CN116458497A - 一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法，属于生物材料技术领域。以解决由于使用DMSO或血清，导致可能的病毒污染技术问题。制备方法包括：将聚乙烯醇水浴中加热，并磁力搅拌下加入到缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；将全甲基化环糊精超声溶解于的缓冲液中，待全甲基化环糊精全部溶解后，加入金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；将第一溶液和第二溶液混合后加入的乙二醇，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到冷冻液；将的聚乙烯醇在水浴中加热，并磁力搅拌下加入到缓冲液中，冷却至室温后加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到解冻液。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，尤其涉及一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法。
背景技术
卵巢细胞在冷冻的过程中，由于其具有大的尺寸继而具有大量的水分，卵巢细胞可能会受到损坏，进而降低其低温冻存存活率。另外卵巢细胞组成复杂，各部分的热导率和热容不均匀，很难在解冻过程中实现均匀传热，解冻过程的冰晶重结晶后会对细胞造成很大的损伤。
卵巢细胞在冷冻和解冻过程中，选择合适的冷冻保护剂能减弱冰晶和高浓度溶质对卵巢细胞的损害，提高卵子存活率，现有技术中的卵巢冷冻采用的冷冻保护剂大多含有血清、二甲基亚砜DMSO或两者的组合等，这些冷冻保护剂可使溶液冰点降低，进而提高细胞膜对水的通透性，减少细胞内冰晶的形成，从而避免卵巢细胞的损伤。
其中，DMSO能够快速穿透卵巢细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时减少卵巢细胞内冰晶的形成，从而避免卵巢细胞损伤，但DMSO对细胞存在一定的毒性，不使用DMSO，寻找其他替代物也显得尤为必要。
冷冻保护剂成分通常还包含血清，然而即使是纯化的白蛋白，由于其动物来源的特性，仍然会极大增加带来病毒等感染物质的可能，同时血清来源受限，价格昂贵，所以其使用也必然会受到越来越多的限制。因此，寻找替代血清的非渗透性保护剂显得尤为必要。
现有技术的冷冻液中一般单独使用血清或者DMSO，或者使用少量的DMSO，但是同时不含有血清和DMSO的冷冻液，且能达到类似或更高存活率效果的冷冻液却非常少见。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卵巢细胞冷冻液和解冻液及其制备方法，通过不使用DMSO和血清制备冷冻液和解冻液，解决了现有技术中由于使用DMSO或血清，导致可能的病毒污染以及增加对卵巢细胞潜在的毒性作用风险的问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面提供了一种卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法，所述冷冻液和解冻液的制备步骤包括：
（1）将0.5g～8g 聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30～40ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
（2）将2 g～5g全甲基化环糊精超声溶解于20m～30ml的缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；
（3）将第一溶液和第二溶液混合后加入5ml～8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到冷冻液；
（4）将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到20～40ml缓冲液中，冷却至室温后加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，然后调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到解冻液。
根据本公开的至少一个实施方式，所述全甲基化环糊精为α-全甲基化环糊精、β-全甲基化环糊精或γ-全甲基化环糊精中的一种，所述全甲基化环糊精具有直径为0.5nm～1.5nm且高度为3 nm～4nm的孔洞。
根据本公开的至少一个实施方式，所述金纳米笼为立方体纳米颗粒，所述立方体纳米颗粒的表面带有孔洞，所述金纳米笼的粒径为20 nm～80nm，优选为30 nm～60nm，更优选为40 nm～50nm。
根据本公开的至少一个实施方式，所述聚乙烯醇的分子量为550 kDa～650kDa。
相对于现有技术，本发明实施例提供的卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法，通过将0.5g～8g聚乙烯醇溶解到缓冲液中得到第一溶液，而将2 g～5g全甲基化环糊精、0.05g～0.2g的金纳米笼加入到缓冲液中形成第二溶液，然后将第一溶液和第二溶液混合后再加入5ml～8ml的乙二醇调节PH值至7从而得到无DMSO或血清的冷冻液。其中，金纳米笼悬浮于冷冻液中，不与冷冻液中的其他成分发生化学反应，无毒副作用，也不会进入卵巢细胞内部，且金纳米笼可有效抑制冰的重结晶，能够提高细胞低温冻存的存活率。另外，全甲基化环糊精和金纳米笼均能提高卵巢细胞存活率，且两者共同使用可以起到协同作用，在冷冻液中同时加入上述两种物质进而避免使用DMSO和血清，降低了其毒性以及易带入寄生性生物污染物的风险。
本发明实施例解冻液也能够避免使用DMSO和血清，将聚乙烯醇加入缓冲液后再加入金纳米笼然后调节PH值至中性，也具有抑制冰晶生长的作用。综上，本发明实施例的冷冻液和解冻液能有效控制冰晶生长，显著改善解冻过程中对卵巢细胞的损害，能达到或优于现有的冷冻解冻液的存活率，且生物相容性好。
