포 배양 상층액에서도 분리가 가능하다. 인간 줄기세포 배양 상층액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법이 개발된 바 있으나 (한국공개특허 10-2016-0086253), 유산균과 같은 프로바이오틱스 미생물의 세포 파쇄물로부터 유래된 엑소좀, 엑소좀 유사 소포체 등의 세포 외 소포체의 피부 상태 개선 용도나 미생물의 파쇄물로부터 엑소좀, 엑소좀 유사 소포체 등의 세포 외 소포체를 고농도로 분리하는 기술에 대한 연구는 미미한 실정이다.
일 양상은 (a) 미생물 배양액의 파쇄물을 수득하는 단계; (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및 (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 (a) 미생물 배양액의 파쇄물을 수득하는 단계; (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및 (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법을 제공한다.
용어 “세포 외 소포체(extracellular vesicle)”는 세포에서 분비되어 세포 외 공간으로 방출된 소포체(vesicles)를 의미하는 것으로서, 막 구조 소포체로 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid), 및 세포질 성분 등을 가지고 있고, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포가 터지면서 내부의 유효 성분을 포집한 뒤 형성된 소포체나 다소포체가 터지면서 막이나 내부의 유효 성분 조성이 재구성된 소포체 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포 외 소포체는 다른 세포에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포 외 전달체로 작용하는 것일 수 있다.
용어 “엑소좀 유사 소포체(exosome like vesicle)”는 나노 크기의 세포 외 소포체를 의미하는 것으로서, 나노 크기의 엑소좀을 포함할 뿐만 아니라 나노 크기의 소포체 구조 및 그 조성물이 엑소좀과 유사한 소포체를 모두 포함하는 최광의 개념일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 미생물 유래 세포 외 소포체는 미생물 유래 엑소좀 및/또는 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 “미생물”은 분리 균주 또는 시판 중인 다양한 균주를 제한 없이 사용 가능한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 엔테로코커스(Enterococcus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.) 및 락토코커스(Lactococcus spp.)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유산균이거나, 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 클루이베로마이세스(Kluyveromyces spp.), 또는 바실러스(Bacillus) 속 균주일 수 있으며, 구체적으로 락토바실러스(Latobacillus spp.) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces Carlsbergensis), 및 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 균체 혼합 배양액의 파쇄물일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 미생물 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 회수한 균체의 파쇄물일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 미생물 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양 상등액의 파쇄물일 수 있다.
용어 “배양액”은 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다.
상기 “균체 혼합 배양액”은 균체가 포함된 배양액 그 자체를 의미할 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배지 (예를 들면, MRS 배지)에서 10 ℃초과 또는 40 ℃미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다. 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 또는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
용어 “배양 상등액”은 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 의미하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제외한 상부의 액체만을 의미할 수 있다.
용어 “파쇄물”은 화학적 또는 물리적 힘으로 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있으며, 용어 “균체 파쇄물”은 용어 “세포 파쇄물”과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 세포 외 소포체를 미생물 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물로부터 분리할 경우, 배양 상등액으로부터 분리하는 경우에 비해 엑소좀 유사 소포체의 수율을 증가시킬 수 있으며, 피부 상태 개선에 있어서 기능적 활성이 우수한 엑소좀 유사 소포체를 분리할 수 있는 바, 생물 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물로부터 분리된 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 조성물은 피부 상태 개선용 조성물로 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 파쇄는 압력을 가하여 세포를 물리적으로 파쇄하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 파쇄는 세포막을 파쇄하거나, 세포 내부 또는 외부에 존재하는 세포 외 소포체를 파쇄하는 것일 수 있으며, 세포막이 터지면서 내부의 유효 성분을 포집한 뒤 소포체를 형성하거나, 소포체가 터지면서 막이나 내부의 조성을 달리하는 소포체를 재형성하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 파쇄물에는 균주의 대사 과정에서 자연적으로 발생한 세포 외 소포체 이외에 세포막 또는 소포체 파쇄와 같은 물리적인 힘에 의해 인위적으로 발생한 세포 외 소포체를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 물리적 파쇄는 고압균질기(High pressure homogenizer)를 사용하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 물리적 파쇄는 마이크로플루다이저 (Microfluidizer)를 사용하여 1 내지 10회 파쇄하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 8회, 1 내지 6회, 1 내지 5회, 1 내지 4회일 수 있으나, 1 내지 3회가 적절할 수 있다. 세포 파쇄를 수행하지 않을 경우 피부 상태 개선에 있어서 기능적 활성이 향상된 세포 외 소포체를 획득하기 어려울 수 있고, 파쇄 회수가 3회 초과일 경우 세포 외 소포체가 외부 팽압으로 인해 소포체막이 파괴되어 수율이 저하되는 문제가 생길 수 있다.
