JP5275711B2

JP5275711B2 - 幹細胞から分化誘導した角化細胞及び人工表皮シート

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Publication number: JP5275711B2
Application number: JP2008190270A
Authority: JP
Inventors: 知久吉村; 靖司長谷川; 祐一長谷部; 勉坂井田; 悟中田
Original assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Current assignee: Nippon Menard Cosmetic Co Ltd
Priority date: 2008-07-23
Filing date: 2008-07-23
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2028-07-23
Also published as: JP2010022327A

Description

本発明は、アオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物および該成分の持つ、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進効果による、幹細胞から皮膚組織の再生を目的とした角化細胞及び／又は人工表皮シートの製造方法と、これらを用いた皮膚の再生方法に関する。詳しくは、アオギリ科に属するハンタイカイの種子抽出物は、哺乳動物の幹細胞に対して、角化細胞への分化誘導促進効果を有し、さらに、該効果により、幹細胞から角化細胞及び／又は人工表皮シートの作製を極めて効率的に行い、且つこれらを生体に移植した場合に、皮膚組織の再生能力を高める技術などに関する。

脊椎動物、特に哺乳動物の組織は、傷害もしくは疾患、又は加齢などに伴い細胞・臓器の損傷が起こった場合、再生系が働き、細胞・臓器の損傷を回復しようとする。この作用に、当該組織に備わる幹細胞が大きな役割を果たしている。幹細胞は、あらゆる細胞・臓器に分化する多能性を有しており、この性質により細胞・組織の損傷部を補うことで回復に導くと考えられている。このような幹細胞を応用した、次世代の医療である再生医療に期待が集まっている。

哺乳動物における幹細胞研究で最も進んでいる組織は骨髄である。骨髄には生体の造血幹細胞が存在しており、すべての血液細胞再生の源であることが明らかにされた。さらに骨髄には、造血幹細胞とは別に、その他の臓器（例えば、骨、軟骨、筋肉、脂肪など）へ分化可能な幹細胞が包含されていることが報告されている（非特許文献１）。
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた（非特許文献２〜５）。また、各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の再生にも利用できる可能性がある。
近年、これらの幹細胞を、臓器や組織の再生へ応用するため、細胞移植治療や組織工学（再生医療や再生美容）の分野において研究が進められている（非特許文献６）。
また、幹細胞は他の細胞に比べて分裂能が高く、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）などは、ほぼ無限に増殖すると考えられている（非特許文献７）。
幹細胞の持つこの能力は、今後の再生医療や再生美容には極めて重要である。すなわち、再生医療や再生美容では組織を再生するための細胞が必要であり、この細胞に限りがあっては、十分に組織を再生できない。この点、幹細胞は無限に増殖することが可能であり、かつ多能性も備えていることから、組織再生用の細胞又は組織を無限に調製できる細胞として期待が大きい。

ＰｉｔｔｅｎｇｅｒＭ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，１４３−１４７ＧｏｏｄｅｌｌＭ．Ｆ．，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，１３３７−１３４５ＺｕｌｅｗｓｋｉＨ．，ｅｔａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００１，５０，５２１−５３３ＳｕｚｕｋｉＡ．，ｅｔａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０００，３２，１２３０−１２３９ＺｕｋＰ．Ａ．，ｅｔａｌ．，ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００１，７，２１１−２２８西川伸一ら，実験医学，２００８，２６，７４−８０末盛博文，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，２００３，４０，９８−１０５

また、幹細胞の再生医療や再生美容への応用を考えた場合、最も重要な課題は、再生したい臓器や組織の細胞に幹細胞を効率よく分化誘導させる技術の開発が重要であり、さらに、目的の細胞に分化誘導できたとしても、臓器や組織は三次元的に構築されているため、これを再現できなければ、生体に移植しても、その効果（臓器、組織の再生）を発揮できない。
すなわち、生体外において幹細胞を培養し、目的の細胞に自由自在に分化誘導させ、再生したい臓器や組織に類似した三次元的な構築を行う技術を開発できれば、今後の再生医療や再生美容の飛躍的な発展が望める。

