CN114836375B - 一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用，属于生物技术领域。本发明提供的外泌体分泌诱导培养基仅可包含基础培养基和四种添加物：L‑抗坏血酸或其盐、硒或其盐、NaHCO₃和Insulin，其成分简单，但可以显著提高干细胞分泌的外泌体的产量，从而可以显著降低外泌体的生产成本；生产获得的外泌体可以更有效保护神经元免受损伤和改善衰老细胞情况。

Description

一种外泌体分泌诱导剂、诱导培养基及其应用

本申请为申请日2020年12月31日、申请号202011636845.1、发明名称“一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种外泌体分泌诱导剂及诱导培养基和应用其的外泌体的生产方法及应用，尤其涉及外泌体在制备改善衰老细胞情况和/或保护神经元的药物中的应用。

背景技术

外泌体是包含了复杂RNA和蛋白质的特异性分泌的小膜泡(30～150nm)，其参与细胞间通讯，调节多种组织器官的正常功能和损伤修复。

由于来源于不同的组织的外泌体具有其特异性蛋白分子和其行使功能的关键分子，因此来源于干细胞的外泌体具备干细胞的重要治疗作用且更加安全，可以有效转运具有疾病治疗作用的RNA和蛋白质等生物活性物质，具有抑制细胞凋亡、抑制炎症反应、促进血管生成、抑制纤维化、提高组织修复潜力等重要生物学功能。另外，外泌体还能够穿透血脑屏障，并且能够递送小分子药物等各种治疗分子，具有非常广阔的临床应用前景，因此从干细胞中高效生产获得这一类外泌体尤为重要。现有外泌体获取方式主要是细胞自分泌，然而其产量非常有限。

发明内容

针对现有技术中存在的问题的一个或多个，本发明的一个方面提供一种外泌体分泌诱导剂，其包含以下使用浓度的成分：

本发明另一方面提供一种外泌体分泌诱导培养基，其包含基础培养基和以下浓度的成分：

且所述外泌体分泌诱导培养基不包含Transferrin、FGF2和TGFβ1/NODAL的组合。

上述外泌体分泌诱导培养基为基础培养基和以下浓度的成分：

上述基础培养基为DMEM/F12。

本发明另一方面还提供一种生产外泌体的方法，其包括以下步骤：

1)将对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁培养至覆盖率达到60％～70％；

2)换用上述的外泌体分泌诱导培养基对步骤1)贴壁培养的干细胞进行外泌体分泌诱导培养20～30小时，取上清收获含外泌体的细胞培养液；

3)从步骤2)收获的含外泌体的细胞培养液中分离获得外泌体；

优选地，重复步骤2)2～3次，合并每次收获的含外泌体的细胞培养液，从所述合并的细胞培养液中分离获得外泌体。

上述方法中，步骤1)中所述干细胞选自胚胎干细胞、诱导多能干细胞和间充质干细胞。

上述方法中，步骤3)中所述分离的方法包括差速离心法、超滤离心法、密度梯度离心法、沉淀法、磁珠免疫法、PS亲和法、色谱法。

上述方法生产的外泌体或含外泌体的细胞培养液也在本发明的保护范围之内，所述外泌体的数量达到外泌体在干细胞中的分泌量≥1000个/细胞，所述外泌体的粒径为30～150nm(主要为50～80nm)，表面标志物中CD9占比≥23％，CD63占比≥10％。

上述的外泌体在制备改善衰老细胞情况和/或保护神经元的药物中的应用也属于本发明的内容。基于此，本发明还提供一种改善衰老细胞情况和/或保护神经元的药物，其包含上述的外泌体。

基于以上技术方案，本发明首次提供一种用于高效外泌体生产的外泌体分泌诱导剂，其可以仅包含L-抗坏血酸或其盐、硒或其盐、NaHCO₃和胰岛素四种成分，因此成分简单，并且当将其和用于干细胞(例如ESC或iPSC等)培养的基础培养基(例如DMEM/F12)组成外泌体分泌诱导培养基对贴壁生产良好的干细胞进行诱导培养时，可以显著促进干细胞中外泌体的分泌，进而显著提高外泌体的产量。实施例结果表明，使用本发明提供的外泌体分泌诱导培养基诱导培养贴壁良好的iPSC细胞的外泌体的产量(即分泌量)高达1000个/细胞以上。实施例结果还表明，本发明生产获得的外泌体可以在脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验，OGD)和脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验)中有效保护大鼠皮层神经元，同时可以有效保护氧化损伤造成的人类皮层神经元轴突断裂。

