CN115521908A - 一种脂肪间充质干细胞的体外培养及外泌体的分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及间充质干细胞技术领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞的体外培养及外泌体的分离纯化方法，将脂肪组织转移至T175细胞培养瓶，处理后得到第一脂肪组织；将第一脂肪组织转移至离心管中，加入胶原蛋白酶，消化，得到第二脂肪组织；在第二脂肪组织中加入氯化钠注射液，混匀，过筛，将滤液进行离心，分离出上清液，得到第三脂肪组织；在第三脂肪组织中加入重悬细胞，细胞计数，将细胞悬液接种至T175培养瓶，并置于CO2恒温培养箱中培养。借此，本发明可以刺激细胞大量分泌细胞因子，提高脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体的数量，并可以使脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体维持较好的状态。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞技术领域，尤其涉及一种脂肪间充质干细胞的体外培养及外泌体的分离纯化方法。
背景技术
人体脂肪组织主要由大量群集的脂肪细胞构成，其中存在一些干细胞群，被称为脂肪组织来源的间充质干细胞，简称脂肪间充质干细胞，是一种具有多向分化潜能的干细胞。外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的膜性囊泡，几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体，它是一种直径为30-100nm的纳米级脂质包裹体结构，内部包裹了蛋白、mRNA和微小RNA(microRNA)、非编码RNA(lncRNA)、DNA、脂质等物质。
目前，通用的外泌体分离纯化方法得到的间充质干细胞外泌体数量非常的少，培养的细胞数和分泌的外泌体数的比大约为1：3，也就是说，目前培养的间充质干细胞只分离纯化得到很少量的外泌体，若要提炼出外泌体用于临床，必须培养大量干细胞，这样会产生巨大成本而失去实际应用意义。此外，目前正常培养的间充质干细胞的外泌体中含有的活性成分只是细胞间维持相互关系的成分例如主要含有G蛋白(调节细胞生化功能)，而激活修复组织细胞的成分含量较少，例如成纤维细胞生长因子(FGF)。
针对脂肪间充质干细胞的体外培养，实验室通常采用在细胞培养瓶中进行多次扩增与传代的培养方式，但是大量传代培养以后，只有少部分细胞仍能保持其多潜能性，而有些细胞则向特定的方向分化或者开始衰老，生长速度逐渐变慢，细胞形态也由长梭形变的扁平粗大，进而失去临床上的使用价值，使用于细胞治疗的细胞数量非常有限。另外实验室在培养过程中需要添加胎牛血清(FBS)来促进细胞的生长，不仅增加了收获细胞携带病原体、异种抗原的可能性，并且常常导致各批细胞间不稳定因素产生，美国FDA命令禁止将FBS培养的细胞用于细胞治疗。因此，寻找新的可应用于临床细胞治疗的脂肪间充质干细胞培养方法具有重要的应用价值。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞的体外培养及外泌体的分离纯化方法，其使用先进的细胞工厂培养容器作为载体，模拟体内环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体的数量。
为了实现上述目的，本发明提供一种脂肪间充质干细胞的体外培养方法，包括如下步骤：
步骤一脂肪组织的清洗
取人脂肪组织，置于无菌储存容器中，将上层脂肪组织转移至T175细胞培养瓶，进行预处理，得到第一脂肪组织。
步骤二脂肪组织的消化
将所述第一脂肪组织转移至离心管中，按体积比1:0.9～1.1加入36～38℃预热的0.18～0.21％II型胶原蛋白酶，封口后放入36～38℃水浴锅中，消化 60～65min，得到第二脂肪组织。
步骤三脂肪组织的离心
弃掉所述第二脂肪组织的最上层颜色较深的油脂，终止消化，在所述第二脂肪组织中加入0.8～1.1％氯化钠注射液，混匀，过筛，将滤液进行离心，分离出上清液，得到第三脂肪组织。
步骤四脂肪间充质干细胞的培养
在所述第三脂肪组织中加入重悬细胞，细胞计数，将细胞悬液接种至T175 培养瓶，并置于CO2恒温培养箱中培养，47～49h换液，之后隔天换液，培养12～14 天收获P0代细胞。
根据本发明的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，步骤一中的所述预处理包括如下步骤：
加入1.9～2.1倍体积的0.8～1.1％氯化钠注射液，震荡混匀并静置2～3min，取上层黄色组织，重复上述操作3～4次，直至下层液体不浑浊，底部无血污。
