CN110438070B - 一种苦参酮用于体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的用途 - Google Patents

一种苦参酮用于体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苦参酮用于体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的用途。通过本发明具体实施例可知，苦参酮可以有效促进人脂肪间充质干细胞体外增殖，而且苦参酮培养既不会明显改变人脂肪间充质干细胞的表型，又不会明显改变人脂肪间充质干细胞的多向分化能力，可以将苦参酮添加到L‑DMEM培养基制成人脂肪间充质干细胞专用的体外增殖培养基，有助于快速为干细胞移植和再生医学领域提供大量的种子细胞。

Description

一种苦参酮用于体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的用途
技术领域
本发明涉及组织工程种子细胞的体外增殖，具体涉及一种苦参酮用于体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的用途。
背景技术
脂肪间充质干细胞(ADSCs)具有来源广、容易获得、低免疫原性等特点，已成为组织工程种子细胞的来源之一，是干细胞移植和再生医学领域重要的种子细胞。
促进脂肪间充质干细胞体外增殖有助于其在干细胞移植和再生医学领域的应用。
文献公开了地黄低聚糖对脂肪间充质干细胞增殖的影响，发现地黄低聚糖对ADSCs的增殖能力具有促进作用(地黄低聚糖对脂肪间充质干细胞增殖的影响，解放军药学学报，2008年2月第24卷第1期)。但是，该文献仅仅是通过MTT法测试了地黄低聚糖对ADSCs的促增殖作用，并没有测试ADSCs经地黄低聚糖培养后的表型是否维持不变，也没有测试地黄低聚糖培养对ADSCs的多向分化能力是否有影响。
天然产物具有多种药理活性，为生物医药领域寻找活性化合物提供了宝贵的化合物库。苦参酮是分离自苦参中的一种天然产物，具有抗炎抗氧化等作用，目前没有文献公开其具有体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的活性。
发明内容
本发明是为了促进人脂肪间充质干细胞体外增殖，特提供一种苦参酮用于体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的用途。
技术方案如下：
一种苦参酮用于促进脂肪间充质干细胞增殖的用途。
进一步地，所述脂肪间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
进一步地，用于体外促进脂肪间充质干细胞增殖。
一种苦参酮用于制备促进脂肪间充质干细胞体外增殖的培养基的用途。
进一步地，所述脂肪间充质干细胞为人脂肪间充质干细胞。
进一步地，所述培养基包括苦参酮和L-DMEM培养基。
技术效果：
1、本发明发现：苦参酮可以有效促进人脂肪间充质干细胞体外增殖；
2、本发明发现：苦参酮体外干预培养不会改变人脂肪间充质干细胞的表型；
3、本发明发现：苦参酮体外干预培养后人脂肪间充质干细胞依然维持多向分化能力。
附图说明
图1为hADSCs的细胞形态观察结果；
图2为hADSCs的细胞表型鉴定结果；
图3为不同处理hADSCs的增殖曲线；
图4为油红O染色结果；
图5为茜素红染色结果。
具体实施方式
一、实验材料
双抗溶液和PBS溶液自制，4℃保存。Ⅰ型胶原酶购自泽叶生物。苦参酮购自成都普瑞法。
胎牛血清、高糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基购自GIBCO。
荧光标记单克隆抗体购自美国Bioscience公司。
脂肪组织取自身体健康的腹部脂肪抽脂术者，签署知情同意书，仅用于科研用途。抽取后于4℃保存，12h内参照文献方法进行脂肪间充质干细胞培养和传代。
成人脂肪间充质干细胞成骨诱导分化培养基(HUXMD-90021)、成人脂肪间充质干细胞成脂诱导分化培养基(HUXMD-90031)购自赛业生物科技有限公司。
二、实验方法
1、hADSCs的培养、传代、形态观察和表型鉴定
取脂肪组织用含有双抗的PBS溶液冲洗3次，用0.25％Ⅰ型胶原酶于37℃、搅拌条件下消化30min，加入等体积含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，200目滤网过滤，再用1200×g离心5min，沉淀用适量含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬，加入5倍体积红细胞裂解液，室温孵育5min，1200×g离心5min，沉淀用适量含15％胎牛血清的低糖DMEM培养基(完全培养基)重悬，计数，以1×106/皿的密度接种于细胞培养皿中，每3d换液1次，待细胞长至80％-90％时，用胰蛋白酶消化后以1:3的比例传代。
取第3代hADSCs进行细胞形态观察、表型鉴定和后续实验。
流式细胞仪进行表型鉴定：消化处于对数生长期的第3代hADSCs，制成单细胞悬液，取适量细胞悬液于流式管中，PBS洗涤2次，将荧光标记单克隆抗体CD73、CD90、CD105和CD34、CD45、HLA-DR加入到流式管中，鼠同型对照抗体作为参照，轻轻混匀，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。
2、MTT法测定苦参酮对hADSCs增殖的影响
