ES2548883T3

ES2548883T3 - Nuevo medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes rápidamente con alta eficiencia y método que usa el mismo

Info

Publication number: ES2548883T3
Application number: ES09843569.6T
Authority: ES
Inventors: Duanqing Pei; Jiekai Chen; Jing Liu
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2009-04-23
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2029-09-30
Also published as: WO2010121465A1; CN101580816B; EP2423302B8; US20120100568A1; EP2423302B1; EP2423302A1; JP2012524525A; EP2423302A4; DK2423302T3; PT2423302E; CN101580816A

Abstract

Un medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes, que comprende un medio basal, un aditivo de sustitución del suero formulado por sustitución de suero KnockOut (KOSR) y suplemento de N2, factor inhibidor de leucemia (LIF), y uno o más factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor seleccionados de al menos uno de bFGF, EGF, IGF2 o VEGF, en el que el bFGF tiene una concentración de 3 ng/ml a 20 ng/ml en el medio final.

Description

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Nuevo medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes rápidamente con alta eficiencia y método que usa el mismo

Descripción

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un medio sin suero para inducir y reprogramar células somáticas en citoblastos pluripotentes inducidos (iPS) rápidamente con alta eficiencia, y el método que usa el mismo para inducir y reprogramar células somáticas sin nodriza, en el que la velocidad y eficiencia del proceso completo de inducir y reprogramar mejoran enormemente. Además, la presente invención también se refiere a los usos del medio en inducir citoblastos pluripotentes, y a los métodos para cribar compuestos, especialmente compuestos de cribado de alta resolución.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los citoblastos son la fuente inicial del cuerpo humano y los diversos histiocitos de los mismos, y biológicamente, se caracterizan prominentemente por su capacidad para auto-renovar y proliferar continuamente, además del potencial de diferenciación multi-direccional. Los citoblastos se dividen en citoblastos somáticos y citoblastos embrionarios (células ES) dependiendo de sus fuentes. Los citoblastos somáticos incluyen citoblastos mesenquimatosos de la médula ósea, citoblastos pancreáticos, citoblastos neurales, o similares, en tejidos adultos.

En 1981, células ES se aislaron y cultivaron satisfactoriamente por primera vez en ratones y las células ES de ratón son las más ampliamente estudiadas y con creces el sistema de citoblastos más maduro. Poco después, las células ES se han aislado y cultivado satisfactoriamente sucesivamente en animales grandes tales como ganado vacuno y ovejas.

Los estudios de células hES son prometedores, principalmente en trasplante terapéutico. En el campo de la ingeniería de tejidos, las células hES se usan como células semilla para proporcionar una gran cantidad de materiales para el trasplante clínico de células, tejidos u órganos. Pueden obtener tipos específicos de histiocitos mediante las estrategias in vitro de inducción y diferenciación que incluyen controlar la diferenciación y el cultivo de entornos de células hES y transfectar genes moleculares clave que pueden promover la diferenciación direccional de células ES. Tales células pueden usarse en trasplante, que traerá una nueva esperanza para el tratamiento de diabetes, enfermedades de Parkinson, lesión de la médula espinal, leucemia, daño miocárdico, insuficiencia renal, cirrosis hepática u otras enfermedades.

Los estudios de hES siempre se han enfrentado a muchos problemas y controversias que principalmente incluyen:

(1) Es difícil obtener la fuente de ovocitos de donante y la eficiencia de establecimiento de la línea de células hES es baja. Además, la tecnología de SCNT es inmadura, que inevitablemente producirá un mayor consumo de ovocitos humanos, por lo que es difícil de garantizar la fuente de ovocitos. (2) Puede producirse rechazo inmunológico. Los pacientes todavía rechazan inmunológicamente diversas células y tejidos diferenciados de células hES, a menos que se aplique la tecnología de SCNT. (3) Las células hES son tumorigénicas y pueden posiblemente desarrollar tumores después de trasplantarse en el cuerpo de un receptor. Este problema puede no resolverse bien a pesar del uso de la tecnología de SCNT, provisión de genes suicidas en células trasplantadas, u otras medidas (Reubinoff BE et al., Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol 2000; 18: 399-404; Richards M et al., Bongso A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2002; 20:933-936; Burdon T et al., cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells. Trends Cell Biol 2002; 12: 432-438). (4) Hay riesgos de mantener hES in vitro (Nakagawa M et al., N, Yamanaka S. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106). Por tanto, la tecnología de transfección de lentivirus puede sufrir riesgos similares.

Para evitar controversias éticas sobre células hES y estudios de clonación terapéutica, es necesario encontrar una forma alternativa a transformar directamente células somáticas humanas en citoblastos pluripotentes inducidos y proporcionar pacientes con citoblastos autólogos “individualizados”. En 2003, el grupo de estudio de Gurdon encontró que, después de inyectar los núcleos de timocitos de ratón completamente diferenciados o linfocitos de sangre periférica adultos en los ovocitos de Xenopus laevis, el marcador de diferenciación del núcleo de mamífero se perdió, mientras que Oct4, el marcador más característico en citoblastos de mamífero, se expresó altamente, que indica que los núcleos de células de mamífero pueden reconstruirse directamente y, por tanto, expresarse por las vacuolas nucleares de ovocitos de anfibio (Byrne JA et al., Nuclei of adult mammalian somatic cells are directly reprogrammed to oct-4 stem cell gene expression by amphibian oocytes. Curr Biol 2003; 13: 1206-1213).

En 2006, el grupo de estudio de Yamanaka en la Universidad de Kioto (Japón) cribó cuatro factores de transcripción que incluían Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 de 24 factores usando la tecnología de transfección génica in vitro, introdujo los cuatro factores de transcripción anteriores en fibroblastos embrionarios de ratón o fibroblastos de la piel de la punta de la cola de ratones adultos mediante retrovirus, y obtuvo una línea de citoblastos pluripotentes Fbx15+ bajo

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las condiciones de cultivo para células ES de ratón. Esta línea celular es muy similar a las células ES de ratón en morfología celular, propiedades de crecimiento, marcadores de superficie, formación de teratomas o similares, mientras que es diferente de células ES de ratón en perfiles de expresión génica, patrones de metilación de ADN y generación de animales quiméricos, de manera que se llama citoblastos pluripotentes inducidos (células iPS) (Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126: 663-676).

En julio de 2007, el grupo de estudio de Yamanaka realizó adicionalmente cribado usando Nanog en lugar de Fbx15 y obtuvo una línea de células iPS Nanog+. Esta célula iPS no es solo muy similar a la célula ES de ratón en morfología celular, propiedades de crecimiento, marcadores de expresión y formación de teratoma que comprende las estructuras de histiocitos de las tres capas germinativa cuando se trasplantan subcutáneamente en el ratón, sino que también son casi idénticas a la célula ES de ratón en patrones de metilación de ADN, perfiles de expresión génica, estado de cromatina y generación de animales quiméricos. Además, el estudio también encontró que la reactivación del proto-oncogén c-Myc es responsable de la neoplasia producida en un animal quimérico; pero los cuatro genes transfectados anteriores no se expresan en la célula iPS. Esto indica que estos genes desempeñan una función solo en el proceso de inducción y el estado pluripotente de la célula iPS es atribuible a la expresión de factores de transcripción endógenos tales como el gen Nanog (Okita K, Ichisaka T et al., germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448: 313-317). Otro artículo publicado independientemente por algunos científicos americanos al mismo tiempo también confirmó que los cuatro factores de transcripción anteriores son suficientes para preparar fibroblastos de ratón inducidos y reconstruidos in vitro en células iPS que son similares a células ES de ratón (Wernig M et al., In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES cell-like state. Nature 2007; 448: 318-324).

