CN115152746A - 一种全甲基环糊精的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全甲基环糊精的新用途。同时提供了一种冰晶生长抑制剂、一种细胞抗冻制剂。本发明所述全甲基环糊精化合物用于制备细胞冰晶生长抑制剂，具有良好的抑制冰晶形成、生长的作用；用于制备细胞抗冻制剂，对冷冻细胞具有良好的细胞复苏作用，对生物细胞具有良好的生物相容性。
Description
技术领域
本发明涉及全甲基环糊精，具体地说是涉及一种全甲基环糊精的新用途。
背景技术
环糊精（CD）是一类环状低聚糖，由于其具有亲水外部和疏水腔体，因此常作为亲脂性化合物或带有亲脂性基团的化合物的保护剂和增溶剂使用。全甲基环糊精是一种取代度为每个吡喃葡萄糖单元3个甲基的环糊精。由于其吡喃葡萄糖单元上不再含有羟基，可促使疏水的药物活性物质可以进入环糊精的空穴中形成复合物，故目前的全甲基环糊精常作为疏水活性药物的增溶剂使用。
细胞保存是现代生物学和医学发展的基础。目前细胞保存技术主要依赖超低温保存技术，即利用极低的温度(-80℃或-196℃)来实现器官、组织、细胞和其它生物材料的长期保存。现有细胞保存技术存在的主要问题是：细胞在冷冻或解冻过程中，会出现冰晶形成、生长和再结晶现象，由此严重影响了细胞的存活及功能维持，这对冷冻细胞的生物医学应用是致命的缺陷。
为了防止由于冷冻细胞冰晶的形成，目前通常使用二甲基亚砜(DMSO)、甘油和聚乙二醇等作为冷冻保护剂（CPA）用于抑制细胞冰晶形成。但是，这些保护剂在抑制细胞内外冰晶形成的同时，可通过疏水作用导致细胞膜松动、膜上形成孔隙和蛋白质失稳，产生细胞膜毒性。
为解决上述问题，研究人员将研究热点放在研制细胞膜抗冻材料上。目前细胞膜的抗冻材料主要包括抗冻蛋白、抗冻聚合物、糖和糖肽类、聚乙烯醇及其衍生物、聚电解质类、纳米材料和水凝胶。这些材料的抗冻作用主要体现在其水溶液可改变生长冰晶形态（DIS），抑制冰的再生长能力（IRI）；以及热滞现象（TH，冰点的非平衡下降）。除此之外，Ben等人证明了长烷基链是赖氨酸基表面活性剂强IRI活性所必需的。王健君等人通过对聚(D/L -丝氨酸)的羟基进行修饰并获得其衍生物，使其有望成为聚乙二醇类的替代品。柯晨峰等人用部分羧甲基化聚轮烷和聚丙烯酰胺制备了一种水凝胶，通过形成假滑动环网络，极大地提高了水凝胶的宏观力学性能、抗冻性能和电导率，可用于制作低温应变传感器。但目前的研究仍然未能有效解决细胞冻存、解冻过程中的冰晶生长、细胞复苏以及抗冻剂与细胞的生物相容性。
发明内容
本发明的目的是提供一种全甲基环糊精的新用途，并由此提出一种可有效抑制冰晶生长、可促进冷冻细胞复苏以及与冷冻细胞具有良好生物相容性的细胞抗冻制剂。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
本发明对全甲基环糊精化合物在细胞冻存、解冻过程中的作用进行了研究，由此提出全甲基环糊精化合物的新用途，即全甲基环糊精化合物在制备抗冻制剂中的应用。其中所述的全甲基环糊精化合物为α-全甲基环糊精化合物、β-全甲基环糊精化合物或γ-全甲基环糊精化合物中的一种。
本发明提供了全甲基环糊精化合物在制备抑制冰晶形成制剂中的应用；以及在制备细胞抗冻制剂中的应用。
更为具体的是：
本发明提供一种冰晶生长抑制剂，其为质量浓度为10-40 mg/mL的全甲基环糊精水溶液。
本发明同时提供两种细胞抗冻制剂：
其中一种细胞抗冻制剂：它包含有冻存液、全甲基环糊精化合物，其质量体积比为0.25～1:1；其中所述的全甲基环糊精化合物为α-全甲基环糊精化合物、β-全甲基环糊精化合物、γ-全甲基环糊精化合物中的一种，冻存液由87.5%DMEM培养液、10% 胎牛血清、2.5%DMSO组成。
另一种细胞抗冻制剂：它包含有冻存液、全甲基环糊精化合物，其质量体积比为0.25～1:1；其中所述的全甲基环糊精化合物为α-全甲基环糊精化合物、β-全甲基环糊精化合物、γ-全甲基环糊精化合物中的一种，冻存液由87.5%干细胞培养液、10% 胎牛血清、2.5% DMSO组成。
本发明所述全甲基环糊精化合物，为取代度为每个吡喃葡萄糖单元3个甲基的环糊精，根据其所含有α-1,4-吡喃葡萄糖单元数量（6,7,8）的不同相对应，命名为α-全甲基环糊精（简称为α-TMCD）、β-全甲基环糊精（简称为β-TMCD）、γ-全甲基环糊精（简称为γ-TMCD）。
其化学结构通式如下所示：
本发明所述的DMEM培养液以及干细胞培养液均可选用市售产品。其中DMEM培养液优选DMEM高糖培养液。
