JPS6070338A - 超微細構造分析用生体組織を凍結調製するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は試料自体の調製の瞭に組織の超微細構造の有意
的な変性を回避することによる超微細構造分析用生体組
織試料の調製方法および装置に関する。医学技術上組織
試料を検査し、細胞構造およびその機能を決定するため
に、殆んど全ての分析方法を適用する前に組織が「固定
」されなければならないことが良（知られている。

各種顕微鏡或いは関連した折、大装置を使用して組織試
料を検査することが長年実施されているが、試料構成成
分の検査をＸ−線分析により２〜３Ａ単位の点間解像力
をもって５００倍〜５００．０００倍の倍率で行うこと
を可能にする現代の高踏イＳ１力分析顕微鏡、例えばＳ
Ｔ弱電子顕微鉦、に使用するための組織試料の調製に当
り、内在する問題がちつた。

具体的には、組織調製過程中に生じた各種人為結果（人
為構造ということもある）の程度を同時に評価しながら
組織分析の結果を解釈することが困難である。従って、
可能な限り人為結果を回避することが必須である。もう
一つの問題は、組織試料が極端ではあるが、現在の定説
においては首尾良い調製操作に必要である程度の操作に
付された場合に、組織試料自体の物理的収縮から生ずる
ものである。殆んどの通常の組織調製工程において組織
の収縮は４０係〜５０係のオーダーにある。この収縮は
必然的に超微細構造の変更および下部構造分解の大きな
再配列をもたらす。この超微細構造の変更の拶傷の正味
の結果はこの分析操作を介した説明における不正確な詳
細である。

所謂「形態学の黄金時代」の際には定性的および定損的
顕微鏡における基本的な目標は審美的に楽しい像であっ
た。この目標は現在利用可能である固定方法および装置
を用いて容易に達成可能である。しかしながら、調製方
法により生成される審美的に楽しい像はまた生きた生物
体における組織の真の状態な正確に反映する、即ち、「
生きた状態」に近似する組織試料もまたもたらすことが
必須となるに至っている。これが将に本発明の方法およ
び装置が目的とし、その解決を図らんとする問題である
。分析用に現在利用可能である拡大装置は従来使用され
て来た現在の組織調製技術よりも技術的にはるかに進歩
している。本発明の方法は公知の拡大および分析装置に
容易に使用される組織試料の調製を与えるものである。

分析用組織試料の最も通常の従来方法は化学固定および
有機溶媒脱水によるものである。この方法に内在するの
は、同時に起る人為結果の形成、試料の収縮およびその
結果得られる組織特性への損傷および変性である。これ
らの変性は人為結果などの形態を取ると否とを問わず個
人による解釈或いは試料を分析或いは評価する装置な会
戦とする。これは多くの場合に不満足な誤差の危険性を
導入する。化学的固定法は周知の技術であり長年に亘っ
て分析生物学者に役立っており今後もある種の限られた
用途においては疑いもなく寄与し続けるものである。し
かしながら、組織試料分析の用途がより複雑になりその
様な分析の用途がより広範になるに従って化学的固定法
に代るものが必要とされている。これは、利用可能な拡
大および分析装置において進歩がなされるにつれて特に
真実である。組織調製方法および装置は試料の分析に使
用されている分析道具即ち電子顕微鏡と同等に進歩して
組織試料を調製する必要がある。明らかに組織試料調製
の技術が顕微鏡の技術に遅れている場合には、進歩した
顕微鏡は形態学者その他の組織研究者にとり何の役にも
立たないことになる。

化学的固定法および有機溶媒脱水に代わる最も通常のも
のは凍結乾燥冷凍固定試料である。冷凍固定に従う凍結
乾燥は文献によく記載されており、組織・保存のための
良く知られた技術である。それは幾つかの利点を有する
。冷凍固定凍結乾燥の結果、はぼ瞬間的な細胞代謝の捕
獲が行われる。また、試料との溶媒接触の除去により可
溶性細胞構成成分の安定化および保持が行われる。これ
らは、冷凍固定および凍結乾燥技術を公知の組繊、調製
方法に適用する試み忙おける数多くの研究努力において
生じた冷凍固定−凍結乾燥への相当な利点である。

不幸なことに、凍結乾燥の使用は多くの欠点があること
が判明した。玩在利用可能な凍結乾燥技術における主た
る欠点は氷結晶形成の防止である。

容易に理解される如（、氷結晶の形成は観察されている
組織の超微細構造の形態学的特徴を破壊する。像は細胞
質が細網化する際に変形される。試料内における氷結晶
の形成はまたおそう（巨大分子の異常な架橋を引き起こ
す可能性のある組織のｐＨの変化を生せしめる可能性が
ある（共晶形成）。

また、蛋白質が変性し、析出する可能性もある。

これらは凍結乾燥方法に内在ずろを・よんの僅がの欠点
を示したにすぎない。

この一般的トビツクは、より紅組に他の従来方法と共に
「電子顕微鏡用生体組織の凍結および乾燥」という標題
の文献に記載されている（”　Ｆｒｅｅｚｉｎｇ　ａｎ
ｄ　Ｄｒｙｉｎｇ　ｏｆ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＴｉｓ
ｅｕｅｅｆｏｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏ
ｐｙ　”　、　Ｌｏｕｉｓ　Ｔｅｒｒａｃｉ。

ａｎｄ　Ｋａｒユ　Ｇ、Ｓｃｈｗａｂｅ　、ｐｕｂｌｉ
ｓｈｅｄ　ｉｎ　ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＨｌＳ
ｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｏｙｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ。

■０ユｕｌｎθ　２９　、Ｎｏ、９　ａｔ　ｐｐ、１０
２１　−　１０２８　（１９８１））。

人為構造形成に伴う問題は「凍結−破壊複製における人
為構造の問題の理解：総説」 （’　０ｎｄｅｒｌｌ］ｔａｎｃｌｉｎｇ　ｔｈｅ　Ａ
ｒｔｉｆａｃｔ　Ｐｒｏｂｌｅｍ　１ｎＦｒｅｅｚｅ　
−Ｆｒａｃｔｕｒｅ　Ｒａｐユ１ｃａｔｉｏｎ　：　Ａ
　Ｒｅｖｉｅｗ　’　。

Ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉａユ　５ｏ
ｃｉｅｔｙ　（１９８２）　１０３　−１２３）に記載
されている。

組織試料の調製において有用性を示してきた凍結技術に
適用可能な一般原理は、冷却速度が上昇するにつれ、組
織流体が水分を細胞外空間に分離することなく凍結され
るということである。しかしながら、冷却速度の如何に
拘らず、氷結晶がおそらくなお生ずるが、しかし、冷却
速度が増大するにつれて細胞内氷結晶の大きさが減少す
るということが判明した。高い凍結速度における氷結晶
の小径は勿論これにより最少の人為構造形成および脱水
中における最少の超微細構造損傷が行われるにすぎない
ので形態学的検査においては実質的な利点である。

歴史的に見て、迅速凍結の技術が判断された基準は系の
冷却速度ではなく、単に組織が凍結された環境の温度で
あった。この様に迅速凍結の用語は冷却剤が一１５０℃
以下の温度を有する如何なる系にも適用されて来た。冷
却系の有効性は熱が試料から除去される速度に依存する
。熱移動は冷却系の温度のみならず、またその物理的お
よび熱的特性並びに試料の大きさおよび熱的特性にも依
存する。

迅速凍結に最も普通に使用されて（・る技術は液体冷却
浴槽中に試料を浸漬即ち「急冷」することである。急冷
に最も通常使用されている液体は液体窒素、インペンク
ン、プロパンおよびＦｒｅｏｎ　１２およびＦｒｅｏｎ
　２２などのフルオロカーボン類でアル。

液体窒素は一般的にその低温（−１９６℃）により理想
的な急冷流体とみなされているが、液体窒素の低い蒸発
熱による組織表面膜沸騰の発生により液体窒素の使用に
は内在的な欠点が存在する。膜沸騰は実際に試料を断熱
することにより熱移動速度を阻害する液体窒素の特性で
ある。

迅速凍結の従来の代替法の一つに冷却金属表面上の凍結
がある。これは典型的には組織試料を磨かれた平坦な金
属表面に対して堅く押し付けて対向させることよりなる
ものであ４）。銀および銅が磨かれた金属ブロックとし
て典型的に使用されている。この方法は、これらの金属
が液体窒素或いは液体ヘリウム温度までに冷却された際
の高い熱伝導性および熱容量を利用するように設計され
たものである。金属表面上の冷却における重要な工程は
、乾燥した冷却金属表面と回転、並行移動或いははね返
りの動きが・なくしつかり接触させることである。医学
において有用性の知られている市販の装置が「はね返り
のない」凍結を提供する。

この装置の開発はメアリーランド医学大学校のＡｌａｎ
　Ｂｏｙｎｅ　博士によってなされたものと一般的にみ
なされている。

最近、冷却速度と急冷液体中の超微細構造保存の間に直
接の相関関係があるとの証明がなされている。凍結速度
が毎秒１００〜４１（１０℃の範囲を越えて増大すると
（液体窒素−プロパン）、それに応じて存在する氷結晶
の大きさの減少があり、従って形態学的保存の改良が得
られる。

引き続＜ＭＪｍ調製過程にお（・て重要な工程は、常に
、最近断熱的「分子蒸留」過程として説明されている過
冷却組織液の昇華−脱水である。一度、適当な過冷却方
法が選択され、手段が提供されたら、凍結された水和標
本の観察を可能にする電子顕微鎖その他の拡大装置は容
易に利用可能でないので、さらに組織な顕做鏡評価のた
めに加工する必要がある。この様に、脱水は生体組織試
料の調製における必須工程であり、しばしば組織形態学
の下部構造および超微細整造の細網化により破壊が生ず
る工程である。

ある種の従来の乾燥技術において、結合水画室内に細胞
流体溶質が濃縮されるので濃縮されるにつれ、共晶が形
成されるために組織試料は全（固化されていなかった。

この溶質の移動はゆるやかな冷却が使用される際に、物
質が流体状態にある間に生ずるものである。迅速凍結技
術が使用される場合には脱水工程において特別の考慮が
必要とされる。これらの問題は、脱水が液体状態よりも
むしろ固体状態において、即ち昇華によって生じなけれ
ばならない（水は除去されなければならない）という事
実から生ずるものである。

従来技術において、凍結代替手法は溶媒或いは溶媒−固
定剤混合物を水と−７５〜−８０℃において置換するこ
とによる組織水の除去を含むものであった。これは、過
去の化学固定法よりも、組織試料に対してよりおだやか
な溶媒相分離および化学的変成人為構造を導入するもの
である。実用的見地からは凍結乾燥は組織試料が過冷却
水の蒸気圧を増大し、昇華を合理的時間内に行わせるよ
うに加温するべきであるという要請により複雑なもので
ある。蒸気圧の増大に加えて、温度の上昇は氷結晶の拡
大および同時に組織試料の超微細構造形態への損傷に導
（一連の物理的現象をもたらす。

加温操作の際に生ずる多（の物理的現象は存在する水の
物理状態における転移に関連するものである。典型的に
見られる変化はガラス松林、失透および一連の結晶格子
立体配置転移を伴う再結晶化である。

この様に、凍結乾燥およびその他の凍結調製技術は形態
学的検査のための組織、試料の調製のための例外的機会
を提供するものでま）る。しかしながら、凍結調製技術
の使用においでは、試料の脱水および固定に伴う問題か
内在する。これらは本発明の方法および装置次により向
けられた問題点である。

本発明の冷凍調製方法は、角膜組戦の移植において異常
な適応性を示した。本発明Ｑ、捕１ｊに（・主供与者か
らの角膜の除去後に必要な凍結成いは凍結乾燥を含んだ
角膜移植の試みは移植時に常に曇った角膜となったとい
うものであった。この移植角７１〆の物理的状態は角膜
自体における結晶形成および支質（基質）への同時に存
する損傷によって生じたものであった。本発明の方法を
使用することにより、眼科医は供与者から取り出した後
に直ちに角膜を凍結調製し、次いでそれらの角膜を殆ん
ど曇り或いは結晶形成などなしに受領者に移植すること
が可能になった。その様に角膜を移植する能力は本発明
の方法に特別の利点を示すと共に角膜移植外科医術にお
ける医学的突破口を示すものでもある。