特に、皮膚組織は、複雑な三次元構造を取っており、また、人の身体の最外層に備わっているため、外的傷害によるダメージを受けやすい組織である。また、人の外観や美容に大きく関わる組織であり、この組織の再生技術を進歩させることは極めて重要な課題である。

これまでに、人の皮膚組織を人工的に培養し、移植することで皮膚組織を再生する技術の研究が幾つか行われている。特に、人工表皮シートによる表皮組織の再生に関しては、Ｇｒｅｅｎらが開発した人工表皮シートの作製技術（非特許文献８、９、１０）により、現在では、この技術をもとに株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリングから、ヒト細胞・組織利用医療機器として、厚生労働省から製造承認（２１９００ＢＺＺ０００３９０００）を受けた人工表皮シートの提供が行われている。しかし、現在のところその有効性については完全に証明されたものではなく、また、作製された人工表皮シートは、幹細胞から作製されたものではない。

Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，２００３，１００，１５６２５−１５６３０ＨａａｓｅＩ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２００７，８６，８０１−８０５Ｈ．Ｇｒｅｅｎ，Ｏ．Ｋｅｈｉｎｄｅ，Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ，ＰＮＡＳＵＳＡ，１９７９，７６，５６６５−５６６８

その他にも、人工表皮シートや人工皮膚に関して、幾つかの特許出願がみられる（特許文献１、２、３、４）。
しかし、やはりこれらの特許出願に関しても、幹細胞から作製されたものではない。尚且つ、いずれも組織再生の目的ではなく、薬物のスクリーニングや基本的な培養技術に関するものであり、組織の再生を目指したものではない。

特開２００２−２１８９７１特開２００４−１２１５２３特開２００５−１３０８３８特開２００８−１２５５４０

また、熊谷は、これら技術を用いて作製した人工表皮シートを移植したとしても、生着率が悪く、瘢痕形成や創収縮などの問題や、皮膚の再生能力を必ずしも高めるものではないことを報告している（非特許文献１１）。以上より、現在までに幹細胞から人工表皮シートを作製した例は皆無であり、今だ、組織の再生に応用できる人工表皮シートの開発は満足いくレベルに至っていない。

熊谷憲夫，ティッシュエンジニアリング２００５，２００５，１１９−１２８

このような現状の中、今後、幹細胞の持つ無限の増殖能と多分化能を利用し、皮膚の再生に利用するためには、幹細胞を目的の細胞へ効率良く分化誘導させる技術と、さらに三次元的に人工表皮シートを作製する技術を確立し、これら細胞もしくは人工表皮シートを組織へ移植した場合に、その組織の再生能力を高める技術の開発が求められている。つまり、簡便で効率的に、幹細胞を角化細胞へ分化誘導させ、皮膚組織の再生能力を高める角化細胞または人工表皮シートの作製技術が望まれている。

かかる状況に鑑み、本発明は、上記のような従来技術における問題点を解決し、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進効果による、幹細胞から皮膚組織の再生を目的とした角化細胞及び／又は人工表皮シートの製造方法と、これらを用いた皮膚の再生方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題の解決に向けて鋭意検討を行った結果、アオギリ科に属するハンタイカイの種子抽出物に、優れた幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果を見出し、さらに、該抽出物を用いて幹細胞から作製した角化細胞及び人工表皮シートは、極めて皮膚組織の再生能力に優れていることを発見し、本発明を完成するに至った。

即ち本発明は、以下のとおりである。
（１）幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、角化細胞。
（２）幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、人工表皮シート。
（３）幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、角化細胞又は人工表皮シートの製造方法。
（４）アオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の角化細胞への分化誘導促進剤。
（５）前記（１）の角化細胞を含有することを特徴とする、医薬組成物。
（６）幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で培養した、角化細胞及び／又は人工表皮シートを用いることを特徴とする、皮膚の再生方法。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。

