CN110839613B - 一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂及其方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂及其方法和应用，包括液态金属纳米颗粒和基础保护剂；所述液态金属纳米颗粒的原材料熔点在60℃以下，所述基础保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖。所述冷冻保护剂可以在降温的过程中实现玻璃化，复温的过程中在近红外激光的照射下作为空间热源，大大提高升温速率，抑制反玻璃化，减少冰晶的形成，提高冻存后细胞及血管组织的存活率及结构完整性。

Description

一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂及其方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂及其方法和应用。
背景技术
冷冻保存是长期保存有价值的细胞以维持细胞功能特性(如免疫调节能力，分化能力)并达到临床应用所需数量的唯一方法。近来，已经开发了用于冷冻保存的各种方法，包括慢速冷冻和玻璃化。慢速冷冻方法很耗时，通常需要昂贵的程序降温仪器才能达到所需的冷却速度。与慢速冷冻相比，由于玻璃化冷冻法是一种快速降低细胞温度的冷冻模式，避免了慢速冷冻过程中细胞遭受的机械损伤，同时缩短了冷冻处理时间，简化了步骤，并且不需要昂贵的程序降温仪器，玻璃化逐渐成为细胞冷冻保存的趋势，尤其是对于干细胞和生殖细胞而言。然而，现有的冷冻损伤和冷冻保护剂(如二甲基亚砜(DMSO))所引起的不希望的分化风险仍然限制了冷冻保存的效率。对于干细胞的冷冻保存而言，减少冷冻损伤和保持其完整功能至关重要。理想情况下，高的升温速率可以确保生物样品在复温期间不会形成冰晶。通常认为高浓度的冷冻保护剂可避免形成冰晶。例如，在厘米尺度的样品中需要使用高达6-8M的冷冻保护剂以实现玻璃化并减少重结晶，但实际上，并非所有细胞都可以耐受高浓度的冷冻保护剂。在复温过程中，临界升温速率必须比临界冷却速率超出至少一个数量级，以防止在冷冻保护剂介质和系统中形成冰晶，目前在低浓度冷冻保护剂中实现更快的升温速率仍然具有挑战性。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂及其(冷冻保存)方法和应用。
本发明的目的之一在于提供一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂，包括液态金属纳米颗粒和基础保护剂；所述液态金属纳米颗粒的原材料熔点在60℃以下，所述基础保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖。本发明中，所述冷冻保护剂可以在降温的过程中实现玻璃化，复温的过程中在近红外激光的照射下作为空间热源，大大提高升温速率，抑制反玻璃化，减少冰晶的形成，提高冻存后细胞及血管组织的存活率及结构完整性。
根据本发明的一些优选实施方式，所述液态金属纳米颗粒的添加浓度为0.1mg/mL-0.8mg/mL；和/或，所述基础保护剂为0.5-2mol/L的乙二醇、0.5-2mol/L的丙二醇和0.5-1.3mol/L的海藻糖，更优选为1mol/L的乙二醇、1mol/L的丙二醇和0.5mol/L的海藻糖。
根据本发明的一些优选实施方式，所述冷冻保护剂为液态金属纳米颗粒、基础保护剂及培养液；其中，所述基础保护剂与所述培养液的体积比为(6.5-26):(93.5-74)；所述培养液以体积百分比计，优选为细胞培养基20-100％、胎牛血清0-80％，更优选为细胞培养基40％、胎牛血清60％；其中，所述细胞培养基优选为人骨髓间充质干细胞完全培养基、DMEM培养液、HBMSC培养液、PBS磷酸缓冲液或MEM培养液。
根据本发明的一些优选实施方式，所述液态金属包括Ga和/或Bi；优选的，所述液态金属合金选自GaIn合金、GaInSn合金、InBiSn合金和GaInSnZn合金中的一种或多种；优选为GaIn24.5。
根据本发明的一些优选实施方式，所述液态金属纳米颗粒的平均直径在100-200nm范围内。