従って、本発明の目的は組織試料の超微細構造の形態学
的特徴の明白な崩壊或いは破壊のな（・生体試料の調製
方法を提供することである。

さらに本発明の目的は迅速凍結による固体ガラス相に得
られる組織試料の製造方法を提供するものであり、その
凍結方法は通常の分析装置による解釈を制限する不必要
な人為結果を生ずるものではない。

さらに本発明の目的は、組織超微細構造に対応する損傷
を与えることな（試料の有効な脱水を可能にし、近代的
高倍率拡大装置ｉ＜１′に使用することのできる試料を
与える組織試料の調製方法を提供することである。

さらにまた本発明の目的は、本発明の方法に使用される
試料保持装置を提供することである。

本発明のこれらおよびその他の目的は、以下の好ましい
実施態様の説明から理解されるであろう。

本発明は超微細構造分析用牛体組織試料の凍結調製方法
に関する。この方法は厳密に脱圧（減圧）された条件下
における生体組織試料の断熱的脱水を含むものである。

この脱圧されたガラス化組織試料は一１４０℃未満の温
度にお（・て平衡化される。この組織試料を次いで平衡
状態に保ちながら脱水する。組織水の除去後組織試料を
脱気された樹脂で浸潤させ、その後樹脂を重合して包埋
された組織試料を形成させる。本発明はさらに本発明の
方法における独特な使用特性を有する試料保持装置片に
関するものである。

本発明を適用するための方法において、所望の生体試料
が得られることが基本的な前提女性である。生体試料は
各種手段、即ち外科的摘出、抜き出された血液試料、バ
インダーおよび任意の公知の通常の各種その他の技術に
より集められる。生体試料を得る特別の方法は、本発明
の方法および装置に限定的なものではない。しかしなが
ら、本発明の方法および装置における組織試料の調製は
、組織試料が摘出後なるべく早く加工されると高められ
る。

組織試料を運搬、貯蔵その他の必要な操作に際して維持
しようとする試みにおいて、これを固定液、即ちホルム
アルデヒドその他の生物学的に活性な安定化溶液に保持
することは可能ではない。

また、本発明の方法に従った調製前に試料を常法に従っ
て凍結成いはその他の物理的変性を行ってはならないこ
ともＭ吸である。この組織試料の大きさは、本発明にお
いて特に重要である。組織試料の調製はそれが受け取ら
れると直ちに行われる。

この試料は、その後、装置内における長期間の貯蔵のた
め或いは現在利用可能な各種分析装置に使用するために
物理的に切断その他の物理的な準備を行うことができる
。

本発明の方法による調製のための好ましい最適生体試料
は新鮮な１　ｍｍ３０部検（〕；イオプシー）試料であ
る。これらの試料はなるべく早くガラスある。ガラス化
の方法にお（・では、使用される凍結装置は組織試料中
に含まれる可溶性および不溶性部分が妨害されず、移動
されず或（・は変更されずまた、濃縮（典品物として）
されないように試料をガラス相にするものである。定着
によれば、ガラス化液体は例えば窓ガラスのように剪断
応力にかけられると粉々になるものである。ガラス相は
液体水の非晶質、即ち「ガラス」相への転換を含むもの
で力・る。これは、組織試料をそれを一１９６℃に維持
された金属棒の高度に磨かれた（釦１状）表面、凝縮物
のない表面に「はね返りのない状態」で接触させること
により迅速に過冷却させることにより達成さねる。これ
らの操作は前記従来技術の説明の箇所において既に説明
した。

本発明の方法および装置ｔ３．にお（・て、勃に有用で
あるのはメアリーランド医学大学校のアレン・ポイン博
士（Ｄｒ、　Ａ１１ｅｎ　Ｂｏｙｎθ）と共同して確認
された「はね返りのない」凍結装置である。この凍結装
置においては、銅ブロックが使用されて組織試料をガラ
ス化する。過冷却液体、例えば液体窒素、ヘリウム、プ
ロパン或いは各種フレオン類すどと共に行われるこのガ
ラス化は視察可能な或いは決定可能な細胞水氷結晶の形
成前および／またはなしに組織試料液体を非晶質状態に
過冷却する。

この様にガラス化された組織試料は組織水の除去前に貯
蔵および移動操作に際して約−１４０℃未満の温度に維
持されることが絶対に必須である。

試料の凍結と試料の脱水の間の予想される時間間隔に応
じて、それは液体窒素デユワ−ビン中に沈めて貯蔵する
ことが出来る。一度試料が乾燥され、適当に包埋される
と、それは、組織を分析データとして解釈不可能にする
望ましくない人為結果をもたらす変性および変形を起こ
す細胞質の細網化その他の形態の細胞の異化作用を起こ
すことな（、実質的に無限に貯蔵することができる。

ガラス化後、および組織試料を一１４０℃未満の温度に
維持しながら、それを標本輸送により移動し真空中にお
いて標本ホールダーに供給する。この標本ホールダー（
また、試料ホールダーとも呼ばれる）は温度制御された
容器内に維持されている。この容器および標本ホールダ
ーは両者共に一１４０℃の温度に維持されている。本発
明の最も好ましい実施態様においては−１９６”Ｃの液
体窒素の温度が維持されるのが好ましい。−１４０℃が
臨界点である理由は、液体窒素温度においてガラス相に
存在する純水が−１４０”Ｃにおいて立方氷結晶の形成
を開始しはじめるからである。前記従来技術の説明にお
いて、確立したように、氷結晶化は組織試料の形態学に
対して超微細構造的損傷即ち、細網化を引き起こす。

次に組織試料、標本ホールダーおよび容器の周囲の雰囲
気を脱圧する。これは典型的には試料ホールダーを真空
に引くことにより行われる。この真空はほぼ３００分以
内に３　、ｘ　１０’−９Ｔｏｒｒの程度に引かれる。