화학적 파쇄 방법의 경우 대량으로 세포 파쇄를 하기에 적합하지 않고, 막 성분이 화학적으로 변형되거나 화학 성분으로 인한 부작용을 방지하기 위해 화학 성분을 제거하는 단계가 추가되며, 시약 처리 과정에서 오염이 발생할 수 있다. 물리적 파쇄 방법 중 압력을 이용한 방법이 아닌 경우, 예를 들어, 고주파를 이용하는 초음파 분쇄기(sonicator)의 경우 수율이 낮아 대량 생산이 어려우며, 열이 발생하여 세포 외 소포체의 변성을 유발할 수 있다. 막자 사발을 이용한 분쇄법의 경우 균질화가 고르게 되지 않을 수 있으며, 유리구슬과 볼텍싱(vortexing)을 이용하여 파쇄하는 경우 균질화가 되지 않는 문제가 발생할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 압력은 700 내지 2000 bar일 수 있으며, 예를 들어, 700 내지 1900 bar, 700 내지 1800 bar, 700 내지 1700 bar, 700 내지 1600 bar, 700 내지 1500 bar, 700 내지 1400 bar, 700 내지 1300 bar, 700 내지 1200 bar, 700 내지 1100 bar, 700 내지 1000 bar, 800 내지 2000 bar, 800 내지 1900 bar, 800 내지 1800 bar, 800 내지 1700 bar, 800 내지 1600 bar, 800 내지 1500 bar, 800 내지 1400 bar, 800 내지 1300 bar, 800 내지 1200 bar, 800 내지 1100 bar, 800 내지 1000 bar, 900 내지 2000 bar, 900 내지 1900 bar, 900 내지 1800 bar, 900 내지 1700 bar, 900 내지 1600 bar, 900 내지 1500 bar, 900 내지 1400 bar, 900 내지 1300 bar, 900 내지 1200 bar, 900 내지 1100 bar, 900 내지 1000 bar일 수 있다. 구체적으로, 상기 압력은 700 내지 2000 bar일 수 있다. 상기 압력이 2000 bar 초과일 경우 원하는 엑소좀이 파괴될 수 있고, 상기 압력이 700 bar 미만일 경우 세포 파쇄가 원활히 일어나지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득된 파쇄물을 원심분리하여 잔해를 제거하고 회수한 상등액을 여과하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 원심분리는 8,000 내지 100,000 ×g에서 20분 내지 2 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 8,000 내지 80,000 ×g, 8,000 내지 60,000 ×g, 8,000 내지 40,000 ×g, 8,000 내지 30,000 ×g, 8,000 내지 20,000 ×g, 8,000 내지 10,000 ×g, 9,000 내지 100,000 ×g, 9,000 내지 80,000 ×g, 9,000 내지 60,000 ×g, 9,000 내지 40,000 ×g, 9,000 내지 30,000 ×g, 9,000 내지 20,000 ×g, 9,000 내지 10,000 ×g, 10,000 내지 100,000 ×g, 10,000 내지 80,000 ×g, 10,000 내지 60,000 ×g, 10,000 내지 40,000 ×g, 10,000 내지 30,000 ×g, 10,000 내지 20,000 ×g에서 20분 내지 2 시간, 20분 내지 1시간 30분, 20 분 내지 1시간, 20분 내지 40분, 20분 내지 30분, 30분 내지 2 시간, 30분 내지 1시간 30분, 30 분 내지 1시간, 30분 내지 40분 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다. 상기 중력가속도가 100,000 ×g 초과일 경우 목표하는 크기의 엑소좀과 잔해물이 함께 제거되어 수율이 낮아지는 문제가 생길 수 있다. 상기 중력가속도가 8,000 ×g 미만일 경우 세포 파쇄 잔해물이 상층액에 남아있는 문제가 생길 수 있으며, 고순도의 엑소좀을 정제하기에 효율이 낮아지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계는 0.3 내지 1.0 ㎛ 필터로 여과하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.3 내지 0.9 ㎛, 0.3 내지 0.8 ㎛, 0.3 내지 0.7 ㎛, 0.3 내지 0.6 ㎛, 0.3 내지 0.5 ㎛, 0.4 내지 1.0 ㎛, 0.4 내지 0.9 ㎛, 0.4 내지 0.8 ㎛, 0.4내지 0.7 ㎛, 0.4 내지 0.6 ㎛, 0.4 내지 0.5 ㎛일 수 있다. 상기 필터의 크기가 1.0 ㎛ 초과일 경우 엑소좀 이외의 세포 파쇄 잔해 물질들이 유입되어 엑소좀을 고순도로 얻을 수 없는 문제가 생길 수 있고, 상기 필터의 크기가 0.3 ㎛ 미만일 경우 수율이 떨어지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (c) 단계는 20 kDa 내지 500kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하여 100kDa 이상, 200kDa 이상, 300kDa 이상, 400kDa 이상, 500kDa 이상의 시료를 수득하여 농축하는 것일 수 있다. 상기 MWCO 필터의 크기가 500kDa 초과일 경우 엑소좀 이외의 물질들이 유입되어 엑소좀을 고순도로 얻을 수 없는 문제가 생길 수 있고, 상기 MWCO 필터의 크기가 20 kDa 미만일 경우 목표하는 크기의 엑소좀의 유입이 차단되는 문제가 생길 수 있다. 상기 (c) 단계에서 세포 파쇄물은 membrane 필터를 통해 pore 사이즈보다 큰 물질은 필터에 걸려 농축되고, 작아서 통과한 물질은 확산 작용에 의해 제거되는 것일 수 있다. 