JP2007176830A - 皮膚バリア機能を向上させるための皮膚外用剤とその製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】
皮膚そのもののバリア機能を向上させる手段を提供することを課題とした。
【解決手段】
表皮角化細胞を低カルシウム条件の液体培地で微細孔を有する支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後に、高カルシウム条件の液体培地で培養することにより、皮膚バリア機能を簡便に評価できる表皮角化細胞層膜が得られることを見出し、これに、キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎の抽出物を適用させることにより、表皮角化細胞層膜のバリア機能が向上することを見出し、この抽出物を皮膚外用剤に含有せしめることにより、簡便に皮膚そのもののバリア機能を向上させる皮膚外用剤が得られた。
【選択図】なし

Description

本発明は、化粧料、皮膚外用医薬品などの皮膚外用剤などに適用するのに好適な皮膚バリア機能を向上させる皮膚外用剤に好適な皮膚外用剤とその製造法に関する。

皮膚は、生体内部と外界を隔てて、生体内部からの水分の蒸散を抑制し、さらに外部からの物理的刺激や化学物質による刺激などから生体を防御している非常に重要な器官である。このように、生体を外部環境から、さらには水分などの蒸散から防御している皮膚であるが、最近の食生活の欧米化、環境ホルモンの影響、過度のエアコンによる皮膚の乾燥などの多様な影響により、皮膚バリア機能に変調を来しているヒトが増えてきている。皮膚バリア機能の低下がその増悪要因の一つであると言われているものにアトピー性皮膚炎や乾燥性皮膚疾患などがあるが、この様な病的疾患に至らないまでも、皮膚が乾燥してカサカサした皮膚状態に悩んでいるヒトも増加していると言われている。この様な乾燥症状を緩和する為に、皮膚のバリア機能を向上させる手段として、高分子物質やシリコーン油等を含む油剤などを含有した皮膚外用剤を塗布して物理的なバリア機能を付与することにより皮膚のバリア機能を向上させることが行われている。この様な物理的手法により皮膚バリア機能を補完する手法以外に、皮膚そのもののバリア機能を向上させようという試みもある（例えば、特許文献１を参照）。しかし、皮膚そのもののバリア機能を向上させるためには、皮膚という生体組織を介しているため、皮膚そのものにおけるバリア機能の測定は、実験動物の皮膚を用いて行った結果をヒトに外挿するか、或いは、実際にヒトに対しての測定などを行うしか方法が無かった。さらに、皮膚バリア機能の測定においては、皮膚を通しての水分量の蒸散量を測定することにより皮膚バリア機能を測定する経表皮水分蒸散量（Trans Epidermal Water Loss；ＴＥＷＬ）の測定が通常行われている。また、ヒトの角層細胞の形態を測定することにより、そのバリア機能を簡便に推定できる技術（例えば、特許文献２を参照）も報告されている。しかし、これらの方法も、ヒトの皮膚でのデータの収集・測定を前提としており、初期のスクリーニング系に使用できるほど簡便な方法とは言いにくい。すなわち、皮膚そのもののバリア機能を向上させることができる素材、さらには皮膚そのもののバリア機能を向上させることができる皮膚外用剤を、簡便に得る方法が求められていたと言える。

一方、表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で０．１〜１２μｍの微細孔を有する支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後に、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養して表皮角化細胞層膜を構築する手法は全く知られていなかったし、この様な方法で構築される表皮角化細胞層膜にタイトジャンクションが発現しており、これを利用することにより、実状に即した皮膚バリア機能向上のための素材を得ることができることも全く知られていなかった。

ここで、キンポウゲ科オウレン属オウレンの抽出物は、化粧料用の原料として既に知られており、コラーゲン合成を促進する作用（例えば、特許文献３を参照）、外部刺激より皮膚を防御する作用（例えば、特許文献４，特許文献５を参照）などを有することが知られている。しかし、前記表皮角化細胞層膜に、キンポウゲ科オウレン属オウレンの根茎の極性溶媒による抽出物を添加することにより、表皮角化細胞層膜を介した指標物質の移動が抑制され、オウレンの極性溶媒による抽出物が、皮膚そのもののバリア機能を向上させる作用を有していることは知られていなかった。

特開平１１−２５５６１４号公報 特開２００５−１８９０１１号公報 特開２００５−２８１２８４号公報 特開２００５−２０６５７３号公報 特開平１１−２９４６０号公報

