CN115975907A - 培养基及其应用以及培养心脏类器官的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及类器官培养技术领域，公开了一种培养基及其应用以及培养心脏类器官的方法。本发明提供的培养基成分简单，无需以复杂培养基为基础，而且其中附加的小分子化合物的种类和用量均有所降低，从而大幅降低了心脏类器官培养的成本。本发明提供的培养心脏类器官的方法以上述培养基为基础，流程简单，培养获得的心脏类器官维持时间长，而且能够呈现出与心脏类似的跳动模式，能够很好反应心脏对药物的真实反应，更利于心脏类器官在药物筛选中的推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，具体涉及一种培养基及其应用以及培养心脏类器官的方法。
背景技术
随着我国经济发展的日益进步，药物的开发也逐渐从仿制药转向新药研发。新药的开发通常由细胞实验，动物实验以及临床试验等多个阶段组成。为了提高研发阶段药物毒性结果的可靠性，科研人员构建了许多动物模型与细胞模型用于新药的前期筛选。其中心脏毒性是被各国食品药品监督管理局所指定的必测项目之一。然而由于种间差异，简单廉价的小鼠模型并不能十分准确地描述药物的心脏毒性，导致新药上市后仍存在因毒副作用退市的隐患，不仅浪费了大量的研究经费，还会为药企和研究机构带来许多后续问题，更可能对病人的健康和生命安全带来巨大风险。虽然多功能干细胞分化的心肌细胞(pluripotent stem cell derived-cardiomyocyte，PSC-CM)为广大药企以及科研机构提供了方便的手段，但由于心脏是多细胞组成的复杂器官，单单使用心肌细胞获得的实验数据并不能体现心脏的真实情况。
类器官是目前药物筛选中较为理想的体外模型之一，其相比于细胞实验更能反映器官对于药物的真实反应。同时，相对于小鼠等动物模型，其又具有结果重复性好、不受种间差异影响、结果不受其他器官的影响等优势。奥地利研究团队于2021年成功的实现了人iPSC分化的，具有明显腔体结构的心脏类器官构建(Hofbauer，Pablo，et al.″Cardioidsreveal self-organizing principles of human cardiogenesis.″Cell(2021))。该心脏类器官由心内膜以及心肌细胞组成，拥有可挤压的腔体结构，十分的接近体内心脏的组织学特征，使其成为未来药物筛选模型的可靠选择之一。然而，目前对于类器官的培养，仍存在很多问题，使得类器官药物筛选无法大规模推广。例如，类器官培养所用的培养基通常为特别配制的高糖培养基，其相比于普通培养基而言价格更高，也更容易受到污染。而且通常类器官培养时所用的培养基均需要加入多种小分子物质以促使干细胞分化，并诱导其分化成所需的器官。但是这些小分子物质的价格昂贵，而且许多依赖进口，使得实验的开展受到供货掣肘。而且，培养基的成分越复杂，配制过程就越容易出错，最终导致实验失败或结果产生较大误差，这不仅会提高新药开发的成本，还可能使得开发出的药物的安全性得不到保证。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种培养基及其应用以及培养心脏类器官的方法。本发明提供的培养基具有成分简单、高价小分子化合物用量少，且无需采用复杂培养基即可诱导iPSC分化获得具有腔体结构且能够跳动的心脏类器官等优点。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种培养基，所述培养基包括基础培养基和附加成分，其中，所述基础培养基选自RPMI 1640培养基或IMDM培养基，所述附加成分包括牛血清白蛋白、L-抗坏血酸-2-磷酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和丙酮酸钠。
本发明第二方面提供第一方面所述的培养基在类器官培养、贴壁细胞中的应用。
本发明第三方面提供一种具有心脏类器官分化功能的培养基，所述培养基包括第一方面所述的培养基和小分子组合物A，其中，所述小分子组合物包括LY294002、激活素A、骨形成蛋白-4、CHIR99021和胰岛素。