구체적으로, 100 kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용할 경우, 세포 소기관들은 제거되고 100 kDa 이상의 엑소좀 및/또는 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체는 필터에 걸리면서 고농축 되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 (c) 단계 이후에 상기 한외여과된 파쇄물을 0.01 내지 0.3 ㎛ 필터, 예를 들어, 0.01 내지 0.25 ㎛, 0.01 내지 0.2 ㎛, 0.1 내지 0.3 ㎛, 0.1 내지 0.25 ㎛, 0.1 내지 0.2 ㎛, 0.2 내지 0.3 ㎛, 0.2 내지 0.25 ㎛의 필터로 제균 여과하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 필터의 크기가 0.3 ㎛ 초과일 경우 제균 여과가 되지 않는 문제가 생길 수 있고, 상기 필터의 크기가 0.01 ㎛ 미만일 경우 효율이 떨어지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 20 nm 내지 400 nm의 직경을 갖는 세포 외 소포체를 제조하는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 nm 내지 350 nm, 20 nm 내지 300 nm, 20 nm 내지 250 nm, 20 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 350 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 400 nm, 100 nm 내지 350 nm, 100 nm 내지 300 nm, 100 nm 내지 250 nm, 100 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 150 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 350 nm, 150 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 250 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 400 nm, 200 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 300 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 350 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 400 nm, 또는 300 nm 내지 350 nm일 수 있으며, 구체적으로, 20 nm 내지 200 nm일 수 있다.
일 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 미생물, 세포 외 소포체에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 엔테로코커스(Enterococcus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.), 락토코커스(Lactococcus spp.), 사카로마이세스(Saccharomyces spp.), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces spp.) 및 바실러스(Bacillus spp.) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces Carlsbergensis), 및 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 미생물 배양액의 파쇄물로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 미생물 배양액의 파쇄물은 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 kDa 내지 500kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터로 한외여과(ultrafiltration)하여 분리된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포 외 소포체는 미생물 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물로부터 한외여과법에 의해 분리되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 세포 외 소포체는 전술한 제조 방법에 의해 제조된 세포외 소포체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 항염증, 피부 미백, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 상처 개선, 및 항노화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 용어 "항염증"은 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 "피부 미백"이란 멜라닌의 합성을 저해하여 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “피부 보습”은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어, "피부 장벽 강화"란 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어, "피부 재생"이란 피부의 일부분이 소실되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “상처 개선”은 피부의 재생을 촉진시켜 상처의 정도를 낮추어주거나 완화시키는 용도를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 상처 개선은 피부 재생을 촉진 시켜 이미 발생한 상처의 정도를 낮추거나 완화시키는 것일 수 있다. 용어 "상처"는 창상, 화상, 찰과상, 자외선(UV)에 의한 광손상 및 흉터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 용어 “항노화”는 피부 노화를 방지하거나 억제하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 피부 노화는 시간의 흐름에 따른 내인성 노화 및 외부 환경에 의한 외인성 노화를 포함한다. 상기 피부 노화는 피부 주름, 잡티, 기미 등을 포함할 수 있다. 상기 피부 주름은 피부가 쇠하여 생긴 잔주름일 수 있다. 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 광노화는 자외선(UVA, UVB, 및 UVC 포함) 노출에 의한 피부 노화일 수 있다. 용어 “피부 주름 개선”은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것일 수 있다.