附图说明

图1为分别采用GDEV培养基、E8培养基培养iPSC细胞以及采用MSC培养基培养MSC细胞的外泌体产量柱状图；

图2为外泌体溶液中粒子浓度与粒径大小分布关系图；

图3为纳米流式检测外泌体表面标志物CD9与CD63的直方图；

图4为外泌体的电镜照片；

图5为人皮肤成纤维细胞、脐带间充质干细胞和神经元细胞摄入外泌体的Hoechst33342染色照片；

图6为脑卒中神经元模型中死细胞统计柱状图；

图7为人类皮层神经元损伤模拟Calcein AM/Hoechst染色照片；

图8为人类皮层神经元长度统计柱状图；

图9为脑卒中神经元模型中小鼠生存曲线；

图10为脑卒中神经元模型中小鼠脑梗死面积统计图。

具体实施方式

针对现有技术中存在的细胞自分泌的外泌体的产量低以及还没有用于外泌体生产的外泌体分泌诱导剂和外泌体分泌诱导培养基的缺陷，本发明旨在提供一种用于从干细胞(ESC或iPSC等)中高效生产外泌体且成分简单的外泌体分泌诱导剂和外泌体分泌诱导培养基，还提供了利用该诱导培养基生产外泌体的方法及生产获得的外泌体的应用。

Guokai Chen等人(文献1：Guokai Chen等.Chemically defined conditions forhuman iPSC derivation and culture，NATURE METHODS，2011年4月10日)和Senquan Liu等人(文献2：Senquan Liu等.Highly Purified Human Extracellular VesiclesProduced by Stem Cells Alleviate Aging Cellular Phenotypes of Senescent HumanCells，STEM CELLS，2019年2月27日)采用E8培养基常规培养干细胞(ESC或iPSC)，已经证明可以改善干细胞ESC和iPSC的衍生效率，E8培养基包含：DMEM/F12、L-Ascorbic Acid(L-抗坏血酸)、Selenium(硒)、Transferrin(转铁蛋白)、NaHCO₃、Insulin(胰岛素)、FGF2、TGFβ1/NODAL，其中Insulin和FGF2对于细胞存活和增殖是重要的，L-Ascorbic Acid促进ESC的增殖，Selenium对于持续培养扩繁至关重要，Transferrin有助于提高克隆效率，TGFβ1/NODAL有助于长期培养稳定性；然而，该E8培养基主要用于干细胞的增殖培养，将其用于培养干细胞生产外泌体的产量仍较低，难以满足高效生产外泌体的需求。在文献1和文献2公开的E8培养基的基础上，发明人惊讶发现，当仅使用E8培养基成分中的L-Ascorbic Acid、Selenium、Transferrin、NaHCO₃、Insulin四种成分配合用于干细胞培养的基础培养基时，可以有效诱导贴壁生长良好的干细胞大量分泌外泌体，进而显著提高外泌体的产量，满足高效生产外泌体的需求。

以下结合具体实施例和附图详细说明本发明的内容。

在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种试验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

以下实施例中以诱导多功能干细胞(iPSC)为例生产外泌体，iPSC细胞是将一些多能遗传基因导入皮肤等细胞中制造而成，通过让普通体细胞“初始化”，使其具备干细胞功能。iPSC不仅在细胞形态、生长特性，干细胞标志物表达等方面与胚胎干细胞(ESC)非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ESC几乎完全相同，因此利用ESC也同样可以实现本发明的目的。