本发明第四方面提供一种培养心脏类器官的方法，所述方法包括将由诱导多功能干细胞或胚胎干细胞培养获得的拟胚体置于培养基A中进行分化诱导培养，所述培养基A为第三方面所述的培养基。
本发明第五方面提供第四方面所述的方法培养获得的心脏类器官。
通过上述技术方案，本发明至少能够取得如下有益效果：
(1)本发明提供的培养基成分简单，配制相对容易，且其所需原料易于获得，价格也较为低廉。
(2)本发明提供的方法中，FGF2的用量大大减少，进一步节约了心脏类器官培养的成本，更利于心脏类器官在药物筛选中的推广应用。
(3)采用本发明提供的培养基和方法培养获得的心脏类器官能够表达心肌细胞特异性标志物TNNT2以及心瓣膜的特异性标志物NFATC 1，并且形态学上接近胚胎发育早期的心瓣膜状态。此外，该心脏类器官还能够呈现两段不同的收缩幅度和收缩快慢的搏动形态，十分接近心脏的新房心室跳动模式。采用该心脏类器官进行药物筛选的结果能够更好地反映心脏对药物的真实反应，使得筛选结果具有更高的参考价值和可信度。
(4)采用本发明提供的培养基和方法培养获得的心脏类器官能够维持较长时间(至少15-30天)，相比于细胞实验每进行一次药物筛选实验就需要培养一批新的细胞，采用该心脏类器官进行药物筛选实验能够有效简化实验前期准备工作，提高实验效率。
(5)本发明得到的心脏类器官具备空腔的组织学结构，是目前所有其他心脏类器官所不具备的，是本发明的独特优势。
附图说明
图1是分化成熟后心脏类器官表达心肌细胞的标志物(TNNT2)以及心瓣膜的标志物(NFATC1)的免疫荧光染色。图左是冰冻切片后染色的图片，可以看到心脏类器官呈现出空腔结构；
图2是跳动节律紊乱的心脏类器官在受到毛喉素刺激后，恢复了有规律有节奏的跳动模式；
图3是本发明提供的构建心脏类器官的方法的流程示意图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
目前，心脏类器官的构建和培养中，通常采用添加B27细胞培养添加剂或多种生长因子的复杂培养基，以促使干细胞分化形成心脏类器官中的不同细胞。而本发明的发明人在研究的过程中偶然发现，在RPMI 1640、IMDM等培养基中添加特定简单的附加成分后，也可用于心脏类器官的培养。经过进一步研究，发明人还发现，通过对附加成分进行甄选，相比于现有技术中以复杂培养基(例如添加B27细胞培养添加剂或多种生长因子的复杂培养基)为基础培养基的方法而言，可以在采用更少的附加成分的情况下，实现心脏类器官的构建和培养。
根据上述发现，本发明一方面提供一种培养基，所述培养基包括基础培养基和附加成分，其中，所述基础培养基选自RPMI 1640培养基或IMDM培养基，所述附加成分包括牛血清白蛋白(BSA)、L-抗坏血酸-2-磷酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和丙酮酸钠。
本发明中，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽是一种L-谷氨酰胺补充剂，其可以为培养基稳定提供L-谷氨酰胺。本发明对于培养基中添加的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽的具体来源没有特别限制，其既可以是自行制备的产物，也可以是通过商购获得的相关产品(例如GlutaMAXTM等)。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述培养基中，相对于500mL基础培养基，附加成分的用量为：
牛血清白蛋白：不低于0.1g；
L-抗坏血酸2-磷酸：不低于0.05g；
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽：不低于0.15g；
丙酮酸钠：不低于0.02g。
优选地，所述培养基中，相对于500mL基础培养基，附加成分的用量为：
牛血清白蛋白：0.2-1g；
L-抗坏血酸2-磷酸：0.1-0.3g；