本発明のその他の実施態様において、所定の通常操作の
残りの間全ての組織水が除去されるまで５　Ｘ　１０−
’　Ｔｏｒｒに留まる。系の平衡化（２４〜４８時間）
の間、真空が引かれおよび維持されながら標本温度を液
体窒素により維持する。

この時点において、組織試料は超低圧および極めて低い
平衡凍結温度にある。平衡が得られた後（平衡温度−１
４０℃未＃）組織試料内に見られたガラス状水は組織内
の昇華先端部に昇華熱に等しいエネルギーが間欠的およ
び増加的に供給されるＫつれて昇華しはじめる。これは
、遅い工程であるが試料の調製には重要なものである。

試料に各エネルギーの添加後平衡に到達するに十分な時
間が与えられることが重要な要件である。平衡化とは組
織試料の温度が２〜４時間の時間間隔に亘って最早変化
しないことを意味する。典型的な組織調製方法において
、試料は一１９６℃に迅速にガラス化され、および昇華
（乾燥）装置内の試料ホールダー中の貯蔵／移動に際し
ては−１４０”Ｃに維持され、適当な平衡化時間の後に
は平衡温度は一１４０′°Ｃと一１９６°Ｃ間のいずれ
かにある。この全平衡化過程に際して、臨界的超低圧は
３　ｘ　１０　’　Ｔｏｒｒ以下に維持される。

本発明の方法における必須段階である平衡化過程の後、
昇華のエネルギー（熱）が系に添加されないならば試料
から感知できる程度の量の水が蒸発するまでには極めて
長い時間がかかる。本発明の方法に従った温度および圧
力において水が蒸発するには数年間の時間が推定される
。従って、本発明の最も好ましい実施態様においては、
乾燥組織試料の超微細拾遺に損傷を与えることなく、第
二次エネルギー源（加熱）が昇華水分子を励起するため
に添加される。特別の波長を有する放射エネルギーがこ
の目的を達成するために特に有用な手法であると思われ
る。マイクロ波、レーザー系統および磁気エネルギーに
よる昇華エイ・ルギーもまた適当である。最も好ましい
第二次エネルギー源は上記エネルギー源と組み合わされ
た核磁気共鳴手法である。平衡において、細織の温度は
至近の環境に対する周囲のパラメーター（放射エネルギ
ーが支配的である、即ち室温は２７℃）が変化しなけれ
ば変化しない。これが糸の平衡点の一般的確認である。

組織試料の平衡到達に引き続き１組織中にガラス化操作
中に形成された過冷却固体水分および／または現在決定
不能な氷結晶（直径２０１１１１１１以下）を除去する
必要がある。この部分の脱水は絶対的に必要であり、組
織中の超微細構造の殆んどの潜圧的崩壊および細網化が
それ自体を表わす段階である。これは、試料中の昇華エ
ネルギーを時間当り最少量の断熱的熱を添加しながら徐
々に置換することにより達成される。最適条件は組織温
度の増加を有しないことである。その様に昇華潜熱に等
価の熱エネルギーを上昇することにより、ミクロ氷結晶
或いは非晶質過冷却水の如何を問わず全ての固体水分が
周囲凍結系より組織試料から有効に除去される。この乾
燥は−１４０“Ｃ〜−８０’Ｉｃの温度で達成される。

この比較的大きな温度の自由度は各種の結果を与え、各
種濃度において細胞水中に溶解している溶質による脱ガ
ラス化温度の上昇によりとにか（可能である。適当な器
具を用いることにより、全ての細胞水が除去された時点
を決定することが可能である。その時点においてエネル
ギー上昇を加速して室温より３゛Ｃ高い最終標本温度（
２８〜３０℃）を形成することができる。この様に、こ
の器具の使用により本発明の方法における有意義な利点
が得られる。

この様に脱水された組織試料は室温＋３℃に到達する。

室温に到達しても、真空は試料の周囲の温度を有するよ
うに元の極めて超低圧に維持される。本発明の目的のた
めの室温はほぼ２４〜２７℃と理解されるべきである。

この温度範囲には論理的には変化があり得るものである
。

この時点において、研究者は電子密度によるコントラス
トを強調させるためにほぼ１時間組織をオスミウム蒸気
に曝すことができる。これは利益上有害であることが証
明されるか或いは最終目標が臨床用途である場合には省
略することができる。

オスミウム蒸気は凍結沈降による再結晶化により除去さ
れる。その他の確立された固定化方法においては、緩衝
溶液中のバラホルムアルデヒドおよび／またはグルタル
アルデヒドが使用される。これらの物質は典型的に化学
的固定物質と称される。

典型的に添加される最も好ましい物質は四酸化オスミウ
ムである。この物質は組織試料の解釈に使用される各種
分析装置の組織の各種構成成分の解像力およびコントラ
ストを高める。

次いで脱気された樹脂がなお脱圧された条件を保ちなが
ら組織に添加される。これは典型的には樹脂浸潤と称さ
れ、包埋された組織試料を生ずる。

過去の方法において有用性を示した樹脂は同等に本発明
の方法に適用可能である。

これらの工程に引き続き組織試料および樹脂を徐々に樹
脂口から空気を通して大気圧にする。樹脂適用過程から
生じた包埋された組織試料を取υ出し、樹脂を所定温度
において重合させる。重合方法は使用された樹脂の種類
に応じて大きく異る。

典型的には、組織試料はオーブン中で熱を加えて１２時
間重合される。通常の温度は６０℃であるが必要に応じ
ては一８０℃程饗の低温も使用することが出来る。重合
工程は組織の超微細構造に損傷を与えないように達成す
ることが必要である。

重合後組織試料を次いで室温で貯蔵し、薄い断片にして
染色し、或いはその他の分析のためにさらに準備するこ
とが出来る。しかしながら、本発明により開示される要
領で脱水された後においては、それは通常のウルトラマ
イクロドームおよび電子顕微鏡により容易に解釈可能で
ある凍結固定状態に保たれ、人為構造の相当な変更およ
び減少をもって組織試料の極めて有意義な分析の基礎を
提供し、同時に過去の束縛を減少或いは除去して視覚分
析のための固定および／或いは組織調製のために至ると
ころに存在し得るものである。