实施例1：外泌体分泌诱导培养基及其使用方法

本实施例为适应高产量外泌体生产，提供一种用于高效生产外泌体的外泌体分泌诱导培养基。

配制用于本发明从干细胞(ESC或iPSC等)中高效生产外泌体的外泌体分泌诱导培养基(命名为GDEV培养基)，其成分包含：作为基础培养基的DMEM/F12(Gibco11330032)和外泌体分泌诱导剂。该外泌体分泌诱导剂为以下使用浓度的成分：浓度为64mg/L的L-Ascorbic acid 2phosphate magnesium salt(L-抗坏血酸二磷酸镁盐，Sigma-AldrichA8960)、浓度为14μg/L的sodium selenium(钠硒，Sigma-Aldrich S5261)、浓度为543mg/L的NaHCO₃(Sigma-Aldrich S5761)、浓度为19.4mg/L的Insulin(胰岛素，普西唐I10022)。

作为对照，按照文献1公开的方法配制其E8培养基，具体为：DMEM/F12、64mg/LL-Ascorbic acid 2phosphate magnesium salt(L-抗坏血酸二磷酸镁盐)、14μg/L sodiumselenium、100μg/L FGF2(成纤维细胞生长因子2)、19.4mg/L insulin、543mg/L NaHCO₃、10.7mg/L transferrin(转铁蛋白)、2μg/L TGFβ1(转化生长因子-β1)或100μg/L Nodal。

利用上述配制的GDEV培养基和E8培养基分别对贴壁覆盖率达到60％～70％的iPSC细胞进行诱导培养，随后收集iPSC细胞培养上清中的外泌体并对外泌体的含量进行检测，具体操作包括以下步骤。

1.1、细胞培养

对iPSC细胞(国典(北京)医药科技有限公司商品)进行扩增培养(例如使用Essential 8^TM Medium试剂盒(购自thermo fisher，货号：A1517001)进行常规扩增培养)至对数生长期且状态良好，按照Versene Solution试剂盒(购自Thermo Fisher公司，货号15040066)的技术手册消化成小细胞团(3-10个细胞)，然后将其铺在玻连蛋白(购自Peprotech公司的Recombinant Human Vitronectin，货号140-09)包被的10cm细胞培养皿中，贴壁后覆盖率达到60％～70％，37℃，95％空气和5％CO₂气氛下培养过夜。如果iPSC贴壁状况良好，换液为GDEV培养基或E8培养基，24h后换液收取细胞培养上清，重复上一步操作，一批细胞可收取2～3次。

同步利用MSC的XF人间充质干细胞无血清培养基(BI，实施例中命名为MSC培养基)培养人间充质干细胞(MSC，按照常规分离方法获取)获取细胞培养上清。

1.2、收集细胞培养上清中的外泌体

分别取上述步骤1.1中利用GDEV培养基、E8培养基和MSC培养基诱导培养细胞获得的细胞培养上清在3000g条件下室温离心15min，去除死细胞和细胞碎片。收集上清液，0.22μm滤器过滤；将滤出液转移至Amicon Ultra-15(100kDa)或Centricon Plus-70(100kDa)超滤管中浓缩，3000g室温离心30min。用DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)将浓缩液按照约1：100进行稀释，然后使用相同的装置再次浓缩。即可得到较为纯净的外泌体溶液。该步骤采用超滤法分离细胞培养上清中的外泌体。也可以采用差速离心法、密度梯度离心法、沉淀法、磁珠免疫法、PS亲和法、色谱法等分离细胞培养上清中的外泌体。

1.3、外泌体产量检测

分别取20μl以上步骤1.2收集的分别由GDEV培养基、E8培养基和MSC培养基培养获得的外泌体溶液，用PBS稀释至100μl，加入纳米流式检测仪(品牌：NANOFCM)，按照仪器技术手册操作，获得各自的外泌体产量。

结果如下表1和图1所示，可见使用GDEV培养基诱导培养iPSC可以获得更多的外泌体(1013.9个/细胞)，是使用文献1公开的E8培养基诱导培养iPSC细胞获得的外泌体个数(187.5个/细胞)的5.4倍。同时比较了使用GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体的产量与使用MSC培养基诱导培养MSC获得的外泌体的产量，可见前者是后者的59倍。表明GDEV培养基相对于E8培养基和MSC培养基可以显著提高干细胞(例如iPSC)生产外泌体的产量。另一方面，从组成上比较，GDEV培养基中仅包括五种成分，其相对于包括八种成分的E8培养基组成简单，却能大幅提高外泌体的产量，进而能显著降低外泌体的生产成本。