本发明的另一目的在于还提供一种卵巢细胞冷冻液和解冻液，根据上述的冷冻液和解冻液制备方法制备而得，其中，每100ml冷冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、2 g～5g全甲基化环糊精、0.05 g～0.2g金纳米笼、5ml～8ml的乙二醇，余量为PBS缓冲液；
每100ml解冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、0.05 g～0.2g金纳米笼，余量为PBS缓冲液。
所述卵巢细胞冷冻液和解冻液相对于现有技术的优势与上述卵巢细胞冷冻液和解冻液制备方法相对于现有技术所具有的优势相同，在此不再赘述。
本发明的另一目的在于还提供一种激光加温解冻的方法，采用上述的制备方法制备的冷冻液和解冻液，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射，之后转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻。
根据本公开的至少一个实施方式，在对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，解冻复温的时间为10s～13s。
根据本公开的至少一个实施方式，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，所述近红外激光的波长为650 nm～850nm。
根据本公开的至少一个实施方式，所述转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻的步骤中，所述平衡液的制备步骤至少包括：
将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30～40ml的PBS缓冲液中，待所述聚乙烯醇全部溶解后，加入5ml～10ml的乙二醇，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到平衡液。
所述激光加温解冻的方法相对于现有技术的优势与上述制备方法相对于现有技术所具有的优势相同外，还在于对冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温的步骤中同时使用红外激光进行照射含有金纳米笼的解冻液，在解冻过程中利用红外激光照射金纳米笼可以提高升温速率，实现对卵巢细胞的超快速解冻处理，从而提高冷冻卵巢细胞的存活率。
附图说明
附图示出了本公开的示例性实施方式，并与其说明一起用于解释本公开的原理，其中包括了这些附图以提供对本公开的进一步理解，并且附图包括在本说明书中并构成本说明书的一部分。
图1为根据本公开实施方式的卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法流程图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本公开相关的部分。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施方式来详细说明本公开。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的实施例提供了一种卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法，请参阅图1所示，具体包括以下步骤：
步骤S100：将0.5g～8g 聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到20ml～40ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；上述聚乙烯醇的用量可选地为1g～7g，还可选地为2.5g～5.5g，例如，3g、4g、5g。上述水浴的温度可选地为71℃～79℃，还可选地为73℃～77℃，例如75℃。
本发明对缓冲液没有特殊的限定，本领域熟知的作为溶解保护的市售缓冲液均可，上述缓冲液可选地为PBS缓冲液。
本发明对上述磁力搅拌的条件没有特殊的限定，按照本领域熟知的条件进行即可。
步骤S200：将2 g～5g全甲基化环糊精超声溶解于20ml～30ml的缓冲液中，待全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；上述全甲基化环糊精的用量可选地为2.5g～4.5g，还可选地为2.7g～4.3g，例如，2.9g、3.3g、3.7g。此步骤中上述金纳米笼的用量可选地为0.07g～0.17g，还可选地为0.09g～0.15g，还可选地为0.11g～0.13g，例如，0.12g。
本发明对上述超声振荡的条件没有特殊的限定，按照本领域熟知的条件进行即可。
步骤S300：将步骤S100得到的第一溶液和步骤S200得到的第二溶液混合后加入5ml～8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到冷冻液；上述乙二醇的用量可选地为6.5ml～7.7ml，还可选地为6.7ml～7.3ml，还可选地为6.9ml～7.1ml。
本发明对乙二醇没有特殊的限定，本领域熟知的乙二醇均可。
步骤S400：将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到20ml～40ml缓冲液中，冷却至室温后加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，然后调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到解冻液。上述聚乙烯醇的用量可选地为1g～7g，还可选地为2.5g～5.5g，例如，3g、4g、5g。上述水浴的温度可选地为71℃～79℃，还可选地为73℃～77℃，例如75℃。此步骤中上述金纳米笼的用量可选地为0.07g～0.17g，还可选地为0.09g～0.15g，还可选地为0.11g～0.13g，例如，0.12g。上述缓冲液可选地为PBS缓冲液。