皮膚そのもののバリア機能を向上させる手段を提供することを課題とした。

この様な状況に鑑みて、本発明者らは、皮膚そのもののバリア機能を向上させる皮膚外用剤を簡便に得る手段を求めて鋭意研究努力を重ねた結果、表皮角化細胞をカルシウムイオンを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で０．１〜１２μｍの微細孔を有する支持体上にコンフルエントになるまで培養し、しかる後に、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養することにより、皮膚バリア機能を簡便に評価できる表皮角化細胞層膜が得られることを見出し、この表皮角化細胞層膜に、キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、所望により、前記抽出物を分画、精製、溶媒除去した抽出物を、前記表皮角化細胞層膜の存する液体培地中に含有せしめることにより、表皮角化細胞層膜のバリア機能が向上することを見出し、この抽出物を皮膚外用剤に含有せしめることにより、簡便に皮膚そのもののバリア機能を向上させる皮膚外用剤が得られることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下に示す通りである。

（１） キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、所望により、前記抽出物を分画、精製、溶媒除去した後、これを皮膚外用剤に含有させる場合において、表皮角化細胞をカルシウムを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で０．１〜１２μｍの微細孔を有する支持体上でコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養し、得られる表皮角化細胞層膜を前記抽出物で処理した場合、該表皮角化細胞層膜の物質透過性を抑制する作用を有することを確認した上で、該抽出物を皮膚外用剤に含有せしめることを特徴とする皮膚外用剤の製造法。
（２） 前記表皮角化細胞がヒト由来のものであることを特徴とする、（１）に記載の皮膚外用剤の製造法。
（３） 前記極性溶剤が含水エタノール又は含水１，３−ブタンジオールであることを特徴とする、（１）又は（２）に記載の皮膚外用剤の製造法。
（４） キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、所望により、前記抽出物を分画、精製、溶媒除去する工程が、キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、これから抽出溶媒を除去し、しかる後に酢酸エチルと水を加え、液−液抽出し、酢酸エチル層を取り、該酢酸エチル層の溶媒を除去する工程であることを特徴とする、（１）〜（３）何れかに記載の皮膚外用剤の製造法。
（５） 前記皮膚外用剤が、皮膚バリア機能を向上させるべき用途のものであることを特徴とする（１）〜（４）何れかに記載の皮膚外用剤の製造法。
（６） 前記皮膚バリア機能の向上が、肌の乾燥状態の改善の為のものであることを特徴とする、（１）〜（５）に記載の皮膚外用剤の製造法。
（７） キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎の極性溶媒での抽出物又はその分画・精製物を、皮膚バリア機能を向上させるのに充分な量配合してなる皮膚外用剤。
（８） 皮膚外用剤におけるオウレンの抽出物又はその分画・精製物の配合量について、皮膚バリア機能の向上に充分な量か否かが、パルマチンの量を指標として鑑別されたものであることを特徴とする、（７）に記載の皮膚外用剤。
（９） オウレンの抽出物又はその分画・精製物中のパルマチンの含有量が０．０５〜０．１質量％となるように５０％エタノール水溶液を添加して調整したものを０．０１〜１質量％含有してなる皮膚外用剤。

本発明によれば、皮膚そのもののバリア機能を向上させる皮膚外用剤を提供することができる。

本発明の皮膚外用剤の製造法は、キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、所望により、前記抽出物を分画、精製、溶媒除去した後、これを皮膚外用剤に含有させる場合において、表皮角化細胞をカルシウムを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で０．１〜１２μｍの微細孔を有する支持体上でコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養し、得られる表皮角化細胞層膜を前記抽出物で処理した場合、該表皮角化細胞層膜の物質透過性を抑制する作用を有することを確認した上で、該抽出物を皮膚外用剤に含有せしめることを特徴とする。

前記、キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎の抽出物の製造に用いる溶剤としては極性溶剤が好ましく、水、エタノールやイソプロパノール等のアルコール類、アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリルなどのニトリル類、ジエチルエーテルやテトラヒドロフラン等のエーテル類、酢酸エチルや蟻酸メチル等のエステル類、１，３−ブタンジオール、プロピレングリコール等の多価アルコール類が好ましく例示できる。これらは単独でも複数を混合して用いても良い。抽出に際しては、植物体乃至はその加工物１質量部に対して、１〜１０質量部の溶剤を加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間、所望により攪拌を加え、浸漬すればよい。浸漬後、所望により濾過などで不溶物を除去し、必要に応じて溶媒除去などを行い用いることができる。更に、これらを液−液抽出、イオン交換樹脂やシリカゲルを担体としたクロマトグラフィーなどを用いて分画精製することもできる。