Se informó recientemente que las células de hígado de ratón y células epiteliales del estómago también pueden reconstruirse en células iPS, y como se reveló por análisis de seguimiento de líneas genéticas, las células iPS se derivan de la reconstrucción directa de células somáticas de linaje fijo y no se encuentra que la integración de retrovirus en loci de genes específicos esté relacionada con la reconstrucción de núcleos (Aoi T et al., Generation of Pluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells. Science 2008).

Algunos investigadores también obtuvieron sucesivamente células iPS introduciendo los cuatro mismos factores de transcripción en fibroblastos de piel humana usando la misma tecnología. Similarmente, pueden reconstruirse células sinoviales tipo fibroblasto humano primario, además de líneas celulares derivadas de fibroblastos neonatales, también en células iPS. Tales células iPS son similares a las células hES en morfología celular, capacidad de proliferación, marcadores de antígeno de superficie, perfiles de expresión génica, el estado epigenético de genes específicos de citoblastos pluripotentes, actividad de telomerasa, etc., y pueden diferenciarse en diferentes tipos de células de las tres capas germinativas en cultivo in vitro y en formación de teratoma en ratones (Takahashi K et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007; 131: 861-872). Al mismo tiempo, el grupo de estudio de Thomson de la Universidad de Wisconsin también informó de la inducción satisfactoria de fibroblastos embrionarios en células iPS humanas que tienen las características esenciales de células hES, solo que se usaron lentivirus como vector y se seleccionaron los cuatro factores que incluyen Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 de 14 genes candidatos para realizar la transducción (Yu J et al., Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007; 318: 1917-1920).

Park IH obtuvo los mismos resultados adoptando la estrategia del grupo de estudio de Yamanaka usando fibroblastos primarios de la piel o pulmón de feto, recién nacido o adulto (incluyendo fibroblastos de biopsia de piel de un hombre sano). También encontraron que Oct4 y Sox2 son necesarios en el transcurso de la inducción y reconstrucción en células iPS y son estos dos factores de transcripción los que mantienen la pluripotencia de células iPS humanas, mientras que Klf4 y c-Myc actúan alterando la estructura de cromatina y así facilitan la unión de Oct4 con Sox2 para aumentar la eficiencia de inducción (Park IH et al., Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2008; 451: 141-146). Además, la significancia de este estudio se basa en la inducción de fibroblastos de biopsia de piel en células iPS. Como se indica por el estudio anterior, es viable preparar citoblastos específicos de paciente extrayendo células somáticas de tejidos de piel humana de biopsia y luego induciendo las células somáticas. Por consiguiente, es prometedor vencer el rechazo inmunológico producido en las terapias de trasplante de células. La introducción del gen c-Myc puede conducir a una incidencia de tumor de hasta el 20 % en ratones quiméricos, que puede impedir sus aplicaciones clínicas previstas (Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2007; 448:313-317). En vista de esto, el grupo de estudio de Yamanaka informó recientemente de que también pueden obtenerse células iPS transfectando fibroblastos de piel de ratón y humana con otros tres genes, excepto c-Myc, bajo condiciones de cultivo ajustadas. Aunque la eliminación del gen c-Myc puede mejorar significativamente la seguridad de aplicaciones clínicas previstas, las células iPS se generan a eficiencia significativamente reducida (Nakagawa M et al., Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106).

Sin embargo, aunque se han desarrollado un gran número de métodos que implican células iPS, considerando que actualmente las células iPS sufren los problemas que incluyen uso de virus como vector génico, baja eficiencia y uso del oncogén c-Myc, el esquema óptimo es inducir directamente células somáticas en células iPS mediante fármacos,

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cuyo proceso y posterior proceso de diferenciación se realizan en un medio químicamente definido, obteniéndose así células terapéuticas completamente seguras. Sin embargo, es imposible predecir un fármaco que pueda sustituir a algún factor basándose en el conocimiento existente, y el método óptico es el cribado de alta resolución. El cribado de alta resolución requiere un sistema de inducción de iPS estable con alta eficiencia, en el que la alta eficiencia se requiere para reducir la apertura y aumentar el rendimiento al mismo coste; la estabilidad se requiere para eliminar la diferencia entre lotes, debido a que la repetibilidad es muy importante si van a cribarse millones de fármacos.

Sin embargo, los medios usados en los sistemas de inducción de iPS existentes requieren todos suero. El suero es inestable entre lotes. Además, contiene muchos componentes inciertos cuyas concentraciones frecuentemente varían enormemente. Como tal, el suero es inherentemente desventajoso con respecto al mecanismo de estudio. En vista de esto, los solicitantes esperan estudiar si las células iPS pueden inducirse con un medio sin suero.

El documento WO9830679 informó de una sustitución de suero KnockOut (KOSR), y un medio de citoblastos embrionarios libre de suero que contenía la misma. Sin embargo, este medio no puede soportar la proliferación y generación de células iPS.

Hasta la fecha, no hay bibliografía que informe de la inducción de células iPS sin suero en el proceso completo en células somáticas de ratón, especialmente fibroblastos que están fácilmente disponibles.

Además, en el estado de la técnica, un método general para inducir citoblastos pluripotentes tiene una eficiencia de inducción de aproximadamente el 0,01-0,5 % en suero bovino fetal sobre células nodrizas en aproximadamente 14 días (véase Qin, D., Li, W., Zhang, J. & Pei, D. Direct generation of ES-like cells from unmodified mouse embryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4. Cell research 17, 959-962 (2007); Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006); Meissner, A., Wernig, M. & Jaenisch, R. Direct reprogramming of genetically unmodified fibroblasts into pluripotent stem cells. Nature biotechnology 25, 1177-1181 (2007); Takahashi, K. et al., Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872 (2007); Yamanaka, S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 1, 39-49 (2007)).

La generación de citoblastos embrionarios o citoblastos pluripotentes inducidos se conoce de los siguientes documentos:

AMIT M ET AL: “Feeder layer-and serum-free culture of human embryonic stem cells”, BIOLOGY OF REPRODUCTION, NEW YORK, NY [U.A.]: ACADEM. PRESS, US, vol. 70, 1 January 2004 (2004-01-01), páginas 837-845, XP002978624, ISSN: 0006-3363, DOI: 10.1095/BIOLREPROD.103.021147; TROND AASEN ET AL: “Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes”, NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 26, no. 11, 1 de noviembre de 2008 (2008-11-01), páginas 1276-1284, XP055019438, ISSN: 1087-0156, DOI: 10.1038/nbt.1503; LUDWIG TENNEILLE E ET AL: “Feeder-independent culture of human embryonic stem cells”, NATURE METHODS, NATURE PUBLISHING GROUP, GB, vol. 3, no. 8, 1 de agosto de 2006 (2006-08-01), páginas 637-646, XP008084296, ISSN: 1548-7091, DOI: 10.1038/NMETH902; documentos US 2009/081784 A1; WO2009/0231 A1; VANESSA DING ET AL: “Deciphering the Importance of Three Key Media Components in Human Embryonic Stem Cell Cultures”, BIOTECHNOLOGY LETTERS, SPRINGER NETHERLANDS, DORDRECHT, vol. 28, no. 7, 1 de abril de 2006 (2006-04-01), páginas 491-495, XP019231244, ISSN: 1573-6776, DOI: 10.1007/S10529-006-0005-8; y documento WO 2006/044204 A2.

Así, la presente invención proporciona un medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes en ausencia de células nodrizas de un modo más rápido con mayor eficiencia que el estado de la técnica.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un medio sin suero para cultivar células.

