CN115851576A

CN115851576A - 肺类器官培养方法及培养基

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Publication number: CN115851576A
Application number: CN202211433670.3A
Authority: CN
Inventors: 罗微; 官展文; 毛晓帆; 张楚凌; 张贝莹
Original assignee: First Peoples Hospital of Foshan
Current assignee: First Peoples Hospital of Foshan
Priority date: 2022-11-16
Filing date: 2022-11-16
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明公开了一种肺类器官培养方法及培养基。所述培养基包括一种基础肺类器官培养基，以及一种肺泡类器官培养基。所述肺类器官培养方法使用所述基础肺类器官培养基和所述肺泡类器官培养基，能够将ASC在三维的基质胶中培养获得带有肺泡结构的肺类器官，有助于利用所述肺类器官模拟体内环境进行各类试验。

Description

肺类器官培养方法及培养基

技术领域

本发明属于类器官培养技术领域，具体涉及肺类器官培养方法及培养基。

背景技术

在成人的器官中，大部分功能依赖于三维结构以及各种细胞类型之间的协同作用，这对于器官行使功能至关重要。然而，目前大多数体外研究模型都是利用二维的单层细胞培养。早在21世纪初，人们就发现将细胞从原生环境移至二维培养会丧失组织特异性与功能，例如Mina Bissell等人的工作揭示了三维结构在发育以及在肿瘤发生中都至关重要。因此，模仿体内架构的三维培养对于构建具有代表性的体外模型必不可少。

想要更好地了解传染病发病机制的一个重要要求就是建立具有代表性的模型系统。然而，二维细胞模型与动物模型均不能很好地模拟流行性疾病的发病机制。目前已有众多研究团体利用二维细胞系(如VeroE6、Caco-2和Calu-3细胞)进行新型冠状病毒(SARS-CoV-2)体的外研究。尽管这些细胞系通常对SARS-CoV-2高度敏感，但可能无法模拟病毒生命周期的关键方面，在细胞水平起作用的抗病毒化合物多数在患者体内无效。除细胞系外，多种动物模型也被用于新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的研究，然而各有缺点，显示了不同动物宿主对病毒感染的反应的复杂性。小鼠对野生型SARS-CoV-2感染不敏感，只有过表达ACE-2才可出现高病毒载量。SARS-CoV-2可以使用金色叙利亚仓鼠ACE-2进入，但不会造成重症肺部疾病。同样，在雪貂中，疾病相对较轻，病毒复制主要在上呼吸道观察到，此外由于物种差异，SARS-CoV-2获得了Spike蛋白在雪貂中迅速突变。

类器官是由器官特异性干细胞培养的离体三维结构，有望填补细胞系和体内动物模型之间的空白。在COVID-19疫情中，人类干细胞衍生的类器官已成为研究的有力工具之一。类器官可以从两种不同的干细胞群中建立：分别为成体干细胞(ASC)和多能干细胞(PSC，包括诱导性多能干细胞iPSC和胚胎干细胞ESC)。

目前iPSCs诱导肺类器官的技术比较成熟，已可以诱导形成由多种气道细胞类型组成的结构，包括基底细胞、棒状细胞和纤毛细胞，以及肺泡细胞类型：肺泡I型和II型(ATI和ATII)细胞。由此可以分别诱导iPSC形成气道类器官与肺泡类器官，但尚未能够在一个类器官中实现气道和肺泡的结合。

