CN108753697A - 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法 - Google Patents

一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108753697A
CN108753697A CN201810647971.3A CN201810647971A CN108753697A CN 108753697 A CN108753697 A CN 108753697A CN 201810647971 A CN201810647971 A CN 201810647971A CN 108753697 A CN108753697 A CN 108753697A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
excretion body
induced multi
potent stem
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810647971.3A
Other languages
English (en)
Inventor
骆莹
高英堂
王鹏
高敦芹
李成龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Third Central Hospital
Original Assignee
Tianjin Third Central Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Third Central Hospital filed Critical Tianjin Third Central Hospital
Priority to CN201810647971.3A priority Critical patent/CN108753697A/zh
Publication of CN108753697A publication Critical patent/CN108753697A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其配方如下：每100mLDMEM/F12中加入以下浓度组分：去除外泌体的血清替代物0.5mL；L‑谷氨酰胺0.1mmol；非必需氨基酸0.1mmol；β‑巯基乙醇0.01mmol。本发明提取培养基可用于提取诱导多能干细胞来源的外泌体，能够保持诱导多能干细胞多能性状态，对细胞的活性和干特性不会造成影响，最大限度地保持干细胞来源的外泌体特性，具有巨大的应用前景。

Description

一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用 其提取外泌体的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学与生物技术领域，尤其是一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法。
背景技术
外泌体是一种由真核细胞的多泡内涵体与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的脂质双层膜性小囊泡，其组成包括蛋白质、mRNA、microRNA和细胞器调控受体等各类生物活性分子。外泌体能够选择性地在不同细胞间进行物质运输与信息传递，并参与抗原呈递、血管新生、RNA转运、组织修复再生、免疫激活与抑制等多种生物调节功能。近期研究证实，多种细胞能够分泌外泌体，而外泌体内含有的活性物质及其参与的生物调节功能与其细胞来源密切相关。
诱导多能干细胞是一类与胚胎干细胞类似，具有多向分化潜能并能够持续自我更新的未分化细胞，利用干细胞移植治疗是治愈多种疾病的突破口。但由于干细胞移植会有成瘤风险，阻碍了其进一步应用。诱导多能干细胞来源的外泌体富含其来源细胞的特异性蛋白如Wnt-3、Oct-4蛋白及编码Oct-4、GATA-2、GATA-4、Nanog等早期多潜能性转录因子和MMP-9mRNA，利用干细胞来源的外泌体能够上调抗凋亡基因的表达，抑制受体细胞损伤后的凋亡，修复损伤组织，促进残余细胞增殖与再生。因此，无论是对诱导多能干细胞外泌体的理论研究还是临床应用都极具价值。
不同的培养方式及分离、收集方法都会影响外泌体特性及其内含的蛋白质、mRNA及microRNA等。诱导多能干细胞的培养方式复杂，需要滋养层细胞或含有多种添加物的培养基才能维持细胞的多能性和自我更新能力。而现有文献报道中外泌体收集培养基多采用无血清或低浓度去除外泌体的胎牛血清培养基，比如DMEM/F12+0.5％FBS，但无血清培养基因缺乏养分会致使细胞凋亡；而胎牛血清又因成份复杂，会影响诱导多能干细胞的未分化状态，导致其来源的外泌体失去干细胞特异性，严重影响其理论研究和临床应用的价值。因此建立一套完整的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的制备及应用方法具有重要的实用价值。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，针对现有诱导多能干细胞外泌体的提取培养基会影响细胞的未分化状态或使细胞凋亡，从而导致收集的外泌体丢失其来源细胞的特性，使其理论研究及临床应用失去价值这一现状，提供一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法，该提取培养基可用于提取诱导多能干细胞来源的外泌体，能够保持诱导多能干细胞多能性状态，对细胞的活性和干性不会造成影响，最大限度地保持干细胞来源的外泌体特性，具有巨大的应用前景。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其配方如下：
