CN114891731A - 一种心脏类器官模型及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种心脏类器官模型及其制备方法，该模型制备过程中依次使用培养基A、培养基B、培养基C和培养基D，所述培养基A‑D均含有基础培养基，所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基、DMEM/F12培养基或CDM培养基。本发明的心脏类器官模型大小均一，结构稳定，直径适宜，可以高度模拟人体心脏有节律性跳动和空腔结构，适用于心脏发生发展的基础研究、心脏领域药物高通量筛选等领域，具有产业化意义。
Description
技术领域
本发明属于类器官领域，具体涉及一种心脏类器官模型及其制备方法。
背景技术
病原学和流行病学显示，心血管疾病种类众多，包括缺血性心脏病、脑卒中、高血压心脏病、先天性心脏异常、风湿性心脏病、心肌病和心肌炎、酒精性心肌病、心房颤动和心房扑动、主动脉瘤、心内膜炎、外周动脉疾病等等。另外，导致心血管疾病的危险因素也众多,高血压、血脂异常、糖尿病和肥胖等进一步提高了心血管疾病的发病率和死亡率，这给心血管疾病的治疗带来了极大的挑战。
心血管疾病是导致人类过早死亡和病残的首要原因，心血管疾病负担是全球最大的疾病负担，每年导致千百万人过早死亡，数亿人生活质量受损和难以承受的经济负担，而我国的情况更严峻。因此，迫切需要开发和测试治疗心血管疾病的新方法，但是人类伦理道德的局限导致无法在人体上对心血管疾病进行广泛有效的研究。
目前，对于心血管疾病的研究模型分为体内研究模型和体外研究模型。体内研究模型为动物模型，但动物模型与人体存在固有基因和生理等方面的种属差异(例如正常人体心脏搏动频率为60-100次/min，而鼠的静息心率是人类的10倍)，其在心血管疾病的机制研究和评价药物的心脏毒性反应方面与人体存在较大偏差，且其往往受限于动物和人在生物学上的差异，以及成像观察、混杂变量、出入量有限、可用性限制等缺陷。
体外研究模型为传统的二维细胞模型，尽管在心血管疾病的机制研究和心血管疾病药物筛选上具有一定的参考意义,但这种单细胞组分的模型缺乏细胞-细胞、细胞-细胞基质间的相互作用，体外培养的过程中会丢失细胞的异质性和其在体内的特征，从而无法模拟体内复杂的三维环境及组织细胞功能和相关的信号通路等。心血管疾病的发生发展并不是单一心肌细胞或者内皮细胞的损伤，其发生发展与复杂的微环境和微环境中的多种成分细胞相关，因此二维细胞模型对于药物的多组分多靶点的作用机制难以展示整体作用，影响剂量有效性和剂量毒性的预测，并在药物安全性评价中具有一定的局限性。这大大增加了研究工作者的研究难度，也成为新药开发的一大难题。因此，包含心脏中多种组成细胞类型并能模拟心脏微环境的体外模型亟待开发。
类器官是一种利用哺乳动物干细胞或成体细胞的特性构建的具有多种特异细胞类型的体外模型。近年来多项研究报道,这些具有复杂内部结构的类器官,在功能及构造上已经趋近于相应体内结构。基于多细胞组分的类器官体外模型,可以重现体内心脏节律性的跳动和空腔结构，以及心脏与其他相关细胞的互相作用,如免疫细胞等。因此，构建心脏类器官模型为深入研究心血管疾病发生发展的机制以及心血管疾病药物筛选提供了新的方向。
目前尚未检索到接近活体组织，可提高药物安全性评价效率和准确性的心脏类器官模型的相关报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明包括以下几个方面：
本发明的第一方面提供一种制备心脏类器官模型的方法，其包括以下步骤：
(1)使用mTeSR培养基孵育hiPSC，随后消化离心hiPSCs，使其在U形超低吸附96孔板底部，形成圆形细胞颗粒，将其放入培养箱中孵育1天，形成聚集体；
(2)聚集体形成1天后，计为第0天，吸出mTeSR培养基，加入培养基A；
(3)2天后吸出培养基A，加入基础培养基洗涤，然后加入培养基B，第3-5天每天更换新鲜的培养基B；
(4)第6天吸出培养基B，加入基础培养基洗涤，然后加入培养基C，第7天更换新鲜的培养基C；
(5)第8天吸出培养基C，加入基础培养基洗涤，然后加入培养基D，以后每2天更换1次新鲜的培养基D，第14天即得到所述心脏类器官模型；
所述培养基A、培养基B、培养基C和培养基D均含有基础培养基，所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基、DMEM/F12培养基或CDM培养基。