Este medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes comprende un medio basal, un aditivo de sustitución del suero formulado por sustitución de suero KnockOut (KOSR) y suplemento de N2, factor inhibidor de leucemia (LIF) y uno o más factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor seleccionados de al menos uno de bFGF, EGF, IGF2 o VEGF, en el que bFGF tiene una concentración de 3 ng/ml a 20 ng/ml en el medio final.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir citoblastos pluripotentes de células somáticas con alta eficiencia usando el medio sin suero anterior, que comprende:

(a): introducir uno o más factores de citoblastos pluripotentes en células somáticas;

(b): cultivar las células somáticas resultantes en (a) en el medio sin suero de la presente solicitud en condiciones adecuadas para el crecimiento celular de manera que se induzcan y reprogramen las células somáticas en citoblastos pluripotentes;

(c): detectar y analizar las células inducidas para pluripotencia;

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(d): recoger monoclones pluripotentes de los citoblastos pluripotentes inducidos;

(e): cultivar las células monoclónicas en (d) en condiciones adecuadas para el crecimiento de citoblastos embrionarios.

La presente invención se refiere además a un método para inducir pluripotencia, que, además de las etapas anteriores de (a)-(e), comprende además introducir un gen indicador en las células somáticas, y antes de la etapa (c), indicar la generación de citoblastos pluripotentes y detectar primero la eficiencia de la misma mediante el gen indicador.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere además a los usos del medio sin suero de la presente invención en inducir y reprogramar rápidamente células somáticas en citoblastos pluripotentes con alta eficiencia.

Finalmente, la presente invención se refiere además a los usos del medio de la presente invención en compuestos de cribado, especialmente compuestos de cribado de alta resolución usando citoblastos pluripotentes inducidos en el sistema iPS.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Fig. 1: Células MEF infectadas con cuatro factores (4F, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc) no pueden crecer en medio mKSR y no pueden producir colonias de iPS. El control es células iPS cultivadas en un medio de suero (mES) usando un método clásico conocido. Escala, 100 µm. Fig. 2: iPS-SF1 libre de suero puede soportar la generación de células iPS mejor que un medio de citoblastos con suero.

a.: Curvas de crecimiento de células MEF en medio FBS y medio iPS-SF1 (n = 3).

b.: Se realizó análisis de FACS para células positivas para Oct-GFP en células MEF infectadas con cuatro factores (4F, Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc) o tres factores (3F, Oct4, Sox2 y Klf4) en diferentes momentos de tiempo. Las células infectadas se cultivaron en medio mES y medio iPS-SF1, respectivamente. N = 2; la barra de error indica d.e.

c.: Células MEF infectadas con los cuatro factores se cultivaron en medio mES y medio iPS-SF1, respectivamente. Seis días después se encontró que Oct4-GFP, que indica células, se reprogramaron en células pluripotentes que solo se expresaron en las células cultivadas en medio iPS-SF1 y se formó morfología clónica, mientras que Oct4-GFP no se expresó en las células mES cultivadas en medio de suero clásico mES. Escala, 100 µm.

Fig. 3: La línea de citoblastos pluripotentes inducidos (iPS) obtenida con el medio sin suero iPS-SF1 tiene pluripotencia.

a.: La línea celular iPS obtenida de cultivo de iPS-SF1 después de la infección tiene morfología clónica protuberante similar a citoblastos de ratón típicos y expresó fuertemente Oct4-GFP, que indica pluripotencia.

b.: La línea celular iPS obtenida de cultivo de iPS-SF1 después de la infección puede dar lugar a un ratón quimérico después de inyectarse en una blástula. La blástula de donante es un ratón ICR blanco y pelo negro sobre el ratón indica que se ha producido quimerismo, que demuestra que la línea celular iPS establecida por el cultivo de iPS-SF1 puede implicar desarrollo in vivo normal.

Fig. 4: Bajo ocho condiciones de cultivo diferentes y en el día 7 después de la infección, el porcentaje de células positivas para Oct4-GFP se midió cuando estaban infectadas con los cuatro factores, como se ha descrito anteriormente. El valor de la muestra de iPS-SF1 se fija para ser 1. Las cuatro barras izquierdas indican los efectos positivos producidos cuando los tres suplementos se añaden respectivamente a iPS-SF1. El medio vacío se complementa con DMEM que contiene 10 % de KOSR. Las cuatro barras derechas indican los efectos negativos producidos después de eliminar cada uno de estos componentes de iPS-SF1. Fig. 5: El suero es un fuerte inhibidor de la reprogramación. Para las células MEF infectadas con los cuatro factores, el porcentaje de células positivas para Oct4-GFP se analizó en el día 7 después de la infección. El suero se complementó en iPS-SF1 en diferentes concentraciones. N = 2; la barra de error indica d.e. Fig. 6: Con iPS-SF1 como herramienta de cribado, se seleccionaron los compuestos diana para vías de señalización comunes. La línea de puntos muestra el valor de la muestra de control que se fija para ser 1. n = 2; la barra de error indica d.e. Fig. 7: Análisis de la metilación del promotor de Nanog en el proceso de iPS mediado por tres factores Oct4/Sox2/Klf4. Se cultivaron fibroblastos infectados con los tres factores en mES (medio con suero) y iPS-SF1, respectivamente. Se tomaron muestras en el día 2 y día 6 después de la infección para analizar el estado de metilación del promotor de Nanog usando el método de secuenciación de bisulfato, en el que los círculos blancos representan pares de nucleótidos CpG sin metilar, mientras que los círculos negros representan pares de nucleótidos CpG metilados. Fig. 8: Efectos de diferentes factores de crecimiento (incluyendo tirosina cinasa y estrógeno) en la reprogramación. Los factores de crecimiento mostrados en la figura se añadieron respectivamente en iPS-SF1 sin ningún factor de

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crecimiento, y se analizó Oct4-GFP en el día 7 después de la infección, en el que E2 es un estrógeno y el medio FBS se usa como control negativo. n = 2; la barra de error indica d.e. Fig. 9: Gráficos de FACS representativos de células MEF infectadas cultivadas en diferentes medios. La señal de la vía de PE se usa como control autofluorescente. Para iPS-SF1, las colonias de Oct4-GFP mejoraron significativamente en el día 7 después de la infección tanto en células MEF infectadas con los cuatro factores como en células MEF infectadas con los tres factores.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Definiciones y tecnologías

A menos que se indique lo contrario, la presente invención se pondrá en práctica usando tecnologías tradicionales de biología molecular, microbiología, biología celular, inmunología y ADN recombinante, que se clasifican en el campo técnico de la materia. Véanse, por ejemplo, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition (2002); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel et al. (Eds) (1987)); Series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and GR. Taylor (Eds), (1995)), Harlow and Lane (Eds), (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney (Editor), (1987)); W. French Anderson et al., HANDBOOK OF STEM CELLS, Vol. 2.

A menos que se establezca de otro modo, todos los términos usados en el presente documento tienen los significados convencionalmente percibidos por aquellos expertos en la materia. Para un fácil entendimiento de la presente invención, algunos términos usados en el presente documento se definen como sigue.

Como se usa en la memoria descriptiva y reivindicaciones, la forma en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluye referencias en plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Por ejemplo, el término “una célula” incluye una pluralidad de células, que incluye mezclas de las mismas.

Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, que incluyen intervalos, son aproximaciones. Debe entenderse, aunque no siempre se establezca explícitamente, que el término “aproximadamente” debe proporcionarse delante de todas las designaciones numéricas. También debe entenderse, aunque no siempre se establezca explícitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son simplemente a modo de ejemplo y que equivalentes de tales reactivos se conocen en la técnica.