根据本发明的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，在步骤二中的所述消化过程中，每隔10min将离心管晃动均匀。
根据本发明的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，步骤三中所述过筛的筛网目数为90～110。
根据本发明的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，步骤四中的所述CO2恒温培养箱的温度设置为36～38℃。
本发明还提供一种脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、收集的脂肪间充质干细胞培养上清液分装于离心管中进行第一次离心。
B、第一次离心完成后，过滤，并将滤液转至100KD超滤浓缩离心管中，于高速离心机中进行第二次离心，得到浓缩液。
C、重复所述第二次离心，直至浓缩液浓缩倍数达到8～10倍。
D、将所述浓缩液分装于离心管或冻存管中，封口后，于-75～85℃保存。
根据本发明的脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，所述过滤在 0.22μM无菌真空过滤器中进行。
根据本发明的脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，所述第二次离心的温度控制在3～6℃。
根据本发明的脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，浓缩液的浓缩倍数为8～10倍。
本发明的目的在于提供一种脂肪间充质干细胞的体外培养及外泌体的分离纯化方法，使用先进的细胞工厂培养容器作为载体，模拟体内环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体的数量。综上所述，本发明的有益效果是：可以刺激细胞大量分泌细胞因子，提高脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体的数量，并可以使脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体维持较好的状态。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的体外培养方法，包括如下步骤：
步骤一脂肪组织的清洗
取人脂肪组织，置于含保存液的无菌储存容器中，将上层脂肪组织转移至 T175细胞培养瓶(用10mL移液管吸取下层液体转移至废液瓶中)，加入1.9～2.1 倍体积的0.8～1.1％氯化钠注射液，震荡混匀并静置2～3min，取上层黄色组织，重复上述操作3～4次，直至下层液体不浑浊，底部无血污，得到第一脂肪组织。
步骤二脂肪组织的消化
将第一脂肪组织转移至50mL离心管中(如有大块组织块，需在无菌培养皿中，用无菌精细剪剪碎)，按体积比1:0.9～1.1加入36～38℃预热的0.18～0.21％II 型胶原蛋白酶，封口后放入36～38℃水浴锅中，消化60～65min(每隔10min将离心管晃动均匀)，得到第二脂肪组织。
步骤三脂肪组织的离心
弃掉第二脂肪组织的最上层颜色较深的油脂，加入等体积的培养基作为终止液终止消化，在第二脂肪组织中加入适量含抗生素的0.8～1.1％氯化钠注射液，混匀，过90～110目筛网，将滤液进行离心(300g，10min)，分离出上清液(将上清液倒入另一新的50mL离心管中，封口留样)，得到第三脂肪组织。
步骤四脂肪间充质干细胞的培养
在第三脂肪组织中加入适量含抗生素完全培养液重悬细胞，按每瓶10mL 原脂肪组织体积确定接种瓶数，向培养瓶中加入含抗生素的完全培养液，将细胞悬液接种至T175培养瓶，终体积为20mL/瓶，接入T175细胞培养瓶中，置于CO2恒温培养箱(36～38℃)中培养，47～49h换液，之后隔天换液，(即48 小时后，进行第一次全量换液操作，用25mL移液管将瓶内培养液吸取废弃，重新向每个培养瓶中加入20mL含抗生素的完全培养液；第4～5天，进行第二次全量换液操作)，培养12～14天收获P0代细胞。
细胞长满90％以上后，加入0.15％胰蛋白酶5mL，消化3～5min，加入7mL 培养基终止消化，收集细胞计数，按照2×106个/瓶，共20mL接种到T175瓶中，置于CO2恒温培养箱中36～38℃培养，24～25h镜检，72～96h后收获P1代细胞。
按照上述步骤培养至P4代细胞，接种到细胞工厂中(上述细胞工厂接种量与体积均为T175瓶的36倍)，细胞工厂置于CO2恒温培养箱中36～38℃培养， 24～25h镜检，72～96h后按照上述步骤收获P5代细胞。加入细胞冻存液重悬细胞，转入-80℃冰箱冻存。次日转入液氮冻存。