용어 "개선"이란 상태의 완화 도는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 NO 생성을 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피브로넥틴 (Fibronectin)의 발현을 증진시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 필라그린 (filaggrin)의 발현을 증진시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피부 섬유아세포 (fibroblast cell)를 증식시키는 것일 수 있다. 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.000000001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.0001 중량% 내지 60 중량%, 0.0001 중량% 내지 40 중량%, 0.0001 중량% 내지 30 중량%, 0.0001 중량% 내지 20 중량%, 0.0001 중량% 내지 10 중량%, 0.0001 중량% 내지 5 중량%, 0.001 중량% 내지 80 중량%, 0.001 중량% 내지 60 중량%, 0.001 중량% 내지 40 중량%, 0.001 중량% 내지 30 중량%, 0.001 중량% 내지 20 중량%, 0.001 중량% 내지 10 중량%, 0.001 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 80 중량%, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 80 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%의 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 세포 외 소포체가 106 개/ml 내지 1012 개/ml, 예를 들어, 106 개/ml 내지 1011 개/ml, 106 개/ml 내지 1010 개/ml, 106 개/ml 내지 109 개/ml, 106 개/ml 내지 108 개/ml, 106 개/ml 내지 107 개/ml, 107 개/ml 내지 1012 개/ml, 107 개/ml 내지 1011 개/ml, 107 개/ml 내지 1010 개/ml, 107 개/ml 내지 109 개/ml, 107 개/ml 내지 108 개/ml, 108 개/ml 내지 1012 개/ml, 108 개/ml 내지 1011 개/ml, 108 개/ml 내지 1010 개/ml, 108 개/ml 내지 109 개/ml, 109 개/ml 내지 1012 개/ml, 109 개/ml 내지 1011 개/ml, 109 개/ml 내지 1010 개/ml, 1010 개/ml 내지 1012 개/ml, 1010 개/ml 내지 1011 개/ml, 1011 개/ml 내지 1012 개/ml의 농도로 포함된 것일 수 있다. 세포 외 소포체가 조성물 내에 106 개/ml 미만으로 포함될 경우 유의한 피부 상태 개선 효과가 나타나지 않을 수 있고, 1012 개/ml 초과로 포함될 경우 제형 안정성이 저하될 수 있다.
용어 "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 세포 외 소포체가 첨가되는 것을 의미하고, 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 로션, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다. 상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 미생물, 세포외 소포체, 항염증, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 미생물, 세포외 소포체, 항염증, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 미생물 유래 세포외 소포체 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 또는 상처 개선용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 미생물, 세포 외 소포체, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
용어 "예방"은 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 사전에 방지하거나 발생 가능성 또는 발생 빈도를 낮추는 것을 포괄적으로 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 염증 질환 등의 염증 질환이 발생할 가능성이 있는 환자 또는 발병한 적이 있는 환자에게서 발병 확률을 낮추거나, 재발 확률을 낮추는 것일 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합, 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
용어 "치료"는 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 개선시키는 것을 포괄적으로 의미할 수 있고, 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 질환의 증상이 완화 또는 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있으며, 질환으로 인한 한가지 증상 또는 대부분의 증상을 개선시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 유효량에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 "염증성 질환"은 염증성 피부질환, 알레르기성 염증질환, 염증성 안구질환, 염증성 골관절질환, 염증성 근육질환 또는 염증성 장질환일 수 있으며, 상기 "염증성 피부 질환"은 아토피 피부염, 건선, 접촉성 피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 알러지, 및 과민증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
일 양상에 따른 미생물 유래 세포 외 소포체 제조 방법은 기능적 활성이 우수한 세포 외 소포체를 대량으로 수득할 수 있어, 피부 상태 개선용 조성물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 유산균 균체 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 유산균 배양 상등액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 complex 샘플 및 lysate sample의 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 탁도 변화를 관찰한 사진이다.
도 6a 내지 도 6e는 각각 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자 수를 nano-sight로 측정한 그래프이다.
도 7은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체 단백질의 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과이다.
도 8은 실시예 1 내지 3의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체를 Raw264.7 대식세포에 처리한 후 항염 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 각각 실시예 3 및 비교예 1 로부터 분리된 세포 외 소포체를 HaCaT cell에 처리한 후 피브로넥틴과 필라그린 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 10a 및 10b는 각각 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 HDF 증식능을 확인한 결과이다.
도 11은 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HDF cell에 처리한 후 collagen type Ⅰ α 1 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 12a 및 도 12b는 각각 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HS68 cell에 처리한 후 피브릴린과 엘라스틴 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 13은 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 B16F10 cell에 처리한 후 멜라닌 생성량을 비교 분석한 결과 이다.
도 14는 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 수분유지력을 평가한 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 유산균 균체 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 유산균 배양 상등액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 complex 샘플 및 lysate sample의 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 탁도 변화를 관찰한 사진이다.
도 6a 내지 도 6e는 각각 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자 수를 nano-sight로 측정한 그래프이다.
도 7은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체 단백질의 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과이다.