优选的，所述培养基A包括基础培养基、FGF2、LY294002、激活素A、BMP4、CHIR-99021和胰岛素；所述培养基B包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素、IWP-2、视黄酸和血管内皮生长因子A；所述培养基C包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素和血管内皮生长因子A；所述培养基D包括基础培养基和血管内皮生长因子A。
优选的，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。
优选的，所述培养基A中包含30ng/ml FGF2，5μM LY294002，50ng/ml激活素A、10ng/ml BMP4、3μM CHIR-99021和1μg/ml胰岛素。
优选的，所述培养基B中包含10ng/ml BMP4、8ng/ml FGF2、10μg/ml胰岛素、5μMIWP-2、0.5μM视黄酸和100ng/ml血管内皮生长因子A。
优选的，所述培养基C中包含10ng/ml BMP4、8ng/ml FGF2、10μg/ml胰岛素和100ng/ml血管内皮生长因子A。
优选的，所述培养基D中包含100ng/ml血管内皮生长因子A。
本发明的第二方面提供根据上述方法制备得到的心脏类器官模型。
本发明的第三方面提供一种用于制备心脏类器官模型的培养基组合物，其包括培养基A、培养基B、培养基C和培养基D，所述培养基A包括基础培养基、FGF2、LY294002、激活素A、BMP4、CHIR-99021和胰岛素；所述培养基B包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素、IWP-2、视黄酸和血管内皮生长因子A；所述培养基C包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素和血管内皮生长因子A；所述培养基D包括基础培养基和血管内皮生长因子A。
优选的，所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基、DMEM/F12培养基或CDM培养基。更优选的，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。
优选的，所述培养基A中包含30ng/ml FGF2，5μM LY294002，50ng/ml激活素A、10ng/ml BMP4、3μM CHIR-99021和1μg/ml胰岛素。
优选的，所述培养基B中包含10ng/ml BMP4、8ng/ml FGF2、10μg/ml胰岛素、5μMIWP-2、0.5μM视黄酸和100ng/ml血管内皮生长因子A。
优选的，所述培养基C中包含10ng/ml BMP4、8ng/ml FGF2、10μg/ml胰岛素和100ng/ml血管内皮生长因子A。
优选的，所述培养基D中包含100ng/ml血管内皮生长因子A。
本发明的第四方面提供上述培养基组合物在改善心脏类器官模型外观中的应用。
优选的，所述外观为边缘形态和/或空腔结构的规则度。
本发明的第五方面提供上述培养基组合物在提高心脏类器官模型直径中的应用。
优选的，所述直径至少大于500μm；更优选的，所述直径至少大于800μm；最优选的，所述直径至少大于1000μm。
本发明产生的有益效果：
1、发明人意外发现，本发明基于心脏微环境构成，通过筛选特定培养基(例如培养基A-D的组成及配比，以及Advanced DMEM/F12等基础培养基的组成和配比)以及构建特定的培养方式(例如不同培养基的使用顺序根据中胚层、心脏中胚层、心肌形成、心脏成熟阶段的心脏发育阶段顺序设计，使用顺序不当会直接导致细胞死亡)，建立了性能优异的心脏类器官模型(例如适宜直径、边缘形态和/或空腔结构的规则度等性能)。相比动物试验模型，本发明的心脏类器官模型成本低，周期短，操作简单，可简便的实现高通量筛药等研究，克服了动物模型的成像观察、混杂变量、出入量有限、可用性限制等的缺陷。
2、本发明的心脏类器官模型不仅能够更好地模拟细胞的体内微环境，而且其细胞生物学特性相较二维细胞模型也更接近于活体组织，表现出比单细胞培养更成熟表型，并能体现细胞培养的直观性及条件可控制性，使得心血管疾病发生发展的机制研究更贴近机体反应，进而大幅度提高药物安全性评价效率和准确性。
3、本发明的心脏类器官模型大小均一，结构稳定，直径适宜，可以高度模拟人体心脏有节律性跳动和空腔结构，适用于心脏发生发展的基础研究、心脏领域药物高通量筛选等领域，具有产业化意义。
附图说明
图1为本发明实施例1心脏类器官模型的制备工艺流程图；
图2为本发明实施例1心脏类器官模型建立流程光镜示意图；