在细胞抗冻制剂，冻存液中选择DMEM培养液可适用于种多数细胞抗冻应用如人胃黏膜上皮细胞GES-1、人肺癌细胞A549、以及HeLa等。
在细胞抗冻制剂，冻存液中选择干细胞培养液可适用干细胞抗冻应用。
本发明有益效果主要体现在：
全甲基环糊精化合物用于制备细胞抗冻制剂，具有良好的抑制冰晶生长作用，同时对冷冻细胞具有良好的细胞冻存复苏作用，且对生物细胞具有良好的生物相容性；再则，含有全甲基环糊精化合物的细胞抗冻制剂可大大减低DMSO的使用量，由此降低DMSO引发的毒副作用。
附图说明
图1：实施例对照组
（磷酸盐缓冲溶液组）的冰晶图。
图2：不同浓度α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD冰晶图。
图3：不同浓度α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD冰晶抑制与对照组的对比MGA图。
图4：对照组的单冰晶生长的冰晶图。
图5：不同浓度α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD单冰晶生长的冰晶图。
图6：α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD单冰晶抑制生长与对照组
（蔗糖溶液组）的抑制冰晶生长速率图。
图7：不同浓度α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD对GES-1细胞的细胞毒性。
图8：不同浓度α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD对HUMSC细胞的细胞毒性。
图9：不同浓度α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD对A549细胞的细胞毒性。
图10：空白组DMSO，以及试验组（α-TMCD、β-TMCD对GES-1细胞的冻存实验的细胞复苏率。
图11：空白组DMSO，以及试验组（α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD）对HUMSC细胞的冻存实验的细胞复苏率。
图12：空白组DMSO，以及试验组（α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD）对A549细胞的冻存实验的细胞复苏率。
图13：空白组DMSO，以及试验组α-TMCD对HUMSC细胞普通光镜图和计算的细胞复苏率。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
全甲基环糊精化合物制备：
（1）将氢化钠加入到石油醚中，在60-95℃下回流1小时，冷却至室温，等沉淀完全后，小心倒出石油醚，反复3次；
（2）以天然α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精为原料，分别将其用N,N-二甲基甲酰胺溶解后，冰浴下搅拌半小时，用滴管逐滴加入装有氢化钠的烧瓶；再在避光条件下，用恒压滴液漏斗滴加碘甲烷，反应8-12小时；其中，环糊精、氢化钠和碘甲烷的当量比为1：60：80。反应完全后，溶液冷制室温，用甲醇淬灭氢化钠，然后用饱和硫代硫酸钠溶液和乙酸乙酯进行洗涤，再用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩乙酸乙酯；最后用硅胶柱进行分离，洗脱剂为乙酸乙酯/甲醇的混合溶剂，体积比10-15：1，分别得到白色固体化合物α-TMCD、β-TMCD和γ-TMCD。
所得化合物的表征结果如下：1H NMR（核磁共振氢谱）
α-TMCD：1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) 3.18 (d, 3H, J = 3.2 Hz, -CH3),3.20 (d, 3H, J = 3.2 Hz, -CH3),3.43 (s, 18H), 3.51 (s, 18H), 3.55-3.63 (m,12H), 3.66 (s, 18H), 3.70 (s, 2H), 3.73 (s, 4H), 3.79-3.87 (m, 12H), 5.07 (d,6H, J = 2.8 Hz, -CH3); 13C NMR (CDCl3, 600 MHz): δ(ppm)57.85, 58.99, 61.81,71.23, 71.47, 81.25, 82.22, 82.48, 100.14; HRMS: Calcd. for: C54H96NaO30,1247.5878, found 1247.5873。