これらの生体組織における構造対機能の実際の関連付け
は、これ迄通常の電子顕微鏡では使用されないとみなさ
れていた適用可能な染色方法の巨大な拡張をもって通常
の超薄切断法（即ち、任意の可溶性部分、糖類、脂質類
および可溶性蛋白質の免疫学的分析）、無器官内の酵素
細胞化学、Ｘ−線分配ＥＩＴＦｉＭ分析、組織移植調製
、マイクロプローブ分析、オートコバイオグラフィー（
ａｕｔｏ　−ｃｏｂｉｏｇｒａｐｈｙ　）　（％に可溶
性化合物の）および薬品調製によりなされる。

この体系の実施には、その他の装置も利用可能であるが
、しかしながら、上記の必妄な定義されたパラメーター
を完全に導入するものでないのでいずれも期待された結
果をもたらさなかった。本発明の実施に使用される装置
は模式的に第２図および第３図に図示されている。

第３図に図示される試料ホールダーとも称される標本ホ
ールダーは本発明の実施に独特なものである。この試料
ホールダーは組織試料に悪影響をおよぼすことなく凍結
温度において組織試料を保持する能力を有さなければな
らない。好１しくは、組織試料は懸架され、分離はれた
（熱的伝導のない）状態で保持される。模式図から見ら
れるように、試料ホールダーは、コンスタントン−カッ
パー　（ｃｏｎｓｔａｎｔｏｎ−Ｃｏｐｐｅｒ　）熱電
対温度ゲージにより監視される加減抵抗器で制御された
加熱要素を含有する。これらの材料の調和された使用に
より組織試料自体の近似温度を制御および監視すること
が可能である。

試料ホールダーは低温保持装置又は低温装置内に入れら
れ、それは次いで脱圧装置に連結される。

脱圧装置は第２図て示される如く、極めて低圧を維持す
るための各種の通常の装置の任意のものを包含する。こ
れらは通常の真空型圧力ではなく、事実、シイミーレー
ション型の脱圧であることに注意すべきである。この装
置は必要とされる熱移動のための適当な条件イｃ形成す
るために本発明の方法に使用する適当な装置の一例であ
るが、これは本発明を限定するものではなく単に有用性
を示した装置の型の一例であるに過ぎない。多くの脱圧
装置におけると同様に、脱圧装置の適当な機能を容易に
働かせるために各種の吸引手段、モーター類、ファンお
よび加熱要素が存在することが必要である。

Ａｌａｎ　Ｂｏｙｎθ型の装置により達成される迅速凍
結は本発明の実施に必須である。通常、冷却金属付属物
と組合わされた液体窒素或いはその他の型の急冷浴槽が
本発明の方法において、それらが細胞水のガラス比相を
与える程度に使用される。第２図に模式的に図示される
ように、組織ホールグー中に含まれる組織試料の温度を
低下および維持を行うために液体窒素急冷浴槽が使用さ
れる。組織試料は液体窒素状態中て維持されるが、管の
取付けは本発明の方法において任意に使用することが好
ましい各種染色および固定材料並びて本発明の組織材料
を重合前に包埋するために最終的に使用される各種樹脂
に接近するようにされることが必要であることに注目す
べきである。又これらの機能の各々は添附の図面に概略
図示する。しかしながら、これらは本発明の限定的な特
命を示すことを目的とするものではなく、利用可能な技
術の例示にすぎない。

本発明の方法に使用するだめの装置の設計或いは装置の
選択にあたり、極めて低温および低圧の各種材料におよ
ぼす影響を理解することが必要である。このため、ガラ
ス化状態にある物質を処理するために使用される本発明
の装置の部分は典型的にステンレス製である。その他の
材料も同様に利用可能である。同様に、本発明の装置の
部分は大部分がテトラフロランにより構成されるＤｕｐ
ｏｎｔ社の製品であるＴｅｆｌｏｎで作られた或いは破
覆されたものであってもよい。

第２図は本発明を実施１−るために使用される装置の模
式図である。機械ポンプ目が超高真空ポンプ１（ＩＶＣ
取り付けられている。真空装置１０は試料室２０に連結
されている。この超高真空ポンプｌＯは各種市販の真空
ポンプ装置の任意のものでよい。好ましい実施態様は特
にＬｅｙｂｏｌｄ−Ｈｏｒａ、θｕｓにより製造されて
いるターボ分子ポンプである（モデルＴＭＰ−３６０）
。この超高真空ポンプはそれがターボ分子ポンプである
と否とを問わず炭化水素のない真空をもたらすものであ
ることが必須である。機械ポンプ１１は超高真空ポンプ
１０を介して試料室２０から運び適寸れたガスをポンプ
出しするために使用される。

試料室２０はより詳細に第３図において説明され、示さ
れている。しかしながら、第２図においては、試料室２
０はａ本ホールグー支持組み合わせ体３０に直ちに隣接
している。試料室２０は実際の組織試料を保持するため
に使用される。熱放射シールド４０は試料室２０および
閉じ込められた組織試料を周囲環境から断熱するために
試料室２０を取り囲むものである。

典型的には、冷凍浴槽環境５０はデーワーピンに含有さ
れた液体窒素である。必須特性は温度が一１４０’Ｃを
越えてはならないことである。冷凍浴槽環境５０からの
冷凍エネルギーの試料室２０への熱伝導性は構造に固有
のものである。組織試料に適当な温度を維持するために
放射シールド４０と試料室２０の間には何等の直接の接
続が存在する必要はない。

第３図は試料室２ｏおよび標本ホールダー支持装置３０
をよシ詳細に図示するものである。実際の標本ホールダ
ーは番号６ｏにより示されている。１個以上の標本ホー
ルダー６０は試料室２ｏ内に含まれる。