iPSCs诱导的肺类器官适用于研究病毒侵染机制，而针对COVID-19患者的个体化研究，则需要使用ASC来源的类器官。然而利用成人来源的组织进行培养可以较为容易获得气道细胞，却难以获得肺泡细胞。在新冠疫情前，没有任何已报道的体系可以支持成人肺组织来源的肺泡类器官稳定培养。尽管气道模型可以概括COVID-19患者的一些发现，但研究肺泡对SARS-CoV-2感染的反应至关重要，因为大多数住院的COVID-19患者因急性呼吸窘迫综合征(ARDS)而入院，但从健康个体中新鲜分离的原发性肺泡培养物对SARS-CoV-2的敏感性极低。此外，人类ATII细胞在2D细胞培养中迅速分化为ATI样细胞，限制了研究ATII生物学的可能性。在近两年中，为促进新冠病毒研究，多个实验室尝试获得ASC来源的肺泡类器官，并获得了一些初步成果。2022年6月，Cell discovery首次报道了利用ASC培养的肺泡类器官，作者利用低吸附板以及专用的分化培养基进行悬浮培养，而不是使用三维培养方法(利用基质胶作为支撑)，这是因为在作者的研究中如果使用基质胶(Matrigel)进行培养，则类器官表现为厚壁状态而不是囊状状态。因此，目前针对从ASC培养为肺泡类器官的技术，仍然缺乏可行的常规三维培养方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种肺类器官培养方法及培养基。

在本发明第一方面提出了一种基础肺类器官培养基。所述基础肺类器官培养基的配方如表1所示。

表1基础肺类器官培养基的配方

所述基础肺类器官培养基能够较为迅速地(需要约15天可进行传代)将正常组织来源的ASC培养成呈现透明的囊状结构的肺类器官。

在本发明第二方面提出了一种肺泡类器官培养基。所述肺泡类器官培养基的配方如表2所示。

表2肺泡类器官培养基的配方

试剂名称	终浓度
		Advanced DMEM/F12	\
GlutaMax	1×
		HEPES	10mM
Penicillin/Streptomycin	1×
		B-27Supplement	1×
N-Acety-L-cysteine	1.25mM
		Nicotinamide	5mM
p38MAPK抑制剂	500-700nM
		ALK5抑制剂	500-600nM
Recombinant Human FGF 7	16-20ng/mL
		Recombinant Murine Noggin	40-55ng/mL
Recombinant Human R-Spondin1	180-200ng/mL
		Recombinant Human FGF10	40-60ng/mL
ROCK抑制剂	5-8μM

ASC使用所述肺泡类器官培养基进行培养会造成生产速度缓慢(需要约30天可进行传代)，但肺类器官在此培养基中进行培养能够经过分化生长出肺泡样结构。

在本发明第三方面提出了一种ASC来源肺类器官的培养方法。所述培养方法包括步骤：1)ASC在所述基础肺类器官培养基中培养，每15天进行传代一次，共进行二次传代，得到中间组织；2)利用所述肺泡类器官培养基对所述中间组织进行培养，每30天传代一次。

本发明提供的培养方法可完全在基质胶三维环境中从肺组织获取ASC进行肺泡类器官的培养。所述培养方法较少利用外源诱导试剂，而是利用二段式的营养环境调整，促进无肺泡结构的肺类器官分化成为带有肺泡的肺类器官。

在本发明的一些实施方式中，所述培养方法的步骤1)中，所述ASC是利用胶原酶将获得的肺组织消化为细胞团，并利用基质胶重悬，添加所述基础肺类器官培养基培养，每3天更换一次所述基础肺类器官培养基。

在本发明的一些实施方式中，每次更换基础肺类器官培养基前先对新鲜配制的基础肺类器官培养基进行预热至37.0±0.5℃。

在本发明的一些实施方式中，所述培养方法的步骤2)中，当第一次传代前未出现肺泡结构，则利用重组胰蛋白酶类似物(TrypLE)适度消化所述中间组织后进行传代。为确保合适的消化程度，应在消化过程中每过15min镜下观察，当显现较多的游离细胞团块时为消化适度，当出现较多单个细胞时，则为过度消化。早期曾分别使用胰酶-EDTA和TrypLE进行对比实验，TrypLE消化过程较缓和，能较好地控制消化程度，消化后的细胞存活率也高于胰酶-EDTA，另外TrypLE可常温保存，避免冻融造成的酶活误差。