β-TMCD：1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) 3.20 (d, 3H, J = 3.6 Hz, -CH3),3.23 (d, 4H, J = 3.2 Hz, -CH3),3.41 (s, 22H), 3.53 (s, 25H), 3.56 (s, 2H),3.60 (s, 3H), 3.62 (s, 5H), 3.64 (s, 3H), 3.67 (s, 23H), 3.81-3.90 (m, 15H),5.15 (d, 7H, J = 3.6 Hz, -CH3); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 58.53,58.57, 58.99, 59.02, 61.48, 61.52, 70.95, 71.43, 80.34, 81.78, 82.08, 98.99;HRMS: Calcd. for: C63H112NaO35, 1451.6876, found 1451.6863。
γ-TMCD：1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) 3.21 (d, 4H, J = 3.2 Hz, -CH3), 3.24 (d, 4H, J = 3.6 Hz, -CH3),3.39 (s, 24H), 3.53 (s, 24H), 3.55-3.57(m, 16H), 3.67 (s, 24H), 3.71 (s, 4H), 3.73 (s, 3H),3.76 (s, 6H), 3.78 (s,3H), 3.86 (d, 4H, J = 2.8 Hz, -CH3), 3.88 (d, 4H, J = 2.8 Hz, -CH3), 5.25 (d,8H, J = 3.6 Hz, -CH3); 13C NMR (CDCl3, 400 MHz): δ(ppm) 58.70, 58.74, 61.40,61.44, 70.94, 71.29, 78.48, 81.94, 82.02, 98.05; HRMS: Calcd. for:C72H128NaO40, 1655.7859, found 1655.7874。
实施例2
冰晶生长抑制剂的制备
称取α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD，分别加入纯净水，制备成质量比浓度为10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL即分别制备成相应浓度的α-TMCD冰晶生长抑制剂、β-TMCD冰晶生长抑制剂、γ-TMCD冰晶生长抑制剂。
全甲基环糊精化合物（α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD）对单冰晶生长的抑制作用：
实验分为对照组
（磷酸盐缓冲溶液组）、全甲基环糊精化合物试验组。
全甲基环糊精化合物试验组又分为：低浓度组（10 mg/mL）、中浓度组（20 mg/mL）和高浓度组（40 mg/mL）。实验在偏光显微镜和冷热台上进行。
实验步骤如下：（1）将载玻片放置冷热台上，液氮作用下，冷却至-60℃，分别将10μL的对照组
样品和不同浓度的试验组样品从1.4米高度滴到冷却好的载玻片上，以15℃/分钟的速度逐渐升温至-6℃，在-6℃时保持30分钟后通过偏光显微镜观察各自冰晶形貌和尺寸。
随机选取载玻片上样品冰晶的中心区域和三个边缘区域拍照，统计5倍镜下视野内的冰晶数量，计算磷酸盐缓冲溶液平均冰晶个数为147个（详见图1）。
在低浓度组中，随机选取载玻片上样品冰晶的中心区域和三个边缘区域，统计5倍镜下视野内的冰晶数量，化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD冰晶数量分别为238个、214个、169个（详见图2，10 mg/mL）。
低浓度组与对照组
在抑制冰晶生长活性方面相比，用MGA（Mean grain area）表示分别为61.7%、68.7%、86.9%。结果说明，在低浓度组，α-TMCD、β-TMCD抑制冰晶生长作用较好，γ-TMCD抑制冰晶生长作用较弱。
在中浓度组，随机选取载玻片上样品冰晶的中心区域和三个边缘区域，统计5倍镜下视野内的冰晶数量，化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD冰晶数量分别为307个、286个、196个。其抑制冰晶生长作用的活性与对照组