表1：不同培养基培养细胞生产外泌体的产量

	GDEV培养基	E8培养基	MSC培养基
				外泌体产量(个/细胞)	1013.9	187.5	17.1

1.4、外泌体的鉴定：粒径分析、纳米流式检测和电镜分析

1.4.1、外泌体粒径分析

取20μl由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体溶液，用PBS稀释至100μl，加入纳米流式检测仪(品牌：NANOFCM)，按照仪器技术手册操作，如图2所示，得到粒子大小分布图，可见生产得到的外泌体溶液中粒径大小为50～80nm(约为60nm)的粒子的浓度最高，符合iPSC分泌的外泌体的粒子粒径大小的范围(30～150nm)，证明获得了外泌体。本发明采用纳米流式检测仪检测由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体的粒径主要为50～80nm，当采用其他方法检测时，可能会获得30～150nm范围内的其他范围粒径大小。

1.4.2、纳米流式检测外泌体表面标志物

在10μg由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体溶液中加入1μl抗体(CD9抗体或CD63抗体)。加入抗体后将离心管盖紧，涡旋振荡器混匀1min，再37℃避光孵育30min；向孵育后的外泌体-抗体复合物中加入1mL的1×PBS混匀，按照上述步骤1.2中的外泌体分离方法再次提取外泌体以去除游离染料；标记后的外泌体进行纳米流式检测。

结果如图3所示，为纳米流式检测外泌体表面标志物CD9与CD63的直方图，可见标记后的外泌体表面标志物中CD9和CD63阳性颗粒占总颗粒数的比例分别是25.8％和11.9％，证明由GDEV培养基诱导培养iPSC确实获得了外泌体。

1.4.3、电镜检测外泌体形态

(1)将外泌体固定在载样铜网上：将50μl由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体溶液与等量4％PFA固定液(多聚甲醛溶液)混合得到外泌体悬液，将5μl外泌体悬液加到Formvar-carbon载样铜网上；将100μl PBS加到封口膜上。用镊子将铜网(Formvar膜面朝下)放在PBS液滴上清洗；将铜网放在50μl 1％戊二醛液滴上5min；放在100μl ddH₂O中2min(洗8次)。

(2)外泌体负染色处理及电镜检测：将铜网放在50μl草酸双氧铀液滴上5min；将铜网放在50μl甲基纤维素液滴上10min，冰上操作；铜网放到样品台顶端的不锈钢环上，在滤纸上吸去多余液体；空气中干燥5min到10min；80kV下拍摄电镜照片。

结果如图4所示，为由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体的电镜照片，可见生产的外泌体具有外泌体典型结构(通常为茶托型或一侧凹陷的半球形)。

实施例2：外泌体分泌诱导剂

本实施例为适应高产量外泌体生产，提供一种用于高效生产外泌体的外泌体分泌诱导剂。

按照下表2配制本发明提供的用于高效生产外泌体的外泌体分泌诱导剂(分别命名为GD1、GD2和GD3，其中各成分的浓度为在基础培养基DMEM/F12中的浓度)，将各外泌体分泌诱导剂与基础培养基DMEM/F12按照上述实施例1中步骤1.1至1.3的操作诱导培养iPSC，随后收集细胞培养上清中的外泌体，并分别对外泌体含量进行检测，结果如下表3所示。

表2：外泌体分泌诱导剂的配方

表3：使用GD1、GD2和GD3诱导剂和基础培养基DMEM/F12诱导培养iPSC的外泌体产量

诱导剂	基础培养基	外泌体产量(个/细胞)
			GD1	DMEM/F12	1171
GD2	DMEM/F12	1092
			GD3	DMEM/F12	1208