每100mL DMEM/F12中加入以下浓度组分：
而且，所述去除外泌体的血清替代物的制备步骤如下：
将血清替代物置于超速离心管中离心，120000g、4℃，离心16小时，吸管小心抽取上清，即得去除外泌体的血清替代物，分装后于-20℃保存。
而且，所述血清替代物为KnockOutTM血清替代物。
如上所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的制备方法，步骤如下：
以DMEM/F12为基础培养基，添加去除外泌体的血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇，混匀后，即得诱导多能干细胞外泌体提取培养基。
利用如上所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，步骤如下：
⑴诱导多能干细胞的培养：将诱导多能干细胞接种到由基质胶预包被的培养板中，加入人ES/iPS培养基，每天换液；
⑵诱导多能干细胞培养上清的收集：待诱导多能干细胞铺满培养板板底70％时，换为诱导多能干细胞外泌体提取培养基，每天收集培养上清，连续收集5天；
⑶膜过滤结合超速离心分离外泌体：
将收集培养上清在4℃条件下，300g离心10min，去除悬浮细胞；0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞和细胞碎片；超滤管浓缩培养上清，浓缩60-80倍；0.22μm滤膜过滤，去除大直径颗粒；120,000g 4℃条件下超速离心90min，所得沉淀即为外泌体，留取沉淀，PBS溶解，备用。
而且，所述步骤⑴中基质胶为Matrigel，所述人ES/iPS干细胞无血清培养基为mTeSRTM1培养基。
而且，所述由基质胶预包被的培养板为由质量浓度为4％的Matrigel、4℃包被过夜的培养板。
而且，所述每天为20-28小时。
而且，所述步骤⑶中超滤管浓缩培养上清时使用10KDAmicon Ultra 15进行浓缩。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明提取培养基可用于提取诱导多能干细胞来源的外泌体，能够保持诱导多能干细胞多能性状态，对细胞的活性和干性不会造成影响，最大限度地保持干细胞来源的外泌体特性，具有巨大的应用前景。
2、本发明提取培养基中采用去除外泌体的血清替代物代替胎牛血清，特别是采用了成份确定的KnockOutTM血清替代物，有效地避免了胎牛血清会导致诱导多能干细胞分化的问题，使提取的外泌体具备干细胞的特性，提高了诱导多能干细胞外泌体的利用价值；而且本发明提取培养基添加了L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇等各类物质，达到了很好的复合增效作用，从而有效地减低了在外泌体收集过程中其来源干细胞的分化和凋亡，在基础研究和临床应用上具有巨大的价值。
3、本发明首次使用去除外泌体的血清替代物并添加L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇配制诱导多能干细胞外泌体提取培养基，在外泌体的收集中产生意想不到的效果，可以连续5天有效地收集诱导多能干细胞来源的外泌体，且不会对细胞活性和干细胞特性造成影响，效果十分理想，无论是在基础科研还是临床应用中都具有很大的应用价值。
4、诱导多能干细胞对培养条件要求苛刻，需要滋养层细胞或添加多能细胞因子维持其未分化状态和活力，KnockOutTM是一种血清替代物，成分确定，既能够为诱导多能干细胞的培养提供所需养分，又不会引起其分化；KnockOutTM中含有大量的外泌体，采用过夜超速离心的方式制备ED-KSR能够有效地去除其中的外泌体成分，不会使后续的细胞来源的外泌体提取增加混杂因素。
5、使用本发明提取培养基收集外泌体后，诱导多能干细胞仍能保持多能分化状态，碱性磷酸酶染色阳性，表达多能干细胞标志。
附图说明
图1为本发明中应用提取培养基提取诱导多能干细胞外泌体的电镜图；
图2为本发明中应用提取培养基提取诱导多能干细胞外泌体的Western Blot图；
图3为本发明中应用提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后碱性磷酸酶染色图；
图4为本发明中应用提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后免疫荧光染色图；
图5为本发明中应用提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后流式细胞术检测细胞凋亡情况图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其配方如下：
每100mL DMEM/F12中加入以下浓度组分：
较优地，所述去除外泌体的血清替代物的制备步骤如下：
将血清替代物置于超速离心管中离心，120000g、4℃，离心16小时，吸管小心抽取上清，即得去除外泌体的血清替代物，分装后于-20℃保存。
较优地，所述血清替代物为KnockOutTM血清替代物。
如上所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的制备方法，步骤如下：
以DMEM/F12为基础培养基，添加去除外泌体的血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇，混匀后，即得诱导多能干细胞外泌体提取培养基。
利用如上所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，步骤如下：