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽：0.2-0.3g；
丙酮酸钠：0.04-0.07g。
本发明第二方面提供第一方面所述的培养基在类器官和/或贴壁细胞培养中的应用。
本发明第三方面提供一种具有心脏类器官分化功能的培养基，所述培养基包括权利要求1或2所述的培养基和小分子组合物A，其中，所述小分子组合物包括LY294002、激活素A、骨形成蛋白-4(BMP4)、CHIR99021和胰岛素。
LY294002是一种广谱PI3K抑制剂，CAS号为154447-36-6，其结构式如式I所示。
CHIR99021是一种氨基密啶衍生物，能够有效抑制GSK3，CAS号为252917-06-9，其结构式如式II所示。
本发明中，所述小分子组合物的作用在于促使干细胞(例如诱导性干细胞、胚胎干细胞等)分化形成心脏类器官。本发明对于所述培养基中的小分子组合物的用量没有特别限制，只要能够实现上述目的即可。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述小分子组合物A的用量使得所述具有心脏类器官分化功能的培养基中：
LY294002的浓度不低于2μM；
激活素A的含量不低于30ng/mL；
骨形成蛋白-4的含量不低于3ng/mL；
CHIR99021的浓度不低于2μM；
胰岛素的含量不低于0.2μg/mL。
优选地，所述小分子组合物A的用量使得所述具有心脏类器官分化功能的培养基中：
LY294002的浓度为4-6μM；
激活素A的含量为45-55ng/mL；
骨形成蛋白-4的含量为5-15ng/mL；
CHIR99021的浓度为3-6μM；
胰岛素的含量为0.5-1.5μg/mL。
心脏类器官的构建通常需要经历多个阶段，每个阶段采用不同的培养基进行分化诱导，从而最终形成具有明显腔室结构的心脏类器官。本发明的发明人在研究中发现，采用上述培养基进行心脏类器官构建过程中第一个培养阶段的分化诱导，不仅实现了以添加少量几种附加成分的RPMI 1640或IMDM培养基为基本培养基进行类器官构建，而且最终能够构建出具有明显腔室结构，并且能够规律跳动的心脏类器官。
基于此，本发明第四方面提供一种制备心脏类器官的方法，所述方法包括将由干细胞培养获得的拟胚体置于培养基A中进行分化诱导培养，所述培养基A为第三方面所述的培养基。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述方法包括：
(1)将由干细胞培养获得的拟胚体置于培养基A中进行第一分化诱导培养，获得第一培养产物；
(2)将第一培养产物置于培养基B中进行第二分化诱导培养，获得第二培养产物，其中，培养基B包括第一方面所述的培养基和小分子组合物B；
(3)将第二培养产物置于培养基C中进行第三分化诱导培养，获得第三培养产物，其中，培养基C包括第一方面所述的培养基和小分子组合物C；
(4)将第三培养产物置于培养基D中进行第四分化诱导培养，获得心脏类器官，其中，培养基D包括第一方面所述的培养基和小分子组合物D。
本发明中，小分子组合物B、C、D均为能够诱导干细胞分化，从而形成心脏类器官的化合物，其分别在心脏类器官构建的不同分化培养阶段使用，从而在不同的阶段实现不同的诱导目的，最终形成具有明显腔室结构、能够规律跳动的心脏类器官。任意能够实现上述目的的化合物/组合物均可适用于本发明。
优选地，所述小分子组合物B包括碱性成纤维生长因子(FGF2)、骨形成蛋白-4、IWR-1、视黄酸和胰岛素。
IWR-1是一种Wnt/β catenin信号通路抑制剂，CAS号为1127442-82-3，其结构式如式III所示。
优选地，所述小分子组合物C包括碱性成纤维生长因子、骨形成蛋白-4和胰岛素。
优选地，所述小分子组合物D包括胰岛素。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述干细胞选自诱导性多功能干细胞(iPSC)或胚胎干细胞(ESC)。优选为iPSC。
本发明中，对于上述各培养基中添加的小分子组合物的用量没有特别限制，只要能够诱导干细胞(优选为iPSC)分化形成心脏类器官即可。