由上表2和表3结果可知，本发明提供的用于高效生产外泌体的外泌体分泌诱导剂(包含使用浓度为15-100mg/L的L-抗坏血酸二磷酸镁盐、使用浓度为2-100μg/L的钠硒、使用浓度为200-1000mg/L的NaHCO₃和使用浓度为5-30mg/L的胰岛素)配合使用基础培养基DMEM/F12对贴壁生长良好的iPSC细胞进行诱导培养时，可以显著促进iPSC细胞分泌外泌体，外泌体的产量(即分泌量)均在1000个/细胞以上，实现高效生产外泌体的目的。并且本发明提供的外泌体分泌诱导剂可仅包含四种成分，因此成分简单，易于配制。

本发明首次提供一种用于高效生产外泌体的外泌体分泌诱导剂，该诱导剂中包含的成分除了可以是上述的L-抗坏血酸二磷酸镁盐和钠硒外，还可以是L-抗坏血酸或其其他盐以及硒或其其他盐。其中L-抗坏血酸(维生素C)是保持体内和体外细胞健康生长和维持的必需维生素，又是一种水溶性抗氧化剂，可防止酯化和非酯化不饱和脂肪酸的过氧化，但是在本发明提供的外泌体分泌诱导剂中，当其浓度低于15mg/L或高于100mg/L时，均会影响干细胞的生长状态，可能导致外泌体分泌量降低；硒是体内和体外正常细胞生长和发育的必需微量元素，它能够掺入酶中并通过将过氧化物、有机氢过氧化物和过氧亚硝酸盐还原成无害物质来保护细胞，具有各种抗氧化功能和不同底物特异性的含硒酶位于细胞内、细胞表面和细胞外，这些酶共同构成了完善的氧化损伤防御系统，但是在本发明提供的外泌体分泌诱导剂中，当其浓度低于2μg/L或高于100μg/L时都会影响干细胞的生长状态，可能导致外泌体分泌量降低；细胞培养时，细胞可在开放体系中(培养基上层空气和培养箱中空气可以自由交换)生长，需要含一定浓度NaHCO₃浓度的溶液维持pH，因此体系中NaHCO₃浓度太高或太低，可能会影响细胞的生长状态，进而影响细胞外泌体的分泌；胰岛素可刺激细胞对尿苷和葡萄糖的吸收以合成RNA、蛋白质和脂质，还能与细胞膜上的胰岛素受体结合而调控细胞内的多种代谢途径，增加脂肪酸和葡萄糖的合成，被认为是用来调控大部分细胞生长和分化的关键因子，对细胞生长起重要作用，但是在本发明提供的外泌体分泌诱导剂中，当其浓度低于5mg/L或高于30mg/L时，细胞可能会出现形态异常和生长速率紊乱的现象，可能导致外泌体分泌量降低。因此，为了稳定提高外泌体产量，将本发明提供的外泌体分泌诱导剂中L-抗坏血酸或其盐的使用浓度限定在15-100mg/L范围内，可选为15-50mg/L、15-64mg/L、50-64mg/L、50-100mg/L、64-100mg/L等；硒或其盐的使用浓度限定在2-100μg/L范围内，可选为2-14μg/L、2-20μg/L、14-20μg/L、14-100μg/L、20-100μg/L等；NaHCO₃的使用浓度限定在200-1000mg/L范围内，可选为200-500mg/L、200-543mg/L、500-543mg/L、500-1000mg/L、543-1000mg/L等；胰岛素的使用浓度限定在5-30mg/L范围内，可选为5-19.4mg/L、5-20mg/L、19.4-20mg/L、19.4-30mg/L、20-30mg/L等。

实施例3：外泌体的应用

该实施例利用上述实施例1由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体溶液验证其在脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验，OGD)、改善衰老细胞情况、脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验)中的效果。

3.1、外泌体的摄取

1)按照PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit(购自Sigma公司，货号MINI26)试剂盒的技术手册用PKH26标记外泌体溶液，利用Exosome Spin Columns(MW3000)(购自Invitrogen公司，货号4484449)试剂盒的技术手册去除多余的染料，获得标记的外泌体溶液。