標本ホールダー６０は支持体３ｏにより支持されている
。標本ホールダーは周囲環境から、拡散性（吸収性）で
ある内表面２２Ａおよび分光性（反射性）である外表面
２２Ｂを有する放射制御シールド２２により断熱されて
いる。本発明の好ましい実施態様においては表面２２Ａ
は、発光’ｐＨ＝ｏの完全黒色（黒色の外観）を有し、
完全に如何なる熱放射も吸収するものである。分光表面
２２Ｂは高度に磨かれて如何なる放射エネルギーも完全
に反射するものである。ニッケルその他の高度に磨くこ
とのできる利料で外部表面２２Ｂを被覆することが好ま
しい。

放射加熱手段２４は第３図に図示されており、組織試料
への放射熱源を提供する。放射加熱手段２４は制御手段
２６により制御される。制御手段２Ｇは放射加熱手段。

に無限の可変性を可能にするものであり、典型的には加
減抵抗器或いはサーモスタットである。環境の温度およ
び組織試料の温度が特別に制御されるように試料室のい
くつかの点に温度／指示手段Ｕも接続されている。

第９図および第１θ図は本発明の好ましい方向性放射加
熱手段を図示するものである。好ましい放射加熱手段２
４において適当な配列および製造の結果、熱が、より効
率が低いがより典型的であるランダムな球状の放射熱伝
導とは対照的に、実質的に線形に伝導される。この実施
態様においては、第３図の番号２４により図示されるよ
うな標準的な加熱材料のブロックの代りに第９図および
第１０図に図示される如き特別に設計された加熱材料の
ブロックが使用される。この実施態様において、突出部
９１は好ましい放射加熱器９０の最上部表面から延在し
ている。突出部９１の表面９２は放射熱が出来るだけエ
ネルギーの損失を少なく伝導されろように高度に磨かれ
ており、且つ放射エネルギーの実質的に線状の伝導の基
礎を提供するように特別の角度が与えられている。更に
、特に第１０図を参照すると９３で示されている突出部
９１を分離する溝部分は最大エネルギー伝達を力えるよ
うに黒色物質で被覆されている。

本発明の最も好筐しい実施態様において、放射加熱手段
２４、制御手段２６および温度指示手段２８は全て精密
に規定された範囲内においてコンビ、−ターにより操作
されている。

第３図は放射熱を例示てるものであるが、本発明の装置
および方法においては他の形態のエネルギーも同様ｒこ
有用である。より具体的に（・まマイクＯ波、ラジオ波
、音響波、可視光線波および紫外線或いは近紫外耐波な
どの′１１！罎エネルギー分を使用−「ることが出来る
。磁束もメ有用であり、特に上記エネルギー形態の任意
のものと組み合わせで使用することが出来る。本発明の
装置が値かれる用途および試Ｐ＋に応じて上記エネルギ
ー源の組み合せも使用することが出来る。赤外線照射は
、避けるべきである。最終的に選択されるエネルギーの
決定に当っては試料の特性が最も重要である。

次に、第４図により標本ホールダー組み合わせ物６０が
示されている。典型的には、ステンレス類である標本室
６１が示されている。放射エネルギーの循環並びに水分
の除去の基礎を与えるために穴６２が任意に存在するこ
とが出来る。間隔配置部材６３を室６１０周辺に設ける
のが好ましい。その最も好ましい形態において、スペー
サ−６３はテフロン０−リングである。チーーブ状の支
持部材６４は標本室６１の底部から延在し、その末端は
スペーサ一部材６５で終了する。スペーサ−６５は好１
しくはテフロンで構成され、収納部６６および対をなす
０−リング６７および６８により構成される。好ましい
宴施態様において、チューブ状支持部材６４はゼオライ
！・のような乾燥剤物質を含む。

第５図は本発明の働不ホールグーの上面図でるる。標本
室６１の側面に見られる穴６２は又第５図に図示される
標本室の底部においても結合されている。これらの穴は
水分の流れおよび放射エネルギーの移動を可能にするも
のである。複数の標本スペーサー７０が標本室６１の底
部の至るところに見られる穴６４中に挿入されている。

最も好捷しい態様（第７図参照）においては、標本スペ
ーサー７０は、第８図に図示され、チューブ状支持部材
６４０表面に含まれて取り付けられている周辺エネルギ
ー移動部材８０中に挿入されている下方に延在する脚部
７１を有する。好ましくは、部材８０はその内部長さ方
向にタングステン線が内張すされているテフロンチュー
ブよりなるのがよい。これらのチューブは、タングステ
ン線および標本スペーサー７０の脚部７１の両者が該部
材８０の内部に取り外し可能に挿入可能である大きさで
ろる。実施に際して実際の標本は隣接標本スペーサー７
０の間に置かれる。標本スペーサ−７０の使用により無
限の変化を有する形状および立体構造を得ることが出来
る。この様に本発明の標本ホールグーは実質的に任意の
種類或いは大きさの組織標本に適用可能である。

第７図は本発明の標本スペーサーを図示するものである
。その好ましい実施態様において、標本スペーサ−７０
は穴７３を有し、保持ビン７４に枢着されている平面状
フランジ７２を含むものである。保持ビン７４はチュー
ブ８０内に挿入可能な下方に延在する脚部７１を有する
。複数の標本スペーサー７０を穴６４および場合により
チーーブ状部材８０内に挿入することにより、各種構造
および配置の組織標本を享受することが出来る。

第６図は、標本ホールグー６０Ｓ％にメツジュロ９の底
部を図示するものである。テフロンメツシー６９が備え
られて、チューブ状支持部材６４内にゼオライトその他
の乾燥剤を保持すると共に同時に該標本ホールグー６０
の底部を通じて水分などの自由流動を可能にしている。