根据本发明的一个优选实施方式，其中，所述小分子组合物B的用量使得培养基B中：
碱性成纤维生长因子的含量不低于1ng/mL，
骨形成蛋白-4的含量不低于2ng/mL，
IWR-1的浓度不低于0.3μM，
视黄酸的浓度不低于0.05μM，
胰岛素的含量不低于3μg/mL。
优选地，所述小分子组合物B的用量使得培养基B中：
碱性成纤维生长因子的含量为5-10ng/mL，
骨形成蛋白-4的含量为5-15ng/mL，
IWR-1的浓度为0.5-1.5μM，
视黄酸的浓度为0.1-1μM，
胰岛素的含量为5-15μg/mL。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述小分子组合物C的用量使得培养基C中：
碱性成纤维生长因子的含量不低于1ng/mL，
骨形成蛋白-4的含量不低于2ng/mL，
胰岛素的含量不低于3μg/mL。
优选地，所述小分子组合物C的用量使得培养基C中：
碱性成纤维生长因子的含量为5-10ng/mL，
骨形成蛋白-4的含量为5-15ng/mL，
胰岛素的含量为5-15μg/mL。
根据本发明的一种优选实施方式，其中，所述小分子组合物D的用量使得培养基D中：
胰岛素的含量不低于3μg/mL。
优选地，所述小分子组合物D的用量使得培养基D中：
胰岛素的含量为5-15μg/mL。
为了获得质量更好的心脏类器官，根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述第一分化诱导培养的培养条件包括：培养时间40-50h。
优选地，培养基A的用量不低于培养容器容积的30％。优选为40-70％。培养容器的容积是指其最大单位装液量(如培养板中单个培养孔的最大装液量，单个培养皿/培养瓶的最大装液量等)，后同。例如，采用96孔板时，培养基A的用量可以为150-250μL/孔。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述第二分化诱导培养的培养条件包括：培养时间80-100h。
优选地，培养基B的用量不低于培养容器容积的30％，优选为40-70％。例如，采用96孔板时，培养基B的用量可以为150-250μL/孔。
优选地，所述第二分化诱导培养过程中，每20-30h更换一次培养基B。优选20-25h更换一次。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述第三分化诱导培养的培养条件包括：培养时间40-50h。
优选地，培养基C的用量不低于培养容器容积的30％，优选为40-70％。例如，采用96孔板时，培养基C的用量可以为150-250μL/孔。
优选地，所述第三分化诱导培养过程中，每20-30h更换一次培养基C。优选20-25h更换一次。
根据本发明的一些优选实施方式，其中，所述第四分化诱导培养的培养条件包括：培养时间350-420h。
优选地，培养基D的用量不低于培养容器容积的30％，优选为40-70％。例如，采用96孔板时，培养基D的用量为150-250μL/孔。
优选地，所述第二分化诱导培养过程中，每20-30h更换一次培养基D。优选20-25h更换一次。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括培养干细胞获得拟胚体的步骤。
优选地，所述培养干细胞获得拟胚体的方式包括：采用拟胚体形成培养基培养干细胞，使其形成拟胚体，培养时间为20-50h。优选培养时间为20-30h。
发明人还发现，当采用以特定的细胞密度培养获得的培养体进行心脏类器官构建时，能够进一步提高心脏类器官的培养效率和心脏类器官的质量。因此，本发明中，优选以3000-10000个细胞/100μL的初始细胞密度对干细胞进行拟胚体培养。更优选为3000-8000个细胞/100μL。例如可以为3000个细胞/100μL、4000个细胞/100μL、5000个细胞/100μL、6000个细胞/100μL、7000个细胞/100μL、7500个细胞/100μL、8000个细胞/100μL，或者也可以为上述任意两个数值的任意中间值。