2)按外泌体：细胞为10000：1的数量比例，将标记的外泌体溶液分别加入人皮肤成纤维细胞、脐带间充质干细胞和神经元细胞(国典(北京)医药科技有限公司商品，人皮肤成纤维细胞培养基是DMEM+15％FBS+NEAA、脐带间充质干细胞培养基是DMEM+10％FBS，神经元细胞培养基是B27+Neurobasal+GlutaMAX，培养条件均为37℃，5％CO₂)培养液，置于37℃，95％空气和5％CO₂孵箱共孵育24小时，用PBS洗一遍细胞，加入Hoechst 33342(购自Sigma-Aldrich)至终浓度5μg/ml染色细胞核，荧光显微镜下拍照。

结果如图5所示，示出的是实施例1中由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体的细胞摄取情况，其中A幅为加入外泌体的脐带间充质干细胞；B幅为加入外泌体的人皮肤成纤维细胞；C幅为加入外泌体的人神经元细胞；H为Hoechst 33342信号，指示细胞核；P为PKH26信号，指示外泌体。明显可见，外泌体可以被人皮肤成纤维细胞、脐带间充质干细胞和神经元细胞摄入细胞内。

3.2、外泌体在脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验，OGD)中有效保护大鼠皮层神经元

(1)使用原代大鼠神经元体外培养14天后，将神经元培养液换为无糖无氧培养液(提前用95％N₂/5％CO₂平衡)，神经元在OGD chamber中放置90分钟(用95％N2/5％CO2充气10分钟)；

(2)处理结束后对照组(命名为OGD组)换为正常神经元培养液，实验组1(命名为iPSC EV组)换为正常神经元培养液并加入1μg/ml或0.2μg/ml iPSC外泌体(即实施例1由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的GDEV外泌体)，实验组2(命名为MSC组)换为正常神经元培养液并加入1μg/ml或0.2μg/ml MSC外泌体(即实施例1中由MSC培养基培养MSC生产获得的MSC外泌体)，实验组3(命名为E8组)换为正常神经元培养液并加入1μg/ml或0.2μg/ml E8外泌体(即实施例1中由E8培养基诱导培养iPSC生产获得的E8外泌体)，然后放入95％空气/5％CO₂孵箱中培养24小时后用Hoechst 33342/PI染色，用高内涵拍照进行神经元活性分析。

结果如图6所示，其为统计的死细胞比例柱状图，其中NO OGD表示未进行OGD模型，DPQ表示加入DPQ(PARP-1(聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1)的抑制剂)处理细胞，DPQ已证实在局部缺血影响下，可以降低细胞凋亡。可见相对于对照组(OGD组)、实验组2(即MSC组)和实验组3(即E8组)死细胞比例均明显降低，在相同的外泌体添加浓度下，实验组1(即iPSCEV组)的死细胞比例较实验组3(即E8组)和实验组2(即MSC组)显著降低，表明由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体在OGD模型中可以更有效保护大鼠皮层神经元。

3.3、外泌体可以有效保护氧化损伤造成的神经元轴突断裂

通过双氧水损伤人类皮层神经元模拟衰老相关的神经细胞氧化损伤。具体包括以下步骤：

(1)复苏正常人的iPSC分化的皮层神经元，铺96孔板，培养成熟7天，除了不作处理的对照组外，实验组1配制Neurobasal Medium(B27+Neurobasal+GlutaMAX)加入H₂O₂至终浓度为20μM(命名为H₂O₂组)，实验组2配制Neurobasal Medium加入H₂O₂至终浓度为20μM，同时加入实施例1中由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的iPSC外泌体至终浓度5μg/ml(命名为H₂O₂+EV组)，完全换液，建立双氧水的损伤模型；

(2)加入双氧水处理16h后，使用Calcein AM/Hoechst染色神经元，高内涵拍照，统计神经元突起长度等数据。

结果如图7和图8所示，其中图7为Calcein AM/Hoechst染色神经元照片，图8为各组神经元长度统计柱状图。可见H₂O₂+EV组中加入iPSC外泌体后，神经元轴突长度显著长于未加外泌体组(即H₂O₂组)的细胞，因此外泌体可以有效保护氧化损伤造成的神经元轴突断裂。