⑴诱导多能干细胞的培养：将诱导多能干细胞接种到由基质胶预包被的培养板中，加入人ES/iPS培养基，每天换液；
⑵诱导多能干细胞培养上清的收集：待诱导多能干细胞铺满培养板板底70％时，换为诱导多能干细胞外泌体提取培养基，每天收集培养上清，连续收集5天；
⑶膜过滤结合超速离心分离外泌体：
将收集培养上清在4℃条件下，300g离心10min，去除悬浮细胞；0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞和细胞碎片；超滤管浓缩培养上清，浓缩60-80倍；0.22μm滤膜过滤，去除大直径颗粒；120,000g 4℃条件下超速离心90min，所得沉淀即为外泌体，留取沉淀，PBS溶解，备用。
较优地，所述步骤⑴中基质胶为Matrigel，所述人ES/iPS干细胞无血清培养基为mTeSRTM1培养基。
较优地，所述由基质胶预包被的培养板为由质量浓度为4％的Matrigel、4℃包被过夜的培养板。
较优地，所述每天为20-28小时。
较优地，所述步骤⑶中超滤管浓缩培养上清时使用10KD Amicon Ultra 15进行浓缩。
应用实例1
一、诱导多能干细胞外泌体的提取
主要试剂及仪器：DMEM/F12、KnockOutTM血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、β-巯基乙醇(均来自Thermo Fisher Scientific公司，美国)；Matrigel(Corning公司，美国)，mTeSRTM 1培养基(Stemcell公司，美国)，0.22μm一次性针头式滤器、0.45μm一次性针头式滤器、Amicon Ultra 15超滤管(均来自Merck Millipore公司，美国)，超速离心机(Hitachi，日本)。
A.提取培养基的制备
(1)去除外泌体的KnockOutTM血清替代物(ED-KSR)的制备：将KnockOutTM血清替代物置于超速离心管中，120000g，4℃，离心16小时，吸管小心抽取上清，分装后于-20℃保存。
(2)外泌体提取培养基的制备：以DMEM/F12为基础培养基，添加0.5％ED-KSR、1mML-谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸和0.1mMβ-巯基乙醇，制备外泌体收集培养基。具体配制方案如下：
每100mLDMEM/F12中加入以下浓度组分：
B.提取培养基的应用方法
(1)诱导多能干细胞的培养：将诱导多能干细胞接种到由Matrigel预包被的培养板中，加入mTeSRTM 1培养基，每天换液。
(2)诱导多能干细胞培养上清的收集：待诱导多能干细胞铺满培养板板底70％时，换为外泌体提取培养基，每天收集培养上清，连续收集5天。
C.膜过滤结合超速离心分离外泌体
将收集培养上清在4℃条件下，300g离心10min，去除悬浮细胞；0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞和细胞碎片；10KD Amicon Ultra 15超滤管浓缩培养上清，浓缩60-80倍；0.22μm滤膜过滤，去除大直径颗粒；120,000g 4℃条件下超速离心90min；所得沉淀即为外泌体，留取沉淀，PBS溶解。
二、诱导多能干细胞外泌体的鉴定
A.Western Blot检测外泌体标志蛋白
将分离得到的外泌体加入RIPA溶解，4℃孵育10min，使其充分裂解利用BCA法测定裂解物中蛋白浓度，取25g样品加入5×上样缓冲液，100℃变性5min，在十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上进行变性电泳；湿法转膜后将PVDF膜置于5％脱脂奶粉封闭2小时，加CD63，TSG101(1:1000)的抗体4℃过夜孵育，洗涤后加入相应的二抗(1:4000),室温孵育1小时；采用ECL化学发光显色，经显影、定影后扫描条带。
B.电镜检测外泌体形态
将分离得到的外泌体重悬在200μLPBS中，取10μL悬液滴至铜网栅中，使悬液在铜网上保留至少20min，4％戊二醛10μL固定5min，滤纸吸干，将铜网安装在Hitachi-7500透射电子显微镜下观察并拍照。
采用外泌体提取培养基收集的细胞培养上清，通过膜过滤结合超速离心法能够成功富集纯度高的诱导多能干细胞来源的外泌体。
透射电镜显示出提取外泌体分布直径为50-150nm，外形呈圆形或椭圆型，可见明显膜性结构，部分聚集成群分布，如图1所示。
Western Blot检测特异性蛋白CD9、CD63、Hsp70均表达，如图2所示。
应用实例2：诱导多能干细胞外泌体提取培养基的评价
A.碱性磷酸酶法检测诱导多能干细胞的特性：提取外泌体后的诱导多能干细胞样品使用4％(w/v％)多聚甲醛固定后，PBS洗涤3-5次，每次3-5分钟。按照如下比例依次加入各溶液，混匀后即配制成BCIP/NBT染色工作液。最后一次洗涤完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品。室温避光孵育30分钟，直至显色至预期深浅。去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤1-2次即可终止显色反应。
碱性磷酸酯酶显色缓冲液 3ml 10ml
BCIP溶液(300X) 10μl 33μl
NBT溶液(150X) 20μl 66μl
BCIP/NBT染色工作液 3.03ml 10.1ml
B.免疫荧光检测诱导多能干细胞的多能性标志：提取外泌体后的诱导多能干细胞样品使用4％(w/v％)的多聚甲醛室温下固定15min后，再用浓度为0.2％(v/v％)的Triton-X-100处理细胞10min。然后用BSA封闭细胞抗原30min，将一抗抗体加到培养孔里，放置在4℃条件下过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次，用相应的二抗在室温下孵育细胞1h。细胞核用DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)短暂染色，在荧光显微镜下观察细胞的变化。