本发明中，可以选用任意能够用于干细胞培养，并促使其形成拟胚体的培养基作为拟胚体形成培养基使用。本发明对于所述拟胚体形成培养基的具体来源没有特别限制，其既可以是根据现有技术自行制备获得的，也可以是直接通过商购或定制途径购买获得的。优选所述拟胚体形成培养基可以包括：Essential 8培养基和/或mTeSR培养基。
图3A中示例性地示出了一种本发明提供的方法中的心脏类器官培养流程示意图，其包括：
获得拟胚体：采用拟胚体形成培养基培养干细胞，使其形成拟胚体(图中-2天至0天)。获得的拟胚体的镜下形态如图3B中“0天”所示。
(1)将拟胚体置于前述培养基A中进行第一分化诱导培养，获得第一培养产物(图中0天至2天)。获得的第一培养产物的镜下形态如图3B中“2天”所示。
(2)将第一培养产物置于前述培养基B中进行第二分化诱导培养，获得第二培养产物(图中2天至6天)。第二分化诱导培养过程中，培养产物的镜下形态变化情况如图3B中“3天”至“6天”所示。
(3)将第二培养产物置于前述培养基C中进行第三分化诱导培养，获得第三培养产物(图中6天至8天)。第三分化诱导培养过程中，培养产物的镜下形态变化情况如图3B中“7天”至“8天”所示。
(4)将第三培养产物置于前述培养基D中进行第四分化诱导培养，获得心脏类器官(图中8天至25天)。
本发明第五方面提供第四方面所述的方法培养获得的心脏类器官。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述心脏类器官具有明显腔室结构，优选所述心脏类器官能够(规律地)跳动。
优选地，本发明提供的心脏类器官能够表达心肌细胞特异性标志物TNNT2以及心瓣膜特异性标志物NFATC1。
优选地，本发明提供的心脏类器官可维持15天以上。优选可维持20天以上。更优选可维持30天以上。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于示例性地进一步解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
以下实施例中，iPSC购自浙江美森细胞科技有限公司，LY294002购自MCE公司，牌号为HY-10108，CHIR99021购自MCE公司，牌号为HY-10182，IWR-1购自MCE公司，牌号为HY-12238，丙酮酸钠购自Gibco公司，牌号为11360070，其他未做特殊说明的试剂或材料，均为购自正规化学或生物试剂/材料供应商的商购产品，试剂的纯度均为分析纯。
制备例1
按照如下表1的配方，配制用于心脏类器官构建的培养基。
表1
向基本培养基中分别加入小分子组合物A、B、C、D，即获得心脏类器官分化培养基A、B、C、D(简称为培养基A、B、C、D)。
实施例1
本实施例用于说明采用本发明提供的培养基和方法进行心脏类器官培养的效果。
参考图3A中的培养流程，采用如下方法进行心脏类器官培养：
(一)拟胚体培养
将预先培养好的iPSC用预热的无钙镁离子PBS清洗三次，将其消化分离成单细胞，并采用拟胚体形成培养基(mTeSRTM Plus培养基，购自STEMCELL Technologies公司，牌号为100-0276)将其分别配制成细胞密度为3000个/100μL、5000个/100μL、7500个/100μL、10000个/100μL的细胞悬液。
按100μL/孔将细胞悬液加入到U底96孔超低吸附板中，每个细胞密度的细胞悬液接种12孔。
接种完毕后将U底96孔超低吸附板在4℃下，300g离心5min后，置于37℃，5％CO2的培养箱中培养48h。
(二)心脏类器官分化
(1)从U底96孔超低吸附板中吸去60μL培养基后，加入200μL制备例1中配制的培养基A，进行第一分化诱导培养(37℃、48h)，获得第一培养产物；
(2)从U底96孔超低吸附板中吸去200μL培养基后，加入200μL制备例1中配制的培养基B，进行第二分化诱导培养(37℃、96h，每24h用培养基B换液1次)，获得第二培养产物；
(3)从U底96孔超低吸附板中吸去200μL培养基后，加入200μL制备例1中配制的培养基C，进行第三分化诱导培养(37℃，48h，每24h用培养基C换液1次)，获得第三培养产物；