本发明对步骤S400中的超声振荡的条件没有特殊的限定，按照本领域熟知的条件进行即可。
示例性地，上述全甲基化环糊精为α-全甲基化环糊精、β-全甲基化环糊精或γ-全甲基化环糊精中的一种，优选地为β-全甲基化环糊精；全甲基化环糊精具有直径为0.5nm～1.5nm且高度为3 nm～4nm的孔洞。可选地全甲基化环糊精的内径为0.55nm～1.35nm，还可选地为0.6nm～1.15nm，还可选地为0.75nm～1.05nm，还可选地为0.9m～0.95nm。
本发明实施例的上述全甲基化的环糊精可以按本领域公知的方法进行制备。
在一些实施方式中，金纳米笼为立方体纳米颗粒，立方体纳米颗粒的表面带有孔洞，金纳米笼的粒径为20 nm～80nm，可选地为30 nm～60nm，还可选地为40 nm～50nm，还可选地为43nm～47nm。金纳米笼由于其自身的结构特征可以吸收近红外区域的光，因此当细胞解冻时，利用激光所具有能量密度大的特点，在短时间内迅速地提高冷冻的卵巢细胞的升温速率，实现对卵巢细胞的超快速解冻处理，并且解冻液中的金纳米笼，可以防止细胞解冻时所发生的冰的再结晶化，在细胞解冻过程中可以做到对细胞的损伤最小化，从而极大地提高了卵巢细胞的存活率。上述金纳米笼与全甲基化环糊精均具有多孔结构，且二者的空隙尺寸相同或相差不大，使得二者通过协同作用防止卵巢细胞解冻时所发生的冰的再结晶化，从而使得卵巢细胞的存活率进一步提高。
示例性地，上述聚乙烯醇的分子量为550 kDa～650kDa，可选地为570 kDa～620kDa，可选地为580 kDa～600kDa。
根据本发明的另一方面，提供了一种卵巢细胞冷冻液和解冻液，根据上述的冷冻液和解冻液制备方法制备而得，其中，每100ml冷冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、2 g～5g全甲基化环糊精、0.05 g～0.2g金纳米笼、5ml～8ml的乙二醇，余量为PBS缓冲液；
每100ml解冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、0.05 g～0.2g金纳米笼，余量为PBS缓冲液。
根据本发明的又一方面，提供了一种激光加温解冻的方法，采用上述的制备方法制备的冷冻液和解冻液，对冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射，之后转移到平衡液中平衡2min～6min中完成卵巢细胞的解冻。
在一些实施方式中，上述平衡液的制备方法步骤至少包括：将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到40ml的PBS缓冲液中，待所述聚乙烯醇全部溶解后，加入5ml～10ml的乙二醇，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到平衡液。上述平衡液中，聚乙烯醇的用量可选地为1g～7g，还可选地为2.5g～5.5g，例如，3g、4g、5g。上述水浴的温度可选地为71℃～79℃，还可选地为73℃～77℃，例如75℃。上述乙二醇的用量可选地为6.5ml～9.5ml，还可选地为7ml～8.3ml，还可选地为7.5ml～8.1ml。
示例性地，上述在对冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，解冻复温的时间为10s～13s，可选地为10.5s～12.5s，还可选地为10.7s～12.1s，还可选地为11s～11.7s。
本发明实施例选择的金纳米笼相对于其他形状的金纳米颗粒，本发明实施例的金纳米笼具有较高的加热效率以及较高的存活率，所需要的复温时间更短，金纳米棒一般复温时间需要16 s～25s。
可以理解的是，上述对冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温的同时进行近红外激光照射所使用的近红外激光的波长为650 nm～850nm，可选地为700 nm～820nm，还可选地为750 nm～800nm。
采用上述波长的红外激光照射的复温解冻方法在冷冻的卵巢细胞复温期间，分散在解冻液中的金纳米笼在近红外激光照射下产生均匀的热量，而不与卵巢细胞偶联，这种方法可以提供均匀且快速的加温，缩短冷冻的卵巢细胞复温时间，进而提高存活率。
下面给出几种冷冻液和解冻液制备方法的示例，并选择有代表性的冷冻液和解冻液进行性能分析。
测试方法：
（1）实验材料：取7-8周龄的15只健康雌性小鼠（购自上海杰思捷实验动物有限公司），将其宰杀并摘取卵巢，将卵巢切割为若干卵巢组织片，其厚度为1mm，将上述卵巢组织片作为实验材料。
（2）各个实施例及对比例中聚乙烯醇的分子量为600kDa，金纳米笼的粒径约为50nm，金纳米笼为市售产品，购自中科雷鸣（北京）科技有限公司。
（3）对上述卵巢细胞冷冻保存的方法为：卵巢细胞先置于平衡液中平衡5分钟，然后置于冷冻液中平衡45秒，将已在冷冻液中平衡的卵巢细胞放置于冷冻载杆上，然后快速投入液氮(-195℃)中，并封闭载杆后继续保存。
（4）本发明提供的激光加温解冻方法为：将冷冻液冷冻的卵巢细胞放入解冻液中，同时使用波长为800nm的近红外激光照射，解冻复温时间12s，之后转移到平衡液中平衡5min中完成卵巢细胞的解冻。将解冻完毕的卵巢细胞培养2小时、12小时、24小时、48小时后观察存活细胞数量，计算存活率。
实施例1
本实施例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将0.5g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、将2g全甲基化环糊精超声溶解于25ml的PBS缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.05 g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；