かくして得られた抽出物やその分画・精製物は、表皮角化細胞をカルシウムを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で０．１〜１２μｍの微細孔を有する支持体上でコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養し、さらに前記抽出物を含有する、或いは含有しない液体培地で培養して得られる表皮角化細胞層膜を用い、それぞれの細胞層膜で隔てられた二室の一室に指標物質を充填し、被検物質の他室への移動の程度が、前記抽出物の有無において、前記抽出物を含有する培養液で培養した細胞層膜における物質の透過性の抑制作用を有する分画を求め、かかる作用が皮膚外用剤への配合において十分に効果を奏するとは、この作用が１０％以上の抑制作用を示すことであり、かかる濃度を決定し、皮膚外用剤への配合量が決定される。０．１〜１２μｍの微細孔を有する支持体としては、コーニング社やミリポア社より、ポリエチレンテレスタレート製、ポリカーボネート製、コラーゲン処理ポリテトタフルオロエチレン製の膜が市販されているので、これらを購入して使用することができ、好ましい。これらを用いた測定方法に関しては以下に一例を示す。

＜表皮角化細胞層膜を介しての物質の移動の抑制による皮膚バリア機能の測定＞
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０^５／ｃｍ^２で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、被検試料である抽出物を含有する培養液に交換して、培養を継続し、１日後、２日後、３日後にＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値（Ωｍ）を測定する。被検試料含有培養液の添加時のＴＥＲ値に対する、一定時間後のＴＥＲ値を測定することによって、前記阻害濃度が決定される。この様な阻害濃度は簡易的にパルマチンの含有量によって推定できる。これはオウレン中に含まれる皮膚バリア機能を向上させる作用を有する成分がパルマチンと類似した溶出挙動を示すためである。前記の皮膚外用剤への配合において十分に皮膚バリア機能を向上しうる抽出物としては、パルマチンの含有量が０．０５〜０．１質量％のものが好ましく例示できる。かかる抽出物を、０．０１〜１質量％、好ましくは０．０５〜０．５質量％含有せしめることにより、皮膚バリア機能を向上せしめる皮膚外用剤とすることができる。

前記測定において、１０％以上の抵抗値の増加が認められる場合に、本発明の皮膚外用剤に含有させるのに適切な抽出物の濃度であると判断した。この時、被検試料の力価が一定になるように抽出物乃至は分画・精製物を水、５０％エタノール水溶液、５０％１，３−ブタンジオールなどで希釈して配合することもできる。

本発明の皮膚外用剤に於いては、前記のキンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎の抽出物乃至はその分画・精製物以外に、通常化粧料や皮膚外用医薬で使用される任意成分を含有することが出来る。この様な任意成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類、セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等、イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ−２−エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ−２−エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ−２−ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸グリセリン、トリ−２−エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ−２−エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン、アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２−ココイル−２−イミダゾリニウムヒドロキサイド−１−カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ−グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２−オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２−デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブタンジオール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール等の多価アルコール類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、グアガム、クインスシード、カラギーナン、ガラクタン、アラビアガム、ペクチン、マンナン、デンプン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、グリコーゲン、ヘパラン硫酸、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、トラガントガム、ケラタン硫酸、コンドロイチン、ムコイチン硫酸、ヒドロキシエチルグアガム、カルボキシメチルグアガム、デキストラン、ケラト硫酸，ローカストビーンガム，サクシノグルカン，カロニン酸，キチン，キトサン、カルボキシメチルキチン、寒天、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ベントナイト等の増粘剤、表面を処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面を処理されていても良い、ベンガラ、黄酸化鉄、黒酸化鉄、酸化コバルト、群青、紺青、酸化チタン、酸化亜鉛の無機顔料類、表面を処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、パラアミノ安息香酸系紫外線吸収剤、アントラニル酸系紫外線吸収剤、サリチル酸系紫外線吸収剤、桂皮酸系紫外線吸収剤、ベンゾフェノン系紫外線吸収剤、糖系紫外線吸収剤、２−（２’−ヒドロキシ−５’−ｔ−オクチルフェニル)ベンゾトリアゾール、４−メトキシ−４’−ｔ−ブチルジベンゾイルメタン等の紫外線吸収剤類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ６塩酸塩，ビタミンＢ６トリパルミテート，ビタミンＢ６ジオクタノエート，ビタミンＢ２又はその誘導体，ビタミンＢ１２，ビタミンＢ１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α−トコフェロール，β−トコフェロール，γ−トコフェロール，ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類、フェノキシエタノール等の抗菌剤などが好ましく例示できる。これらを常法に従って処理することにより、本発明の皮膚外用剤は製造することが出来る。