本发明另一方面提供一种所述的冷冻保护剂中液态金属纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：将分散剂用无水乙醇进行溶解，加入适量液态金属，制成混合物，将上述混合物进行超声破碎处理，使所述液态金属全部转变为液态金属纳米颗粒；将上述步骤中的液态金属纳米颗粒溶液进行离心，去掉下层沉淀，将悬浮液进行冷冻干燥得到干燥后的液态金属纳米颗粒；优选的，所述分散剂选自聚乙烯醇、Pluronic F-127和纳米纤维素中的一种或多种，优选为Pluronic F-127。本发明中，合成的液态金属纳米颗粒具有粒径分布均匀、光热转换率高、稳定性好和良好的生物相容性的优良性能。可以在降温的过程中实现玻璃化。
本发明再一方面提供所述的冷冻保护剂对细胞或血管组织进行冷冻保存中的应用，优选在人骨髓间充质干细胞、血管组织冷冻保存中的应用。
本发明再一方面提供所述的冷冻保护剂的冷冻保存方法，采用所述冷冻保护剂对细胞或血管组织进行冻存，包括以下步骤：将细胞消化、离心收集好之后用2-8℃优选4℃平衡液重悬，在平衡液中平衡2-5min优选3min，然后转移到冷冻保护剂中，再立刻转移到冷冻脉管中，并迅速投入到液氮中冷冻，即完成细胞的玻璃化；或者
小鼠尾静脉注射50-150μL优选100μL所述冷冻保护剂；然后将小鼠安乐死，将所述小鼠尾剪成2-10mm优选5mm的小段，立即放入平衡液中，放在2-8℃优选4℃环境中平衡8-15min优选10min；然后，将尾巴迅速浸没如液氮中稳定3-10min优选5分钟；
进一步地，所述平衡液为乙二醇和丙二醇，优选为1mol/L乙二醇和1mol/L丙二醇。
根据本发明的一些优选实施方式，对所述冷冻保护剂冷冻保存的细胞或血管组织进行解冻复温，同时给与近红外激光照射；优选的，包括以下步骤：
将玻璃化后的细胞从液氮中取出立即放到解冻液中复温14s，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到基础液中平衡2-5min优选3min，即完成冷冻细胞的解冻；或者
将血管组织从液氮中取出立即放到解冻液中复温1min，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到PBS溶液中平衡2-5min优选3min，即完成血管组织的解冻。
根据本发明的一些优选实施方式，所述近红外激光波长为808nm；和/或，解冻过程在37℃环境中进行；所述解冻液成分为0.2-0.5mol/L优选0.5mol/L海藻糖的PBS溶液。
本发明的有益效果至少在于：本发明中合成的液态金属纳米颗粒具有粒径分布均匀、光热转换率高、稳定性好和良好的生物相容性的优良性能。本发明所提出的冷冻保护剂组分为常规培养液、基础保护剂和液态金属纳米颗粒，并且可以在降温的过程中实现玻璃化。本发明中提供的柔性液态金属纳米颗粒可以实现在复温的过程中利用近红外激光作用作为空间发热源来显著提高升温速率，抑制冻存样品冰晶的形成，降低冷冻保存对冻存样品的损伤，提高冻存样品复苏之后的存活率及结构完整性，特别是人骨髓间充质干细胞，存活率可以达到78％，而且冻存后的细胞形态结构、膜蛋白表达和分化功能都保持不变。因而本发明提供的一种基于柔性液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂及冷冻保存方法具有极高的安全性及可行性，在生物医学领域具有很大的应用前景。
附图说明
图1为本发明实验例1、2提供的冷冻保存人骨髓间充质干细胞的细胞活率。
图2为本发明实验例3、4提供的小鼠尾巴血管组织的免疫组化染色切片。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明中，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。本发明中所用的化工原料均可在国内化工产品市场方便买到。下列实施例中所使用的液态金属纳米颗粒的制备步骤如下：将分散剂Pluronic F-127用无水乙醇进行溶解，加入各实施例中所用液态金属，制成混合物，将上述混合物进行超声破碎处理，使所述液态金属全部转变为液态金属纳米颗粒；将上述步骤中的液态金属纳米颗粒溶液进行离心，去掉下层沉淀，将悬浮液进行冷冻干燥得到干燥后的液态金属纳米颗粒。