图3为本发明实施例1心脏类器官模型荧光显微镜鉴定结果图；
图4为本发明实施例2心脏类器官模型荧光显微镜鉴定结果图；
图5为本发明实施例3心脏类器官模型荧光显微镜鉴定结果图；
图6为本发明实施例1-3心脏类器官模型的直径对比图。
具体实施方式
如无特别说明，下述各实施例中使用的Advanced DMEM/F12培养基、DMEM/F12培养基和CDM培养基均购自Thermo公司。
实施例1、制备本发明心脏类器官模型O1(AdvancedDMEM/F12培养基)
本实施例中使用的细胞材料及各培养基组成如下：
接种细胞：人类诱导多能干细胞(hiPSCs)
培养基A：Advanced DMEM/F12培养基、FGF2(30ng/ml)、LY294002(5μM)、激活素A(Activin A，50ng/ml)、BMP4(10ng/ml)、CHIR-99021(3μM)、胰岛素(1μg/ml)；
培养基B：Advanced DMEM/F12培养基、BMP4(10ng/ml)、FGF2(8ng/ml)、胰岛素(10μg/ml)、IWP-2(5μM)、视黄酸(0.5μM)、血管内皮生长因子A(VEGF-A，100ng/ml)；
培养基C：Advanced DMEM/F12培养基、BMP4(10ng/ml)、FGF2(8ng/ml)、胰岛素(10μg/ml)、血管内皮生长因子A(VEGF-A，100ng/ml)；
培养基D：Advanced DMEM/F12培养基、血管内皮生长因子A(VEGF-A，100ng/ml)。
本实施例心脏类器官模型的具体制备方法如下：
1、使用mTeSR培养基在无饲养层的条件下，在6孔板上培养hiPSC。每隔4-5天将细胞传代一次。
2、待细胞融合度达到70-80％时，加入1ml DPBS洗涤一遍，吸出DPBS，加入1mlReLeSR，30s后将其吸出，将培养板放入37℃培养箱，孵育5分钟。
3、加入1ml mTeSR，进行细胞计数，将10μL的细胞悬浮液和10μL的0.1％台盼蓝溶液混合，加入到计数载玻片上，用自动细胞计数器对活细胞进行计数。
4、计算实验所需的细胞悬浮液体积，每孔5000个细胞。将所需细胞悬浮液于22-23℃以100g离心3分钟，然后吸出培养液。
5、将所需细胞重悬于含有10μM Y-27632的新鲜mTeSR培养基中，每孔200μl。
6、将每孔200μl细胞悬液置于U形超低吸附96孔板中。
7、将U形超低吸附96孔板在200g和4℃下离心5分钟，使细胞到达培养皿底部，离心后，hiPSCs在培养板底部形成圆形细胞颗粒，将培养皿放入培养箱中，孵育1天。
8、聚集体形成一天后(D0)，吸出mTeSR培养基，加入100μl培养基A。
9、48h后(即D2)，沿壁轻轻吸出培养基A，加入200μl基础培养基Advanced DMEM/F12，洗涤一遍，然后加入100μl培养基B。
10、在第3、4、5天换液，即沿壁轻轻吸出培养基B，加入100μl新鲜的培养基B。
11、在第6天，沿壁轻轻吸出培养基B，加入200μl基础培养基Advanced DMEM/F12，洗涤一遍，然后加入100μl培养基C。
12、在第7天换液，即沿壁轻轻吸出培养基C，加入100μl新鲜的培养基C。
13、在第8天，沿壁轻轻吸出培养基C，加入200μl基础培养基Advanced DMEM/F12，洗涤一遍，然后加入100μl培养基D。
14、以后每两天换一次液，即沿壁轻轻吸出培养基D，加入100μl培养基D，第14天后即得到本发明心脏类器官模型O1。
实施例2、制备本发明心脏类器官模型O2(CDM培养基)
使用相同用量的CDM培养基替换实施例1各步骤中的Advanced DMEM/F12培养基，其余实验条件和制备方法同实施例1，制备得到本发明心脏类器官模型O2。
实施例3、制备本发明心脏类器官模型O3(DMEM/F12培养基)
使用相同用量的DMEM/F12培养基替换实施例1各步骤中的Advanced DMEM/F12培养基，其余实验条件和制备方法同实施例1，制备得到本发明心脏类器官模型O3。
试验例1、本发明心脏类器官模型性能表征
一、试验方法
分别将实施例1-3制备得到的心脏类器官转移到1.5mlEP管，用4％PFA于4℃固定1小时，用含4％山羊血清和0.5％Triton X-100的封闭液室温孵育2h，一抗4℃孵育两天，二抗4℃孵育一天，封片后于室温下晾干，使用荧光共聚焦显微镜Z轴扫描功能拍照，得到心脏类器官模型的结构形态图。
使用ImageJ软件测量上述得到的心脏类器官的结构形态图，得到心脏类器官模型的直径数值。
二、试验结果
1、心脏类器官模型外观