相比，用MGA（Mean grain area）表示分别为47.8%、51.4%、75.0%。结果说明，在中浓度组，α-TMCD和β-TMCD具有好的抑制冰晶生长作用，而γ-TMCD抑制冰晶生长作用较弱。（详见图2，20 mg/mL）。
在高浓度组中，随机选取载玻片上样品冰晶的中心区域和三个边缘区域，统计5倍镜下视野内的冰晶数量，化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD的冰晶数量分别为406个、374个、242个。其抑制冰晶生长作用的活性与对照组
相比，用MGA（Mean grain area）表示分别为36.2%、39.3%、60.7%。结果说明，在高浓度组，α-TMCD和β-TMCD具有好的抑制冰晶生长作用，γ-TMCD也体现了随着浓度的增加，抑制冰晶生长作用增强。（详见图2，40 mg/mL）
上述实验表明，全甲基环糊精类化合物的抑制冰晶生长作用与浓度成正相关（详见图3）。尤其是高浓度α-TMCD对冰晶抑制生长作用的MGA值达到36.2%左右。
实施例3
化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD的单冰晶生长及抑制冰晶生长速率研究：
实验分为对照组
（45%蔗糖溶液组）、全甲基环糊精化合物试验组，全甲基环糊精化合物试验组又分为：低浓度组（10 mg/mL）、中浓度组（20 mg/mL）和高浓度组（40 mg/mL），在偏光显微镜和冷热台上进行。
实验步骤如下： 将1 μL样品溶液滴在载玻片的圆中心，用盖玻片盖住，边缘用封片胶封住。以25 ℃/分钟的速率降温至-50 ℃，保持2分钟；再以5 ℃/分钟的速率升温至-8℃，保持1小时，并以0.5℃/分钟的速率进一步升温，以融化大部分冰晶。然后以0.1 ℃/分钟的速率继续升温至冰晶大小不变的某一时刻，温度定义为T0，当仅存在少量冰晶时，以相同的速率0.1 ℃/分钟进行冷却，直到晶体突然增大，继续以速率0.1 ℃/分钟进行冷却，每隔0.2 ℃进行拍照。
在低浓度组中，用Nase AtoM 2000软件选取冰晶的三条最长直径，计算每个化合物的冰晶抑制增长速率。实验结果表明，与对照组
相比，化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD都表现出抑制作用（详见图4、图5，图6，10 mg/mL）。其中，α-TMCD的抑制冰晶增长作用最为明显，最大增长速率为15 μm/min，相同时间内，对照组II的增长速率达到50 μm/min；β-TMCD也表现出缓慢增长的趋势，γ-TMCD前期增长缓慢，当达到一定时间后，增长速率增大。
在中浓度组中，用Nase AtoM 2000软件选取冰晶的三条最长直径，计算每个化合物的冰晶抑制增长速率。实验结果表明，与对照组II相比，α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD都表现出明显的抑制作用（详见图4、图5、图6，20 mg/mL）。其中，α-TMCD的抑制冰晶增长呈先上升后降低的趋势，最大增长速率为18 μm/min；其次，β-TMCD和γ-TMCD化合物前期增长速率较快，随着时间的变化，增长速率逐渐缓慢，最大增长速率为25 μm/min。
在高浓度组中，用Nase AtoM 2000软件选取冰晶的三条最长直径，计算每个化合物的冰晶抑制增长速率。实验结果表明，与对照组II相比，化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD都表现出明显的抑制作用（详见图4、图5、图6，40 mg/mL）。其中，α-TMCD的抑制冰晶增长作用最为明显，最大增长速率为14 μm/min；其次，β-TMCD表现出缓慢增长的趋势，最大增长速率为21 μm/min；而γ-TMCD增长速率较快，最大增长速率在30 μm/min左右。
实验表明α-TMCD在不同浓度下都具有好的冰生长抑制作用，低浓度下即可达到好的冰生长抑制速率，随着浓度增大，冰生长抑制速率变化不大。
实施例4
α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD的细胞毒性实验：