实施例1
本实施例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻平衡液、冷冻保护剂和解冻液，冷冻平衡液组分为：常规培养液及基础保护剂，常规培养液由40％人骨髓间充质干细胞完全培养基和60％胎牛血清组成，基础保护剂为乙二醇和丙二醇，其浓度都为1M。冷冻保护剂组分为：常规培养液及基础保护剂。其中常规培养液由40％人骨髓间充质干细胞完全培养基和60％胎牛血清组成，基础保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖，乙二醇、丙二醇浓度都为2M，海藻糖浓度为0.5M。解冻液组分为0.5M海藻糖的PBS溶液。
实施例2
本实施例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻平衡液、冷冻保护剂和解冻液，冷冻平衡液组分为：常规培养液及基础保护剂，常规培养液由40％人骨髓间充质干细胞完全培养基和60％胎牛血清组成，基础保护剂为乙二醇和丙二醇，其浓度都为1M。冷冻保护剂组分为：液态金属纳米颗粒、常规培养液及基础保护剂。其中液态金属纳米颗粒为GaIn24.5合金(平均粒径为100-200nm)浓度为0.1mg/mL，常规培养液由40％人骨髓间充质干细胞完全培养基和60％胎牛血清组成，基础保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖，乙二醇、丙二醇浓度均为2M，海藻糖浓度为0.5M。解冻液组分为0.5M海藻糖的PBS溶液。
实施例3
本实施例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻保护剂，制备方法同实施例2，区别在于：纳米液态金属浓度为0.2mg/mL。
实施例4
本实施例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻保护剂，制备方法同实施例2，区别在于：纳米液态金属浓度为0.4mg/mL。
实施例5
本实施例提供了一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂，制备方法同实施例2，区别在于：纳米液态金属浓度为0.8mg/mL。
实验例1
本实验例对上述实施例中的冷冻保护剂通过如下方法进行冻存效果测试：
将106个人骨髓间充质干细胞按照以下步骤进行玻璃化：将细胞消化、离心(以1000转/分钟离心5分钟)收集好之后用4℃平衡液重悬，在平衡液中平衡3分钟，然后转移到50微升冷冻保护剂中，再立刻转移到冷冻脉管中，并迅速投入到液氮中冷冻，即完成细胞的玻璃化。
将玻璃化后的细胞按照以下步骤进行冷冻细胞的解冻复温：将玻璃化后的细胞从液氮中取出立即放到解冻液中复温14s，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到基础液中平衡3分钟，即完成冷冻细胞的解冻。
将解冻后的细胞进行AO/EB染色，并置于荧光显微镜下观察拍照，定量计算细胞的存活率。
对比例1
本对比例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻保护剂，制备方法同实施例1，区别在于：复温的同时不给与近红外激光照射。
对比例2
本对比例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻保护剂，制备方法同实施例2，区别在于：复温的同时不给与近红外激光照射。
对比例3
本对比例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻保护剂，制备方法同实施例3，区别在于：复温的同时不给与近红外激光照射。
对比例4
本对比例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻保护剂，制备方法同实施例4，区别在于：复温的同时不给与近红外激光照射。
对比例5