도 8은 실시예 1 내지 3의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체를 Raw264.7 대식세포에 처리한 후 항염 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 각각 실시예 3 및 비교예 1 로부터 분리된 세포 외 소포체를 HaCaT cell에 처리한 후 피브로넥틴과 필라그린 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 10a 및 10b는 각각 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 HDF 증식능을 확인한 결과이다.
도 11은 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HDF cell에 처리한 후 collagen type Ⅰ α 1 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 12a 및 도 12b는 각각 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HS68 cell에 처리한 후 피브릴린과 엘라스틴 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 13은 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 B16F10 cell에 처리한 후 멜라닌 생성량을 비교 분석한 결과 이다.
도 14는 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 수분유지력을 평가한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
다양한 미생물로부터 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체를 하기 실시예의 방법(이를 'HPEV'공정이라 명명)에 따라 분리하여 미생물 유래 세포 외 소포체를 제조하고, 이를 수율 평가, 기능적 활성 평가 등에 사용하였다.
실시예 1. 유산균 균체 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S1)
락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균체 혼합 배양액으로부터 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체를 분리하였다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus, KCCM 32405)는 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁되어 있는 균주를 분양 받아 이용하였다.
구체적으로, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24 시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액 (이하, complex sample로 명명)을 수득하였다. 상기 수득된 complex sample을 고압균질기(Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000 bar의 압력으로 세포 파쇄를 수행하였다. 수득된 세포 파쇄물을 4 ℃에서 10,000 ×g으로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정을 3회 반복하였다. 도 5a는 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 complex 샘플의 탁도 변화를 관찰한 사진이다. 그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 세포 파쇄에 의한 잔해가 대부분 제거되었음을 확인하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100 kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100 kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하고, 배지성분을 제거하기 위하여 3차 증류수 혹은 등장액 (saccharide 또는 PBS 등)으로 2회 워싱하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 2. 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S2)
Lysate sample을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 외 소포체를 분리하였다.
구체적으로, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24 시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액을 4 ℃에서 10,000×g으로 30분 동안 원심분리하여 배양 상등액 제거하고 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 3차 증류수 혹은 등장액(예를 들면, saccharide 또는 PBS 등) 500 mL에 현탁하여 균체 샘플(이하, lysate sample로 명명)을 준비하였다. 상기 수득된 lysate 샘플을 고압균질기(Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000 bar의 압력으로 세포 파쇄를 수행하였다. 수득된 세포 파쇄물을 4 ℃에서 10,000×g으로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정을 3회 반복하였다. 도 5b는 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 lysate 샘플의 탁도 변화를 관찰한 사진이다. 그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이, 세포 파쇄에 의한 잔해가 대부분 제거되었음을 확인하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100 kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 3. 유산균 배양 상등액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S3)
Filtration sample을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 외 소포체를 분리하였다.
구체적으로, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액을 4 ℃에서 10,000 ×g으로 30분 동안 원심분리를 2회 반복하여 균체를 제거하고 배양 상등액(이하, filtration sample로 명명)을 회수하였다. 상기 수득된 filtration sample을 고압균질기(Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000 bar의 압력으로 파쇄를 수행하여 배양액으로 분비된 세포 외 소포체의 재구성을 유도한 후 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100 kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하고, 배지성분을 제거하기 위하여 3차 증류수 혹은 등장액 (saccharide 또는 PBS 등)으로 2회 워싱하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 4. 효모 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S4)
상기 실시예 2에서 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 대신에 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae)를 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세포 외 소포체를 분리하였다.
비교예 1. 유산균 배양 상등액 유래 세포 외 소포체의 분리(R1)
락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액을 4 ℃에서 10,000 ×g으로 30분 동안 원심분리를 2회 반복하여 균체를 제거하고 수득된 배양 상등액(이하, ultra-filtration sample로 명명)을 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100 kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였고, 배지성분을 제거하기 위하여 3차 증류수 혹은 등장액 (saccharide 또는 PBS 등)으로 2회 워싱하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실험예 1. 세포 외 소포체의 크기 및 농도 측정
분리 방법에 따른 세포 외 소포체의 특성과 수율을 비교 분석하기 위하여, nano-sight NS300(Malvern Panalytical, Almelo, Nederland)를 이용해 나노 입자 추적 분석을 수행하여 세포 외 소포체의 크기와 농도를 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체 샘플을 PBS 혹은 3차 증류수로 입자 수가 1~4x108이 되도록 희석하였고, 측정 중 frame 수는 20~30이 되도록 하였다. 샘플을 1mL 준비하고, 기기 챔버에 loading 하였다. Particle에 초점을 맞추고, camera level을 조절한 후 측정을 시작하였다. Capture duration을 30~60초 사이로 하고 3번 반복 측정을 시행하였다. 측정이 끝나면 detection threshold를 조절하고, 3번 측정한 값을 분석하였다. 이때 3번 반복한 결과의 패턴이 비슷한 양상을 보이는 것이 적당한 것으로 간주하였다. 도 6a 내지 도 6e는 각각 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자 수를 nano-sight로 측정한 그래프이다.