消化处于对数生长期的第3代hADSCs，制成单细胞悬液，接种于24孔板中，1×104/孔，分为实验组和对照组，24h后，实验组更换为含有不同浓度苦参酮(50nM、100nM)的完全培养基继续培养，对照组更换为新鲜完全培养基继续培养，继续培养24、48、72h后，吸弃上清，PBS洗涤3次，每孔加入20μL 5g/L的MTT溶液，继续培养4h，弃上清后加入150μL二甲基亚砜，振荡10min，酶标仪检测各孔吸光度值(λ＝490nm)。使用3块24孔板平行操作，每块24孔板上各组的不同时间点各设2个复孔。根据吸光度值绘制hADSCs增殖曲线。
3、流式细胞仪鉴定苦参酮对hADSCs表型的影响
消化处于对数生长期的第3代hADSCs，制成单细胞悬液，1×106/皿的密度接种于细胞培养皿中，更换为含有100nM苦参酮的完全培养基培养48h后，吸弃上清，PBS洗涤3次，消化，制成单细胞悬液，取适量细胞悬液于流式管中，PBS洗涤2次，将荧光标记单克隆抗体CD73、CD90、CD105和CD34、CD45、HLA-DR加入到流式管中，鼠同型对照抗体作为参照，轻轻混匀，4℃避光孵育30min，流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。
4、油红O染色法测定苦参酮对hADSCs成脂分化能力的影响
消化处于对数生长期的第3代hADSCs，制成单细胞悬液，1×106/皿的密度接种于细胞培养皿中，分为给药组和不给药组：给药组更换为含有100nM苦参酮的完全培养基培养48h后，吸弃上清，PBS洗涤3次，消化，制成单细胞悬液，再以1×106/皿的密度接种于细胞培养皿中使用完全培养基培养，细胞融合生长至85％左右时，更换为成脂诱导培养基，不给药组不添加苦参酮，其他同给药组，诱导至第14天进行油红O染色，显微镜观察并记录。
另设置空白对照组：取对数生长期的第3代hADSCs用完全培养基培养14天染色。
5、茜素红染色法测定苦参酮对hADSCs成骨分化能力的影响
消化处于对数生长期的第3代hADSCs，制成单细胞悬液，1×106/皿的密度接种于细胞培养皿中，分为给药组和不给药组：给药组更换为含有100nM苦参酮的完全培养基培养48h后，吸弃上清，PBS洗涤3次，消化，制成单细胞悬液，再以1×106/皿的密度接种于细胞培养皿中使用完全培养基培养，细胞融合生长至85％左右时，更换为成骨诱导培养基，不给药组不添加苦参酮，其他同给药组，诱导至第14天进行茜素红染色，显微镜观察并记录。
另设置空白对照组：取对数生长期的第3代hADSCs用完全培养基培养14天染色。
6、统计学分析
结果以均值±标准差表示，应用SPSS 17.0进行数据分析进行统计学比较。
三、实验结果
1、hADSCs形态观察和表型鉴定结果
倒置显微镜下观察显示细胞形态呈长梭形，呈漩涡状生长，排列有序，符合hADSCs的细胞形态学特点，如图1所示。
流式细胞仪鉴定结果显示，细胞阳性表达CD73、CD90和CD105，阴性表达CD34、CD45和HLA-DR，符合hADSCs的表型特点，流式图如图2所示。表达率如表1所示。
表1第3代hADSCs的细胞表型测定结果
单克隆抗体 表达率
CD73 99.8％
CD90 97.1％
CD105 99.5％
CD34 0.72％
CD45 0.69％
HLA-DR 0.61％
2、苦参酮对hADSCs增殖的影响
不同组hADSCs增殖曲线如图3所示，与对照组相比，hADSCs经50nM、100nM苦参酮干预培养24、48、72h后增殖率显著升高，且呈现明显的浓度依赖性和时间依赖性。
490nm吸光度值如表2所示。
表2 490nm吸光度值
组别 24h 48h 72h
对照组 0.15±0.04 0.23±0.04 0.44±0.06
实验组(50nM) 0.27±0.06 0.47±0.06 0.83±0.06
实验组(100nM) 0.32±0.05 0.63±0.06 1.25±0.08
3、苦参酮对hADSCs表型的影响
hADSCs经100nM苦参酮干预培养48h后的细胞表型测定结果如表3所示，CD73、CD90和CD105表达率均在95％以上，CD34、CD45和HLA-DR表达率均在1％以下，与苦参酮干预前的表型无明显变化。
表3 hADSCs经100nM苦参酮干预培养48h后的细胞表型测定结果
Figure BDA0002176055430000041
Figure BDA0002176055430000051
4、苦参酮对hADSCs成脂分化能力的影响
油红O染色结果说明，给药组与不给药组hADSCs均能够正常成脂分化(图4，其中A为给药组，B为不给药组)。空白对照组未见明显成脂分化。
上述结果说明苦参酮体外干预培养不会改变人脂肪间充质干细胞的成脂分化能力。
5、苦参酮对hADSCs成骨分化能力的影响
茜素红染色结果说明，给药组与不给药组hADSCs均能够正常成骨分化(图5，其中A为给药组，B为不给药组)。空白对照组未见明显成骨分化。
通过上述具体实施例可知，苦参酮可以有效促进人脂肪间充质干细胞体外增殖，而且苦参酮培养既不会明显改变人脂肪间充质干细胞的表型，又不会明显改变人脂肪间充质干细胞的多向分化能力，可以将苦参酮添加到L-DMEM培养基制成人脂肪间充质干细胞专用的体外增殖培养基，有助于快速为干细胞移植和再生医学领域提供大量的种子细胞。

Claims (2)

1.苦参酮用于体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的用途。
2.苦参酮用于制备体外促进人脂肪间充质干细胞增殖的培养基的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102018697A (zh) * 2009-09-11 2011-04-20 清华大学 苦参酮作为具有抗血管新生作用的药物有效成分

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