Los “citoblastos pluripotentes inducidos (células iPS)” descritos en el presente documento son aquellas células que se derivan de células somáticas mediante la inducción in vitro de células somáticas por factores de citoblastos pluripotentes que pueden inducir la reprogramación de células somáticas. Bajo condiciones de cultivo de células ES, las células iPS son muy similares a las células de ratón ES en morfología celular, propiedades de crecimiento, expresión de marcadores de superficie, formación de teratoma que comprende la estructuras de histiocito de las tres capas germinativas cuando se trasplantan subcutáneamente, y también son casi idénticas a células ES de ratón en patrones de metilación de ADN, perfiles de expresión génica, estado de cromatina y generación de animales quiméricos, o similares.

El término “medio basal” usado en la presente invención se refiere a cualquier medio que pueda soportar el crecimiento celular. El medio basal proporciona sales inorgánicas estándar tales como cinc, hierro, magnesio, calcio y potasio, vitaminas, glucosa, sistema tampón y aminoácidos clave. El medio basal que puede usarse en la presente invención incluye, pero no se limita a, medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio basal de Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F-12, medio esencial mínimo α (αMEM), medio esencial mínimo de Glasgow (G-MEM) y medio Dulbecco modificado por Iscove. Aquellos expertos en la materia ya saben cómo seleccionar un medio basal adecuado para las células que van a cultivarse. En una realización preferida, el medio basal es una mezcla de DMEM y F12 (1:1) o DMEM con alta glucosa. En una realización más preferida, el medio basal es DMEM con alta glucosa (por ejemplo, 4,5 g/l).

Como se usa en la presente invención, el término “aditivo de sustitución del suero” se refiere, en cultivo celular, a un aditivo que se añade al medio basal para sustituir parcialmente o completamente la función del suero en soportar la supervivencia o crecimiento celular. Generalmente, incluye insulina, transmetaloproteína, oligoelemento, vitamina u otros factores. Estos factores generalmente no están incluidos en el medio basal, pero se proporcionan por el suero generalmente usado en el cultivo de células. El aditivo de sustitución del suero comprende al menos uno o más de los siguientes componentes que soportan el crecimiento celular: una o más insulinas o sustituciones de las mismas, una o más transmetaloproteínas o sustituciones de las mismas, uno o más oligoelementos, una o más vitaminas, uno o más aminoácidos, una o más hormonas o compuestos tipo hormona, albúmina de suero o sustituciones de la misma, y uno o más lípidos. Muchos aditivos de sustitución del suero comercializados, tales como la sustitución de suero KnockOut (KOSR), N2, B27, suplemento de insulina-transferrina-selenio (ITS) y G5 son muy conocidos y están fácilmente disponibles para aquellos expertos en la materia. Estos aditivos se caracterizan por componentes bien definidos, de manera que las concentraciones de sus componentes pueden determinarse basándose en su proporción en el medio.

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Aquellos expertos en la materia pueden preparar fácilmente un aditivo de sustitución del suero basándose en el estado de la técnica, el tipo de células que van a cultivarse, y otros aspectos. El aditivo de sustitución del suero usado en el presente documento es un aditivo de mezcla obtenido mezclando KOSR y 10 N2 en cierta relación. Lo más preferentemente, en el medio final, KOSR tiene una concentración del 10 % y N2 tiene una concentración del 0,5 %.

La tirosina cinasa de receptor usada en la presente invención incluye factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor que tienen las propiedades de tirosina cinasas de receptor y está seleccionada de bFGF, EGF, IGF2 o VEGF. Lo más preferentemente, la tirosina cinasa de receptor es bFGF. Basándose en el tipo de células que van a cultivarse y otras condiciones, aquellos expertos en la materia pueden determinar fácilmente la concentración suficiente de la tirosina cinasa de receptor que va a añadirse para mantener el crecimiento celular. La concentración es aproximadamente 3-20 ng/ml, más preferentemente aproximadamente 5-15 ng/ml, y lo más preferentemente aproximadamente 7 ng/ml. En una realización preferida, el medio de la presente invención puede comprender aproximadamente 5 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de EGF, 25 ng/ml de IGF2 y/o 10 ng/ml de VEGF. En la realización más preferida, el medio de la presente invención comprende aproximadamente 5 ng/ml de bFGF.

Como se usa en el presente documento, LIF se refiere a factor inhibidor de leucemia que es un factor de crecimiento que se añade frecuentemente a citoblastos en cultivo como se conoce en la técnica. Aquellos expertos en la materia pueden ajustar la concentración de LIF usada en un medio específico basándose en condiciones específicas. En el medio de la presente invención, la concentración de LIF añadida al medio está preferentemente en el intervalo de 500 U/ml a 2000 U/ml, más preferentemente en el intervalo de 700 U/ml a 1400 U/ml, y lo más preferentemente aproximadamente 1000 U/ml.

Como se conoce por aquellos expertos en la materia, con el fin de facilitar el crecimiento celular, otros componentes pueden añadirse opcionalmente al medio. Aquellos expertos en la materia ya saben cómo seleccionar otros componentes (tales como L-glutamina, NEAA MEM y 2-mercaptoetanol) requeridos por un medio específico basado en células que van a cultivarse y otras condiciones.

El medio sin suero según la presente invención se prepara por tecnologías convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia, por ejemplo, las tecnologías y condiciones para mezclar la preparación de suero como se describe en A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney (Editor), 1987); W. French Anderson et al., HANDBOOK OF STEM CELLS.

El término “célula somática” usada en el presente documento es un concepto que es opuesto a “célula germinativa” y “citoblasto embrionario”. Las células somáticas son células que se generan por diferenciación de “citoblastos embrionarios” y ya no poseen pluripotencia, pero tienen una función específica. Específicamente, las células somáticas son células que se generan por diferenciación de “citoblastos embrionarios” o desarrollo adicional de las masas de células internas y ya no poseen pluripotencia, pero tienen una función específica. Generalmente, las células somáticas se toman de ratones fetales que han pasado de la etapa de blástula (para ratones, siendo específicamente 3,5 días después de la fecundación) con respecto a la etapa de desarrollo o a partir de ratones adultos. Al tomar las células, generalmente deben evitarse células posiblemente pluripotentes germinativas y sus fuentes (tales como espermatogonio primitivo, citoblastos de la cresta genital). Las células somáticas usadas en el presente documento se derivan preferentemente de mamíferos, más preferentemente de ser humano, mono, perro, gato, rata o ratón, y lo más preferentemente de ratón. Las células somáticas en el presente documento pueden ser cualquier tipo de células somáticas en el organismo, preferentemente fibroblastos o meningocitos.

El “factor pluripotente de citoblastos que puede inducir la reprogramación de células somáticas” descrito en el presente documento es un factor crítico para mantener la pluripotencia de citoblastos. La introducción del factor en células somáticas puede inducir y reprogramar células somáticas en citoblastos embrionarios bajo ciertas condiciones. Hasta la fecha, numerosas bibliografías han informado de muchos de tales factores usados para reprogramar, véase, por ejemplo, Qin, D., Li, W., Zhang, J. & Pei, D. Direct generation of ES-like cells from unmodified mouse embryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4. Cell research 17, 959-962 (2007); Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-317 (2007); Wernig, M. et al., In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448, 318324 (2007); Yamanaka, S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 1, 39-49 (2007), etc. Hay muchos factores de citoblastos pluripotentes conocidos por aquellos expertos en la materia que pueden usarse para tales fines. Preferentemente, los factores pluripotentes incluyen Oct4, Sox2 (opcionalmente Sox1), C-myc (opcionalmente L-Myc o N-Myc), Klf4 (opcionalmente Klf5 o Klf2), Esrrb, Nanog y Lin28. Los factores pluripotentes descritos anteriormente pueden derivarse de cualquier fuente dependiendo de las células en las que van a introducirse y, preferentemente, son factores pluripotentes de ratón y variantes de los mismos, tales como Sox2 (acceso de NCBI nº: NM_011443.3, caja SRY de ratón que contiene el gen 2); Oct4 (acceso de NCBI nº: NM_013633.2, dominio POU de ratón, clase 5, factor de transcripción 1 (Pou5f1)); Klf4 (acceso de NCBI nº: NM_010637.2, factor 4 tipo Kruppel de ratón); c-Myc (acceso de NCBI nº: NM_010849.4, oncogén de mielocitomatosis de ratón) (c-Myc); Sox1 (acceso de NCBI nº: NM_009233.3, caja SRY de ratón que contiene el gen 1); Klf2 (acceso de NCBI nº: NM_008452.2, factor 2 tipo Kruppel de ratón (pulmón)); Klf5 (acceso de NCBI nº: NM_009769.4, factor 5 tipo Kruppel de ratón); Nanog (acceso de NCBI nº: NM_028016); o Lin28 (acceso