S300、将第一溶液和第二溶液混合后加入5ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S400、将0.5 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温后加入0.05 g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
实施例2
本实施例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将2g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、将3g全甲基化环糊精超声溶解于25ml的PBS缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.1 g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；
S300、将第一溶液和第二溶液混合后加入7ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S400、将2 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温后加入0.1 g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
实施例3
本实施例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将5g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、将5g全甲基化环糊精超声溶解于25ml的PBS缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.2 g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；
S300、将第一溶液和第二溶液混合后加入8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S400、将5 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温后加入0.2 g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
对比例1
本对比例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将5g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、将第一溶液中加入8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S300、将5 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
对比例2
本对比例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将5g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、将5 g全甲基化环糊精超声溶解于25ml的PBS缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，得到第二溶液；
S300、将第一溶液和第二溶液混合后加入8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S400、将5 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温后，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
对比例3
本对比例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将5g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、在25ml的PBS缓冲液中，加入0.2 g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；
S300、将第一溶液和第二溶液混合后加入8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S400、将5 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温后加入0.2 g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
对比例4
本对比例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将5g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、将5 g羟丙基-β-环糊精超声溶解于25ml的PBS缓冲液中，待所述羟丙基-β-环糊精全部溶解后，加入0.2 g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；
S300、将第一溶液和第二溶液混合后加入8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S400、将5 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温后加入0.2 g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
对比例5
本对比例提供的冷冻液和解冻液制备方法，具体包括：