以上、詳細に本発明の標本ホールグーの好ましい実施態
様について説明したが、特別の最終用途のために装置を
設計する者（（は各種の実施態様が容易に利用可能であ
る。本発明の好ましい標本ポールグーの説明は本発明を
限定する意図を有するものでなく、単に本発明の好まし
い実施態様を例示するものにすぎない。上記説明された
ものに修正および変化を導入するその他の標本ホールグ
ーも又同様に本発明の範囲内に含まれるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の概略フローダイアグラムである
。第２図は本発明の装置の概略図である。 第３図は本発明の試料室の概略図である。第４図は本発
明の標本ホールグーの側面図である。第５図は、本発明
の標本ホールグーの上面図である。 第６図は、本発明の標本ホールグーの底面図である。第
７図は、本発明の標本分離手段の斜視図である。第８図
は、第４図の線５−ｓＶｃ沿ってとられた断面図である
。＠９図は、本発明の好寸しい放射加熱器の上面斜視図
である。第１０図は、本発明の好ましい放射加熱器の側
面斜視図である。 図中、 １０・・・超高真空ポンプ、１１・・・機械ポンプ、２
＋）・・試料室、２２・・・放射制御装置、２２Ａ・・
・拡散性（吸収性）表面、２２Ｂ・・・分光性（反射性
）表面、２４・・・放射加熱手段、２６・・・放射加熱
制御手段、２８・・・温５ｆ指示装置、３０・・・標本
ホールグー支持体、４０・・・熱放射シールド、５０・
・・冷凍浴槽環境、６０・・・標本ホールグー。 Ｊシフ、　９ ９１ 鴇 ノ乞のｌθ βＺす８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記工程を含んでなることを特徴とする超微細構造
   分析用生体組織試料の凍結調製方法：（ａ）　生体組織
   試料をガラス化する工程；（ｂ）該試料の周囲の雰囲気
   を脱圧する工程；（ｅ）　該ガラス化組織試料を一１４
   ０℃未満の温度において平衡化させる工程： （Ｃ１）　該試料が平衡状態に保たれている間に該ガラ
   ス化組織試料を脱水する工程； （ｅ）　該脱水組織試料を脱気された樹脂で浸潤する工
   程；および （ｆ）　該浸潤組織試料中の該樹脂を重合させて包埋さ
   れた組織試料を形成する工程。 ２、該ガラス化が一１４０℃以下の温度までで行われる
   、特許請求の範囲第１項記載の方法、３、該ガラス化が
   液体窒素を用いて行われる、特許請求の範囲第２項記載
   の方法、 ４、該ガラス化が３００分未満以内に完結される、特許
   請求の範囲第３項記載の方法。 ５、該脱圧が該組織試料の周囲の２５囲気を真空に引く
   ことにより行われる、特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ６、該真空が少なくとも３　ｘ　１０＝　Ｔｏｒｒであ
   る、特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７、該真空が３００分未満以内に形成される、特許請求
   の範囲第６項記載の方法。 ８、該ガラス化組織試料の平衡が恒温により示される、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ９、該恒温が一１４０℃〜−１９６℃である、特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １０、該脱水が昇華により行われる、喝許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ＩＬ該脱水が二次的エネルギー源からのエネルギーの添
   加により高められる、特許請求の範囲第１０項記載の方
   法。 １２．該二次的エネルギー源が熱エネルギーである、特
   許請求の範囲第１１項記載の方法。 １３、該二次的エネルギー源が放射エネルギーである、
   特許請求の範囲第１１項記載の方法。 １４、該放射エネルギーが核磁気共鳴を用いて行われる
   、特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、該放射エネルギーがレーザーにより生成され繊維
   光学により伝達される赤外線である、特許請求の範囲第
   １１項記載の方法。 １６、コントラスト強調物質の添加をさらに含んでなる
   、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １７、該コントラスト強調物質が四酸化オスミウムであ
   る、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、該重合が熱により行われる、特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 １９、該重合が紫外線を用いて行われる、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ２０、下記工程を含んでなることを特徴とする超微細構
   造分析用生体組織試料の凍結調製方法：＜ａ）生体組織
   試料を該試料の温度を一１４０℃以下の温度に低下させ
   ることによりガラス化する工程； （１））　該試料の周囲の雰囲気を３００分未満以内に
   真空に引くことにより３　Ｘ　１Ｏ−９Ｔｏｒｒ未満に
   脱圧する工程； （Ｑ）　−１４０℃〜−１９６℃の温度において該ガラ
   ス化組織試料を平衡化する工程； （ｄ）　該試料が平衡状態に保たれている間に該ガラス
   化組織試料を昇華により脱水する工程；（ｅ）　コント
   ラスト強調物質を該試料に添加する工程； （ｆｌ　該脱水組織試料を脱気された樹脂で浸潤する工
   程；および （ｇｌ　該浸潤組織試料中の＃樹脂を重合させて包埋試
   料を形成する工程。 ２］、該ガラス化が液体窒素を用いて行われる、特許請
   求の範囲第２０項記載の方法。 ２２、該ガラス化が３００分未満以内に完結される、特
   許請求の範囲第２１項記載の方法。 ２３、該脱水が第二次エネルギ、−源からのエネルギー
   の添加により高められる、特許請求の範囲第２０項記載
   の方法。 Ｕ、該第二次エネルギー源が熱エネルギーである、特許
   請求の範囲第２３項記載の方法。 ２５、該第二次エネルギー源が放射エネルギーである、
   特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２６、該放射エネルギーが核磁気共鳴を用いて行われる
   、特許請求の範囲第２３項記載の方法。 ２７−　該放射エネルギーがレーザーにより生成され、