本对比例提供了一种人骨髓间充质干细胞冷冻保护剂，制备方法同实施例5，区别在于：复温的同时不给与近红外激光照射。
实验例2
本实验例对上述对比例中的冷冻保护剂通过如下方法进行冻存效果测试：
将106个人骨髓间充质干细胞按照以下步骤进行玻璃化：将细胞消化、离心(以1000转/分钟离心5分钟)收集好之后用4℃平衡液重悬，在平衡液中平衡3分钟，然后转移到50微升冷冻保护剂中，再立刻转移到冷冻脉管中，并迅速投入到液氮中冷冻，即完成细胞的玻璃化。
将玻璃化后的细胞按照以下步骤进行冷冻细胞的解冻复温：将玻璃化后的细胞从液氮中取出立即放到解冻液中复温1分钟，之后转移到基础液中平衡3分钟，即完成冷冻细胞的解冻。解冻过程均在37℃环境中进行。
将解冻后的细胞进行AO/EB染色，并置于荧光显微镜下观察拍照，定量计算细胞的存活率，图1为本发明实验例1-2提供的冷冻保存人骨髓间充质干细胞的细胞活率。并对冷冻保存人骨髓间充质干细胞冷冻后的贴壁率进行了检测，所得到的实验结果汇总如表1和2所示。
表1冷冻保存人骨髓间充质干细胞的细胞活率实验结果
实验类别 细胞存活率
实施例1 25.3％
实施例2 73.5％
实施例3 74.5％
实施例4 76.7％
实施例5 77.9％
对比例1 23.7％
对比例2 28.3％
对比例3 29.3％
对比例4 31.2％
对比例5 33.2％
表2冷冻保存人骨髓间充质干细胞的细胞贴壁率实验结果
Figure BDA0002285257380000081
Figure BDA0002285257380000091
结论：结果显示，当使用液态金属纳米颗粒介导的光热复温时，冷冻保存后的细胞活力大大增强。所有细胞活力均超过70％，并且较高的液态金属纳米颗粒的浓度组表现出较高的平均细胞活力。此外，当使用液态金属纳米颗粒介导的光热复温时，冷冻保存后的细胞贴比率明显高于未使用光热复温的细胞贴壁率。
实施例6
本实施例提供了一种小鼠尾巴血管组织的冷冻平衡液、冷冻保护剂及解冻液，冷冻平衡液组分为：PBS溶液、乙二醇和丙二醇，其中乙二醇和丙二醇浓度都为1M。冷冻保存剂组分为：PBS溶液、乙二醇、丙二醇、海藻糖和液态金属纳米颗粒，其中乙二醇和丙二醇浓度都为2M，海藻糖浓度为0.5M，液态金属纳米颗粒浓度为0.8mg/mL。解冻液组分为0.5M海藻糖的PBS溶液。
对比例6
本对比例提供了一种小鼠尾巴血管组织的冷冻平衡液及冷冻保存剂，制备方法同实施例6，区别在于：冷冻保存剂组分中未添加液态金属纳米颗粒。
实验例3
本实验例为空白对照组，通过如下方法进行冻存效果测试：
将小鼠安乐死，尾巴剪成5mm的小段，然后将小鼠尾巴段进行固定、石蜡包埋和HE染色切片后在显微镜下观察拍照。实验结果记录为空白例1。
实验例4
本实验例对上述实施例6和对比例6中的冷冻保护剂通过如下方法进行冻存效果测试：
小鼠尾静脉注射100μL冷冻保护剂。然后将小鼠安乐死，尾巴剪成5mm的小段立即放入平衡液中，放在4℃环境中平衡10分钟。然后，将尾巴迅速浸没如液氮中稳定5分钟。
然后进行尾巴血管的解冻复温：将尾巴血管从液氮中取出立即放到解冻液中复温1分钟，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到PBS中平衡3分钟，即完成冷冻细胞的解冻。解冻过程均在37℃环境中进行。
将解冻后的小鼠尾巴段进行固定、石蜡包埋和HE染色切片后在显微镜下观察拍照。
如图2所示为冷冻保存小鼠尾巴血管组织的免疫组化染色切片实验结果汇总。
结论：结果显示，当使用液态金属纳米颗粒介导的光热复温时，冷冻保存后的血管组织的结构完整性得到了改善。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种基于液态金属纳米颗粒的冷冻保护剂，其特征在于，所述冷冻保护剂为液态金属纳米颗粒、基础保护剂及培养液；所述液态金属纳米颗粒的原材料熔点在60℃以下，所述基础保护剂为乙二醇、丙二醇和海藻糖；
所述液态金属纳米颗粒的添加浓度为0.1mg/mL-0.8mg/mL；
所述基础保护剂为0.5-2mol/L的乙二醇、0.5-2mol/L的丙二醇和0.5-1.3mol/L的海藻糖；