하기 [표 1]은 상기 실시예 1 내지 4와 비교예 1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 배양액 기준 L당 총 입자수를 비교한 결과이다.
| 실시예 1 (S1) |
실시예 2 (S2) |
실시예 3 (S3) |
실시예 4 (S4) |
비교예 1 (R1) |
|
| 입자 수 (particles/L) | 5.17E+11 | 7.00E+11 | 3.26E+10 | 1.58E+11 | 8.20E+09 |
그 결과, 도 6a 내지 도 6e에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 대부분의 소포체 직경이 20 내지 200 nm인 것을 확인하였다.또한, 표 1을 보면 세포 파쇄를 수행하지 않는 비교예 1에 비해 세포 파쇄를 수행하는 실시예 1~3에서 입자 수가 약 4~85배 증가되었는 바, 세포 파쇄에 의해 수득률이 향상되었음을 확인하였다.
실험예 2. 유산균 유래 세포 외 소포체의 단백질 패턴 비교
유산균 및 유산균 유래 세포외 소포체에 포함된 단백질의 발현 양상을 비교하기 위해, 균 배양 후 원심분리하여 얻은 cell pellet과 실시예 1 내지 3, 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체 단백질 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 비교하였다.
구체적으로, 균 배양 후 원심분리하여 얻은 cell pellet을 PBS에 현탁시켰다. 그리고 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에서 얻은 세포 외 소포체의 동결건조물을 일정한 농도로 3차증류수 혹은 PBS에 녹였다. 그 후 sample buffer와 섞은 후 95℃에서 10분간 끓여주었다. 이 후 10% SDS-PAGE gel에 loading하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 끝난 gel을 Coomassie blue staining solution을 이용해 30분간 염색시켰다. 염색 후 destaining solution을 이용해 탈염색하고 결과를 확인하였다. 도 7은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체 단백질의 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과이다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 cell pellet과 실시예 1 내지 3, 비교예 1의 유산균 유래 세포외 소포체는 단백질 구성에서 서로 다른 양상을 보임을 확인하였다.
실험예 3. 유산균 유래 세포 외 소포체의 항염 효과
상기 실시예 1 내지 3에서 분리된 세포 외 소포체의 항염 효과를 확인하기 위하여, Raw264.7 대식세포에 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 NO 생성양을 평가하였다.
구체적으로, Raw264.7 대식세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 배양하고 96 웰 플레이트에 각각 80%의 밀도를 갖도록 분주하였다. 24시간 배양 후 염증유발물질인 LPS 1ug/mL과 실시예 1 내지 3, 비교예 1의 샘플들을 0.0025 및 0.01 %(v/v)의 농도별로 처리하여 24시간 추가 배양하였다. 대조군은 PBS를 처리하였고, 음성 대조군은 LPS 1ug/mL만 처리하였으며, 양성 대조군은 LPS 1ug/mL 처리 후 ascorbic acid를 처리한 것을 사용하였다. 배양 상층액과 NO와 발색반응을 일으키는 Griess reagent를 1:1 비율로 섞고 10분간 차광한 상태로 shake incubation하였다. 그 이후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 standard curve를 측정하여 NO 생성양을 확인하고, LPS만 처리한 음성 대조군 대비 억제율을 계산하였다. 도 8은 실시예 1 내지 3의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체를 Raw264.7 대식세포에 처리한 후 항염 효과를 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 세포 파쇄를 수행하는 실시예 1 내지 3에서 분리된 세포 외 소포체는 NO 생성을 농도 의존적으로 유의하게 감소시켰으며, 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체보다 NO 생성 억제 효과가 현저하게 향상됨을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 항염 활성이 현저하게 향상된 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 4. 유산균 유래 세포외 소포체의 피부 장벽 강화 효과 확인
상기 실시예 3에서 분리된 유산균 유래 세포 외 소포체의 피부 장벽 기능 개선 효과를 확인하기 위하여, 피부각질세포(HaCat)에 실시예 3과 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 피브로넥틴 (fibronectin; FN1)과 필라그린 (filaggrin; FLG)의 유전자 발현능을 평가하였다.