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de NCBI nº: NM_145833). C-Myc también puede sustituirse por sus mutantes L-myc (acceso nº: NM_008506.2, homólogo 1v del oncogén de mielocitomatosis viral v-myc de ratón, derivado de carcinoma de pulmón (aviar)) (Mycl1); o N-Myc (acceso nº: NM_008709.3, oncogén relacionado con el virus de la mielocitomatosis v-myc de ratón, derivado de neuroblastoma (aviar)) (Mycn).

El término “inducir y reprogramar” (algunas veces también abreviado como “inducir”) descrito en el presente documento se refiere a un proceso de desdiferenciación de células somáticas en citoblastos pluripotentes. Preferentemente, las células somáticas pueden inducirse para desdiferenciarse en citoblastos pluripotentes introduciendo ADNc de factor pluripotente requerido para el mantenimiento de pluripotencia de citoblastos en células somáticas (Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006; 126:663-676; Wernig M, Meissner A, Foreman R, et al., Nature. 2007; 448: 318-324; Yu J. Vodyanik MA, Smuga-Otto K et al., Science. 2007; 318: 1917-1920). Entre otros, preferentemente, el factor pluripotente incluye uno o más de Oct4, Sox2 (opcionalmente Sox1), C-myc (opcionalmente L-Myc o N-Myc), Klf4 (opcionalmente Klf5 o Klf2), Nanog y Lin28.

Los métodos para introducir el ADNc de factor pluripotente de citoblastos en células somáticas pueden ser varias tecnologías conocidas por aquellos expertos en la materia, que incluyen infección viral, transfección de liposomas, expresión insercional mediada por transposón, proteína que atraviesa la membrana, inducción de fármaco, electroporación, bombardeo de partículas y otros métodos que introducen ADN en células. Preferentemente, un vector viral que contiene ADNc se usa para transfección. El vector viral incluye una variedad de vectores virales tales como vector lentiviral y vector retroviral, y se prefiere vector retroviral (tal como vector pMX), como se describe en los ejemplos.

“Condiciones adecuadas para crecimiento celular”, como se describe en el presente documento, son condiciones convencionales para cultivar citoblastos en la materia e incluyen algunas modificaciones que son adecuadas para líneas celulares específicas, pero no influyen en las propiedades básicas de las células. Para los métodos de cultivo y condiciones, véase W. French Anderson et al., HANDBOOK OF STEM CELLS, Vol. 2.

El gen indicador descrito en el presente documento se refiere a ser capaz de indicar que una célula ha sido transformada mediante inducción externamente aplicada para alcanzar una etapa similar al citoblasto embrionario, que incluye introducción de una secuencia que expresa proteína fluorescente o resistencia por medio de transgén o recombinación homóloga. Esta secuencia está bajo el control de los promotores para algunos genes específicamente expresados por citoblastos embrionarios. Por tanto, la expresión de esta proteína fluorescente o gen de resistencia puede activarse cuando esta célula alcanza el estado de citoblasto embrionario de forma que esta célula pueda poseer algunas características detectables (tales como verde brillante) para diferenciarse de otras células que no se reprograman a este estado. Genes indicadores comunes usados en la materia incluyen proteína verde fluorescente, genes de resistencia tales como genes de resistencia a ampicilina, o similares. Aquellos expertos en la materia pueden seleccionar genes indicadores adecuados para diversas realizaciones basándose en las condiciones de cultivo y usos de células. Véanse, por ejemplo, Young II Yeom et al., Germline regulatory element of Oct-4 specific for the totipotent cycle of embryonal cells, Development 122,000-000 (1996), Printed in Great Britain, The company of Biologists Limited 1996, P881-894; Shin-ya Hatano et al., Pluripotential competence of cells associated with Nanog activation, Mechanisms of Development 122(2005), 67-79.

Los métodos para detectar pluripotencia de células como se describe en el presente documento son muy conocidos por aquellos expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Yamanaka, S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 1, 39-49 (2007), etc. Los métodos incluyen identificación de la expresión del marcador molecular pluripotente, detección del estado de metilación de células, formación del cuerpo embrionario (EB), formación de teratoma, generación de ratón quimérico usando citoblastos pluripotentes inducidos, etc.

“Ratón quimérico”, como se describe en el presente documento, se implementa mediante la tecnología de “ratones quiméricos” muy conocida por aquellos generalmente expertos en la materia. Esto implica inyectar citoblastos embrionarios o las células iPS obtenidas mediante la tecnología descrita en el presente documento en una blástula de ratón para mezclar con las células embrionarias en su interior y luego cultivar y desarrollarlas juntas en el útero del ratón madre de alquiler. Después del parto, el ratón tiene sus tejidos compuestos de estas dos células embrionarias juntas en mezcla, precisamente como patrones en mosaico. Un ratón tal se llama un ratón quimérico (Evans M J, et al.; The ability of EK cell to form chimeras after selection of clones in G418 and some observation on the integration of retroviral vector proviral DNA into EK cells [M]; Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology; 1985; Xian MW, Wu BY, Hu XL, Shang KG, Wu HL, 1996. Construction of chimeric mice of ES cells by microinjection method. Hereditas (Beijing) 18(1): 7-10 (en chino)). La evidencia más directa y crítica para verificar si las células iPS y citoblastos embrionarios tienen propiedades similares se basa en si las células iPS pueden conducir a la formación de ratones quiméricos.

“Compuestos de cribado”, como se describe en el presente documento, significa cribar en una biblioteca de compuestos especificada, mediante la verificación de las características del gen indicador o la propia célula, para: 1. compuestos que afectan las condiciones del proceso e inducción de iPS; 2. compuestos que pueden sustituir algunos o todos de actualmente los factores conocidos requeridos por el proceso de inducción de iPS. Aquellos

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expertos en la materia han desarrollado métodos para cribar compuestos usando el proceso de iPS, véase, por ejemplo, Yan Shi et al., Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by Oct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds, Cell Stem Cell 3, 568-574, Nov. 6, 2008.

El método de cribado de “alta resolución”, como se describe en el presente documento, es conocido por aquellos expertos en la materia, en el que la función de cada individuo en una gran biblioteca en un modelo de prueba especificado puede cribarse en un periodo de tiempo corto usando instrumentos automáticos y pequeño tamaño de muestra. Véase, por ejemplo, Nil Emre, et al., A chemical approach to stem cell biology, Current Opinion in Chemical Biology 2007, 11: 252-258. En este método, se realiza cribado de alto rendimiento para el proceso de iPS en bibliotecas de compuestos y bibliotecas de productos naturales de gran orden de magnitud.