在本发明的一些实施方式中，所述培养方法的步骤2)具体包括以下步骤：

2-1)去除所述基础肺类器官培养基，向所述中间组织加入细胞收集缓冲液；

2-2)加入基质胶重悬，在4℃摇床振荡孵育，后加入Hank's平衡盐溶液(HBSS)，在4℃下离心，去除上清液；

2-3)沉淀物使用机械破碎的方式解离，后加入HBSS，在4℃下离心，去除上清液；

2-4)向沉淀物加入基质胶重悬，后再加入所述肺泡类器官培养基；

2-5)每3.5天更换所述肺泡类器官培养基。

在本发明的一些实施方式中，步骤2-2)和2-3)所述离心处理的参数设置均为400xg离心5min。

在本发明的一些实施方式中，所述HBSS中含有1％的胎牛血清(FBS)。

在本发明的一些实施方式中，当所述步骤2-2)去除上清液后，沉淀所得的肺类器官提及较大，为进一步分解，可以加入TrypLE，在37℃环境下孵育，并伴随移液枪吹吸等机械方式进行解离。

本发明提供的培养基和培养方法可以一直在三维的基质胶中将ASC培养为带有肺泡的肺类器官，只需要单纯地通过改变培养基的成分以及调整培养条件，即可从基础肺类器官诱导为带有肺泡的肺类器官，获得更好的三维结构，有助于模拟真实的体内环境。

附图说明

图1为实施例2中所述中间组织的镜检图；

图2为实施例2中所述肺类器官的镜检图；

图3为对照例1中培养结束后所得组织的镜检图；

图4为对照例2中培养结束后所得组织的镜检图；

图5为实施例3中所述Normal组的中间组织的免疫荧光图；

图6为实施例3中所述Tumor组的中间组织的免疫荧光图；

图7为实施例3中所述Normal组的中间组织的免疫荧光图；

图8为实施例3中所述Normal组的带有肺泡结构的肺类器官的免疫荧光图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

以下实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1培养基的配制

按表3和表4的配比进行基础肺类器官培养基和肺泡类器官培养基的调配。

表3基础肺类器官培养基配比

表4肺泡类器官培养基配比

实施例2人源ASC及肺肿瘤组织的肺类器官培养

从肺癌患者获取人源的ASC以及肿瘤组织分别进行带有肺泡的类器官培育。

具体步骤包括：

1-1)获取肺远端正常组织(Normal)及肺肿瘤组织(Tumor)后马上将其储存在冰浴的组织保存液中，离体后的24小时内均可用；理想情况下，应当立即处理组织。

1-2)将固体组织切成约1mm³的小块，并保存在10ml冰冷的HBSS(含1％FBS)中。在等待碎片沉降的同时，通过将移液枪的枪头浸入冰冷的FBS中2～3次来预涂吸头。

1-3)使用FBS预涂的枪头去除上清液。用10ml冰冷的HBSS(含1％FBS)再清洗一次组织块。

1-4)在组织块中加入10ml组织消化缓冲液(含胶原酶和组织蛋白酶)，在37℃的恒温摇床上摇动1～2小时，消化过程中每30分钟检查一次，进行消化程度的评估。

1-5)当组织块被消化至游离细胞团块较多时，使用预涂的移液器转移悬浮液，并通过100μm过滤器过滤。对于剩余的组织块，用10ml含1％FBS的HBSS重悬并再次过滤。

1-6)向过滤的悬浮液中添加浓度为2％的FBS以终止消化。

1-7)将悬浮液置于50ml试管中以400xg在4℃下离心5分钟。

1-8)如果有可见的红色沉淀，将沉淀重悬于2～4ml的红细胞裂解缓冲液(又名ACK缓冲液)中，并在室温(R.T.)下孵育5分钟。然后加入10ml含1％FBS的HBSS，并再次以400xg离心；如果没有可见的红色沉淀，直接用10ml含1％FBS的HBSS重悬沉淀，然后再次以400xg离心。