(4)从U底96孔超低吸附板中吸去200μL培养基后，加入200μL制备例1中制备的培养基D，进行第四分化诱导培养(37℃，每24h用培养基D换液1次)，获得心脏类器官。每天镜下观察心脏类器官的培养情况，约24-120h后，可观察到心脏类器官呈现两段不同的收缩幅度和收缩快慢的搏动形态，十分接近心脏的新房心室跳动模式。
通过对比以不同密度的iPCS培养的拟胚体分化形成的心脏类器官，发现采用细胞密度为7500个/100μL的干细胞培养获得的拟胚体分化形成的心脏类器官相比对其他细胞密度的iPS细胞培养体系更加稳定。
记录采用不同密度干细胞培养的拟胚体分化获得的心脏类器官的维持时间(当心脏类器官不再跳动时，则认为其无法继续维持)，结果详见表2。
表2
| 细胞密度(个/100μL) | 3000 | 5000 | 7500 | 10000 |
| 维持时间(天) | 20 | 20 | 30 | 15 |
(三)心脏类器官结构和功能检测
(1)免疫荧光检测
参考Hofbauer P，et al.，Cardioids reveal self-organizing principles ofhuman cardiogenesis.Cell.2021 Jun 10；184(12)：3299-3317.e22.doi：10.1016/j.cell.2021.04.034.Epub 2021 May 20.PMID：34019794.中记载的免疫荧光法对分化成熟后的心脏类器官中的细胞标志物进行检测。
图1中示出了分化成熟后的心脏类器官(采用细胞密度为7500个/100μL的干细胞培养获得的拟胚体分化形成)的免疫荧光染色图，其中图1A为冷冻切片后的免疫荧光染色图，图1B为类器官整体染色的免疫荧光染色图。从图中可以看出，该心脏类器官能够表达心肌细胞标志物TNNT2(图中粉色荧光)和心瓣膜标志物NFATC1(图中黄色荧光)，而且心脏类器官呈现出明显的空腔结构。
(2)心脏类器官跳动模式观察
在D溶液中添加毛喉素使其终浓度为10uM。挑选一颗跳动异常的心脏类器官，显微镜下拍摄10s视频，随后吸去全部培养基，然后添加200u1含有10uM毛喉素的D溶液，放入培养箱中。1个小时以后取出心脏类器官并在显微镜下拍摄10s的视频，并将两段视频进行前后对比。
图2中示出了跳动节奏紊乱的心脏类器官在加药毛喉素前后的对比图。其中，图2A为加药前的心脏类器官跳动信号，从图中可以看出，此时心脏类器官的跳动呈现出不规律的状态；而从图2B和图2C中可以看出，加入毛喉素后，心脏类器官恢复有规律跳动。
将表1中的基本培养基中的RPMI 1640培养基替换为IMDM培养基，并参照上述步骤进行心脏类器官培养，结果与采用RPMI 1640培养基时类似。
实施例2
(一)分化培养基成分替换
将表1中小分子组合物A中的CHIR99021替换为CHIR98014，按照实施例1的方法进行心脏类器官培养(用于培养拟胚体的干细胞密度为7500个细胞/100μL)，结果显示分化出的心脏类器官形态畸形，不能出现腔体。
(二)分化培养基成分缺失
将表1中小分子组合物A中的CHIR99021去除，按照实施例1的方法进行心脏类器官培养(用于培养拟胚体的干细胞密度为7500个细胞/100μL)，结果未培养出可以跳动的心脏类器官。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和附加成分，其中，所述基础培养基选自RPMI 1640培养基或IMDM培养基，所述附加成分包括牛血清白蛋白、L-抗坏血酸-2-磷酸、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽和丙酮酸钠。
2.根据权利要求1所述的培养基，其中，所述培养基中，相对于500mL基础培养基，附加成分的用量为：
牛血清白蛋白：不低于0.1g，优选0.2-1g；
L-抗坏血酸2-磷酸：不低于0.05g，优选0.1-0.3g；
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽：不低于0.15g，优选0.2-0.3g；