本発明は、アオギリ科に属するハンタイカイの種子抽出物の持つ、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進効果による、幹細胞から皮膚組織の再生を目的とした角化細胞及び／又は人工表皮シートの製造方法と、これらを用いた皮膚の再生方法を提供する。

本発明に用いるハンタイカイとは、アオギリ科に属する落葉高木で、学名はＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬである。

上記ハンタイカイの種子抽出物の調製に際し、使用する部位は特に限定されるものではないが、種子を含む植物体そのままを用いることも可能であり、また、必要に応じて、花、葉、根、樹皮、果実、果皮などより、選択した部位を混合して用いても良い。より好ましくは種子のみを用いるのが良い。また、抽出には、植物体をそのまま使用しても良く、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってから抽出を行っても良い。

抽出する溶媒としては、例えば、水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノール等）、液状多価アルコール（１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）が挙げられる。好ましくは、水、低級アルコール及び液状多価アルコールが良く、特に好ましくは、水、エタノールが良い。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いても良い。また、抽出法は特に限定されないが、加熱による抽出が好ましい。さらに上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加してｐＨ調整して用いてもよい。

ハンタイカイの種子抽出物は、抽出した溶液のまま用いても良く、必要に応じて、濃縮、稀釈、濾過等の処理及び活性炭等による脱色、脱臭処理をして用いても良い。特に、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いることが好ましい。

幹細胞を培養する培地、角化細胞への分化誘導を行う際の培地又は人工表皮シートを調製する培地などに含有するハンタイカイの種子抽出物の含有量は、特に限定されないが、乾燥物として０．００００１〜１０重量％であることが好ましく、０．０００１〜１重量％含まれる濃度で使用することが最も好ましい。０．００００１重量％未満であると本発明の効果が十分に発揮されにくい場合がある。

また、本発明のハンタイカイの種子抽出物は、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進剤としての応用や、これを用いた分化誘導技術による幹細胞からの角化細胞や人工表皮シートの製造方法への応用が可能である。また、これら用途以外にも、細胞培養用添加剤、研究用試薬、医療用試薬、細胞移植剤への配合や応用が可能である。

本発明の幹細胞としては、本発明の目的に沿うものであれば、胚性の幹細胞（ＥＳ細胞）、もしくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪、脳、肝臓、膵臓、腎臓、筋肉やその他の組織に存在する、未分化な状態の細胞（総称して、体性幹細胞と記す）、さらには遺伝子導入などにより人工的に作製された幹細胞を示しており、また、これら幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、凍結細胞いずれであってもよい。好ましくは、骨髄、血液、皮膚、脂肪組織由来の幹細胞に対してより効果を発揮する。また、哺乳動物における、幹細胞の分化の方向性、および、分化の過程等について同等の特性を持っていれば、全ての哺乳動物に応用が可能である。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の哺乳動物の幹細胞に対して効果を発揮することができる。

本発明の幹細胞を培養する培地または角化細胞への分化誘導を行う時の培地、また、それら培地と同時に用いる添加剤としては、例えば以下のものを使用できるが、限定されるものではない。

具体的には、細胞の生存に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓＭｏｄｉｆｉｄｅＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ），ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ），ＲＰＭＩ１６４０，ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＢＭＥ），Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓＭｏｄｉｆｉｄｅＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２），ＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ），ハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ），ＭＣＤＢ１５３倍地などに、増殖因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）の少なくともいずれか１種を添加した培地が用いられ、好ましくは、これら増殖因子の全てが含有されたものである。また、必要に応じて、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７−サプリメント、Ｎ２−サプリメント、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質が含有されてもよい。

また、上記以外には、１〜２０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。

幹細胞を培養する培地の市販品としては、インビトロジェン製の間葉系幹細胞基礎培地、三光純薬製の間葉系幹細胞基礎培地、ＴＯＹＯＢＯ社製のＭＦ培地、幹細胞用無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＭＣＤＢ１５３培養液（Ｓｉｇｍａ社製）やＳｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。また、幹細胞から角化細胞への分化誘導を行う時の培地の市販品としては、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＭＣＤＢ１５３培養液（Ｓｉｇｍａ社製）やＳｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましいが、より好ましくは毎日行うことが好ましい。