1-9)将细胞沉淀重悬在冰冷的基质胶中，避免产生气泡。最终浓度应为1-1.5×10⁵细胞/mL。

1-10)将30-40μL混合有ASC细胞的冰冷Matrigel混合物快速加入24孔细胞培养板的每个孔的中心，每孔约2000-4000ASC细胞。

1-11)将24孔板在37℃的培养箱中孵育10-20分钟，使Matrigel固化。

1-12)胶凝化后，向每个孔中加入450-500μL基础肺类器官培养基，并在37℃的培养箱(常规5％的CO₂)中培养细胞。基础肺类器官培养基每3-4天更换一次，确保在换液之前预热新鲜的基础肺类器官培养基。

1-13)使用基础肺类器官培养基培养15天后进行传代，在第二次传代时的中间组织如图1所示。Normal组的中间组织呈现透明的囊状结构与已有的类器官鉴定结果吻合。Tumor组的中间组织呈现较不光滑的实心结构，与已有的类器官鉴定结果吻合。

2-1)除去基础肺类器官培养基，然后加入0.5-1mL冰冷的细胞收集缓冲液。

2-2)用移液器吸头机械破碎Matrigel。然后将24孔板在4℃摇床振荡孵育20-30分钟，以进一步溶解Matrigel。

2-3)将基质胶转移到15mL锥形管中，并加入5mL含1％FBS的冰冷HBSS。

2-4)在4℃下以400xg离心5分钟，去除上清液。

2-5)如果中间组织较大，可加入0.5-1mL TrypLE，在37℃水浴或培养箱中孵育1-2分钟。

2-6)用移液枪吹吸中间组织20次，以进一步解离。

2-7)向试管中加入5-10mL含1％FBS的冰冷HBSS，在4℃下以400xg离心5分钟。弃上清，每孔加入30-40μl冰冻基质胶(约100个类器官)，重悬后分装各孔，并加入450-500μl肺泡类器官培养基。

2-8)严格按照每3.5天更换一次肺泡类器官培养基，持续培养1个月。稳定生长一个月后，中间组织经过分化可生长为肺胞样结构，如图2所示，Normal组的类器官经过分化可生长为肺胞样结构。Tumor组的类器官生长为相对不规则的结构。

对比例1基础肺类器官培养基对照试验

按实施例1相同的步骤，但将步骤2-7)的所述肺泡类器官培养基替换成所述基础肺类器官培养基进行培养。按2-8)要求每3.5天更换一次基础肺类器官培养基。培养一个月后，随着代数增加，Normal组的中间组织的形态始终保持空心的透明囊状结构，并不发生明显变化；Tumor组的中间组织由于营养供给问题，实心结构限制了生长上限，部分正常细胞获得生长优势，因此逐渐出现部分类似Normal组的中间组织相似的空心囊状结构(如图3所示)。即使刻意延长传代间隔至超过一个月，中间组织也不会出现类似肺泡的结构，只会由于生长迅速而导致基质胶中缺乏空间。

对比例2肺泡类器官培养基对照试验

按实施例1中1-1)至1-11)相同的步骤，但将步骤1-12)的所述基础肺类器官培养基替换成所述肺泡类器官培养基进行培养。按步骤1-13)培养一个月后，如图4所示，能够观察到Normal组和Tumor组的中间组织均发育缓慢，体积相较于实施例1步骤1-13)获得的中间组织要小。

实施例3肺类器官的免疫荧光观察

为了保持类器官结构的同时保证其可观察性，我们对实施例1培育的肺类器官进行透明化处理，按照需求可利用免疫荧光技术对不同的标记物进行标记(例如TTF1、Ecad、Ki67、F-actin等)。具体步骤：