本申请实施例1-3获得的心脏类器官结构形态图分别如图3-5所示。如图所示，实施例1制备的心脏类器官模型外观形态(边缘)规则完整，且具有非常明显和规则的空腔结构；实施例2制备的心脏类器官同样具有明显的空腔结构，但外观形态(边缘)稍不完整；实施例3制备的心脏类器官外观形态(边缘)较为完整，但空腔结构稍不显著。
2、心脏类器官模型直径
从图6可以看出，实施例1-3制备的心脏类器官的直径分别为1250μm、950μm和590μm，3个实施例的类器官直径依次递减，证明实施例1制备的心脏类器官的效果最佳。
Claims (10)
1.一种制备心脏类器官模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用mTeSR培养基孵育hiPSC，随后消化离心hiPSCs，使其在U形超低吸附96孔板底部，形成圆形细胞颗粒，将其放入培养箱中孵育1天，形成聚集体；；
(2)聚集体形成1天后，计为第0天，吸出mTeSR培养基，加入培养基A；
(3)2天后吸出培养基A，加入基础培养基洗涤，然后加入培养基B，第3-5天每天更换新鲜的培养基B；
(4)第6天吸出培养基B，加入基础培养基洗涤，然后加入培养基C，第7天更换新鲜的培养基C；
(5)第8天吸出培养基C，加入基础培养基洗涤，然后加入培养基D，以后每2天更换1次新鲜的培养基D，第14天即得到所述心脏类器官模型；
所述培养基A、培养基B、培养基C和培养基D均含有基础培养基，所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基、DMEM/F12培养基或CDM培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基A包括基础培养基、FGF2、LY294002、激活素A、BMP4、CHIR-99021和胰岛素；所述培养基B包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素、IWP-2、视黄酸和血管内皮生长因子A；所述培养基C包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素和血管内皮生长因子A；所述培养基D包括基础培养基和血管内皮生长因子A。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基A中包含30ng/ml FGF2，5μMLY294002，50ng/ml激活素A、10ng/ml BMP4、3μM CHIR-99021和1μg/ml胰岛素。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基B中包含10ng/ml BMP4、8ng/mlFGF2、10μg/ml胰岛素、5μM IWP-2、0.5μM视黄酸和100ng/ml血管内皮生长因子A。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基C中包含10ng/ml BMP4、8ng/mlFGF2、10μg/ml胰岛素和100ng/ml血管内皮生长因子A。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基D中包含100ng/ml血管内皮生长因子A。
7.根据权利要求1-6任一项所述方法制备得到的心脏类器官模型。
8.一种用于制备心脏类器官模型的培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物包括培养基A、培养基B、培养基C和培养基D，所述培养基A包括基础培养基、FGF2、LY294002、激活素A、BMP4、CHIR-99021和胰岛素；所述培养基B包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素、IWP-2、视黄酸和血管内皮生长因子A；所述培养基C包括基础培养基、BMP4、FGF2、胰岛素和血管内皮生长因子A；所述培养基D包括基础培养基和血管内皮生长因子A，所述基础培养基选自AdvancedDMEM/F12培养基、DMEM/F12培养基或CDM培养基。
9.权利要求8所述的培养基组合物在改善心脏类器官模型外观中的应用，其特征在于，所述外观为边缘形态和/或空腔结构的规则度。
10.权利要求8所述的培养基组合物在提高心脏类器官模型直径中的应用，其特征在于，所述模型直径至少大于500μm。
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