本発明の皮膚外用剤は、本発明の皮膚外用剤の製造法に従って製造されたものであり、前記キンポウゲ科オウレン属オウレンの根茎の抽出物乃至は分画・精製物を、表皮角化細胞層膜の透過性を抑制するにたる量を含有することを特徴としている。この様な透過性の抑制効果について、効果を確認した後に配合されるので、ロット毎の力価の変動が無く、生化学的に安定した皮膚外用剤とすることができる。通常、生薬等の植物体などの抽出物を含有する皮膚外用剤において、有効成分の含有量が生薬等の産地や季節により異なるため、生理化学的効果が大きく異なってしまう場合があったが、本発明の皮膚外用剤では生理学的効果は、生薬等の抽出物を含有する形態においても安定している。

以下に、実施例を挙げて、本発明についてさらに詳細に説明を加えるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではないことは言うまでもない。

キンポウゲ科オウレン属オウレンの根茎１ｋｇを裁断し、５０％エタノール水溶液１０Ｌ中に浸漬し、１週間放置した。濾過後、濾液を濃縮し、凍結乾燥した。この凍結乾燥物中のパルマチンの濃度を測定した。パルマチンの定量は、ＨＰＬＣを用いて以下の条件で実施したところ、１．２４質量％であった。これを５０％エタノール水溶液で２０倍に希釈して、パルマチン含量０．０６２質量％の本発明の皮膚外用剤に適用するのに適当なオウレン抽出物を得た。ここで、前記凍結乾燥物を５０％エタノール水溶液で５０倍に希釈したものを比較品１とした。この比較品１のパルマチン含有量は０．０２４８質量％であった。

（ＨＰＬＣ条件）
検出器 ：紫外吸光光度計（測定波長：３４５ｎｍ）
カラム ：東ソー ＴＳＫ−ＯＤＳ８０ＴｓＱＡ カラム温度：４０℃
移動層 ：水／アセトニトリル／ＫＨ_２ＰＯ_４／ＳＤＳ＝５００ｍｌ／５００ｍｌ／３．４ｇ／１．７ｇ 流量：１ｍｌ／ｍｉｎ

電流の抵抗値による皮膚バリア機能の測定
凍結正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）（倉敷紡績株式会社製）を解凍し、０．１５ｍＭ−Ｃａ含有培養液（Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２；倉敷紡績株式会社製）にて、３７℃、５０％二酸化炭素雰囲気下で培養した。この正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）をMillicell Tissue Culture Plate（ミリポア社製）にコーニング社製トランスウェル（直径１２ｍｍ、ポリエチレンテレフタレート０．４μｍポア）をセットし、上層０．５ｍｌ、下層０．５ｍｌの前記培養液を入れ、２×１０^５／ｃｍ^２で播種し、さらに７２時間培養した。コンフルエントになったことを確認し、１．４５ｍＭ−Ｃａ含有−Ｈｕｍｅｄｉａ−ＫＧ２培地に交換し、その後９６時間培養した。その後、実施例１のオウレン抽出物を１０^―５ｖ／ｖ％となるように培養液中に添加した培養液に交換して、培養を継続し、１日後、２日後、３日後にＴＥＲを測定した。抽出物の添加時のＴＥＲ（Transepitherial Electrical Resistance）値（Ωｍ）に対する、一定時間後のＴＥＲ値の割合（％）で示した。結果を図１に示す。さらに、前記実施例１において、作製したパルマチン含有量の低い比較品１に関しても同様の測定を実施した。結果を図２に示す。

図１の結果より、エキス類無添加のコントロールに比べて、オウレン抽出物を添加して培養した表皮角化細胞層膜ではＴＥＲ値が上昇し、培養表皮角化細胞層のバリア機能が向上していることが判った。しかも、ＴＥＲ値はコントロールと比べて１０％以上高くなり、本発明の皮膚外用剤に使用するのに適当であるオウレン抽出物であることも判った。また、図２の結果より、パルマチン含有量の低い比較品１では、コントロールと比較して、ＴＥＲ値が、それほど高くならず、十分なバリア機能の向上作用を有していなかった。本発明の十分なバリア機能の向上作用を発揮させるには、０．０５質量％程度以上のパルマチンを含有しているオウレン抽出物であれば十分であることが判った。

下記に示す処方に従って、本発明の皮膚外用剤である乳液を作製した。即ち、（Ａ）の各成分を混合し、８０℃に加熱した。一方、（Ｂ）の各成分を８０℃に加熱した。（Ａ）の混合物に（Ｂ）の混合物を加えて撹拌して乳化させ、更に（Ｃ）を加えて中和し、その後３５℃にまで撹拌、冷却し、実施例６乳液を作製した。実施例６において、実施例１のオウレン抽出物を水に置換した比較例１も作製した。