3-1)每个孔用1ml的4℃的PBS溶液冲洗，不要破坏基质胶。

3-2)将24孔板放置在冰板上，每孔加入加入1ml 4℃的cell recovery solution，划破基质胶后轻轻吹打，在4℃、60rpm的恒温水平摇床上孵育0.5～1h。

3-3)用4℃的PBS-BSA(含1％BSA的PBS)试剂润洗枪头，然后吸取PBS-BSA试剂使细胞重悬。

3-4)将中间组织/肺类器官转移到预涂有1％ PBS-BSA的15ml的离心管中。

3-5)用1ml 4℃的1％ PBS-BSA将培养液冲洗干净，收集孔中所有的类有机物。

3-6)加入4℃的PBS试剂使离心管中总体积达到10ml，在4℃、100g的条件下离心3min，移去上清液。

3-7)用4℃的PBS试剂润洗枪头，然后吸1ml的4％多聚甲醛，在4℃冰箱中放置45min，放置期间需要每隔10min左右对离心管进行轻微的摇晃，使中间组织/肺类器官重悬)。

3-8)加入4℃的PBST(含0.1％吐温的PBS)试剂使离心管中总体积达到10ml，然后在4℃的冰箱中孵育10min，在4℃、100g的离心机下离心5min，移去上清液。

3-9)用4℃的类器官清洗液(含0.1％Triton X-100和0.2％BSA的PBS)使其重悬，然后转移至24孔板上(每孔加入至少200μl的类器官清洗液)。

3-10)将24孔板放在4℃的冰箱中孵育15min。

3-11)用600μl的类器官清洗液试剂加入8μl抗体，反复吹打10～20次，使其充分混匀，配置成一抗试剂。

3-12)吸除每个孔中的类器官清洗液至只剩200μl，然后再向每个孔加入200μl所述一抗试剂。

3-13)将24孔板用锡纸紧密包裹后置于4℃的恒温摇床中孵育15分钟后在4℃冰箱中孵育过夜。

3-14)取出24孔板后，每孔加入1ml的类器官清洗液孵育3min，等待细胞沉底。

3-15)轻轻吸取去除1ml的类器官清洗液，每孔剩余200μl。

3-16)每孔加入1ml的类器官清洗液后，放在37℃、60rpm的恒温摇床上孵育2h。

3-17)重复清洗步骤3-14)至3-16)至少清洗2次。

3-18)用600μl的类器官清洗液加入与一抗对应种属的荧光二抗，每种抗体加入3μl，反复吹打10～20次，使其充分混匀，配制成二抗试剂。

3-19)去除1ml的类器官清洗液至每个孔仅剩下200μl。

3-20)每孔加入200μl所述二抗试剂，充分混匀后用锡纸紧密包裹后置于4℃的恒温摇床中孵育15分钟，随后置于4℃冰箱中孵育过夜。

3-21)重复步骤3-14)至3-16)，共清洗3次。

3-22)分装到1.5ml/2ml的离心管中，用PBS试剂冲洗24孔板(尽量将类器官全部转移)。在4℃、100g的离心机下离心2min。

3-23)尽可能的去除上清液，然后每个离心管加入最少50μl的去基因组DNA污染逆转录(RT)试剂。

3-24)在载玻片的四个边上配上双面胶(至少3层)。为避免液体渗出，在用疏水笔在双面胶以内的位置画一个四边形。

3-25)将样品均匀的平铺在中心位置，然后将盖玻片一段先接触样品缓缓盖上(尽量避免气泡产生，且尽可能铺满整个载玻片)。(注意：进行步骤23～25时，要用剪掉尖头的200μl的枪头)。