C.流式检测诱导多能干细胞凋亡效率：提取外泌体后的诱导多能干细胞样品用不含EDTA的胰酶消化后，300g，4℃离心5min收集细胞。计数细胞，调整细胞密度为106，用预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5min收集细胞。吸弃PBS，加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞。加入5μLAnnexin V-FITC和10μLPI Staining Solution，轻轻混匀。避光、室温反应10-15min。加入400μL 1×Binding Buffer，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪或荧光显微镜检测。
碱性磷酸酶染色显示提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后，如图3所示，细胞仍能够显示干细胞特性，能够被碱性磷酸酶染色。
免疫荧光染色显示提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后，如图4所示，细胞仍能够表达Oct4、SOX2和SEEA4这3种干细胞的标志。
流式细胞术检测显示提取培养基培养诱导多能干细胞1、3、5天后，如图5所示，细胞活率仍能够达80％以上，显示出极好的活力。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

Claims (9)

1.一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其特征在于：其配方如下：
每100mL DMEM/F12中加入以下浓度组分：
2.根据权利要求1所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其特征在于：所述去除外泌体的血清替代物的制备步骤如下：
将血清替代物置于超速离心管中离心，120000g、4℃，离心16小时，吸管小心抽取上清，即得去除外泌体的血清替代物，分装后于-20℃保存。
3.根据权利要求3所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基，其特征在于：所述血清替代物为KnockOutTM血清替代物。
4.如权利要求1至3任一项所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的制备方法，其特征在于：步骤如下：
以DMEM/F12为基础培养基，添加去除外泌体的血清替代物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和β-巯基乙醇，混匀后，即得诱导多能干细胞外泌体提取培养基。
5.利用如权利要求1至3任一项所述的诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴诱导多能干细胞的培养：将诱导多能干细胞接种到由基质胶预包被的培养板中，加入人ES/iPS培养基，每天换液；
⑵诱导多能干细胞培养上清的收集：待诱导多能干细胞铺满培养板板底70％时，换为诱导多能干细胞外泌体提取培养基，每天收集培养上清，连续收集5天；
⑶膜过滤结合超速离心分离外泌体：
将收集培养上清在4℃条件下，300g离心10min，去除悬浮细胞；0.45μm滤膜过滤，进一步去除细胞和细胞碎片；超滤管浓缩培养上清，浓缩60-80倍；0.22μm滤膜过滤，去除大直径颗粒；120,000g 4℃条件下超速离心90min，所得沉淀即为外泌体，留取沉淀，PBS溶解，备用。
6.根据权利要求5所述的利用诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤⑴中基质胶为Matrigel，所述人ES/iPS培养基为mTeSRTM1培养基。
7.根据权利要求6所述的利用诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，其特征在于：所述由基质胶预包被的培养板为由质量浓度为4％的Matrigel、4℃包被过夜的培养板。
8.根据权利要求5所述的利用诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，其特征在于：所述每天为20-28小时。
9.根据权利要求5至8任一项所述的利用诱导多能干细胞外泌体提取培养基的提取外泌体的方法，其特征在于：所述步骤⑶中超滤管浓缩培养上清时使用10KD Amicon Ultra15进行浓缩。
CN201810647971.3A 2018-06-22 2018-06-22 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法 Pending CN108753697A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810647971.3A CN108753697A (zh) 2018-06-22 2018-06-22 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810647971.3A CN108753697A (zh) 2018-06-22 2018-06-22 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108753697A true CN108753697A (zh) 2018-11-06