将GES-1细胞以每孔7×103个细胞(含180 μL DMEM培养液)的浓度接种在96孔板，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育24 h。将待测物配置成250 μM、125 μM、50 μM、25 μM和5μM五个浓度，每个浓度设置六个复孔，将药物混匀后，每个孔加20 μL；同时设置6个只加培养液的空白对照，置于37 ℃，5% CO2的条件下孵育48 h。首先，将每个药物复孔用PBS清洗一遍，再加上180 μL培养液，避光条件下，在每个有溶液的孔中加入20 μL MTT (0.5 mg/mL)混合均匀，孵育4 h。然后避光条件下，将96孔板中的液体用移液枪吸出，并在每个孔加入100 μL盐酸-异丙醇混合溶液，振荡器震荡5 min。用酶标仪490 nm波长处测定每孔的OD值，由OD值计算细胞存活率。人脐带间充质干细胞HUMSC和人肺癌细胞A549的细胞毒性试验用上述方法进行测试。
实验结果显示，α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD对GES-1细胞、HUMSC细胞、A549细胞均无细胞毒性，说明具有良好的生物相容性（详见图7、图8、图9）。
实施例5
细胞抗冻剂的制备：
分别称取0.25 mg、0.5 mg、1.0 mg的α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD，分别加入到1 mL的冻存液中，冻存液含有87.5% DMEM培养液、10% 血清、2.5% DMSO。制备成不同浓度的全甲基环糊精细胞抗冻剂。
其中DMEM培养液为市售DMEM高糖培养基（商品厂家：BeiJing Solarbio Science& Technology），其含L-谷氨酰胺（不含丙酮酸钠）、含葡萄糖4.5g/L、含hepes5958mg/L、含青霉素100U/mL、含链霉素100μg/mL。
α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD细胞抗冻剂的应用（在人胃黏膜上皮细胞GES-1冻存方面的应用）。
细胞冻存过程：将GES-1细胞接种在含10% 胎牛血清的DMEM培养液（高糖型培养基）中，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育48 h。用0.25% 的胰蛋白酶消化细胞，1200 rpm离心3 min。将0.5 mL的细胞（浓度为2.5 × 105 cells/mL-1）转移到冻存管中，其中空白组的冻存条件是：87.5% DMEM培养液、10% 胎牛血清、2.5% DMSO；试验组的冻存条件是：1mL冻存液（87.5% DMEM培养液、10% 胎牛血清、2.5% DMSO，）加入0.25mg或0.5 mg或1.0 mg的α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD。
将所有细胞先从4 ℃冰箱冷却5 min，进一步在-20 ℃冰箱预冻存0.5 h，最后在-80 ℃冰箱冻存24 h。
细胞复苏过程：将冻存细胞在37 ℃的条件下水浴2 min，进行细胞解冻，移除冻存液，把复苏的细胞接种在培养瓶中，培养液为含10% 胎牛血清的DMEM培养液，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中孵育24 h。孵育24 h后，吸出死细胞，用0.25%的胰蛋白酶对贴壁的细胞进行消化，用细胞计数仪计数，计算细胞复苏率。每组设5个平行实验，细胞计数结果舍去最大值和最小值。
实验结果显示，空白组GES-1细胞的复苏率在50.0%左右，试验组化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD细胞复苏率分别提高了19.9%、14.0%、7.3%。（详见图10-1、图10-2）。
实施例6
α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD细胞抗冻剂的应用（在人脐带间充质干细胞HUMSC冻存方面的应用）：
细胞冻存过程：将HUMSC细胞接种在含胎牛血清的干细胞培养基中，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中孵育48 h。用0.05% 的胰蛋白酶消化细胞，1200 rpm离心3 min。将0.5 mL的细胞（浓度为2.5 × 105 cells/mL-1）转移到冻存管中，其中空白组的冻存条件是：87.5%干细胞培养液、10% 血清、2.5% DMSO；试验组的冻存条件是：1 mL的冻存液（含有87.5%干细胞培养液、10% 血清、2.5% DMSO），并分别加入0.25、0.5和1.0 mg的α-TMCD或β-TMCD或γ-TMCD化合物。将所有细胞先从4 ℃冰箱冷却5 min，进一步在-20 ℃冰箱预冻存0.5 h，最后在-80 ℃冰箱冻存24 h。