（Ａ）
ベヘニルアルコール ０．５ 質量％
イソオクタン酸セチル ２．０ 質量％
スクワラン ８．０ 質量％
ジメチコン ２．０ 質量％
セスキステアリン酸ソルビタン １．５ 質量％
ＰＯＥ（４５）ステアリン酸 １．０ 質量％
ステアリン酸セチル ０．５ 質量％
ベヘン酸 ０．５ 質量％
（Ｂ）
１，３−ブタンジオール ５．０ 質量％
グリセリン ５．０ 質量％
１，２−オクタンジオール １．０ 質量％
純水 ５０．０ 質量％
実施例１のオウレン抽出物 ０．５ 質量％
グリチルリチン酸ジカリウム ０．１ 質量％
（Ｃ）
純水 ２２．８ 質量％
水酸化カリウム ０．６ 質量％

（試験例１）
健常な成人男子５名の上腕内側部に１ｃｍ×１ｃｍの３部位を設定し、未処置部位のＴＥＷＬ値を測定した。次いで、サージカルテープ（３Ｍ社製）により、浸潤液が出るまでテープストリッピングを繰り返し、テープストリッピング直後のＴＥＷＬ値を測定した。ＴＥＷＬ値の測定後、１部位には実施例６のオウレン抽出物含有乳液、もう一部位には比較例１を塗布し、残りの１部位は何も塗布しないで放置した。このサンプル塗布を１日３回行い、サンプル塗布４８時間後に再度ＴＥＷＬ値を測定し、テープストリッピング直後からのＴＥＷＬの回復状況を評価した。結果を、図３に示す。

図３の結果より、テープストリッピング後に、何も塗布しない未処置に対して、比較例１を塗布した部位では、若干の回復の促進が認められたが、オウレン抽出物を含有した実施例６の乳液においては、損傷されたバリア機能の回復の顕著な促進が認められ、本発明のスクリーニング方法で、バリア能の向上効果の認められたオウレン抽出物に関して、ヒトの皮膚においても皮膚バリア能の回復効果が認められた。

本発明は、化粧料などの皮膚外用剤に応用できる。

実施例２の結果を示す図である（オウレン抽出物）。 実施例２の結果を示す図である（比較品１）。 試験例１の結果を示す図である。

Claims (9)

1. キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、所望により、前記抽出物を分画、精製、溶媒除去した後、これを皮膚外用剤に含有させる場合において、表皮角化細胞をカルシウムを０．１〜０．２ｍＭ含有する液体培地で０．１〜１２μｍの微細孔を有する支持体上でコンフルエントになるまで培養し、しかる後、カルシウムイオンを１〜２ｍＭ含有する液体培地で培養し、得られる表皮角化細胞層膜を前記抽出物で処理した場合、該表皮角化細胞層膜の物質透過性を抑制する作用を有することを確認した上で、該抽出物を皮膚外用剤に含有せしめることを特徴とする皮膚外用剤の製造法。
2. 前記表皮角化細胞がヒト由来のものであることを特徴とする、請求項１に記載の皮膚外用剤の製造法。
3. 前記極性溶剤が含水エタノール又は含水１，３−ブタンジオールであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の皮膚外用剤の製造法。
4. キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、所望により、前記抽出物を分画、精製、溶媒除去する工程が、キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎を極性溶媒で抽出し、抽出物を得て、これから抽出溶媒を除去し、しかる後に酢酸エチルと水を加え、液−液抽出し、酢酸エチル層を取り、該酢酸エチル層の溶媒を除去する工程であることを特徴とする、請求項１〜３何れかに記載の皮膚外用剤の製造法。
5. 前記皮膚外用剤が、皮膚バリア機能を向上させるべき用途のものであることを特徴とする請求項１〜４何れかに記載の皮膚外用剤の製造法。
6. 前記皮膚バリア機能の向上が、肌の乾燥状態の改善の為のものであることを特徴とする、請求項１〜５に記載の皮膚外用剤の製造法。
7. キンポウゲ科キンポウゲ属オウレンの根茎の極性溶媒での抽出物又はその分画・精製物を、皮膚バリア機能を向上させるのに充分な量配合してなる皮膚外用剤。
8. 皮膚外用剤におけるオウレンの抽出物又はその分画・精製物の配合量について、皮膚バリア機能の向上に充分な量か否かが、パルマチンの量を指標として鑑別されたものであることを特徴とする、請求項７に記載の皮膚外用剤。
9. オウレンの抽出物又はその分画・精製物中のパルマチンの含有量が０．０５〜０．１質量％となるように５０％エタノール水溶液を添加して調整したものを０．０１〜１質量％含有してなる皮膚外用剤。

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