Ejemplos

Las prácticas de laboratorio estándar de los inventores se ilustran en los siguientes ejemplos que se usan para ejemplificar el modo de la presente invención. El alcance de la presente invención no debe interpretarse como que esté limitado a estos ejemplos. Según lo que se desvela en el presente documento y el nivel común de aquellos expertos en la materia, debe apreciarse que los siguientes ejemplos son solo para ilustración y pueden someterse a diversos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance de la presente invención. A menos que se establezca de otro modo, todas las tecnologías en cuestión son tecnologías convencionales en la biología molecular, biología celular, bioquímica, u otros campos que son muy conocidos por aquellos expertos en la materia.

Resumen de tecnologías usadas en la presente invención:

A menos que se establezca específicamente, todas las sustancias mencionadas en el presente documento son de Invitrogen.

Cultivo celular:

Se derivaron fibroblastos embrionarios de ratón del embrión en e13,5 de hemicigotos para el alelo del transgén Oct-GFP y el alelo Rosa26, y se cultivaron en el siguiente medio de fibroblastos: DMEM con alta glucosa, complementado con 10 % de FBS, L-glutamina y NEAA. Tanto las células iPS como las células ES se cultivaron sobre la nodriza MEF de un medio que contenía suero (mES) y un medio sin suero (mKSR). La designación y composición de medios individuales en el presente documento se muestran en la Tabla 1 en detalle. Las células nodrizas MEF se habían desactivado por mitomicina C.

Tabla 1: Medios usados en el presente documento

Composición: Designación mES mKSR FB-SF1 iPS-SF1

Medio Basal: DMEM con alta glucosa Knock Out DMEM DMEM/F1 2 (1:1) DMEM con alta glucosa

Serum o aditivo reemplazable de serum: 15% FBS 10% KOSR 10% KOSR 0.5% N2 10% KOSR 0.5% N2

Factor de crecimiento: 1000U/mL LIF (Miliporo) 1000U/mL LIF 1000U/mL LIF 5ng/mL bFGF 1000U/mL LIF 5ng/mL bFGF

Otros componentes: 2mM L-glutamina 1/100 NEAA MEM 0.1mM 2mercaptoetanol 1mM sodio piruvato Penicilina/ estreptomicina (Hiclona) 2mM L-glutamina 1/100 NEAA MEM 0.1mM 2mercaptoetanol Penicilina/ estreptomicina 2mM Lglutamina 1/100 NEAA MEM Penicilina/ estreptomicina 2mM L-glutamina 1/100 NEAA MEM 0.1mM 2mercaptoetanol Penicilina/ estreptomicina

Producción de retrovirus y generación de células iPS:

Se compraron los vectores retrovirales (pMX) para ADN que comprenden Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc de ratón de Addgene. La generación e infección de virus se realizaron según la tecnología existente (Qin, D., Li, W., Zhang, J. & Pei, D. Direct generation of ES-like cells from unmodified mouse embryonic fibroblasts by Oct4/Sox2/Myc/Klf4. Cell

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research 17, 959-962 (2007); Qin, D. et al., Mouse meningiocytes express Sox2 and yield high efficiency of chimeras after nuclear reprogramming with exogenous factors. J Biol Chem 283, 33730-33735 (2008)). En resumen, estos plásmidos se transfectaron en células PlatE usando métodos convencionales; entonces, el sobrenadante viral se recogió y se filtró durante 48 horas con el fin de infectar células MEF, en el que se complementó polibreno. En el día 2, se repitió el mismo procedimiento. El día en el que el sobrenadante viral se elimina se define como el día 0 después de la infección. Los fibroblastos infectados con virus (es decir, transfectados con Oct4, Sox2, Klf4 y/o c-Myc; en lo sucesivo, a menos que se establezca especialmente, la infección con tres factores representa la infección con Oct4, Sox2 y Klf4 y la infección con cuatro factores representa la infección con Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc) se cultivaron en el medio de la presente invención, y 10-15 días después de la infección, las colonias de iPS se recogieron basándose en Oct-GFP (es decir, colonias que emiten fluorescencia bajo un microscopio de fluorescencia) y morfología de ES típica. Después, las colonias recogidas se expandieron y se mantuvieron como células ES (como arriba, Qin, D., Li, W., Zhang, J. & Pei, D, 2007; y Qin, D. et al., 2008).

Cuantificación de la eficiencia de reprogramación:

El principal método para cuantificar la eficiencia de reprogramación es el análisis de FACS para células positivas para Oct4-GFP. Basándose en los resultados del proceso de sincronización, las células MEF infectadas se digirieron con tripsina en los días 7 y 9 después de la infección y a continuación se analizaron mediante FACSCalibur. Células positivas para GFP recibieron las puertas de señales de control de la vía de PE, y se registraron 15.000 acontecimientos como mínimo. Las células infectadas con pMXs-FLAG se usaron como control negativo. Con el fin de verificar la eficiencia como se analiza por FACS, las colonias positivas para GFP se contaron directamente bajo un microscopio de fluorescencia en el día 14 después de la infección.

Caracterización de células iPS:

Se realizaron tinción con fosfatasa alcalina y tinción por inmunofluorescencia (como arriba, Qin, D., Li, W., Zhang, J. & Pei, D, 2007; y Qin, D. et al., 2008). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: de ratón anti-Oct4 (Santa Cruz), de ratón anti-SSEA1 (Abcam) y de ratón anti-Nanog (Abcam).

Ejemplo 1: El medio de mKSR tradicional no puede mantener el crecimiento de células MEF transfectadas con los cuatro factores, y mientras tanto no puede inducir la formación de células iPS.

Como se ha descrito anteriormente, los virus de los cuatro factores se mezclaron en 1:1:1:1 (1 ml cada uno) y a continuación se infectaron en totalmente 35.000 fibroblastos en un pocillo de una placa de seis pocillos y se cultivaron en medio mKSR y medio mES, respectivamente a 37 ºC con 5 % de CO2.

Como se muestra en la Fig. 1, los fibroblastos transfectados con los cuatro factores y cultivados en mKSR crecieron lentamente y todavía no formaron morfología de colonia de células pluripotentes, que indica que el medio mKSR no puede inducir y generar colonias de iPS.

Ejemplo 2: El uso de medio iPS-SF1 puede aumentar enormemente la eficiencia de inducir células iPS.

A. Se cultivaron células MEF en medio FBS y medio iPS-SF1, respectivamente. Las curvas de crecimiento de las mismas son casi idénticas, que indica que iPS-SF1 no tiene efecto sobre el cultivo celular de MEF. A diferencia, el crecimiento de células MEF se detuvo sustancialmente en mKSR (Fig. 2A).

Después de transfectarse tres factores (Oct4, Klf4 y Sox2) o cuatro factores (cMyc, Oct4, Klf4 y Sox2) en fibroblastos, las células transfectadas se cultivaron en medio iPS-SF1 respectivamente y la eficiencia de células positivas para GFP se midió como se ha descrito anteriormente en los días 2, 5 y 7 después de la transfección. Se observó que todas las células, que tanto estaban transfectadas con los cuatro factores como los tres factores, presentaron alta eficiencia (Fig. 2B) e incluso alcanzaron una eficiencia del 18 % en el día 7. Así, esto es una gran mejora en comparación con métodos tradicionales (control de mES como se muestra).

Por consiguiente, en este proceso, la observación directa usando un microscopio de fluorescencia también pudo encontrar que, para las células transfectadas cultivadas en medio iPS-SF1, clones tipo ES que expresan fuertemente Oct4-GFP, aparecieron en el día 6 después de la transfección, mientras que los clones formados en el medio tradicional no expresaron fluorescencia (Fig. 2C).