구체적으로, HaCaT 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 실시예 3과 비교예 1의 샘플들을 0.00001 %(v/v)의 농도로 처리하였다. 처리 후 48시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, Takara, Shiga, Japan)의 실험 방법에 따라 mRNA를 추출한 후 reverse transcriptase를 이용해 cDNA로 합성하고, 합성된 cDNA를 SYBR green master mix (LightCycler® 480 SYBR Green I Master, Roche, Basel, Switzerland)와 섞은 후 realtime-PCR을 수행하며 실시간으로 유전자 발현을 확인하였다. 도 9a 및 도 9b는 각각 실시예 3 및 비교예 1 로부터 분리된 세포 외 소포체를 HaCaT cell에 처리한 후 피브로넥틴과 필라그린 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 9a와 9b에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 분리된 세포 외 소포체 처리군은 fibronectin과 filaggrin의 발현을 유의하게 증가시켰으며, 특히 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체 처리군에서보다 fibronectin과 filaggrin의 발현이 현저하게 향상됨을 확인하였다. 이는 같은 배양액으로부터 유래한 세포 외 소포체라도 본 공정에 의해 효능이 증가된 것으로 판단되며, 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 피부 장벽 강화 활성이 현저하게 향상된 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 5. 유산균 및 효모 유래 세포 외 소포체의 세포 독성 검사 및 피부 재생 효과 확인
상기 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 유산균 및 효모 유래의 세포외 소포체를 인체피부섬유아세포(HDF)에 처리하여 세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 인체피부섬유아세포 HDF을 CO2 배양기에서 배양하고, 상기 실시예 2와 실시예 4의 샘플들을 0.00001~0.001% (v/v)의 농도별로 처리한 후 24시간 동안 serum-free 조건에서 배양하였다. 대조군은 무처리군을 사용하였고, 양성 대조군으로는 serum을 포함하는 배지에서 배양한 것을 사용하였다. 배양 종료 후, 상등액을 제거하고 1 mg/mL의 MTT 시약을 처리하고 4시간동안 추가 배양하였다. 상등액을 제거하고 DMSO를 처리해 준 후 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 및 세포 독성을 대조군과 비교하여 산정하였다. 도 10a 및 10b는 각각 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 HDF 증식능을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 10a와 10b에 나타난 바와 같이, 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체는 피부섬유아세포 증식 효과가 있으며, 시험물질의 농도가 증가함에도 세포 증식율이 유의하게 감소하지 않았는 바, 세포 독성이 없어 안전함을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 우수한 상처 치유 및 피부 재생능을 가지면서, 세포 독성이 없어 안전한 세포외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 6. 유산균 및 효모 유래 세포 외 소포체의 항노화 효과 확인
(1) 콜라겐 유전자 발현능 평가
상기 실시예 2와 실시예 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 유산균 및 효모 유래 세포 외 소포체의 항노화 효과를 확인하기 위하여, 인체피부섬유아세포(HDF)에 실시예 2와 실시예 4의 세포 외 소포체를 처리한 뒤 collagen type Ⅰ α 1의 유전자 발현능을 평가하였다.
구체적으로, HDF 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 실시예 2와 실시예 4의 샘플들을 0.00001 %(v/v)의 농도로 처리하였다. 처리 후 48시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, Takara, Shiga, Japan) 의 실험 방법에 따라 mRNA를 추출한 후 reverse transcriptase를 이용해 cDNA로 합성하고, 합성된 cDNA를 SYBR green master mix (LightCycler® 480 SYBR Green I Master, Roche, Basel, Switzerland)와 섞은 후 realtime-PCR을 수행하며 실시간으로 유전자 발현을 확인하였다. 도 11은 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HDF cell에 처리한 후 collagen type Ⅰ α 1 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체는 collagen type Ⅰ α 1 발현을 유의하게 증가시킴을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 피부 주름 개선 등의 우수한 항노화 활성을 갖는 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
(2) 피브릴린, 엘라스틴 유전자 발현능 평가
상기 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 항노화 효과를 확인하기 위하여, 인간 진피 섬유아세포(HS68)에 실시예 2의 세포 외 소포체를 처리한 뒤 피브릴린(Fibrilin), 엘라스틴(Elastin) 유전자 발현능을 평가하였다.
구체적으로, HS68 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 실시예 2의 샘플을 0.000000001 및 0.00000001 %(v/v)의 농도별로 처리하였다. 양성 대조군은 EGCG를 처리한 것을 사용하였다. 처리 후 24시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 trizol을 이용해 mRNA를 추출한 후 reverse transcriptase를 이용해 cDNA로 합성하고, 합성된 cDNA를 프라이머와 dNTP, taq polimerase와 섞은 후 PCR을 수행하며 실시간으로 유전자 발현을 확인하였다. 도 12a 및 도 12b는 각각 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HS68 cell에 처리한 후 피브릴린과 엘라스틴 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 12a및 도 12b에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 분리된 세포 외 소포체는 피브릴린과 엘라스틴 발현을 농도 의존적으로 유의하게 증가시킴을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 피부 주름 및 탄력 개선 등의 우수한 항노화 활성을 갖는 세포외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 7. 유산균 유래 세포 외 소포체의 미백 효과 확인
상기 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 미백 효과를 확인하기 위하여, B16F10 cell에 실시예 2의 세포 외 소포체를 처리한 뒤 멜라닌 생성량을 평가하였다.