Family

ID=63976361

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810647971.3A Pending CN108753697A (zh) 2018-06-22 2018-06-22 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108753697A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536440A (zh) * 2018-11-19 2019-03-29 深圳市第二人民医院 外泌体的提取方法
CN113358618A (zh) * 2021-06-04 2021-09-07 南京鼓楼医院 一种基于表面多刺编码微球的外泌体捕获方法
CN114836375A (zh) * 2020-12-31 2022-08-02 国典(北京)医药科技有限公司 一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用
CN117721070A (zh) * 2024-02-07 2024-03-19 国典(北京)医药科技有限公司 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101580816A (zh) * 2009-04-23 2009-11-18 中国科学院广州生物医药与健康研究院 诱导多能性干细胞快速高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法
CN107475187A (zh) * 2017-09-05 2017-12-15 山东艾克韦生物技术有限公司 培养液及大量获得脐带间充质干细胞外泌体的生产工艺
WO2018029656A2 (en) * 2016-08-12 2018-02-15 The University Of Chicago Methods for making and using therapeutic exosomes
CN107760654A (zh) * 2017-11-20 2018-03-06 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种无血清、无饲养层的小鼠诱导多能干细胞的培养基及其方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101580816A (zh) * 2009-04-23 2009-11-18 中国科学院广州生物医药与健康研究院 诱导多能性干细胞快速高效产生的新型无血清培养基以及使用其的方法
WO2018029656A2 (en) * 2016-08-12 2018-02-15 The University Of Chicago Methods for making and using therapeutic exosomes
CN107475187A (zh) * 2017-09-05 2017-12-15 山东艾克韦生物技术有限公司 培养液及大量获得脐带间充质干细胞外泌体的生产工艺
CN107760654A (zh) * 2017-11-20 2018-03-06 广东艾时代生物科技有限责任公司 一种无血清、无饲养层的小鼠诱导多能干细胞的培养基及其方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANGJIN LEE等: "Exosomes mediate the cytoprotective action of mesenchymal stromal cells on hypoxia-induced pulmonary hypertension", 《CIRCULATION》 *
JAN LÖTVALL等: "Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles", 《JOURNAL OF EXTRACELLULAR VESICLES》 *
LIJUAN CHEN等: "Cardiac progenitor-derived exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury", 《BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS》 *
YING LUO等: "Optimized culture methods for isolating small extracellular vesicles derived from human induced pluripotent stem cells", 《J EXTRACELL VESICLES》 *
YINGJIE WANG等: "Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF CARDIOLOGY》 *
储炬等主编: "12.4-动物细胞培养基", 《现代生物工艺学（上册）》 *
王振宇等主编: "17.3.4-影响分离的工艺参数因素", 《生物活性成分分离技术》 *
高佳佳等: "血清饥饿对结肠癌HCT116细胞外泌体分泌的影响", 《世界华人消化杂志》 *
高敦芹: "诱导多能干细胞来源小胞外囊泡提取方法的建立及优化", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)-基础科学辑》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109536440A (zh) * 2018-11-19 2019-03-29 深圳市第二人民医院 外泌体的提取方法