本发明还提供一种间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，包括如下步骤：
A、收集的脂肪间充质干细胞培养上清液分装于50mL离心管中进行第一次离心(500g，10min)。
B、第一次离心完成后，取上清液放入0.22μM无菌真空过滤器中，真空过滤，并将滤液转至6支100KD超滤浓缩离心管中，每支离心管装16mL过滤液，于高速离心机中进行第二次离心(4000g，10min)，温度3～6℃。
C、第二次离心结束后，观察每支离心管中浓缩液的体积，计算离心前后的总体积比，得到浓缩液(若体积加起来大于9mL，即浓缩倍数小于8，则重复上述第二次离心步骤，直至浓缩倍数为8～10倍)。
D、吸取浓缩液于15mL离心管中(若不足9mL，用0.9％氯化钠注射液补充)，然后再吸取浓缩液于洁净的培养瓶中，并倒去离心管底部滤过液。
E、将浓缩液分装于15mL离心管或5mL冻存管中，用封口膜封口，贴上对应的标签，于-75～85℃保存。
本发明提供了一种脂肪间充质干细胞的体外培养及外泌体的分离纯化方法，使用先进的细胞工厂培养容器作为载体，模拟体内环境，刺激细胞大量分泌细胞因子，提高脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体的数量。综上所述，本发明的有益效果是：可以刺激细胞大量分泌细胞因子，提高脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体的数量，并可以使脂肪间充质干细胞的增值及生产的外泌体维持较好的状态。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (9)
1.一种脂肪间充质干细胞的体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一脂肪组织的清洗
取人脂肪组织，置于无菌储存容器中，将上层脂肪组织转移至T175细胞培养瓶，进行预处理，得到第一脂肪组织；
步骤二脂肪组织的消化
将所述第一脂肪组织转移至离心管中，按体积比1:0.9～1.1加入36～38℃预热的0.18～0.21％II型胶原蛋白酶，封口后放入36～38℃水浴锅中，消化60～65min，得到第二脂肪组织；
步骤三脂肪组织的离心
弃掉所述第二脂肪组织的最上层颜色较深的油脂，终止消化，在所述第二脂肪组织中加入0.8～1.1％氯化钠注射液，混匀，过筛，将滤液进行离心，分离出上清液，得到第三脂肪组织；
步骤四脂肪间充质干细胞的培养
在所述第三脂肪组织中加入重悬细胞，细胞计数，将细胞悬液接种至T175培养瓶，并置于CO2恒温培养箱中培养，47～49h换液，之后隔天换液，培养12～14天收获P0代细胞。
2.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤一中的所述预处理包括如下步骤：
加入1.9～2.1倍体积的0.8～1.1％氯化钠注射液，震荡混匀并静置2～3min，取上层黄色组织，重复上述操作3～4次，直至下层液体不浑浊，底部无血污。
3.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，其特征在于，在步骤二中的所述消化过程中，每隔10min将离心管晃动均匀。
4.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤三中所述过筛的筛网目数为90～110。
5.根据权利要求1所述的脂肪间充质干细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤四中的所述CO2恒温培养箱的温度设置为36～38℃。
6.一种脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、收集的脂肪间充质干细胞培养上清液分装于离心管中进行第一次离心；
B、第一次离心完成后，过滤，并将滤液转至100KD超滤浓缩离心管中，于高速离心机中进行第二次离心，得到浓缩液；
C、重复所述第二次离心，直至浓缩液浓缩倍数达到8～10倍；
D、将所述浓缩液分装于离心管或冻存管中，封口后，于-75～85℃保存。
7.根据权利要求6所述的脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于，所述过滤在0.22μM无菌真空过滤器中进行。
8.根据权利要求6所述的脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于，所述第二次离心的温度控制在3～6℃。
9.根据权利要求6所述的脂肪间充质干细胞外泌体的分离纯化方法，其特征在于，浓缩液的浓缩倍数为8～10倍。
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