丙酮酸钠：不低于0.02g，优选0.04-0.07g。
3.权利要求1所述的培养基在类器官和/或贴壁细胞培养中的应用。
4.一种具有心脏类器官分化功能的培养基，其特征在于，所述培养基包括权利要求1或2所述的培养基和小分子组合物A，其中，所述小分子组合物包括LY294002、激活素A、骨形成蛋白-4、CHIR99021和胰岛素。
5.根据权利要求4所述的培养基，其中，所述小分子组合物A的用量使得所述具有心脏类器官分化功能的培养基中：
LY294002的浓度不低于2μM，优选4-6μM；
激活素A的含量不低于30ng/mL，优选45-55ng/mL；
骨形成蛋白-4的含量不低于3ng/mL，优选5-15ng/mL；
CHIR99021的浓度不低于2μM，优选3-6μM；
胰岛素的含量不低于0.2μg/mL，优选0.5-1.5μg/mL。
6.一种制备心脏类器官的方法，其特征在于，所述方法包括将由干细胞培养获得的拟胚体置于培养基A中进行分化诱导培养，所述培养基A为权利要求4或5所述的培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法包括：
(1)将由干细胞培养获得的拟胚体置于培养基A中进行第一分化诱导培养，获得第一培养产物；
(2)将第一培养产物置于培养基B中进行第二分化诱导培养，获得第二培养产物，其中，培养基B包括权利要求1或2所述的培养基和小分子组合物B，优选所述小分子组合物B包括碱性成纤维生长因子、骨形成蛋白-4、IWR-1、视黄酸和胰岛素；
(3)将第二培养产物置于培养基C中进行第三分化诱导培养，获得第三培养产物，其中，培养基C包括权利要求1或2所述的培养基和小分子组合物C，优选所述小分子组合物C包括碱性成纤维生长因子、骨形成蛋白-4和胰岛素；
(4)将第三培养产物置于培养基D中进行第四分化诱导培养，获得心脏类器官，其中，培养基D包括权利要求1或2所述的培养基和小分子组合物D，优选所述小分子组合物D包括胰岛素。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述干细胞选自诱导性多功能干细胞或胚胎干细胞；
优选地，所述小分子组合物B的用量使得培养基B中：
碱性成纤维生长因子的含量不低于1ng/mL，优选5-10ng/mL，
骨形成蛋白-4的含量不低于2ng/mL，优选5-15ng/mL，
IWR-1的浓度不低于0.3μM，优选0.5-1.5μM，
视黄酸的浓度不低于0.05μM，优选0.1-1μM，
胰岛素的含量不低于3μg/mL，优选5-15μg/mL；
优选地，所述小分子组合物C的用量使得培养基C中：
碱性成纤维生长因子的含量不低于1ng/mL，优选5-10ng/mL，
骨形成蛋白-4的含量不低于2ng/mL，优选5-15ng/mL，
胰岛素的含量不低于3μg/mL，优选5-15μg/mL；
优选地，所述小分子组合物D的用量使得培养基D中：
胰岛素的含量不低于3μg/mL，优选5-15μg/mL。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一分化诱导培养的培养条件包括：培养时间40-50h，优选培养基A的用量不低于培养容器容积的30％，优选为40-70％；
和/或，所述第二分化诱导培养的培养条件包括：培养时间80-100h，优选培养基B的用量不低于培养容器容积的30％，优选为40-70％；
优选地，所述第二分化诱导培养过程中，每20-30h更换一次培养基B；
和/或，所述第三分化诱导培养的培养条件包括：培养时间40-50h，优选培养基C的用量不低于培养容器容积的30％，优选为40-70％；
优选地，所述第三分化诱导培养过程中，每20-30h更换一次培养基C；
和/或，所述第四分化诱导培养的培养条件包括：培养时间350-420h，优选培养基D的用量不低于培养容器容积的30％，优选为40-70％；
优选地，所述第二分化诱导培养过程中，每20-30h更换一次培养基D。
10.权利要求6-9中任意一项所述的方法培养获得的心脏类器官。
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