幹細胞の培養または幹細胞から角化細胞へ分化誘導する場合の容器としては、使い捨てのシャーレを使用することが好ましく、また、セルカルチャーインサート（ファルコン社製）などを使用することがより好ましい。なお、いずれの場合も、マイトマシンＣ処理した３Ｔ３細胞などをフィーダー細胞として用いることも可能である。

また、上記の方法で幹細胞から分化誘導させた角化細胞は、一般的に体外で培養後、創傷部や組織を再生させたい部位に直接注射などで移植することが可能である。すなわち、細胞医薬品や医薬品組成物として使用され、具体的な症例としては、シワ、タルミの美容治療、熱傷、先天性表皮水疱症、下腿潰瘍、難治性潰瘍などの治療に用いられるが、限定されるものではない。

さらに、人工表皮シートの培養方法としては、培養容器に幹細胞または幹細胞から分化させた角化細胞を２．０ｘ１０^５個／ｍＬの濃度で細胞を播種し、培養することで人工表皮シートを作製することが好ましい。より好ましくは、細胞を播種する時に、培養容器の表面を４型コラーゲン（新田ゼラチン社製）もしくマイトマシンＣ処理した３Ｔ３細胞などをフィーダー細胞でコートすることが好ましい。

また、人工表皮シートを作製する場合、上記培養の過程で、幹細胞もしくは幹細胞から分化させた角化細胞がコンフルエントな状態を確認した後に、さらに空気暴露培養を行うことが好ましい。

その他、人工表皮シートを作製する培養容器としては、使い捨てのシャーレを使用することが好ましく、また、セルカルチャーインサート（ファルコン社製）などを使用することが好ましい。

本発明の人工表皮シートを作製する培地、または同時に用いる添加剤としては、例えば以下のものを使用できるが、限定されるものではない。

具体的には、細胞の生存に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓＭｏｄｉｆｉｄｅＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ），ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ），ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ（ＢＭＥ），Ｄｕｌｂｅｃｏ‘ｓＭｏｄｉｆｉｄｅＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２（Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２），ＧｌａｓｇｏｗＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ（ＧｌａｓｇｏｗＭＥＭ），ＭＣＤＢ１５３に、添加因子として上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、インスリン、コレラトキシン、ヒドロコルチゾンを添加した培地が用いられ、好ましくは、これら全ての因子が含有されたものである。また、必要に応じて、ビタミン類、インターロイキン類、トランスフェリン、セレナイト、ＩＴＳ−サプリメント、抗生物質が含有されてもよい。

また、上記以外には、０．５〜１０％の含有率で血清が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。

また、人工表皮シートを作製する培地の市販品としては、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（クラボウ社製）、正常ヒト表皮角化細胞用無血清培地（ＤＳファーマバイオメディカル社製）、ＭＣＤＢ１５３培養液（Ｓｉｇｍａ社製）やＳｉｇｍａ社製のハンクス液（Ｈａｎｋ‘ｓｂａｌａｎｃｅｄｓａｌｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）などを用いることができる。なお、培地の交換は２〜３日に１回行うことが好ましいが、より好ましくは毎日行うことが望まれるが、限定されるものではない。

上記の方法で作製した人工表皮シートは、一般的に体外でシートを作製後、創傷部や組織を再生させたい部位に直接移植される。具体的な症例としては、シワ、タルミの美容治療、熱傷、先天性表皮水疱症、下腿潰瘍、難治性潰瘍などの治療に用いられるが、限定されるものではない。