CN114836375A (zh) * 2020-12-31 2022-08-02 国典(北京)医药科技有限公司 一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用
CN114836375B (zh) * 2020-12-31 2023-07-21 国典(北京)医药科技有限公司 一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用
CN113358618A (zh) * 2021-06-04 2021-09-07 南京鼓楼医院 一种基于表面多刺编码微球的外泌体捕获方法
CN117721070A (zh) * 2024-02-07 2024-03-19 国典(北京)医药科技有限公司 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂
CN117721070B (zh) * 2024-02-07 2024-05-10 国典(北京)医药科技有限公司 一种用于hiPSC源外泌体纯度检测的方法及其专用消化剂

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108753697A (zh) 一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法
Cheng et al. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities
Gao et al. Expression pattern of embryonic stem cell markers in DFAT cells and ADSCs
CN104946590B (zh) 成人骨髓中Muse细胞诱导为神经前体细胞的方法
CN106834218A (zh) 人羊膜上皮干细胞无血清培养基及其培养方法
CN107254432B (zh) 一种同时分离尿源性干细胞两种亚群的培养基、分离方法及应用
CN107858328A (zh) 一种来自多能干细胞的神经嵴谱系间充质细胞及其诱导分化方法
CN107937338A (zh) 一种来自多能干细胞的中胚层谱系间充质干细胞及其制备方法
Song et al. In vitro culture, determination, and directed differentiation of adult adipose-derived stem cells towards cardiomyocyte-like cells induced by angiotensin II
CN105255826A (zh) 人诱导多功能干细胞向睾丸间质细胞的诱导分化方法及其用途
CN111621474A (zh) 间充质干细胞膜片及其制备方法
CN105754936A (zh) 人诱导性多能干细胞诱导为间充质干细胞的方法
CN102286532B (zh) 一种获得诱导性多能干细胞的方法
CN106520687A (zh) 一种诱导多能干细胞向间充质干细胞分化的方法
Li et al. Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells differentiate into epidermal-like cells using a novel co-culture technique
WO2023016029A1 (zh) 一种分离来源于人类诱导多能干细胞的成纤维细胞的方法及其应用
Sevastianov et al. Formation of tissue-engineered construct of human cartilage tissue in a flow-through bioreactor
Li et al. Agarose-based spheroid culture enhanced stemness and promoted odontogenic differentiation potential of human dental follicle cells in vitro
CN106939295A (zh) 多能性干细胞的非致瘤性增殖
CN108486039A (zh) 小分子诱导人脂肪干细胞分化为睾丸间质细胞的方法
US20100285585A1 (en) Method for extracellular matrix mediated differentiation and proliferation of stem cells
Talakoob et al. Capability of cartilage extract to in vitro differentiation of rat mesenchymal stem cells (MSCs) to chondrocyte lineage
Huang et al. Amniotic fluid mesenchymal stromal cells from early stages of embryonic development have higher self-renewal potential
KR20090130582A (ko) 배아줄기세포의 추출물을 이용한 맞춤형 만능줄기세포의유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포
CN105255821B (zh) 一种牙周膜干细胞的培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181106