3.4、外泌体在脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验)中有效保护大鼠皮层神经元

大脑中动脉闭塞(MCAO)造模方案为：取18只雄性C57小鼠(8-12周，购自维通利华动物技术有限公司)进行MCAO造模。同时，6只雄性C57小鼠(8-12周)进行sham，作为假手术组对照。使用麻醉剂按1.5-2％异氟烷将小鼠麻醉，使用加热垫在使小鼠在整个手术过程中保持37℃。将线栓通过右侧颈外动脉的小切口插入右侧颈内动脉，缓慢推过右侧颈内动脉，直至到达大脑中动脉基底部，阻断进入大脑中动脉脑区的血流。阻断60min后，取出线栓进行再灌注。在整个造模过程中用激光多普勒血流计监测流向大脑的血流。

造模成功后，GDEV治疗组6只小鼠分别在造模后2h，24h，3天和5天尾静脉注射iPSC外泌体(250μg/ml，即实施例1中由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体)200μl，即50μg/只/次；MSC EV治疗组6只小鼠分别在造模后2h，24h，3天和5天尾静脉注射等体积间充质干细胞外泌体(250μg/ml，即实施例1中由MSC培养基培养MSC获得的外泌体)200μl，即50μg/只/次；脑卒中后未治疗组6只小鼠分别在造模后2h，24h，3天和5天尾静脉注射等体积DPBS200μl；Sham组(即未脑卒中对照)不做任何处理。小鼠按以上相应分组处理后，饲养8天并记录小鼠死亡情况，在第8天时处死，做生存曲线。

结果如图9和图10所示，其中图9为各组小鼠生存曲线结果，可见GDEV治疗组第8天生存率为83.3％，显著高于MSC EV治疗组(30％)和脑卒中后未治疗组(50％)。图10中A幅为各组小鼠处死后取脑，切片后进行TTC染色展示的脑卒中造成的脑梗死面积，其中白色区域是缺血梗死区域；B幅为各组小鼠脑梗死面积统计柱状图，可见GDEV治疗组小鼠的脑梗死面积显著小于脑卒中后未治疗组和MSC EV治疗组，表明相对于实施例1中由MSC培养基培养MSC获得的外泌体，由GDEV培养基诱导培养iPSC获得的外泌体在脑卒中神经元模型(糖氧剥夺试验)中更加有效保护大鼠皮层神经元。

综上实施例1-3的结果，可见在对数生长期且生长状态良好的干细胞贴壁培养至覆盖率达到60％～70％后由本发明提供的培养基(GDEV培养基)继续培养干细胞可以获得较高产量的外泌体，达到1000个外泌体/细胞以上；并且本发明提供的GDEV培养基在DMEM/F12作为基础培养基的基础上仅包括L-抗坏血酸及其盐、硒及其盐、NaHCO₃和胰岛素四种成分作为主要成分，因此该GDEV培养基成分简单，配制容易，可以显著降低外泌体的生产成本。另一方面，由本发明提供的方法获得的外泌体相对于由现有的E8培养基以及MSC培养基培养干细胞获得的外泌体在保护神经元免受损伤和改善衰老细胞情况方面具有更优的效果，因此本发明提供的外泌体更加适合用于制备改善衰老细胞情况和/或保护神经元的药物。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种外泌体分泌诱导剂或外泌体分泌诱导培养基在生产外泌体中的应用，其特征在于，所述外泌体分泌诱导剂为以下使用浓度的成分：

L-抗坏血酸或其盐 15-100 mg/L；

硒或其盐 2-100 µg/L；

NaHCO₃ 200-1000 mg/L；

胰岛素 5-30 mg/L；

所述外泌体分泌诱导培养基包含基础培养基和所述外泌体分泌诱导剂：

且所述外泌体分泌诱导培养基不包含Transferrin、FGF2和TGFβ1/NODAL的组合。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用包括使用权利要求1提及的外泌体分泌诱导剂或外泌体分泌诱导培养基诱导干细胞分泌生产外泌体，其中所述干细胞选自诱导多能干细胞和间充质干细胞。