其中干细胞培养液为市售间充质干细胞无血清基础培养液（商品厂家中乔新舟公司），其成分含必需和非必需氨基酸、维生素、有机和无机化合物、激素、微量矿物质等。
细胞复苏过程：将冻存细胞在37 ℃的条件下水浴2 min，进行细胞解冻，移除冻存液，把复苏的细胞接种在培养瓶中，培养液为含胎牛血清的干细胞培养基，置于37 ℃，5%CO2的培养箱中孵育24 h。孵育24 h后，吸出死细胞，用0.05%的胰蛋白酶对贴壁的细胞进行消化，用细胞计数仪计数，计算细胞复苏率。每组设5个平行实验，细胞计数结果舍去最大值和最小值。
实验结果显示，空白组HUMSC细胞的复苏率在45.0%左右，试验组化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD的细胞复苏率分别提高了13.6%、9.6%、5.5%。（详见图11-1、图11-2）。
实施例7
α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD细胞抗冻剂的应用（在人肺癌细胞A549冻存方面的应用）：
实验操作同实施例5
实验结果显示，空白组A549细胞的复苏率在57.0%左右，试验组化合物α-TMCD、β-TMCD、γ-TMCD细胞复苏率分别提高了19.1%、17.3%、9.4%。（详见图12-1、图12-2）。
实施例8
α-TMCD对HUMSC细胞冻存普通光镜观察及计算的细胞增殖率：
细胞冻存过程：将HUMSC细胞接种在含血清的干细胞培养基中，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育48 h。用0.05%的胰蛋白酶消化细胞，1000 rpm离心5 min。将0.5 mL的细胞（浓度为2.5× 105 cells/mL-1）转移到冻存管中，其中空白组的冻存条件是：87.5%干细胞培养液、10% 胎牛血清、2.5% DMSO；试验组的冻存条件是：1 mL的冻存液（含有87.5%干细胞培养液、10% 胎牛血清、2.5% DMSO）并加入0.5 mg的α-TMCD。将所有细胞先从4 ℃冰箱冷却5 min，进一步在-20 ℃冰箱预冻存0.5 h，最后在-80 ℃冰箱冻存24 h。
细胞复苏过程：将冻存细胞在38 ℃的条件下水浴2 min，进行细胞解冻，移除冻存液，把复苏的细胞接种在培养皿中，培养液为含血清的干细胞培养基，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中孵育24 h。孵育24 h后，去除非贴壁细胞，用普通显微镜对细胞进行拍照。使用软件Image J对照片中的细胞进行计数，计算细胞存活率，平行三组实验。
实验结果显示（图13），0.5 mg/mL浓度的α-TMCD与空白组DMSO的细胞相比，复苏率提高了97%左右。
Claims (8)
1.全甲基环糊精化合物在制备抗冻制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的全甲基环糊精化合物在制备抗冻制剂中的应用，其特征在于所述的全甲基环糊精化合物为α-全甲基环糊精化合物。
3.根据权利要求1所述的全甲基环糊精化合物在制备抗冻制剂中的应用，其特征在于所述的全甲基环糊精化合物为β-全甲基环糊精化合物。
4.根据权利要求1所述的全甲基环糊精化合物在制备抗冻制剂中的应用，其特征在于所述的全甲基环糊精化合物为γ-全甲基环糊精化合物。
5.根据权利要求1所述的全甲基环糊精化合物在制备抗冻制剂中的应用，其特征在于所述应用是在制备冰晶生长制剂中的应用。
6.一种冰晶生长抑制剂，其特征在于：其为质量浓度为10-40 mg/mL的全甲基环糊精水溶液。
7.一种细胞抗冻制剂，其特征在于它包含有冻存液、全甲基环糊精化合物，其质量体积比为0.25～1:1；其中所述的全甲基环糊精化合物为α-全甲基环糊精化合物、β-全甲基环糊精化合物、γ-全甲基环糊精化合物中的一种，冻存液由87.5% DMEM培养液、10%胎牛血清、2.5% DMSO组成。
8.一种细胞抗冻制剂，其特征在于它包含有冻存液、全甲基环糊精化合物，其质量体积比为0.25～1:1；其中所述的全甲基环糊精化合物为α-全甲基环糊精化合物、β-全甲基环糊精化合物、γ-全甲基环糊精化合物中的一种，冻存液由87.5%干细胞培养液、10%胎牛血清、2.5% DMSO组成。
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