구체적으로, B16F10 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 멜라닌 색소의 생성을 촉진하는 물질인 α-MSH 0.5 μM과 실시예 2의 샘플을 0.00005~0.005 %(v/v)의 농도별로 처리하였다. 대조군은 무처리군을 사용하였고, 음성 대조군은 α-MSH 0.5 μM만 처리하였으며, 양성 대조군은 kojic acid를 처리한 것을 사용하였다. 처리 후 48시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 PBS를 이용해 세포를 워싱한 후 trypsin을 이용해 회수한 후 세포를 계수하여 일정한 세포수로 맞추었다. 13000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. 1N 농도의 NaOH와 10% DMSO 100 uL를 넣고 80 ℃에서 2시간을 두어 세포를 lysis하였다. 이후 405 nm에서 흡광도를 제거하였다. 도 13은 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 B16F10 cell에 처리한 후 멜라닌 생성량을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 분리된 세포 외 소포체는 멜라닌 발현을 농도 의존적으로 유의하게 감소시킴을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 우수한 피부 미백 활성을 갖는 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 8. 유산균 유래 세포 외 소포체의 보습 효과 확인
상기 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 수분유지력을 확인하기 위해 단기 임상을 진행하였다.
구체적으로, 시험물질을 적용할 부위의 보습을 수분 측정기(JANUS-Ⅲ, Pie, Seoul, Korea)를 이용해 미리 측정하였다. 대조군인 3차 증류수와 실시예 2의 샘플을 필터페이퍼에 동량으로 적용한 후 피험자 팔에 붙인 후 시료가 스며들 때까지 30분을 기다린 다음, 필터페이퍼를 제거한 후 0분, 5분, 15분, 30분마다 보습력을 수분측정기로 측정하였다. 보습 변화량은 하기 식 1에 의해 평가하였다.
[식 1]
도 14는 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 수분유지력을 평가한 결과이다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 대조군인 3차 증류수에서보다 실시예 2에서 분리된 세포 외 소포체 처리군에서 수분 유지력이 우수함을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 우수한 피부 보습력을 갖는 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
Claims (33)
- (a) 미생물 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 균체를 회수하는 단계;
(b) 상기 회수된 균체의 파쇄물을 수득하는 단계;
(c) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및
(d) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법으로서,
상기 미생물은 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae)인 것인, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 (b) 단계에서 수득된 파쇄물을 원심분리하여 잔해를 제거하고 회수한 상등액을 여과하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 (d) 단계 이후에 상기 한외여과된 파쇄물을 0.01 내지 0.3 ㎛ 필터로 제균 여과하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 파쇄는 700 내지 2000 bar의 압력을 가하여 세포를 물리적으로 파쇄한 것인 방법.
- 청구항 1 및 청구항 5 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 원심분리는 8,000 내지 100,000 ×g에서 20분 내지 2 시간 동안 수행하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계는 0.3 내지 1.0 ㎛ 필터로 여과하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 (d) 단계는 20 kDa 내지 500kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 내지 400 nm의 직경을 갖는 것인 방법.
- 삭제
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- 삭제
- 청구항 1에 따른 방법으로 제조된 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서,
상기 피부상태 개선은 항염증, 피부 미백, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 화장료 조성물. - 삭제
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- 청구항 15에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 내지 400 nm의 직경을 갖는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 NO 생성을 억제하는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 피브로넥틴 (Fibronectin)의 발현을 증진시키는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 필라그린 (filaggrin)의 발현을 증진시키는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 피부 섬유아세포 (fibroblast cell)를 증식시키는 것인 화장료 조성물.
- 청구항 1에 따른 방법으로 제조된 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 피부 외용제 조성물로서,
상기 피부상태 개선은 항염증 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 피부 외용제 조성물. - 청구항 1에 따른 방법으로 제조된 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus) 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 피부상태 개선은 항염증 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 건강기능식품 조성물. - 청구항 1에 따른 방법으로 제조된 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae) 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서,
상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 재생, 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 화장료 조성물. - 청구항 1에 따른 방법으로 제조된 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae) 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 피부 외용제 조성물로서,
상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 재생, 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 피부 외용제 조성물. - 청구항 1에 따른 방법으로 제조된 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae) 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 재생, 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 건강기능식품 조성물.
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