本発明のハンタイカイの種子抽出物は、幹細胞から角化細胞への分化誘導を顕著に促進させることで、幹細胞から角化細胞または人工表皮シートの作製を極めて効率的に行うことが可能となった。また、本発明により作製した角化細胞または人工表皮シートは、皮膚組織へ移植した場合、組織の再生能力を著しく向上させた。以上より、本発明は、組織の再生の分野において大きく貢献できるものであり、医学、医薬品、医薬部外品、美容、健康分野への応用が期待される。

以下、次に本発明を詳細に説明するため、具体的且つ詳細な実施例を挙げるが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。

次に本発明を詳細に説明するため、実施例として本発明に用いるハンタイカイの種子抽出物の製造例、また幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果及び本発明で作製した人工表皮シートの皮膚組織の再生能力に関する効果を示す実施例を挙げるが、本発明はこれに限定されるものではない。

以下に、ハンタイカイの種子を用いた溶媒抽出物の製造例を示す。

製造例１ハンタイカイの熱水抽出物
ハンタイカイの種子の乾燥物２０ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５〜１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してハンタイカイの熱水抽出物を３．４ｇ得た。

製造例２ハンタイカイの５０％エタノール抽出物
ハンタイカイの葉及び種子の乾燥物２０ｇに５０（ｖ／ｖ）％エタノール４００ｍＬを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ハンタイカイの５０％エタノール抽出物を３．７ｇ得た。

製造例３ハンタイカイのエタノール抽出物
ハンタイカイの種子及び根の乾燥物１００ｇにエタノール１Ｌを加え、常温で７日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、ハンタイカイのエタノール抽出物を６．７ｇ得た。

以下に、実施例１で示した製造例１〜３のハンタイカイの種子抽出物を用いた、幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果を評価し、該抽出物の角化細胞への分化誘導促進剤としての効果について確認した。

実験例１幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果の評価
ＭＣＤＢ１５３培養液（Ｓｉｇｍａ社製）に、ＩＴＳ−Ｘサプリメント（１００倍希釈、ＧＩＢＣＯ社製）、ハイドロコルチゾン（０．４ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）を加えて調製した培地を用いて、マウス表皮組織から分離した幹細胞を、６ｃｍディッシュに１ｘ１０^６個播種し、各抽出物（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加し、３日間培養を続けた。次に細胞をＰＢＳ（−）にて３回洗浄した後、ラバーポリスマンにて集め、血球計数板にて細胞数をカウントした後、ＣｅｌＬｙｔｉｃ（Ｓｉｇｍａ社製）にてタンパク質を抽出し、角化細胞への分化状態の測定を豊岡らの報告に従って行った（文献：豊岡やよい，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｒ臨時増刊号再生医学，２００３，１０６−１１５）。
すなわち、角化細胞への分化状態を示しているインボルクリンタンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法にて定量解析し、これを指標に、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進効果を評価した。この場合、ハンタイカイの種子抽出物を添加せずに培養した細胞が発現したインボルクリンタンパク質の量をコントロール（１００％）とし、各抽出物（製造例１〜３）を添加して培養した時のインボルクリンタンパク質の発現量を相対値（％）として算出し、コントロールと比較することで、角化細胞への分化誘導促進効果（％）について評価した。なお、本実験例では、一般的に角化細胞の分化誘導因子として使用されているＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ：角化細胞成長因子、文献：Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ．ＪＤｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９７７，２６５，４２１−４２４）１０ｎｇ／ｍＬ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社製）を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。

これらの試験結果を表１に示した。その結果、ハンタイカイの種子抽出物（製造例１〜３）全てに、顕著な幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果が認められた。以上より、ハンタイカイの種子抽出物の極めて優れた幹細胞の角化細胞への分化誘導促進効果を明らかとし、ハンタイカイの種子抽出物の分化誘導促進剤としての効果を確認した。これらハンタイカイの種子抽出物の分化誘導促進効果は、現在、角化細胞の分化誘導因子として一般的に用いられているＥＧＦに比べても、顕著に高い効果を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、その他、未分化な状態の細胞（体性幹細胞）についても試験を行ったところ、同様な効果が確認できた。