Similarmente, como se muestra en la Fig. 9, células MEF infectadas con los tres factores y los cuatro factores se recogieron respectivamente en el día 7 y a continuación se analizaron para eficiencia por FACS, que indica que la eficiencia de reprogramación de iPS (que como se ha descrito anteriormente, se representa por el porcentaje de células positivas para Oct4-GFP en células globales) de las células MEF infectadas es mucho mayor que en el medio mES convencional (iPS-SF1 frente a mES: tres factores: 0,07 % frente al 17,82 %; cuatro factores: 0,10 % frente al 15,07 %).

Ejemplo 3: Células iPS inducidas por iPS-SF1 poseen pluripotencia.

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A. La morfología celular de la línea celular iPS obtenida mediante inducción es similar a la del citoblasto embrionario.

Como se ha descrito anteriormente, se infectaron fibroblastos con los tres factores y a continuación se cultivaron en medio iPS-SF1 todo el tiempo. En los días 12-14 después de la infección, se recogieron coágulos de clones representativos basándose en la morfología de clones y la expresión de fluorescencia, y se formaron líneas celulares de iPS uniformes después de varias generaciones de pase estable.

Como se muestra en la Fig. 2A, el panel izquierdo muestra citoblastos embrionarios normales y el panel derecho muestra las líneas celulares iPS descritas anteriormente. Estas líneas celulares son muy similares a citoblastos embrionarios en morfología y expresan fuertemente la fluorescencia verde de Oct4-GFP.

B. La formación de ratones quiméricos confirma que las líneas celulares iPS obtenidas mediante inducción poseen pluripotencia.

Construcción de ratones quiméricos

Se tomaron blástulas para inyección de ratones hembra ICR en superovulación de cuatro semanas de edad (blancos). Estos ratones se alojaron con ratones macho en la misma jaula. 3,5 días después de la manifestación de un tapón eyaculatorio (el día que el tapón se observa es 0,5 días), se recogieron embriones del útero y las trompas de Falopio, se transfirieron a gotitas de cultivo M16 recubiertas por aceite de parafina y se incubaron en una estufa de incubación a 37 ºC con 5 % de CO2.

Tres horas antes de la inyección, células iPS para quimerismo (es decir, las líneas celulares iPS obtenidas anteriormente) se proveyeron en su lugar de medio de cultivo fresco, se digirieron con tripsina y a continuación se prepararon en suspensión de células individuales para uso posterior. Se transfirieron cantidades apropiadas de suspensión de células iPS y embriones en la etapa de blástula a gotitas de inyección M2, la blástula se fijó con una pipeta de sujeción bajo el sistema de microinyección y las células iPS se extrajeron con una pipeta de inyección, en el que la pipeta se insertó en la nodriza lejos de la masa de células internas, y cada blástula se inyectó con 10-12 células. El blastocele desapareció después de la inyección. La blástula se incubó durante 1-3 horas en el medio de cultivo en la estufa de incubación, y después de recuperarse el blastocele, se transfirió al útero de ratones madre pseudopreñados que se habían apareado durante 2,5 días para crecer en su interior.

La Fig. 3-B muestra los ratones quiméricos construidos con células iPS obtenidas usando el método de la presente invención, en el que los ratones no quiméricos son puros blancos, mientras que los ratones quiméricos presentan color del cuerpo negro alterno con blanco debido a que las células iPS inyectadas en ellos se consiguen de ratones OG2/Rosa26 negros. Esto demuestra que las células iPS obtenidas según el método de la presente invención pueden participar en el desarrollo in vivo normal y generar ratones quiméricos, que indica que estas células no se diferencian de citoblastos embrionarios en desarrollo.

Ejemplo 4: El medio de la presente invención acelera la desmetilación de los promotores para genes pluripotentes en el proceso de inducción de iPS.

Se adquirieron ADN genómicos (700 ng) de las líneas celulares (preparadas como se ha descrito anteriormente) infectadas con los tres factores Oct4, Sox2 y Klf4 y se cultivaron en medio mES y el medio iPS-SF1 de la presente invención, y se expusieron a una mezcla de 50,6 % de bisulfito de sodio (Sigma S-1516) e hidroquinona 10 mM (Sigma H-9003) durante la noche de manera que se modificaran por bisulfito. La región promotora de Nanog se amplificó por PCR usando el par de cebadores expuesto en la Tabla 2. El producto de PCR se clonó en el vector pMD8-T plano (Takara), proliferó en DH5α y se secuenció.

Tabla 2

Gen: Cebador directo (5’-3’) Cebador inverso (5’-3’)

Met-Nanog: imagen1

En el transcurso de la inducción de células iPS, por último lugar, se necesita activar endógenamente genes pluripotentes expresados de manera que mantengan espontáneamente la auto-renovación de células iPS independiente de la expresión exógena. Por consiguiente, la reprogramación va acompañada de la desmetilación de los promotores para genes pluripotentes. En este ejemplo, se infectaron células MEF con tres virus Oct4, Sox2 y Klf4 en 1:1:1 y se cultivaron en el medio mES y el medio iPS-SF1 tradicionales de la presente invención, respectivamente. En los días 2 y 6 después de la infección, se tomaron muestras de células y se extrajeron ADN genómicos, se escindieron con DNasa y a continuación se trataron con bisulfato durante la noche, de forma que la C

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(citosina) en el par de bases de CpG sin metilar cambió a U (uracilo). Después, el promotor de Nanog se produjo mediante proliferación usando PCR anidada y a continuación se entregó a una empresa de secuenciación conocida en la técnica (tal como Invitrogen) para secuenciación. Basándose en los resultados de secuenciación, se analizaron los cambios en la metilación del promotor Nanog en el proceso de iPS.

Como se muestra en la Fig. 7, para células MEF infectadas con los tres factores, el promotor Nanog se desmetiló lentamente en mES (D2: 33 %, D6: 41,7 %), mientras que en el medio de la presente invención (iPS-SF1), esta desmetilación avanzó rápidamente y alcanzó el 66,7 % en el día 2, y a continuación avanzó continuamente y alcanzó el 80,9 % en el día 6. Esto indica que el fragmento detectado en el promotor Nanog se ha activado sustancialmente. La activación del factor de citoblastos pluripotentes típico Nanog indica la inducción de células iPS.

Como puede apreciarse del ejemplo anterior, el medio iPS-SF1 de la presente invención puede inducir satisfactoriamente la reprogramación de células iPS. Además, esta reprogramación inducida puede evitar la infección por el gen c-Myc carcinogénico. Además, para el medio iPS-SF1 de la presente invención, su eficiencia de reprogramación y velocidad de desmetilación son muy superiores a aquellos del medio mES existente.

Ejemplo 5: Efectos de componentes individuales del medio de la presente invención sobre la eficiencia de reprogramación de iPS

LIF, N2 y bFGF en medio iPS-SF1 como se enumeran en la Tabla 1 se delecionaron respectivamente, o N2 y bFGF se añadieron a DMEM + 10 % de medio KOSR (es decir, que no contiene factor de crecimiento pero que contiene NEAA, L-glutamina u otros componentes al mismo tiempo, llamado bKSR en lo sucesivo) a concentraciones equivalentes a la de iPS-SF1, respectivamente, con el fin de detectar los efectos de LIF, N2, bFGF sobre la eficiencia de reprogramación de iPS de células MEF transfectadas con los cuatro factores. Los signos en la Fig. 4 tienen los siguientes significados:

Vacío: bKSR Vacío + LIF: bKSR + LIF Vacío + N2: bKSR-LIF + N2 Vacío + bFGF: bKSR-LIF + bFGF iPS-SF1 -LIF: iPS-SF1 libre de LIF iPS-SF1 -N2: iPS-SF1 libre de N2 iPS-SF1 -bFGF: iPS-SF1 libre de bFGF

Así, puede observarse que los efectos de bFGF sobre la eficiencia de reprogramación de iPS son incluso superiores a aquellos de LIF conocidos en la técnica.