Normal组和Tumor组中间组织的形态如图5和6所示，与显微观察现象一致。随后，对比Normal组的中间组织与Normal组具有肺泡的肺类器官的形态，结果如图7和8所示肺类器官在免疫荧光实验中也显示多囊状结构，而中间组织则显示单个囊状结构。由此可以确认本发明提供的培养方法能够利用ASC在三维的基质胶中培养获得带有肺泡结构的肺类器官。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.一种基础肺类器官培养基，其特征在于，包括组分：Advanced DMEM/F12、GlutaMax、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、青霉素/链霉素双抗、B-27Supplement、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、P38MAPK抑制剂、ALK5抑制剂、成纤维生长因子-7、重组小鼠头蛋白、重组人Rspo1蛋白、成纤维生长因-10、ROCK抑制剂；优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的终浓度为10mM；优选地，所述N-乙酰半胱氨酸的终浓度为1-1.5mM；优选地，所述烟酰胺的终浓度为5-7mM；优选地，所述P38 MAPK抑制剂的终浓度为500-700nM；优选地，所述ALK5抑制剂的终浓度为500-600nM；优选地，所述成纤维生长因子-7的终浓度为25-30ng/mL；优选地，所述重组小鼠头蛋白的终浓度为100-120ng/mL；优选地，所述重组人Rspo1蛋白的终浓度为500-700ng/mL；优选地，所述成纤维生长因-10的终浓度为100-150ng/mL；优选地，所述ROCK抑制剂的终浓度为4-8μM。

2.一种肺泡类器官培养基，其特征在于，包括组分：Advanced DMEM/F12、GlutaMax、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、青霉素/链霉素双抗、B-27Supplement、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、P38MAPK抑制剂、ALK5抑制剂、成纤维生长因子-7、重组小鼠头蛋白、重组人Rspo1蛋白、成纤维生长因-10、ROCK抑制剂；优选地，所述4-羟乙基哌嗪乙磺酸的终浓度为10mM；优选地，所述N-乙酰半胱氨酸的终浓度为1.25mM；优选地，所述烟酰胺的终浓度为5mM；优选地，所述P38MAPK抑制剂的终浓度为500-700nM；优选地，所述ALK5抑制剂的终浓度为500-600nM；优选地，所述成纤维生长因子-7的终浓度为16-20ng/mL；优选地，所述重组小鼠头蛋白的终浓度为40-55ng/mL；优选地，所述重组人Rspo1蛋白的终浓度为180-200ng/mL；优选地，所述成纤维生长因-10的终浓度为40-60ng/mL；优选地，所述ROCK抑制剂的终浓度为5-8μM。

3.一种ASC来源肺类器官的培养方法，其特征在于，包括步骤：

1)成体干细胞在权利要求1所述基础肺类器官培养基中培养，每15天进行传代一次，共进行二次传代，得到中间组织；

2)利用权利要求2所述肺泡类器官培养基对所述中间组织进行培养，每30天传代一次。

4.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，所述步骤1)中所述成体干细胞是利用胶原酶将获得的肺组织消化为细胞团，并利用基质胶重悬，添加所述基础肺类器官培养基培养，每3天更换一次所述基础肺类器官培养基。

5.根据权利要求4所述培养方法，其特征在于，每次更换培养基前先对新鲜的所述基础肺类器官培养基进行预热至37.0±0.5℃。

6.根据权利要求3所述培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，当第一次传代前未出现肺泡结构，则利用重组胰蛋白酶类似物消化所述中间组织后进行传代。

7.根据权利要求3或6所述培养方法，其特征在于，所述步骤2)具体包括以下步骤：

2-2)加入基质胶重悬，在4℃摇床振荡孵育，后加入HBSS，在4℃下离心，去除上清液；

2-4)向沉淀物加入基质胶，重悬后再加入所述肺泡类器官培养基；

2-5)每3.5天更换所述肺泡类器官培养基。

8.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，所述离心处理的参数设置为400xg离心5min。

9.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，所述HBSS中含有1％的FBS。

10.根据权利要求7所述培养方法，其特征在于，所述步骤2-2)去除上清液后，加入重组胰蛋白酶类似物，37℃孵育。