以下に、実施例１で示した製造例１〜３のハンタイカイの種子抽出物を用いた幹細胞から角化細胞の作製方法と作製した角化細胞による皮膚組織の再生能力を確認する実験例とその結果を示す。

実験例２幹細胞から角化細胞の作製方法
幹細胞用無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて、マウス表皮幹細胞を培養し、増殖した幹細胞を、３Ｔ３細胞をフィーダーとした６ｃｍディッシュに１ｘ１０^６個播種した。播種１日後、細胞の生着を確認し、角化細胞へ分化誘導を行った。具体的には、ＭＣＤＢ１５３培養液（Ｓｉｇｍａ社製）に、ＩＴＳ−Ｘサプリメント（１００倍希釈、ＧＩＢＣＯ社製）、ハイドロコルチゾン（０．４ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）とストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ社製）にハンタイカイの種子抽出物（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加した分化誘導用の培養液に換え、引き続き１４日間培養を続けた。これにより、幹細胞から角化細胞へ分化誘導した。なお、抽出物（製造例１〜３）を添加しない培養液にて、同様に作製した角化細胞をコントロールとし、また、一般的に角化細胞の分化誘導因子として使用されているＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ：角化細胞成長因子）を添加した培養液にて作製したものを陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。

実験例３作製した角化細胞の皮膚組織の再生能力の評価
バイオプシーパンチ（ＫＡＩ社）を用いて、ヌードマウスの背部に直径５ｍｍの創傷部位を作製し、実験例２で作製した角化細胞（コントロール、ＥＧＦまたは各抽出物を添加して作製したもの）をそれぞれ創傷部位に移植した。具体的には、調製した角化細胞１ｘ１０^８個を生理食塩水（大塚製薬工業社製）１０μＬに懸濁し、創傷部に注射器にて直接投与した。その後、移植部位はテガダームＴＭ（３Ｍ社）で保護し、１４日間飼育を行った。１４日目にそれぞれの創傷部位の直径ｍｍを測定し、コントロールを移植した創傷部位の直径ｍｍをコントロール（１００％）とし、これに対して、ＥＧＦまたはハンタイカイの種子抽出物（製造例１〜３）を用いて作製した各角化細胞を移植した創傷部位の直径ｍｍを算出し、創傷部位の再生能力について比較した。
すなわち、コントロールより皮膚の再生能力が高ければ、創傷部位の直径ｍｍは小さくなることから、この変化を相対的に算出し、再生能力（％）として示した。

これらの試験結果を表２に示した。その結果、実験例２で作製した角化細胞のうち、作製時にハンタイカイの種子抽出物（製造例１〜３）を用いて作製した角化細胞全てにおいて極めて高い皮膚の再生能力（％）を示した。この皮膚の再生能力は、現在までに報告があるＥＧＦ（陽性コントロール）に比べても、顕著に高い効果であった。
以上より、本製造方法により幹細胞からハンタイカイの種子抽出物を用いて分化誘導させた角化細胞は、極めて高い皮膚の再生能力を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、その他、未分化な状態の細胞（体性幹細胞）についても同様な試験を行ったところ、いずれも顕著な皮膚の再生能力の向上が認められた。

以下に、実施例１で示した製造例１〜３のハンタイカイの種子抽出物を用いた人工表皮シートの作製方法と作製したシートによる皮膚組織の再生能力を確認する実験例とその結果を示す。

実験例４幹細胞から人工表皮シートの作製方法
幹細胞用無血清培地ＳＴＫ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて、ヒト表皮幹細胞を培養し、増殖した幹細胞を、３Ｔ３細胞をフィーダーとした６ｃｍディッシュに１ｘ１０^６個播種し、コンフルエントになるまで培養した。その後、ヒト表皮角化細胞培養液（クラボウ社製）に各ハンタイカイの種子抽出物（製造例１〜３）を最終濃度が０．００１％になるように添加した培養液に換え、引き続き、幹細胞から角化細胞への分化誘導を促進させつつ１４日間培養を続け、人工表皮シートを作製した。なお、抽出物（製造例１〜３）を添加しない培養液にて、同様に作製した人工表皮シートをコントロールとし、また、一般的に角化細胞の分化誘導因子として使用されているＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ：角化細胞成長因子）を添加した培養液にて作製したものを陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。