其中，所述基础保护剂与所述培养液的体积比为(6.5-26):(93.5-74)；所述培养液以体积百分比计，为细胞培养基40％、胎牛血清60％；其中，所述细胞培养基为人骨髓间充质干细胞完全培养基、DMEM培养液、HBMSC培养液、PBS磷酸缓冲液或MEM培养液；
所述液态金属为GaIn24.5；
所述液态金属纳米颗粒的平均直径在100-200nm范围内；
所述的冷冻保护剂中液态金属纳米颗粒的制备包括如下步骤：将分散剂用无水乙醇进行溶解，加入适量液态金属，制成混合物，将上述混合物进行超声破碎处理，使所述液态金属全部转变为液态金属纳米颗粒；将上述步骤中的液态金属纳米颗粒溶液进行离心，去掉下层沉淀，将悬浮液进行冷冻干燥得到干燥后的液态金属纳米颗粒；所述分散剂为Pluronic F-127。
2.根据权利要求1所述的冷冻保护剂对细胞或血管组织进行冷冻保存中的应用。
3.根据权利要求2所述的冷冻保护剂在人骨髓间充质干细胞、血管组织冷冻保存中的应用。
4.根据权利要求1所述的冷冻保护剂的冷冻保存方法，其特征在于，采用所述冷冻保护剂对细胞或血管组织进行冻存。
5.根据权利要求4所述的冷冻保护剂的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
将细胞消化、离心收集好之后用2-8℃平衡液重悬，在平衡液中平衡2-5min，然后转移到冷冻保护剂中，再立刻转移到冷冻脉管中，并迅速投入到液氮中冷冻，即完成细胞的玻璃化；或者
小鼠尾静脉注射50-150μL所述冷冻保护剂；然后将小鼠安乐死，将所述小鼠尾剪成2-10mm的小段，立即放入平衡液中，放在2-8℃环境中平衡8-15min；然后，将尾巴迅速浸没入液氮中稳定3-10min；
所述平衡液为乙二醇和丙二醇。
6.根据权利要求5所述的冷冻保护剂的冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
将细胞消化、离心收集好之后用4℃平衡液重悬，在平衡液中平衡3min，然后转移到冷冻保护剂中，再立刻转移到冷冻脉管中，并迅速投入到液氮中冷冻，即完成细胞的玻璃化；或者
小鼠尾静脉注射100μL所述冷冻保护剂；然后将小鼠安乐死，将所述小鼠尾剪成5mm的小段，立即放入平衡液中，放在4℃环境中平衡10min；然后，将尾巴迅速浸没如液氮中稳定5分钟；
所述平衡液为1mol/L乙二醇和1mol/L丙二醇。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述冷冻保护剂冷冻保存的细胞或血管组织进行解冻复温，同时给与近红外激光照射。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将玻璃化后的细胞从液氮中取出立即放到解冻液中复温14s，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到基础液中平衡2-5min，即完成冷冻细胞的解冻；或者
将血管组织从液氮中取出立即放到解冻液中复温1min，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到PBS溶液中平衡2-5min，即完成血管组织的解冻。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将玻璃化后的细胞从液氮中取出立即放到解冻液中复温14s，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到基础液中平衡3min，即完成冷冻细胞的解冻；或者
将血管组织从液氮中取出立即放到解冻液中复温1min，复温的同时给与近红外激光照射，之后转移到PBS溶液中平衡3min，即完成血管组织的解冻。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述近红外激光波长为808nm；和/或，解冻过程在37℃环境中进行；所述解冻液成分为0.2-0.5mol/L海藻糖的PBS溶液。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述解冻液成分为0.5mol/L海藻糖的PBS溶液。
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