S100、将5g聚乙烯醇在75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
S200、将5 g全甲基化环糊精超声溶解于25ml的PBS缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.2 g金纳米棒，超声振荡后，得到第二溶液；
S300、将第一溶液和第二溶液混合后加入8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到冷冻液；
S400、将5 g聚乙烯醇75℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到30ml的PBS缓冲液中，冷却至室温后加入0.2 g金纳米棒，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到解冻液。
下面给出各个实施例及对比例的冷冻卵巢细胞存活率，请参阅表1所示：
表1 各个实施例及对比例的冷冻卵巢细胞存活率
表1给出了解冻完毕的卵巢细胞在培养2小时、12小时、24小时、48小时后观察存活细胞数量，计算得出存活率。从表1可以看出，实施例1-3中的冷冻液的2h存活率都在99%以上，而12h、24h和48h的存活率也都在98%以上。相对于实施例3的制备方法，对比例1不含全甲基化环糊精和金纳米笼，对比例2不含金纳米笼，对比例3不含全甲基化环糊精，对比例1-3的2h存活率都比实施例1-3低，并且12h、24h和48h的存活率下降的比较严重。可见，全甲基化环糊精和金纳米笼均能提高卵巢细胞存活率，两者共同使用由于具有多孔结构、以及孔洞具有相同、相似或相差不大孔径可以起到协同作用，在冷冻液中加入上述两种物质避免使用DMSO和血清，降低了毒性以及易带入寄生性生物污染物的风险，并且提高冷冻细胞的存活率。
对比例4选用了羟丙基-β-环糊精，相对于本发明实施例中的全甲基化环糊精，冷冻卵巢细胞的存活率较低。
对比例5选用了金纳米棒，相对于本发明实施例中的金纳米笼的存活率较低，且复温时间需要20s，比本申请所需的复温时间要长。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。
Claims (9)
1.一种卵巢细胞冷冻液和解冻液的制备方法，其特征在于，所述冷冻液和解冻液的制备步骤包括：
（1）将0.5g～8g 聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到20～40ml缓冲液中，冷却至室温后得到第一溶液；
（2）将2g～5g全甲基化环糊精超声溶解于20ml～30ml的缓冲液中，待所述全甲基化环糊精全部溶解后，加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，得到第二溶液；
（3）将第一溶液和第二溶液混合后加入5ml～8ml的乙二醇，然后调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到冷冻液；
（4） 将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到20～40ml缓冲液中，冷却至室温后加入0.05 g～0.2g金纳米笼，超声振荡后，调节pH值至7，并定容补足余量缓冲液至100ml，得到解冻液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全甲基化环糊精为α-全甲基化环糊精、β-全甲基化环糊精或γ-全甲基化环糊精中的一种或多种，所述全甲基化环糊精具有直径为0.5nm～1.5nm且高度为3 nm～4nm的孔洞。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述金纳米笼为立方体纳米颗粒，所述立方体纳米颗粒的表面带有孔洞，所述金纳米笼的粒径为20 nm～80nm。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇的分子量为550 kDa～650kDa。
5. 一种卵巢细胞冷冻液和解冻液，其特征在于，根据权利要求1-4任一项所述的制备方法制备而得，其中，每100ml冷冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、2 g～5g全甲基化环糊精、0.05 g～0.2g金纳米笼、5ml～8ml的乙二醇，余量为PBS缓冲液；
每100ml解冻液中包括0.5 g～8g的聚乙烯醇、0.05 g～0.2g金纳米笼，余量为PBS缓冲液。
6.一种激光加温解冻的方法，其特征在于，采用权利要求1-4任一项所述的制备方法制备的冷冻液和解冻液，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射，之后转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻。
7.根据权利要求6所述的激光加温解冻的方法，其特征在于，在对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，解冻复温的时间为10s～13s。
8. 根据权利要求6所述的激光加温解冻的方法，其特征在于，对所述冷冻液冷冻的卵巢细胞进行解冻复温，同时通过近红外激光进行照射的步骤中，所述近红外激光的波长为650 nm～850nm。
9.根据权利要求6-8任一项所述的激光加温解冻的方法，其特征在于，所述转移到平衡液中平衡2min～6min中完成所述卵巢细胞的解冻的步骤中，所述平衡液的制备步骤至少包括：
将0.5 g～8g的聚乙烯醇在70℃～80℃水浴中加热，并磁力搅拌下加入到20～40ml的PBS缓冲液中，待所述聚乙烯醇全部溶解后，加入5ml～10ml的乙二醇，调节pH值至7，并定容补足余量PBS缓冲液至100ml，得到平衡液。
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