Ejemplo 6: Efectos inhibidores del suero sobre la reprogramación de células iPS cultivadas en medio iPS-SF1

Como se muestra en la Fig. 5, cuando el 2 %, 4 %, 6 %, 8 % y 10 % de los sueros se añadieron a medio iPS-SF1, respectivamente, el suero inhibió la eficiencia de reprogramación de iPS el 96 % como máximo, que es diferente del estado de la técnica conocido.

Ejemplo 7: Efectos de otras tirosina cinasas sobre el medio de la presente invención

Con el fin de verificar si otras tirosina cinasas y estrógenos pueden desempeñar una función en inducir la reprogramación de células iPS en el medio de la presente invención, después de infectar células MEF con los virus con cuatro factores, en su lugar se usaron los siguientes medios, en los que el control del blanco fue iPS-SF1 sin bFGF, el grupo experimental fue del medio del blanco (es decir, iPS-SF1 sin bFGF) complementado con diversas tirosina cinasas de receptor (incluyendo factor de crecimiento de fibroblastos básico bFGF, factor de crecimiento epidérmico EGF, factor de crecimiento endotelial vascular VEGF, factor de crecimiento similar a la insulina 2 IGF2 y estradiol), y se usó un medio de suero (FBS) como control negativo de este experimento.

Como se muestra en la Fig. 8, excepto por bFGF, todas las otras tirosina cinasas tales como EGF, IGF2, VEGF y estrógeno tuvieron efectos comparables sobre la inducción del proceso de reprogramación de iPS.

Ejemplo 8: Cribado de compuestos en el proceso de iPS en medio iPS-SF1

Se sembraron 20.000 células MEF en cada pocillo de una de placa de doce pocillos. El medio fue iPS-SF1. Entonces, las células se infectaron con los virus que se han descrito anteriormente con el fin de transfectarlos con los cuatro factores. Los compuestos como se muestran en la Fig. 6 se añadieron al medio a las siguientes concentraciones respectivamente: PD0325901 (1 µM), CHIR99021 (3 µM), SU5402 (2 µM, EMD Biosciences), Y27632 (10 µM), vitamina E (25 µM, Sigma), vitamina A (1 µM, Sigma), A83-01 (0,5 µM, EMD), SB203580 (2 µM), dorsomorfina (3 µM, Sigma), PFF-α (10 µM), TSA (20 nM, Sigma), VPA (1 mM, EMD), inhibidor de JAK (0,3 µM, EMD), 5aza-DC (1 µM, Sigma), BIX01294 (1 µM), Bayk8644 (2 µM, EMD).

E09843569

01-10-2015

En el día 7 después de la infección, las células se recogieron para análisis de FACS como se ha descrito anteriormente, y se midió la eficiencia de GFP relativa. Puede observarse que TSA y VPA pudieron potenciar significativamente la eficiencia de reprogramación de iPS (100 %). Sin embargo, en condiciones usando el medio de la presente invención, los compuestos que se habían informado previamente como favorables para la auto5 renovación de citoblastos embrionarios de ratón, tales como PD0325901, CHIR99021 y SU5402, redujeron la eficiencia de reprogramación de iPS.

LISTADO DE SECUENCIAS

10 <110> INSTITUTO DE BIOMEDICINA Y SALUD DE GUANGZHOU; ACADEMIA CHINA DE LAS CIENCIAS

<120> NUEVO MEDIO LIBRE DE SERUM PARA INDUCIR RAPIDAMENTE PLURIPOTENTES CON ALTA EFICIENCIA Y METODO DE USO DE LAS MISMAS

15 <130> P09245WO/EP

<150> 200910038883.4

<151> 2009-04-23

20 <150> PCT/CN2009/074358

<151> 2009-09-30

<160> 2

25 <170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 25

<212> ADN 30 <213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador

35 <400> 1 aatgtttatg gtggattttg taggt 25

<210> 2

<211> 25 40 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 45

<400> 2 cccacactca tatcaatata ataac 25

50

55

60

65

NUEVAS CÉLULAS MADRE

Claims

Reivindicaciones

1. Un medio sin suero para inducir citoblastos pluripotentes, que comprende un medio basal, un aditivo de sustitución del suero formulado por sustitución de suero KnockOut (KOSR) y suplemento de N2, factor inhibidor de

5 leucemia (LIF), y uno o más factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor seleccionados de al menos uno de bFGF, EGF, IGF2 o VEGF, en el que el bFGF tiene una concentración de 3 ng/ml a 20 ng/ml en el medio final.
2. El medio de la reivindicación 1, en el que el medio basal incluye medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo (MEM), medio basal de Eagle (BME), F-10, F-12, RPMI 1640, medio esencial mínimo de

10 Glasgow (GMEM), medio esencial mínimo α (αMEM), medio Dulbecco modificado por Iscove y M199, preferentemente DMEM.
3. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el KOSR tiene una concentración de aproximadamente

el 10 % y el suplemento de N2 tiene una concentración de aproximadamente el 0,5 %. 15
4. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que los factores de crecimiento de tirosina cinasa de receptor pueden estar sustituidos con un estrógeno, preferentemente estradiol.
5. El medio de la reivindicación 1, en el que el bFGF tiene una concentración de 5 ng/ml a 15 ng/ml, lo más preferido 20 5 ng/ml a 7 ng/ml.
6. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el EGF tiene una concentración de aproximadamente 10 ng/ml.

25 7. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el IGF2 tiene una concentración de aproximadamente 25 ng/ml.
8. El medio de la reivindicación 1, en el que en el medio final el VEGF tiene una concentración de aproximadamente

10 ng/ml. 30
9. El medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medio incluye adicionalmente otros componentes adecuados para crecimiento celular, en el que los otros componentes están seleccionados de Lglutamina, NEAA MEM, piruvato de sodio y 2-mercaptoetanol.

35 10. Uso del medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un método para inducir citoblastos pluripotentes de células somáticas con alta eficacia, que comprende:

(a) introducir uno o más factores de citoblastos pluripotentes que se ha demostrado que son suficientes para inducir pluripotencia en células somáticas;

40 (b) cultivar las células somáticas resultantes de (a) en el medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones adecuadas para el crecimiento celular de manera que se induzcan las células somáticas en citoblastos pluripotentes;

(c)

detectar y analizar las células inducidas para pluripotencia;

(d)

recoger monoclones pluripotentes de los citoblastos pluripotentes inducidos;

45 (e) cultivar las células monoclónicas de (d) en un medio de citoblastos embrionarios en condiciones adecuadas para el crecimiento de citoblastos embrionarios.
11. Uso del medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un método para cribar compuestos, que

comprende 50

(a)

introducir uno o más factores de citoblastos pluripotentes en células somáticas;

(b)

cultivar las células somáticas resultantes de (a) en el medio de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en condiciones adecuadas para el crecimiento celular de manera que se induzcan las células somáticas en citoblastos pluripotentes;

55 (c) detectar y analizar las células inducidas para pluripotencia;

(d)

recoger monoclones pluripotentes de los citoblastos pluripotentes inducidos;

(e)

cultivar las células monoclónicas de (d) en un medio de citoblastos embrionarios en condiciones adecuadas para el crecimiento de citoblastos embrionarios;

(f)

cribar compuestos usando los citoblastos pluripotentes inducidos cultivados en (d); en el que los compuestos

60 se criban para su capacidad para afectar las condiciones de proceso e inducción iPS o su capacidad de sustitución de algunos o todos los factores actualmente conocidos requeridos por el proceso de inducción de iPS.

14