実験例５人工表皮シートの皮膚組織の再生能力の評価
バイオプシーパンチ（ＫＡＩ社）を用いて、ヌードマウスの背部に直径５ｍｍの創傷部位を作製し、実験例４で作製した各人工表皮シート（コントロール、ＥＧＦまたは各抽出物を添加して作製したもの）をそれぞれ創傷部位に移植した。移植部位はテガダームＴＭ（３Ｍ社）で保護し、その後７日間飼育を行った。７日目にそれぞれの創傷部位の直径ｍｍを測定し、コントロールを移植した創傷部位の直径ｍｍをコントロール（１００％）とし、これに対して、ＥＧＦまたはハンタイカイの種子抽出物（製造例１〜３）を用いて作製した各人工表皮シートを移植した創傷部位の直径ｍｍを算出し、創傷部位の再生能力について比較した。
すなわち、コントロールより皮膚の再生能力が高ければ、創傷部位の直径ｍｍは小さくなることから、この変化を相対的に算出し、再生能力（％）として示した。

これらの試験結果を表３に示した。その結果、実験例４で作製した人工表皮シートのうち、作製時に各ハンタイカイの種子抽出物（製造例１〜３）を用いて作製した人工表皮シート全てにおいて極めて高い皮膚の再生能力（％）を示した。この皮膚の再生能力は、現在までに報告があるＥＧＦ（陽性コントロール）に比べても、顕著に高い効果であった。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、その他、未分化な状態の細胞（体性幹細胞）についても同様な試験を行ったところ、いずれも顕著な皮膚の再生能力の向上が認められた。

以上の結果より、ハンタイカイの種子抽出物は、幹細胞から角化細胞への分化誘導を促進し、かつ本発明による幹細胞から作製した角化細胞及び人工表皮シートは、それらを移植した場合、皮膚の再生能力を優位に向上させることを確認した。

本発明の、ハンタイカイの種子抽出物は、従来の技術に比べて、幹細胞の角化細胞への分化誘導を顕著に促進させることを見出し、さらに、これを応用することで、極めて質の高い皮膚組織の再生能力に優れた角化細胞及び人工表皮シートを簡便かつ効率的に作製する技術を確立した。

本発明の活用例として、再生医療、再生美容への応用が期待される。例えば、本発明のハンタイカイの種子抽出物は、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進剤として有用であり、また、これを利用することで、再生医療、再生美容に用いる皮膚の再生能力の高い角化細胞や人工表皮シートを安全かつ効率よく作製することが可能となる。さらに、本発明のハンタイカイの種子抽出物を直接注入または経口投与、塗布、貼付などにより導入させることで、組織に存在する幹細胞に直接効果を与え、角化細胞への分化を促進させることも可能である。これにより、直接的な皮膚組織の再生も期待できる。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞から角化細胞への分化誘導促進剤であり、かつ、幹細胞からの角化細胞や人工表皮シートの作製技術及び皮膚の再生技術として利用が可能である。

Claims

幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で分化誘導させて作製したことを特徴とする、角化細胞。
幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で分化誘導させて作製したことを特徴とする、人工表皮シート。
幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、角化細胞又は人工表皮シートの製造方法。
アオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の角化細胞への分化誘導促進剤。
請求項１記載の角化細胞を含有することを特徴とする、医薬組成物。
幹細胞をアオギリ科に属するハンタイカイ（学名：ＳｔｅｒｃｕｌｉａｓｃａｐｈｉｇｅｒａＷＡＬＬ）の種子抽出物の存在下で分化誘導させて作製した角化細胞及び／又は人工表皮シートを用いることを特徴とする、ヒトを除く皮膚の再生方法。