   繊維光学により伝達される赤外線である、特許請求の範
   囲第２３項記載の方法。 ２８、該コントラスト強調物質が四酸化オスミウムであ
   る、特許請求の範囲第２０項記載の方法。 ２９、該重合が熱により行われる、特許請求の範囲第２
   ０項記載の方法□ ３０、該重合が紫外線を用いて行われる、特許請求の範
   囲第２０項記載の方法。 ３１、下記工程を含んでなることを特徴とする超微細構
   造分析用生体組織試料の凍結調製方法：（ａ）　該試料
   の温度を液体窒素浴を使用して一１４０℃以下に低下さ
   せることにより生体組織試料をガラス化する工程； （ｂ）該試料を３００分未満以内に真空に引くことによ
   り該試料の周囲の雰囲気を３　Ｘ　１０−’Ｔｏｒｒ呆
   満に脱圧する工程； （ｃ）　−１４０”Ｃ〜−１９６℃の温度において該ガ
   ラス化組織試料を平衡化させる工程； （ｄ）　該試料が平衡状態に保たれている間に昇苺によ
   りおよび第二次エネルギー源の使用により該ガラス化組
   織試料を脱水する工程；ｆｅ）　該組織試料のコントラ
   ストを強調するために四酸化オスミウムを添加する工程
   ；（０該脱水組織試料を脱気された樹脂により浸潤する
   工程；および （ω　該浸潤組織試料中の該樹脂を熱を加えることによ
   り重合する工程。 ３２、下記手段を含んでなる超微細構造分析用生体組織
   試料凍結調製用装置： （ａ）生体組織試料をガラス化させるための手段； （ｂ）　生体組織試料の雰囲気を脱圧させるための手段
   纂 （Ｃ）　該試料が平衡状態に葆たれている間にガラス化
   組織試料を脱水化するための手段；（（１１脱水組織試
   料な脱気された樹脂で浸潤するための手段；および １（ｅ）該樹脂を重合させるための手段。 ３３、該ガラス化が一１４０℃以下の温度までで行われ
   る、特許請求の範囲第３２項記載の装置。 ３４、該ガラス化が液体窒素を用いて行われる、特許請
   求の範囲第３３項記載の装置。 ３５、該ガラス化が３００分未滴り、内に完結される、
   特許請求の範囲第３４項記載の装置。 ３６、該脱圧が該組織試料の周囲の雰囲気を真空に引く
   ことＫより行われる、特許請求の範囲第３２項記載の装
   置。 ３７、該真空が少な（とも３　Ｘ　１０””９ＴＯｒｒ
   である、特許請求の範囲第３６項記載の装置。 ３８、該真空が３００分未満以内に形成される、特許請
   求の範囲第３７項記載の装置。 ３９、該ガラス化組織試料の平衡が恒温により示される
   、特許請求の範囲第３２項記載の装置。 ４０、該恒温が一１４０℃〜−１９６℃である、特許請
   求の範囲第３９項記載の装置。 ４１、該脱水が昇華により行われる、特許請求の範囲第
   ３２項記載の＆置。 ４２、該脱水が第二次エネルギー源からのエネルギーの
   添加により高められる、慣”蔚′請求の範囲第４１項記
   載の製条。 ４３、第二次エネルギー源が熱エネルギーである、特許
   請求の範囲第４２項記載の装置。 ４４、該第二次エネルギー源が放射エネルギーである、
   特許請求の範囲第４２項記載の装置。 ４５、該放射エネルギーが核磁気共鳴を用いて行われる
   、特許請求の範囲第４４項記戦の装置。 ４６、さらにコントラスト強調物質の象加を含んでなる
   、特許請求の範囲第３２項記載の装置。 ４７、該コントラスト強調物質が四酸化オスミウムであ
   る、特許請求の範囲第４６項記載の装置。 ４８、該重合が熱により行われる、特許請求の範囲第４
   ７項記載の装置。 ４９、該重合が紫外線を用いて行われる、特許請求の範
   囲第４７項記載の装置。 ５０、下記の部品を含んでなる生体試料の凍結調製用標
   本保持装置： （ａ）１個以上の組織試料を保持するようにされた標本
   室； （ｂ）該標本室に取り付けられた該標本室をエネルギ一
   手段から絶縁するための支持組立て部品；および （ｅ）　該組織試料が該標本室中にある際に、組織試料
   を相互に分離するようにされ、該標本室により取り外し
   可能に係合されている間隔配置手段。 ５１、該標本室が該組織試料への水分およびエネルギー
   の流れを許容する複数の穴を含む、特許請求の範囲第５
   ０項記載の標本保持装置。 ５２、該支持組立て部品が、該標本室に取り付けられて
   支持体収納部に嵌合されているチーープ状部材を含む、
   特許請求の範囲第５１項記載の標本保持装置。 ５３、該チューブ状部材が乾燥剤物質を含む、特許請求
   の範囲第５２項記載の標本保持装置。 ５４、該チューブ状部材が、１個以上の周辺エネルギー
   移動手段を含み、該周辺エネルギー移動手段が該チーー
   プ状部材の内面に取付けられており、かつ、該手段の大
   きさが、該間隔配置手段の部分が該周辺エネルギー移動
   手段中に挿入可能であるような大きさであることを特徴
   とする特許請求の範囲第５２項記載の標本保持装置。 ５５、該周辺エネルギー移動手段が放射エネルギーに対
   して伝導性である夛手段を含む、特許請求の範囲第５４
   項記載の標本保持装置。 ５６、該間隔配置手段が保持対に枢着された複数の平面
   状フランジを含んでなる、特許請求の範囲第５０項記載
   の標本保持装置。 ５７゜該標本室および該支持紐め立て部品が加熱手段に
   より取り外し可能に係合されている、特許請求の範囲第
   ５０項記載の標本保持装置。 ５８、下記部品を含んでなる生体試料の凍結試料用標本
   保持装置： （ａ）１個以上の組織試料を保持するようにされ、該組
   織試料への水分およびエネルギーの流れを許容する複数
   の穴を含む標本室； （１））　該標本室に取り付けられ、支持収納部に嵌合
   されて収納されている、該標本室に取り付けられたチュ
   ーブ状部材を含む支持組み立て部品；および （ｅ）　該組織試料が該標本室中にある際に組織試料を
   相互に分離するようにされ、該標本室により取り外し可
   能に係合されており、および保持対に枢着されて（・る
   複数の平面状フランジを含んでなる間隔配価１手段。 ５９、該チューブ状部材が１個以上の周辺エネルギー移
   動手段を含み、該周辺エネルギ・−移動手段が該チュー
   ブ状部材の内面に取り付けられており、かつ、該手段の
   大きさが該間隔配置手段の部分が該周辺エネルギー移動
   手段に挿入可能であるような大きさであることを特徴と
   する特許請求の範囲第５８項記載の標本保持装置。 ６Ｑ、該間隔配置装置が保持対に枢着された複数の平面
   状フランジを含んでなる、特許請求の範囲第５８項記載
   の標本保持装置。